JP2006515762A - 家族性高コレステロール血症に関連する低密度リポタンパク質受容体(LDL−r)の単離された遺伝子配列における突然変異の検出のための方法及びデバイス - Google Patents
家族性高コレステロール血症に関連する低密度リポタンパク質受容体(LDL−r)の単離された遺伝子配列における突然変異の検出のための方法及びデバイス Download PDFInfo
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Abstract
Description
− Antoranakis S.E.及び命名作業グループ、「ヒト遺伝子突然変異に対する命名系についての勧告(Recommendations for Nomenclature Systems for Human Gene Mutations)」Human Mutation 11:1〜3頁;1998
− Dunnen JT、Antoranakis S.E.「複合突然変異を記載するための突然変異命名の拡張と提案:一論考(Mutation Nomenclature Extensions and Suggestions to describe Complex Mutations:A Discussion)」Human Mutation 15:7〜12頁、2000
に定義されている。
− Harris H.「ヒト生化学遺伝学の原理(The Principles of Human Biochemical Genetics)」、第3版、アムステルダム、ノールトホラント1980
− Beauder AL、Scriver CL、Sly WS、Valle D.「多様なヒト表現型の遺伝学、生化学及び分子的基礎(Genetics,Biochemistry and Molecular Basis of Variant Human Phenotypes)」、The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease、Beaudet AL、Scriver CR、Sly WS、Valle D編、第7版、53頁、MacGraw Hill、ニューヨーク1995
に定義されている。
・ 印刷用緩衝液としてDMSOを用いてアミノシラン化スライドグラスに突然変異を検出可能なオリゴヌクレオチドを印刷する。
・ 温度及び湿度が制御される「スポッター」又はオリゴヌクレオチドプリンターを用いて印刷を行う。
・ スライドグラスに印刷した後にUV照射処理を行う。
・ ろ過法を用いることにより約300μlの血液試料から患者のゲノムDNAを抽出する。
・ 多重PCR反応を行い、各患者についてプロモーター及びLDL受容体遺伝子の18個のエキソンすべてを増幅させる。
・ ビオチン化ヌクレオチドをPCRプロセスの間に組み入れる。間接標識法として、蛍光体ストレプトアビジン発色剤を用いた染色の最終ステップがハイブリダイゼーション後に必要となる。
・ PCR産物を電気泳動し、アガロースゲルで可視化する。
・ 標的DNAを断片化する。
・ ハイブリダイゼーション緩衝液を断片化したPCR産物に加える。
・ 変性ステップを95℃で15分間行う。
・ 本目的のためにAmersham Biosciencesが設計したステーションでハイブリダイゼーションを自動実施する。
・ スライドグラスを予備ハイブリダイゼーションする。
・ Hamiltonピペットでハイブリダイゼーション溶液を注入する。
・ ハイブリダイゼーション時間を1時間とする。
・ スライドグラスを3回洗浄し乾燥させる。
・ ステーションはスライドグラスを□。
・ スライドグラスをスキャナに挿入する。
・ レーザーで刺激した際に標準マーカーから発光するシグナルをスキャンする。
・ スキャナソフトウェアは得られた画像においてハイブリダイゼーションが起こった点のシグナルを定量することを可能にする。
・ オリゴヌクレオチドにおいて得られた、正常対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を検出するシグナルから、患者における突然変異の存在の有無を立証する。
LDLr遺伝子エキソン1に位置する変異の同定
LDLr遺伝子エキソン1の215bp断片を、プライマーEx1F(配列番号2)とEx1R(配列番号3)を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により増幅した。
この変異は新たなAvaII認識部位を生じる。メーカー(NEB、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、エキソン1増幅材料5μLを15単位のAvaIIにより総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは148bpと67bp長、変異アリルでは93bp、67bp、55bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
この変異(47T>C、CTC>CCC、Leu(−6)Pro)は、FHと臨床診断されたLDL−r遺伝子エキソン1の215bp断片の解析において、これを自動配列決定することによって特性決定した。配列決定反応は、PE Gene Amp System9700サーモサイクラーで、CET2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをBeckman Quick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーはEx1F(配列番号2)とEx1R(配列番号3)を使用して実施した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL NDA Beckman Analysis Systemで解析した。見出されたT>Cの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号240、配列番号241、配列番号242、配列番号243のオリゴヌクレオチドを用いて解析できる。
この変異(58G>A、GGG>AGG、Gly(−2)Arg)は、FHと臨床診断された患者のLDL−r遺伝子エキソン1の215bp断片の解析において、これを自動配列決定することによって特性決定した。DNAサンプルから得られた精製PCR産物を、メーカーのプロトコールに従い、増幅用プライマーのEx1F(配列番号2)とEx1R(配列番号3)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)を使って、両方向から直接配列決定した。塩基配列をCEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマンコールター社、フラートン)により検出し、CEQ8000のソフトウェアで解析した。58G>A変換は2回目のPCR産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号220、配列番号221、配列番号222、配列番号223のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン2に位置する変異の同定
エキソン2の183bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、Ex2F(配列番号4)とEx2R(配列番号5)のデオキシヌクレオチドを用いて増幅した。
この変異は新たなMnlI切断部位を生じる。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン1増幅材料15μLを15単位のMnlIで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは150bpと33bp長、変異アリルでは118bp、33bp、32bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
この変異(185C>T、ACG>ATG、Thr41Met)は酵素TaiIの切断制限部位を破壊する。メーカー(NEB、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、エキソン1増幅材料15μLを15単位のTaiIで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は正常アリルでは154bpと29bp長、変異アリルでは183bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)を、スライドと共に使用して、配列番号140、配列番号141、配列番号142、配列番号143のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
この変異C42Y(188G>A、TGC>TAG、Cys42Tyr)は、FHと臨床的に診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン2に該当する183bpの断片を配列決定して同定した。メーカーのプロトコールに従い、DNAサンプルから得られた精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx2F(配列番号4)とEx2R(配列番号5)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)を使って、両方向から直接配列決定した。塩基配列をCEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマンコールター社、フラートン)により検出し、CEQ8000のソフトウェアで解析した。G>A変換は別に行った2回目のPCR産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号248、配列番号249、配列番号250、配列番号251のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
このC74Y(284G>A、TGC>TAC、Cys74Tyr)は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン3の196bpの断片を配列決定して同定した。DNAサンプルから得られた精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx3F(配列番号6)とEx3R(配列番号7)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をCEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマンコールター社、フラートン)により検出し、CEQ8000のソフトウェアで解析した。G>A変換は別に行った2回目のPCR産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号212、配列番号213、配列番号214、配列番号215のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することが可能であった。
LDLr遺伝子エキソン3に位置する変異の同定
LDLr遺伝子エキソン3の196bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx3F(配列番号6)とEx3R(配列番号7)を用いて増幅した。
この変異は制限酵素地図を変えないため、我々は正常アリルではBfaI認識部位が導入され、変異アリルでは導入されない、1組の変異導入プライマーをデザインした。
この変異(240C>A、AAC>AAA、Asn59Lys)は酵素HincIIによるエンドヌクレアーゼ切断部位を破壊する。メーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを総量30μL中の15単位HincIIで切断した。得られた断片は、111bpと85bp長(正常アリル)、196bp(変異アリル)であった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
この変異はエンドヌクレアーゼHaeIII切断部位を破壊する。メーカー(Gibco BRL、カールスバド、カルフォルニア、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを15単位のHaeIIIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは76bp、51bp、42bp、25bp長で、変異アリルでは117bp、51bp、27bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
この変異はTrulI制限エンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン3の増幅材料15μLをTrulI15単位とで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは196bp長で、変異アリルでは162bpと34bpであった。これらの断片を3%NuSieveアガロースゲルでの電気泳動により分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
LDLr遺伝子のエキソン4に位置する変異の同定
LDLr遺伝子エキソン4の5’側(エキソン4A)の242bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx4AF(配列番号9)とEx4AR(配列番号10)を用いて増幅した。
この変異はVan91I制限エンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国)のプロトコールに従い、エキソン4の増幅材料15μLを15単位Van91Iで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは242bp、変異アリルでは174bpと52bpであった。これらの断片を2%アガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。
この変異は制限酵素地図を変えないため、我々は変異アリルでは制限酵素MnlI認識部位が導入され、正常アリルでは導入されない、1組の変異導入プライマーをデザインした。
この変異(451del3)は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン4(4A)の242bpの断片をDNA配列決定して同定した。DNAサンプルから得られた精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx4AF(配列番号9)とEx4AR(配列番号10)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をCEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマンコールター社、Fullerton)により検出し、CEQ8000のソフトウェアで解析した。3塩基対の欠損は2回目のPCR産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、マイクロアレイ(「バイオチップ」)を用いて、スライド内の配列番号172、配列番号173、配列番号174、配列番号175のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
LDLr遺伝子のエキソン4Bに位置する変異の同定
LDLr遺伝子エキソン4の3’側(エキソン4B)の237bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx4BF(配列番号12)とEx4BR(配列番号13)を用いて増幅した。
この変異(533A>G、GAT>GGT、Asp195Gly)はHphIエンドヌクレアーゼの新たな切断部位を生じる。メーカー(NEB、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、エキソン4Bの増幅された材料15μLを15単位HphIで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは237bp、変異アリルでは175bpと62bpであった。これらの断片を3%NuSieveアガロースゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
この変異(646T>C、TGT>CGT、Cys195Arg)はBshNI切断部位を生じる。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン4Bの増幅された材料15μLを15単位BshNIで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは切断していない増幅材料に相当する237bpで、変異アリルでは159bpと78bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド中の配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71のオリゴヌクレオチドを用いて解析可能であった。
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。エキソン4Bの増幅されたPCR材料を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲル電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスバンドが現れた。得られた断片は、正常アリルでは237bpであり、変異アリルでは222bpであった。このヘテロデュープレックスのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動する。他の方法として、この変異はマイクロアレイ(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異はエキソン4Bの増幅された材料をMnIIエンドヌクレアーゼ制限部位で分解して解析した。8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲル電気泳動及びエチジウムブロマイドでのゲルの染色により、変異によって作られた12bpの追加によってエキソン4B中のこの変異の存在が判別できる。さらに、メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン4Bの増幅された材料15μLを15単位MnlIで、総量30μL中で加水分解した。得られた断片は、正常アリルでは192bpと45bp、変異アリルでは204bpと45bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異(D200V(662A>T、GAC>GTC、Asp200Val))は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン4(4B)の237bpの断片をDNA配列決定して同定した。DNAサンプルから得た精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx4BF(配列番号12)とEx4BR(配列番号13)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)を使って、メーカーのプロトコールに従い、両方向から直接配列決定した。塩基配列をCEQ8000 Genetic Analysis System(ベックマンコールター社、Fullerton)により検出し、CEQ8000のソフトウェアで解析した。662A>Tは2回目のPCR産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)を用いて、スライド内の配列番号232、配列番号233、配列番号234、配列番号235のオリゴヌクレオチドを使って解析可能であった。
このS205C変異(677C>G、TCT>TGT、Ser205Cys)は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン4(4B)の237bpの断片をDNA配列決定して同定した。DNAサンプルから得た精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx4BF(配列番号12)とEx4BR(配列番号13)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国)を使って、両方向から直接配列決定した。配列決定反応で得られた断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Analysis Systemで解析した。見出されたC>G変換は同じサンプルの2回目のPCR産物を自動配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号228、配列番号229、配列番号230、配列番号231のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子のエキソン6に位置する変異の同定
LDLr遺伝子エキソン6の179bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx6F(配列番号14)とEx6R(配列番号15)を用いて増幅した。
このC255G変異(826T>G、TGC>GGC、Cys255Gly)は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではBstUI認識部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないようなデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、非隣接の塩基を入れて合成した。LDLr遺伝子エキソン6の163bpをポリマラーゼ連鎖反応(PCR)でEx6R(配列番号15)とMutC255GF(配列番号16)のプライマーを用いて増幅した。
このE291X変異(934G>T、GAG>TAG、Asp291Stop)は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではSspI認識部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないようなデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、非隣接の塩基を入れて合成した。
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。エキソン6の増幅産物を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、179bpと171bpの、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスのバンドがエチジウムブロマイドでの染色後ゲル内で簡単に見分けられ、その存在が示された。このヘテロデュープレックスの2つのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動する。
このR279G変異(898A>G、AGA>GGA、Arg279Gly)は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン6の179bpの断片を自動配列決定して同定した。DNAサンプルから得た精製PCR産物を、増幅用プライマーのEx6F(配列番号14)とEx6R(配列番号15)、及びキットCEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingとQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国)を使って、両方向から直接配列決定した。配列決定反応で得られた断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckmane Analysis Systemで解析した。見出されたA>G変換は同じサンプルの2回目のPCR産物を配列決定して確認した。
LDLr遺伝子エキソン7に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン7の234bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx7F(配列番号18)とEx7R(配列番号19)を用いて増幅した。
この変異はApaI切断部位を破壊する。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン7のPCRサンプル15μLを15単位ApaIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは186、26、22bpであったが、変異アリルでは208bpと26bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このC319Y変異(1019G>A、TGC>TAC、Cys319Tyr)は新たなRsaIエンドヌクレアーゼ切断部位を生じる。メーカー(Gibco BRL社、カールスバド、カルフォルニア、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを15単位のRsaIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは234bp(切断していない断片)、変異アリルでは136bpと98bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異はHphI酵素のエンドヌクレアーゼ切断部位を破壊する。メーカー(Gibco BRRL社、カールスバド、カルフォルニア、米国)のプロトコールに従い、エキソン7の増幅された材料15μLを15単位のHphIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは189bpと45bpで、変異アリルでは223bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン8に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン8の220bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx8F(配列番号148)とEx8R(配列番号149)を用いて増幅した。
この変異(1186+5G>A)は、臨床的にFHと診断された対象からLDL−r遺伝子変異をスクリーニングする間に、エキソン8の220bpの断片を自動配列決定して同定した。配列決定反応は、PE Gene Amp System 9700サーモサイクラーで、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをBeckman Quick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用いて行い、プライマーはEx8BF(配列番号148)とEx8BR(配列番号149)を使用した。
LDLr遺伝子エキソン9に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン9の224bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx9F(配列番号20)とEx9R(配列番号21)を用いて増幅した。
この変異はヘテロデュープレックス解析で検出された。PCR産物を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、該当する正常及び変異のホモデュープレックスではなく、ヘテロデュープレックスが現れた。得られた断片は、正常アリルでは224bpで、変異アリルでは215bpであった。ヘテロデュープレックスのバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じるため、ホモデュープレックスより遅く移動した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することができた。
このY379X変異(1200C>A、TAC>TAA、Tyr379Stop)は酵素エンドヌクレアーゼMnlIの切断部位を破壊する。メーカー(Gibco BRL社、カールスバド、カルフォルニア、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLに15単位MnlIを加え、総量30μL中で切断した。得られた断片は、正常アリルでは87、56、34、22、18、4、3bpで、変異アリルでは87、56、38、22、18、3bpであった。これらの断片を16%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動することにより、34bpと38bpのバンドの区別が可能となり、エチジウムブロマイド染色での可視化により両アリルを判別した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)を、スライド上に配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異は制限酵素MboIIの切断部位を破壊する。メーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国)のプロトコールに従い、エキソン9の増幅された材料15μLを15単位のMboIIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは140、46、35、3bpで、変異アリルでは140、48、35bpであった。これらの断片を16%ポリアクリルアミド(PAA)ゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイドで染色して可視化すると、両アリルを判別する46bpと48bpのバンドが区別できた。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このY421X変異(1326C>G、TAC>TAG、Tyr421Stop)はエンドヌクレアーゼBfaIの新たな切断部位を生じる。メーカー(NEB社、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを15単位BfaIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは224bp(非分解断片)、変異アリルでは164bpと60bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載されているデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異はエンドヌクレアーゼMboIIによる切断部位を破壊する。メーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国)のプロトコールに従い、エキソン9のPCRサンプル15μLをMboII15単位で、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは141、45、35、3bpで、変異アリルでは141、45、39bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)を、スライド上に配列番号168、配列番号169、配列番号170、配列番号171のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン10に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン10の278bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx10F(配列番号22)とEx10R(配列番号23)を用いて増幅した。
この変異は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではNaeI制限酵素部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
このT433N変異(1361C>A、ACC>AAC、Tyr433Asn)は、臨床的にFHと診断された対象のLDL−r遺伝子エキソン10の278bp断片の分析において、これを自動配列決定することにより同定された。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをBeckman Quick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用いて行い、プライマーはEx10F(配列番号22)とEx10R(配列番号23)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。C>Aの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号156、配列番号157、配列番号158、配列番号159のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このT446I変異(1400C>T、ACC>ATC、Tyr446Ile)は、臨床的にFHと診断された対象のLDL−r遺伝子エキソン10の278bp断片を自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーはEx10F(配列番号22)とEx10R(配列番号23)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。C>Tの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を用いて配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号204、配列番号205、配列番号206、配列番号207のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この1423delGC/insA変異はエンドヌクレアーゼMvaIの切断部位を破壊する。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、エキソン10のPCRサンプル15μLを15単位MvaIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは150bpと128bpで、変異アリルでは128、87、63bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、エチジウムブロマイド染色で可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号164、配列番号165、配列番号166、配列番号167のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン11に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン11の194bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx11F(配列番号25)とEx11R(配列番号26)を用いて増幅した。
このW515X変異(1607G>A、TGG>TAG、Trp515Stop)は新たなBfaI切断部位を生じる。メーカー(NEB社、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLをBfaI15単位で、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは164bpと30bpで、変異アリルでは97、67、30bpであった。これらの断片を3%NuSieveアガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号120、配列番号121、配列番号122、配列番号123のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異[1587−5del5;1587del31]は、臨床的にFHと診断された対象のLDL−r遺伝子エキソン11の194bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーは(配列番号25)とEx11R(配列番号26)を使用した。
この変異(1609G>T、GGA>TGA、Gly516Stop)は新たなHphI切断部位を生じる。メーカー(NEB社、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、エキソン11の増幅材料15LをHphI15単位で、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは139、43、12bpで、変異アリルでは81、58、43、12bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号176、配列番号177、配列番号178、配列番号179のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異(1749C>A、CAC>CAA、His562Gln)は、臨床的にFHと診断された患者のLDL−r遺伝子エキソン11の194bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーは(配列番号25)とEx11R(配列番号26)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。見出されたC>Aの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号208、配列番号209、配列番号210、配列番号211のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン12に位置する変異の同定
エキソン12の236bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx12F(配列番号150)とEx12R(配列番号151)を用いて増幅した。
このE579D変異(1800G>C、GAG>GAC、Glu579Asp)は、臨床的にFHと診断された患者のLDL−r遺伝子エキソン12の236bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーはEx12F(配列番号150)とEx12R(配列番号151)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。見出されたG>Cの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を用いて自動配列決定により確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号224、配列番号225、配列番号226、配列番号227のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異はヘテロデュープレックス解析で同定することができた。エキソン12のPCR増幅材料を8%ポリアクリルアミド(PAA)ゲル電気泳動すると、変異がある場合は、236bpと225bpの2本のホモデュープレックスバンドより見かけ上大きな分子量を示すヘテロデュープレックスのバンドの存在が示され、それらはエチジウムブロマイドで染色してゲル中で容易に見分けられた。形成するヘテロデュープレックスの2本のバンドは、ミスマッチの配列の間に間隙が生じる結果、ホモデュープレックスより遅く移動する。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号184、配列番号185、配列番号186、配列番号187のオリゴヌクレオチドをスポットして解析することができた。
LDLr遺伝子エキソン13に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン13の215bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx13F(配列番号27)とEx13R(配列番号28)を用いて増幅した。
このD630N変異(1951G>A、GAT>AAT、Asp630Asn)はMnlI切断部位を破壊する。メーカー(Fermentas社、ハノーバー、メリーランド、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを15単位MnlIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは89、48、39、14+14、12、11bpであったが、変異アリルでは89、59、39、14+14、12bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)を用いて、スライド上に配列番号124、配列番号125、配列番号126、配列番号127のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このH635N変異(1966C>A、CAC>AAC、His635Asn)は制限地図を変えないため、正常アリルの存在下ではCaiI制限部位が導入され、変異アリルの存在下では現れないような、ミスマッチ2つを含むデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
LDLr遺伝子エキソン14に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン14の288bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、デオキシオリゴヌクレオチドEx14F(配列番号30)とEx14R(配列番号31)を用いて増幅した。
このD686Y変異(2119G>T、GAC>TAC、Asp686Tyr)は、臨床的にFHと診断された対象者のLDL−r遺伝子エキソン14の288bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーはEx14F(配列番号30)とEx14R(配列番号31)を使用した。
LDLr遺伝子エキソン15に位置する変異の同定
LDLr遺伝子のエキソン15の243bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、デオキシオリゴヌクレオチドEx15F(配列番号32)とEx15R(配列番号33)を用いて増幅した。
この変異は新たなAluI制限酵素切断部位を生じる。メーカー(Gibco BRL社製、カールスバド、カルフォルニア、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLをAluI15単位で、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは166bpと78bpで、変異アリルでは166、67、11bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号132、配列番号133、配列番号134、配列番号135のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このT740M変異(2282C>T、ACG>ATG、Tyr740Met)は新たなNlaIII分解部位を生じる。メーカー(NEB社、べバリー、マサチューセッツ、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLをNlaIII15単位で、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは247bpで、変異アリルでは274、194、53bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号192、配列番号193、配列番号194、配列番号195のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
LDLr遺伝子エキソン16に位置する変異の同定
エキソン16の273bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx16F(配列番号152)とEx16R(配列番号153)を用いて増幅した。
このV766E変異(2360T>A、GTG>GAG、Val766Glu)は、臨床的にFHと診断された患者のLDL−r遺伝子エキソン16の273bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをBeckman Quick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、USA)と共に用い、プライマーはEx16F(配列番号152)とEx16R(配列番号153)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。見出されたT>Aの変換を、2回目のPCR産物を配列決定して確認した。他の方法としては、この変異は、記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号236、配列番号237、配列番号238、配列番号239のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
このI771T変異(2375T>C、ATT>CACT、Ile771Thr)は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではHincII制限部位が導入され、正常アリルの存在下では現れないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
この2389+3C>T変異、臨床的にFHと診断された患者のLDL−r遺伝子エキソン16の273bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国)と共に用い、プライマーはEx16F(配列番号152)とEx16R(配列番号153)を使用した。配列決定反応で生成された断片を自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで解析した。見出されたC>Tの変換を、同じサンプルの2回目のPCR産物を自動配列決定で確認した。
この変異(2389+4A>G)は制限地図を変えないため、変異アリルの存在下ではBshNI制限部位が導入され、正常アリルの存在下では導入されないような、ミスマッチのデオキシオリゴヌクレオチドをデザインし、合成した。
LDLr遺伝子エキソン17に位置する変異の同定
エキソン17の242bp断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、プライマーEx17F(配列番号34)とEx17R(配列番号35)を用いて増幅した。
この変異は、2399位置で配列TCTTCを削除し配列GGGTを導入して、新たなAvaI分解部位を生じる。メーカー(アマシャムファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ニュージャージー、米国)のプロトコールに従い、PCRサンプル15μLを15単位のAvaIで、総量30μL中で分解した。得られた断片は、正常アリルでは230bpと12bpで、変異アリルでは183、46、12bpであった。これらの断片を8%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して可視化した。他の方法として、この変異は記載のデバイス(「バイオチップ」)で、スライド上に配列番号136、配列番号137、配列番号138、配列番号139のオリゴヌクレオチドをスポットして解析可能であった。
この変異は、臨床的にFHと診断された対象のLDL−r遺伝子エキソン17の242bp断片の解析において、これを自動配列決定して同定した。配列決定反応はサーモサイクラーPE Gene Amp System9700で行い、CEQ2000Dye Terminator Cycle SequencingキットをQuick Start(ベックマンコールター社、パロアルト、カルフォルニア、米国)と共に用い、プライマーはEx17F(配列番号34)とEx17R(配列番号35)を使用して、その後に自動シーケンサーCEQ2000XL DNA Beckman Analysis Systemで電気泳動した。この欠失を、同じサンプルの2回目のPCR産物を自動配列決定して確認した。
Claims (16)
- 請求項1の遺伝子配列に含まれる突然変異のいずれかにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドプローブ。
- 配列番号8、配列番号11、配列番号16、配列番号17、配列番号24、配列番号29の少なくとも1つ、又は配列番号37から配列番号147まで若しくは配列番号154から配列番号259までからの少なくとも1つから選択される、請求項5に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
- 家族性高コレステロール血症の診断のための、LDL−r遺伝子突然変異のin vitro検出の体外法における請求項5に記載のオリゴヌクレオチドプローブの使用。
- 家族性高コレステロール血症の診断のための、LDL−r遺伝子突然変異のin vitro検出の体外法における請求項6に記載のプローブの使用。
- 請求項5に記載のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用のアッセイキット。
- 請求項6に記載のオリゴヌクレオチドプローブのいずれかが結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用のアッセイキット。
- 家族性高コレステロール血症の診断のためのLDL−r遺伝子突然変異のin vitro検出の体外法における、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号153から選択されるオリゴヌクレオチドプローブのいずれかの使用。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号9、配列番号10、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号148、配列番号149、配列番号150、配列番号151、配列番号152、配列番号153から選択されるオリゴヌクレオチドプローブのいずれかがさらに結合している支持体を備える、家族性高コレステロール血症の診断における適用の、請求項9又は10のいずれかに記載のアッセイキット。
- 個体の生体試料において請求項1に記載の配列番号1の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のin vitro診断の体外法。
- 個体の生体試料において請求項2に記載の配列番号1の突然変異のいくつかと組み合わせて、請求項1に記載の前記配列番号1の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のin vitro診断の体外法。
- 個体の生体試料において請求項3に記載の配列番号1の多型のいくつかと組み合わせて、請求項1に記載の前記配列番号1の突然変異のいくつかが検出されることを特徴とする、家族性高コレステロール血症のin vitro診断の体外法。
- 請求項1に記載の突然変異を単独で又は請求項2に記載の突然変異及び/若しくは請求項3に記載の多型と組み合わせて含むDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法により増幅させること、そのために配列番号2から配列番号259までから選択されるオリゴヌクレオチドのいずれか又はその組合せを利用すること、前記PCRの産物を単連鎖高次構造多型法(SSCP)による分析にかけること、制限分析又は請求項9、10、若しくは12に記載のアッセイキットによりその後同定されるであろう突然変異を検出するために、SSCPにより異常パターンを有する前記断片を配列決定することを含む、請求項13から15までに記載の診断法。
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