JP2006515762A - 家族性高コレステロール血症に関連する低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−ｒ）の単離された遺伝子配列における突然変異の検出のための方法及びデバイス - Google Patents

Abstract

本発明は、家族性高コレステロール血症を引き起こす突然変異の存在の有無を分析する体外法に関する。本発明の方法は、個体からのＤＮＡ試料を用いて前記突然変異を検出できる方法を記載し、以下、即ち低密度リポタンパク質受容体遺伝子と相補性のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応、配列決定による増幅産物の分析、制限分析、一本鎖高次構造多型法、ヘテロ二本鎖分析、及びオリゴヌクレオチドプローブが配列するバイオチップガラス支持体上面にあるデバイスの分析を含み、本方法はＤＮＡにおける前記突然変異を検出するために使用できる。

Description

本発明は、家族性高コレステロール血症という名の疾患に対する個体の疾病素質を判定するための体外「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」生体試料の専門診断の領域に属する。

ＷＨＯの定義によると、アテローム性動脈硬化症は、線維組織の形成、石灰化を伴い、同様に中膜における変化に関連した脂質及び複合化合物の限局性蓄積に起因する動脈内膜における変化の組合せである。

アテローム性動脈硬化症は、動脈壁への脂質の病原的に重大な沈着を伴う特別な形の動脈硬化症とみなされる場合もある。大部分の形の動脈硬化症は血管壁の脂肪変性を伴い、「動脈硬化症」及び「アテローム性動脈硬化症」という用語を同義語的に使用できる（Ａｓｓｍａｎｎ Ｇ．「脂質代謝とアテローム性動脈硬化症（Ｌｉｐｉｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、Ｓｃｈａｔｔａｕｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧＭｂＨ、シュトゥットガルト、１９８２：１頁）。

脂質は水溶液に不溶である。リポタンパク質は血中への脂質の輸送を可能にする粒子である。リポタンパク質は超遠心によりどのように分離できるかに応じて、その密度により様々な種類に分類される（Ｈａｖｅｌ ＲＪら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９５５、３４：１３４５頁）。低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）（ｄ＝１．０１９〜１．０６３ｇ／ｍＬ）は血中でコレステロールの積み荷を輸送する。ＬＤＬは脂質（主にコレステロール、コレステリルエステル及びリン脂質）約７５％から構成され、血中コレステロールの総量の約７０％がＬＤＬ粒子により輸送される。

抗コレステロール血症は特定の集団に対して正常とみなされるレベルよりも高い血漿中コレステロールの増加を表すために使用され、アテローム性動脈硬化症の発症及び進行における決定的な要因の１つである。西欧社会における死亡の半分超がアテローム性動脈硬化性心血管疾患に関係している（Ｍｕｒｒａｙ ＣＪＬ及びＬｏｐｅｚ ＡＤ．Ｌａｎｃｅｔ １９９７；３４９：１２６９〜１２７６頁）。

家族性高コレステロール血症（ＦＨ）はＬＤＬ受容体遺伝子（ＬＤＬ−ｒ）に作られる常染色体優性遺伝性疾患である。この遺伝子はＬＤＬの細胞内取り込み及び分解を可能にするタンパク質をコードする（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＪＬ、Ｂｒｏｗｎ ＭＳ Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８５；１：１〜３９頁）。

ＦＨの浸透度はほぼ１００％であり、これは冒された親の子孫の半数が誕生以後血漿中コレステロールレベルの激しい上昇を有し、男性及び女性が等しく冒されることを意味する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＪＬ、Ｂｒｏｗｎ ＭＳ．「遺伝性疾患の代謝的基礎（Ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ）」Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＲ、Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ、Ｓｌｙ ＷＳ、Ｖａｌｌｅ Ｄ編、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、ニューヨーク、第６版、１９８９；１２１５〜１２５０頁）。

ＦＨに冒された個体は、角膜輪、腱黄色腫、及び若年性症候性冠性心疾患を表す（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｍｏｎ Ｂｒｏｏｍｅ ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９９；１４２：１０５〜１１５頁）。ＦＨはヘテロ接合の患者の頻度及びホモ接合体の頻度がそれぞれ１／５００及び１／１００００００と推定されている最もよくみられる遺伝性障害の１つである。

少数の突然変異のようなある集団が創立者効果により優勢であると、ヘテロ接合性ＦＨの頻度は高くなる。これらの集団にはフランス系カナダ人（Ｌｅｉｔｅｒｓｄｏｒｆ Ｅら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９０；８５：１０１４〜１０２３頁）、キリスト教レバノン人（Ｌｅｈｒｍａｎ ＭＡら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２：４０１〜４１０頁）、ドルーズ派（Ｌａｎｄｓｂｅｒｇｅｒ Ｄら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９２；５０：４２７〜４３３頁）、フィンランドの原住民（Ｋｏｉｖｉｓｔｏ ＵＭら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９２；９０：２１９〜２２８頁）、南アフリカアフリカ人（Ｋｏｔｚｅ ＭＪら、Ａｎｎ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９１；５５：１１５〜１２１頁）があり、リトアニア系アシュケナジユダヤ人（Ｍｅｉｎｅｒ Ｖら、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９１；４９：４４３〜４４９頁）はＦＨの原因である突然変異をわずか２、３しか有さないという特色を持つ。これらは創立者効果の結果であるため、これらの集団におけるヘテロ接合性ＦＨの頻度は他の集団に対する推定値よりも高い。

ＦＨヘテロ接合性患者は、一般に９５パーセンタイル値を超える非常に高い血漿中コレステロール濃度を示す。ＦＨを有する患者では年齢標準化死亡率及び性別標準化死亡率は一般集団に比べ４〜５倍高い（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ ｂｅｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｍｏｎ Ｂｒｏｏｍｅ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９９；１４２：１０５〜１１５頁）。ＬＤＬ−ｒ遺伝子座に２つの突然変異が遺伝した患者は「ＦＨホモ接合体」又は「ＦＨ複合ヘテロ接合体」と称し、この場合ＬＤＬ受容体は実際的に機能的受容体ではなく、血漿中ＬＤＬ−ｃレベルを正常値に比べ６〜８倍に上昇させる。これらの患者の大多数では２０歳前の年齢で冠性心疾患が概して起こる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＪＬら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８３；３０９：２８８〜２９６頁）。ヘテロ接合性又はホモ接合性ＦＨを有する個体が症候性疾患を発症する前に診断できるのであれば、予防的にそれらの個体を治療して心筋梗塞のリスクを実質的に減らすことができるであろう。

ＬＤＬ−ｒは、エンドサイトーシスにより細胞へのＬＤＬの輸送を仲介する、アミノ酸８３９個の汎存膜貫通糖タンパク質である（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｊ及びＢｒｏｗｎ Ｍ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７４；２４９：５１５３〜５１６２頁）（図１）。

ＬＤＬ−ｒ遺伝子は、染色体１９ｐ１３．１〜１３．３の短腕に位置し（Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｔら、Ｃｅｌｌ １９８４；３９：２７〜３８頁）、４５０００塩基対（ｂｐ）に及ぶ。この遺伝子は、成熟タンパク質の６つの機能的ドメインであるシグナルペプチドドメイン、リガンド結合ドメイン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）前駆体様ドメイン、Ｏ結合型糖ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインをコードする１８個のエキソン及び１７個のイントロンを含む（Ｓｕｎｄｈｏｆ Ｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５；２２８：８９３〜８９５頁）（図２）。

ＬＤＬ−ｒ合成は、細胞内ステロール濃度の変動及び細胞のコレステロール要求性に応答してＬＤＬ−ｒ遺伝子の転写を制御する高度フィードバックメカニズムにより調節されている（Ｓｕｄｈｏｆ ＴＣら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２：１０７７３〜１０７７９頁）。ＬＤＬ−ｒ遺伝子の転写調節に必要なＤＮＡモチーフは隣接プロモーターから１７７ｂｐ以内に位置する（Ｓｕｄｈｏｆ ＴＣら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８７；２６２：１０７７３〜１０７７９頁）。この領域は基礎発現及びステロールの調節を行うためのすべてのシス作用領域を含有し、それぞれ１６ｂｐの不完全ダイレクトリピート３つを含んでいる。リピート１及び３は、転写因子Ｓｐ１に対する結合部位を含み、遺伝子の基礎発現を作り出すために必須であるが、完全な発現にはリピート２の寄与を必要とする（Ｄａｗｓｏｎ ＰＡら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９８８；２６３；３３７２〜３３７９頁）。リピート２は１０ｂｐの調節エレメントであるＳＲＥ−１を含み（Ｓｍｉｔｈ ＪＲら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０；２６５：２３０６〜２３１０頁）、細胞内ステロール濃度が減少した場合にＳＲＥ−１はＳＲＥＢＰ−１と称する転写因子の結合を可能にする。今日までに、いくつかの自然突然変異がＬＤＬ遺伝子受容体の転写調節エレメントに位置付けされた（Ｈｏｂｂｓ ＨＨら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ １９９２；１：４４５〜４６６頁；Ｋｏｉｖｉｓｔｏ ＵＭら、ＰｒｏｃＮａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９９４；９１：１０５２６〜１０５３０頁）、Ｍｏｚａｓ Ｐら、Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ２００２；４３：１３〜１８頁、ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｆｈ；ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｎｅｃｋｅｒ．ｆｒ）。

エキソン１はアミノ酸２１個の配列であるシグナルペプチドをコードし、シグナルペプチドは小胞体に移行する際にタンパク質から開裂する。数個のフレームシフト突然変異、ミスセンス突然変異及びナンセンス突然変異はこのエキソンで起こることが記載されている（ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｆｈ；ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｕｍｄ．ｎｅｃｋｅｒ．ｆｒ）。

エキソン２〜６はリガンド結合ドメインをコードし、リガンド結合ドメインはそれぞれアミノ酸４０個のタンデムリピート７個からなる。リガンド結合ドメインの構造は部分的に解明された（Ｊｅｏｎ Ｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃ Ｂｉｏｌ ２００１；８：４９９〜５０４９頁）。各リピートには負に荷電したアミノ酸のクラスターＡｓｐ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ及び３つのジスルフィド結合を形成する６つのシステイン残基がある。

ヒトＬＤＬ−ｒの第２ドメインは、エキソン７〜１４がコードするアミノ酸４００個の配列からなる。この配列は、上皮増殖因子前駆体（ＥＧＦＰ）と３３％の相同性を示す。リガンド結合ドメインのように、この領域もシステインリッチ配列を有するアミノ酸４０個のリピート３個を含む。Ａ及びＢと称する初めの２つのリピートは連続し、ＹＷＴＤ（Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ）配列の５つのコピーを含む２８０個のアミノ酸領域により第３リピートとは離れている。ＥＧＦＰ様ドメインは、受容体のリサイクリングの際にエンドソームで起こる、ＬＤＬ−ｒ及びクラスリン被覆ピットからのＬＤＬ粒子の酸依存性解離の基本となる。今までに記載されたすべての突然変異のうち、約５５％はＥＧＦＰホモロジー領域に位置し、３５％はＹＷＴＤリピートに位置する（ｈｔｔｐ．／／ｗｗｗ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｆｈ）。

エキソン１５がコードするＬＤＬ−ｒの第３ドメインは、トレオニン及びセリン残基に富む領域である。このドメインの機能は未知であるが、この領域では糖鎖がアンカーを形成することが分かっている。この領域は、分析された６種の間で最低の配列保存性を示し、このドメインは受容体の安定化に役割を果たすと考えられている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、「遺伝性疾患の代謝及び分子的基礎（Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ）」Ｓｃｉｖｅｒ ＣＲ、Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ、Ｓｌｙ ＷＳ、Ｖａｌｌｅ Ｄ．、第７版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、１９９５：１９８１〜２０３０頁）。

膜貫通ドメインは、エキソン１６及びエキソン１７の５’末端がコードする２２個の疎水性アミノ酸を含む。このドメインは細胞膜にＬＤＬ−ｒがアンカー形成するために必須である。

ＬＤＬ−ｒの細胞質ドメインは、５０個のアミノ酸残基の配列により形成され、エキソン１７の３’領域及びエキソン１８の５’末端によりコードされる。このドメインはタンパク質を細胞表面にターゲッティングするための、及び被覆ピットに受容体を局在化するための２つの配列シグナルを含む（Ｙｏｋｏｄｅ Ｍら、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９２；１１７：３９〜４６頁）。このドメインは分析された６種の間で８６％のアミノ酸が保存されている、最も保存性の高いドメインの１つである。

ＦＨ患者でみられるＬＤＬ−ｒ突然変異は、５つのクラスであるヌル対立遺伝子、輸送欠損対立遺伝子、結合欠損対立遺伝子、インターナリゼーション欠損対立遺伝子及びリサイクリング欠損対立遺伝子に分類されている。一般則としてそれぞれの分類区分は、タンパク質の特定の一ドメインをコードする遺伝子領域に局在する突然変異に関連している（Ｈｏｂｂｓ，ＨＨら、Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ １９９２；１：４４５〜４６６頁）。

血漿中ＬＤＬ−ｃレベル及び冠性心疾患に関するＦＨ患者の不均一性は、突然変異の性質における相違が一部の原因となっている（Ｓｕｎ ＸＭら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓ Ｂｉｏｌ １９９３；１３：１６８０〜１６８８頁、Ｋｏｔｚｅ ＭＪら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓ Ｂｉｏｌ １９９３；１３：１４６０〜１４６８頁；Ｇｕｄｎａｓｏｎ Ｖら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓ Ｂｉｏｌ １９９７；１７：３０９２〜３１０１頁）。他方で、ＦＨヘテロ接合性患者においてヒドロキシメチルグルタリルコエンザイムＡ（ＨＭＧＣｏＡ）還元酵素阻害剤による治療後のＬＤＬ−ｃ低下応答は、ＬＤＬ−ｒ遺伝子における突然変異の性質に部分的に依存する（Ｌｅｉｓｔｅｒｄｏｒｆ Ｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９３；８７：３５〜４４頁；Ｊｅｅｎａｈ Ｍ ｅｔら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９３；９８：５１〜５８頁；Ｓｉｊｂｒａｎｄｓ ＥＪＧら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９８；１３６：２４７〜２５４頁）。

この受容体に対する主要リガンドはＬＤＬであり、ＬＤＬはアポリポタンパク質Ｂ−１００（ＡｐｏＢ−１００）と呼ばれるタンパク質の単一コピーを含んでいる（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ Ｊ及びＢｒｏｗｎ Ｍ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９７４；２４９：５１５３〜５１６２頁）。このアポリポタンパク質は、塩基性アミノ酸に富み受容体との結合部位である区域を有する（Ｂｏｒｅｎ Ｊら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓ １９９８；１０１：１０８４〜１０９３頁）。アポリポタンパク質Ｂ遺伝子に位置する数個の突然変異はタンパク質の機能的活性を改変し、受容体がＬＤＬ粒子を引き抜く能力を低下させ、血漿中にＬＤＬコレステロールを蓄積させることが見出された。今までにアポＢ−１００遺伝子から４つの突然変異が同定され、それらの突然変異は家族性アポリポタンパク質欠損（ＢＤＦ）と名付けられた高コレステロール血症を引き起こし、それら突然変異のすべてはアポＢ−１００タンパク質のＬＤＬ−ｒ結合ドメイン（残基３１３０〜３６３０）のＲ３４８０Ｗ、Ｒ３５００Ｑ、Ｒ３５００Ｗ及びＲ３５３１Ｃに局在する（Ｓｏｒｉａ Ｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９；８６：５８７〜５９１頁；Ｐｕｌｌｉｎｇｅｒ ＣＲら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９５；９５：１２２５〜１２３４頁；Ｇａｆｆｎｅｙ Ｄら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９５；１５：１０２５〜１０２９頁；Ｂｏｒｅｎ Ｊら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１；２７６；９２１４〜９２１８頁）。アルギニンからグルタミンへの置換を生ずるアミノ酸３５００に対するコドンのＣＧＧからＣＡＧへの突然変異（Ｒ３５００Ｑ）は家族性アポリポタンパク質Ｂ−１００欠損（ＦＤＢ）を引き起こす最も頻度の高い改変である。アポＢ−３５００突然変異にヘテロ接合性の患者は、通常は高コレステロール血症であるが、血清中コレステロール濃度はＦＨでみられる濃度からわずかに軽度の上昇に至るまで変動しうる（Ｔｙｂｊａｅｒｇ−Ｈａｎｓｅｎ Ａら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ １９９０；８０：２３５〜２４２頁；Ｈａｎｓｅｎ ＰＳら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌ Ｔｈｒｏｍ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ １９９７；１７：７４１〜７４７頁）。これらの患者における臨床的及び生化学的性質は非常に似ていることから、ＦＤＢ又はＦＨを有する患者の間の鑑別診断は遺伝子分子診断によってのみ可能である。

ＦＨの臨床診断は、血漿中の脂質及びリポタンパク質の分析データ、臨床症候学（黄色腫）、並びに冠状疾患の家族歴及び本人歴に基づく。ＷＨＯはＭｅｄＰｅｄプログラムを通じてＦＨの臨床診断を実施するために一連の基準に従うように推奨している。これらの基準は、高コレステロール血症の本人歴及び家族歴に頼った、患者の臨床的性質及び分析的性質の採点システムに基づく。患者が到達する得点が８点以上である場合はＦＨ診断の臨床基準は「確実」、５点と８点の間の場合は「疑い大」、３点と５点の間ならば「可能性あり」と分類される（「家族性高コレステロール血症。ＷＨＯ第２回協議報告。（Ｆａｍｉｌｉａｌ Ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ＷＨＯ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ）」Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＭｅｄＰｅｄ ＦＨ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ジュネーブ１９９８）。しかし、家族歴が不完全若しくは未知であることから、又は分析の時点で患者が中程度の濃度の血漿中コレステロールしか示さず、腱黄色腫、角膜輪、又は黄色板症のようなコレステロールの組織沈着の徴候を示さなかったことから、一部の患者はＦＨの基準を満たさない。

ｒ−ＬＤＬ遺伝子の突然変異が既知である家族において、診断の最良の「カットオフ」点はｃ−ＬＤＬ濃度の９０パーセンタイル値の使用であることが実証されている（Ｕｍａｎｓ−Ｅｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ ＭＡＷら、Ｌａｎｃｅｔ ２００１；３５７：１６５〜１６８頁。しかし、突然変異を保持するＦＨ患者の１８％はこのパーセンタイル値未満の総コレステロール濃度を有し、さらに偽陽性の比率は１８％であった。したがって、血漿中コレステロールの数字のみが利用されるならば、誤った診断が高率となるであろう。５０％を超える患者がＦＨを有する患者として正しく診断されなかった結果として、脂質低下療法及び食事カウンセリングを受けていないことが発表されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＲＲら、Ａｍ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９３；７２：１８Ｄ〜２４Ｄ頁）。

ＦＨの分子的基礎の解明は、大多数の症例にＤＮＡレベルの診断を実施できるようにした。ＬＤＬ−ｒ遺伝子に欠損が潜在することを実証することにより、診断は実際にはっきりと確定される（「家族性高コレステロール血症。ＷＨＯ第２回協議報告。（Ｆａｍｉｌｉａｌ ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａ ｓｅｃｏｎｄ ＷＨＯ ｃｏｎｓｕｌｔａｔｉｏｎ）」Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＭｅｄＰｅｄ ＦＨ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ、ジュネーブ１９９８）。ＦＨの正確な診断は分子法により可能であるが、異種集団における分子法の使用はＬＤＬ−ｒ遺伝子の突然変異が不均一性なことにより今のところ限られている。

ＰＣＴ出願ＷＯ８８／０３１７５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｌｔｄ．）において、アポリポタンパク質ＡＯ−ＣＩＩＩ−ＡＩＶの遺伝子領域、又は遺伝子ａｐｏＢ、ａｐｏＣＩ、ａｐｏＡＩＩ、及びＬＤＬ受容体遺伝子における様々な多型の存在の有無の検出に基づいたアテローム性動脈硬化症の診断のための方法が請求されている。この遺伝子のために詳細には多型Ｃｆｒ１３１及びＢｓｔＥＩＩの利用が提示されている。

興味深い別の文書は、日本国特許出願特開平１０−０９９０９９であり、家族性高コレステロール血症が詳細に指摘されているわけではないが、これはＬＤＬ受容体遺伝子における異常の診断のためにアミノ酸１０９のトリプレットコードにおける突然変異、詳細にはＣの挿入の使用について言及している。

最後にどちらもテキサス大学の米国特許第４，７４５，０６０号及び同第４，９６６，８３７号はＬＤＬ受容体遺伝子における突然変異を基本とした家族性高コレステロール血症の診断のための方法を提示している。しかし、最初の特許で請求されたものは「正常」遺伝子に対応する配列であり、その特許はＸｂａ Ｉによる制限地図の変化により定義される突然変異の特定例を提示している。それに関係して２番目の特許では、ＬＤＬ−ｒ遺伝子における突然変異を決定するための方法に様々な制限酵素（Ｅｃｏ ＲＩ、Ａｓｐ７１８、Ｔａｑ Ｉ、Ｂａｍ ＨＩ、Ｘｂａ Ｉ、Ｉｎｆ．Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｃｌａ Ｉ、Ｅｃｏ ＲＶ、Ｋｐｎ Ｉ、Ｐｖｕ ＩＩ、Ｓｐｈ Ｉ、Ｓｓｔ Ｉ、Ｓｓｔ ＩＩ、Ｓｔｕ Ｉ、Ｘｈｏ Ｉ、Ｎｄｅ Ｉ及びＮｓｉ Ｉ）を使用することが請求されており、これは正常遺伝子に対応するモデルと比較してこれらの酵素を用いた制限モデルの改変を観察することに基づいている。

本発明に最も近い特許文書はＷＯ０２／０６４６７であり、これにはＬＤＬ−ｒ遺伝子の一連の突然変異及び多型に基づいた、脂質代謝におけるエラーの検出のための方法が記載されている。しかし、前記特許に記載された突然変異又は多型のいずれも本出願で請求する突然変異又は多型と一致しない。

突然変異及び多型の命名は、
− Ａｎｔｏｒａｎａｋｉｓ Ｓ．Ｅ．及び命名作業グループ、「ヒト遺伝子突然変異に対する命名系についての勧告（Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １１：１〜３頁；１９９８
− Ｄｕｎｎｅｎ ＪＴ、Ａｎｔｏｒａｎａｋｉｓ Ｓ．Ｅ．「複合突然変異を記載するための突然変異命名の拡張と提案：一論考（Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｔｏ ｄｅｓｃｒｉｂｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ）」Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １５：７〜１２頁、２０００
に定義されている。

同様に、多型の概念は、
− Ｈａｒｒｉｓ Ｈ．「ヒト生化学遺伝学の原理（Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、第３版、アムステルダム、ノールトホラント１９８０
− Ｂｅａｕｄｅｒ ＡＬ、Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＬ、Ｓｌｙ ＷＳ、Ｖａｌｌｅ Ｄ．「多様なヒト表現型の遺伝学、生化学及び分子的基礎（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｖａｒｉａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ）」、Ｔｈｅ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｅｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、Ｂｅａｕｄｅｔ ＡＬ、Ｓｃｒｉｖｅｒ ＣＲ、Ｓｌｙ ＷＳ、Ｖａｌｌｅ Ｄ編、第７版、５３頁、ＭａｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、ニューヨーク１９９５
に定義されている。

以下に詳述する一連の新しい突然変異の全体が検出、単離、及び特性決定された。同様に、すでに記載された一連の突然変異及び多型の全体を新しい突然変異と組み合わせて個体が家族性高コレステロール血症を発症する見込みを分析した。本発明において家族性高コレステロール血症の発症に関係づけられた突然変異及び多型のすべては、低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＬＤＬ−ｒ）に対応する遺伝子配列番号１に生じている。いわば、突然変異のすべてが同一遺伝子において生み出され、同一の手法を用いて、同一の検査デバイスにおいて使用され、同一の体外及びｉｎ ｖｉｔｒｏ法を用いて同一の疾患を発症する見込みが決定される。このことが本発明の統一性を支えている。

科学的に承認され、上記の出版物に詳述された命名にしたがって検出された新しい突然変異のすべてを表Ｉに詳述する。同じく、突然変異に英数字コードを付ける。

すでに記載され公知である突然変異を表ＩＩに詳述する。家族性高コレステロール血症の診断のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検査デバイスにおいて、表Ｉの突然変異と組み合わせてこれらの突然変異を使用することは、本発明の実施形態の新規で発明力を要する好ましい形態の１つである。同様に、公知の突然変異を指摘したのと類似した方法で、多型を表ＩＩＩに詳述する

アミノ酸突然変異を一文字のコードで表し、表ＩＶにそのコードに相当するアミノ酸を示す。

本発明において開発された診断アッセイ「バイオチップ」は、配列リストに示される多量のプローブを表面に有するスライドである。これらのオリゴヌクレオチドプローブは表Ｉ〜ＩＩＩに収載されている突然変異配列にハイブリダイズ可能である。各突然変異に必要な方法論を以下に示す。

スライドグラスの印刷
・ 印刷用緩衝液としてＤＭＳＯを用いてアミノシラン化スライドグラスに突然変異を検出可能なオリゴヌクレオチドを印刷する。
・ 温度及び湿度が制御される「スポッター」又はオリゴヌクレオチドプリンターを用いて印刷を行う。

スライドグラスの加工
・ スライドグラスに印刷した後にＵＶ照射処理を行う。

標的ＤＮＡの調製
・ ろ過法を用いることにより約３００μｌの血液試料から患者のゲノムＤＮＡを抽出する。
・ 多重ＰＣＲ反応を行い、各患者についてプロモーター及びＬＤＬ受容体遺伝子の１８個のエキソンすべてを増幅させる。
・ ビオチン化ヌクレオチドをＰＣＲプロセスの間に組み入れる。間接標識法として、蛍光体ストレプトアビジン発色剤を用いた染色の最終ステップがハイブリダイゼーション後に必要となる。
・ ＰＣＲ産物を電気泳動し、アガロースゲルで可視化する。
・ 標的ＤＮＡを断片化する。
・ ハイブリダイゼーション緩衝液を断片化したＰＣＲ産物に加える。
・ 変性ステップを９５℃で１５分間行う。

ハイブリダイゼーション
・ 本目的のためにＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓが設計したステーションでハイブリダイゼーションを自動実施する。
・ スライドグラスを予備ハイブリダイゼーションする。
・ Ｈａｍｉｌｔｏｎピペットでハイブリダイゼーション溶液を注入する。
・ ハイブリダイゼーション時間を１時間とする。
・ スライドグラスを３回洗浄し乾燥させる。
・ ステーションはスライドグラスを□。

スライドグラスのスキャン
・ スライドグラスをスキャナに挿入する。
・ レーザーで刺激した際に標準マーカーから発光するシグナルをスキャンする。

画像の定量
・ スキャナソフトウェアは得られた画像においてハイブリダイゼーションが起こった点のシグナルを定量することを可能にする。
・ オリゴヌクレオチドにおいて得られた、正常対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を検出するシグナルから、患者における突然変異の存在の有無を立証する。

各突然変異は検出のための４つのオリゴヌクレオチドが１０回繰り返したものをスライドグラスに有する。それらの２つは正常な対立遺伝子を検出し、残りの２つは突然変異対立遺伝子を検出する。問い合わせされた塩基をオリゴヌクレオチド全体の中央の位置に見出すことができる。

正常な患者の場合（図３Ａ）、その患者は突然変異対立遺伝子を提示しない。したがって、スライドグラスから得られた画像において突然変異対立遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーションシグナルを示さないか、又は正常対立遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドよりも弱いシグナルを示す。

逆に、突然変異についてヘテロ接合性の個体（図３Ｂ）は、正常対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を有する。よって、正常対立遺伝子を検出するオリゴヌクレオチド及び突然変異対立遺伝子を検出するオリゴヌクレオチドは等しいハイブリダイゼーションシグナルを有する。

分析される個体のＤＮＡから生じたマーク付きＰＣＲとＤＮＡチップとのハイブリダイゼーションの結果は、図３Ａに示された個体がＬＤＬ−ｒ遺伝子にＥ２５６Ｋアミノ酸変化の誘因となる特定の突然変異を有さず、図３Ｂの個体はこの突然変異についてヘテロ接合性であることを実証している。

このように、ヘテロ接合性個体は家族性高コレステロール血症と遺伝的に診断される。

分析実施例により、一部の突然変異について次に詳述し、本発明のアッセイデバイスを用いてその突然変異を検出する。

（実施例１）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１の２１５ｂｐ断片を、プライマーＥｘ１Ｆ（配列番号２）とＥｘ１Ｒ（配列番号３）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む反応混合液５０μＬ中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃１分間、伸長７４℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物は一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ；ＳＳＣＰ）で解析を行った。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片について、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、記載のデバイス「バイオチップ」を用いて、その存在を判定した。

（−２３）Ａ＞Ｃ変異解析
この変異は新たなＡｖａＩＩ認識部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、エキソン１増幅材料５μＬを１５単位のＡｖａＩＩにより総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは１４８ｂｐと６７ｂｐ長、変異アリルでは９３ｂｐ、６７ｂｐ、５５ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

（−２３）Ａ＞Ｃ変異は、家族性高コレステロール血症と診断され、ＭｅｄＰｅｄ（家族性高コレステロール血症。ＷＨＯ第２回協議報告。国際ＭｅｄＰｅｄ ＦＨ協会、ジュネーブ、１９９８）により診断スコア８とされた角膜環と黄色腫の６０歳の女性から検出された。この女性の家族の中で彼女の近親者には、若年性心血管系疾患の徴候はみられなかった。薬剤療法の前の、血漿脂質濃度は、総コレステロール（ＴＣ）３５２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ２７１ｍｇ／ｄＬで、トリグリセリド（ＴＧ）と高比重リポ蛋白コレステロール（ＨＤＬ−ｃ）で、正常範囲であった。シンバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療によりＴＣとＬＤＬ−ｃのレベルはそれぞれ２５１ｍｇ／ｄＬと１７１ｍｇ／ｄＬまで低下した。

Ｌ（−６）Ｐ変異解析
この変異（４７Ｔ＞Ｃ、ＣＴＣ＞ＣＣＣ、Ｌｅｕ（−６）Ｐｒｏ）は、ＦＨと臨床診断されたＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１の２１５ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定することによって特性決定した。配列決定反応は、ＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００サーモサイクラーで、ＣＥＴ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＢｅｃｋｍａｎ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーはＥｘ１Ｆ（配列番号２）とＥｘ１Ｒ（配列番号３）を使用して実施した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＮＤＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＴ＞Ｃの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、配列番号２４３のオリゴヌクレオチドを用いて解析できる。

Ｌ（−６）Ｐ変異は、角膜環の４７歳の女性から検出されたもので、この女性の父親はＴＣ３５０ｍｇ／ｄＬの高コレステロール血症で、父方の高コレステロール血症の２人の叔父はそれぞれ２４歳と３３歳のときに心筋梗塞で死亡した。家族性高コレステロール血症としての臨床診断は、ＭｅｄＰｅｄの基準で９ポイントのスコアであった。薬剤療法前の血漿脂質濃度は、ＴＣ４２０ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３２０ｍｇ／ｄＬで、ＴＧ１５５ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−ｃは４９ｍｇ／ｄＬであった。アトルバスタチン（１５ｍｇ／日）による治療でＴＣとＬＤＬ−ｃのレベルはそれぞれ２８９ｍｇ／ｄＬと２３３ｍｇ／ｄＬに低下した。

Ｇ（−２）Ｒ変異解析
この変異（５８Ｇ＞Ａ、ＧＧＧ＞ＡＧＧ、Ｇｌｙ（−２）Ａｒｇ）は、ＦＨと臨床診断された患者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１の２１５ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定することによって特性決定した。ＤＮＡサンプルから得られた精製ＰＣＲ産物を、メーカーのプロトコールに従い、増幅用プライマーのＥｘ１Ｆ（配列番号２）とＥｘ１Ｒ（配列番号３）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）を使って、両方向から直接配列決定した。塩基配列をＣＥＱ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、フラートン）により検出し、ＣＥＱ８０００のソフトウェアで解析した。５８Ｇ＞Ａ変換は２回目のＰＣＲ産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号２２０、配列番号２２１、配列番号２２２、配列番号２２３のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｇ（−２）Ｒ変異は３４歳の女性から同定され、この女性は角膜環で、母親はＴＣ４００ｍｇ／ｄＬの高コレステロール血症であった。この女性のＭｅｄＰｅｄ基準によるＦＨ臨床診断スコアは１０ポイントであった。血漿脂質レベルは治療前でＴＣ３５４ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ２６４ｍｇ／ｄＬで、ＴＧは正常、ＨＤＬ−ｃは６４ｍｇ／ｄＬであった。

（実施例２）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン２に位置する変異の同定
エキソン２の１８３ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、Ｅｘ２Ｆ（配列番号４）とＥｘ２Ｒ（配列番号５）のデオキシヌクレオチドを用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、各０．２μＭのデオキシオリゴヌクレオチド、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を最終５０μＬ反応混合液中で５００ｍｇのＤＮＡを増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、ハイブリダイゼーション５９℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物は一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析を行った。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。配列決定により同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出の「バイオチップ」装置を用いて、その存在を判定した。

１０８ｄｅｌＣ変異解析
この変異は新たなＭｎｌＩ切断部位を生じる。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン１増幅材料１５μＬを１５単位のＭｎｌＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは１５０ｂｐと３３ｂｐ長、変異アリルでは１１８ｂｐ、３３ｂｐ、３２ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

１０８ｄｅｌＣの変異は、高コレステロール血症ではあるが、それによる臨床的な皮膚症状のない５０歳の女性から検出された。この女性は臨床的にＦＨＭｅｄＰｅｄスコア９ポイントであると診断された。一親等の１人に若年性心疾患が見出されている。脂質低下薬治療をしていないときの空腹時の血漿脂質レベルは、ＴＣ（３８１ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１４２ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３２１ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（３２ｍｇ／ｄＬ）であった。

Ｔ４１Ｍ変異解析
この変異（１８５Ｃ＞Ｔ、ＡＣＧ＞ＡＴＧ、Ｔｈｒ４１Ｍｅｔ）は酵素ＴａｉＩの切断制限部位を破壊する。メーカー（ＮＥＢ、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、エキソン１増幅材料１５μＬを１５単位のＴａｉＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は正常アリルでは１５４ｂｐと２９ｂｐ長、変異アリルでは１８３ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）を、スライドと共に使用して、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｔ４１Ｍ変異は、６９歳の男性で、５５歳のときに心筋梗塞を起こし、ＭｅｄＰｅｄ基準で診断スコア６ポイントの家族性高コレステロール血症と診断された患者から検出された。親戚には若年性心血管系疾患の徴候がみられた。脂質低下剤を使用していないときのこの男性の空腹時血清を分析すると、ＴＣ（２７４ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ−ｃ（２１７ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃは正常であった。

Ｃ４２Ｙ変異解析
この変異Ｃ４２Ｙ（１８８Ｇ＞Ａ、ＴＧＣ＞ＴＡＧ、Ｃｙｓ４２Ｔｙｒ）は、ＦＨと臨床的に診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン２に該当する１８３ｂｐの断片を配列決定して同定した。メーカーのプロトコールに従い、ＤＮＡサンプルから得られた精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ２Ｆ（配列番号４）とＥｘ２Ｒ（配列番号５）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）を使って、両方向から直接配列決定した。塩基配列をＣＥＱ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、フラートン）により検出し、ＣＥＱ８０００のソフトウェアで解析した。Ｇ＞Ａ変換は別に行った２回目のＰＣＲ産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２５０、配列番号２５１のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｃ４２Ｙ変異は、１７歳の男性から検出され、この男性は角膜リポイド環を持ち、ＭｅｄＰｅｄによる診断スコア１０ポイントの家族性高コレステロール血症と診断された。この男性の母親は重度の高コレステロール血症であった。脂質低下剤を使用していないときのこの男性の空腹時血清を分析すると、ＴＣ（３５０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃは正常であった。シンバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療で、この男性のＴＣとＬＤＬ−ｃはそれぞれ２７４ｍｇ／ｄＬと２１４ｍｇ／ｄＬのレベルまで低下した。

Ｃ７４Ｙ変異解析
このＣ７４Ｙ（２８４Ｇ＞Ａ、ＴＧＣ＞ＴＡＣ、Ｃｙｓ７４Ｔｙｒ）は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン３の１９６ｂｐの断片を配列決定して同定した。ＤＮＡサンプルから得られた精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ３Ｆ（配列番号６）とＥｘ３Ｒ（配列番号７）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をＣＥＱ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、フラートン）により検出し、ＣＥＱ８０００のソフトウェアで解析した。Ｇ＞Ａ変換は別に行った２回目のＰＣＲ産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することが可能であった。

Ｃ７４Ｙ変異は、５２歳の男性から検出され、この男性は角膜環、腱黄色腫、及び高コレステロール血症の家族歴を持っていた。この男性はＭｅｄＰｅｄ基準で診断スコア１７ポイントの家族性高コレステロール血症と診断された。脂質低下剤使用前のこの男性の空腹時血清を分析すると、ＴＣ（４２０ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（９６ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ−ｃ（６９ｍｇ／ｄＬ）であった。ＨＭＧＣｏＡリダクターゼ阻害剤の投与（１０ｍｇ／日）により、この男性のＬＤＬ−ｃレベルは２２％低下した。

（実施例３）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン３に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン３の１９６ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ３Ｆ（配列番号６）とＥｘ３Ｒ（配列番号７）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃で１分間、伸長７２℃で１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析し、異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

１９１−２ｄｅｌＡｉｎｓＣＴ変異解析
この変異は制限酵素地図を変えないため、我々は正常アリルではＢｆａＩ認識部位が導入され、変異アリルでは導入されない、１組の変異導入プライマーをデザインした。

ＬＤＬｒ遺伝子エキソン３の１８４ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、Ｅｘ３Ｒ（配列番号７）とＭｕｔ１９１−２Ｆ（配列番号８）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（ＮＥＢ、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＢｆａＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは２３ｂｐと１６１ｂｐ長、変異アリルでは１８５ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルでの気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法としては、この変異はマイクロアレイ（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

１９１−２ｄｅｌＡｉｎｓＣＴ変異は、常染色体優性高コレステロール血症の、関連のない２つの家族から検出された。これらうちの一家族の初発症例は、５８歳の女性で、腱黄色腫、黄色腫、狭心症があり、冠状動脈性心臓病及び高コレステロール血症の家族歴を持っていた。この女性はＭｅｄＰｅｄ診断スコアが１５ポイントの家族性高コレステロール血症と診断された。この女性の血漿の脂質レベルは、ＴＣ（５５９ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４６７ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１７５ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（５７ｍｇ／ｄＬ）であった。シンバスタチンによる治療（４０ｍｇ／日）により、この女性のＴＣとＬＤＬ−ｃのレベルはそれぞれ３０２ｍｇ／ｄＬと２２８ｍｇ／ｄＬに低下した。

Ｎ５９Ｋ変異解析
この変異（２４０Ｃ＞Ａ、ＡＡＣ＞ＡＡＡ、Ａｓｎ５９Ｌｙｓ）は酵素ＨｉｎｃＩＩによるエンドヌクレアーゼ切断部位を破壊する。メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを総量３０μＬ中の１５単位ＨｉｎｃＩＩで切断した。得られた断片は、１１１ｂｐと８５ｂｐ長（正常アリル）、１９６ｂｐ（変異アリル）であった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法として、この変異はマイクロアレイ（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｎ５９Ｋ変異は、ＭｅｄＰｅｄ診断スコア１２ポイントのＦＨ高コレステロール血症と臨床的に診断された４３歳の男性から検出された。脂質低下治療前のこの男性の血漿脂質レベルは、ＴＣ（４６５ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３９７ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１００ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４８ｍｇ／ｄＬ）であった。シンバスタチンによる脂質低下治療（４０ｍｇ／日）によってこの男性のＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ３５０ｍｇ／ｄＬと２８２ｍｇ／ｄＬに低下した。一方この男性の母親は５８歳で狭心症を起こし、またこの男性の８歳の息子はＴＣ（３２５ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２４１ｍｇ／ｄＬ）の高コレステロール血症である。

２３１ｄｅｌＣ変異の解析
この変異はエンドヌクレアーゼＨａｅＩＩＩ切断部位を破壊する。メーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、カールスバド、カルフォルニア、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＨａｅＩＩＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは７６ｂｐ、５１ｂｐ、４２ｂｐ、２５ｂｐ長で、変異アリルでは１１７ｂｐ、５１ｂｐ、２７ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

この変異は角膜環の３７歳の女性から検出された。この女性は臨床的にＦＨであると診断され、ＷＨＯのＭｅｄＰｅｄ基準によるスコアは１６ポイントであった。脂質低下治療なしの場合の血漿脂質レベルは、ＴＣ（５４３ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４５６ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１７８ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬ−ｃ（５１ｍｇ／ｄＬ）であった。アトルバスタチン（４０ｍｇ／日）とコレスチポール（２０ｇ／日）による脂質低下治療で、この女性のＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ２６０ｍｇ／ｄＬと１９０ｍｇ／ｄＬに低下した。この女性の兄は３８歳で心筋梗塞となり、この女性の１２歳の息子はＴＣ濃度３０５ｍｇ／ｄＬの高コレステロール血症である。

３１３＋１ｉｎｓＴ変異解析
この変異はＴｒｕｌＩ制限エンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン３の増幅材料１５μＬをＴｒｕｌＩ１５単位とで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは１９６ｂｐ長で、変異アリルでは１６２ｂｐと３４ｂｐであった。これらの断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

３１３＋１ｉｎｓＴ変異は、黄色腫と角膜環の５３歳の女性から検出された。この女性の現存の家族メンバーでは若年性の心血管系疾患はみられなかった。この女性は臨床的にＦＨであると診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１９ポイントであった。脂質低下薬剤の使用していないときのこの女性の空腹時血清の脂質レベルは、ＴＣ（５７４ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（５０５ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。シンバスタチン（８０ｍｇ／日）とコレスチポール（２０ｇ／日）による脂質低下治療で、ＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ２８２ｍｇ／ｄＬと２２５ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例４）
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン４に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン４の５’側（エキソン４Ａ）の２４２ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ４ＡＦ（配列番号９）とＥｘ４ＡＲ（配列番号１０）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６３℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析し、異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

３３８ｄｅｌ１６変異解析
この変異はＶａｎ９１Ｉ制限エンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、エキソン４の増幅材料１５μＬを１５単位Ｖａｎ９１Ｉで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは２４２ｂｐ、変異アリルでは１７４ｂｐと５２ｂｐであった。これらの断片を２％アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法として、この変異は記載されているデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

３３８ｄｅｌ１６変異は、常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない３つの家族から検出された。これらの家族の初発症例は、黄色腫と角膜環の４０歳の男性で、ＴＣ５４２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬｃ４４１ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。この男性はＭｅｄＰｅｄスコア１９ポイントのＦＨと診断された。この男性の現存の家族メンバーでは心血管系疾患は検出されなかった。アトルバスタチンによる脂質低下治療（１０ｍｇ／日）により、この男性のＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ２９３ｍｇ／ｄＬと２１８ｍｇ／ｄＬまで低下した。

５０９０ｉｎｓＣ変異解析
この変異は制限酵素地図を変えないため、我々は変異アリルでは制限酵素ＭｎｌＩ認識部位が導入され、正常アリルでは導入されない、１組の変異導入プライマーをデザインした。

エキソン４Ａの２４４ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、Ｅｘ４ＡＦ（配列番号９）とＭｕｔ５０９ｉｎｓＣＲ（配列番号１１）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６５℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＭｎｌＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１４１ｂｐ、９９ｂｐ、４ｂｐで、変異アリルでは１４１ｂｐ、８８ｂｐ、１２ｂｐ、４ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法としては、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

５０９ｉｎｓＣ変異は４４歳の女性から検出されており、この女性はＴＣ（４７７ｍｇ／ｄＬ）及びＬＤＬｃ（３９４ｍｇ／ｄＬ）の高コレステロール血症であるが、本人及び家族に若年性冠状動脈性心臓病の病歴はない。ＭｅｄＰｅｄ基準による診断スコアは９であった。この女性には２人の兄弟があり、どちらもｃ−ＬＤＬ濃度が９５を超えた高コレステロール血症である。

４５１ｄｅｌ３変異解析
この変異（４５１ｄｅｌ３）は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン４（４Ａ）の２４２ｂｐの断片をＤＮＡ配列決定して同定した。ＤＮＡサンプルから得られた精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ４ＡＦ（配列番号９）とＥｘ４ＡＲ（配列番号１０）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をＣＥＱ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）により検出し、ＣＥＱ８０００のソフトウェアで解析した。３塩基対の欠損は２回目のＰＣＲ産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ（「バイオチップ」）を用いて、スライド内の配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

４５１ｄｅｌ３変異は、かつて３４歳で心筋梗塞の発作のあった、角膜環の３６歳の男性から検出された。この男性には２歳と８歳の２人の子供がおり、彼らのＴＣはそれぞれ３２０ｍｇ／ｄＬと２７５ｍｇ／ｄＬである。この男性は臨床的にＦＨと診断され、スコアは１７ポイントであった。脂質低下薬剤の使用していないときのこの男性の空腹時血清の脂質分析は、ＴＣ４４９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３６７ｍｇ／ｄＬ、ＴＧ２１８ｍｇ／ｄＬ、ｃ−ＨＤＬ３８ｍｇ／ｄＬであった。シンバスタチンによる治療（４０ｍｇ／日）によりこの男性のＬＤＬ−ｃレベルは２７０ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例５）
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン４Ｂに位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン４の３’側（エキソン４Ｂ）の２３７ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ４ＢＦ（配列番号１２）とＥｘ４ＢＲ（配列番号１３）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリングと伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析し、異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析及びマイクロアレイ（「バイオチップ」）によって、その存在を判定した。

Ｄ１５７Ｇ変異解析
この変異（５３３Ａ＞Ｇ、ＧＡＴ＞ＧＧＴ、Ａｓｐ１９５Ｇｌｙ）はＨｐｈＩエンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、エキソン４Ｂの増幅された材料１５μＬを１５単位ＨｐｈＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは２３７ｂｐ、変異アリルでは１７５ｂｐと６２ｂｐであった。これらの断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｄ１５７Ｇ変異は高コレステロール血症の３２歳の女性から検出された。この女性の家族に心血管系疾患は検出されていなかった。この女性は臨床的にＦＨの可能性が診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは６ポイントであった。脂質低下治療前のこの女性の空腹時血清の脂質を分析すると、ＴＣ（３５８ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２９６ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチンによる治療（１０ｍｇ／日）で、この女性のＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ２１２ｍｇ／ｄＬと１４０ｍｇ／ｄＬまで低下した。この女性の父親も血漿コレステロールレベルがＴＣ３６４ｍｇ／ｄＬに上昇しており、祖母も３４１ｍｇ／ｄＬであった。

Ｃ１９５Ｒ変異解析
この変異（６４６Ｔ＞Ｃ、ＴＧＴ＞ＣＧＴ、Ｃｙｓ１９５Ａｒｇ）はＢｓｈＮＩ切断部位を生じる。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン４Ｂの増幅された材料１５μＬを１５単位ＢｓｈＮＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは切断していない増幅材料に相当する２３７ｂｐで、変異アリルでは１５９ｂｐと７８ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド中の配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。

Ｃ１９５Ｒは高コレステロール血症で角膜環の６４歳の女性から検出された。この女性の母親に若年性の心臓血管疾患が見出された。この女性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは１１ポイントであった。この女性の脂質低下治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ（５６０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４６８ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。

６７５ｄｅｌ１５変異解析
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。エキソン４Ｂの増幅されたＰＣＲ材料を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスバンドが現れた。得られた断片は、正常アリルでは２３７ｂｐであり、変異アリルでは２２２ｂｐであった。このヘテロデュープレックスのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動する。他の方法として、この変異はマイクロアレイ（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

６７５ｄｅｌ１５変異は臨床的にＦＨと診断された、ＭｅｄＰｅｄスコア８ポイントの６３歳の女性から検出された。この女性の家族に心血管系疾患は見出されなかった。この女性の治療前の脂質検査によると、ＴＣ（４５０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３７９ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。他の家族で遺伝子検査をすることはできなかった。

６８４ｄｕｐ１２変異解析
この変異はエキソン４Ｂの増幅された材料をＭｎＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位で分解して解析した。８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイドでのゲルの染色により、変異によって作られた１２ｂｐの追加によってエキソン４Ｂ中のこの変異の存在が判別できる。さらに、メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン４Ｂの増幅された材料１５μＬを１５単位ＭｎｌＩで、総量３０μＬ中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは１９２ｂｐと４５ｂｐ、変異アリルでは２０４ｂｐと４５ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

６８４ｄｕｐ１２変異は、常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない２つの家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は、黄色腫で角膜環の６３歳の男性であった。この男性は５５歳で心筋梗塞に襲われ、ＭｅｄＰｅｄ診断スコア１７ポイントのＦＨと診断された。この男性の家族に心血管系疾患はみられなかった。脂質低下治療をしていないときの血漿の脂質レベルは、ＴＣ（４６９ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４０８ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１００ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４１ｍｇ／ｄＬ）であった。

Ｄ２００Ｖ変異解析
この変異（Ｄ２００Ｖ（６６２Ａ＞Ｔ、ＧＡＣ＞ＧＴＣ、Ａｓｐ２００Ｖａｌ））は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン４（４Ｂ）の２３７ｂｐの断片をＤＮＡ配列決定して同定した。ＤＮＡサンプルから得た精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ４ＢＦ（配列番号１２）とＥｘ４ＢＲ（配列番号１３）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をＣＥＱ８０００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）により検出し、ＣＥＱ８０００のソフトウェアで解析した。６６２Ａ＞Ｔは２回目のＰＣＲ産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド内の配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５のオリゴヌクレオチドを使って解析可能であった。

Ｄ２００Ｖ変異は常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は４３歳の女性で、幼年期から高コレステロール血症であり、母親と兄がＬＤＬ−ｃ９５パーセンタイル超のレベルであるとの家族歴を持っていた。この女性は臨床的に家族性高コレステロール血症と診断されており、ＭｅｄＰｅｄ基準ではスコア８ポイントであった。脂質低下剤プラバスタチンの使用により（４０ｍｇ／日）、この女性の空腹時血清脂質は、ＴＣ３２９ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ２７３ｍｇ／ｄＬ、ＴＧ７３ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−ｃ４１ｍｇ／ｄＬであった。

Ｓ２０５Ｃ変異解析
このＳ２０５Ｃ変異（６７７Ｃ＞Ｇ、ＴＣＴ＞ＴＧＴ、Ｓｅｒ２０５Ｃｙｓ）は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン４（４Ｂ）の２３７ｂｐの断片をＤＮＡ配列決定して同定した。ＤＮＡサンプルから得た精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ４ＢＦ（配列番号１２）とＥｘ４ＢＲ（配列番号１３）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）を使って、両方向から直接配列決定した。配列決定反応で得られた断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＣ＞Ｇ変換は同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を自動配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｓ２０５Ｃの変異は３９歳の女性から検出されており、この女性は高コレステロール血症（母親と兄のＴＣはそれぞれ４５０ｍｇ／ｄＬ、５００ｍｇ／ｄＬ）の家族歴を持ち、子供２人はＴＣが９５パーセンタイル超である。この女性は２０歳のときに家族性高コレステロール血症と臨床的に診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコア８ポイントであった。薬剤療法前のこの女性の血漿脂質濃度は、ＴＣ３９０ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３２５ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−ｃ３５ｍｇ／ｄＬであった。シンバスチン（１０ｍｇ／日）による治療で、この女性の血漿ＬＤＬ−ｃレベルは２７０ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例６）
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン６に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン６の１７９ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ６Ｆ（配列番号１４）とＥｘ６Ｒ（配列番号１５）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００□Ｍの各ｄＮＴＰ、０．２□Ｍの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０□Ｌ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５６℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

Ｃ２５５Ｇ変異解析
このＣ２５５Ｇ変異（８２６Ｔ＞Ｇ、ＴＧＣ＞ＧＧＣ、Ｃｙｓ２５５Ｇｌｙ）は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではＢｓｔＵＩ認識部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないようなデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、非隣接の塩基を入れて合成した。ＬＤＬｒ遺伝子エキソン６の１６３ｂｐをポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＥｘ６Ｒ（配列番号１５）とＭｕｔＣ２５５ＧＦ（配列番号１６）のプライマーを用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００□Ｍの各ｄＮＴＰ、０．２□Ｍの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０□Ｌ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６３℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（ＮＥＢ社、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＢｓｔＵＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１６３ｂｐで、変異アリルでは１４１ｂｐと２２ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｃ２５５Ｇの変異は高コレステロール血症の家族歴を持つ６３歳の女性から検出された。治療時のこの女性の脂質は、ＴＣ（４３９ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３５５ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。この女性は家族性高コレステロール血症と臨床的に診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコア８ポイントであった。

Ｅ２９１Ｘ変異解析
このＥ２９１Ｘ変異（９３４Ｇ＞Ｔ、ＧＡＧ＞ＴＡＧ、Ａｓｐ２９１Ｓｔｏｐ）は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではＳｓｐＩ認識部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないようなデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、非隣接の塩基を入れて合成した。

ＬＤＬｒ遺伝子エキソン６の１６４ｂｐをポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＥｘ６Ｆ（配列番号１３）とＭｕｔＥ２９１ＸＲ（配列番号１７）のプライマーを用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００□Ｍの各ｄＮＴＰ、０．２□Ｍの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０□Ｌ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＳｓｐＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１６４ｂｐ（非分解断片）で、変異アリルでは１４４ｂｐと２０ｂｐであった。これらの断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。

他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｅ２９１Ｘ変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は４４歳の角膜環の男性で、この男性は、ＴＣ（３８１ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４５ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１１１ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３１４ｍｇ／ｄＬ）であった。この男性の家族性高コレステロール血症の臨床診断は、ＭｅｄＰｅｄ基準によると、スコア１２ポイントに達していた。シンバスタチン（４０ｍｇ／日）とコレスチラミン（１２ｍｇ／日）の脂質低下治療を組み合わせたところ、この男性の血漿ＴＣとＬＤＬ−ｃのレベルは２５３ｍｇ／ｄＬと１８８ｍｇ／ｄＬまで低下した。

８１８ｄｅｌ８変異解析
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。エキソン６の増幅産物を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、１７９ｂｐと１７１ｂｐの、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスのバンドがエチジウムブロマイドでの染色後ゲル内で簡単に見分けられ、その存在が示された。このヘテロデュープレックスの２つのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動する。

さらに、エキソン６のＰＣＲ増幅と、８１８ｄｅｌ８変異によって生成された新たなＭａｅＩＩＩエンドヌクレアーゼ制限部位を利用した制限酵素分析によって、変異を確認した。メーカー（ロシュダイアグノスティックス社、マンハイム、ドイツ）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＭａｅＩＩＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１１８、３４、２７ｂｐで、変異アリルでは１１８ｂｐと５３ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

８１８ｄｅｌ８変異は、ＦＨであると臨床的に診断され、ＭｅｄＰｅｄスコア１０ポイントであった、６９歳の女性から検出された。この女性の２人の息子は高コレステロール血症で、血漿ＴＣのレベルはそれぞれ３８２と３０４ｍｇ／ｄＬであった。家族性高コレステロール血症であるとの臨床診断は、ＭｅｄＰｅｄ基準ではスコア１０ポイントに達した。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（５３０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４３９ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１７０ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（５７ｍｇ／ｄＬ）であった。セリバスタチンによる脂質低下治療により（０．４ｍｇ／日）、この女性のＬＤＬ−ｃは３６３ｍｇ／ｄＬに低下した。

Ｒ２７９Ｇ変異解析
このＲ２７９Ｇ変異（８９８Ａ＞Ｇ、ＡＧＡ＞ＧＧＡ、Ａｒｇ２７９Ｇｌｙ）は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン６の１７９ｂｐの断片を自動配列決定して同定した。ＤＮＡサンプルから得た精製ＰＣＲ産物を、増幅用プライマーのＥｘ６Ｆ（配列番号１４）とＥｘ６Ｒ（配列番号１５）、及びキットＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）を使って、両方向から直接配列決定した。配列決定反応で得られた断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＡ＞Ｇ変換は同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を配列決定して確認した。

他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０２、配列番号２０３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｒ２７９Ｇの変異は、父親と２人の兄弟が高コレステロール血症である家族歴を持つ、黄色腫の５９歳の女性から検出された。ＦＨの臨床診断のスコアは１０ポイントで、治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ３８４ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３１４ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。シンバスタチンによる脂質低下治療（８０ｍｇ／日）は、この女性のＬＤＬ−ｃを１６７ｍｇ／ｄＬまで低下させた。

（実施例７）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン７に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン７の２３４ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ７Ｆ（配列番号１８）とＥｘ７Ｒ（配列番号１９）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００□Ｍの各ｄＮＴＰ、０．２□Ｍの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０□Ｌ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５７℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。配列決定によって同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

９４１−３９Ｃ＞Ｔ変異解析
この変異はＡｐａＩ切断部位を破壊する。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン７のＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位ＡｐａＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１８６、２６、２２ｂｐであったが、変異アリルでは２０８ｂｐと２６ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

９４１−３９Ｃ＞Ｔ変異は、共通して常染色体優性高コレステロール血症である関連のない４家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は、心筋梗塞の発作に襲われたことがあり、若年性心臓血管疾患の家族歴のある、高コレステロール血症の６１歳の女性であった。この女性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは７ポイントであった。この女性の治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ（３４０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２４８ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧは１３６ｍｇ／ｄＬ、ＨＤＬ−ｃは６５ｍｇ／ｄＬであった。アトルバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療後のＴＣとＬＤＬ−ｃレベルはそれぞれ２３３ｍｇ／ｄＬと１４４ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルに著しい変化はみられなかった。

Ｃ３１９Ｙ変異解析
このＣ３１９Ｙ変異（１０１９Ｇ＞Ａ、ＴＧＣ＞ＴＡＣ、Ｃｙｓ３１９Ｔｙｒ）は新たなＲｓａＩエンドヌクレアーゼ切断部位を生じる。メーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＲｓａＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは２３４ｂｐ（切断していない断片）、変異アリルでは１３６ｂｐと９８ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｃ３１９Ｙ変異は常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は４３歳の角膜環、アキレス腱と手の甲の黄色腫、角膜アークの男性で、この男性の１７歳の息子は血漿総コレステロールが３８４ｍｇ／ｄＬであった。この男性の父親は４５歳で突然死している。この男性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは２２ポイントであった。治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ（４２８ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３７２ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧは正常であった。

１０５４ｄｅｌ１１変異解析
この変異はＨｐｈＩ酵素のエンドヌクレアーゼ切断部位を破壊する。メーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）のプロトコールに従い、エキソン７の増幅された材料１５μＬを１５単位のＨｐｈＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１８９ｂｐと４５ｂｐで、変異アリルでは２２３ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

１０５４ｄｅｌ１１変異は常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は４３歳の男性で、アキレス腱の黄色腫と心臓血管疾患があり、１親等の親族に若年性心筋梗塞が起こっていた。この男性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは１６ポイントであった。治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ（４８０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４１６ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（９５ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（３６ｍｇ／ｄＬ）であった。

（実施例８）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン８に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン８の２２０ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ８Ｆ（配列番号１４８）とＥｘ８Ｒ（配列番号１４９）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６４℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。配列決定によって同定された変異はさらに制限酵素分析により、また、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

１１８６＋５Ｇ＞Ａ変異解析
この変異（１１８６＋５Ｇ＞Ａ）は、臨床的にＦＨと診断された対象からＬＤＬ−ｒ遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン８の２２０ｂｐの断片を自動配列決定して同定した。配列決定反応は、ＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００サーモサイクラーで、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＢｅｃｋｍａｎ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用いて行い、プライマーはＥｘ８ＢＦ（配列番号１４８）とＥｘ８ＢＲ（配列番号１４９）を使用した。

配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。Ｇ＞Ａの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

この変異は、常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない２家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は３４歳の女性で、黄色腫、角膜環、腱黄色腫、及び高コレステロール血症の家族歴がある。この女性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは２１ポイントであった。この女性の治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ４１１ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３４６ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃのレベルは正常であった。セリバスタチン（０．２ｍｇ／日）による脂質低下治療でこの女性のＬＤＬ−ｃレベルは２２２ｍｇ／ｄＬまで低下した。

（実施例９）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン９に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン９の２２４ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ９Ｆ（配列番号２０）とＥｘ９Ｒ（配列番号２１）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６３℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

１１９７ｄｅｌ９変異解析
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。ＰＣＲ産物を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスが現れた。得られた断片は、正常アリルでは２２４ｂｐで、変異アリルでは２１５ｂｐであった。ヘテロデュープレックスのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することができた。

１１９７ｄｅｌ９変異は、共通して常染色体優性高コレステロール血症である関連のない８家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は、黄色腫の４５歳の女性で、４１歳のときに狭心症に襲われている。この女性の父親は３６歳で心筋梗塞を起こした。この女性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは１８ポイントであった。この女性の治療前の血漿脂質レベルは、ＴＣ（５２５ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４４３ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１６３ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４９ｍｇ／ｄＬ）であった。アトルバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療でこの女性のＬＤＬ−ｃレベルは３２３ｍｇ／ｄＬに減少した。

Ｙ３７９Ｘ変異解析
このＹ３７９Ｘ変異（１２００Ｃ＞Ａ、ＴＡＣ＞ＴＡＡ、Ｔｙｒ３７９Ｓｔｏｐ）は酵素エンドヌクレアーゼＭｎｌＩの切断部位を破壊する。メーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬに１５単位ＭｎｌＩを加え、総量３０μＬ中で切断した。得られた断片は、正常アリルでは８７、５６、３４、２２、１８、４、３ｂｐで、変異アリルでは８７、５６、３８、２２、１８、３ｂｐであった。これらの断片を１６％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動することにより、３４ｂｐと３８ｂｐのバンドの区別が可能となり、エチジウムブロマイド染色での可視化により両アリルを判別した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）を、スライド上に配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｙ３７９Ｘ変異は常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象はこの家族の６９歳の男性であった。この男性の父親は５０歳で心筋梗塞を起こしており、２人の子供は血漿総コレステロールが９５パーセンタイル超であった。この男性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは７ポイントであった。この男性の治療していないときの脂質値は、ＴＣ（３８１ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３０６ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常という結果であった。アトルバスタチン（２０ｍｇ／日）による治療で、この男性のＬＤＬｃのレベルは２５９ｍｇ／ｄＬに減少した。

１２０７ｄｅｌＴ変異解析
この変異は制限酵素ＭｂｏＩＩの切断部位を破壊する。メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、エキソン９の増幅された材料１５μＬを１５単位のＭｂｏＩＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１４０、４６、３５、３ｂｐで、変異アリルでは１４０、４８、３５ｂｐであった。これらの断片を１６％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、両アリルを判別する４６ｂｐと４８ｂｐのバンドが区別できた。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

１２０７ｄｅｌＴ変異は常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は３５歳の女性であった。ＦＨ臨床診断のＭｅｄＰｅｄスコアは９ポイントであった。この女性の脂質低下治療をしていないときの血漿脂質レベルは、ＴＣ（４２９ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３４５ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１８８ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４６ｍｇ／ｄＬ）であった。シンバスタチン（４０ｍｇ／日）とコレスチポール（５ｇ／日）の脂質低下治療を組み合わせたところ、この女性のＴＣとＬＤＬ−ｃのレベルは２２０ｍｇ／ｄＬと１３７ｍｇ／ｄＬに減少したが、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルには著しい変化はなかった。

Ｙ４２１Ｘ変異解析
このＹ４２１Ｘ変異（１３２６Ｃ＞Ｇ、ＴＡＣ＞ＴＡＧ、Ｔｙｒ４２１Ｓｔｏｐ）はエンドヌクレアーゼＢｆａＩの新たな切断部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ社、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位ＢｆａＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは２２４ｂｐ（非分解断片）、変異アリルでは１６４ｂｐと６０ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載されているデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｙ４２１Ｘ変異は、共通して常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない３家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は、角膜環、腱黄色腫、黄色腫の７１歳の女性であった。この女性の父親は５１歳で心筋梗塞の発作に襲われており、息子は著しい高コレステロール血症（ＴＣ３６７ｍｇ／ｄＬ）であった。この女性は臨床的にＦＨと診断されており、ＭｅｄＰｅｄスコアは１６ポイントであった。脂質低下薬剤を使用していないときのこの女性の血漿脂質濃度は、ＴＣ（６１５ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（５５０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。

１２０４ｉｎｓＴ変異解析
この変異はエンドヌクレアーゼＭｂｏＩＩによる切断部位を破壊する。メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、エキソン９のＰＣＲサンプル１５μＬをＭｂｏＩＩ１５単位で、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１４１、４５、３５、３ｂｐで、変異アリルでは１４１、４５、３９ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）を、スライド上に配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

この変異は１２歳の少女から検出された。この少女の父親と７歳の弟は高コレステロール血症でＴＣレベルがそれぞれ４１２ｍｇ／ｄＬと３２１ｍｇ／ｄＬであった。臨床診断ＦＨとしてのＭｅｄＰｅｄスコアは９ポイントであった。脂質低下薬剤を使用していないときのこの少女の空腹時血清脂質レベルの分析では、ＴＣ３３２ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ２６７ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。レジン（１５ｇ／日）による脂質低下治療でＬＤＬ−ｃレベルは２４８ｍｇ／ｄＬまで低下した。

（実施例１０）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１０に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１０の２７８ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１０Ｆ（配列番号２２）とＥｘ１０Ｒ（配列番号２３）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５８℃１分間、伸長７４℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、また、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

１４３２ｄｅｌＧ変異解析
この変異は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではＮａｅＩ制限酵素部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。

ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１０の２００ｂｐをポリマラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）でＥｘ１０Ｒ（配列番号２３）とＭｕｔｌ４３２ｄｅｌＧＦ（配列番号２４）のプライマーを用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５８℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＮａｅＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは２００ｂｐ（非分解断片）で、変異アリルでは１７９ｂｐと２０ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

１４３２ｄｅｌＧ変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は腱黄色腫の５３歳の女性で、この女性は心筋梗塞を起こしており、さらに若年性心臓血管疾患の家族歴も持つ。この女性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１５ポイントであった。脂質低下治療をしていないときのこの女性の脂質分析では、ＴＣ（５４８ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４７０ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常という結果であった。

Ｔ４３３Ｎ変異解析
このＴ４３３Ｎ変異（１３６１Ｃ＞Ａ、ＡＣＣ＞ＡＡＣ、Ｔｙｒ４３３Ａｓｎ）は、臨床的にＦＨと診断された対象のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１０の２７８ｂｐ断片の分析において、これを自動配列決定することにより同定された。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＢｅｃｋｍａｎ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用いて行い、プライマーはＥｘ１０Ｆ（配列番号２２）とＥｘ１０Ｒ（配列番号２３）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。Ｃ＞Ａの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｔ４３３Ｎ変異は、５０歳の男性から検出され、この男性は角膜環及び常染色体優性高コレステロール血症の家族歴を持ち、２１歳の娘はＴＣレベルが３１０ｍｇ／ｄＬであった。臨床診断ＦＨとしてのＭｅｄＰｅｄスコアは６ポイントであった。薬剤治療開始前の血漿脂質濃度の分析では、ＴＣ３１８ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ２４９ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。ロバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療でこの男性のＬＤＬ−ｃは１９９ｍｇ／ｄＬに低下した。

変異Ｔ４４６Ｉの解析
このＴ４４６Ｉ変異（１４００Ｃ＞Ｔ、ＡＣＣ＞ＡＴＣ、Ｔｙｒ４４６Ｉｌｅ）は、臨床的にＦＨと診断された対象のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１０の２７８ｂｐ断片を自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーはＥｘ１０Ｆ（配列番号２２）とＥｘ１０Ｒ（配列番号２３）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。Ｃ＞Ｔの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｔ４４６Ｉ変異は、若年性心臓血管疾患（６２歳のときに痛み）の背景を持つ６４歳の女性から検出され、この女性の２人の兄弟は高コレステロール血症で、それぞれ４０歳と４６歳のときに心筋梗塞に襲われた。この女性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは９ポイントであった。薬剤治療時の脂質の血漿濃度は、ＴＣ（３５２ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２８１ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。シンバスタチン２０ｍｇ／日による脂質低下治療後のＬＤＬ−ｃレベルは１５０ｍｇ／ｄＬに低下した。

変異１４２３ｄｅｌＧＣ／ｉｎｓＡ解析
この１４２３ｄｅｌＧＣ／ｉｎｓＡ変異はエンドヌクレアーゼＭｖａＩの切断部位を破壊する。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、エキソン１０のＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位ＭｖａＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１５０ｂｐと１２８ｂｐで、変異アリルでは１２８、８７、６３ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド染色で可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

この変異は、親が高コレステロール血症である３４歳の男性から検出された。ＦＨとの臨床的診断でのＭｅｄＰｅｄスコアは９ポイントであった。脂質低下剤を使用していないときの空腹時の血清脂質レベルを分析すると、総ＴＣ５５４ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ４２２ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。アトルバスタチン（１０ｇ／日）による脂質低下治療で、ＬＤＬ−ｃレベルは４０６ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１１）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１１に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１１の１９４ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１１Ｆ（配列番号２５）とＥｘ１１Ｒ（配列番号２６）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６５℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。配列決定によって同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

Ｗ５１５Ｘ変異解析
このＷ５１５Ｘ変異（１６０７Ｇ＞Ａ、ＴＧＧ＞ＴＡＧ、Ｔｒｐ５１５Ｓｔｏｐ）は新たなＢｆａＩ切断部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ社、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬをＢｆａＩ１５単位で、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１６４ｂｐと３０ｂｐで、変異アリルでは９７、６７、３０ｂｐであった。これらの断片を３％ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｗ５１５Ｘの変異は、角膜環の３９歳の男性から検出され、この男性の父親は５０歳のときに心筋梗塞に襲われた。この男性は家族性高コレステロール血症と診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは１３ポイントであった。薬剤治療していないときの血漿脂質濃度は、ＴＣ（３６４ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３０８ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。この対象者の父親、２人の兄弟、及び息子のコレステロールレベルは９５パーセンタイルであった。

［１５８７−５ｄｅｌ５；１５８７ｄｅｌ３１］変異解析
この変異［１５８７−５ｄｅｌ５；１５８７ｄｅｌ３１］は、臨床的にＦＨと診断された対象のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１１の１９４ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーは（配列番号２５）とＥｘ１１Ｒ（配列番号２６）を使用した。

配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。この欠失は、２％アガロースゲル電気泳動で、正常アリルと変異アリルに対応してそれぞれ１９４ｂｐと２５８ｂｐのバンドとして観察されるのを確認した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

［１５８７−５ｄｅｌ５；１５８７ｄｅｌ３１］変異は、角膜環の４３歳の男性から検出され、この男性は常染色体優性高コレステロール血症の家族歴を持ち（父親と息子は高コレステロール血症）、家族には心臓血管系疾患の徴候がみられた（父親は５０歳のときに心筋梗塞に襲われた）。この男性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは９ポイントであった。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（３４５ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１６０ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（３４ｍｇ／ｄＬ）であった。シンバスタチン４０ｍｇ／日とコレスチポール１０ｇ／日を組み合わせた脂質低下治療によりＬＤＬ−ｃレベルは２０８ｍｇ／ｄＬに低下した。

Ｇ５１６Ｘ変異解析
この変異（１６０９Ｇ＞Ｔ、ＧＧＡ＞ＴＧＡ、Ｇｌｙ５１６Ｓｔｏｐ）は新たなＨｐｈＩ切断部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ社、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、エキソン１１の増幅材料１５ＬをＨｐｈＩ１５単位で、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１３９、４３、１２ｂｐで、変異アリルでは８１、５８、４３、１２ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｇ５１６Ｘの変異は、腱黄色腫と高コレステロール血症家族歴（母親と２人の思春期の兄弟はＬＤＬ−ｃレベル９５パーセンタイル超）を持つ２０歳の女性から検出された。この女性は家族性高コレステロール血症と診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは１７ポイントであった。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ４７６ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ４０３ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。ＨＭＧＣｏＡリダクターゼ阻害剤による脂質低下治療後のＬＤＬ−ｃレベルは２０２ｍｇ／ｄＬに低下した。

Ｈ５６２Ｑ変異解析
この変異（１７４９Ｃ＞Ａ、ＣＡＣ＞ＣＡＡ、Ｈｉｓ５６２Ｇｌｎ）は、臨床的にＦＨと診断された患者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１１の１９４ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーは（配列番号２５）とＥｘ１１Ｒ（配列番号２６）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＣ＞Ａの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｈ５６２Ｑの変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族歴（父親は高コレステロール血症で４８歳のときに心筋梗塞を起こし、１３歳の息子のＴＣレベルは５００ｍｇ／ｄＬ）を持つ３７歳の女性から検出された。この女性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは９ポイントであった。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（３５０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチン２０ｍｇ／日による脂質低下治療で、ＴＣレベルは３３３ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１２）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１２に位置する変異の同定
エキソン１２の２３６ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１２Ｆ（配列番号１５０）とＥｘ１２Ｒ（配列番号１５１）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５８℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス（「バイオチップ」）によって、その存在を判定した。

Ｅ５７９Ｄ変異解析
このＥ５７９Ｄ変異（１８００Ｇ＞Ｃ、ＧＡＧ＞ＧＡＣ、Ｇｌｕ５７９Ａｓｐ）は、臨床的にＦＨと診断された患者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１２の２３６ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーはＥｘ１２Ｆ（配列番号１５０）とＥｘ１２Ｒ（配列番号１５１）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＧ＞Ｃの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｅ５７９Ｄの変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族歴（父親はＴＣ４５０ｍｇ／ｄＬで、兄と思春期の子供２人はＬＤＬ−ｃレベルが９５パーセンタイル）を持つ４９歳の男性から検出された。この男性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは８ポイントであった。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（３２０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ−ｃ（２５０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。アトルバスタチン（１０ｍｇ／日）による脂質低下治療で、ＬＤＬ−ｃレベルは１８７ｍｇ／ｄＬに低下した。

１８１５ｄｅｌ１１変異
この変異はヘテロデュープレックス解析で同定することができた。エキソン１２のＰＣＲ増幅材料を８％ポリアクリルアミド（ＰＡＡ）ゲル電気泳動すると、変異がある場合は、２３６ｂｐと２２５ｂｐの２本のホモデュープレックスバンドより見かけ上大きな分子量を示すヘテロデュープレックスのバンドの存在が示され、それらはエチジウムブロマイドで染色してゲル中で容易に見分けられた。形成するヘテロデュープレックスの２本のバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じる結果、ホモデュープレックスより遅く移動する。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号１８４、配列番号１８５、配列番号１８６、配列番号１８７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することができた。

１８１５ｄｅｌ１１変異は、常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない４家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は、角膜環と、若年性冠動脈疾患の徴候（５６歳のときに痛み）がある６９歳の女性で、家族数人（２人の兄弟はＴＣがそれぞれ７００ｍｇ／ｄＬと４３５ｍｇ／ｄＬ）に高コレステロール血症歴があった。この女性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１３ポイントであった。この女性のシンバスタチン（４０ｍｇ／ｄＬ）による脂質低下治療時の血漿脂質レベルは、ＴＣ４４４ｍｇ／ｄＬ、ＬＤＬ−ｃ３６８ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃは正常レベルであった。アトルバスタチン（３０ｍｇ／日）による脂質低下治療で、ＬＤＬ−ｃレベルは２２５ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１３）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１３に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１３の２１５ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１３Ｆ（配列番号２７）とＥｘ１３Ｒ（配列番号２８）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃１分間、伸長７４℃３分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

Ｄ６３０Ｎ変異解析
このＤ６３０Ｎ変異（１９５１Ｇ＞Ａ、ＧＡＴ＞ＡＡＴ、Ａｓｐ６３０Ａｓｎ）はＭｎｌＩ切断部位を破壊する。メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位ＭｎｌＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは８９、４８、３９、１４＋１４、１２、１１ｂｐであったが、変異アリルでは８９、５９、３９、１４＋１４、１２ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）を用いて、スライド上に配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｄ６３０Ｎ変異は、常染色体優性遺伝のある、関連のない２家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は３６歳の女性で、両親は６２歳と６４歳で心筋梗塞で死亡した。ＦＨ臨床診断のＭｅｄＰｅｄスコアは７ポイントであった。薬剤治療をしていないときの血漿脂質濃度は、ＴＣ（３２２ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２６８ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（８１ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（４８ｍｇ／ｄＬ）であった。

Ｈ６３５Ｎ変異解析
このＨ６３５Ｎ変異（１９６６Ｃ＞Ａ、ＣＡＣ＞ＡＡＣ、Ｈｉｓ６３５Ａｓｎ）は制限地図を変えないため、正常アリルの存在下ではＣａｉＩ制限部位が導入され、変異アリルの存在下では現れないような、ミスマッチ２つを含むデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。

エキソン１３の１６９ｂｐ断片を、デオキシオリゴヌクレオチドＥｘ１３Ｆ（配列番号２７）と２つのミスマッチのあるデオキシオリゴヌクレオチドＭｕｔＨ６３５ＮＲ（配列番号２９）を用いてＰＣＲで増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５６℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＣａｉＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１５１ｂｐと１８ｂｐで、変異アリルでは１６９ｂｐであった。これらの断片を８％ＰＡＡゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｈ６３５Ｎ変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族のメンバーから検出された。対象は角膜環のある４３歳の男性で、若年性心臓血管疾患の家族歴はなかった。この男性の母親と３人の兄弟姉妹たちはコレステロール濃度が９５パーセンタイル超であった。この男性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１３ポイントであった。この男性の薬剤治療をしていないときの血漿脂質濃度は、ＴＣ（４４８ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（３８４ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。

（実施例１４）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１４に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１４の２８８ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、デオキシオリゴヌクレオチドＥｘ１４Ｆ（配列番号３０）とＥｘ１４Ｒ（配列番号３１）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（２５０ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５９℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

Ｄ６８６Ｙ変異解析
このＤ６８６Ｙ変異（２１１９Ｇ＞Ｔ、ＧＡＣ＞ＴＡＣ、Ａｓｐ６８６Ｔｙｒ）は、臨床的にＦＨと診断された対象者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１４の２８８ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーはＥｘ１４Ｆ（配列番号３０）とＥｘ１４Ｒ（配列番号３１）を使用した。

配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＧ＞Ｔの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｄ６８６Ｙの変異は、黄色腫と角膜環の３１歳の男性から検出され、この男性は若年性冠動脈疾患（痛み）の徴候と高コレステロール血症の家族歴を持っていた。この男性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは２１ポイントであった。この男性の薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（４３０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチン４０ｍｇ／日とコレスチポール（５ｇ／日）の組合せによる脂質低下治療で、ＴＣレベルは２０５ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１５）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１５に位置する変異の同定
ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１５の２４３ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、デオキシオリゴヌクレオチドＥｘ１５Ｆ（配列番号３２）とＥｘ１５Ｒ（配列番号３３）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５５℃３０秒間、伸長７２℃１．５分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、また、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

２１８４ｄｅｌＧ変異解析
この変異は新たなＡｌｕＩ制限酵素切断部位を生じる。メーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬをＡｌｕＩ１５単位で、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１６６ｂｐと７８ｂｐで、変異アリルでは１６６、６７、１１ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

２１８４ｄｅｌＣの変異は、常染色体優性高コレステロール血症の家族から検出された。対象は３２歳の女性で、若年性心臓血管疾患の家族歴を持つ。ＦＨ臨床診断のＭｅｄＰｅｄ診断スコアは６ポイントであった。薬剤治療していないときの血漿脂質濃度は、ＴＣ（３３０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２７０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。

Ｔ７４０Ｍ変異解析
このＴ７４０Ｍ変異（２２８２Ｃ＞Ｔ、ＡＣＧ＞ＡＴＧ、Ｔｙｒ７４０Ｍｅｔ）は新たなＮｌａＩＩＩ分解部位を生じる。メーカー（ＮＥＢ社、べバリー、マサチューセッツ、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬをＮｌａＩＩＩ１５単位で、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは２４７ｂｐで、変異アリルでは２７４、１９４、５３ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｔ７４０Ｍの変異は６０歳の女性から検出され、この女性は角膜環と高コレステロール血症の家族歴と若年性心臓血管疾患の家族歴を持つ。父親は３４歳で、脳血管障害で死亡した。この女性は、ＭｅｄＰｅｄ診断スコア１０ポイントで家族性高コレステロール血症と診断された。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ４９２ｍｇ／ｄＬで、ＴＧとＨＤＬ−ｃレベルは正常であった。アトルバスタチンによる脂質低下治療で、ＴＣレベルは２５１ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１６）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１６に位置する変異の同定
エキソン１６の２７３ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１６Ｆ（配列番号１５２）とＥｘ１６Ｒ（配列番号１５３）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６３℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

Ｖ７６６Ｅ変異解析
このＶ７６６Ｅ変異（２３６０Ｔ＞Ａ、ＧＴＧ＞ＧＡＧ、Ｖａｌ７６６Ｇｌｕ）は、臨床的にＦＨと診断された患者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１６の２７３ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＢｅｃｋｍａｎ Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、ＵＳＡ）と共に用い、プライマーはＥｘ１６Ｆ（配列番号１５２）とＥｘ１６Ｒ（配列番号１５３）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＴ＞Ａの変換を、２回目のＰＣＲ産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｄ６８６Ｙの変異は、５８歳の女性から検出され、この女性はひじの腱黄色腫、角膜環、黄色腫、及び高コレステロール血症の家族歴があった。この女性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１２ポイントであった。薬剤治療前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（４２０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ−ｃ（３２４ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。

Ｉ７７１Ｔ変異解析
このＩ７７１Ｔ変異（２３７５Ｔ＞Ｃ、ＡＴＴ＞ＣＡＣＴ、Ｉｌｅ７７１Ｔｈｒ）は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではＨｉｎｃＩＩ制限部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。

ＬＤＬｒ遺伝子のエキソン１６の１４２ｂｐを、デオキシオリゴヌクレオチドＥｘ１６Ｒ（配列番号１５３）とミスマッチのあるデオキシオリゴヌクレオチドＭｕｔＩ７７１ＴＦ（配列番号１５４）を用いてＰＣＲ技法で増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６１℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＨｉｎｃＩＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１４２ｂｐで、変異アリルでは１２１ｂｐと２１ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

Ｉ７７１Ｔの変異は、６０歳の女性から検出され、この女性には若年性の冠状動脈性心臓病の家族的徴候と、高コレステロール血症の家族歴があった。この女性は家族性高コレステロール血症と診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは２１ポイントであった。この女性の血漿脂質濃度は、ＴＣ（４２２ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ−ｃ（３６８ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。

２３８９＋３Ａ＞Ｃ変異解析
この２３８９＋３Ｃ＞Ｔ変異、臨床的にＦＨと診断された患者のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１６の２７３ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）と共に用い、プライマーはＥｘ１６Ｆ（配列番号１５２）とＥｘ１６Ｒ（配列番号１５３）を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで解析した。見出されたＣ＞Ｔの変換を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を自動配列決定で確認した。

他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

２３８９＋３Ｃ＞Ｔの変異は、３６歳の男性から検出され、この男性にはアキレス腱黄色腫とそれの手への拡大、及び家族の高コレステロール血症歴（母親、兄、息子１人はＬＤＬ−ｃレベルが９５パーセンタイル超）がみられた。この男性は臨床的にＦＨと診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは１８ポイントであった。薬剤療法前の血漿脂質濃度は、ＴＣ（４５０ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチン（２０ｍｇ／日）による脂質低下治療で、ＬＤＬ−ｃは２５９ｍｇ／ｄＬに低下した。

２３８９＋４Ａ＞Ｇ変異解析
この変異（２３８９＋４Ａ＞Ｇ）は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではＢｓｈＮＩ制限部位が導入され、正常アリルの存在下では導入されないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。

エキソン１６の１９４ｂｐを、デオキシオリゴヌクレオチドＥｘ１６Ｆ（配列番号１５２）とミスマッチのあるデオキシオリゴヌクレオチドＭｕｔ２３８９＋４Ａ＞ＧＲ（配列番号１５５）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（５００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング６１℃１分間、伸長７２℃２分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

メーカー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社、ハノーバー、メリーランド、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＢｓｈＮＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは１９４ｂｐで、変異アリルでは１７５ｂｐと１９ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

２３８９＋４Ａ＞Ｇの変異は、関連のない１１組の高コレステロール血症の家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は２２歳の女性で、この女性は腱黄色腫と若年性心臓血管疾患（父親は高コレステロール血症で２９歳のときに心筋梗塞）の家族歴を持つ。この女性は家族性高コレステロール血症と診断され、ＭｅｄＰｅｄ診断スコアは１７ポイントであった。脂質低下治療をしていないときのこの女性の血漿脂質レベルは、ＴＣ（３５６ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（２９３ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチン（４０ｍｇ／日）とコレスチポール（５ｇ／日）の組合せによる脂質低下治療で、ＨＤＬ−ｃレベルは２２７ｍｇ／ｄＬに低下した。

（実施例１７）
ＬＤＬｒ遺伝子エキソン１７に位置する変異の同定
エキソン１７の２４２ｂｐ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で、プライマーＥｘ１７Ｆ（配列番号３４）とＥｘ１７Ｒ（配列番号３５）を用いて増幅した。

２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．４、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、１．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製、カールスバド、カルフォルニア、米国）を含む５０μＬ反応混合液中でＤＮＡ（３００ｎｇ）を増幅した。増幅のサイクルは、９６℃で１０分間変性後、変性９４℃１分間、アニーリング５８℃１分間、伸長７２℃１分間を３５サイクル、最終伸長を７２℃で１０分間とした。

ＰＣＲ産物を一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析（ＳＳＣＰ）で解析した。異常なＳＳＣＰパターンを示す断片については、自動ＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）で配列決定した。同定された変異はさらに制限酵素分析により、及び、既出のデバイス「バイオチップ」によって、その存在を判定した。

２３９９ｄｅｌ５ｉｎｓ４変異解析
この変異は、２３９９位置で配列ＴＣＴＴＣを削除し配列ＧＧＧＴを導入して、新たなＡｖａＩ分解部位を生じる。メーカー（アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国）のプロトコールに従い、ＰＣＲサンプル１５μＬを１５単位のＡｖａＩで、総量３０μＬ中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは２３０ｂｐと１２ｂｐで、変異アリルでは１８３、４６、１２ｂｐであった。これらの断片を８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。

２３９９ｄｅｌ５ｉｎｓ４変異は、常染色体優性高コレステロール血症である、関連のない３つの家族から検出された。これらのうちの１家族の初発症例は腱黄色腫の４９歳の女性で、この女性の父親は心筋梗塞で５１歳で死亡した。ＦＨ臨床診断のＭｅｄＰｅｄスコアは１６ポイントであった。脂質低下治療前のこの女性の血漿脂質レベルは、ＴＣ（５１０ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬｃ（４２４ｍｇ／ｄＬ）、ＨＤＬｃ（５８ｍｇ／ｄＬ）、ＴＧ（１４０ｍｇ／ｄＬ）であった。シンバスタチン２０ｍｇ／日とコレスチポール２０ｇ／日の組合せによる治療で、ＴＣは２８０ｍｇ／ｄＬに低下した。さらに、この女性の２２歳と２０歳の２人の子供は、それぞれコレステロールレベルが３３０と３８６ｍｇ／ｄＬであった。

２５４４ｉｎｓＣ変異解析
この変異は、臨床的にＦＨと診断された対象のＬＤＬ−ｒ遺伝子エキソン１７の２４２ｂｐ断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーＰＥ Ｇｅｎｅ Ａｍｐ Ｓｙｓｔｅｍ９７００で行い、ＣＥＱ２０００Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇキットをＱｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ（ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国）と共に用い、プライマーはＥｘ１７Ｆ（配列番号３４）とＥｘ１７Ｒ（配列番号３５）を使用して、その後に自動シーケンサーＣＥＱ２０００ＸＬ ＤＮＡ Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで電気泳動した。この欠失を、同じサンプルの２回目のＰＣＲ産物を自動配列決定して確認した。

他の方法としては、この変異は、記載のデバイス（「バイオチップ」）で、スライド上に配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２４６、配列番号２４７のオリゴヌクレオチドをスポットして解析できる。

２５４４ｉｎｓＣ変異は、心筋梗塞に襲われた３７歳の男性から検出され、この男性は腱黄色腫と角膜環、及び高コレステロール血症の家族歴（この男性の父親は若年性の心筋梗塞で死亡）を持っていた。この男性はＦＨと臨床診断され、ＭｅｄＰｅｄスコアは２１ポイントであった。薬剤療法前のこの男性の血漿脂質レベルは、ＴＣ（４４４ｍｇ／ｄＬ）、ＬＤＬ−ｃ（３７９ｍｇ／ｄＬ）で、ＴＧとＨＤＬｃレベルは正常であった。アトルバスタチン（４０ｍｇ／日）による資質低下治療でこの男性のＬＤＬ−ｃは２８２ｍｇ／ｄＬに低下した。

ヒト細胞におけるＬＤＬ−ｒの順路の概略表示を示す図である。ＬＤＬ−ｒはみかけの分子量１２０Ｋｄの前駆体として小胞体で合成され、ゴルジ装置に輸送される。細胞表面にいったん輸送されると、この受容体はＬＤＬのアポリポタンパク質Ｂ−１００成分を認識する。結合は受容体介在性エンドサイトーシスによる細胞へのＬＤＬの取り込み及びＬＤＬのリソソームでの分解をもたらす。この取り込み過程は、細胞のコレステロール要求性を満たし、このようにして内因性コレステロール合成の抑制を維持する。 ヒトＬＤＬ受容体タンパク質の構造における５つのドメイン及び遺伝子エキソンとのそれらドメインの対応の概略表示を示す図である。 突然変異Ｅ２５６Ｋについて１０個のカップで繰り返す４つのプライマー（正常２つ及び突然変異２つ）を用いた画像の定量のためのスライドグラスを示す図である。（Ａ）正常な個体、（Ｂ）家族性高コレステロール血症を有する個体。各突然変異について２対のオリゴヌクレオチドをスポットした。各プローブ対は野生型対立遺伝子に特異的な一プローブ及び突然変異対立遺伝子に特異的な第２プローブからなる。

Claims (16)

1. 家族性高コレステロール血症のための体外及びｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法における適用の、以下の突然変異、即ち
   

   

   
   の少なくとも１つを含む、配列番号１に対応する遺伝子配列。
2. 家族性高コレステロール血症の体外及びｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法における適用の、以下の突然変異、即ち
   

   

   
   のいずれかをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子配列。
3. 家族性高コレステロール血症の体外及びｉｎ ｖｉｔｒｏ診断法における適用の、以下の多型、即ち
   

   

   
   のいずれかをさらに含む、請求項１又は２のいずれかに記載の遺伝子配列。
4. 以下の突然変異、即ち
   

   

   
   のいずれかにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドの設計及び調製における請求項１に記載の遺伝子配列の使用。
5. 請求項１の遺伝子配列に含まれる突然変異のいずれかにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ。
6. 配列番号８、配列番号１１、配列番号１６、配列番号１７、配列番号２４、配列番号２９の少なくとも１つ、又は配列番号３７から配列番号１４７まで若しくは配列番号１５４から配列番号２５９までからの少なくとも１つから選択される、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
7. 家族性高コレステロール血症の診断のための、ＬＤＬ−ｒ遺伝子突然変異のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出の体外法における請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
8. 家族性高コレステロール血症の診断のための、ＬＤＬ−ｒ遺伝子突然変異のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出の体外法における請求項６に記載のプローブの使用。
9. 請求項５に記載のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用のアッセイキット。
10. 請求項６に記載のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用のアッセイキット。
11. 家族性高コレステロール血症の診断のためのＬＤＬ−ｒ遺伝子突然変異のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出の体外法における、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５３から選択されるオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの使用。
12. 配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３から選択されるオリゴヌクレオチドプローブのいずれかがさらに結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用の、請求項９又は１０のいずれかに記載のアッセイキット。
13. 個体の生体試料において請求項１に記載の配列番号１の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の体外法。
14. 個体の生体試料において請求項２に記載の配列番号１の突然変異のいくつかと組み合わせて、請求項１に記載の前記配列番号１の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の体外法。
15. 個体の生体試料において請求項３に記載の配列番号１の多型のいくつかと組み合わせて、請求項１に記載の前記配列番号１の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断の体外法。
16. 請求項１に記載の突然変異を単独で又は請求項２に記載の突然変異及び／若しくは請求項３に記載の多型と組み合わせて含むＤＮＡ断片をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により増幅させること、そのために配列番号２から配列番号２５９までから選択されるオリゴヌクレオチドのいずれか又はその組合せを利用すること、前記ＰＣＲの産物を単連鎖高次構造多型法（ＳＳＣＰ）による分析にかけること、制限分析又は請求項９、１０、若しくは１２に記載のアッセイキットによりその後同定されるであろう突然変異を検出するために、ＳＳＣＰにより異常パターンを有する前記断片を配列決定することを含む、請求項１３から１５までに記載の診断法。

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