JP2018512121A5

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Publication number: JP2018512121A5
Application number: JP2017545686A
Authority: JP
Filing date: 2016-02-29
Publication date: 2020-02-27
Anticipated expiration: 2036-02-29

Description

発明者らは、エクソン３の両側の２つを除くイントロンが除去された全長オプシン配列を含有するプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に遺伝子移入する、ミニ遺伝子試験を設計した。ｍＲＮＡを回収し、それを使用してｃＤＮＡを作製した。次の段階に対して、発明者らは、対立遺伝子特異的なプライマー伸長とそれに続く質量分析によって一ヌクレオチドレベルの遺伝子分析を行うためにＭＡＳＳアレイ（登録商標）機器を使用した。エクソン３を欠いたＬオプシンｍＲＮＡの断片を定量するためにアッセイを設計した。アッセイを最初に試験し、全長およびエクソンスキッピングｃＤＮＡの既知の混合物で較正した。次いで、これを使用して、Ｌオプシンエクソン３の全１２８個の変異体にわたりエクソンスキッピングを探索した。発明者らは、質量分析の、エクソン３スキッピングオプシンｍＲＮＡに対する全長の相対量を定量する能力を利用した。しかし、これは、本方法の可能性がある１つの実行に過ぎず；２つのｍＲＮＡ種の相対量を決定可能な何らかの定量的方法を使用し得る。

Claims

対象における、エクソン３―スキッピング（ＥＸ３（−））Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡと比較した全長エクソン３Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を判定するための方法であって、
（ａ）前記対象から得られた生体試料からゲノムＤＮＡを単離することと、
（ｂ）前記ゲノムＤＮＡから、エクソン３オプシン遺伝子及びエクソン３の両側のイントロンオプシン遺伝子を発現させ、前記対象由来のオプシン遺伝子ｍＲＮＡを生成することと、
（ｃ）前記オプシン遺伝子ｍＲＮＡを単離することと、
（ｄ）前記オプシン遺伝子ｍＲＮＡを逆転写して、オプシン遺伝子ｃＤＮＡを生成することと、
（ｅ）１つ以上のオプシン遺伝子のエクソン３にまたがるＰＣＲプライマーを用いて、前記オプシン遺伝子ｃＤＮＡから、増幅産物を生成することであって、前記増幅産物が、全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の第１の集団と、ＥＸ３（−）オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の第２の集団と、を含むことと、
（ｆ）前記全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の第１の集団の量と、前記ＥＸ３（−）オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の第２の集団の量と、を検出することと、
を含む、方法。
前記オプシン遺伝子ｍＲＮＡの少なくとも１２％がＥＸ３（−）オプシン遺伝子ｍＲＮＡである場合、ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対する全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡの相対量を屈折異常に対する素因と相関させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記生体試料が、唾液又は血液である、請求項１に記載の方法。
前記増幅産物を検出することが、エクソン３の末端に隣接した前記増幅産物に結合するプライマーを使用して、前記増幅産物からプライマー伸長産物を生成させることを含む、請求項１に記載の方法。
前記プライマー伸長産物がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により検出される、請求項４に記載の方法。
前記ゲノムＤＮＡからエクソン３オプシン遺伝子及びエクソン３の両側のイントロンオプシン遺伝子を発現させオプシン遺伝子ｍＲＮＡを生成することの前に、エクソン３オプシン遺伝子及びエクソン３の両側のイントロンオプシン遺伝子を前記ゲノムＤＮＡから発現ベクターにクローニングすることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記増幅産物を生成することが、
（ｉ）前記ｃＤＮＡの増幅に適切な条件下で、エクソン３にまたがり、Ｌ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡ及び／又はＭ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡのｃＤＮＡを選択的に増幅可能であるプライマー対と前記ｃＤＮＡを接触させることと、
（ｉｉ）前記ｃＤＮＡを増幅し、全長ｃＤＮＡ増幅産物を含む増幅産物の第１の集団と、ＥＸ３（−）増幅産物を含む増幅産物の第２の集団と、を生成することと、
を含む、請求項１に記載の方法。
前記検出することが、全長Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の前記第１の集団と、ＥＸ３（−）Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子ｍＲＮＡに相当する増幅産物の前記第２の集団と、の両方の少なくとも一部と相補的な全長配列を有するプローブと前記増幅産物を接触させることを含み、
前記接触させることが、前記増幅産物への前記プローブのハイブリッド形成に適切な条件下で行われる、
請求項１に記載の方法。
前記Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子がＬ−オプシン遺伝子を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
前記Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子がＭ−オプシン遺伝子を含む、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
屈折異常に対する対象の素因を判定するための方法であって、
（ａ）Ｌ又はＭオプシン遺伝子の位置１５３、１７１、１７４、１７８及び１８０でコードされるアミノ酸に対するものとして指定されるＬＩＶＶＡ（配列番号１）を含むＬ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子変異体を同定するために、前記対象から得られた生体試料を試験することと、
（ｂ）前記対象がＬＩＶＶＡ（配列番号１）を含む前記Ｌ−オプシン遺伝子及び／又はＭ−オプシン遺伝子変異体を有すると同定された場合、前記オプシン遺伝子変異体を屈折異常に対する素因と相関させることと、
を含む、方法。
前記オプシン遺伝子変異体がＬＩＶＶＡ（配列番号１）である、請求項１１に記載の方法。
前記屈折異常が青錐体一色型色覚である、請求項２、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
前記屈折異常が近視である、請求項２、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
前記屈折異常が強度近視である、請求項２、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
前記屈折異常が若年発症型近視である、請求項２、１１及び１２のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）ヒトＬ−オプシン遺伝子及び／又はヒトＭ−オプシン遺伝子の検出可能部分を選択的に増幅可能なプライマー対であって、前記検出可能部分がエクソン３を含み、（Ｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物と（ＩＩ）ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物の両方を増幅可能なプライマー対と、
（ｂ）（Ｉ）全長オプシン遺伝子ｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物と（ＩＩ）ＥＸ３（−）ｍＲＮＡに対応するＰＣＲ産物の両方と相補的な全長配列を有するプローブと、
を含む、又は、からなる、組成物。
前記プライマー対が、
（ａ）配列番号１４の１２個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第１のプライマーと；
（ｂ）配列番号１５の１２個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む、第２のプライマー対と、
を含む、請求項１７に記載の組成物。
前記プライマー対が、
（ａ）配列番号１１（エクソン１）の１２個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第１のプライマーと；
（ｂ）配列番号１２（エクソン６）の１２個以上の連続ヌクレオチド又はその完全相補体を含む第２のプライマー対と、
を含む、請求項１７に記載の組成物。
前記プライマー対の少なくとも１つのプライマーが検出可能に標識される、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の組成物。
前記プローブが検出可能に標識される、請求項１７から１９のいずれか１項に記載の組成物。