CN116103417A - 用于幽门螺杆菌vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合 - Google Patents

用于幽门螺杆菌vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于幽门螺杆菌vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合，包括：引物vacAs‑F、引物vacAs‑R、引物vacAm1‑F、引物vacAm1‑R、引物vacAm2‑F、引物vacAm2‑R和探针vacAs1‑P、探针vacAs2‑P、探针vacAm1‑P、探针vacAm2‑P；本发明还提供了幽门螺杆菌空泡毒素基因分型检测的方法和试剂盒。本发明所建立的检测方法能够很好的对幽门螺杆菌vacA基因分型，并且能够在同一个体系中一次性做到s1、s2、m1、m2四种基因的检测。

Description

用于幽门螺杆菌vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测幽门螺杆菌毒素基因vacA分型检测的荧光定量PCR引物和探针。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是世界卫生组织癌症研究机构规定的第一类致癌因子，是胃癌预防的一级措施。HP感染常导致胃炎、胃溃疡等疾病，我国平均感染率为59％。幽门螺杆菌的主要致病因子包括细胞毒性cagA、空泡毒素vacA和粘附接触诱导因子iceA等，其中vacA是导致胃溃疡等症状的主要毒素因子，因为在体外可诱导各种哺乳动物细胞胞浆发生空泡变性而得名。
研究表明，几乎所有的HP菌株都携带了vacA基因，但是其蛋白表达率不到50％，这与基因不同类型有很大的关系。不同人群、不同疾病状态分离的HP中，vacA基因存在多态性，这种多态性导致了基因表达的差异。在西方国家，vacA的基因表达率为30％-50％，在中国表达率达50％-80％。vacA基因最重要的突变区域有两处，第一个位于编码信号，约50bp，第二个位于基因中部，约700bp。基因信号区域的突变可以分为s1和s2两种，其中s1又分为s1a、s1b和s1c三种不同的类型。中间基因区域序列分为m1和m2两种基因序列，其中m1又分为m1a和m1b两种类型。根据s基因和m基因的不同组合类型，能够确定vacA毒素表达的高低，s2基因类型完全不能表达vacA毒素，s1型基因却具有很高的表达率。m1和m2与vacA基因表达存在高度关联性。除了s2/m1基因类型之外，其余s1/m1、s1/m2、s2/m2基因类型都存在。我国菌株以s1/m2型为主，美国以s1/m1为主。1989年，研究者Figura比较了从胃溃疡和胃炎患者中分离到的HP菌株vacA毒素的活性，发现胃溃疡患者有66.6％表现为vacA活性，而胃炎患者则只有30.1％的活性。这说明vacA的高表达是导致胃溃疡的主要原因。同时，研究者也发现，vacAs1型与胃癌呈正相关。因此，临床检测HP vacA的基因类型，能够起到预测疾病严重程度，确定采取不同临床策略的作用。现有的文章报道中，主要以普通PCR扩增后，再进行测序判断为主。该方法耗时耗力，且成本高，不方便高通量检测。其另外一个缺点是需要分离到菌株以后才能检测，不能直接对胃粘膜等标本进行vacA分型检测。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供用于幽门螺杆菌毒素基因vacA基因分型检测的实时荧光PCR探针、引物和检测方法，实现在一个检测体系中可以同时检测vacA s1、s2、m1和m2，一次分型，并且能够直接对胃粘膜进行检测。
本发明的技术方案为：用于幽门螺杆菌毒素基因vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合，包括：引物vacAs-F、引物vacAs-R、引物vacAm1-F、引物vacAm1-R、引物vacAm2-F、引物vacAm2-R和探针vacAs1-P、探针vacAs2-P、探针vacAm1-P、探针vacAm2-P；其中，引物vacAs-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物vacAs-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示，引物vacAm1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物vacAm1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，引物vacAm2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物vacAm2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，探针vacAs1-P的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，探针vacAs2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，探针vacAm1-P的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，探针vacAm2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
进一步地，探针vacAs1-P 5’端标记发光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1；探针vacAs2-P 5’端标记发光基团HEX，3’端标记淬灭基团BHQ1；探针vacAm1-P 5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2；探针vacAm2-P 5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2。
一种试剂盒，含有上述所述的引物和探针组合。
进一步地，还含有荧光定量反应液、阴性模板或阳性模板中的一种或多种，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为幽门螺杆菌基因组DNA。
一种幽门螺杆菌空泡毒素基因vacA分型检测的方法，以样品总DNA为模板，以上述所述的引物和探针组合进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
进一步地，实时荧光定量PCR的反应体系为
           
进一步地，本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，54～62℃退火30s，40个循环。
本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，56℃退火30s，45个循环。
进一步地，每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)AND POS(+)
无效扩增：NTC(+)AND POS(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(－)AND POS(－)提示体系错误或者试剂失效。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。
在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了用于检测幽门螺杆菌毒素基因vacA分型的引物和探针，四种基因分型探针具有较强的特异性，利用所提供引物和探针能够从所分离幽门螺杆菌菌株、胃粘膜、胃液和粪便中检测三种毒素基因。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性阳性对照，该试剂盒的推广应用有利于对幽门螺杆菌vacA毒素基因类型分型，判断其表达的水平，有助于临床对HP感染者进行判断，进而确定合适的治疗策略。
附图说明
图1为vacA基因分型s1、s2、m1、m2探针PCR退火温度优化扩增结果图；
图2.所构建HP毒素vacA基因分型体系特异性验证，除各自对应基因型别，其余无扩增；
图3.所构建HP vacA毒素基因四重荧光PCR检测体系对株临床分离菌株检测结果图；
图4.所构建HP毒素基因vacA多重荧光PCR对60例胃粘膜标本检测结果图。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
通过对NCBI数据库中已经报道的幽门螺杆菌vacA基因序列进行比对分析，找到s1和s2，m1和m2基因差异，并在此基础上进行引物和探针的设计。可以使用Primer Express3.0，Beacon Designer 8等软件来设计引物和探针。其中s1和s2基因类型公用一对引物，m1和m2分别设计一对引物。四个HP vacA基因分别标记如下：s1探针5’端标记发光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1；s2探针5’端标记发光基团HEX，3’端标记淬灭基团BHQ1；m1探针5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2；m2探针5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2。
引物序列为：
vacAs-F：CGCAAAATCAATCGCCCT(SEQ ID No.1)
vacAs-R：GGCTGGAATGATCACGGTTG(SEQ ID No.2)
vacAm1-F：TTAAAAGTGGATGCCCATACAG(SEQ ID No.3)
vacAm1-R：GATATTGACTTTGTTTGTAACGCC(SEQ ID No.4)
vacAm2-F：GCTCATACAGCTTATTTTAATGGCAAT(SEQ ID No.5)
vacAm2-R：TGGCATCAATATTTTTAAAATGAG(SEQ ID No.6)
探针序列为：
vacAs1-P，ACACCGCAACAAAGTCATGCCG(SEQ ID No.7)
vacAs2-P，AACTAGGGGCTAAYACGCCAAAYGATCC(SEQ ID No.8)
vacAm1-P，TATTGATACTGGTAATGGTGGTTTCAACACC(SEQ ID No.9)
vacAm2-P，CCACGAATTTAAGAGTGAATGGCCATAG(SEQ ID No.10)。
本发明提供一种幽门螺杆菌毒素基因vacA分型检测方法，包括以样品中的总DNA为模板，以上述的毒素基因为靶序列，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为20μl反应体系时，其优选配置为：
本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，54～62℃退火30s，40个循环。
本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，56℃退火30s，45个循环。
本发明每次检测标本时必须设立NTC对照(无模板对照)和POS对照(阳性对照)，两种对照对于结果判读起决定性作用：
有效扩增：NTC(－)AND POS(+)
无效扩增：NTC(+)AND POS(+)提示体系污染
无效扩增：NTC(－)AND POS(－)提示体系错误或者试剂失效。
只有对照有效扩增情况下的样品检测结果才可信，否者试验需要重复。
在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
实施例1
vacA基因分型实时荧光定量PCR体系退火温度优化：体系退火温度从55℃～64℃改变，结果显示56℃左右体系扩增效果最好(图1)
vacA基因分型实时荧光定量PCR退火温度优化体系和条件
优化后的扩增条件：
37℃2min，95℃10min，45个循环：95℃10s，56℃30s，45个循环。
实施例2
用优化了的real-time PCR检测结果测序确认的vacA基因s1s2m1m2分别进行扩增检测。结果显示相互没有交叉反应，能够达到很好的区分结果(图2)。
实施例3
采用优化后的vacA基因分型四重荧光PCR检测体系对100株临床分离到的幽门螺杆菌菌株进行检测，结果显示s1m1、s1m2、s2m1型别分别为2％、90％、6％(图3)。
实施例4
对60例尿素酶呼气试验阳性的幽门螺杆菌感染者，胃镜下取胃粘膜，采用已经优化好的vacA基因分型四重荧光PCR体系进行检测，结果显示所构建vacA分型检测体系能够从胃粘膜中直接检测HPvacA分型，主要以s1m2型别为主，阳性率达90％(图4)。

Claims (8)

1.用于幽门螺杆菌毒素基因vacA基因分型的实时荧光PCR特异性引物和探针组合，其特征在于，包括：引物vacAs-F、引物vacAs-R、引物vacAm1-F、引物vacAm1-R、引物vacAm2-F、引物vacAm2-R和探针vacAs1-P、探针vacAs2-P、探针vacAm1-P、探针vacAm2-P；其中，引物vacAs-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，引物vacAs-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，引物vacAm1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，引物vacAm1-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示，引物vacAm2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，引物vacAm2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，探针vacAs1-P的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，探针vacAs2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，探针vacAm1-P的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，探针vacAm2-P的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，探针vacAs1-P 5’端标记发光基团FAM，3’端标记淬灭基团BHQ1；探针vacAs2-P 5’端标记发光基团HEX，3’端标记淬灭基团BHQ1；探针vacAm1-P 5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2；探针vacAm2-P 5’端标记发光基团Texasred，3’端标记淬灭基团BHQ2。
3.一种试剂盒，含有权利要求1或2所述的引物和探针组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还含有荧光定量反应液、阴性模板或阳性模板中的一种或多种，所述阴性模板为去核酸水，所述阳性模板为幽门螺杆菌基因组DNA。
5.一种幽门螺杆菌空泡毒素基因vacA分型检测的方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为
           
Figure FDA0004055212350000011
Figure FDA0004055212350000021
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为：37℃去污染2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃变性10s，56℃退火30s，45个循环。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，同时设立无模板对照和阳性对照，在对照有效扩增的情况下，样品检测结果可信，否者试验需要重复；在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下：
Ct值小于等于38的标本为阳性结果；
Ct值大于40的标本为阴性性结果；
Ct值在38-40之间的标本需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。
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