KR101995835B1

KR101995835B1 - Elovl5 유전자를 이용한 제2형 당뇨병 진단용 조성물 및 방법

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Publication number: KR101995835B1
Application number: KR1020180112620A
Authority: KR
Inventors: 황주연; 이혜자; 이효정; 고민진; 장한별; 김봉조; 박상익
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2018-09-20
Filing date: 2018-09-20
Publication date: 2019-07-08

Abstract

본 발명은 제2형 당뇨병의 효과적인 진단을 위한 신규 바이오마커로서의 ELOVL5(ELOVL fatty acid elongase 5) 유전자에 관한 것으로, ELOVL5 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정함으로써 제2형 당뇨병을 조기에 진단할 수 있으므로 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

ELOVL5 유전자를 이용한 제2형 당뇨병 진단용 조성물 및 방법 {Composition and method for diagnosing type 2 diabetes using ELOVL fatty acid elongase 5 gene}

본 발명은 제2형 당뇨병의 진단을 위한 신규 바이오마커에 관한 것으로, 구체적으로는 ELOVL5(ELOVL fatty acid elongase 5) 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정함으로써 제2형 당뇨병을 진단하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

제2형　당뇨병(Type 2 Diabetes)은 전체　당뇨병 환자의 90 ~ 95%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 제2형　당뇨병은 체내에서 인슐린은 생산되지만, 인슐린의 양이 비정상적이거나, 인슐린에 대한 민감도(sensitivity)가 낮은 사람들에게서 발병하는데, 혈액 내 혈당 수준의 변이가 크게 나타나는 증세를 나타낸다. 이는 인슐린의 이상으로 인해 혈액 내의 포도당을 세포 내로 이동시킬 수 없기 때문에 음식물로부터 에너지를 얻는데 어려움이 생기는 것으로 알려져 있다.

제2형　당뇨병의 발병에는 유전적 요인이 있는 것으로 알려져 있고, 그 외의 위험인자로는 45세 이상의 나이,　당뇨병에 대한 가족력, 과체중, 고혈압 및 콜레스테롤 수준 등을 들 수 있다.

현재　당뇨병의 진단은 주로 공복시의 혈당치 (FSB: fasting blood glucose) 시험, 및　경구　포도당 부하시험 (OGTT: oral glucose tolerance test) 등을 통해 질병에 의한 표현형의 변화, 즉 혈당량을 측정하는 방법으로 이루어지고 있다(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases of the National Institutes of Health, http://www.niddk.nih.gov, 2003).

제2형　당뇨병으로 진단되면 운동 및 식이 습관의 변화, 체중조절, 및 각종 약물 치료 등을 통해 치료하거나　당뇨병의 진행 속도를 늦출 수 있기 때문에 조기 진단의 필요성이 매우 높은 질병이라 할 수 있다. 밀레니움 파마슈니컬스(Millenium Pharmaceuticals) 사에서 HNF1 유전자에 있는 유전자형의 변이들을 탐지함으로써 제2형　당뇨병의 진단 및 예측이 가능하다고 발표하였고(PR Newswire, Sept 1, 1998), 시쿼넘(Sequenom) 사에서는 FOXA2 (HNF3β) 유전자가 제2형　당뇨병의 발병과 높은 연관이 있다고 발표한 바 있다(PR Newswire, Oct 28, 2003).

이와 같이 몇몇 유전자들이 제2형　당뇨병의 발병과 연관이 있다고 보고되고 있지만, 일부 염색체 상의 소수의 특정 유전자에만 연구가 집중되어 있고 주로 특정 인구집단을 대상으로 실험한 결과에 관한 것이다. 이에 따라 인종에 따라 다른 결과가 나타날 가능성이 있고, 제2형　당뇨병의 원인 유전자가 모두 밝혀진 것은 아니기 때문에 제2형　당뇨병을 진단하는 방법이 많지 않은 상황이다.

한편, 후성 유전학은　DNA　염기서열의 변화를 초래하지 않고 유전자 발현의 조절에 변화가 일어나는 현상에 관한 것이다. 특히 DNA 메틸화는 가장 연구가 많이 된 포유류 내 후성적 변이로서, 후성 유전학의 중요한 요인으로 DNA 메틸화, 마이크로 RNA, 히스톤 단백질의　메틸화 또는 아세틸화, 뉴클레오솜 위치결정 등이 알려져 있다. 후성적 과정에 대한 조절 이상은 유전자 기능 변이 및 종양 세포로의 변화를 초래할 수 있다.

DNA 메틸화는 인체 질환내 전사 유전자 발현억제와 연관되어 있는 것으로 알려져 있고, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 여러 질병을 진단하는 방법들이 다양하게 제시되고 있다. DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 아일랜드(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단(gene silencing)되는 것으로, 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이다.

암을 포함한 다양한 질병들에서 CpG 아일랜드에서의 이러한 비정상적인 메틸화/탈메틸화가 보고되었으며, 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진단에 사용하려는 시도가 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M.　et al., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M.　et al., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A.　et al.,　Gastroenterol., 119:1219, 2000).

많은 연구들에 의하여 DNA 메틸화가 종양의 발달과 이형에 연관되어 있다는 것이 알려져 왔으나, DNA 메틸화가 제2형 당뇨병의 발병과 연관되어 있는지 여부와 제2형 당뇨병 환자의 전체 유전자 DNA 메틸화 변이에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 보다 효과적으로 제2형 당뇨병을 진단할 수 있는 DNA 메틸화 마커가 요구된다.

대한민국 등록특허 제10-1860238호 대한민국 공개특허 제10-1573467호

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명에서는 ELOVL5 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정함으로써 제2형 당뇨병을 진단할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 효과적으로 제2형 당뇨병을 진단할 수 있는 ELOVL5 유전자 마커를 이용한 제2형 당뇨병 진단용 조성물 및 진단 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 ELOVL5(ELOVL Fatty Acid Elongase 5) 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정하는 제제를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단용 조성물에 관한 것이다.

구체적으로 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는, (a) 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소; (b) 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및　(c) 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 메틸화 민감성 제한효소는　사이토신(cytosine)과 구아닌(guanine) 인식부위(CG 인식분위)를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 SmaI,　SacII,　EagI,　HpaII,　MspI,　BssHII,　BstUI 또는　NotI일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 ELOVL5(ELOVL Fatty Acid Elongase 5) 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제2형 당뇨병의 진단 방법에 관한 것이다.

구체적으로 본 발명은 (1) 시료에서 DNA를 수득하는 단계; (2) 상기 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (3) 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하는 증폭시키는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병의 진단 방법에 관한 것이다.

상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 지방조직 또는 췌장조직일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 ELOVL5 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정함으로써 제2형 당뇨병을 조기에 진단할 수 있으므로 제2형 당뇨병의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 동일인 지방조직으로부터 분리된 지방전구세포 및 지방세포의 DNA 메틸레이션 차이를 나타낸 PCA plot이다.
도 2는 당뇨환자의 지방조직으로부터 분리된 지방전구세포군과 지방세포군 간 ELOVL5 유전자 발현 차이분석 결과이다.
도 3은 지방전구세포 및 지방세포 전사체의 계층적 클러스터링 계통도(hierarchical clustering dendogram)이다.
도 4는 당뇨환자 및 정상인의 pancreatic islet에서의 GEO(Gene Expression Omnibus) 프로파일을 나타낸 것이다.

본 발명은 ELOVL5(ELOVL fatty acid elongase 5) 유전자의 CpG 부위의 메틸화를 측정함으로써 제2형 당뇨병을 진단하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "메틸화" 또는 “메틸레이션”은 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 의미한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화는 ELOVL5 유전자의 CpG 부위의 사이토신에서 발생하는 메틸화를 의미한다.

메틸화가 발생한 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 상기 유전자의 발현이 억제되며, 반대로 비메틸화 또는 저메틸화가 발생하는 경우 상기 유전자의 발현이 증가하게 된다.

포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T에 추가하여, 사이토신 고리의 5번 탄소에 메틸기가 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이 존재한다. 본 발명의 CpG는 유전자에서 사이토신(cytosine)과 구아닌(guanine)이 연결되어 있는 부위를 의미한다. 메틸화는 CpG의 사이토신에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 유전자의 발현이 억제된다. 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후생유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.

ELOVL5 유전자의 CpG 부위란, 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 유전자는 인핸서(Enhancer) 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터(terminator) 영역 등을 포함하므로, ELOVL5 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 인핸서 영역, 단백질 코딩 영역 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다.

본 발명에서 ELOVL5 유전자(cg 18681426)의 CpG 부위의 메틸화를 측정하는 것은, 6번 염색체에서 서열번호 1의 61번째 염기의 유전자형이 “C” 인 경우, 해당 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미한다. 시퀀스의 61번째 염기의 유전자형이 “C” 인 경우를 서열번호 1로 나타내었다.

본 발명에서, ELOVL5 유전자의 CpG 부위의 메틸화를 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, ELOVL5 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(국제공개공보 제2001/26536호 및 미국출원 제2003/0148326호).

또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면,　SmaI,　SacII,　EagI,　HpaII,　MspI,　BssHII,　BstUI,　NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 사이토신에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "메틸화의 측정"은 ELOVL5 유전자의 CpG 부위의 메틸화를 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적 PCR (methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR (real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

ELVOL5 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화를 측정하는 대표적인 방법으로, 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 ELOVL5 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 같을 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다.

본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않은 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

본 발명은 ELOVL5 유전자의 CpG부위의 메틸화를 측정하는 것을 특징으로 하는, 제2형 당뇨병의 진단 방법에 대한 것이다.

구체적으로, 본 발명은 (1) 시료에서 DNA를 수득하는 단계; (2) 상기 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및 (3) 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하는 증폭시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단 방법에 관한 것이다.

상기 (1) 단계에서 시료는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 혈액, 지방조직 또는 췌장조직일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

먼저, 환자로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화를 측정하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 (2) 단계에서 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 특정 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

또한, 상기 (2) 단계에서 메틸화 민감성 제한효소는 상기에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소는　사이토신(cytosine)과 구아닌(guanine) 인식부위(CG 인식분위)를 포함할 수 있으며, 예를 들면,　SmaI,　SacII,　EagI,　HpaII,　MspI,　BssHII,　BstUI,　NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

상기 (3) 단계에서 증폭은 통상적인 PCR 방법에 의해 수행될 수 있다. 이때 사용되는 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않은 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머일 수 있다.

ELOVL5 유전자의 CpG 부위의 메틸화를 측정하는 방법은, 상기 (3) 단계에서 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 (3) 단계에서 증폭된 결과물의 존부는 당업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 상기 (3) 단계에서 사용한 두 종류의 프라이머, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 또한, 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, ELOVL5 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실험방법]

1. 인체유래물 자원수집

DNA methylation 및 RNA expression 정보생산을 위해 국립인체자원은행으로부터 분양 받은 한국 당뇨불일치 쌍둥이 11쌍의 혈액시료로부터 DNA를 추출하였다. 모든 절차는 해당 기관 검토위원회의 승인을 받고 지침에 따라 행해졌으며, 참가자의 사전동의를 획득하였다. 연구프로토콜은 한국 질병관리본부로부터 승인받았다(2017-02-06-P-A).

서울아산병원 수술환자의 지방조직으로부터 순수 분리된 지방전구세포(pre-adipocyte) 및 지방세포(adipocyte)를 대상으로 DNA 및 RNA를 추출하여 각 정보생산용 정제기준에 따라 정도 관리 분석을 수행하였다.

2. DNA 추출과 바이설파이트(Bisulfite) 처리

혈액과 조직에서 추출한 DNA 샘플을 picogreen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 Victor 3 분광광도계 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)로 정량하였다. DNA 함량은 NanoDrop ND-1000 분광광도계 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA)로 측정하였다.

Genomic DNA에 바이설파이트(Bisulfite)를 처리하면 DNA 염기서열 중 5'-CpG-3' 부위의 사이토신이 메틸화된 경우에는 그대로 유지되지만, 비메틸화된 경우에는 우라실로 바뀌어서 메틸화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 메틸화된 사이토신과 비메틸화된 사이토신을 구별하기 위하여 DNA를 바이설파이트로 처리하였다. EZ-96 DNA 메틸화 키트 (Zymo Research, Irving, CA, USA)로 DNA 샘플 (500 ng)을 제조사의 매뉴얼에 따라 바이설파이트로 전환하고 CpG 부위의 사이토신을 genotyping 하였다.

3. 전장유전체 메틸화 분석

Infinium Human Methylation 450K BeadChip을 이용하여 혈액기반 DNA 메틸레이션 정보를 생산하였다. R package 분석 프로그램을 이용하여 각 메틸레이션 사이트에 대한 β 값을 계산하여, 전장메틸레이션 연관성 분석에 필요한 데이터 정제분석을 수행하였다. DNA 메틸화 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다.

메틸레이션 칩에 탑재된 450,000개의 프로브 사이트에 대한 기본 검출 유의성 기준은 P<0.05로 적용하였다. 메틸레이션 데이터는 내부 컨트롤 프로브의 median강도를 뺀 다음 베타-믹스처 변위치 정규화법(beta-mixture quantile normalization method, BMIQ)을 사용하여 표준화하여 배경 보정을 하였다.

4. mRNA 시퀀싱

시퀀싱 시료 키트(polyA-based TruSeq V2 RNA)를 기반으로, 200-500bp 기준으로 단편 절단된 cDNA 라이브러리를 이용하여 Illumina HiSeq 2000 시퀀싱 기기를 통해 시퀀싱 정보를 생산하였다. 생산된 Reads는 TopHat 2.0.6 분석 방법을 통해 참조 유전체정보(버전 GRCh37 (hg19))에 매핑되었으며, 모든 유전자의 FPKM은 Cufflinks 분석 방법을 이용하여 계산되었다.

5. 통계분석

메틸화 차이를 보이는 부위들(differential methylated region, DMR) 및 유전적으로 독립적인 메틸화 차이(giDMR)를 보이는 부위들은 SAS 프로그램(version 9.1; SAS institute Inc., Cary, NC, USA)으로 분석되었다. 선형 혼합 효과 모델(linear mixed effects model)에서 연령, 성별, 체질량 지수가 고정 효과(fixed effect)로, 가족 구조는 무작위 효과(random effect)로 간주되었고, P값은 단일표본 t-test를 통해 계산되었다.

[실시예 1]

당뇨불일치 쌍둥이 코호트로부터의 전장메틸레이션 분석

연구대상자의 선정

제2형 당뇨에 대한 질환불일치 쌍둥이 코호트로부터 11쌍의 연구 대상자를 선정하였다. 제2형 당뇨병 환자는 과거 당뇨병 진단 여부와 과거 및 현재 약물력 설문조사 결과를 이용하여 당뇨병으로 진단된 대상자들이며 WHO 당뇨병 진단 기준을 적용하였다. 제2형 당뇨환자의 경우 공복혈당이 7 mmol/L 이상이거나, 경구 당 부하검사(Oral Glucose Tolerance Test)로 75mg의 포도당을 섭취 후 2시간 후 혈당이 11.1 mmol/L 이상인 자로 선정하였으며, 정상인 군은 공복혈당이 5.6 mmol/L 미만이거나, 경구 당 부하검사(oral glucose tolerance test)로 75mg의 포도당을 섭취 후 2시간 후 혈당이 7.8 mmol/L 미만인 대상자들로 선정하였다.

당뇨 질환불일치 쌍둥이 코호트로부터 선정한 당뇨 및 정상군에 대한 임상적 특성은 아래 표 1과 같으며, 기본적으로 에피 유전 변이를 살펴보기 위해 성별, 나이, 체질량지수는 동일하게 고정하여 선별하였으며, 다른 임상적 특성은 제2형 당뇨군과 정상군 사이에 다소 차이가 있는 것을 확인하였다.

구분	제2형 당뇨병 환자	정상인
성별 (남/여)	5 / 6	5 / 6
나이	42.18 ± 8.35	42.18 ± 8.35
체질량지수 (kg/m²)	24.08 ± 2.56	24.43 ± 2.27
LDL 콜레스테롤 (mg/dl)	123 ± 30.95	107 ± 29.42
HDL 콜레스테롤 (mg/dl)	42.91 ± 8.99	53.82 ± 23.88
공복혈당 (mmol/L)	8.08 ± 2.6	6.49 ± 1.42

Infinium Human Methylation 450K BeadChip을 이용하여 상기 11쌍의 당뇨불일치 쌍둥이 코호트로부터의 단일표본 t-test을 통한 전장메틸레이션 연관분석을 수행한 결과, 차이를 나타내는 giDMRs(genetically independent differentially methylated regions)를 발견하였다.

[실시예 2]

영국 트윈코호트 당뇨불일치 쌍둥이 데이터를 이용한 재현성 분석

실시예 1의 전장메틸레이션 분석을 통해 발굴된 후보 마커에 대하여 재현성 분석(external validation)을 수행하기 위해 TwinsUK 레지스트리로부터 당뇨질환 불일치쌍둥이 데이터(17쌍)를 이용하여 분석하였다.

해당 데이터의 시료를 제공한 제2형 당뇨병 환자는 공복 혈당이 ≥ 7 mmol/L로 측정되거나 설문지를 통해 자가 보고되었다. 시료 제공자의 전혈로부터 DNA 정제 키트(Norgen Biotek Corporation, Thorold, Canada)를 이용하여 게놈 DNA를 분리하였다. DNA 메틸레이션은 메틸화된 DNA 면역침강 서열분석(methylated DNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing, MeDIP-seq)으로 측정하였다. Novoalign　V2.07.11(Novocraft Technologies, Malaysia)를 사용하여 참조 인간 유전체 서열(hg19)에 판독물을 매핑하고 500 bp 영역에서 MEDIPS로 quantify하였다. 확인된 CpG 부위를 분석하였고, 단일표본 t-test를 통해 쌍둥이 간의 불일치를 확인하였다.

영국 트윈코호트 당뇨질환 불일치쌍둥이 데이터를 이용한 재현성 분석결과를 아래 표 2에 나타내었다.

CHR	MAPINFO	TargetID	Gene	Location	실시예 1(11쌍)		실시예 2(17쌍)
CHR	MAPINFO	TargetID	Gene	Location	mean.dif	P	mean.dif	P
1	99469819	cg26527487	LPPR5	Body	-0.0716	0.0078	-0.8500	0.0031
17	16283976	cg06537829	UBB	TSS1500	-0.2170	0.0066	-0.5728	0.0073
4	52943197	cg24395452	SPATA18	Body	0.1015	0.0486	-0.6919	0.0107
6	53174395	cg18681426	ELOVL5	5'UTR;Body	-0.0075	0.0102	-0.6708	0.0123
1	64649805	cg08036553	ROR1	Intergenic	0.4494	0.0370	0.7339	0.0128
1	32714038	cg11286035	FAM167B	Body	-0.2385	0.0003	-0.7814	0.0176
3	142700876	cg00831726	PAQR9	Intergenic	0.7795	0.0396	-0.7331	0.0196
6	169002120	cg14806083	SMOC2	Body	0.9558	0.0347	-0.7905	0.0208
6	21589356	cg20825506	SOX4	Intergenic	-0.2274	0.0295	0.8511	0.0217
6	27841122	cg25845597	HIST1H4L	Body	-0.2798	0.0454	-0.5534	0.0221
12	7021987	cg09815977	LRRC23	Body	0.9468	0.0079	0.4969	0.0240
7	156813574	cg24052359	MNX1	Intergenic	0.0741	0.0289	-0.5202	0.0332
14	55661413	cg10351052	DLGAP5	Intergenic	0.9583	0.0392	0.7630	0.0381
8	41168336	cg23359714	SFRP1	Intergenic	-0.2461	0.0435	-0.8940	0.0382
3	38496096	cg01465620	ACVR2B	Body	-0.0141	0.0448	-0.4999	0.0404
18	77201558	cg18108009	NFATC1	Body	0.6736	0.0232	0.6492	0.0504

재현성 분석을 위하여 혈액 기반 메틸화된 DNA 면역침강 서열분석으로 16개의 주요 CpG사이트를 in silico 분석한 결과, ELOVL5 유전자(cg 18681426)는 두 코호트간 서로 같은 방향성(mean.dif)을 보이며 유의적으로 신뢰성 검증이 되었다 (P<0.05). 본 검증 분석을 통해 새롭게 발굴된 ELOVL5 유전자는 당뇨 연관 혈액기반의 메틸레이션 변화와 연관성이 높게 나타나는 것을 알 수 있었다.

[실시예 3]

정상인의 비만조직으로부터 분리된 미분화 지방전구세포 및 지방세포의 메틸레이션 분석

전장메틸레이션 분석을 통해 새롭게 발굴된 혈액기반 메틸레이션 마커(cg18681426, ELOVL5)에 대한 바이오마커로서의 재현성 검증분석을 위해 정상인 4명의 지방조직으로부터 순수 분리된 지방전구세포(pre-adipocyte) 및 지방세포(adipocyte)를 대상으로 DNA methylation 및 RNA expression 분석을 수행하였으며, 연구대상자 4인의 임상적 특성은 아래 표 3과 같다.

구분	Mean ± SD
성별	여성
나이	60.50 ± 5.07
키 (cm)	149.45 ± 2.28
체중 (kg)	65.94 ± 12.11
체질량지수 (kg/m²)	29.48 ± 5.02
수축기 혈압 (mmHg)	116.75 ± 15.73
이완기 혈압 (mmHg)	85.5 ± 14.73

도 1에서 나타낸 바와 같이 정상인(n=4) 지방조직으로부터 순수 분리한 각 지방전구세포 및 지방세포간의 주성분(PCA) 메틸롬 분석 (4 pair) 결과, 각 시료pair간의 전 데이터 특성의 차이가 명확히 구분되어 분포함을 확인하여, 신규 메틸레이션 마커(cg18681426, ELOVL5)는 정상군의 동일인 지방조직으로부터 순수 분리된 지방전구세포 및 지방세포간 메틸레이션 차이분석 결과에서도 유의미한 차이를 나타내는 것을 알 수 있었다.

[실시예 4]

당뇨환자의 비만조직으로부터 분리된 미분화 지방전구세포 및 지방세포의 메틸레이션 분석

혈액기반 메틸레이션 마커(cg18681426, ELOVL5)에 대한 바이오마커로서의 재현성 검증분석을 위해 제2형 당뇨환자의 비만조직으로 순수 분리된 지방세포군(7명) 및 미분화 지방전구세포군(6명)을 대상으로 RNA expression 분석을 수행하였으며, 연구대상자의 임상적 특성은 아래 표 4과 같다.

구분	지방세포군	미분화지방전구세포군
성별(남/여)	1 / 6	0 / 6
나이	63.71 ± 6.26	66.83 ± 3.31
키 (cm)	163.59 ± 6.61	167.67 ± 3.47
체중 (kg)	72.24 ± 13.30	76.82 ± 20.80
체질량지수 (kg/m²)	26.81 ± 3.43	27.42 ± 7.61
수축기 혈압 (mmHg)	118.43 ± 14.88	124.67 ± 7.84
이완기 혈압 (mmHg)	75.86 ± 7.58	79.33 ± 9.22
공복혈당 (mmol/L)	9.11 ± 3.57	8.96 ± 3.43
2시간 식후혈당 (mmol/L)	13.90 ± 9.02	13.15 ± 8.60
HbA1c (%)	7.47 ± 2.16	7.02 ± 0.84

상기 시료에 대한 ELOVL5 유전자 발현 프로파일을 하기 표 5, 도 2 및 도 3에 나타내었다.

ID	transcript type	length	지방세포군 (n = 7)		미분화지방전구세포군 (n = 6)		P
ID	transcript type	length	mean	std dev	mean	std dev	P
NM_021814	variant 1	81,782	134.10	51.20	52.27	17.16	0.0050
NM_001242828	variant 2	81,782	1.03	0.79	0.31	0.28	0.0337
NM_001242830	variant 3	81,782	14.48	7.82	1.83	1.26	0.0020
NM_001242831	variant 4	55,092	5.24	3.78	2.45	1.11	0.0522

표 5에서 확인되는 바와 같이, ELOVL5 유전자 발현 비교 분석 시 당뇨환자 중 분화전지방전구세포군(6명)와 분화 후 지방세포(7명)간의 유의한 발현 차이가 나타났으며, 특히 4개의 전사체 아형변이간 발현도 비교 분석 결과, 주 변이형((NM_021814)에 비해 유전체 구조적 차이(몇 엑손이 없거나 3' 터미널 위치에 새로운 엑손을 보유)가 있는 변이타입 4의 경우 상대적으로 발현 차이가 낮음을 확인하였다.

또한 도2에 나타낸 바와 같이, 개별(Unrelated) 당뇨환자들의 지방전구세포군 및 지방세포군 간의 전사체 양상 (heat map clustering) 비교분석 결과, 두 데이터군 간 유전자발현도에 대한 이질적 특성 패턴을 확인하였고, 도3에 나타낸 바와 같이 개별(Unrelated) 당뇨환자들의 지방전구세포군 및 지방세포군 간의 전사체 양상 계층분석(Hierachical clustering) 비교분석 결과, 분화 전 후의 두 그룹으로 명확한 트리구조를 확인하였다.

[실시예 5]

당뇨환자 및 정상인의 췌장조직에서 ELOVL5 유전자의 발현 분석

DNA메틸레이션과 유전자 발현의 관계를 확인하기 위하여, GEO(Gene Expression Omnibus) 공개 데이터베이스(Accession Number: GSE38642)로부터 당뇨환자 및 정상인의 pancreatic islet에서의 발현 데이터를 분석하였다. 분석을 위한 10명의 임상적 특징은 아래 표 6과 같다. 나이와 성별을 정확히 매치하였으며, 당뇨환자의 경우 정상인에 비해 체질량지수 및 당화혈색소가 높게 나타났다.

구분	제2형 당뇨병 환자	정상인
성별(남/여)	2 / 3	2 / 3
나이	47.2	47.6
체질량지수 (kg/m²)	28.26 ± 4.46	23.76 ± 1.04
HbA1c (%)	7.06 ± 0.42	5.32 ± 0.19

도 4에 나타낸 바와 같이, 당뇨환자의 췌장조직으로부터의 유전자 발현을 검증하기 위해 유전자발현 공공데이터베이스인 Gene Expression Omnibus (GEO) database로부터 Affymetrix GeneChip Human Gene 1.0 ST Array 기반 데이터 세트인 GEO accession number: GSE38642를 이용하여 상기 표 6의 나이와 성별을 매치한 정상인 (5명) 및 당뇨 환자 (5명) 총10명에 대해 유전자 비교 분석 결과, 정상군에 비해 당뇨 환자군에서 ELOVL5 유전자의 유의적인 발현차이가 나타남을 확인하였다.

<110> Korea Centers for Disease Control and Prevention <120> Composition and method for diagnosing type 2 diabetes using ELOVL fatty acid elongase 5 gene <130> P180046 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 122 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagatgcccc caaagatcct ggtacacctg atactcacac ccttatgtag tgccctttcc 60 cgatgaacca gggttgtgtg tgtgaccaac agaataaagc aaaagggatg gtatgtcgct 120 tc 122

Claims

ELOVL5(ELOVL Fatty Acid Elongase 5) 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 조성물로서, 상기 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1의 염기서열 중에 나타나는 CpG를 포함하는 것인, 제2형 당뇨병의 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는,
비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소;
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및　
비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하고, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단용 조성물.
삭제
제2항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는　사이토신(cytosine)과 구아닌(guanine) 인식부위(CG 인식부위)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는　SmaI,　SacII,　EagI,　HpaII,　MspI,　BssHII,　BstUI 또는　NotI인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단용 조성물.
ELOVL5(ELOVL Fatty Acid Elongase 5) 유전자의 CpG 부위의 메틸화를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1의 염기서열 중에 나타나는 CpG를 포함하는 것인, 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제6항에 있어서,
시료에서 DNA를 수득하는 단계;
상기 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 증폭시키는 단계를 포함하고, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는, 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 지방조직 또는 췌장조직인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는　사이토신(cytosine)과 구아닌(guanine) 인식부위(CG 인식부위)를 포함하는 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는　SmaI,　SacII,　EagI,　HpaII,　MspI,　BssHII,　BstUI 또는　NotI인 것을 특징으로 하는 제2형 당뇨병의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.