JP7240097B2 - 屈折異常に対する素因を予測するための方法および試薬 - Google Patents
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Description
本願は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる、2015年2月27日提出の米国特許仮出願第62/126,284号明細書の優先権を主張する。
(a)1つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン3スプライシング欠損を判定するために前記対象から得られた生体試料を試験すること;および
(b)1つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン3スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む、方法を提供する。
(a)LまたはMオプシン遺伝子の位置153、171、174、178および180でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるLIVVA(配列番号1)を含むオプシン遺伝子変異体を同定するために、対象から得られた生体試料を試験すること;および
(b)オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
(a)1つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン3スプライシング欠損を判定するために前記対象から得られた生体試料を試験すること;および
(b)1つ以上のオプシン遺伝子におけるエクソン3スプライシング欠損を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
相関させることは、EX3(-)mRNAに対する全長オプシン遺伝子mRNAの相対量を屈折異常に対する素因と相関させることを含む。
(i)生体試料中に存在するオプシン遺伝子mRNAのcDNAから、エクソン3にまたがる増幅産物を生成させること;および
(ii)全長オプシン遺伝子mRNAに対応する増幅産物およびEX3(-)mRNAに対応する増幅産物を検出すること
を含む。
配列の二重下線の部分は、エクソン4からエクソン3/2への伸長プライマーに対する相補体である。
(Ex3(-)オプシンmRNAに相当)となるように、アッセイを設計する。プライマーは太字ヌクレオチドのすぐ上流に結合し、これは、配列において示されるものに対応し、したがって相補鎖に結合し、示される太字ヌクレオチドを組み込み、ポリメラーゼが太字ヌクレオチドを組み込むようにする。本アッセイは定方向であり、したがって、エクソン2からエクソン3/4に向かうための唯一の可能な方法およびエクソン4からエクソン3/2へ向かうための唯一の可能な方法がある。
(i)生体試料中に存在するオプシン遺伝子mRNAのcDNAを生成させること;および
(ii)全長オプシン遺伝子mRNAに対応するcDNAおよびEX3(-)mRNAに対応するcDNAを検出すること
を含む。
(i)cDNAの増幅に適切な条件下で、エクソン3にまたがり、cDNAを選択的に増幅可能である1つ以上のプライマー対とcDNAを接触させることおよび
(ii)全長cDNA増幅産物を含む増幅産物の第1の集団およびEX3(-)増幅産物を含む増幅産物の第2の集団を生成させるためにcDNAを増幅させること
を含む。
エクソン1:(変異なし)
(a)LまたはMオプシン遺伝子の位置153、171、174、178および180でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるオプシン遺伝子変異体LIVVA(配列番号1)を同定するために対象から得られた生体試料を試験すること;および
(b)オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させること
を含む方法を提供する。
エクソン1:(変異なし)
(a)配列番号14(エクソン2)ヌクレオチド1~81、83~187、189~218、220~232または244~307の12個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第1のプライマー;および
(b)配列番号15(エクソン4)ヌクレオチド1~110または129~166)の12個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第2のプライマー対
を含む。
(a)配列番号11(エクソン1)の12個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第1のプライマー;および
(b)配列番号12(エクソン6)の12個以上の連続ヌクレオチドまたはその全ヌクレオチドを含む第2のプライマー対
を含む。
導入
嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび網膜色素変性症を含め、多くのヒト疾患は遺伝子スプライシングエラーを含む。近年、Ueyamaら(Biochem Biophys Res Commun,424,152,2012)は、赤緑色覚異常に関連する錐体オプシン遺伝子の変異体が、最終的なmRNAからのエクソン3が欠如するスプライシングエラーにつながったことを見出した。ヒトLおよびMオプシン遺伝子は非常に変化し易く、発明者らは、オプシン遺伝子変異体を調べて、エクソン3スプライシング欠損と関連するものを同定するためにアッセイを設計した。さらに、発明者らは、エクソンスキッピングと関連する変異体の中でも、エクソン3がスキッピングされたメッセージと比較して、正常な全長メッセージを含有するmRNAの断片を定量しようとした。
赤緑色覚異常がXq28でのX-染色体における錐体感光色素遺伝子の再編成の結果であるという発見は、X-染色体オプシン遺伝子アレイにおける突然変異と色覚異常との間の遺伝子型-表現型の相関に対する過去数十年にわたる広範囲の研究につながった(概説については[1]を参照)。長(L)および中(M)波長の錐体は、人間の錐体の95%を占め、非常に低い光レベルを除き、杆体が活性である場合、全視覚が錐体に基づく。したがって、色を見分けることだけではなく、視力の全ての態様は、LおよびM錐体感光色素に依存する。それぞれOPN1LWおよびOPN1MWと呼ばれるLおよびM錐体オプシン遺伝子は、エクソン2、3および4の配列において非常にばらつきがある。視覚および、視覚誘導性の眼の成長などの他の過程における感光色素の必須の役割のために、これらの遺伝子における遺伝的変異は、現代人を悩ませる一般的な眼の障害に対する重要なリスク因子である。発明者らは、オプシンの位置153、171、174、178および180でコードされるアミノ酸について、LIAVA(配列番号2)およびLVAVA(配列番号4)と呼ばれる2個のオプシン遺伝子変異体を詳細に研究した。発明者らは、これらのオプシン遺伝子変異体が光受容体機能不全および重篤な視力障害と関連することを発見した[2~6]。これらの変異体は、色覚異常、強度近視、錐体ジストロフィー、青錐体一色型色覚、ボルンホルム眼疾患および緑内障にわたる臨床診断がある患者において見られる。これらの変異体は視力欠陥がない個体では観察されない。
血液または唾液試料を対象から回収した。製造者の説明書に従い、市販のDNA抽出キットを使用して、ゲノムDNAを単離した。発明者らは、参考文献2に記載の詳細な手順(Neitzら、2004)に従い、OPN1LWおよびOPN1MW遺伝子を増幅する。参考文献8に記載のように、PCR産物を哺乳動物発現ベクターpCMV5aにクローニングし、またこれも参考文献8に記載のように、HEK293または他の適切な細胞に遺伝子移入した。遺伝子移入から24~48時間後にmRNAを細胞培養物から単離した。市販のキットを使用して、製造者の説明書に従い、mRNAを抽出し、逆転写した。スプライシングされる領域にまたがるプライマーとともにPCRで使用したcDNA。リバースPCRプライマーは、5’CATGTAAGACTGCACCCCGG(配列番号20)である。伸長プライマーは5’AGGCCGTGGGGCCAGTACC(配列番号21)である。以下はPCRおよび伸長プライマーのマップである。
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Claims (20)
- 対象における、エクソン3―スキッピング(EX3(-))オプシン遺伝子mRNAと比較したエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定するための方法であって、
(a)前記対象から得られた生体試料からゲノムDNAを単離することと、
(b)前記ゲノムDNAから、エクソン3オプシン遺伝子及びエクソン3の両側のイントロンオプシン遺伝子を発現させ、前記対象由来のオプシン遺伝子mRNAを生成することと、
(c)前記オプシン遺伝子mRNAを単離することと、
(d)前記オプシン遺伝子mRNAを逆転写して、オプシン遺伝子cDNAを生成することと、
(e)PCRプライマーを用いて、前記オプシン遺伝子cDNAから、増幅産物を生成することであって、前記PCRプライマーが、エクソン2の保存領域にハイブリダイズするフォワードプライマーと、エクソン4の保存領域にハイブリダイズするリバースプライマーを含み、前記増幅産物が、エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団と、を含むことと、
(f)エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団の量と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団の量と、を検出することと、
(g)エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団の量と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団の量と、を比較し、前記対象における、EX3(-)mRNAに対するエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定することと、
を含む、方法。 - 対象における、エクソン3―スキッピング(EX3(-))オプシン遺伝子mRNAと比較したエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定するための方法であって、
(a)前記対象から得られた生体試料からゲノムDNAを単離することと、
(b)前記ゲノムDNAから、エクソン3オプシン遺伝子及びエクソン3の両側のイントロンオプシン遺伝子を発現させ、前記対象由来のオプシン遺伝子mRNAを生成することと、
(c)前記オプシン遺伝子mRNAを単離することと、
(d)前記オプシン遺伝子mRNAを逆転写して、オプシン遺伝子cDNAを生成することと、
(e)PCRプライマーを用いて、前記オプシン遺伝子cDNAから、増幅産物を生成することであって、前記PCRプライマーが、エクソン1の保存領域にハイブリダイズするフォワードプライマーと、エクソン6の保存領域にハイブリダイズするリバースプライマーを含み、前記増幅産物が、エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団と、を含むことと、
(f)エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団の量と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団の量と、を検出することと、
(g)エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第1の集団の量と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の第2の集団の量と、を比較し、前記対象における、EX3(-)mRNAに対するエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定することと、
を含む、方法。 - 前記生体試料が、唾液又は血液である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記増幅産物を検出することが、エクソン3の末端に隣接した前記増幅産物に結合するプライマーを使用して、前記増幅産物からプライマー伸長産物を生成させることを含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記プライマー伸長産物がMALDI-TOF質量分析により検出される、請求項4に記載の方法。
- 前記ゲノムDNAからエクソン3オプシン遺伝子及びエクソン3の両側のイントロンオプシン遺伝子を発現させオプシン遺伝子mRNAを生成することの前に、エクソン3オプシン遺伝子及びエクソン3の両側のイントロンオプシン遺伝子を前記ゲノムDNAから発現ベクターにクローニングすることをさらに含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記検出することが、エクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の前記第1の集団と、エクソン3を含まないオプシン遺伝子mRNAに相当する増幅産物の前記第2の集団と、の両方の少なくとも一部と相補的な全長配列を有するプローブと前記増幅産物を接触させることを含み、
前記接触させることが、前記増幅産物への前記プローブのハイブリッド形成に適切な条件下で行われる、
請求項1又は2に記載の方法。 - 前記オプシン遺伝子がL-オプシン遺伝子を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記オプシン遺伝子がM-オプシン遺伝子を含む、請求項1又は2に記載の方法。
- 屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
(a)L又はMオプシン遺伝子の位置153、171、174、178及び180でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるLIVVA(配列番号1)を含むL-オプシン遺伝子及び/又はM-オプシン遺伝子変異体を同定するために、前記対象から得られた生体試料を試験することと、
(b)前記対象がLIVVA(配列番号1)を含む前記L-オプシン遺伝子及び/又はM-オプシン遺伝子変異体を有すると同定された場合、前記オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させることと、
を含む、方法。 - 前記オプシン遺伝子変異体がLIVVA(配列番号1)である、請求項10に記載の方法。
- 前記屈折異常が青錐体一色型色覚である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記屈折異常が近視である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記屈折異常が強度近視である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記屈折異常が若年発症型近視である、請求項10又は11に記載の方法。
- 対象の一又は複数のオプシン遺伝子から転写した、エクソン3―スキッピング(EX3(-))オプシン遺伝子mRNAと比較したエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定するための組成物であって、
ヒトオプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対であって、前記検出可能部分がエクソン3を含み、(I)エクソン3を含むPCR産物と(II)エクソン3を含まないPCR産物の両方を増幅可能なプライマー対を含む、又は、からなる、組成物であって、
前記プライマー対が、
(a)配列番号11の12個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第1のプライマーと、
(b)配列番号12の12個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第2のプライマーと、
を含む、
組成物。 - 対象の一又は複数のオプシン遺伝子から転写した、エクソン3―スキッピング(EX3(-))オプシン遺伝子mRNAと比較したエクソン3を含むオプシン遺伝子mRNAの相対量を判定するための組成物であって、
ヒトオプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対であって、前記検出可能部分がエクソン3を含み、(I)エクソン3を含むPCR産物と(II)エクソン3を含まないPCR産物の両方を増幅可能なプライマー対を含む、又は、からなる、組成物であって、
前記プライマー対が、
(a)配列番号14の12個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第1のプライマーと;
(b)配列番号15の12個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む、第2のプライマーと、
を含む、
組成物。 - 前記プライマー対の少なくとも1つのプライマーが検出可能に標識される、請求項16又は17に記載の組成物。
- (I)エクソン3を含むPCR産物と(II)エクソン3を含まないPCR産物の両方の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブをさらに含む、請求項16又は17に記載の組成物。
- 前記プローブが検出可能に標識される、請求項19に記載の組成物。
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