JP3976346B2

JP3976346B2 - 脊髄小脳変性症２型の原因遺伝子のｃＤＮＡ断片

Info

Publication number: JP3976346B2
Application number: JP52029998A
Authority: JP
Inventors: 省次辻; 一弘三瓶
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-30
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2017-10-30
Also published as: WO1998018920A1; AU4725597A; EP0878543A1; CA2241173A1

Description

技術分野
本発明は、脊髄小脳変性症２型（以下、「ＳＣＡ２」ということがある）の原因遺伝子のｃＤＮＡ断片、それがコードするタンパク質、該タンパク質に対する抗体及び前記ｃＤＮＡ断片のアンチセンス核酸に関する。
背景技術
ＳＣＡ２は、小脳及び中枢神経系の他の領域に影響を与える、常染色体性優性神経変性症である。
最近、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体委縮症（dentatorubral-pallidoluysian atrophy（DRPLA））等６種類の神経変性疾患において、原因遺伝子にはＣＡＧから成るトリプレットの反復数が正常な遺伝子よりも多く含まれていることが明らかになった。すなわち、これらの神経変性疾患患者の原因遺伝子では、ＣＡＧの反復数が３７〜１００回であるのに対し、正常な遺伝子では３５未満である。
ＳＣＡ２についても、原因遺伝子ではＣＡＧの反復数が増大していることが示唆されている（Trottier, Y. et al. Nature, 378, 403-406（1995））。しかしながら、ＳＣＡ２の原因遺伝子は同定されておらず、その塩基配列も明らかではないので、ＳＣＡ２を遺伝子検査により診断することはできない。
発明の開示
本発明の目的は、塩基配列が決定された、ＳＣＡ２の原因遺伝子のｃＤＮＡ断片を提供することである。また、本発明の目的は、ＳＣＡ２の治療や抗体調製のための免疫原として有用な、ＳＣＡ２の原因遺伝子に基づいて産生されるタンパク質を提供することである。さらに、本発明の目的は、ＳＣＡ２の治療や診断に有用な、該タンパク質に対する抗体を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ＳＣＡ２患者においてのみＣＡＧトリプレットの繰り返し数が増大している、２．５ｋｂのTspE1断片を見出し、その部分塩基配列を決定し、ＣＡＧトリプレットの繰り返しを挟む２つの領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングしてこれら２種類のプローブの両方とハイブリダイズするｃＤＮＡ断片をクローニングし、さらにこのｃＤＮＡ断片をプローブとして用いてヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、このプローブとハイブリダイズするｃＤＮＡ断片を複数クローニングした。これらのｃＤＮＡ断片の塩基配列を決定したところ、これらは互いに重複していた。５’末端側及び３’末端側の領域の塩基配列を決定するために、さらにＲＡＣＥ（rapid amplification of cDNA ends）を行ない、さらに５’側の端部の塩基配列を決定するためにＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＳＣＡ２の原因遺伝子のｃＤＮＡの全領域の塩基配列を決定することに成功した。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（ただし、第１６６番目ないし第１８８番目のGlnの繰り返し数は１５〜１００の間で変化する）をコードする核酸領域を含む核酸断片を提供する。また、本発明は、上記本発明の核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。さらに本発明は、該タンパク質と抗原抗体反応を行う抗体を提供する。
本発明により、塩基配列が決定された、ＳＣＡ２の原因遺伝子のｃＤＮＡ断片が提供された。本発明の核酸断片によりコードされるタンパク質はＳＣＡ２の治療に用いることができるし、また、ＳＣＡ２の治療及び診断に有用な抗体を調製するための免疫原として用いることができる。さらに、本発明により、ＳＣＡ２の原因遺伝子の塩基配列が明らかにされたので、該遺伝子に対するアンチセンスを設計することが可能になった。さらに、本発明により、上記本発明の核酸断片を、ヒト体内で所望の遺伝子を発現させることができる発現ベクターに組込んだ、ヒト体内で前記核酸断片を発現させることができる組換えベクターが提供された。このように、本発明はＳＣＡ２の治療及び診断に大いに貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の実施例において決定された、本発明のｃＤＮＡ断片の塩基配列をそれがコードするアミノ酸配列とともに示す図である。
図２は、図１の続きを示す図である。
図３は、図２の続きを示す図である。
図４は、図３の続きを示す図である。
図５は、本発明の実施例において材料として用いられたＤＮＡが由来するＳＣＡ２患者の家系図である。
図６は、本発明の実施例において得られたゲノミックＤＮＡ断片Tsp1及びTsp2並びにＳＣＡ２ｃＤＮＡのサイズ、位置及び制限酵素部位並びに得られた各ｃＤＮＡ断片のサイズ及び位置を示す図である。
図７は、（CAG）₅₅プローブを用いて測定された、正常遺伝子及びＳＣＡ２遺伝子中のＣＡＧ反復単位の数の分布を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明の核酸断片は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする核酸領域を含む。ただし、第１６６番目ないし第１８８番目のGlnの繰り返し数は１５〜１００の間で変化する。なお、この繰り返し数は、健常人では１５〜２５個であり、一方、ＳＣＡ２患者では３５〜１００個である。なお、周知のように、縮重により１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在するが、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするものであれば、いずれの塩基配列を有するものであっても本発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際に決定された塩基配列は配列番号１及び図１〜４に示される。この塩基配列がどのようにして決定されたか、また、この塩基配列を有するｃＤＮＡがＳＣＡ２の原因遺伝子のｃＤＮＡであることは下記実施例に詳述されている。
本発明の核酸断片は、下記実施例に詳述する方法によりクローニングすることができる。また、本発明の核酸断片は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、ヒトｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いたＰＣＲによる増幅や、さらにそのＰＣＲ産物をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、クローニングすることができる。なお、単一のＰＣＲで増幅することが困難な場合には、複数の領域に分け、増幅産物を常法により連結してクローニングすることもできる。
上記本発明の核酸断片を、常法により、市販の発現ベクターのマルチクローニング部位に組込み、得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換することにより、該核酸断片によりコードされるタンパク質を発現させることができる。任意の遺伝子を宿主細胞内で発現させるための宿主−ベクター系は、この分野において周知であり、多くの宿主−ベクター系が市販されている。このような市販の宿主−ベクター系を用いて当業者は容易に本発明の核酸断片を発現させてタンパク質を生産することができる。このような周知の方法は例えば、D. M. Glover, DNA Cloning Volume III a practical approach, 1987, IRL Pressに記載されている。
例えば、本発明の核酸断片を、定法に従い、プライマーに制限酵素部位を導入したロングPCR（LA PCR）（向井博之蛋白質核酸酵素Vol41, No.5, 585-594, 1996）を用いて増幅させ、増幅産物を制限酵素処理し、これを市販のプラスミドベクターであるpGEX（ファルマシア社製）のマルチクローニング部位に挿入してライゲーションし、得られた組換えベクターで大腸菌ＤＨ５α株（GIBCO BRL社製）を常法である塩化カルシウム法により形質転換し、薬剤耐性マーカー（アンピシリン耐性）の形質転換株を選択し、該形質転換株からＳＣＡ２の原因遺伝子がコードするタンパク質を回収することができる。またこのベクターを用いると目的蛋白質は、GST（Glutathion S-Transferase）との融合蛋白質として発現するので、市販の抗GST抗体（ファルマシア社製）を用いて容易に検出する事ができる。
健常人の遺伝子（ＣＡＧリピートが１５〜２５回）に基づいて産生されたタンパク質で活性を持つものは、正常な機能を有していると考えられるので、これをＳＣＡ２患者に投与することによりＳＣＡ２を治療し又はその症状を軽減させることができる。ただしＳＣＡ２の遺伝形式は、常染色体優性遺伝であるので、後述するアンチセンスにより、患者由来のＳＣＡ２原因遺伝子を同時にブロックする必要がある。
上記本発明のタンパク質又は免疫原性を有するその一部を免疫原として用いて動物を免疫し、該動物から常法により該タンパク質又はその部分に対する抗体を回収することができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体も周知の方法により調製できる。
またCAGリピートによってコードされるポリグルタミン鎖を用いて、その長さの違いのみによって反応性の異なる抗体を作製することは論理的に困難であるが、本発明で明らかになった、蛋白質の全長を用いることにより、健常人と患者の蛋白質の違いを立体構造の違いとして認識する抗体をつくることができる。さらに本発明により、SCA2遺伝子産物で、健常人と患者に共通な部分を用いて抗体を作製することができるので、本発明蛋白質に対する抗体を用いた、あらゆる検出系において対照が可能となる。これらの抗体を用いて、定法により、例えばプレート法のような簡便な検出法を作ることができる。
また、本発明の抗体を、周知の方法によりアガロースゲル（例えばファルマシア社のセファデックス（商品名）等）やポリスチレンビーズ等に常法により不動化し、カラムに詰めてアフィニティーカラムを作製することができる。このアフィニティカラムに患者の体液（血液、血清、髄液等）を通すことにより、患者のＳＣＡ２原因遺伝子由来タンパク質を取得することができ、これを溶離してその分子量を測定することにより、ＳＣＡ２の診断を行うことができる。なぜならＳＣＡ２患者の当該タンパク質は健常人のものよりも、ＣＡＧリピートが多い分だけ分子量が大きいからである。
また遺伝子治療としては、異常SCA2産物の産生停止と正常SCA2産物の導入の２通りが考えられ、前者の方法としては、アンチセンスを使った、mRNAの翻訳のブロック、後者の方法としては、前述のような、インビトロで得られたＳＣＡ２遺伝子産物の投与や当該核酸断片の細胞内への導入がある。ＣＡＧリピートの伸長によるＳＣＡ２患者においては、異常タンパク質が優性に作用すると考えられていることから、両者を同時に行うことで効果が得られると予想されるが、該核酸断片の導入の場合はアンチセンスをＳＣＡ２産物の活性に関与しない部分に設定し、導入される正常ＳＣＡ２遺伝子からはその部分を取り除き、互いに効果を相殺させないようにする。またそのようにアンチセンスと正常ＳＣＡ２遺伝子を設定することにより、上記アンチセンスとＳＣＡ２遺伝子を同一ベクター内に組込んで細胞内へ導入することも可能である。
上記アンチセンス核酸は、本発明の核酸断片から転写されるｍＲＮＡとハイブリダイズしてその翻訳を阻害するものであり、少なくとも１５ｂｐのサイズを有する。アンチセンスのサイズは１５ｂｐ以上、核酸断片のコード領域の全長以下のサイズを有することが好ましく、より好ましくは５０ｂｐ以上、コード領域の全長以下である。アンチセンス核酸は、本発明の核酸断片から転写されるｍＲＮＡの全部又は一部と完全に相補的な塩基配列を有していることが好ましいが、生体内でハイブリダイズできるだけの相同性を有しているものも上記アンチセンス核酸に包含される。本発明のアンチセンスをＳＣＡ２患者に投与することにより、患者のＳＣＡ２原因遺伝子をブロックすることができ、そうした上で健常人由来の上記タンパク質を投与することによりＳＣＡ２の治療又は症状の軽減を達成することができる。アンチセンス核酸の投与量は、患者の状態により適宜選択されるが、通常体重１ｋｇ、１日当り本発明のアンチセンス核酸を0.001mmol〜1000mmol程度投与する。
遺伝子を生体内に導入する主な手段として、レトロウイルスやアデノウイルスをベクターとして用いる方法（瀬戸口靖弘、実験医学Vol.12 No.15（増刊）1994,pp.114-121；鐘ケ江裕美ら、実験医学Vol.12 No.15（増刊）1994,pp.34-40）、リポソームによる方法、あるいはそれらを融合したもの（膜融合リポソーム等）が知られている。そのうちのアデノウイルスは、標的細胞の分裂増殖なしで導入遺伝子を発現させるため、当該核酸を神経系へ導入する手段としてもっとも適当である。具体的には野生株アデノウイルス５型DNAのE1aの一部とE3を取り除き、二本鎖DNAとした当該核酸をプロモーター等の発現ユニットと共に組み込み、E1a、E1b遺伝子を発現するヒト胎児腎由来の２９３細胞で増殖させ、ウイルス液を調整して接種する。細胞核内に取り込まれたウイルスゲノムは複製することなく染色体外にあり、神経細胞では細胞分裂によってウイルスゲノムが失われないので、１〜3ヶ月間は、正常SCA2遺伝子の発現を持続させることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
（1）（CAG）₅₅プローブの調製
ＣＡＧ反覆単位を５０個含む歯状核赤核・淡蒼球ルイ体委縮症（dentatorubral-pallidoluysian atrophy（DRPLA））遺伝子（Koide, R. et al., Nature Genet., 6, 9-13（1994））をＤＲＰＬＡ患者のゲノミックＤＮＡから増幅し、プラスミドベクターpT7Blue T（p-2093）にサブクローニングした。p-2093は、（CAG）₅₅及びその両端のフランキング配列を含む。すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA（CAG）₅₅CAT CAC GGA AAC TCT GGG CC-3'で表される配列を含む。一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA CA-3'及び5'-ビオチン-GGC CCA GAG TTT CCG TGA TG-3'を用いてＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，1.5mM MgCl₂，2M N,N,N-トリメチルグリシン、0.1mM TTP，0.1mM dCTP，0.1mM dGTP，9.25MBqの[α-³²P〕dATP（222TBq/mmol），0.5μMずつの各プライマー、0.3ngのプラスミドＤＮＡ（p-2093）及び2.0UのTaqＤＮＡポリメラーゼ（日本国京都府の宝酒造社製）を含む全量１６μｌの溶液を用いて行った。最初に９４℃で２分間変性を行った後、９４℃、１分の変性、５４℃、１分のアニーリング、７２℃、３分の伸長を３０サイクル行い、最後に７２℃で１０分間伸長を行った。
２０μｌのストレプトアビジンを被覆した磁化ビーズ（Dynabeads M-280, Streptavidin；ノルウェー、Dynal AS社製）を用いて一本鎖（CAG）₅₅プローブを調製した。すなわち、ＰＣＲ産物をストレプトアビジン被覆磁化ビーズに吸着させた後、５ｍＭ Tris-HCl（pH7.5）、０．５ｍＭＥＤＴＡ及び１ＭＮａＣｌを含む４０μｌの溶液でビーズを洗浄した。次いで５０μｌの０．１ＭＮａＯＨ溶液中で１０分間インキュベートすることにより、放射標識された非ビオチン化鎖をビオチン化鎖から分離した。得られた上清をプローブ液としてそのまま下記ハイブリダイゼーションに用いた。
なお、上記のようにして調製した一本鎖（CAG）₅₅プローブを用いて、ＣＡＧ反復単位数が９、２２、４３、５１であるアンドロゲンレセプター遺伝子についてサザン分析を行ったところ、（CAG）₅₅プローブはＣＡＧ反復単位が４３及び５１個の遺伝子とは強くハイブリダイズしたが、２２個の遺伝子とはほとんどハイブリダイズせず、９個の遺伝子とは全くハイブリダイズしなかった（K. Sanpei et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.212, No.2, 1995, pp.341-346）。すなわち、このプローブを用いれば、ハイブリダイゼーション条件を適正に設定することにより、ＣＡＧ反復単位を多数（例えば３５個以上）含むＤＮＡとのみ特異的にハイブリダイズさせることが可能である。
（2）ＳＣＡ２遺伝子の塩基配列決定
図５には、ＳＣＡ２患者の家系図を示す。この家系図において、男性が四角、女性が丸で示されており、患者は黒く塗りつぶされており、健常人は白抜きで示されている。
これらのＳＣＡ２患者及び健常人から常法により採取した高分子量ゲノミックＤＮＡ（各１５μｇ）を１００ＵのTspEI（日本国大阪府の東洋紡績社製）で消化し、０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、該膜を上記（CAG）₅₅プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、2.75 x SSPE（1 x SSPE=150mM NaCl，10mM NaH₂PO₄，1mM EDTA），50%ホルムアミド、５ｘデンハルツ液、100ng/ml剪断サケ精子ＤＮＡ及び（CAG）₅₅プローブ（6 x 10⁶cpm/ml）を含む溶液中で６２℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、0.5% SDSを含む1 x SSC（150mM NaCl，１５mMクエン酸ナトリウム）で膜を６５℃で０．５時間洗浄した。次いで、ＭＳ増感スクリーンを用い、Kodak Bio Max MSフィルムに１６時間−７０℃でオートラジオグラフィーにかけた。
その結果、全てのＳＣＡ２患者についてのみ、プローブとハイブリダイズした2.5kbpのTspEI断片が検出された。
そこで、一人のＳＣＡ２患者（図５中の７）からゲノミックＤＮＡを常法により抽出し、その２７０μｇをTspEIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけた。上記した2.5kbのTspEI断片を包含するゲノミックＤＮＡ断片を、EcoRIで開裂したλZAPII（Stratagene社製）ベクターにクローニングした。得られたゲノミックライブラリーを上記（CAG）₅₅プローブを用い、上述したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。増大したＣＡＧ反復を含むゲノミッククローンTsp1が単離された。
プローブを除去した後、ランダムプライム法により標識したTsp1をプローブとして用いて上記ゲノミックライブラリーを再度スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは5 x SSC，1 x デンハルツ液、１０％硫酸デキストラン、２０ｍＭリン酸ナトリウム、４００μｇ／ｍｌのヒト胎盤ＤＮＡ及びTsp1プローブを含む溶液中で４２℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.1 x SSC-0.1% SDS中で５２℃で０．５時間洗浄した。ＭＳ増感スクリーンを用い、膜をKodak Bio Max MSフィルムに−７０℃で２４時間オートラジオグラフィにかけた。その結果、正常な対立遺伝子由来のゲノミッククローンであるTsp2が単離された。
また、Tsp2のSmaI-ApaI断片（630bp）の塩基配列を決定し、ＣＡＧ反復領域を挟むようにオリゴヌクレオチドＦ−１（5'-CCC TCA CCA TGT CGC TGA AGC-3'）及びＲ−１（5'-CGA CGC TAG AAG GCC GCT G-3'）を設定した（図１参照）。ヒト前脳皮質ｃＤＮＡライブラリー（Stratagene社製）をオリゴヌクレオチドＦ２−１及びＲ−１をプローブとして用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、6 x SSC，10 x デンハルツ液、0.5% SDS，0.05%ピロリン酸ナトリウム、100ng/ml剪断サケ精子ＤＮＡ及び末端標識オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液中で５５℃で１８時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.5％ SDS及び0.05%ピロリン酸ナトリウムを含む6 x SSC中で５５℃で０．５時間洗浄した。両方のプローブとハイブリダイズする、4.0kbのｃＤＮＡクローンFc1が得られた。Fc1、Tsp1及びTsp2の塩基配列を決定し、比較したところ、ＣＡＧ反復領域近傍の塩基配列は、ＣＡＧの反復回数を除き一致していた。なお、Tsp1及びTsp2の制限酵素地図並びにFc1及び後述の他の断片のサイズ及び位置を図６に示す。さらに、Fc1又は以降のスクリーニングにより単離された断片をプローブとして用いて種々のヒトｃＤＮＡライブラリー（ヒト前脳皮質、ヒト胎児脳、ヒト脳及びヒト脳幹）をスクリーニングすることにより、ｃＤＮＡクローンFc2、Fb14、B4、C6及びC19を単離した（図６参照）。Fc1の５’末端を同定するために、5'-RACE-Ready cDNA（Clonetech, Palo Alto, CA, USA）を用いて5'-RACEを行った（Frohman, M.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002（1988））。プライマーＲ−１を第１のＰＣＲに用い、プライマーＲ−２（5'-CTT GCG GAC ATT GGC AGC C-3'、図１参照）を第２のＰＣＲに用いた。なお、forward側のプライマーとしてはいずれの場合もＦ−１（図１参照）を用いた。350bpの5'-RACE産物（5R1）をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした（pT7Blue T-vector（5R1）。5R1の同一性は、Fc1，Tsp1及びTsp2の塩基配列とのオーバーラップにより確認した。ｃＤＮＡの３’末端を同定するために、ヒト脳から抽出されたpoly（A）⁺mRNAの１μｇを鋳型として用い、プライマーＦ−１３（5'-TTC TCT CAG CCA AAG CCT TCT ACT ACC-3'、図３参照）をプライマーとして用いて3'-RACEを行なった。得られた1300bpの3'-RACE産物（3R1）をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした（pT7Blue T-vector（3R1））。
ｃＤＮＡの５’領域をさらに調べるために、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）を行なった。すなわち、ヒト脳からのオートプシーから抽出された全ＲＮＡを先ず、RNaseフリーのDNase（Promega社製）で消化した（Onodera, O. et al., Am. J. Hum. Geent. 57, 1050-1060（1995））。逆転写反応は、２μｇの全ＲＮＡと、２０pmolのランダムヘキサマーを用い、４２℃で行なった（Onodera, O. et al.,前掲）。ＰＣＲのプライマーとしては、F1006（5'-TAT CCG CAG CTC CGC TCC C-3'、図１参照）及びR1002（5'-AGC CGG GCC GAA ACG CGC CG-3'、図１参照）を用いた。５pmolずつの各プライマー、10mM Tris HCl（pH8.3），50mM KCl，1.5mM MgCl₂，1.7M N,N,N−トリメチルグリシン、200μMずつのdATP，dCTP及びTTP、100μMのdGTP、100μMの７−デアザdGTP及び2.5UのTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む総量２０μｌの溶液中でＰＣＲを行なった。９６℃で２分間初期変性を行なった後、９６℃１分間の変性工程、６５℃１分間のアニーリング工程、７２℃１分間の伸長工程から成るサイクルを３０回繰り返し、最後に７２℃で５分間伸長することによりＰＣＲを行なった。その結果、5R1の上流に246bp延びる、クローン５Ｒ１を得た（図６参照）。
なお、図６中、Tsp1及びTsp2断片中の白抜きの部分はＳＣＡ２ｃＤＮＡ中に存在する領域を示す。また、ＳＣＡ２ｃＤＮＡ中の白抜きの部分はコード領域を示す。ＣＡＧ反復領域の位置は黒塗りのボックスで示されている。TspE1（T）、NotI（N）、Sac II（S）、Sau3AI（Sa）、Sma I（Sm）、Eco52I（E52）、Apa I（Ap）、AccI（Ac）、BamHI（B）、XhoI（X）、EcoRI（E）及びPst I（P）の制限酵素部位が示されている。各ｃＤＮＡクローンのサイズ及び位置がコンセンサスＳＣＡ２ｃＤＮＡの下に示されている。
本実施例においては、二本鎖プラスミドＤＮＡを鋳型として用いたジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger, F, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467（1977）; Chen E.Y. et al, DNA 4, 165-170（1985））によりＤＮＡの二本鎖の塩基配列を決定した。ＣＡＧ反復領域及びその隣接領域の塩基配列を決定するために、ビオチン化したF-1及びRS-1（5'-CCT CGG TGT CGC GGC GAC TTC C-3'）を用いたＰＣＲにより、ＣＡＧ反復領域を含むゲノミック断片を増幅した。0.25μＭずつの各プライマー、10mM Tris HCl（pH8.3），50mM KCl，2.0mM MgCl₂，1.7M N,N,N−トリメチルグリシン、200μMずつのdNTP、200ngのゲノミックＤＮＡ、及び1.25UのTaqポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む総量２５μｌの溶液中でＰＣＲを行なった。９５℃で２分間初期変性を行なった後、９５℃１分間の変性工程、６２℃１分間のアニーリング工程、７２℃１分間の伸長工程から成るサイクルを３２回繰り返し、最後に７２℃で５分間伸長することによりＰＣＲを行なった。ストレプトアビジン被覆磁石ビーズを用いてビオチン化された鎖を回収し、直接塩基配列分析を行なった。
上記各ｃＤＮＡクローンの塩基配列に基づき、ポリＡテールを除いて４３５１ｂｐのコンセンサスＳＣＡ２ｃＤＮＡ配列を決定した（配列番号１及び図１〜４、図６参照）。なお、配列番号１の４３５２ｎｔ〜４３６７ｎｔはポリＡテールを示すものであり、Ａの数は必ずしも配列番号１に記載のものに限らない。なお、独立したｃＤＮＡクローンであるＣ１９、Ｂ４及び３Ｒ１において、同一の位置にポリＡテールが存在することが確認された。
実施例２検体中のＣＡＧ反復単位数の測定
プライマーＦ−１及びＲ−１を用いて得られたＰＣＲ産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、ＣＡＧ反復単位の数を測定した。ＰＣＲは、10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2.0mM MgCl₂，1.7M N,N,N-トリメチルグリシン、111KBqの[α-³²P]dCTP（111Tbq/mmol），30μＭ dCTP，各200μＭのdATP，dGTP及びTTP，各0.25μＭの上記２種類のプライマー、200ngのゲノミックＤＮＡ並びに1.25UのTaq DNAポリメラーゼを含む全量１０μｌの溶液中で行った。まず、９５℃、２分間変性を行った後、９５℃、１分間の変性、６０℃、１分間のアニーリング及び７２℃、１分間の伸長からなるサイクルを３２回繰り返し、最後に７２℃、５分間の伸長を行った。ＳＣＡ２遺伝子のクローン化されたゲノミック領域を用いて得られた、種々のサイズのＣＡＧ反復単位を含む配列ラダー（sequence ladder）をサイズマーカーとして用いた。ＣＡＧ反復領域中にＣＡＡを含む正常な対立遺伝子の場合には、これらのＣＡＡ単位はＣＡＧ反復サイズに含めた。ＣＡＧ領域が増大しているＳＣＡ２対立遺伝子の場合、ＣＡＧ領域直後の上記挿入配列はＣＡＧ領域のサイズには含めなかった。
上記の方法により、健常人（２８６染色体）及び１０家系のＳＣＡ２患者（３４種のＳＣＡ２染色体）におけるＣＡＧ反復単位数を測定した。結果を図７に示す。図７中、白抜きの棒グラフが正常遺伝子についての結果を示し、黒塗りの棒グラフがＳＣＡ２遺伝子についての結果を示す。
図７から明らかなように、正常遺伝子ではＣＡＧ反復単位の数が全て２４個以下であるのに対し、ＳＣＡ２遺伝子では全て３５個以上であった。よって、上記により特定されたｃＤＮＡは、ＳＣＡ２の原因遺伝子のｃＤＮＡであることが確認された。
配列表
配列番号：１
配列の長さ：４３６７
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：2
配列の長さ：203
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：3
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：4
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：5
配列の長さ：165
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：6
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：7
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：8
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：9
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：10
配列の長さ：19
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

配列番号：11
配列の長さ：20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列

Claims

配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列（ただし、第１６６番目ないし第１８８番目のGlnの繰り返し数は１５〜１００の間で変化する）をコードする核酸領域を含む核酸断片。
前記核酸領域は、配列表の配列番号１に示される塩基配列のうち、４９ｎｔ〜３９８７ｎｔの領域（ただし、５４３ｎｔ〜６１２ｎｔにあるＣＡＧ又はＣＡＡの繰り返し数は１５〜１００の間で変化し、また、この領域中のＣＡＡはＣＡＧであってもよい）である請求項１記載の核酸断片。
請求項１又は２記載の核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質。
請求項３記載のタンパク質と抗原抗体反応を行う抗体。
請求項１又は２記載の核酸断片を、ヒト体内で所望の遺伝子を発現させることができる発現ベクターに組込んだ、ヒト体内で前記核酸断片を発現させることができる組換えベクター。