JP3976346B2 - 脊髄小脳変性症2型の原因遺伝子のcDNA断片 - Google Patents
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Description
本発明は、脊髄小脳変性症2型(以下、「SCA2」ということがある)の原因遺伝子のcDNA断片、それがコードするタンパク質、該タンパク質に対する抗体及び前記cDNA断片のアンチセンス核酸に関する。
背景技術
SCA2は、小脳及び中枢神経系の他の領域に影響を与える、常染色体性優性神経変性症である。
最近、歯状核赤核・淡蒼球ルイ体委縮症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy(DRPLA))等6種類の神経変性疾患において、原因遺伝子にはCAGから成るトリプレットの反復数が正常な遺伝子よりも多く含まれていることが明らかになった。すなわち、これらの神経変性疾患患者の原因遺伝子では、CAGの反復数が37〜100回であるのに対し、正常な遺伝子では35未満である。
SCA2についても、原因遺伝子ではCAGの反復数が増大していることが示唆されている(Trottier, Y. et al. Nature, 378, 403-406(1995))。しかしながら、SCA2の原因遺伝子は同定されておらず、その塩基配列も明らかではないので、SCA2を遺伝子検査により診断することはできない。
発明の開示
本発明の目的は、塩基配列が決定された、SCA2の原因遺伝子のcDNA断片を提供することである。また、本発明の目的は、SCA2の治療や抗体調製のための免疫原として有用な、SCA2の原因遺伝子に基づいて産生されるタンパク質を提供することである。さらに、本発明の目的は、SCA2の治療や診断に有用な、該タンパク質に対する抗体を提供することである。
本願発明者らは、鋭意研究の結果、SCA2患者においてのみCAGトリプレットの繰り返し数が増大している、2.5kbのTspE1断片を見出し、その部分塩基配列を決定し、CAGトリプレットの繰り返しを挟む2つの領域にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとして用いてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングしてこれら2種類のプローブの両方とハイブリダイズするcDNA断片をクローニングし、さらにこのcDNA断片をプローブとして用いてヒトcDNAライブラリーをスクリーニングし、このプローブとハイブリダイズするcDNA断片を複数クローニングした。これらのcDNA断片の塩基配列を決定したところ、これらは互いに重複していた。5’末端側及び3’末端側の領域の塩基配列を決定するために、さらにRACE(rapid amplification of cDNA ends)を行ない、さらに5’側の端部の塩基配列を決定するためにRT−PCRを行ない、SCA2の原因遺伝子のcDNAの全領域の塩基配列を決定することに成功した。
すなわち、本発明は、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列(ただし、第166番目ないし第188番目のGlnの繰り返し数は15〜100の間で変化する)をコードする核酸領域を含む核酸断片を提供する。また、本発明は、上記本発明の核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質を提供する。さらに本発明は、該タンパク質と抗原抗体反応を行う抗体を提供する。
本発明により、塩基配列が決定された、SCA2の原因遺伝子のcDNA断片が提供された。本発明の核酸断片によりコードされるタンパク質はSCA2の治療に用いることができるし、また、SCA2の治療及び診断に有用な抗体を調製するための免疫原として用いることができる。さらに、本発明により、SCA2の原因遺伝子の塩基配列が明らかにされたので、該遺伝子に対するアンチセンスを設計することが可能になった。さらに、本発明により、上記本発明の核酸断片を、ヒト体内で所望の遺伝子を発現させることができる発現ベクターに組込んだ、ヒト体内で前記核酸断片を発現させることができる組換えベクターが提供された。このように、本発明はSCA2の治療及び診断に大いに貢献するものと考えられる。
【図面の簡単な説明】
図1は、本発明の実施例において決定された、本発明のcDNA断片の塩基配列をそれがコードするアミノ酸配列とともに示す図である。
図2は、図1の続きを示す図である。
図3は、図2の続きを示す図である。
図4は、図3の続きを示す図である。
図5は、本発明の実施例において材料として用いられたDNAが由来するSCA2患者の家系図である。
図6は、本発明の実施例において得られたゲノミックDNA断片Tsp1及びTsp2並びにSCA2cDNAのサイズ、位置及び制限酵素部位並びに得られた各cDNA断片のサイズ及び位置を示す図である。
図7は、(CAG)55プローブを用いて測定された、正常遺伝子及びSCA2遺伝子中のCAG反復単位の数の分布を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
上記のように、本発明の核酸断片は、配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードする核酸領域を含む。ただし、第166番目ないし第188番目のGlnの繰り返し数は15〜100の間で変化する。なお、この繰り返し数は、健常人では15〜25個であり、一方、SCA2患者では35〜100個である。なお、周知のように、縮重により1つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在するが、配列番号1に示されるアミノ酸配列をコードするものであれば、いずれの塩基配列を有するものであっても本発明の範囲に含まれる。なお、下記実施例において実際に決定された塩基配列は配列番号1及び図1〜4に示される。この塩基配列がどのようにして決定されたか、また、この塩基配列を有するcDNAがSCA2の原因遺伝子のcDNAであることは下記実施例に詳述されている。
本発明の核酸断片は、下記実施例に詳述する方法によりクローニングすることができる。また、本発明の核酸断片は、本発明によりその塩基配列が決定されたので、ヒトcDNAライブラリーを鋳型として用いたPCRによる増幅や、さらにそのPCR産物をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、クローニングすることができる。なお、単一のPCRで増幅することが困難な場合には、複数の領域に分け、増幅産物を常法により連結してクローニングすることもできる。
上記本発明の核酸断片を、常法により、市販の発現ベクターのマルチクローニング部位に組込み、得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換することにより、該核酸断片によりコードされるタンパク質を発現させることができる。任意の遺伝子を宿主細胞内で発現させるための宿主−ベクター系は、この分野において周知であり、多くの宿主−ベクター系が市販されている。このような市販の宿主−ベクター系を用いて当業者は容易に本発明の核酸断片を発現させてタンパク質を生産することができる。このような周知の方法は例えば、D. M. Glover, DNA Cloning Volume III a practical approach, 1987, IRL Pressに記載されている。
例えば、本発明の核酸断片を、定法に従い、プライマーに制限酵素部位を導入したロングPCR(LA PCR)(向井博之 蛋白質核酸酵素Vol41, No.5, 585-594, 1996)を用いて増幅させ、増幅産物を制限酵素処理し、これを市販のプラスミドベクターであるpGEX(ファルマシア社製)のマルチクローニング部位に挿入してライゲーションし、得られた組換えベクターで大腸菌DH5α株(GIBCO BRL社製)を常法である塩化カルシウム法により形質転換し、薬剤耐性マーカー(アンピシリン耐性)の形質転換株を選択し、該形質転換株からSCA2の原因遺伝子がコードするタンパク質を回収することができる。またこのベクターを用いると目的蛋白質は、GST(Glutathion S-Transferase)との融合蛋白質として発現するので、市販の抗GST抗体(ファルマシア社製)を用いて容易に検出する事ができる。
健常人の遺伝子(CAGリピートが15〜25回)に基づいて産生されたタンパク質で活性を持つものは、正常な機能を有していると考えられるので、これをSCA2患者に投与することによりSCA2を治療し又はその症状を軽減させることができる。ただしSCA2の遺伝形式は、常染色体優性遺伝であるので、後述するアンチセンスにより、患者由来のSCA2原因遺伝子を同時にブロックする必要がある。
上記本発明のタンパク質又は免疫原性を有するその一部を免疫原として用いて動物を免疫し、該動物から常法により該タンパク質又はその部分に対する抗体を回収することができる。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体も周知の方法により調製できる。
またCAGリピートによってコードされるポリグルタミン鎖を用いて、その長さの違いのみによって反応性の異なる抗体を作製することは論理的に困難であるが、本発明で明らかになった、蛋白質の全長を用いることにより、健常人と患者の蛋白質の違いを立体構造の違いとして認識する抗体をつくることができる。さらに本発明により、SCA2遺伝子産物で、健常人と患者に共通な部分を用いて抗体を作製することができるので、本発明蛋白質に対する抗体を用いた、あらゆる検出系において対照が可能となる。これらの抗体を用いて、定法により、例えばプレート法のような簡便な検出法を作ることができる。
また、本発明の抗体を、周知の方法によりアガロースゲル(例えばファルマシア社のセファデックス(商品名)等)やポリスチレンビーズ等に常法により不動化し、カラムに詰めてアフィニティーカラムを作製することができる。このアフィニティカラムに患者の体液(血液、血清、髄液等)を通すことにより、患者のSCA2原因遺伝子由来タンパク質を取得することができ、これを溶離してその分子量を測定することにより、SCA2の診断を行うことができる。なぜならSCA2患者の当該タンパク質は健常人のものよりも、CAGリピートが多い分だけ分子量が大きいからである。
また遺伝子治療としては、異常SCA2産物の産生停止と正常SCA2産物の導入の2通りが考えられ、前者の方法としては、アンチセンスを使った、mRNAの翻訳のブロック、後者の方法としては、前述のような、インビトロで得られたSCA2遺伝子産物の投与や当該核酸断片の細胞内への導入がある。CAGリピートの伸長によるSCA2患者においては、異常タンパク質が優性に作用すると考えられていることから、両者を同時に行うことで効果が得られると予想されるが、該核酸断片の導入の場合はアンチセンスをSCA2産物の活性に関与しない部分に設定し、導入される正常SCA2遺伝子からはその部分を取り除き、互いに効果を相殺させないようにする。またそのようにアンチセンスと正常SCA2遺伝子を設定することにより、上記アンチセンスとSCA2遺伝子を同一ベクター内に組込んで細胞内へ導入することも可能である。
上記アンチセンス核酸は、本発明の核酸断片から転写されるmRNAとハイブリダイズしてその翻訳を阻害するものであり、少なくとも15bpのサイズを有する。アンチセンスのサイズは15bp以上、核酸断片のコード領域の全長以下のサイズを有することが好ましく、より好ましくは50bp以上、コード領域の全長以下である。アンチセンス核酸は、本発明の核酸断片から転写されるmRNAの全部又は一部と完全に相補的な塩基配列を有していることが好ましいが、生体内でハイブリダイズできるだけの相同性を有しているものも上記アンチセンス核酸に包含される。本発明のアンチセンスをSCA2患者に投与することにより、患者のSCA2原因遺伝子をブロックすることができ、そうした上で健常人由来の上記タンパク質を投与することによりSCA2の治療又は症状の軽減を達成することができる。アンチセンス核酸の投与量は、患者の状態により適宜選択されるが、通常体重1kg、1日当り本発明のアンチセンス核酸を0.001mmol〜1000mmol程度投与する。
遺伝子を生体内に導入する主な手段として、レトロウイルスやアデノウイルスをベクターとして用いる方法(瀬戸口靖弘、実験医学Vol.12 No.15(増刊)1994,pp.114-121;鐘ケ江裕美ら、実験医学Vol.12 No.15(増刊)1994,pp.34-40)、リポソームによる方法、あるいはそれらを融合したもの(膜融合リポソーム等)が知られている。そのうちのアデノウイルスは、標的細胞の分裂増殖なしで導入遺伝子を発現させるため、当該核酸を神経系へ導入する手段としてもっとも適当である。具体的には野生株アデノウイルス5型DNAのE1aの一部とE3を取り除き、二本鎖DNAとした当該核酸をプロモーター等の発現ユニットと共に組み込み、E1a、E1b遺伝子を発現するヒト胎児腎由来の293細胞で増殖させ、ウイルス液を調整して接種する。細胞核内に取り込まれたウイルスゲノムは複製することなく染色体外にあり、神経細胞では細胞分裂によってウイルスゲノムが失われないので、1〜3ヶ月間は、正常SCA2遺伝子の発現を持続させることができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例1
(1) (CAG)55プローブの調製
CAG反覆単位を50個含む歯状核赤核・淡蒼球ルイ体委縮症(dentatorubral-pallidoluysian atrophy(DRPLA))遺伝子(Koide, R. et al., Nature Genet., 6, 9-13(1994))をDRPLA患者のゲノミックDNAから増幅し、プラスミドベクターpT7Blue T(p-2093)にサブクローニングした。p-2093は、(CAG)55及びその両端のフランキング配列を含む。すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA(CAG)55CAT CAC GGA AAC TCT GGG CC-3'で表される配列を含む。一対のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、5'-CAC CAC CAG CAA CAG CAA CA-3'及び5'-ビオチン-GGC CCA GAG TTT CCG TGA TG-3'を用いてPCRを行なった。PCRは、10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,1.5mM MgCl2,2M N,N,N-トリメチルグリシン、0.1mM TTP,0.1mM dCTP,0.1mM dGTP,9.25MBqの[α-32P〕dATP(222TBq/mmol),0.5μMずつの各プライマー、0.3ngのプラスミドDNA(p-2093)及び2.0UのTaqDNAポリメラーゼ(日本国京都府の宝酒造社製)を含む全量16μlの溶液を用いて行った。最初に94℃で2分間変性を行った後、94℃、1分の変性、54℃、1分のアニーリング、72℃、3分の伸長を30サイクル行い、最後に72℃で10分間伸長を行った。
20μlのストレプトアビジンを被覆した磁化ビーズ(Dynabeads M-280, Streptavidin;ノルウェー、Dynal AS社製)を用いて一本鎖(CAG)55プローブを調製した。すなわち、PCR産物をストレプトアビジン被覆磁化ビーズに吸着させた後、5mM Tris-HCl(pH7.5)、0.5mM EDTA及び1M NaClを含む40μlの溶液でビーズを洗浄した。次いで50μlの0.1M NaOH溶液中で10分間インキュベートすることにより、放射標識された非ビオチン化鎖をビオチン化鎖から分離した。得られた上清をプローブ液としてそのまま下記ハイブリダイゼーションに用いた。
なお、上記のようにして調製した一本鎖(CAG)55プローブを用いて、CAG反復単位数が9、22、43、51であるアンドロゲンレセプター遺伝子についてサザン分析を行ったところ、(CAG)55プローブはCAG反復単位が43及び51個の遺伝子とは強くハイブリダイズしたが、22個の遺伝子とはほとんどハイブリダイズせず、9個の遺伝子とは全くハイブリダイズしなかった(K. Sanpei et al.,Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol.212, No.2, 1995, pp.341-346)。すなわち、このプローブを用いれば、ハイブリダイゼーション条件を適正に設定することにより、CAG反復単位を多数(例えば35個以上)含むDNAとのみ特異的にハイブリダイズさせることが可能である。
(2) SCA2遺伝子の塩基配列決定
図5には、SCA2患者の家系図を示す。この家系図において、男性が四角、女性が丸で示されており、患者は黒く塗りつぶされており、健常人は白抜きで示されている。
これらのSCA2患者及び健常人から常法により採取した高分子量ゲノミックDNA(各15μg)を100UのTspEI(日本国大阪府の東洋紡績社製)で消化し、0.8%アガロースゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、該膜を上記(CAG)55プローブとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションは、2.75 x SSPE(1 x SSPE=150mM NaCl,10mM NaH2PO4,1mM EDTA),50%ホルムアミド、5xデンハルツ液、100ng/ml剪断サケ精子DNA及び(CAG)55プローブ(6 x 106cpm/ml)を含む溶液中で62℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、0.5% SDSを含む1 x SSC(150mM NaCl,15mMクエン酸ナトリウム)で膜を65℃で0.5時間洗浄した。次いで、MS増感スクリーンを用い、Kodak Bio Max MSフィルムに16時間−70℃でオートラジオグラフィーにかけた。
その結果、全てのSCA2患者についてのみ、プローブとハイブリダイズした2.5kbpのTspEI断片が検出された。
そこで、一人のSCA2患者(図5中の7)からゲノミックDNAを常法により抽出し、その270μgをTspEIで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけた。上記した2.5kbのTspEI断片を包含するゲノミックDNA断片を、EcoRIで開裂したλZAPII(Stratagene社製)ベクターにクローニングした。得られたゲノミックライブラリーを上記(CAG)55プローブを用い、上述したハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせることによりスクリーニングした。増大したCAG反復を含むゲノミッククローンTsp1が単離された。
プローブを除去した後、ランダムプライム法により標識したTsp1をプローブとして用いて上記ゲノミックライブラリーを再度スクリーニングした。ハイブリダイゼーションは5 x SSC,1 x デンハルツ液、10%硫酸デキストラン、20mMリン酸ナトリウム、400μg/mlのヒト胎盤DNA及びTsp1プローブを含む溶液中で42℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.1 x SSC-0.1% SDS中で52℃で0.5時間洗浄した。MS増感スクリーンを用い、膜をKodak Bio Max MSフィルムに−70℃で24時間オートラジオグラフィにかけた。その結果、正常な対立遺伝子由来のゲノミッククローンであるTsp2が単離された。
また、Tsp2のSmaI-ApaI断片(630bp)の塩基配列を決定し、CAG反復領域を挟むようにオリゴヌクレオチドF−1(5'-CCC TCA CCA TGT CGC TGA AGC-3')及びR−1(5'-CGA CGC TAG AAG GCC GCT G-3')を設定した(図1参照)。ヒト前脳皮質cDNAライブラリー(Stratagene社製)をオリゴヌクレオチドF2−1及びR−1をプローブとして用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、6 x SSC,10 x デンハルツ液、0.5% SDS,0.05%ピロリン酸ナトリウム、100ng/ml剪断サケ精子DNA及び末端標識オリゴヌクレオチドプローブを含む溶液中で55℃で18時間行った。ハイブリダイゼーション後、膜を最終的に0.5% SDS及び0.05%ピロリン酸ナトリウムを含む6 x SSC中で55℃で0.5時間洗浄した。両方のプローブとハイブリダイズする、4.0kbのcDNAクローンFc1が得られた。Fc1、Tsp1及びTsp2の塩基配列を決定し、比較したところ、CAG反復領域近傍の塩基配列は、CAGの反復回数を除き一致していた。なお、Tsp1及びTsp2の制限酵素地図並びにFc1及び後述の他の断片のサイズ及び位置を図6に示す。さらに、Fc1又は以降のスクリーニングにより単離された断片をプローブとして用いて種々のヒトcDNAライブラリー(ヒト前脳皮質、ヒト胎児脳、ヒト脳及びヒト脳幹)をスクリーニングすることにより、cDNAクローンFc2、Fb14、B4、C6及びC19を単離した(図6参照)。Fc1の5’末端を同定するために、5'-RACE-Ready cDNA(Clonetech, Palo Alto, CA, USA)を用いて5'-RACEを行った(Frohman, M.A. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002(1988))。プライマーR−1を第1のPCRに用い、プライマーR−2(5'-CTT GCG GAC ATT GGC AGC C-3'、図1参照)を第2のPCRに用いた。なお、forward側のプライマーとしてはいずれの場合もF−1(図1参照)を用いた。350bpの5'-RACE産物(5R1)をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした(pT7Blue T-vector(5R1)。5R1の同一性は、Fc1,Tsp1及びTsp2の塩基配列とのオーバーラップにより確認した。cDNAの3’末端を同定するために、ヒト脳から抽出されたpoly(A)+mRNAの1μgを鋳型として用い、プライマーF−13(5'-TTC TCT CAG CCA AAG CCT TCT ACT ACC-3'、図3参照)をプライマーとして用いて3'-RACEを行なった。得られた1300bpの3'-RACE産物(3R1)をpT7Blue Tベクターにサブクローニングした(pT7Blue T-vector(3R1))。
cDNAの5’領域をさらに調べるために、逆転写PCR(RT-PCR)を行なった。すなわち、ヒト脳からのオートプシーから抽出された全RNAを先ず、RNaseフリーのDNase(Promega社製)で消化した(Onodera, O. et al., Am. J. Hum. Geent. 57, 1050-1060(1995))。逆転写反応は、2μgの全RNAと、20pmolのランダムヘキサマーを用い、42℃で行なった(Onodera, O. et al.,前掲)。PCRのプライマーとしては、F1006(5'-TAT CCG CAG CTC CGC TCC C-3'、図1参照)及びR1002(5'-AGC CGG GCC GAA ACG CGC CG-3'、図1参照)を用いた。5pmolずつの各プライマー、10mM Tris HCl(pH8.3),50mM KCl,1.5mM MgCl2,1.7M N,N,N−トリメチルグリシン、200μMずつのdATP,dCTP及びTTP、100μMのdGTP、100μMの7−デアザdGTP及び2.5UのTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)を含む総量20μlの溶液中でPCRを行なった。96℃で2分間初期変性を行なった後、96℃1分間の変性工程、65℃1分間のアニーリング工程、72℃1分間の伸長工程から成るサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で5分間伸長することによりPCRを行なった。その結果、5R1の上流に246bp延びる、クローン5R1を得た(図6参照)。
なお、図6中、Tsp1及びTsp2断片中の白抜きの部分はSCA2cDNA中に存在する領域を示す。また、SCA2cDNA中の白抜きの部分はコード領域を示す。CAG反復領域の位置は黒塗りのボックスで示されている。TspE1(T)、NotI(N)、Sac II(S)、Sau3AI(Sa)、Sma I(Sm)、Eco52I(E52)、Apa I(Ap)、AccI(Ac)、BamHI(B)、XhoI(X)、EcoRI(E)及びPst I(P)の制限酵素部位が示されている。各cDNAクローンのサイズ及び位置がコンセンサスSCA2cDNAの下に示されている。
本実施例においては、二本鎖プラスミドDNAを鋳型として用いたジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法(Sanger, F, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467(1977); Chen E.Y. et al, DNA 4, 165-170(1985))によりDNAの二本鎖の塩基配列を決定した。CAG反復領域及びその隣接領域の塩基配列を決定するために、ビオチン化したF-1及びRS-1(5'-CCT CGG TGT CGC GGC GAC TTC C-3')を用いたPCRにより、CAG反復領域を含むゲノミック断片を増幅した。0.25μMずつの各プライマー、10mM Tris HCl(pH8.3),50mM KCl,2.0mM MgCl2,1.7M N,N,N−トリメチルグリシン、200μMずつのdNTP、200ngのゲノミックDNA、及び1.25UのTaqポリメラーゼ(宝酒造社製)を含む総量25μlの溶液中でPCRを行なった。95℃で2分間初期変性を行なった後、95℃1分間の変性工程、62℃1分間のアニーリング工程、72℃1分間の伸長工程から成るサイクルを32回繰り返し、最後に72℃で5分間伸長することによりPCRを行なった。ストレプトアビジン被覆磁石ビーズを用いてビオチン化された鎖を回収し、直接塩基配列分析を行なった。
上記各cDNAクローンの塩基配列に基づき、ポリAテールを除いて4351bpのコンセンサスSCA2cDNA配列を決定した(配列番号1及び図1〜4、図6参照)。なお、配列番号1の4352nt〜4367ntはポリAテールを示すものであり、Aの数は必ずしも配列番号1に記載のものに限らない。なお、独立したcDNAクローンであるC19、B4及び3R1において、同一の位置にポリAテールが存在することが確認された。
実施例2 検体中のCAG反復単位数の測定
プライマーF−1及びR−1を用いて得られたPCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることにより、CAG反復単位の数を測定した。PCRは、10mM Tris-HCl,pH8.3,50mM KCl,2.0mM MgCl2,1.7M N,N,N-トリメチルグリシン、111KBqの[α-32P]dCTP(111Tbq/mmol),30μM dCTP,各200μMのdATP,dGTP及びTTP,各0.25μMの上記2種類のプライマー、200ngのゲノミックDNA並びに1.25UのTaq DNAポリメラーゼを含む全量10μlの溶液中で行った。まず、95℃、2分間変性を行った後、95℃、1分間の変性、60℃、1分間のアニーリング及び72℃、1分間の伸長からなるサイクルを32回繰り返し、最後に72℃、5分間の伸長を行った。SCA2遺伝子のクローン化されたゲノミック領域を用いて得られた、種々のサイズのCAG反復単位を含む配列ラダー(sequence ladder)をサイズマーカーとして用いた。CAG反復領域中にCAAを含む正常な対立遺伝子の場合には、これらのCAA単位はCAG反復サイズに含めた。CAG領域が増大しているSCA2対立遺伝子の場合、CAG領域直後の上記挿入配列はCAG領域のサイズには含めなかった。
上記の方法により、健常人(286染色体)及び10家系のSCA2患者(34種のSCA2染色体)におけるCAG反復単位数を測定した。結果を図7に示す。図7中、白抜きの棒グラフが正常遺伝子についての結果を示し、黒塗りの棒グラフがSCA2遺伝子についての結果を示す。
図7から明らかなように、正常遺伝子ではCAG反復単位の数が全て24個以下であるのに対し、SCA2遺伝子では全て35個以上であった。よって、上記により特定されたcDNAは、SCA2の原因遺伝子のcDNAであることが確認された。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:4367
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:2
配列の長さ:203
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:3
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:4
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:5
配列の長さ:165
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:6
配列の長さ:21
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:7
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:8
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:9
配列の長さ:27
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:10
配列の長さ:19
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
配列番号:11
配列の長さ:20
配列の型:核酸
鎖の数:一本鎖
トポロジー:直鎖状
配列
Claims (5)
- 配列表の配列番号1に示されるアミノ酸配列(ただし、第166番目ないし第188番目のGlnの繰り返し数は15〜100の間で変化する)をコードする核酸領域を含む核酸断片。
- 前記核酸領域は、配列表の配列番号1に示される塩基配列のうち、49nt〜3987ntの領域(ただし、543nt〜612ntにあるCAG又はCAAの繰り返し数は15〜100の間で変化し、また、この領域中のCAAはCAGであってもよい)である請求項1記載の核酸断片。
- 請求項1又は2記載の核酸断片によりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質。
- 請求項3記載のタンパク質と抗原抗体反応を行う抗体。
- 請求項1又は2記載の核酸断片を、ヒト体内で所望の遺伝子を発現させることができる発現ベクターに組込んだ、ヒト体内で前記核酸断片を発現させることができる組換えベクター。
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