CN108085375B - 检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述方法在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；然后根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值△Ct值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。本发明的方法操作简单和准确性高。

Description

检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别涉及检测角膜营养不良基因突变的基因型的方法及其试剂盒。
背景技术
角膜营养不良是一组原发性、遗传性、双眼具有病理组织特征改变的疾病，其共同特点为在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。目前报道与角膜营养不良相关的基因有多种，其中TGFBI基因是首个被发现且最为常见的相关基因，为常染色体显性遗传。在中国人群中，R555和R124为该基因上的突变热点，占所有突变的80％以上。
根据临床症状可将TGFBI基因突变引起的角膜营养不良分为3大类：1)格子状角膜营养不良(LCD)，包括：LCDI、LCDIII/IIIA、LCDIV和非典型LCD；2)颗粒状角膜营养不良(GCD)，包括：GCDI、GCDII(也称Avellino角膜营养不良，ACD)、GCDIII(也称Reis-Bucker角膜营养不良，RBCD)和非典型GCD；3)蜂窝状营养不良，也称Thiel-Behnke角膜营养不良(TBCD)。其中，在中国人群中，R555W和R124H突变分别与GCD I和GCD II(ACD)表型具有明显相关性。
有研究报道，角膜营养不良(GCD)的患者进行激光视力矫正术或角膜表面的微小伤痕等刺激可导致病情迅速恶化，视力在1～3年后出现下降，甚至导致失明，尤其是GCDII(ACD)型患者。目前在韩国，已经禁止对ACD型患者进行激光类视力矫正术。至于激光视力矫正术是否会使其它两种类型的角膜营养不良患者病情恶化目前尚无准确报道。
部分角膜营养不良患者为杂合型突变，其症状不是很明显，常规检查很难发现角膜营养不良，如果这类患者经过近视激光手术之后将可能出现角膜混浊、视力下降等症状，而且目前没有有效的治疗方法。因此有必要通过基因检测确定被检者DNA中与角膜营养不良症相关的易感基因是否发生突变，从而对角膜营养不良症的临床诊断提供依据。基因检测比传统检查拥有更高的准确性和更远的前瞻性，可有效预防角膜营养不良症患者在进行激光视力矫正术后出现角膜混浊症状急速恶化的后果。
用于检测基因多态性的方法很多，包括如DNA直接测序，限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphisms,RFLP)，扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，所以临床应用受到很大限制。限制性片段长度多态性仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。
扩增阻碍突变系统是验证性检测DNA序列变化的常用经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA模板和一条相同的共有引物和反应条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3`末端与野生型模板匹配，突变型ARMS引物3`末端与突变型模板匹配，使两个反应选择性扩增特定的DNA模板，即3`末端不匹配引物的延伸受到阻碍，通常还在3`末端2-4个碱基设置一个错配碱基，以提高错配引物的选择扩增性。但由于人基因组DNA分子模板浓度一般较高，导致ARMS引物经选择性扩增后背景仍然很高，而且对于特定序列，ARMS引物不足以形成较明显的扩增差异，不利于结果判断。
发明内容
为了解决角膜营养不良基因多态性的检测，本发明提供检测角膜营养不良基因突变的基因型的方法及其试剂盒。
本发明整合了ARMS-PCR技术和荧光定量PCR技术。本发明的特征在于，在相同反应体系(例如，包括样本DNA、ROX、TaqMan探针、dNTP、聚合酶及缓冲液等)中，分别使用本发明的针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物以及与所述增强型ARMS引物对应的共用上游或下游引物，用两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过CT值和△CT值的大小判定样本基因型。
本发明依据传统ARMS-PCR技术的原理，进行了增加增强型ARMS引物3`端和中间区域的错配碱基数，使得针对野生型模板的增强型增强型ARMS引物对突变型样本不扩增或扩增效率很低，并且针对突变型模板的增强型ARMS引物对野生型样本不扩增或扩增效率很低，这样大大降低背景信号，使得结果更易于判断。
在一种实施方式中，本发明提供一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，它包括以下步骤：
步骤1：在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；
针对所述野生型模板的增强型ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；
针对所述突变型模板的增强型ARMS引物的3`末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3`末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；
所述野生型模板的增强型ARMS引物和所述突变型模板的增强型ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分别与所述针对野生型模板的增强型ARMS引物或所述针对突变型模板的增强型ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列；和
步骤2：根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值△Ct值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。
在一种实施方式中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测时，加入内参，根据内参的扩增信号有无和内参荧光定量PCR检测的Ct内参值，用于确定待测样本的扩增是否正常以及待测样本的基因型的判断。
在一种实施方式中，若内参引物无扩增信号，需要重新提取样本或重新取样后进行检测；若内参有扩增信号且30＜Ct内参≤38，根据以下情况进行判断：
a)该位点的突变型或野生型的扩增曲线呈S型曲线且Ct值满足Ct≤34：
a1.若突变型和野生型检测体系均有扩增信号，若△Ct≥6，判定为野生纯合型；若-3≤△Ct≤3，判定为杂合型；若△Ct≤-6，判定为突变纯合型；
a2.若突变型有扩增信号且Ct值小于34、野生型无扩增信号，则判定为突变纯合型；若突变型Ct值大于34，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试；
a3.若野生型有扩增信号且Ct值小于34、突变型无扩增信号，则判定为野生纯合型；若野生型Ct值大于34，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试；
a4.若突变型和野生型检测体系Ct值大于34，说明样本DNA提取浓度过低或超出本方法检测范围，需要重新提取样本测试
b)该位点的突变型或野生型的检测Ct为0或无数值，则判断为该位点的野生型或突变型；和
c)该位点的的野生型或突变型扩增曲线呈S型曲线且Ct值满足Ct＞34，则该样本检测结果异常，对该位点进行测序分析。
在一种实施方式中，内参为β-actin；实时荧光定量PCR中用于扩增内参的上游引物AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)，下游引物为CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ IDNO:2)；和检测其的探针为TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)。
在一种实施方式中，针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述针对野生型模板的增强型ARMS引物和所述针对突变型模板的增强型ARMS引物完全相同。
在一种实施方式中，角膜营养不良多态性位点是TGFBI基因R555W 1824C>T点突变、TGFBI基因R555Q 1825G>A点突变、TGFBI基因R124H 532G>A点突变、TGFBI基因R124L532G>T点突变或TGFBI基因R124S 531C>A、R124C531C>T点突变中的一个或多个。
在一种实施方式中，检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGAC(SEQ ID NO:4)、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTAT(SEQ ID NO:5)，和共用下游引物为CTAGCAAAGGATGAGGCCAACC(SEQ ID NO:6)；和检测其的探针为CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTT(SEQ ID NO:7)；
检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:8)、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:9)，和共用下游引物为CCCAGAGGCCATCCCTCCTTC(SEQ ID NO:10)；和检测其的探针为GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCT(SEQ ID NO:11)；
检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:12)、突变型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCT(SEQ ID NO:13)，和共用上游引物为CACCTGTAGATGTACCGTGCTC(SEQ ID NO:14)；和检测其的探针为AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGA(SEQ ID NO:15)；
检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACG(SEQ ID NO:16)、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATA(SEQ ID NO:17)，和共用下游引物为CAAAGGATGAGGCCAACCCGAT(SEQ ID NO:18)；
检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:20)、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:21)，和共用上游引物为GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTA(SEQ ID NO:22)；和检测其的探针为CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGT(SEQ ID NO:23)；和
检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:24)、突变型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:25)，和共用上游引物为TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTC(SEQ ID NO:26)；和检测其的探针为TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGT(SEQ ID NO:27)。
在一种实施方式中，本发明提供在上述方法中使用的试剂盒。
在一种实施方式中，试剂盒进一步包括：ROX校正液、dNTP、聚合酶及缓冲液。
与现有基因多态性检测方法相比，本发明的基于增强型ARMS荧光定量PCR检测基因多态性的试剂盒及方法不仅特异性强，敏感性高，成本低，结果高度可靠，背景低，结果易于判断，而且在操作和使用上还具有独特优势，荧光定量PCR检测快捷方便，全程闭管检测，降低污染，减少了不必要的费用和工作量。特别是荧光定量PCR可以用CT值来表征扩增效率，因此这个方法可以检测角膜营养不良样本纯合野生型、纯合突变型和杂合子基因型情况，使得结果判断可以准确可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为实施例1中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图2为R555W野生型样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)中的荧光扩增曲线图；
图3为实施例1使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R555W野生型测序的原始峰图；
图4为实施例2中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图5R124H杂合样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)中的荧光扩增曲线；
图6为实施例2使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124H杂合突变型测序的原始峰图；
图7为实施例3中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图8为R124L野生型样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)的荧光扩增曲线；
图9为实施例3使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124L野生型测序的原始峰图；
图10为实施例4中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图11为R555Q野生型样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)的荧光扩增曲线；
图12为实施例4使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R555Q野生型测序的原始峰图；
图13为实施例5中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图14为R124C野生型样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)的荧光扩增曲线；
图15为实施例5使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124C野生型测序的原始峰图；
图16为实施例6中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；
图17为R124S野生型样本分别在野生型反应液(A)和突变型反应液(B)的荧光扩增曲线；和
图18为实施例6使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124S野生型测序的原始峰图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，PCR缓冲液、dNTP均随DNA聚合酶，ROX校正液购于宝生物工程(大连)有限公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。在下列实施例中均使用血液基因组DNA提取试剂盒制备样本DNA。
实施例1角膜营养不良相关的TGFBI基因R555W点突变基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下游引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物(SEQ ID NO:4)、突变型增强型ARMS引物(SEQID NO:5)，共用下游引物为R555W-R(SEQ ID NO:3)，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
增强型上游增强型ARMS引物：
R555W-WF AGCCCTGCCACCAAGAGGAC(SEQ ID NO:4)
R555W-MF AGCCCTGCCACCAAGAGTAT(SEQ ID NO:5)
共用下游引物R555W-R：CTAGCAAAGGATGAGGCCAACC(SEQ ID NO:6)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R555W-P探针：CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTT(SEQ ID NO:7)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000071
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25，说明样品合格，试验结果如图1所示。
图2中角膜营养不良待检样本(R555W野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.15，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝10.15，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。
图3中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R555W野生型)测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R555W野生型。
实施例2角膜营养不良相关的TGFBI基因R124H点突变的基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124H-F，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
下游增强型ARMS引物：
R124H-WR AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:8)
R124H-MR AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:9)
共用上游引物R124H-F：CCCAGAGGCCATCCCTCCTTC(SEQ ID NO:10)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R124H-P探针：GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCT(SEQ ID NO:11)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000081
Figure BDA0001147108500000091
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.5，说明样品合格，试验结果如图4所示。
图5中角膜营养不良待检样本(R124H野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.8；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为25.9，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝0.1，根据判定标准，该样本为杂合样本。
图6中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R124H杂合型)测序，原始峰图结果显示为碱基A/G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124H杂合型。
实施例3角膜营养不良相关的TGFBI基因R124L点突变基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124L-F，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
下游增强型ARMS引物：
R124L-WR TCAGCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:12)
R124L-MR TCAGCTCAGCTTCTCCATGCT(SEQ ID NO:13)
共用上游引物R124L-F：CACCTGTAGATGTACCGTGCTC(SEQ ID NO:14)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R124L-P探针：AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGA(SEQ ID NO:15)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000101
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.5，说明样品合格，试验结果如图7所示。
图8中角膜营养不良待检样本((R124L野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.1；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.9，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝10.8，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。
图9中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R124L野生型)测序，原始峰图结果显示为碱基G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124L野生型。
实施例4角膜营养不良相关的TGFBI基因R555Q点突变的基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用下游引物为R555W-R，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
增强型上游增强型ARMS引物：
R555Q-WF AGCCCTGCCACCAAGAGGACG(SEQ ID NO:16)
R555Q-MF AGCCCTGCCACCAAGAGTATA(SEQ ID NO:17)
共用下游引物R555W-R：CAAAGGATGAGGCCAACCCGAT(SEQ ID NO:18)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃-70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R555Q-P探针：TAAAGTAGTGATCCCTCAGGGCCCCAGCA(SEQ ID NO:19)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000111
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在24.4，说明样品合格，试验结果如图10所示。
图11中角膜营养不良待检样本((R555Q野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为24.3；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.9，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝11.6，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。
图12中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R555Q野生型)测序，原始峰图显示为碱基G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R555Q野生型。
实施例5角膜营养不良相关的TGFBI基因R124C点突变的基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124C-F，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
下游增强型ARMS引物：
R124C-WR AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:20)
R124C-MR AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:21)
共用上游引物R124C-F：GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTA(SEQ ID NO:22)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R124C-P探针：CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGT(SEQ ID NO:23)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000131
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃15秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在26.2，说明样品合格，试验结果如图13所示。
图14中角膜营养不良待检样本((R124C野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.8；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.7，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝9.9，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。
图15中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R124C野生型)测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124C野生型。
实施例6角膜营养不良相关的TGFBI基因R124S点突变的基因型的检测
本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。
本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。
1)β-actin引物设计
实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。引物序列如下：
上游引物：β-actin-F AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ ID NO:1)
下游引物：β-actin-R CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2)
2)β-actin探针设计
设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：
β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)
3)增强型ARMS引物设计
实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124S-F，相关参数为：Tm值55.0℃－60.0℃，GC值40.0％－60.0％，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：
下游增强型ARMS引物：
R124S-WR GCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQ ID NO:24)
R124S-MR GCTCAGCTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:25)
共用上游引物R124S-F：TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTC(SEQ ID NO:26)
4)探针设计
在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为：Tm值68.0℃－70.0℃，GC值40.0％－70.0％，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：
R124S-P探针：TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGT(SEQ ID NO:27)
5)ARMS荧光定量PCR扩增反应
Figure BDA0001147108500000141
PCR反应程序为：50℃2分钟、95℃5分钟；40个循环：95℃3秒，60℃45秒(收集荧光)。所用仪器为ABI stepone plus、SLAN。
6)实验结果：
平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.8，说明样品合格，试验结果如图16所示。
图17中角膜营养不良待检样本((R124C野生型)在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.6；在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，没有CT值，我们认为没有扩增，CT值默认为40，△Ct值＝Ct突变型-Ct野生型＝14.4，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。
图18中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本(R124S野生型)测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124S野生型。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京宏微特斯生物科技有限公司
<120> 检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试剂盒
<130> 2016
<160> 27
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agtggcttcc ccagtgtgac atg 23
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccgtggtggt gaagctgta 19
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcgtgatgga ctccggtgac ggggtc 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agccctgcca ccaagaggac 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
agccctgcca ccaagagtat 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctagcaaagg atgaggccaa cc 22
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
caaacagttg gcacatcaag gattgactt 29
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggcctcact tctccatgcg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aggcctcact tctccatgca 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccagaggcc atccctcctt c 21
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggagtcgttg gatccaccac cactcagct 29
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcagctcagc ttctccatgc g 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tcagctcagc ttctccatgc t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cacctgtaga tgtaccgtgc tc 22
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
agggtgtggt tgggctggac ccccaga 27
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agccctgcca ccaagaggac g 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
agccctgcca ccaagagtat a 21
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
caaaggatga ggccaacccg at 22
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
taaagtagtg atccctcagg gccccagca 29
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aggcctcact tctccatgcg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aggcctcact tctccatgca 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtcttctgct cctgcagccc ta 22
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ctctcaaacc tttacgagac cctgggagtc gt 32
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gctcagcttc tccatgcg 18
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gctcagcttc tccatgca 18
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ttgggctttc ccacatgcct cctc 24
<210> 27
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
taccgtgctc tctgtcagag aagggagggt gt 32

Claims (5)

1.ARMS引物在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型，其中，
所述角膜营养不良多态性位点是TGFBI基因R555W 1824C>T点突变、TGFBI基因R555Q1825G>A点突变、TGFBI基因R124H 532G>A点突变、TGFBI基因R124 L 532G>T点突变或TGFBI基因R124 S531C>A、R124C531C>T点突变中的一个或多个；
用于检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGAC(SEQID NO:4)、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTAT(SEQ ID NO:5)，和共用下游引物为C T A G C A A A G G A T G A G G C C A A C C ( S E Q I D N O : 6 ) ；和检测其的探针为CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTT(SEQ ID NO:7)；
用于检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQID NO:8)、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:9)，和共用下游引物为C C C A G A G G C C A T C C C T C C T T C ( S E Q I D N O : 1 0 ) ；和检测其的探针为GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCT(SEQ ID NO:11)；
用于检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQID NO:12)、突变型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCT(SEQ ID NO:13)，和共用上游引物为C A C C T G T A G A T G T A C C G T G C T C ( S E Q I D N O : 1 4 )；和检测其的探针为AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGA(SEQ ID NO:15)；
用于检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACG(SEQID NO:16)、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATA(SEQ ID NO:17)，和共用下游引物为CAAAGGATGAGGCCAACCCGAT(SEQ ID NO:18)；
用于检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQID NO:20)、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:21)，和共用上游引物为G T C T T C T G C T C C T G C A G C C C T A ( S E Q I D N O : 2 2 )；和检测其的探针为CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGT(SEQ ID NO:23)；和
用于检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQ IDNO:24)、突变型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:25)，和共用上游引物为T T G G G C T T T C C C A C A T G C C T C C T C ( S E Q I D N O : 2 6 )；和检测其的探针为TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGT(SEQ ID NO:27)。
2.根据权利要求1的所述用途，其特征在于，所述试剂盒进一步包括内参，所述内参为β-actin；实时荧光定量PCR中用于扩增内参的上游引物AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATG(SEQ IDNO:1) ，下游引物为CCGTGGTGGTGAAGCTGTA(SEQ ID NO:2) ；和检测其的探针为TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTC(SEQ ID NO:3)。
3.根据权利要求1的所述用途，其特征在于，针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同，除了突变位点处的碱基以外，针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物完全相同。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括在权利要求1至3任一种应用中所采用试剂，具体地，包括：
用于检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物AGCCCTGCCACCAAGAGGAC(SEQID NO:4)、用于检测TGFBI基因R555W点突变的突变型增强型ARMS引物AGCCCTGCCACCAAGAGTAT(SEQ ID NO:5)，和共用下游引物C T A G C A A A G G A T G A GG C C A A C C ( S E Q I D N O : 6 )；和检测其的探针CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTT(SEQ ID NO:7)；
用于检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQID NO:8)、用于检测TGFBI基因R124H点突变的突变型增强型ARMS引物AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:9)，和共用下游引物为C C C A G A G G C C A T C CC T C C T T C ( S E Q I D N O : 1 0 ) ；和检测其的探针GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCT(SEQ ID NO:11)；
用于检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物TCAGCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQID NO:12)、用于检测TGFBI基因R124L点突变的突变型增强型ARMS引物TCAGCTCAGCTTCTCCATGCT(SEQ ID NO:13)，和共用上游引物C A C C T G T A G A T G T AC C G T G C T C ( S E Q I D N O : 1 4 ) ；和检测其的探针AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGA(SEQ ID NO:15)；
用于检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物AGCCCTGCCACCAAGAGGACG(SEQID NO:16)、用于检测TGFBI基因R555Q点突变的突变型增强型ARMS引物AGCCCTGCCACCAAGAGTATA(SEQ ID NO:17)，和共用下游引物CAAAGGATGAGGCCAACCCGAT(SEQID NO:18)；
用于检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物AGGCCTCACTTCTCCATGCG(SEQID NO:20)、用于检测TGFBI基因R124C点突变的突变型增强型ARMS引物AGGCCTCACTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:21)，和共用上游引物G T C T T C T G C T C C T GC A G C C C T A ( S E Q I D N O : 2 2 ) ；和检测其的探针CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGT(SEQ ID NO:23)；和
用于检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物GCTCAGCTTCTCCATGCG(SEQIDNO:24)、用于检测TGFBI基因R124S点突变的突变型增强型ARMS引物GCTCAGCTTCTCCATGCA(SEQ ID NO:25)，和共用上游引物T T G G G C T T T C C C A C A T G C C T C C T C( S E Q I D N O : 2 6 ) ；和检测其的探针TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGT(SEQID NO:27)。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括：ROX校正液、dNTP、聚合酶及缓冲液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN108796062A (zh) * 2018-06-06 2018-11-13 无锡正则精准医学检验有限公司 一种检测tgfbi基因多态性的试剂盒
CN109161589A (zh) * 2018-10-07 2019-01-08 浙江数问生物技术有限公司 一种人tgfbi基因突变检测试剂盒及其检测方法
CN113999899A (zh) * 2020-07-28 2022-02-01 首都医科大学附属北京同仁医院 一种检测tgfbi基因突变的试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101251538B1 (ko) * 2009-04-17 2013-04-08 (주)아벨리노 아벨리노 각막이상증 진단용 프라이머
CN104031978B (zh) * 2013-03-06 2016-04-06 北京宏微特斯生物科技有限公司 一种基于arms荧光定量pcr检测基因突变的试剂盒和方法
WO2015073978A2 (en) * 2013-11-15 2015-05-21 Avellino Lab Usa, Inc. Methods for multiplex detection of alleles associated with ophthalmic conditions

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