KR101700623B1 - 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준 판단용 snp 마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 혈액 내 아밀라아제(amylase)의 수준 판단용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트, 마이크로 어레이 및 이를 상기 SNP 마커, 조성물 등을 이용한 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단 방법, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지의 제조방법, 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시키는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 신부전, 타액선염, 비만 또는 당뇨 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

Description

돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준 판단용 SNP 마커 및 이의 용도{Novel SNP marker for discriminating level of amylase within porcine blood and use thereof}

본 발명은 돼지의 혈액 내 아밀라아제(amylase)의 수준 판단용 SNP 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트, 마이크로 어레이 및 이를 상기 SNP 마커, 조성물 등을 이용한 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단 방법, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지의 제조방법, 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시키는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 SNP 마커를 포함하는 돼지의 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 신부전, 타액선염, 비만 또는 당뇨 질환의 진단용 조성물 및 이를 이용한 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단 방법에 관한 것이다.

약 9000년 전에 인도의 동부 지방에서 사육된 이래로, 돼지는 세계적으로 사람이 필요로 하는 단백질 섭취를 위한 가장 기본적인 가축으로 각각의 시대와 상황 및 사람들의 기호에 따라 사육되어 왔다.

또한, 돼지는 오랜 기간 동안 사료효율과 성장률을 증가시키는 방향으로 사육되어 왔으며, 이러한 결과로 스트레스에 민감한 돼지가 발생하고, 육질의 저하가 발생하고 있다. 이에 따라 돼지의 건강 상태를 개선하고 대사 장애가 없는 우량 개체를 선발하여 우량 집단을 구축하기 위한 노력이 계속되고 있다.

아밀라아제(amylase)는 소화 효소 중 하나로서 녹말을 말토스와 덱스트린으로분해하며, 췌장액, 타액, 혈액, 뇨 등에 존재하고 있는 것으로 알려져 있다. 특히 혈중 아밀라아제는 주로 췌장염, 췌장의 가성낭종, 췌장암, 등에서 상승하며, 침샘에 염증이 있을 때도 상승이 나타나, 상기 질환에 대한 마커로서도 활용되고 있다. 또한, 혈액 내 아밀라아제의 수준에 따라 높을 경우 췌장염 등이 유발될 수 있으며, 낮을 경우 대사 증후군이 유발될 수 있음이 보고된 바 있다(JOP . J. Pancreas 2005; 6(6):536-551 「 Pancreatic Hyperenzymemia: Clinical Significance and Diagnostic Approach」, Cardiovasc Diabetol. 2011; 10: 34. 「Low serum amylase in association with metabolic syndrome and diabetes: A community-based study」).

그러나, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자 또는 SNP에 대해 보고된 바 없으며, SNP를 이용하여 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단하고, 상기 SNP에서의 대립유전자형을 고정시킴으로써 혈액 내 아밀라아제의 수준을 정상 수준으로 유지시키는 것에 대해서는 보고된 바 없다.

최근 돼지의 개량 사업에 있어서 대사 장애가 없는 건강한 우량 개체를 선발하여 우량 종축 집단을 구축하기 위한 노력이 계속되고 있으며, 이에 따라 개체의 건강 상태를 조기에 판단하여 개체를 선별하기 위한 기술 개발이 필요한 실정이다.

이러한 배경하에 본 발명자들은 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단하고, 혈액 내 아밀라아제를 정상 수준으로 유지시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준에 관여하는 유전자의 SNP를 이용할 경우, 유전적으로 결정되는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단하고 이를 정상 수준으로 유지시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 조성물을 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 신부전, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 구현예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AMY2(amylase alpha 2B) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 177번째 염기가 C 또는 T이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 99번째 염기가 T 또는 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 C 이거나, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 482번째 염기가 A 또는 G 이며, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 177번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 482번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제(amylase)의 수준 판단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2(amylase alpha 2B) 유전자 유래 폴리뉴클레오티드는 돼지의 아밀라아제 수준에 관여하는 유전자의 다형성 부위를 포함하는 다형성 서열(polymorphic sequence)로서, 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 포함하는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 의미한다. 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위(polymorphic site) 중에서, 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)이라 한다. 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 구체적으로는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가질 수 있다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

또한 구체적으로, 상기 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준의 판단 대상이 되는 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 제주재래돼지와 랜드레이스의 교배 참조축군에 대하여 아밀라아제와 관련된 유전자 및 SNP 마커를 분석하였으며, 아밀라아제와 관련하여 유의성이 가장 높은 SNP는 ASGA0022387로 확인됨에 따라, 이를 기준으로 염기서열을 추가로 추출하고 서열을 분석함으로써 아밀라아제 수준에 영향을 미치는 염기 변이를 확인하였다. 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열의 177번째 염기가 C 또는 T이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 99번째 염기가 T 또는 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 C 이거나, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 482번째 염기가 A 또는 G 임에 따라 아밀라아제의 함량 차이가 나타나는 것을 확인하였다(표 3 내지 표 5).

본 발명의 용어 " SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제" 란, 유전자내 SNP가 포함된 다형성 부위(polymorphic site)에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 다형성 부위를 증폭시킬 수 있는 제제로서, 구체적으로는 SNP가 포함된 다형성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브, 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

더욱 구체적으로는 서열번호 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 SNP 마커에 결합하여 인식하는 데 사용되는 프로브는 SNP를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 상보적인 서열을 포함하며, 이에 제한되지 않으나 DNA, RNA 또는 DNA-RNA 잡종(hybrid) 형태일 수 있다. 또한, 육안으로 인식가능하도록 하기 위해 프로브의 5’또는 3’ 말단에 형광 표지인자, 방사선 표지 인자 등을 추가로 부착할 수 있다.

본 발명의 용어 “프라이머”란, 짧은 자유 3’말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드의 크기로 사용될 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

또한, 프라이머는 변형시킬 수 있으며, 예를 들어 메틸화, 캡화, 뉴클레오티드의 치환 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있을 수 있다.

본 발명에서 용어, “아밀라아제(amylase)”란, 소화 효소 중 하나로서 녹말을 가수분해하며, 췌장액, 타액, 혈액, 뇨 등에 존재한다. 또한, 혈액 내 아밀라아제의 수준이 높으면 췌장염, 타액선염 등의 췌장 질환을 유발하며, 너무 낮으면 대사장애로 비만, 당뇨 등을 유발하는 것으로 보고된 바 있다. 혈액 내 아밀라아제는 혈청 아밀라아제로도 불리며, 정상 수준에 비해 높은 수준을 나타낼 때 췌장염 등을 일으키고 낮은 수준을 나타낼 때 대사 증후군의 원인이 되는 것으로 보고된 바 있다. 본 발명에서는 혈액 내 아밀라아제 함량에 관여하는 유전자 및 SNP를 규명하여, 이를 이용하여 혈액 내 아밀라아제 수준을 판단할 뿐 아니라 이를 이용하여 건강상태가 양호한 우량 돼지를 선별하고 제조할 수 있도록 하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준에 관여하는 유전자인 AMY2 및 SNP ASGA0022387 등을 확인하였다(도 1 및 표 1). 또한, 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기 서열의 177번째 위치에서 대립유전자형이 C/C형일 때 혈액 내 아밀라아제 함량이 높게 나타나고, T/T형일 때 낮게 나타나는 것을 확인하였으며(표 3 및 도 6), 서열번호 2로 표시되는 AMY2 유전자의 엑손 3 영역에서 99번째 위치의 대립유전자형이 C/C형일 때 혈액 내 아밀라아제 함량이 높게 나타나고, T/T형일 때 낮게 나타나는 것을 확인하였으며(표 4), 3'-UTR 영역을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기 서열의 482번째 위치에서 대립유전자형이 A/A형일 때 혈액 내 아밀라아제 함량이 높게 나타나고, G/G형일 때 낮게 나타나는 것을 확인하였다(표 5).

혈액 내 아밀라아제의 함량과 췌장염, 타액선염, 대사 장애 질환 등과의 관계가 있음이 다수 보고되어 있음에 따라, 대립유전자형을 목적하는 형질로 고정시킴으로써 정상 수준의 아밀라아제가 유지될 수 있도록 할 수 있으며, 나아가 상기 유전자형으로부터 상기 질환들을 진단할 수 있는 조성물 및 방법에 적용할 수 있음은 당업자에게는 자명한 일이라 할 것이다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 조성물을 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트를 제공한다. 구체적으로, 상기 키트는 이에 제한되지는 않으나 PCR(Polymerase Chain Reaction) 키트, DNA 분석용 (예, DNA 칩) 키트일 수 있다.

본 발명의 키트는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자를 증폭시킨 후 제한효소로 절단하여 나타나는 밴드의 양상을 확인함으로써 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있다. 상기 PCR 키트는, SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드에 대해 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 등의 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PCR 키트는 PCR-RFLP(PCR-restriction fragment length polymorphism) 수행을 위한 키트일 수 있다.

본 발명에서, “PCR-RFLP”방법은 가축의 유전적 특성이나 능력 개량을 위한 다양한 DNA 분석기술 중, PCR 기술을 이용한 유전자 단편들의 다형성(Restriction Fragment length polymorphism)을 분석하는 기법으로, 특정 점 돌연변이(point mutation) 부위에 제한효소 인지부위가 존재할 경우, 각 개체의 유전자 형 차이에 따라 제한효소에 의해 절단되어 생기는 절편의 길이가 다양하게 나타나는 것을 이용하여 각 개체의 바람직한 유전자 형을 보다 신속하고 정확하게 판정하는 방법이다. 또한, PCR 키트를 이용하여 AMY2 유전자 내 엑손 3 영역의 염기의 결실 및 변이로 인한 프레임 시프트 돌연변이(frame shift mutation)를 검출함으로써 아밀라아제 수준을 판단할 수 있다.

또한, 구체적으로 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 일반적으로 편평한 고체 지지판, 전형적으로는 현미경용 슬라이드보다 크지않은 유리 표면에 핵산 종을 격자형 배열(gridded array)로 부착한 것으로, 칩 표면에 핵산이 일정하게 배열되어, DNA 칩 상의 핵산과 칩 표면에 처리된 용액 내에 포함된 상보적인 핵산 간에 다중 혼성화(hybridization) 반응이 일어나 대량 병렬 분석이 가능하도록 하는 도구로서, 이를 이용하여 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 각 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단하는 방법을 제공한다. 이때, 상기 분리된 시료의 DNA는 개체로부터 분리된 시료로부터 수득할 수 있다.

본 발명의 용어 “개체”란, 혈액 내 아밀라아제의 수준을 확인하고자 하는 대상인 돼지를 의미하며, 상기 돼지로부터 얻은 검체를 이용하여, SNP를 분석함으로써 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있다. 상기 검체로는 털, 뇨, 혈액, 각종 체액, 분리된 조직, 분리된 세포 또는 타액과 같은 시료 등으로부터 DNA를 수득할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 특히 본 발명을 이용하여 비침습적인 방법으로 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준을 조기에 판단하고 아밀라아제가 특히 높거나 낮지 않고 정상 수준의 아밀라아제 함량을 유지하는 돼지를 선별할 수 있다.

상기 (a) 단계의 DNA로부터 상기 SNP 마커의 다형성 부위를 증폭하거나 프로브와 혼성화하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR)(Wu 및 Wallace, Genomics 4, 560(1989), Landegren 등, Science 241, 1077(1988)), 전사증폭(transcription amplification)(Kwoh 등, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86, 1173(1989)) 및 자가유지 서열 복제(Guatelli 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1874(1990)) 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

상기 방법 중 (b)단계의 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allele-specifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip) 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 마이크로새틀라이트, SNP 또는 다른 종류의 다형성 마커를 포함한, 다형성 마커에서의 하나 이상의 대립유전자가 확인될 수 있다. 이와 같은 다형성 부위의 염기를 결정하는 것은 구체적으로는 SNP 칩을 통해 수행할 수 있다.

상기 용어, “SNP 칩”이란, 수십만 개의 SNP의 각 염기를 한번에 확인할 수 있는 DNA 마이크로어레이의 하나를 의미한다.

TaqMan 방법은 (1) 원하는 DNA 단편을 증폭할 수 있도록 프라이머 및 TaqMan 탐침을 설계 및 제작하는 단계; (2) 서로 다른 대립유전자의 탐침을 FAM 염료 및 VIC 염료로 표지(Applied Biosystems)하는 단계; (3) 상기 DNA를 주형으로 하고, 상기의 프라이머 및 탐침을 이용하여 PCR을 수행하는 단계; (4) 상기의 PCR 반응이 완성된 후, TaqMan 분석 플레이트를 핵산 분석기로 분석 및 확인하는 단계; 및 (5) 상기 분석결과로부터 단계 (1)의 폴리뉴클레오티드의 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.

시퀀싱 분석은 염기서열 결정을 위한 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 자동화된 유전자분석기를 이용하여 수행될 수 있다. 또한, 대립유전자 특이적 PCR은 SNP가 위치하는 염기를 3' 말단으로 하여 고안한 프라이머를 포함한 프라이머 세트로 상기 SNP가 위치하는 DNA 단편을 증폭하는 PCR 방법을 의미한다. 상기 방법의 원리는, 예를 들어, 특정 염기가 A에서 G로 치환된 경우, 상기 A를 3' 말단 염기로 포함하는 프라이머 및 적당한 크기의 DNA 단편을 증폭할 수 있는 반대 방향 프라이머를 고안하여 PCR 반응을 수행할 경우, SNP 위치의 염기가 A인 경우에는 증폭반응이 정상적으로 수행되어 원하는 위치의 밴드가 관찰되고, 상기 염기가 G로 치환된 경우에는 프라이머는 주형 DNA에 상보적으로 결합할 수 있으나, 3' 말단 쪽이 상보적 결합을 하지 못함으로써 증폭반응이 제대로 수행되지 않는 점을 이용한 것이다. DASH는 통상적인 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로는 프린스 등에 의한 방법에 의하여 수행될 수 있다.

한편, PCR 연장 분석은 먼저 SNP가 위치하는 염기를 포함하는 DNA 단편을 프라이머 쌍으로 증폭을 한 다음, 반응에 첨가된 모든 뉴클레오티드를 탈인산화시킴으로써 불활성화시키고, 여기에 SNP 특이적 연장 프라이머, dNTP 혼합물, 디디옥시뉴클레오티드, 반응 완충액 및 DNA 중합효소를 첨가하여 프라이머 연장반응을 수행함으로써 이루어진다. 이때, 연장 프라이머는 SNP가 위치하는 염기의 5' 방향의 바로 인접한 염기를 3' 말단으로 삼으며, dNTP 혼합물에는 디디옥시뉴클레오티드와 동일한 염기를 갖는 핵산이 제외되고, 상기 디디옥시뉴클레오티드는 SNP를 나타내는 염기 종류 중 하나에서 선택될 수 있다. 예를 들어, A에서 G로의 치환이 있는 경우, dGTP, dCTP 및 TTP 혼합물과 ddATP를 반응에 첨가할 경우, 상기 치환이 일어난 염기에서 프라이머는 DNA 중합효소에 의하여 연장되고, 몇 염기가 지난 후 A 염기가 최초로 나타나는 위치에서 ddATP에 의하여 프라이머 연장반응이 종결된다. 만일 상기 치환이 일어나지 않았다면, 그 위치에서 연장반응이 종결되므로, 상기 연장된 프라이머의 길이를 비교함으로써 SNP를 나타내는 염기 종류를 판별할 수 있게 된다.

이때, 검출방법으로는 연장 프라이머 또는 디디옥시뉴클레오티드를 형광 표지한 경우에는 일반적인 염기서열 결정에 사용되는 유전자 분석기(예를 들어, ABI사의 Model 3700 등)를 사용하여 형광을 검출함으로써 상기 SNP을 검출할 수 있으며, 무-표지된 연장 프라이머 및 디디옥시뉴클레오티드를 사용할 경우에는 MALDI-TOF(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight) 기법을 이용하여 분자량을 측정함으로써 상기 SNP를 검출할 수 있다.

구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레티드에서, 다형성 부위인 177번째 염기의 대립유전자가 모두 C 이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 98번째 염기가 결실되고 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 C 이거나 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 482번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 경우 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준이 증가된 것으로 판단할 수 있다.

또한 구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레티드에서, 다형성 부위인 177번째 염기의 대립유전자가 모두 T 이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 T이거나, 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 482번째 염기의 대립유전자가 모두 G인 경우 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준이 감소된 것으로 판단할 수 있다. 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자의 SNP형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 177번째 염기의 대립유전자를 C/T형으로 고정시키거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기의 대립유전자를 T/C형으로 고정시키거나, 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 482번째 염기의 대립유전자를 A/G형으로 고정시키는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자의 SNP형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 177번째 염기의 대립유전자를 C/T형으로 고정시키거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기의 대립유전자를 T/C형으로 고정시키거나, 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 482번째 염기의 대립유전자를 A/G형으로 고정시키는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시키는 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행될 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 177번째 위치, 서열번호 2로 표시한 엑손 3 영역의 98번째 염기가 결실되고 99번째 위치 또는 3’-UTR을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 482번째 위치에서의 대립유전자 형에 따라 아밀라아제 함량이 다르게 나타남을 확인하였다. 구체적으로, 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 177번째 위치의 대립유전자형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하였으며(표 3), 서열번호 2로 표시한 엑손 3 영역의 98번째 염기가 결실되고 99번째 위치에서의 대립유전자 형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하였고(표 4), 3’-UTR을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 482번째 위치에서의 대립유전자 형이 A/A형일 때 평균 아밀라아제 함량이 높게 나타나고, G/G형일 때 평균 아밀라아제 함량이 낮게 나타나는 것을 확인하였다(표 5). 또한, 상기 각 위치에서 대립유전자형이 각각 C/T형, T/C형 또는 A/G형인 경우 평균 수준의 아밀라아제 함량을 나타내는 것을 알 수 있었다.

상기 결과를 통해 AMY2 유전자 내 혈액 내 아밀라아제 수준에 관여하는 SNP 위치의 염기를 고정시킴으로써 혈액 내 아밀라아제 수준이 평균 수준을 유지할 수 있도록 하여, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지를 제조할 수 있으며, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 177번째 염기가 C 또는 T이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 99번째 염기가 T 또는 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 C 이거나, 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 482번째 염기가 A 또는 G 이며, 상기 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 177번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 482번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍, 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 조성물일 수 있다.

상기 검출 또는 증폭할 수 있는 제제, 프라이머 등은 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 구체적인 일 구현예는 상기 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 신부전, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단용 조성물을 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 검체 시료 내 AMY2 유전자 내 특정 위치의 SNP를 검출할 수 있는 제제 뿐 아니라, 상기 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 분석용(예, DNA 칩)키트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는, (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 1 내지 서열번호 3 중 어느 하나의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 신부전, 타액선염, 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환의 진단 방법을 제공한다.

구체적으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 177번째 염기의 대립유전자가 모두 C 이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 98번째 염기가 결실되고 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 C 이거나 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 482번째 염기의 대립유전자가 모두 A인 경우 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염 또는 타액선염으로 진단할 수 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서, 다형성 부위인 177번째 염기의 대립유전자가 모두 T 이거나, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 T 이거나, 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 482번째 염기의 대립유전자가 모두 G인 경우 신부전, 간염, 간경변, 비만 또는 당뇨 질환으로 진단할 수 있다.

상기 개체, 다형성 부위는 앞서 설명한 바와 같다.

혈청 아밀라아제라고도 불리는 혈액 내 아밀라아제가 정상 수준을 유지하지 못하고 정상보다 높은 수준을 나타내거나, 낮은 수준을 나타낼 때, 각각의 경우에 따른 질환이 발생하는 것으로 보고된 바 있다. 구체적으로, 혈액 내 아밀라아제가 정상 보다 높은 수준을 나타내는 경우, 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염, 타액선염을 유발시키는 것으로 보고된 바 있다(JOP . J. Pancreas 2005; 6(6):536-551「 Pancreatic Hyperenzymemia: Clinical Significance and Diagnostic Approach」). 상기 췌장염은 만성 췌장염 및 급성 췌장염, 구체적으로는 급성 췌장염을 포함한다.

본 발명에서 용어, "고아밀라아제혈증(hyperamylasemia)"은 혈액 내의 아밀라아제가 증가되어 있는 것을 말하며, 급성 혹은 만성 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장 손상 등과 같은 췌장 질환과 함께 나타날 수 있다.

본 발명에서 용어, "마크로아밀라아제혈증(macroamylasemia)"은 혈액 내 아밀라아제가 혈중 단백질이나 다당류, 면역 글로불린과 결합하여 복합체를 형성하여 크기가 커짐으로써 신장에서 여과가 제한되어 발생하는 질환을 의미한다.

또한, 혈액 내 아밀라아제가 정상보다 낮은 수준을 나타낼 때 대사 증후군 및 당뇨를 유발하는 것으로 보고된 바 있다(Cardiovasc Diabetol. 2011; 10: 34. 「Low serum amylase in association with metabolic syndrome and diabetes: A community-based study」). 구체적으로, 비만, 당뇨, 신부전, 간손상을 일으킬 수 있으며, 더욱 구체적으로 상기 간손상은 간염, 간경변일 수 있다.

본 발명 일 실시예에서는 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 177번째 위치의 대립유전자형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하였으며(표 3), 서열번호 2로 표시한 엑손 3 영역의 98번째 염기가 결실되고 99번째 위치에서의 대립유전자 형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하였고(표 4), 3’-UTR을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 482번째 위치에서의 대립유전자 형이 A/A형일 때 평균 아밀라아제 함량이 높게 나타나고, G/G형일 때 평균 아밀라아제 함량이 낮게 나타나는 것을 확인하였다(표 5).

상기와 같은 결과로부터 혈액 내 아밀라아제 함량에 영향을 미치는 유전자 내 각 변이 위치에서의 유전자형을 검출함으로써 조기에 혈액 내 아밀라아제의 수준이 높고 낮음을 판단할 수 있으며, 이로부터 혈액 내 아밀라아제가 높은 수준을 나타낼 때 고아밀라아제혈증, 마크로아밀라아제혈증, 췌장염, 췌장 가성낭종, 췌장암, 담낭염 또는 타액선염이 유도될 수 있음을 진단할 수 있으며, 혈액 내 아밀라아제가 낮은 수준을 나타낼 때 비만, 당뇨, 신부전 또는 간손상이 유도될 수 있음을 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 177번째 염기, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기 또는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 482번째 염기에 위치한, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 SNP 마커를 제공한다. 구체적으로, 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종일 수 있다.

본 발명의 SNP 마커와 관련하여, 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 177번째 염기가 C 또는 T 이거나, 서열번호 2로 표시한 엑손 3 영역의 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 T 또는 C 이거나 3'-UTR을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 482번째 염기가 A 또는 G 임에 따라 아밀라아제의 함량이 다르게 나타남을 실시예를 통해 확인하였으며, 특히 상기 위치에서 나타나는 대립유전자형에 따라 나타나는 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있다. 나아가, 특정 염기를 고정시킴으로써 아밀라아제를 정상 수준으로 유지시킬 수 있음으로써 건강상태가 양호한 돼지를 제조하고 선별하는데 활용할 수 있다. 또한, 적용하는 SNP 마커의 수가 증가할수록 정확도가 높아질 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 구현예는 상기 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 마이크로어레이를 제공한다. 상기 마이크로어레이는 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 프로브 폴리뉴클레오티드에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어진다.

프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하여 마이크로어레이를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 프로브 폴리뉴클레오티드는 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 본 발명의 프로브는 대립유전자에 특이적인 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립유전자간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립유전자 중 하나에만 혼성화 하도록 충분히 엄격하면 바람직하다. 이렇게 함으로써 다른 대립유전자 형태 간에 좋은 혼성화 차이를 유발할 수 있다. 본 발명의 상기 프로브는 대립유전자를 검출하여 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단 방법 등에 사용될 수 있다. 상기 판단 방법에는 서던 블롯트 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, DNA 칩을 이용한 방법에서 DNA 칩의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

본 발명의 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단과 연관된 프로브 폴리뉴클레오티드를 기판상에 고정화하는 과정도 또한 이러한 종래 기술을 사용하여 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질 예를 들면 Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.

본 발명은 돼지 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있는 SNP 마커를 규명하고, 이를 이용하여 돼지의 건강 상태에 영향을 미치는 아밀라아제 함량을 객관적으로 평가할 수 있는 수단으로 사용될 수 있도록 할 뿐 아니라 아밀라아제 함량을 조절하여 대사 장애가 없는 우량 돼지를 제조할 수 있도록 한 것으로서 효과적인 육종 개량을 도모할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 제주재래돼지와 랜드레이스 교배 참조축군에서 GWAS(genome-wide association study) 분석을 통해 혈액 내 아밀라아제 수준에 관여하는 유전자 좌위를 나타낸 것이다.
도 2는 QTL 영역 내 126.3M 위치의 AMY2(amylase alpha 2B) 유전자를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 AMY2(amylase alpha 2B) 유전자의 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 돼지 AMY2 유전자의 인트론 1에서의 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 혈액 내 아밀라아제 함량과 연관된 돼지 AMY2 유전자의 인트론 1을 포함하는 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 돼지 AMY2 유전자의 인트론 1의 염기 변이에 의한 대립유전자 형의 차이에 따른 혈액 내 아밀라아제 함량의 차이를 나타낸 것이다.
도 7은 돼지 AMY2 유전자의 엑손 3에서의 변이를 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 혈액 내 아밀라아제 함량과 연관된 돼지 AMY2 유전자의 엑손 3에서의 98번째 염기의 결실 및 변이 가능한 99번째 염기를 표시한 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 혈액 내 아밀라아제 함량과 연관된 돼지 AMY2 유전자의 3’-UTR을 포함하는 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 돼지 AMY2 유전자의 3’-UTR을 포함하는 서열번호 3의 염기서열에서 482번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 A/A형, A/G형 및 G/G형으로 나타남을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. GWAS ( genome - wise association study )를 통한 돼지 혈청 내 아밀라아제 함량에 대한 유전자 좌위 분석

제주재래돼지와 랜드레이스 교배 참조축군에서 혈액 내 아밀라아제 함량에 대한 초위성체 마커를 이용한 QTL 분석과 대용량 SNP 칩을 활용한 GWAS(genome-wide association study) 분석을 수행하였다.

구체적으로, illumina에서 상용으로 시판하는 60k SNP Beadchip을 돼지 1100두를 대상으로 유전자형을 판독하였으며, 돼지의 모든 염색체를 대상으로 유전자형을 판독하고, 이 유전자형을 가지고 표현형과 연관성 분석에 활용하였다. 이 때, plink 프로그램을 활용하여 각 염색체에 할당되어 있는 SNP와 표현형과의 연관성 분석에 의해 결과를 도출하였다.

GWAS 분석을 통해, 혈액 내 아밀라아제 함량 관련 유전자가 4번 염색체 말단에 존재하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

또한, 돼지 혈액 내 아밀라아제 함량 관련 유의성이 높은 상위 20개의 SNP 리스트를 추출하였을 때 하기 표 1과 같이 나타났다.

혈액 내 아밀라아제 함량에 관여하는 유전자 좌위는 돼지 4번 염색체의 126.7M 위치에서 가장 높은 SNP를 확인하였으며, 상위 20개의 SNP를 추출하였을 때 120M 내지 127M 영역에서 나타나는 것을 확인하였다. 이 중 혈액 내 아밀라아제 함량은 ASGA0022387에서 가장 높은 유의성을 나타내었으며, 위치는 126.7M임을 알 수 있었다.

또한, QTL영역 내 126.3M위치에 AMY2(amylase alpha 2B)유전자가 확인됨에 따라 이를 후보유전자로 선정하여 상기 유전자의 mRNA 염기서열 완전 해독을 통해 돼지 AMY2 유전자는 511개의 아미노산으로 구성되어 있고, 엑손(exon)은 모두 10개로 구성되어 있는 것을 확인하였다(도 2 및 도 3). 나아가 인트론 1(intron 1)영역, 엑손 3(exon 3) 영역 및 3’-UTR 영역에서 염기서열 변이가 나타나는 것을 확인하였다.

실시예 2. 돼지 AMY2 유전자 내 인트론 1에서의 변이에 따른 아밀라아제의 함량 변화 확인

제주재래돼지와 랜드레이스 교배 참조축군에서 혈액 내 아밀라아제 함량과 관련하여 유의성이 가장 높은 SNP는 ASGA0022387였으며 126.7M 위치에서 가장 유의서이 높았다. 주변 유전자를 스크린한 결과 126.3M 위치에 AMY2(amylase alpha 2B)가 확인되어 측정한 표현형인 아밀라제 함량과 유전자 이름이 일치함에 따라 핵심유전자를 선정하여 RNA서열 및 DNA 서열을 분석하여 염기서열을 해독하였다. 염기서열(서열번호 1)은 도 5에 나타난 바와 같다.

GenBank에 등록되어 있는 AMY2 유전자의 염기서열을 주형으로 하여, 인트론 1에서의 유전자형과 아밀라아제 함량과의 연관성을 판단하기 위해 유전자 증폭 프라이머를 제작하였다.

정방향 프라이머(AMY2_int1_F): 5’-GGT-TGA-CAT-TGC-TCT-TGA-ATG-TG-3’(서열번호 4)

역방향 프라이머(AMY2_int1_R): 5’- biotin-AGC-GGA-AAT-GTC-CTG-CTT-AAA-A- 3’(서열번호 5)

AMY2 유전자 내 인트론 1의 서열(AMY2_int1_Seq): 5’-TGC-CGT-GCT-TAG -AGT-AAA-AGG-3’(서열번호 6)

도 5에 나타난 서열 중 붉은색 굵은글씨로 표시한 부분은 프라이머 위치를 나타낸 것이며, 적색으로 기재한 부분은 근섬유 유형을 판단하기 위한 염기변이 부분([C/T])으로서, 인트론 1의 위치는 초록색 밑줄 친 글씨로 표시하였다.

상기와 같이 나타난 유전자형의 변이에 따른 혈액 내 아밀라아제의 함량에 대해 분석하였다. 그 결과, 대립유전자 빈도(allele frequency)가 하기 표 2와 같이 나타났다.

또한, 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기 서열에서의 유전자형에 따른 평균 아밀라아제 함량을 조사한 결과, 대립유전자 형이 C/C형일 때 혈액 내 아밀라아제 함량이 2806.19±1033.07 U/L로 높게 나타났으며, 대립유전자 형이 T/T일 때 615.55±501.07 U/L로 낮게 나타난 것을 알 수 있었다(표 3 및 도 6).

상기 결과로부터 도 5에 나타난 서열번호 1의 염기서열의 177번째 염기가 C 또는 T 임에 따라 나타나는 대립유전자 형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하여, 상기 위치의 염기 변이에 따라 혈액 내 아밀라아제의 함량이 달라지게 됨을 확인하였다.

실시예 3. 돼지 AMY2 유전자 내 엑손 3에서의 변이에 따른 아밀라아제의 함량 변화 확인

하기 프라이머를 이용하여 시퀀싱을 통해 엑손 3에서의 프레임 시프트 돌연변이(frame shift mutation)을 검출하였다.

정방향 프라이머(AMY2_E3F): 5’- biotin-TGA-AAT-GGA-ACC-TTT-GAC-TTT-CAG-3’(서열번호 7)

역방향 프라이머(AMY2_E3R): 5’-TGC-TGA-GAA-GCA-CAG-ATA-GTT-CTT-G-3’(서열번호 8)

도 8 내의 붉은색 글씨로 표시된 부분이 엑손 3 영역(서열번호 2)으로, 분석용 정방향 프라이머는 인트론 2 영역에서 제작하였으며, 역방향 프라이머는 인트론 3 영역에서 제작하였다. 상기 프라이머를 이용한 분석을 통하여, 엑손 3 영역에서의 98번째 염기가 결실되고, 99번째 염기가 T 또는 C로 변이되어 나타남을 알 수 있었다.

상기와 같이 나타난 돼지 AMY2 유전자의 엑손 3 영역에서의 유전자형에 따른 평균 아밀라아제 함량을 조사한 결과, 99번째 염기 변이에 따른 대립유전자 형이 C/C형일 때 3022.03±967.76 U/L로 평균 아밀라아제 함량이 높게 나타났으며, 대립유전자 형이 T/T형일 때 920.39±920.58 U/L로 평균 아밀라아제 함량이 낮게 나타나는 것을 알 수 있었다(표 4).

상기 결과로부터 서열번호 2의 엑손 3의 98번째 염기가 T 또는 C 임에 따라 나타나는 대립유전자 형이 C/C형 일 때 아밀라아제 함량이 높고, T/T형일 때 아밀라아제 함량이 낮게 나타남을 확인하여, 상기 위치의 염기 변이에 따라 혈액 내 아밀라아제의 함량이 달라지게 됨을 알 수 있었다.

실시예 4. 돼지 AMY2 유전자 내 3'- UTR 영역에서의 변이에 따른 아밀라아제의 함량 변화 확인

Pyro-sequencer를 이용한 유전자형 분석을 수행하여 상기 돼지 AMY2 유전자 내 3’-UTR 영역에서의 염기 변이를 검출할 수 있는 프라이머를 다음과 같이 제작하였다.

정방향 프라이머(AMY2_3UF): 5’-TCG-CAA-ACA-ACA-GTT-TGT-CAG-3’(서열번호 9)

역방향 프라이머(AMY2_3UR): 5’-Biotin-AAT-AAA-CCA-TGA-AAG-GGC-CTA-3’(서열번호 10)

AMY2 유전자 내 3’-UTR 영역의 서열(AMY2_3U_seq): 5’- GGC-CAT-GAA-CAC-AAT-CTG-CC-3’ (서열번호 11)

도 9에 나타난 서열번호 3의 염기서열 중 붉은색 글씨로 표시된 부분은 엑손 10의 영역이며, 마지막 TAA는 종결코돈(stop codon)을 나타낸 것이다. 종결 코돈 이후의 3’-UTR 영역에서의 분석용 프라이머는 도 9 내에 밑줄친 파란 글씨로 표시하였다.

상기 프라이머를 이용한 파이로-시퀀싱(pyro-sequencing) 분석 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 서열번호 3의 염기서열에서 482번째 염기의 변이가 A 또는 G로 나타남에 따라 대립유전자형이 A/A형, A/G형 및 G/G형으로 각각 나타나는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명자들은 돼지 AMY2 유전자의 3’-UTR 영역에서의 유전자형에 따른 평균 아밀라아제 함량을 조사하였으며, 그 결과 482번째 염기의 변이에 따른 대립유전자 형이 A/A형일 때 2735.2±1007.9 U/L로 평균 아밀라아제 함량이 높게 나타났으며, 대립유전자 형이 G/G형일 때 98.6±175.5 U/L로 평균 아밀라아제 함량이 낮게 나타나는 것을 알 수 있었다(표 5).

특히 참조축군 2세대 자손 1080두에 대한 전체 평균은 2538U이나 유전자형에 따른 분포를 살펴보면 A/A 유전자형은 2735U, A/G 유전자형은 1861U, G/G 유전자형은 98.6U으로 유전자형에 따른 아밀라아제 함량 차이가 큰 것을 알 수 있었다.

상기와 같은 결과들로부터 인트론 1 영역을 포함하는 서열번호 1로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 177번째 염기가 C 또는 T 이거나, 서열번호 2로 표시한 엑손 3 영역의 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 T 또는 C 이거나 3’-UTR을 포함하는 서열번호 3으로 표시한 돼지 AMY2 유전자의 염기서열에서 482번째 염기가 A 또는 G 임에 따라 아밀라아제의 함량이 다르게 나타남을 알 수 있었다.

또한, 돼지 AMY2 유전자 내에서 상기 위치에서의 대립유전자형을 분석하여 돼지 혈액 내 아밀라아제의 수준을 판단할 수 있으며, 나아가 특정 염기를 고정시킴으로써 아밀라아제를 정상 수준으로 유지시킬 수 있음으로써 건강상태가 양호한 돼지를 제조하고 선별하는데 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Novel SNP marker for discriminating level of amylase within porcine blood and use thereof <130> KPA140972-KR <160> 11 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 400 <212> DNA <213> porcine <220> <221> gene <222> (1)..(400) <223> Y= C or T <400> 1 agtatgcccc acaaacccag tctggacgaa cgtctattgt ccatctgttt gaatggcgct 60 gggttgacat tgctcttgaa tgtgagcggt atttgggccc caaaggattt ggaggggtac 120 aggtgggtat ggttcgcagt ataaattgga gattttgccg tgcttagagt aaaaggyatt 180 gcgatctgtg tctgtgaagc tgggacgtta gttcacaggt taagtaggcg aagtaaaaca 240 gttttctgaa gaagaaacac acgtgaaatt gttggcaact cactgtttta tttctaatac 300 catatttttt aagcaggaca tttccgctgt gatattgata ttcttacctg gttgtaaaga 360 acggtggcag catatacaaa gattcagaaa agaaaaaaat 400 <210> 2 <211> 198 <212> DNA <213> porcine <220> <221> gene <222> (1)..(198) <223> Y= C or T <400> 2 gtgcgtatat atgtggatgc tgtcattaat catatgtgtg gaagtggtgc agctgcagga 60 acgggcacca cttgtggaag ttattgcaac cctggaaaya gggagtttcc agcagtccca 120 tactctgctt gggattttaa cgatggtaaa tgtaaaactg caagtggagg aatcgagagc 180 tataatgatc cttatcaa 198 <210> 3 <211> 656 <212> DNA <213> porcine <220> <221> gene <222> (1)..(656) <223> R= G or A <400> 3 gcaattatct tcaactttgc aaactggtct tcctggtggc acatactgtg atgttatctc 60 tggagataaa gttggtaaca gttgtacagg aattaaagtc tatgtttcca gtgatggcac 120 agctcagttt tctattagta actctgctga agatccattt attgcaattc atgctgaatc 180 caaattgtaa aatttgaatt aaatacatct tccaagagca ataagaagtg tttgtttcct 240 ttctttatgt atgcgacata taacttccta caattcatta gtttttggta aaagctatca 300 tcagcaataa acttggaaag ctcagaaaag catgaaaatg acatatatga ttataagatg 360 atcgcaaaca acagtttgtc aggtggcaga agactcacat tgacctcttt gtcaaaaaag 420 tttccacgaa ctcagagaag catgctgaca agtatttttt tggccatgaa cacaatctgc 480 cragctgtgt ctctctcatg tgtgcctgta tttcttccgt aaggtgtttc taacccttgg 540 gtaggggtag ctgcttttat gatgagtccc atacaaaggt ataaggtctg ggtgtttttc 600 acaatatata ggccctttca tggtttatta ggtaaaacaa taaaagacac taaaat 656 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 intron1 forward primer <400> 4 ggttgacatt gctcttgaat gtg 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 intron1 reverse primer <400> 5 agcggaaatg tcctgcttaa aa 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> porcine <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> AMY2 Intron1 <400> 6 tgccgtgctt agagtaaaag g 21 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 exon3 forward primer <400> 7 tgaaatggaa cctttgactt tcag 24 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 exon3 reverse primer <400> 8 tgctgagaag cacagatagt tcttg 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 3'UTR forward primer <400> 9 tcgcaaacaa cagtttgtca g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AMY2 3'UTR reverse primer <400> 10 aataaaccat gaaagggcct a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> porcine <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> AMY2 3'-UTR <400> 11 ggccatgaac acaatctgcc 20

Claims (20)

1. 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 99번째 염기가 T 또는 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 C 이며,
   상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제(amylase)의 수준 판단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종인, 조성물.
   
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 키트.
   
5. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단 방법.
   
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 98번째 염기가 결실되고 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 C 인 경우 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준이 증가된 것으로 판단하는 것인, 방법.
   
7. 제5항에 있어서,
   서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 T 인 경우 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준이 감소된 것으로 판단하는 것인, 방법.
   
8. 제5항에 있어서, 상기 돼지는 제주재래돼지, 랜드레이스 또는 제주재래돼지 및 랜드레이스의 교잡종인, 방법.
   
9. 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자의 SNP형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기의 대립유전자를 T/C형 으로 고정시키는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시킨 돼지의 제조방법.
   
10. 제9항에 있어서,
    상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 방법.
    
11. 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준에 관여하는 유전자의 SNP형질을 고정시키는 단계로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기의 대립유전자를 T/C형으로 고정시키는 단계를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준을 정상 돼지의 혈액 내 아밀라아제 수준으로 유지시키는 방법.
    
12. 제11항에 있어서,
    상기 SNP 형질을 고정시키는 단계는 SNP 형질을 모두 보유하는 개체를 교배시켜서, 목적하는 형질을 가지는 개체를 선발함에 의해 수행되는 것인, 방법.
    
13. 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드에서 99번째 염기가 T 또는 98번째 염기가 결실되고 99번째 염기가 C 이며,
    상기 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 AMY2 유전자 유래 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기를 포함하는 5 내지 1,000개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는, 돼지의 고아밀라아제혈증 또는 마크로아밀라아제혈증 질환의 진단용 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킬 수 있는 서열번호 7 또는 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는 것인, 조성물.
    
15. 제13항의 조성물을 포함하는, 돼지의 고아밀라아제혈증 또는 마크로아밀라아제혈증 질환의 진단용 키트.
    
16. (a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드의 다형성 부위(polymorphic site)를 증폭시키는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 증폭된 다형성 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 돼지의 고아밀라아제혈증 또는 마크로아밀라아제혈증 질환의 진단 방법.
    
17. 제16항에 있어서,
    서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드에서 98번째 염기가 결실되고 다형성 부위인 99번째 염기의 대립유전자가 모두 C 인 경우 고아밀라아제혈증 또는 마크로아밀라아제혈증으로 진단하는 것인, 방법.
    
18. 삭제
19. 삭제
20. 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 99번째 염기에 위치한, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 SNP 마커를 포함하는, 돼지의 혈액 내 아밀라아제의 수준 판단용 마이크로어레이.

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