ES2493865T3 - Método y dispositivo para la detección de mutaciones en secuencias génicas aisladas del receptor de lipoproteínas de baja densidad (R LDL) asociado con la hipercolesterolemia familiar - Google Patents
Método y dispositivo para la detección de mutaciones en secuencias génicas aisladas del receptor de lipoproteínas de baja densidad (R LDL) asociado con la hipercolesterolemia familiar Download PDFInfo
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Abstract
La invención describe métodos extracorpóreos para analizar la presencia o ausencia de mutaciones causantes de hipercolesterolemia familiar. Los métodos indican la forma de detectar estas mutaciones a partir de una muestra de ADN de un individuo y utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con cebadores complementarios al gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad, el análisis del producto amplificado por secuenciación, análisis de restricción, técnicas de los polimorfismos de conformación de cadena sencilla, análisis de heterodúplex y de un dispositivo sobre un soporte de vidrio "biochip" en el que se depositan sondas de oligonucleótidos que permite detectar estas mutaciones en el ADN.
Description
Método y dispositivo para la detección de mutaciones en secuencias génicas aisladas del receptor de lipoproteínas de baja densidad (R-LDL) asociado con la hipercolesterolemia familiar.
Sector de la invención
La presente invención se refiere a un método “in vitro” para detectar individuos que están predispuestos a la enfermedad llamada hipercolesterolemia familiar y, más particularmente, a un método para detectar la presencia o ausencia de la mutación [313+1 inst en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1] asociada con hipercolesterolemia familiar.
Antecedentes de la invención
La aterosclerosis se define, según la Organización Mundial de la Salud (OMS), como una combinación variable de cambios que se produce en la íntima de las arterias que implica la acumulación focal de lípidos y compuestos complejos con sangre y sus constituyentes, que se acompaña con la formación de tejido fibroso, calcificación y cambios asociados en la media.
La aterosclerosis puede considerarse como una forma especial de arteriosclerosis con un depósito patógeno significativo de lípidos en la pared arterial. La mayoría de formas de la arteriosclerosis implican la degeneración grasa de la pared vascular, los términos “arteriosclerosis” y “aterosclerosis” pueden utilizarse de forma indistinta (Assmann G. en “Lipid Metabolism and Atherosclerosis” Schattauer Verlag GMbH, Stuttgart 1982:1).
Los lípidos son casi completamente insolubles en soluciones acuosas. Las lipoproteínas representan la unidad funcional del transporte de lípidos insolubles en agua en la sangre. Las lipoproteínas se dividen en diversas categorías según su densidad, tal como se determina por ultracentrifugación. (Havel RJ y otros J Clin Invest 1955,
34: 1345). Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (d=1,019-1,063 g/ml) transportan la mayor parte del colesterol en la sangre. Éstas están compuestas por aproximadamente el 75% de lípidos (principalmente colesterol, ésteres de colesterol y fosfolípidos) y el 25% de proteínas. Aproximadamente el 70% del colesterol total de la sangre es transportado por las partículas LDL.
La hipercolesterolemia (es decir, la elevación del colesterol de lipoproteínas de baja densidad en plasma (c-LDL) es uno de los factores de riesgo más críticos para el inicio y progresión de la arteriosclerosis. Más de la mitad de todas las muertes en la sociedad occidental están relacionadas con enfermedades cardiovasculares ateroscleróticas (Murray CJL y López AD. Lancet 1997; 349: 1269-1276).
Las hipercolesterolemia familiar (HF: MIM#143890) es una enfermedad hereditaria autosómica codominante del metabolismo de lipoproteínas causada por mutaciones que se producen en el gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (r-LDL), una proteína de la superficie celular que media en la captación y degradación específica de las LDL plasmáticas (Goldstein JL, Brown MS Ann Rev Cell Biol 1985; 1: 1 -39). La penetrancia de la HF es cercana al 100% lo que significa que la mitad de la descendencia de un progenitor afectado tendrá un nivel de colesterol plasmático muy elevado desde el momento de nacer, afectando por igual a hombres y mujeres (Goldstein JL, Brown MS. The metabolic basis of inherited disease. Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D. McGraw Hill Nueva York 6ª edición, 1989; 1215-1250). Los individuos afectados por HF presentan arco lipoideo corneal, xantomas tendinosos y cardiopatía coronaria sintomática prematura (Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115). La HF es uno de los trastornos hereditarios más frecuentes con frecuencias estimadas de heterocigotos y homocigotos de 1/500 y 1/1.000.000, respectivamente.
En algunas poblaciones predominan un pequeño número de mutaciones debido a efectos fundadores y, por lo tanto, la frecuencia de heterocigóticos para HF es mayor, estas poblaciones incluyen los canadienses de habla francesa (Leitersdorf E y otros J Clin Invest 1990; 85:1014-1023), cristianos libaneses (Lehrman MA y otros J Biol Chem 1987; 262:401-410), drusos (Landsberger D y otros Am J Hum Genet 1992; 50: 427-433) finlandeses (Koivisto UM y otros J Clin Invest 1992; 90: 219-228), los “Afrikaners” de Sudáfrica (Kotze MJ y otros Ann Hum Genet 1991; 55: 115-121) y los judíos Ashkenazi de descendencia lituana (Meiner V y otros Am J Hum Genet 1991; 49:443-449).
Los pacientes heterocigóticos para HF presentan un incremento de dos veces del colesterol en plasma, (por regla general superior al valor del percentil 95 para la población). La mortalidad de los pacientes con HF, ajustada por edad y sexo, es entre cuatro y cinco veces más alta que en la población general (Scientific Steering Committee on behalf of the Simon Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115). Los pacientes que heredan dos mutaciones en el locus del gen del r-LDL se denominan “homocigóticos para HF” o “heterocigóticos compuestos para HF”. Poco o ningún r-LDL funcional se sintetiza en dichos individuos. Estas anomalías conducen a una elevación de los niveles de c-LDL en plasma de entre seis y ocho veces ya en la gestación intrauterina, como consecuencia, la cardiopatía coronaria habitualmente aparece antes de los 20 años (Goldstein JL y otros N Engl J Med 1983; 309: 288-296). Si los individuos con HF heterocigótica u homocigótica pudieran ser diagnosticados antes
de desarrollar la enfermedad sintomática, podrían ser tratados de forma preventiva para reducir su riesgo de infarto de miocardio.
El r-LDL es una glucoproteína ubicua transmembrana de 839 aminoácidos que media en el transporte de LDL al interior de las células por endocitosis (Goldstein J. y Brown M. J Biol Chem 1974; 249:5153-5162) (figura 1).
El gen del r-LDL se encuentra situado en el brazo corto del cromosoma 19pl3.1-13.3 (Yamamoto T y otros Cell 1984;
39: 27-38), tiene un tamaño de 45.000 pares de bases (pb). Éste contiene 18 exones y 17 intrones los cuales codifican los seis dominios funcionales de la proteína madura: el péptido señal, el dominio de unión del ligando, el dominio homólogo al factor de crecimiento epidérmico (EGF), azúcar con enlaces O-glucosídicos, el dominio transmembrana y el citoplásmico (Sundhof T y otros Science 1985; 228: 893-895) (figura 2).
La producción de r-LDL se encuentra regulada estrechamente por un sofisticado mecanismo de retroalimentación que controla la transcripción del gen del r-LDL en respuesta a variaciones de la concentración intracelular de esteroles y la demanda celular de colesterol (Sudhof TC y otros J Biol Chem 1987; 262: 10773-10779). Los motivos de ADN necesarios para la regulación de la transcripción del gen del r-LDL están situadas en una región de 177 pb del promotor proximal (Sudhof TC y otros J Biol Chem 1987; 262: 10773-10779). Esta región contiene todos los elementos en cis para la expresión basal y la regulación de esteroles e incluye tres repeticiones directas imperfectas de 16 pb cada una, las repeticiones 1 a 3. La repetición 1 y la 3 contienen sitios de unión para el factor de transcripción Sp1 y contribuyen a la expresión basal del gen, pero requieren la contribución de la repetición 2 para una expresión fuerte (Dawson PA y otros J Biol Chem 1988; 263; 3372-3379). La repetición 2 contiene un elemento regulador de 10 pb, SRE-1 (Smith JR y otros J Biol Chem 1990; 265: 2306-2310) que potencia la transcripción cuando la concentración de esteroles intracelulares es baja mediante interacción con un factor de transcripción denominado SREBP-1. Hasta la fecha, se han cartografiado varias mutaciones de origen natural en los elementos reguladores de la transcripción del gen del r-LDL (Hobbs HH, y otros Hum Mutat 1992; 1: 445-466; Koivisto UM, y otros Proc Natl Acad Sci Estados Unidos, 1994; 91: 10526-10530), Mozas P, y otros J Lipid Res 2002; 43: 13-18, http.//www.ucl.ac.uk/fh; http.//www.umd.necker.fr).
El exón 1 codifica el péptido señal; una secuencia hidrófoba de 21 aminoácidos. Este péptido es escindido de la proteína durante la translocación que tiene lugar en el retículo endoplasmático. Se han descrito varias mutaciones por cambio de marco, sin sentido y antisentido en este exón (http.//www.ucl.ac.uk/fh; http.//www.umd.necker.fr).
Los exones 2 a 6 codifican el dominio de unión al ligando, el cual consta de siete repeticiones en tándem de 40 aminoácidos cada una. La estructura del dominio de unión al ligando ha sido esclarecida de forma parcial (Jeon H y otros Nature Struc Biol 2001; 8: 499-5049). En cada repetición hay una agrupación de aminoácidos cargados negativamente Asp-X-Ser-Asp-Glu y seis residuos de cisterna que forman tres puentes disulfuro.
El segundo dominio del r-LDL humano comprende una secuencia de 400 aminoácidos codificada por los exones 7 al
14. Esta secuencia muestra un 33% de homología con el precursor del factor del crecimiento epidérmico (EGFP). Al igual que el dominio de unión al ligando, esta región, contiene también tres repeticiones de 40 aminoácidos con secuencias ricas en cisteína. Las dos primeras repeticiones, denominadas A y B. son contiguas y están separadas de la tercera repetición, C, por una secuencia de 280 aminoácidos que contiene cinco copias de la secuencia conservada YWTD (Tyr-Trp-Thr-Asp). El dominio análogo al EGFP es fundamental para la disociación dependiente de ácido de las partículas de LDL del r-LDL y de las vesículas recubiertas por clatrina que tiene lugar en el endosoma durante el reciclaje del receptor. De todas las mutaciones descritas hasta la fecha, aproximadamente el 55% están ubicadas en la región de homología con EGFP del r-LDL y el 35% entre las repeticiones YWTD (http.//www.ucl.ac.uk/fh).
El tercer dominio del r-LDL, es una región rica en residuos de treonina y serina, que está codificada por el exón 15. La función de este dominio se desconoce, pero se ha observado que esta región sirve como sitios de unión para las cadenas de carbohidratos con enlaces O-glucosídicos. Esta región muestra conservación de secuencias mínima en seis especies analizadas (Goldstein y otros En The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Sciver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D. 7ª Edición. McGraw Hill, 1995: 1981-2030). Se cree que este dominio desempeña un papel en la estabilización del receptor.
El dominio transmembrana que contiene 22 aminoácidos hidrofóbicos está codificado por el exón 16 y el extremo 5' del exón 17. Este dominio es esencial para el anclaje del r-LDL a la membrana celular.
El dominio citoplásmico del r-LDL, que comprende de 50 residuos de aminoácidos, es codificado por la región 3' restante del exón 17 y el extremo 5' del exón 18. Este dominio contiene dos secuencias señal para dirigir al r-LDL a la superficie y para situar al receptor en las vesículas revestidas (Yokode M, y otros J Cell Biol 1992; 117: 39-46). Este dominio es la región más conservada del r-LDL, que es más del 86% idéntica entre seis especies (Goldstein y otros En The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Sciver CR, Beaudet AL, Sly WS, Valle D. 7ª Edición. McGraw Hill, 1995: 1981-2030).
Las mutaciones del r-LDL de origen natural se han clasificado en 5 clases, incluyendo alelos nulos, alelos defectuosos en el transporte, alelos defectuosos en la unión, alelos defectuosos en la internalización y alelos defectuosos en el reciclaje. (Hobbs HH, y otros, Hum Mutat 1992; 1: 445-466). En muchos casos, cada categoría está asociada con mutaciones en regiones del gen que codifican un dominio particular de la proteína.
Se ha sugerido que la heterogeneidad observada en los pacientes con HF en cuanto a los niveles plasmáticos de c-LDL y cardiopatía coronaria se debe a diferencias en cuanto a la naturaleza de la mutación en el gen del r-LDL y se han publicado varios estudios que apoyan esto (Koivisto PVI y otros, Sun XM y otros Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13: 1680-1688, Kotze y otros Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13: 1460-1468; Gudnason V y otros Arterioscler Thromb Vas Biol 1997; 17: 3092-3101). Por otra parte, en heterocigotos para HF, la respuesta de reducción de c-LDL a inhibidores de la hidroxi-metilglutaril coenzima A (HMGCoA) reductasa puede depender de la naturaleza de la mutación del gen del r-LDL (Leisterdorf E y otros Circulation 1993; 87: 35-44; Jeenah M y otros Atherosclerosis 1993; 98: 51-58, Sijbrands EJG y otros Atherosclerosis 1998; 136: 247-254).
El principal ligando del receptor es LDL, que contiene una sola copia de apolipoproteína B-100 (Goldstein J y Brown M J Biol Chem 1974; 249: 5153-5162). Esta apolipoproteína tiene cortos segmentos que son ricos en aminoácidos básicos y que se unen al agrupamiento cargado negativamente receptor (Boren J y otros J Clin Inves 1998; 101: 1084-1093). Varias mutaciones ubicadas en el gen de la apolipoproteína B alteran la actividad funcional de la proteína y disminuyen su unión al receptor de LDL, retardando el aclaramiento de partículas LDL, y conduciendo a la acumulación de colesterol LDL en la circulación. Hasta la fecha se han identificado cuatro mutaciones que causan BDF, todas ellas ubicadas en el dominio de unión de a r-LDL de la proteína apo-B100; (residuos 3130-3630: R3480W, R3500Q, R3500W y R3531C (Soria L y otros Proc Natl Acad Sci Estados Unidos 1989; 86: 587-591; Pullinger CR. y otros J Clin Invest 1995; 95: 1225-1234; Gaffney D, y otros Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15: 1025-1029; Boren J, y otros J Biol Chem 2001; 276; 9214-9218). La mutación CGG a CAG en el codón para el aminoácido, que da como resultado una sustitución de una arginina por glutamina (R3500Q), es la alteración más frecuente que causa apolipoproteína B defectuosa familiar (BDF). Los pacientes heterocigóticos para la mutación apo B-3500 son por regla general hipercolesterolémicos, aunque sus concentraciones de colesterol sérico pueden variar desde las observadas en pacientes con HF hasta solamente elevaciones modestas. (Tybjaerg-Hansen A, y otros Atherosclerosis 1990; 80: 235-242; Hansen PS, y otros Arterioscl Tliro Vasc Biol 1997; 17: 741-747). Dado que los diagnósticos clínicos y bioquímicos a menudo son imprecisos, solamente el diagnóstico molecular que analiza genes del receptor de LDL y la apo B podía distinguir entre BDF y HF.
El diagnóstico clínico de la HF se basa en descubrimientos de laboratorio, signos clínicos (xantomas) y antecedentes del paciente. Ponderando la aparición de signos clínicos, puede construirse una tabla de puntuación de diagnóstico para HF y este método de diagnóstico clínico ha sido recomendado por la OMS (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998).
Algunos pacientes con hipercolesterolemia pueden no haber sido diagnosticados mediante criterios clínicos como HF, porque los antecedentes familiares son confusos o imprecisos. Otros pacientes pueden no haber sido diagnosticados con HF debido a que sólo presentan una elevación moderada de la concentración de colesterol plasmático y no presentan signos de depósito de colesterol en tejidos, tales como xantomas, arco lipoideo corneal o xantelasmas. Se ha demostrado que el mejor “punto de corte” para diagnosticar la HF en familiares mediante la concentración de colesterol plasmático total es el percentil 90 específico de la edad y específico del sexo (Umans-Eckenhausen MAW y otros Lancet 2001; 357: 165-168. Sin embargo, el 18% de los pacientes de HF presentan una concentración de colesterol plasmático total por debajo de este percentil y, por otra parte, la proporción de falsos positivos fue también del 18% cuando se usaba el percentil 90 como punto de corte. Por lo tanto, este porcentaje de pacientes podría haberse perdido si se hubiera utilizado solo la concentración de colesterol como criterio de diagnóstico.
Se descubrió que más del 50% de los pacientes con HF no estaban recibiendo terapia hipolipemiante ni asesoramiento dietético como consecuencia de no estar al tanto de su afección (Williams RR y otros Am J Cardiol 1993; 72: 18D-24D).
El esclarecimiento de las bases moleculares de la HF ha hecho factible el diagnóstico a nivel del ADN en la gran mayoría de casos. La demostración de un defecto subyacente en el gen del r-LDL constituye, de hecho, una confirmación definitiva del diagnóstico (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Aunque el diagnóstico preciso de la HF es posible por medio de métodos moleculares, sin embargo, en la actualidad su utilización en poblaciones heterogéneas se encuentra limitada debido a la heterogeneidad de las mutaciones del gen del r-LDL.
En la solicitud PCT WO-88/03175 (Biotechnology Research Partners, Ltd.) se reivindica un método para el diagnóstico de la aterosclerosis, que se basa en la detección de la presencia o ausencia de diversos polimorfismos en la región génica de la apolipoproteína AI-CIII-AIV, o en los genes apoB, apoCI, apoAII, así como en el gen del receptor de LDL. Específicamente para este gen, se presenta la utilización de los polimorfismos Cfr131 y BstEII.
Otro documento de interés es la patente japonesa JP-10099099 que se refiere a la utilización de una mutación en el triplete codificante del aminoácido 109, en concreto la inserción de una C, para el diagnóstico de anomalías en el gen del receptor de LDL, aunque no se menciona específicamente la hipercolesterolemia familiar.
5 Finalmente, las patentes de Estados Unidos US-4.745.060 y US-4.966.837, ambas de la Universidad de Texas, presentan métodos para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar basándose en mutaciones en el gen del receptor de LDL. Sin embargo, lo que se reivindica en la primera de ellas son secuencias correspondientes al gen “normal”, presentando un ejemplo particular de una mutación que se define por el cambio del mapa de restricción con Xba I. En la segunda patente, por su parte, se reivindica la utilización de diversas enzimas de restricción (Eco
10 RI, Asp 718, Taq I, Bam HI, Xba I, Inf. I, Bgl II, CIa I, Eco RV, Kpn I, Pvu II, Sph I, Sst I, Sst II, Stu I, Xho I, Nde I y Nsi I) en un método para determinar mutaciones en el gen del r-LDL, que se basa en observar la alteración del modelo de restricción con estas enzimas frente al modelo correspondiente al gen normal.
El documento de patente más próximo a la presente invención es WO02/06467, en el que se describe un método
15 para la detección de errores en el metabolismo lipídico basado en una serie de mutaciones y polimorfismos del gen del r-LDL. Sin embargo, ninguna de las mutaciones ni polimorfismos descritos en dicha patente coincide con los reivindicados en la presente solicitud.
Descripción detallada
20 La nomenclatura de las mutaciones y los polimorfismos se define en
- -
- Antoranakis S. E and the Nomenclature Working Group, Recommendations for Nomenclature Systems for Human Gene Mutations. Human Mutation 11: 1-3; 1998.
25 -Dunnen JT, Antoranakis S.E. Mutation Nomenclature Extrensions and Suggestions to describe Complex Mutations: A Discussion. Human Mutation 15: 7-12, 2000.
Asimismo el concepto del polimorfismos se define en
30 -Harris H. The Principles of Human Biochemical Genetics, 3ª Edición. Ámsterdam. Holanda Septentrional 1980.
- -
- Beauder AL, Scriver CL, Sly WS, Valle D. Genetics, Biochemistry and Molecular Basis of Variant Human Phenotypes, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease. Beaudet AL, Scriver CR, Sly WS, Valle D 7*
35 Edition. pg. 53 MacGraw Hill. Nueva York 1995.
Se han detectado, aislado y caracterizado toda una serie de mutaciones nuevas que se detallan a continuación. Análogamente, toda una serie de mutaciones y polimorfismos ya descritos, se han combinado con ellas para analizar la probabilidad de que un individuo desarrolle hipercolesterolemia familiar. Todas las mutaciones y
40 polimorfismos descritos en el presente documento que se relacionan con el desarrollo de la hipercolesterolemia familiar, se producen en la secuencia génica SEQ ID NO: 1 correspondiente al gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad (r-LDL). Es decir, todas las mutaciones se producen en el mismo gen, se utilizan en el mismo dispositivo de ensayo, de forma extracorporal e in vitro, la probabilidad de desarrollar la misma enfermedad, lo que apoya el carácter unitario de la presente invención.
45 En la tabla I se detallan todas las mutaciones nuevas detectadas, según la nomenclatura científicamente aprobada y detallada en las publicaciones mencionadas anteriormente. Asimismo, se les otorga un código alfanumérico.
En la tabla II se detallan mutaciones ya descritas y conocidas, cuya utilización en combinación con las mutaciones
50 de la tabla I, en dispositivos de ensayo in vitro para diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar se describe en el presente documento. Asimismo, de forma análoga a lo mencionado para las mutaciones conocidas, en la tabla III se detallan polimorfismos.
Las mutaciones de aminoácidos se representan en códigos de una letra que tienen su equivalencia según la tabla 55 IV.
El ensayo de diagnóstico o matriz de ADN “biochip” es un portaobjetos que presenta en su superficie una gran cantidad de sondas. La secuencia de cada sonda de oligonucleótidos sintética se muestra en la lista de secuencia. Las sondas son capaces de hibridar con las secuencias mutantes incluidas en las tablas I a III. La metodología
5 implicada en la detección de cada mutación es:
Impresión de los portaobjetos de vidrio
• Un dispositivo de micromatriz “microarrayer”, dosificador puntual (“spotter”) o impresor de oligonucleótidos dosifica
10 puntualmente las sondas diseñadas en un portaobjetos de vidrio aminosilanizado utilizando DMSO como tampón de impresión.
• Durante el proceso de impresión se controlan la temperatura y la humedad de la dosificación puntual.
Proceso posterior a la dosificación puntual
• Los portaobjetos se procesan, posteriormente a la dosificación puntual mediante reticulación por UV.
Preparación del ADN diana
20 • Se extrae el ADN genómico de cada paciente a partir de una muestra de sangre de 300 µl utilizando un método de filtración.
• Se realiza una reacción de PCR múltiple que permite la amplificación del promotor y 18 exones del gen del receptor de LDL.
- •
- Se incorpora un nucleótido biotinilado durante el proceso de PCR. Como método de marcado indirecto, se requiere 25 una etapa final de tinción con un complejo fluoróforo-estreptavidina después de la hibridación.
- •
- Los productos de PCR se someten a electroforesis y se visualizan en gel de agarosa.
- •
- El ADN diana se fragmenta.
- •
- Se añade el tampón de hibridación a los productos de PCR fragmentados.
- •
- La etapa de desnaturalización tiene lugar durante 15 minutos a 95°C. 30
Hibridación
• La hibridación se lleva a cabo en una estación de hibridación automática.
• Se prehibrida el portaobjetos. 35 • La solución de hibridación se aplica sobre el portaobjetos de vidrio.
- •
- Una hora es el tiempo de hibridación.
- •
- El portaobjetos de vidrio se lava tres veces y se seca.
Escaneado de micromatrices
• Se capturan imágenes de las micromatrices utilizando un escáner fluorescente confocal, equipado con un láser
Cuantificación de la micromatriz
45 • Se obtiene la señal de hibridación de cada sonda de oligonucleótidos utilizando software del escáner.
• La señal de hibridación de los oligonucleótidos utilizados para el genotipado de cada mutación, permite determinar si la muestra de ADN porta la mutación.
50 Se han diseñado dos pares de oligonucleótidos para cada mutación. Cada par de sondas consta de una sonda específica para el alelo de tipo salvaje y una segunda sonda específica para el alelo mutante. La base diana se define como el nucleótido en el que se encuentra la variación de frecuencia. El nucleótido diana está siempre ubicado en la posición central de los oligonucleótidos para maximizar la especificidad de hibridación.
55 Un sujeto de tipo salvaje (figura 3A), no presenta alelo mutante. Por lo tanto, la señal de hibridación de las sondas específicas para el alelo mutante es nula o inferior a la señal de hibridación de las sondas específicas para el alelo normal.
Un paciente mutante heterocigótico presenta el alelo de tipo salvaje y el alelo mutante. A continuación, la señal de
60 hibridación de las sondas específicas para el alelo mutante, es equivalente a la señal de hibridación de las sondas específicas para el alelo normal.
La hibridación de fragmentos de PCR marcados, que han sido amplificados a partir del ADN de los sujetos a analizar, demuestra que la imagen de la matriz de ADN en la figura 3A corresponde a un sujeto de tipo salvaje para 65 la mutación E256K del gen del receptor de LDL. Sin embargo, la imagen de la matriz de ADN en la figura 3B es de
un paciente mutante heterocigótico para esta mutación. Por consiguiente, al paciente mutante heterocigótico se le proporciona un diagnóstico genético definitivo de hipercolesterolemia familiar.
EJEMPLO 1: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 1 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 215 pb del exón 1 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los cebadores Ex1F (SEQ ID NO: 2) y Ex1R (SEQ ID NO: 3).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59°C durante 1 minuto y elongaci ón a 74°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de la mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo, micromatriz, descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación (-23)A>C
Esta mutación crea un nuevo sitio digestión AvaII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de AvaII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 148 y 67 pb para alelos normales y de 93, 67 y 55 para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 39.
La mutación (-23)A>C se detectó en una mujer de 60 años que presentaba arco corneal y xantelasmas, habiendo sido diagnosticada de hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico de 8 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). En su familia no se detectó evidencia de evento cardiovascular prematuro. Los análisis de su suero en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fueron: CT (352 mg/dl) y c-LDL (271 mg/dl), con niveles normales de TG y c-HDL. El tratamiento con simvastatina (20 mg/día) disminuyó sus niveles de CT y c-LDL a 251 y 171 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación L(-6)P
Esta mutación (47T>C, CTC>CCC, Leu(-6)Pro) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 215 pb del exón 1 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex1F (SEQ ID NO: 2) y Ex1R (SEQ ID NO: 3) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 47T>C observado se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: ID NO: 240, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242 y SEQ ID NO: 243.
La mutación L(-6)P se detectó en una mujer de 47 años con arco lipoideo corneal, a la que se le había diagnosticado previamente clínicamente hipercolesterolemia familiar con una puntuación de 9 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Se detectó enfermedad cardiovascular prematura en dos tíos a los 24 y 33 años respectivamente. Su padre tenía hipercolesterolemia con colesterol plasmático por encima del valor del 95º percentil para la población española. Los análisis de los lípidos séricos en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fueron: CT 420 mg/dl, c-LDL 320 mg/dl, TG 155 mg/dl y c-HDL 49 mg/dl. El tratamiento con atorvastatina (15 mg/día) redujo sus niveles de CT y c-LDL a 289 y 233 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación G(-2)R
Esta mutación ((58G>A, GGG>AGG, Gly(-2)Arg) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 215 pb del exón 1 durante cribado para mutaciones en el gen r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex1F (SEQ ID NO: 2) y Ex1R (SEQ ID NO: 3) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing
con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 58G>A observado se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, SEQ ID NO: 222 y SEQ ID NO: 223.
La mutación G(-2)R se identificó en una mujer de 34 años con arco corneal e hipercolesterolemia. Su puntuación para el diagnóstico clínico de HF era de 10 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Los niveles de lípidos en plasma antes del tratamiento fueron: CT 354 mg/dl, c-LDl de 264 mg/dl, con TG normal y c-HDL de 64 mg/dl. Su madre también presentaba hipercolesterolemia con CT de 400 mg/dl.
EJEMPLO 2: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 2 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 183 pb del exón 2 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex2F (SEQ ID NO: 4) y Ex2R (SEQ ID NO: 5).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de la mutación identificada por secuenciación se analizó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo, micromatriz, descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 108delC
Esta mutación crea un nuevo sitio de digestión de Mnll. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Mnll en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 150 y 33 pb en alelos normales y de 118, 33 y 32 pb en alelos mutantes; estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con el dispositivo (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43.
La mutación 108delC se detectó en una mujer de 50 años sin ninguna manifestación clínica de su hipercolesterolemia. Le fue diagnosticada clínicamente HF con una puntuación MedPed de 9 puntos. Se detectó enfermedad cardiovascular prematura en un familiar en primer grado. Los niveles de lípidos plasmáticos en ayunas sin terapia con fármaco hipolipemiante fueron: CT (381 mg/dl), TG (142 mg/dl), c-LDL (321 mg/dl), y c-HDL (32 mg/dl).
Análisis de la mutación T41M
Esta mutación (185C>T, ACG>ATG, Thr41Met) destruye un sitio de restricción de escisión para la enzima Tail. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Tail en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 154 y 29 pb para alelos normales y de 183 pb para alelos mutantes; estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con el dispositivo (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 y SEQ ID NO: 143.
La mutación T41M se detectó en un hombre de 69 años que sufrió un infarto de miocardio a la edad de 55 años, y que había sido diagnosticado clínicamente de hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico de 6 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Se detectaron evidencias de evento cardiovascular prematuro en familiares. El análisis de su suero en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fue: CT (274 mg/dl) y c-LDL (217 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación C42Y
Esta mutación (C42Y (188G>A, TGC>TAG, Cys42Tyr) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 183 pb del exón 2 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex2F (SEQ ID NO: 4) y Ex2R (SEQ ID NO: 5) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio G>A se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR independiente. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 248, SEQ ID NO: 249, SEQ ID NO: 250 y SEQ ID NO: 251.
La mutación C42Y se detectó en un hombre de 17 años que presentaba arco lipoideo corneal al que se le había diagnosticado que tenía hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico de 10 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Su madre presentaba hipercolesterolemia grave. El análisis de su suero en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fue: CT (350 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento con simvastatina (20 mg/día) disminuyó sus niveles de CT y c-LDL a 274 y 214 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación C74Y
Esta mutación C74Y (284 G>A, TGC>TAC, Cys74Tyr) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 196 pb del exón 3 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex3F (SEQ ID NO: 6) y Ex3R (SEQ ID NO: 7) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio G>A observado se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR independiente. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214 y SEQ ID NO: 215.
La mutación C74Y se detectó en un hombre de 52 años que presentaba arco corneal, xantomas tendinosos y antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Había sido diagnosticado de hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico de 17 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). El análisis de su suero en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fue: CT (420 mg/dl), TG (96 mg/dl) y c-HDL (69 mg/dl). El tratamiento con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa (10 mg/día) redujo sus niveles de c-LDL en un 22%.
EJEMPLO 3: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 3 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 196 pb del exón 3 del gen del r-LDL por la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex3F (SEQ ID NO: 6) y Ex3R (SEQ ID NO: 7).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de la mutación identificada por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo, micromatriz, descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 191-2delAinsCT
Como esta mutación no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de Bfal en presencia del alelo normal pero no en presencia del alelo mutante.
Se amplificó un fragmento de 184 pb del exón 3 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex3R (SEQ ID NO: 7) y Mut191-2F (SEQ ID NO: 8).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Bfal en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 23 y 161 pb para alelos normales y de 185 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 y SEQ ID NO: 47.
La mutación 191-2delAinsCT se detectó en dos familias no relacionadas con hipercolesterolemia autosómica dominante. El probando de una de estas familias era una mujer de 58 años con xantomas tendinosos, xantelasmas, angina de pecho y con antecedentes familiares de cardiopatía coronaria e hipercolesterolemia. Se le había diagnosticado hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico de MedPed de 15 puntos. Sus niveles plasmáticos de lípidos fueron: CT (559 mg/dl) y c-LDL (467 mg/dl), TG (175 mg/dl) y c-HDL (57 mg/dl). El tratamiento con simvastatina (40 mg/día) disminuyó sus niveles de CT y c-LDL a 302 y 228 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación N59K
Esta mutación (240C>A, AAC>AAA, Asn59Lys) destruye un sitio de endonucleasa de escisión para la enzima HincII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de HincII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 111 y 85 pb (alelos normales) o 196 pb (alelos mutantes). Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 y SEQ ID NO: 51.
La mutación N59K se detectó en un hombre de 43 años diagnosticado clínicamente de HF con una puntuación de diagnóstico MedPed de 12 puntos. Sus niveles plasmáticos de lípidos sin terapia hipolipemiante fueron: CT (465 mg/dl), c-LDL (397 mg/dl), TG (100 mg/dl) y c-HDL (48 mg/dl). El tratamiento con simvastatina (40 mg/día) disminuyó sus niveles de CT y c-LDL a 350 y 282 mg/dl respectivamente. Por otro lado, su madre había sufrido una angina de pecho a la edad de 58 años y tenía un hijo de 8 años con hipercolesterolemia, CT (325 mg/dl) y c-LDL (241 mg/dl).
Análisis de la mutación 231delC
La mutación 231delC destruye un sitio de digestión de endonucleasa HaelII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Haelll en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 76, 51, 42 y 25 pb para alelos normales y 117, 51 y 27 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 y SEQ ID NO: 55.
La mutación 231celC se detectó en una mujer de 37 años con arco corneal. Su hermano sufrió un infarto de miocardio a la edad de 38 y su hijo de 12 años de edad tenía hipercolesterolemia con una concentración de CT de 305 mg/dl. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed 16 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos sin terapia hipolipemiante fueron: CT (543 mg/dl), c-LDL (456 mg/dl), TG (178 mg/dl) y c-HDL (51 mg/dl). El tratamiento con atorvastatina (40 mg/día) y colestipol (20 g/día) disminuyó sus niveles de CT y c-LDL a 260 y 190 mg/dl respectivamente.
Análisis de la mutación 313+linsT
Esta mutación crea un nuevo sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Tru1l. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Tru1l en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 196 pb para alelos normales y 162 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa NuSieve al 3% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59.
La mutación 313+linsT se detectó en una mujer de 53 años con xantomas tendinosos y arco corneal. No se detectaron eventos cardiovasculares prematuros en los miembros de su familia disponibles. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 19 puntos. El análisis de sus niveles lipídicos en suero en ayunas fue: CT (574 mg/dl) y c-LDL (505 mg/dl) y con niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con simvastatina (80 mg/día) y colestipol (20 g/día) sus niveles de CT y c-LDL disminuyeron a 282 y 225 mg/dl, respectivamente.
EJEMPLO 4: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 4 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 242 pb del gen del r-LDL de la región 5' del exón 4 (exón 4A) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex4AF (SEQ ID NO: 9) y Ex4 AR (SEQ ID NO: 10).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 63°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por la técnica de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 338del16
Esta mutación crea un nuevo sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Van91I. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Van91I en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 242 pb para alelos normales y 174 y 52 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146 y SEQ ID NO: 147.
La mutación 338del16 se detectó en tres familias no relacionadas con hipercolesterolemia autosómica dominante. Un probando de una de estas familias era un hombre de 40 años con CT 542 mg/dl y c-LDL de 441 mg/dl, y niveles de TG y c-HDL normales. Presentaba xantomas tendinosos y arco corneal. Se le diagnosticó HF con una puntuación MedPed de 19 puntos. No se detectó ningún evento cardiovascular en los miembros de su familia disponibles. El tratamiento con atorvastatina (10 mg/día) redujo sus niveles plasmáticos de CT y c-LDL a 293 y 218 mg/dl, respectivamente.
Análisis de la mutación 510insC
Como esta mutación no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción Mnll en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 244 pb del exón 4A del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex4AF (SEQ ID NO: 9) y Mut509insCR (SEQ ID NO: 11).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 65°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de MnII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 141, 99 y 4 pb para alelos normales y 141, 88, 12 y 4 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) utilizando en el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 63.
La mutación 510insC se detectó en una mujer de 44 años. El análisis de sus lípidos séricos en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fue: CT (477 mg/dl) y (c-LDL 394 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. No se observaron antecedentes familiares ni personales de cardiopatía coronaria prematura ni xantomas ni xantelasmas. Su puntuación MedPed de diagnóstico clínico era de 9 puntos. Tenía dos hermanos con hipercolesterolemia.
Análisis de la mutación 451de13
Esta mutación (451de13) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 242 pb del exón 4 (4A) durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex4AF (SEQ ID NO: 9) y Ex4AR (SEQ ID NO: 10) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. La deleción de tres pares de bases se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 174 y SEQ ID NO: 175.
La mutación 451del3 se detectó en un hombre de 36 años que presentaba arco lipoideo corneal y que había sufrido previamente un infarto de miocardio a los 34 años de edad. Este paciente tenía dos hijos de 2 y 8 años de edad con CT de 320 y 275 mg/dl, respectivamente. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación de 17 puntos. Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fueron: CT 449 mg/dl, c-LDL 367 mg/dl, TG 218 mg/dl y c-HDL 38 mg/dl. El tratamiento con simvastatina (40 mg/día) disminuyó su nivel de c-LDL a 270 mg/dl.
EJEMPLO 5: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 4B del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 237 pb de 3' del exón 4 (exón 4B) del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex4BF (SEQ ID NO: 12) y Ex4BR (SEQ ID NO: 13).
Se amplificó ADN (200 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación y elongación a 72°C durante 2 minu tos, y una extensión final de 72°C durante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación D157G
Esta mutación (533A>G, GAT>GGT, Asp195Gly) crea un nuevo sitio de digestión para la endonucleasa Hphl. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Hphl en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 237 pb para alelos normales y 175 y 62 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa NuSieve al 3% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 67.
La mutación D157G se encontró en una mujer de 32 años. No se detectó ningún evento cardiovascular en su familia. Se le diagnosticó clínicamente posible HF con una puntuación MedPed de 6 puntos. Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas antes de la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (358 mg/dl) y c-LDL (296 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento con atorvastatina (10 mg/día) redujo los niveles de CT y c-LDL a 212 y 140 mg/dl, respectivamente. Su padre también presentaba niveles elevados de colesterol plasmático CT de 364 mg/dl, así como su abuela 341 mg/dl.
Análisis de la mutación C195R
Esta mutación (646T>C, TGT>CGT, Cys195Arg) crea un sitio de digestión de BshNI. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de BshNI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 237 pb para
alelos normales y 159 y 78 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) utilizando en el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 71.
La mutación C195R se detectó en una mujer de 64 años que tenía hipercolesterolemia y arco corneal. Se detectó de enfermedad cardiovascular prematura en su madre. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 11 puntos. Los niveles de lípidos plasmáticos terapia hipolipemiante fueron: CT (560 mg/dl) y (c-LDL 468 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación 675del15
Esta mutación se identificó por análisis de heterodúplex; la electroforesis en un gel de poliacrilamida (PAA) al 8% de los productos de PCR del exón 4B visualizados mediante tinción con bromuro de etidio mostraba la presencia de bandas de heterodúplex en lugar de los homodúplex normales y mutados correspondientes. Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 237 pb en alelos normales y 222 pb en alelos mutantes. La banda de heterodúplex migraba más lentamente debido a la formación de los abultamientos entre las secuencias apareadas erróneamente. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 75.
La mutación 675del15 se detectó en una mujer de 63 años, diagnosticada clínicamente de HF con una puntuación MedPed de 8 puntos. No se detectó ningún evento cardiovascular en su familia. Una determinación de lípidos sin tratamiento proporcionó los siguientes resultados: CT (450 mg/dl) y c-LDL (379 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Ningún miembro de la familia estaba disponible para completar el estudio genético.
Análisis de la mutación 684dup12
Esta mutación se identificó mediante amplificación por PCR del exón 4B y análisis de restricción, la adición de 12 pb crea un nuevo sitio de restricción de la endonucleasa Mnll. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de MnII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 192 y 45 pb para alelos normales y 204 y 45 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 79.
La mutación 684dup12 se detectó en dos familias no relacionadas con hipercolesterolemia autosómica dominante. El probando de una de estas familias era un hombre de 63 años con xantomas tendinosos y arco corneal. Había sufrido un infarto de miocardio a la edad de 55 años y se le había diagnosticado clínicamente HF con una puntuación MedPed de 17 puntos. No se detectó ningún evento cardiovascular en su familia. Los niveles de lípidos plasmáticos sin terapia hipolipemiante fueron: CT (469 mg/dl), c-LDL (408 mg/dl), TG (100 mg/dl) y c-HDL 41 mg/dl.
Análisis de la mutación D200V
Esta mutación (D200V (662A>T, GAC>GTC, Asp200Val)) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 237 pb del exón 4 (4B) durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex4BF (SEQ ID NO: 12) y Ex4BR (SEQ ID NO: 13) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 662A>T se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, SEQ ID NO: 234 y SEQ ID NO: 235.
La mutación D200V se detectó en una mujer de 43 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante. Se le diagnosticó clínicamente hipercolesterolemia familiar con una puntuación de 8 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas utilizando el fármaco hipolipemiante pravastatina (40 mg/dl) fueron: CT 329 mg/dl, c-LDL 273 mg/dl, TG 73 mg/dl y c-HDL 41 mg/dl.
Análisis de la mutación S205C
La mutación S205C (677C>G, TCT>TGT, Ser205Cys) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 237 pb del exón 4 (4B) durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones
utilizando los cebadores de amplificación Ex4BF (SEQ ID NO: 12) y Ex4BR (SEQ ID NO: 13) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 677C>G se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230 y SEQ ID NO: 231.
La mutación S205C se detectó en una mujer de 39 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante (madre y hermano con CT de 450 mg/dl y 500 mg/dl respectivamente). Se le diagnosticó clínicamente hipercolesterolemia familiar a los 20 años con una puntuación MedPed de 8 puntos. Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas sin utilizar fármacos hipolipemiantes fueron: CT 390 mg/dl, c-LDL 325 mg/dl y c-HDL 35 mg/dl. El tratamiento con simvastatina (10 mg/día) disminuyó su nivel de c-LDL plasmático a 270 mg/dl.
EJEMPLO 6: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 6 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 179 pb del exón 6 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex6F (SEQ ID NO: 14) y Ex6R (SEQ ID NO: 15).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 56ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación C255G
Como esta mutación C255G (826T>G, TGC>GGC, Cys255Gly) no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción BstUI en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 163 pb del exón 6 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex6R (SEQ ID NO: 15) y MutC255GF (SEQ ID NO: 16).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 63°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de BstUI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de y 163 pb para alelos normales y de 141 y 22 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 83.
La mutación C255G se detectó en una mujer de 63 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia familiar. No se detectó ninguna enfermedad cardiovascular en su familia. Una determinación de lípidos sin tratamiento proporcionó los siguientes resultados: CT (439 mg/dl) y c-LDL (355 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Se le diagnosticó clínicamente hipercolesterolemia familiar con una puntuación MedPed de 8 puntos.
Análisis de la mutación E291X
Como esta mutación E291X (934G>T, GAG>TAG, Asp291Stop) no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de la enzima SspI en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 164 pb del exón 6 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex6F (SEQ ID NO: 13) y Mut E291XR (SEQ ID NO: 17).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de SspI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 164 pb para alelos normales y de 144 y 20 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa NuSieve al 3% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 87.
La mutación E291X se detectó en un hombre de 44 años de una familia con hipercolesterolemia familiar autosómica dominante. Éste tenía arco lipoideo corneal y no se observó ninguna enfermedad cardiovascular en su familia. Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas sin utilizar fármacos hipolipemiantes fueron: CT (381 mg/dl), c-HDL (45 mg/dl), TG (111 mg/dl) y c-LDL (314 mg/dl). El tratamiento hipolipemiante con simvastatina (40 mg/día) y colestiramina (12 g/día) redujo sus niveles de CT plasmático y c-LDL a 253 mg/dl y 188 mg/dl, respectivamente.
Análisis de la mutación 818de18
Esta mutación se identificó por análisis de heterodúplex; la electroforesis en un gel de poliacrilamida (PAA) al 8% del producto amplificado del exón 6 visualizado mediante tinción con bromuro de etidio mostraba la presencia de bandas de heterodúplex en lugar de los homodúplex normales y mutados correspondientes de 179 y 171 pb, respectivamente. La banda de heterodúplex migraba más lentamente debido a la formación de los abultamientos entre las secuencias apareadas erróneamente. Además, la mutación podía confirmarse mediante amplificación por PCR del exón 6 y análisis de restricción, la mutación 8181del8 crea un nuevo sitio de restricción de la endonucleasa MaelII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de MaeIII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 118, 34 y 27 pb para alelos normales y de 118 y 53 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 162 y SEQ ID NO: 163.
La mutación 818de18 se detectó en una mujer de 69 años diagnosticada clínicamente con HF con una puntuación MedPed de 10 puntos. Sus dos hijos tenían hipercolesterolemia con niveles de CT plasmáticos de 382 y 304 mg/dl respectivamente. Los análisis de sus lípidos séricos en ayunas antes de utilizar fármacos hipolipemiantes fueron: CT (530 mg/dl) y c-LDL (439 mg/dl), TG (170 mg/dl) y c-HDL 57 mg/dl. El tratamiento hipolipemiante con cerivastatina (0,4 mg/día) disminuyó su c-LDL a 363 mg/dl.
Análisis de la mutación R279G
Esta mutación R279G (898A>G, AGA>GGA, Arg279Gly) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 179 pb del exón 6 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex6F (SEQ ID NO: 14) y Ex6R (SEQ ID NO: 15) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 898A>G se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 201, SEQ ID NO: 202 y SEQ ID NO: 203.
La mutación R279G se identificó en una mujer de 59 años con xantelasmas y antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Su puntuación para el diagnóstico clínico HF era de 10 puntos (Hipercolesterolemia familiar. Informe de una segunda consulta de la OMS. Organización internacional de HF MedPed, Ginebra 1998). Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento fueron: CT 384 mg/dl, c-LDL 314 mg/dl, y niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con simvastatina (80 mg/día) redujo su c-LDL a 167 mg/dl.
EJEMPLO 7: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 7 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 234 pb del exón 7 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex7F (SEQ ID NO: 18) y Ex7R (SEQ ID NO: 19).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 57ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 941-39C>T
Esta mutación destruye un sitio de digestión de Apal. Quince µl de muestra de PCR del exón 7 se digirieron con 15 unidades de ApaI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 186, 26 y 22 pb para alelos normales y 208 y 26 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 y SEQ ID NO: 91.
La mutación 941-39C>T se detectó en cuatro familias no relacionadas. El probando de una de estas familias era una mujer de 61 años. Enfermedad cardiovascular prematura estaba presente en el probando y también en un familiar de primer grado. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 7 puntos Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento fueron: CT (340 mg/dl) y c-LDL (248 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante atorvastatina (20 mg/día) los niveles de CT y c-LDL se redujeron a 223 mg/dl y 144 mg/dl respectivamente, sin cambios significativos en los niveles de TG y c-HDL.
Análisis de la mutación C319Y
Esta mutación C319Y (1019G>A, TGC>TAC, Cys319Tyr) crea un nuevo de digestión para la endonucleasa Rsal. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de RsaI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 234 pb en alelos normales y 139 y 98 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94 y SEQ ID NO: 95.
La mutación C319Y se detectó en un hombre de 43 años con arco corneal y xantomas en el tendón de Aquiles y el dorso de las manos. Su padre falleció por muerte súbita a los 45 años. Se observó enfermedad cardiovascular prematura en un familiar de primer grado. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 22 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento fueron: CT (428 mg/dl), c-LDL (372 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación 1054del11
Esta mutación destruye un sitio restricción de endonucleasa para la enzima Hphl. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de HphI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 189 y 45 pb en alelos normales y 223 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98 y SEQ ID NO: 99.
La mutación 1054del11 se detectó en un hombre de 43 años, con xantomas en el tendón de Aquiles y enfermedad cardiovascular prematura; por otro lado, tenía un familiar de primer grado que sufrió un infarto de miocardio prematuro. Se le diagnosticó clínicamente HF con puntuación MedPed de 16 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento fueron: CT (480 mg/dl), c-LDL (416 mg/dl), TG (95 mg/dl) y c-HDL 36 mg/dl.
EJEMPLO 8: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 8 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 220 pb del exón 8 gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex8F (SEQ ID NO: 148) y EX8R (SEQ ID NO: 149).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 64ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 1186+5 G>A
Esta mutación (1186+5 G>A) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 220 pb del exón 8 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex8BF (SEQ ID NO: 148) y Ex8BR (SEQ ID NO: 149) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio G>A se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 190 y SEQ ID NO: 191.
La mutación 1186+5 G>A se identificó en dos familias no relacionadas con hipercolesterolemia autosómica dominante. El probando de una de estas familias era una mujer de 34 años con xantelasmas, arco corneal y xantomas tendinosos. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 21 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento farmacológico fueron: CT de 411 mg/dl, c-LDL de 346 mg/dl y niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con cerivastatina (0,2 mg/día) redujo su c-LDL a 222 mg/dl.
EJEMPLO 9: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 9 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 224 pb del exón 9 gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex9F (SEQ ID NO: 20) y Ex9R (SEQ ID NO: 21).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 63ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 1197de19
Esta mutación se analizó por análisis de heterodúplex; la electroforesis en un gel de poliacrilamida al 8% de los productos de PCR visualizados mediante tinción con bromuro de etidio mostraba la presencia de bandas de heterodúplex en lugar de los homodúplex normales y mutados correspondientes. Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 224 en alelos normales y 215 pb en alelos mutantes. La banda de heterodúplex migraba más lentamente debido a la formación de los abultamientos entre las secuencias apareadas erróneamente. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103.
La mutación 1197deI9 se detectó en ocho familias no relacionadas. El probando de una de estas familias era una mujer de 45 años con xantomas y que sufrió una angina de pecho a los 41 años. Su padre padeció un infarto de miocardio a los 36 años. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 18 puntos Los niveles
plasmáticos de lípidos antes del tratamiento fueron: CT (525 mg/dl), c-LDL (443 mg/dl), TG (163 mg/dl) y c-HDL (49 mg/dl). El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (20 mg/día) redujo su c-LDL a 323 mg/dl.
Análisis de la mutación Y379X
Esta mutación Y379X (1200C>A, TAC>TAA, Tyr379Stop) destruye un sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Mnll. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de MnII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 87, 56, 34, 22, 18, 4 y 3 pb en alelos normales y 87, 56, 38, 22, 18 y 3 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida (PAA) al 16% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106 y SEQ ID NO: 107.
La mutación Y379X se detectó en hombre de 69 años con hipercolesterolemia grave. Su padre sufrió un infarto de miocardio a los 50 años de edad. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 7 puntos. Una determinación de lípidos sin tratamiento proporcionó los siguientes resultados: CT (381 mg/dl) y c-LDL (306 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (20 mg/día) redujo su c-LDL a 259 mg/dl.
Análisis de la mutación 1207delT
Esta mutación destruye un sitio de escisión para la enzima de restricción MboII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de MboII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 140, 46, 35 y 3 pb para alelos normales y 140, 48 y 35 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 16% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO. 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110 y SEQ ID NO: 111.
La mutación 1207delT se detectó en un miembro de una familia con hipercolesterolemia autosómica dominante. Ella era una mujer de 35 años sin antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de 9 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento hipolipemiante fueron: CT (429 mg/dl), c-LDL (345 mg/dl), TG (188 mg/dl y c-HDL (46 mg/dl). El tratamiento hipolipemiante combinado con simvastatina (40 mg/día) y colestipol (5 g/día) redujo su CT y c-LDL a 220 mg/dl y 137 mg/dl, respectivamente.
Análisis de la mutación Y421X
Esta mutación Y421X (1326C>G, TAC>TAG, Tyr421Stop) crea un nuevo sitio de escisión para la endonucleasa Bfal. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Bfal en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 224 pb para alelos normales y 140 y 60 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114 y SEQ ID NO: 115.
La mutación Y421 se detectó en tres familias no relacionadas con hipercolesterolemia. El probando de una de estas familias era una mujer de 71 años con arco corneal y xantomas tendinosos. Su padre presentaba hipercolesterolemia y sufrió un infarto de miocardio a los 51 años. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 16 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas fueron: CT (615 mg/dl) y c-LDL (550 mg/dl), con niveles de TC y c-HDL normales.
Análisis de la mutación 1204insT
Esta mutación (1204insT) destruye un sitio de escisión para la endonucleasa MboII. Quince µl de muestra de PCR del exón 9 se digirieron con 15 unidades de MboII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 141, 45, 35 y 3 pb en alelos normales y 141, 45 y 39 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170 y SEQ ID NO: 171.
Esta mutación se detectó en una niña de 12 años. Su padre y su hermano presentaban hipercolesterolemia con niveles de CT de 412 y 321 mg/dl, respectivamente. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de
9 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fueron: CT 332 mg/dl, c-LDL de 267 mg/dl con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con resinas (15 g/día) redujo los niveles de c-LDL a 248 mg/dl.
EJEMPLO 10: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 10 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 278 pb del exón 10 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex10F (SEQ ID NO: 22) y Ex10R (SEQ ID NO: 23).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 58ºC durante 1 minuto y elongación a 74°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 1432delG
Como esta mutación no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de NaeI en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 200 pb del exón 10 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex10R (SEQ ID NO: 23) y Mut1432delGF (SEQ ID NO: 24).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 58°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de NaeI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 200 pb (fragmento sin digerir) para alelos normales y 179 y 20 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 118 y SEQ ID NO: 119.
La mutación 1432delG se detectó en una mujer de 53 años con xantomas tendinosos de una familia con hipercolesterolemia autosómica dominante. Ella sufrió una enfermedad cardiovascular prematura al igual que un familiar de primer grado. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 15 puntos. Un análisis de lípidos sin utilizar terapia hipolipemiante proporcionó los siguientes resultados: CT (548 mg/dl) y c-LDL (470 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación T433N
Esta mutación T433N (1361 C>A, ACC>AAC, Tyr433Asn) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 278 pb del exón 10 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex10F (SEQ ID NO: 22) y Ex10R (SEQ ID NO: 23) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio C>A se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 159.
La mutación T433N se detectó en un hombre de 50 años con arco corneal y antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante. Su hija de 21 años presentaba hipercolesterolemia con CT de 310 mg/dl. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de 6 puntos. Los análisis sus lípidos séricos en ayunas
eran CT 318 mg/dl, c-LDL 249 mg/dl y con niveles de TG y c-HDL normales. La terapia hipolipemiante con lovastatina (20 mg/día) redujo su c-LDL a 199 mg/dl.
Análisis de la mutación T446I
Esta mutación T446I (1400C>T, ACC>ATC, Tyr446Ile) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 278 pb del exón 10 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex10F (SEQ ID NO: 22) y Ex10R (SEQ ID NO: 23) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio C>T se confirmó secuenciado un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206 y SEQ ID NO: 207.
La mutación T446I se detectó en una mujer de 64 años que sufrió un ángor a los 62 años. Tenía dos hermanos que habían sufrido un infarto de miocardio a la edad de 40 y 46 años respectivamente. Se le diagnosticó clínicamente HF, con una puntuación MedPed de 9 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas durante la utilización de tratamiento hipolipemiante con pravastatina fueron: CT (352 mg/dl) y c-LDL (281 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con simvastatina 20 mg/día, los niveles de c-LDL disminuyeron a 150 mg/dl.
Análisis de la mutación 1423deIGC/insA
Esta mutación 1423delGC/insA destruye un sitio de escisión para la endonucleasa Mval. Quince µl de muestra de PCR del exón 10 se digirieron con 15 unidades de Mval en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 150, y 128 pb en alelos normales y 128, 87 y 63 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 166 y SEQ ID NO: 167.
Esta mutación se detectó en un hombre de 34 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de 9 puntos. Los análisis de los niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de fármacos hipolipemiantes fueron: CT 554 mg/dl, c-LDL 422 mg/dl con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (10 mg/día) disminuyó sus niveles de c-LDL a 406 mg/dl.
EJEMPLO 11: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 11 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 194 pb del exón 11 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex11F (SEQ ID NO: 25) y Ex11R (SEQ ID NO: 26).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 65ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación W515X
Esta mutación W515X (1607G>A, TGG>TAG, Trp515Stop) crea un nuevo sitio de digestión de Bfal. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Bfal en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 164 y 30 pb para alelos normales y 97, 67 y 30 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de agarosa NuSieve al 3% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122 y SEQ ID NO: 123.
La mutación W515X se detectó en un hombre de 39 años con arco corneal, y antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Su padre sufrió un infarto de miocardio a los 50 años. Se le diagnosticó hipercolesterolemia familiar con una puntuación MedPed de 13 puntos. Una determinación de lípidos sin tratamiento proporcionó los siguientes resultados: CT (364 mg/dl) y c-LDL (308 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación [1587-5del5; 1587del31]
La mutación [1587-5del5; 1587del31] se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 194 pb del exón 11 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex11F (SEQ ID NO: 25) y Ex11R (SEQ ID NO: 26) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. La deleción se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% analizando el producto de PCR, podían observarse dos fragmentos de 194 y 158 pb. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, SEQ ID NO: 258 y SEQ ID NO: 259.
La mutación [1587-5del5; 1587del31] se detectó en un hombre de 43 años con arco corneal y antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante. Su padre sufrió un infarto de miocardio a los 50 años. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 9 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (345 mg/dl) y TG (160 mg/dl) y c-HDL (34 mg/dl). Después del tratamiento hipolipemiante combinado con simvastatina 40 mg/día y colestipol 10 g/día los niveles de c-LDL disminuyeron a 208 mg/dl.
Análisis de la mutación G516X
Esta mutación (1609G>T, GGA>TGA, Gly516Stop) crea un nuevo sitio de digestión de Hphl. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Hphl en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 139, 43 y 12 pb para alelos normales y 81, 58, 43 y 12 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 178 y SEQ ID NO: 179.
La mutación G516X se detectó en una mujer de 20 años con xantomas tendinosos y antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Se le diagnosticó hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico MedPed de 17 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas antes de la terapia hipolipemiante fueron: CT 476 mg/dl, c-LDL 403 mg/dl y niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con un inhibidor de la HMG-CoA reductasa, los niveles de c-LDL disminuyeron a 202 mg/dl.
Análisis de la mutación H562Q
Esta mutación H562Q (1749C>A, CAC>CAA, His562Gln) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 194 pb del exón 11 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex11F (SEQ ID NO: 25) y Ex11R (SEQ ID NO: 26) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio C>A se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 210 y SEQ ID NO: 211.
La mutación H562Q se detectó en una mujer de 37 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante. Su padre tenía hipercolesterolemia y sufrió un infarto de miocardio a los 48 años y su hijo a los 13 años presentaba niveles de CT de 500 mg/dl. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 9 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (350 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con atorvastatina 20 mg/día el nivel de CT disminuyó a 333 mg/dl.
EJEMPLO 12: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 12 del gen del r-LDL
Se amplificó un fragmento de 236 pb del exón 12 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex12F (SEQ ID NO: 150) y Ex12R (SEQ ID NO: 151).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 58ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación E579D
Esta mutación E579D (1800G>C, GAG>GAC, Glu579Asp) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 236 pb del exón 12 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex12F (SEQ ID NO: 150) y Ex12R (SEQ ID NO: 151) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio G>C se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226 y SEQ ID NO: 227.
La mutación E579D se detectó en un hombre de 49 años con antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante (padre con 450 mg/dl de CT y su hermano y dos hijos con CT por encima del percentil 95). Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 8 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (320 mg/dl), c-LDL (250 mg/dl) y niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (10 mg/día) el nivel de c-LDL disminuyó a 187 mg/dl.
Análisis de la mutación 1815del11
Esta mutación se confirmó por análisis de heterodúplex; la electroforesis en un gel de poliacrilamida (PAA) al 8% de los productos de PCR del exón 12 visualizados mediante tinción con bromuro de etidio mostraba la presencia de bandas de heterodúplex en lugar de los homodúplex normales y mutados correspondientes. Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 236 pb para alelos normales y 225 pb para alelos mutantes. La banda de heterodúplex migraba más lentamente debido a la formación de los abultamientos entre las secuencias apareadas erróneamente. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 186 y SEQ ID NO: 187.
La mutación 1815del11 se identificó en cuatro familias no relacionadas con hipercolesterolemia. El probando de una de ellas, era una mujer de 69 años con arco corneal y arteriopatía coronaria prematura a los 56 años. Sus dos hermanos presentaban una marcada elevación de los niveles plasmáticos de colesterol CT 700 y 435 mg/dl respectivamente. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 13 puntos. Los niveles plasmáticos de lípidos con tratamiento hipolipemiante con simvastatina, (40 mg/dl) fueron: CT 444 mg/dl, c-LDL 368 mg/dl y niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (30 mg/día) su c-LDL disminuyó a 225 mg/dl.
EJEMPLO 13: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 13 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 215 pb del exón 13 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex13F (SEQ ID NO: 27) y Ex13R (SEQ ID NO: 28).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59ºC durante 1 minuto y elongación a 74°C durante 3 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia
de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación D630N
Esta mutación D630N (1951G>A, GAT>AAT, Asp630Asn) destruye un sitio de digestión de Mnll. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Mnll en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 89, 48, 39, 14+14, 12 y 11 pb en alelos normales y 89, 59, 39, 14+14 y 12 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126 y SEQ ID NO: 127.
La mutación D630N se detectó en dos familias no relacionadas. El probando de una de estas familias era una mujer de 36 años cuyos padres murieron de infarto de miocardio a los 62 y 64 años. Su puntuación MedPed para un diagnóstico clínico de HF era de 7 puntos. Una determinación de lípidos sin tratamiento proporcionó los siguientes resultados: CT (332 mg/dl) y c-LDL (268 mg/dl), TG (81 mg/dl) y c-HDL (48 mg/dl).
Análisis de la mutación H635N
Como esta mutación H635N (1966C>A, CAC>AAC, His635Asn) no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de CaiI en presencia del alelo normal pero no en presencia del alelo mutante.
Se amplificó un fragmento de 169 pb del exón 13 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex13F (SEQ ID NO: 27) y MutH635NR (SEQ ID NO: 29).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 56°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de CaiI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 151 y 18 pb en alelos normales y 169 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de PAA al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130 y SEQ ID NO: 131.
La mutación H635N se detectó en un miembro de una familia con hipercolesterolemia autosómica dominante. Éste era un hombre de 43 años con arco lipoideo corneal. Su madre y tres sus hermanos presentaban un nivel elevado de colesterol plasmático. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 13 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (448 mg/dl), c-LDL (364 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales.
EJEMPLO 14: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 14 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 288 pb del exón 14 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex14F (SEQ ID NO: 30) y Ex14R (SEQ ID NO: 31).
Se amplificó ADN (250 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 20 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 59ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación D686Y
Esta mutación D686Y (2119G>T, GAC>TAC, Asp686Tyr) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 288 pb del exón 14 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex14F (SEQ ID NO: 30) y Ex14R (SEQ ID NO: 31) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio G>T se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218 y SEQ ID NO: 219.
La mutación D686Y se detectó en un hombre de 31 años con xantomas, arco corneal, evidencia de arteriopatía coronaria prematura y antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 21 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (430 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante combinado con atorvastatina 40 mg/día y colestipol 5 g/día los niveles de CT disminuyeron a 205 mg/dl.
EJEMPLO 15: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 15 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 243 pb del exón 15 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex15F (SEQ ID NO: 32) y Ex15R (SEQ ID NO: 33).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 20 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 55ºC durante 30 segundos y elongación a 72°C durante 1,5 minutos, y una extensión final de 72°C durante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 2184delG
Esta mutación crea un nuevo sitio de escisión para la enzima de restricción Alul. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Alul en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 166 y 78 pb para alelos normales y 166, 67 y 11 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134 y SEQ ID NO: 135.
La mutación 2184delC se detectó en un miembro de una familia con hipercolesterolemia autosómica dominante. Éste es una mujer de 32 años con antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular prematura. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de 6 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (330 mg/dl) y c-LDL (270 mg/dl), con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación T740M
Esta mutación T740M (2282C>T, ACG>ATG, Tyr740Met) crea un nuevo sitio de digestión de NIalII. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de NIalII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (NEB, Beverly, MA, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 247 pb para alelos normales y 194 y 53 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194 y SEQ ID NO: 195.
La mutación T740M se detectó en una mujer de 60 años, con arco corneal, antecedentes familiares de hipercolesterolemia y antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular. Se le había diagnosticado
hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico MedPed de 10 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas antes de la terapia hipolipemiante fueron: CT 492 mg/dl y niveles de TG y c-HDL normales. Después del tratamiento hipolipemiante con atorvastatina, los niveles de CT disminuyeron a 251 mg/dl.
EJEMPLO 16: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 16 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 273 pb del exón 16 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex16F (SEQ ID NO: 152) y Ex16R (SEQ ID NO: 153).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 20 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 63ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación V766E
Esta mutación V766E (2360T>A, GTG>GAG, Val766Glu) se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 273 pb del exón 16 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex16F (SEQ ID NO: 152) y Ex16R (SEQ ID NO: 153) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio 2360T>A se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 236, SEQ ID NO: 237, SEQ ID NO: 238 y SEQ ID NO: 239.
La mutación D686Y se detectó en una mujer de 58 años con xantomas tendinosos, arco corneal, xantelasmas y antecedentes familiares de arteriopatía coronaria prematura. Se le diagnosticó clínicamente HF, con una puntuación MedPed de 12 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (420 mg/dl), c-LDL de (324 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación I771T
Como esta mutación I771T (2375T>C, ATT>CACT, Ile771Thr), no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de HincII en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 142 pb del exón 16 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex16R (SEQ ID NO: 153) y Mut1771TF (SEQ ID NO: 154).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 61°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de HincII en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 142 pb en alelos normales y 121 y 21 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 198 y SEQ ID NO: 199.
La mutación I771T se detectó en una mujer de 60 años de una familia con hipercolesterolemia autosómica dominante y antecedentes de enfermedad cardiovascular prematura. Se le había diagnosticado hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico MedPed de 21 puntos. Sus niveles plasmáticos de lípidos fueron: CT (422 mg/dl) y c-LDL (368 mg/dl) y niveles de TG y c-HDL normales.
Análisis de la mutación 2389+3 C>T
Esta mutación 2389+3 C>T se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 273 pb del exón 16 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex16F (SEQ ID NO: 152) y Ex16R (SEQ ID NO: 153) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. El cambio C>T se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 252, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254 y SEQ ID NO: 255.
La mutación 2389+3 C>T se detectó en un hombre de 36 años con xantomas tendinosos múltiples y antecedentes familiares de hipercolesterolemia. Se le diagnosticó HF, con una puntuación MedPed de 18 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (450 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (20 mg/día) redujo su c-LDL a 259 mg/dl.
Análisis de la mutación 2389+4 A>G
Como esta mutación (2389+4 A>G) no cambia el mapa de restricción, se diseñó un par de cebadores mutágenos para introducir el sitio de reconocimiento de BshNI en presencia del alelo mutante pero no en presencia del alelo normal.
Se amplificó un fragmento de 194 pb del exón 16 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores Ex16F (SEQ ID NO: 152) y Mut2389+4 A>GR (SEQ ID NO: 155).
Se amplificó ADN (500 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 61°C durante 1 minuto y elongaci ón a 72°C durante 2 minutos, y una extensión final de 72°C du rante 10 minutos.
Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de BshNI en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Fermentas Inc., Hanover, MD, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 194 pb para alelos normales y 175 y 19 pb para alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182 y SEQ ID NO: 183.
La mutación 2389+4 A>G se detectó en 11 familias no relacionadas con hipercolesterolemia. El probando de una de estas familias era una mujer de 22 años con xantomas tendinosos y antecedentes familiares de enfermedad cardiovascular prematura. Se le había diagnosticado hipercolesterolemia familiar con una puntuación de diagnóstico MedPed de 17 puntos. Sus niveles plasmáticos de lípidos sin tratamiento hipolipemiante fueron: CT (356 mg/dl) y c-LDL (293 mg/dl) y niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante combinado con atorvastatina (40 mg/día) y colestipol (5 g/día) disminuyó su nivel de c-HDL a 227 mg/dl.
EJEMPLO 17: Identificación de mutaciones ubicadas en el exón 17 del gen del r-LDL.
Se amplificó un fragmento de 242 pb del exón 17 del gen del r-LDL mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando los siguientes cebadores: Ex17F (SEQ ID NO: 34) y Ex17R (SEQ ID NO: 35).
Se amplificó ADN (300 ng) en una mezcla de reacción de 50 µl que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,4, KCl 50 mM, MgCl2 1,5 mM, 200 µM de cada dNTP, 0,2 µM de cada cebador y 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa (Gibco BRL, Carlsbad, CA, Estados Unidos). El ciclo de amplificación fue: 10 minutos de desnaturalización a 96°C, seg uidos por 35 ciclos de desnaturalización a 94°C durante 1 min uto, hibridación a 58ºC durante 1 minuto y elongación a 72°C durante 1 minuto, y una extensión final de 72°C dur ante 10 minutos.
Los productos de PCR fueron analizados por polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP). Aquellos fragmentos que mostraron patrones anómalos por SSCP fueron secuenciados utilizando un secuenciador automatizado CEQ 2000XL DNA Analysis System (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos). La presencia de las mutaciones identificadas por secuenciación se determinó posteriormente por análisis de restricción y con el dispositivo descrito anteriormente, “biochip”.
Análisis de la mutación 2399del5ins4
Esta mutación elimina la secuencia TCTTC e introduce la secuencia GGGT en la posición 2399 y crea un nuevo sitio de digestión de Aval. Quince µl de muestra de PCR se digirieron con 15 unidades de Aval en un volumen total de 30 µl según el protocolo descrito por el fabricante (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ, Estados Unidos). Los fragmentos obtenidos tenían una longitud de 230 y 120 pb en alelos normales y 183, 46 y 12 pb en alelos mutantes. Estos fragmentos se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) utilizando en el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 138 y SEQ ID NO:
139.
La mutación 2399del5ins4 se detectó en tres familias no relacionadas hipercolesterolémicas. El probando de una de estas familias era una mujer de 49 años con xantomas tendinosos. Tenía dos hijos con hipercolesterolemia, TC 330 y 386 mg/dl, respectivamente. Su padre había muerto de enfermedad cardiovascular a los 51 años. Su puntuación MedPed para el diagnóstico clínico de HF era de 16 puntos. Sus niveles plasmáticos de lípidos antes del tratamiento hipolipemiante fueron: CT (510 mg/dl), c-LDL (424 mg/dl), c-HDL (58 mg/dl) y TG (140 mg/dl). El tratamiento combinado con simvastatina 20 mg/dl y colestipol 20 g/día redujo su CT a 280 mg/dl.
Análisis de la mutación 2544insC
Esta inserción 2544insC se identificó mediante secuenciación de ADN del fragmento de 242 pb del exón 17 durante cribado para mutaciones en el gen del r-LDL en sujetos con diagnóstico clínico de HF. El producto de PCR purificado de la muestra de ADN se secuenció directamente en ambas direcciones utilizando los cebadores de amplificación Ex17F (SEQ ID NO: 34) y Ex17R (SEQ ID NO: 35) y el kit CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing con Quick Start (Beckman Coulter, Palo Alto, CA, Estados Unidos) según el protocolo descrito por el fabricante. Las secuencias se detectaron utilizando el CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, Inc. Fullerton) y se analizaron con el software CEQ 8000. La inserción de C se confirmó secuenciando un segundo producto de PCR. Como alternativa, esta mutación podía analizarse con la micromatriz (“biochip”) dosificando puntualmente sobre el portaobjetos los oligonucleótidos: SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246 y SEQ ID NO: 247.
La mutación 2544insC se detectó en un hombre de 37 años que había sufrido un infarto de miocardio. Presentaba xantomas tendinosos, arco corneal, antecedentes familiares de hipercolesterolemia y cardiopatía coronaria. Se le diagnosticó clínicamente HF con una puntuación MedPed de 21 puntos. Los análisis de sus niveles de lípidos séricos en ayunas sin la utilización de terapia hipolipemiante fueron: CT (444 mg/dl), c-LDL (379 mg/dl) con niveles de TG y c-HDL normales. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (40 mg/día) redujo su c-LDL a 282 mg/dl.
Descripción breve de las figuras:
La figura 1 es una representación esquemática del itinerario del r-LDL en células humanas. El r-LDL se sintetiza en el retículo endoplasmático como un precursor de peso molecular aparente de 120 Kd y es transportado al aparato de Golgi donde se procesan los carbohidratos con enlace N-glucosídico. Una vez que es transferido a la superficie celular, el receptor reconoce al componente de apolipoproteína B-100 de las LDL. La unión conduce a la captación celular, y degradación lisosómica de las LDL mediante endocitosis mediada por el receptor. Este proceso de captación satisface las necesidades de colesterol de las células y, por lo tanto, mantiene la supresión de la síntesis de colesterol.
La figura 2 es una representación esquemática de los cinco dominios en la estructura de la proteína receptora de LDL humana y sus correspondientes exones en el gen del receptor de LDL.
La figura 3 muestra la imagen de la micromatriz de la región utilizada para analizar la mutación E256K. Se dosificaron puntualmente dos pares de oligonucleótidos para cada mutación. Cada par de sondas consta de una sonda específica para el alelo de tipo salvaje y una segunda sonda específica para el alelo mutante. (A) sujeto de tipo salvaje. (B) paciente con HF portador de la mutación E256K.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> EFARMES, SA.
<120> Método y dispositivo para detectar mutaciones del gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad
asociadas con hipercolesterolemia familiar
<130> PCT-154
<160> 259
<150> E5200300206
<151> 28.01.03
<150> E5200302671
<151> 17.11.03
<210>SEQ ID NO.: 1 5 <211> 60.000
<212> polinucleótido
<213> humano
<220>
<221> gen 10 <223> rLDL
<400>
<210> SEQ ID NO.: 2
<211> 24
5 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido 10 <223> Ex1F
<400>
cacattgaaa tgctgtaaat gacg
<211> 24
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<221> oligonucleótido
<223> Ex1R
<400>
25 ctattctggc gcctggagca agcc
<210> SEQ ID NO.: 4
<211> 24
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex2F
10 <400> ttgagagacc ctttctcctt ttcc
<210> SEQ ID NO.: 5
<211> 20 15 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido 20 <223> Ex2R
<400>
gcatatcatg cccaaagggg
<211> 24
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<221> oligonucleótido
<223> Ex3F
<400>
35 ttcctttgag tgacagttca atcc
<210> SEQ ID NO.: 7
<211> 24
<212> polinucleótido 40 <213> secuencia artificial
<220>
- <221> oligonucleótido <223> Ex3R
- 5
- <400> gataggctca atagcaaagg cagg
- 10
- <210> SEQ ID NO.: 8 <211> 24 <212> polinucleótido <213> secuencia artificial
- 15
- <220> <221> oligonucleótido <223> Mut191-2F <400> acagttcaat cctgtctctt ctct
- 20
- <210> SEQ ID NO.: 9 <211> 10 <212> polinucleótido <213> secuencia artificial
- 25
- <220> <221> oligonucleótido <223> Ex4AF
- 30 35
- <400> gtggtctcgg ccatccatcc <210> SEQ ID NO.: 10 <211> 20 <212> polinucleótido <213> secuencia artificial <220> <221 > oligonucleótido <223> Ex4ARF
- 40
- <400> agccatcttc gcagtcgggg
<210> SEQ ID NO.: 11
<211> 12
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Mut 509insCR
<400>
cgagccatct tcgcagtcgg ag
<210> SEQ ID NO.: 12
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex4BF
<400>
cccccagctg tgggcctgcg
<210> SEQ ID NO.: 13
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex4BR
<400>
cgcccccacc ctgccccgcc
<210> SEQ ID NO.: 14
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex6F
<400>
tcctccttcc tctctctggc
<210> SEQ ID NO.: 15
<211 > 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex6R
<400>
tctgcaagcc gcctgcaccg
<210> SEQ ID NO.: 16
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> MutC255GF
<400>
ctctggctctc acagtgacac gc
<210> SEQ ID NO.: 17
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Mut E291 XR
<400>
gcaccgagac tcaccgcaat
<210> SEQ ID NO.: 18
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex7F
<400>
ggcgaaggga tgggtagggg
<210> SEQ ID NO.: 19
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex7R
<400>
gttgccatgt caggaagcgc
<210> SEQ ID NO.: 20
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex9F
<400>
cccctgacct cgctccccgg
<210> SEQ ID NO.: 21
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex9R
<400>
gctgcaggca ggggcgacgc
<210> SEQ ID NO.: 22
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex10F
<400>
atgcccttct ctcctcctgc
<210> SEQ ID NO.: 23
<211> 24
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex10R
<400>
agccctcagc gtcgtggata
<210> SEQ ID NO.: 24
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Mut1432delGF
<400>
gggacatcca ggcccccgcc
<210> SEQ ID NO.: 25 <211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex11F
<400>
tcctcccccg ccctccagcc
<210> SEQ ID NO.: 26
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex11R
<400>
gctgggacgg ctgtcctgcg
<210> SEQ ID NO.: 27
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex13F
<400>
gtcatcttcc ttgctgcctg
<210> SEQ ID NO.: 28
<211> 30
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex13R
<400>
ttccacaagg aggtttcaag gttggggggg
<210> SEQ ID NO.: 29
<211> 13
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> MutH635NR
<400>
acctcttggc tgggtcaggt tct
<210> SEQ ID NO.: 30
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex14F
<400>
aaatttctgg aatcttctgg
<210> SEQ ID NO.: 31
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex14R
<400>
gcagagagag gctcaggagg
<210> SEQ ID NO.: 32
<211> 22
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex15F
<400>
gaagggcctg cagcacgtgg ca
<210> SEQ ID NO.: 33
<211> 19
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex15R
<400>
tagggagggc ccagtcttt
<210> SEQ ID NO.: 34
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex17F
<400>
gggtctctgg tctcgggggc
<210> SEQ ID NO.: 35
<211> 22
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<223> Ex17R
<400>
ggctctggct ttctagagag gg
<210> SEQ ID NO.: 36
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgggtcggga cactgcctgg cag
<210> SEQ ID NO.: 37
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgggtcggga ccctgcctgg cag
<210> SEQ ID NO.: 38
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgccaggca gtgtcccgac ccg
<210> SEQ ID NO.: 39
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgccaggca gggtcccgac ccg
<210> SEQ ID NO.: 40
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atgcatttcc cgtcttggca ctg
<210> SEQ ID NO.: 41
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gatgcatttc cctcttggca ctg
<210> SEQ ID NO.: 42
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gatgcatttc ccgtcttggc actgg
<210> SEQ ID NO.: 43
<211> 25 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agatgcattt ccctcttggc actgg
<210> SEQ ID NO.: 44
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtctcttct gtagtgtctg tcacc
<210> SEQ ID NO.: 45
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtctcttctg tctgtgtctg tcacc
<210> SEQ ID NO.: 46
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgtctcttc tgtagtgtct gtcacct
<210> SEQ ID NO.: 47
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtctcttct gtctgtgtct gtcacct
<210> SEQ ID NO.: 48
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggccgtgtca accgctgcat tcc
<210> SEQ ID NO.: 49
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gccgtgtcaa ccgctgcatt c
<210> SEQ ID NO.: 50
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aggaatgcag cgtttgacac ggccc
<210> SEQ ID NO.: 51
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaggaatgca gcgtttgaca cggcccc
<210> SEQ ID NO.: 52
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctgtgggg gccgtgtcaa ccg
<210> SEQ ID NO.: 53
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctgtgggg gcgtgtcaac cgc
<210> SEQ ID NO.: 54
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido <400>
cggttgacac ggcccccaca gct
<210> SEQ ID NO.: 55
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcggttgaca cgcccccaca gct
<210> SEQ ID NO.: 56
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
caaggctgtc gtaagtgtgg c
<210> SEQ ID NO.: 57
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcaaggctgt cgtaagtgtg gcc
<210> SEQ ID NO.: 58
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
caaggctgtc gttaagtgtg gcc
<210> SEQ ID NO.: 59
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aaggctgtcg ttaagtgtgg c
<210> SEQ ID NO.: 60
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gacaacgacc ccgactgcga agatg
<210> SEQ ID NO.: 61
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gacaacgacc cccgactgcg aagat
<210> SEQ ID NO.: 62
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acaacgaccc cgactgcgaa gat
<210> SEQ ID NO.: 63
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acaacgaccc ccgactgcga aga
<210> SEQ ID NO.: 64
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcggccactc atccgagcca tct
<210> SEQ ID NO.: 65
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcggccactc acccgagcca tct
<210> SEQ ID NO.: 66
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgcggccact catccgagcc atctt
<210> SEQ ID NO.: 67
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgcggccact cacccgagcc atctt
<210> SEQ ID NO.: 68
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccagctggcg ctgtgatggt ggc
<210> SEQ ID NO.: 69
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccagctggcg ccgtgatggt ggc
<210> SEQ ID NO.: 70
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tccagctggc gctgtgatgg tggcc
<210> SEQ ID NO.: 71
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tccagctggc gccgtgatgg tggcc
<210> SEQ ID NO.: 72
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgcaaggac aaatctgacg aggaa
<210> SEQ ID NO.: 73
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgcaaggac aactgcggta tgggc
<210> SEQ ID NO.: 74
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actgcaagga caaatctgac gaggaaa
<210> SEQ ID NO.: 75
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actgcaagga caactgcggt atgggcg
<210> SEQ ID NO.: 76
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
caaatctgac gaggaaaact gcggt
<210> SEQ ID NO.: 77
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220> <221> oligonucleótido
<400>
caaatctgac gacaaatctg acgag
<210> SEQ ID NO.: 78
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acaaatctga cgaggaaaac tgcggta
<210> SEQ ID NO.: 79
<211> 27
<212> polinucleótido
<213 > secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acaaatctga cgacaaatct gacgagg
<210> SEQ ID NO.: 80
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gggtccctcg cagagtgtca ctg
<210> SEQ ID NO.: 81
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial <220>
<221> oligonucleótido
<400>
gggtccctcg ccgagtgtca ctg
<210> SEQ ID NO.: 82
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgggtccctc gcagagtgtc actgt
<210> SEQ ID NO.: 83
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgggtccctc gccgagtgtc actgt
<210> SEQ ID NO.: 84
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aacccatcaa agagtgcggt gag
<210> SEQ ID NO.: 85
<211> 23 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aacccatcaa atagtgcggt gag
<210> SEQ ID NO.: 86
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaacccatca aagagtgcgg tgagt
<210> SEQ ID NO.: 87
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaacccatca aatagtgcgg tgagt
<210> SEQ ID NO.: 88
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tcactctcgg gcccctacca
<210> SEQ ID NO.: 89
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tcactctcgg acccctaccc a
<210> SEQ ID NO.: 90
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cactctcggg cccctaccc
<210> SEQ ID NO.: 91
<211> 19
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cactctcgga cccctaccc
<210> SEQ ID NO.: 92
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400> acgagtgcct gtgcgccgac ggctt
<210> SEQ ID NO.: 93
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acgagtgcct gtacgccgac ggctt
<210> SEQ ID NO.: 94 <211>23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgagtgcctg tgcgccgacg gct
<210> SEQ ID NO.: 95
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgagtgcctg tacgccgacg gct
<210> SEQ ID NO.: 96
<211> 24
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido <400>
gcgaagatgc gaaggtgatt ccgg
<210> SEQ ID NO. : 97
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggcccagcga agatttccgg gtggg
<210> SEQ ID NO.: 98
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agcgaagatg cgaaggtgat ttccggg
<210> SEQ ID NO.: 99
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tggcccagcg aagatttccg ggtggga
<210> SEQ ID NO.: 100
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgaagaagag gtaggcgatg g
<210> SEQ ID NO.: 101
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cggttggtga agacgatgga g
<210> SEQ ID NO.: 102
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtgaagaaga ggtaggcgat gga
<210> SEQ ID NO.: 103
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggttggtg aagacgatgg agc
<210> SEQ ID NO.: 104
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctccatcgcc tacctcttct tcacc
<210> SEQ ID NO.: 105
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctccatcgcc taactcttct tcacc
<210> SEQ ID NO.: 106
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gctccatcgc ctacctcttc ttcacca
<210> SEQ ID NO.: 107
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gctccatcgc ctaactcttc ttcacca
<210> SEQ ID NO.: 108
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgccggttgg tgaagaagag gtagg
<210> SEQ ID NO.: 109
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtgccggttg gtgagaagag gtagg
<210> SEQ ID NO.: 110
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtgccggttg gtgaagaaga ggtaggc
<210> SEQ ID NO.: 111
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgtgccggtt ggtgagaaga ggtaggc
<210> SEQ ID NO.: 112
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
caatagaatc tactggtctg acctg
<210> SEQ ID NO.: 113
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
caatagaatc tagtggtctg acctg
<210> SEQ ID NO.: 114
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcaatagaat ctactggtct gacctgt
<210> SEQ ID NO.: 115
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcaatagaat ctagtggtct gacctgt
<210> SEQ ID NO.: 116
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggcccccgac gggctggctg tggac
<210> SEQ ID NO.: 117
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggcccccgac ggctggctgt ggact
<210> SEQ ID NO.: 118
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtccacagcc agcccgtcgg gggcc
<210> SEQ ID NO.: 119
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220> <221 > oligonucleótido
<400>
agtccacagc cagccgtcgg gggcc
<210> SEQ ID NO.: 120
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcgggagttc cccagtcagt ccagt
<210> SEQ ID NO.: 121
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcgggagttc cctagtcagt ccagt
<210> SEQ ID NO.: 122
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgggagttcc ccagtcagtc cag
<210> SEQ ID NO.: 123
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial <220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgggagttcc ctagtcagtc cag
<210> SEQ ID NO.: 124
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgtccccag aggatatggt tctct
<210> SEQ ID NO.: 125
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgtccccag agaatatggt tctct
<210> SEQ ID NO.: 126
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtccccaga ggatatggtt ctc
<210> SEQ ID NO.: 127
<211> 23 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtccccaga gaatatggtt ctc
<210> SEQ ID NO.: 128
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tggttctctt ccacaacctc acc
<210> SEQ ID NO.: 129
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tggttctctt caacaacctc acc
<210> SEQ ID NO.: 130
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atggttctct tccacaacct caccc
<210> SEQ ID NO.: 131
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atggttctct tcaacaacct caccc
<210> SEQ ID NO.: 132
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gctgaccttt agcctgacgg tggat
<210> SEQ ID NO.: 133
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctgacctt tagctgacgg tggat
<210> SEQ ID NO.: 134
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctgacctt tagcctgacg gtggatg
<210> SEQ ID NO.: 135
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gagctgacct ttagctgacg gtggatg
<210> SEQ ID NO.: 136
<211 > 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgctcctcgt cttcctttgc ctg
<210> SEQ ID NO.: 137
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgctcctcgg ggtctttgcc tgg
<210> SEQ ID NO.: 138
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtgctcctcg tcttcctttg cctgg
<210> SEQ ID NO.: 139
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtgctcctcg gggtctttgc ctggg
<210> SEQ ID NO.: 140
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gactcacagc acgtctcctg ggact
<210> SEQ ID NO.: 141
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gactcacagc acatctcctg ggact
<210> SEQ ID NO.: 142
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actcacagca cgtctcctgg gac
<210> SEQ ID NO.: 143
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actcacagca catctcctgg gac
<210> SEQ ID NO.: 144
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccatcgtggc agcgaaactc gtc
<210> SEQ ID NO.: 145
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atgcacttcc cacgtcctgg gag
<210> SEQ ID NO.: 146
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
catcgtggca gcgaaactcg t
<210> SEQ ID NO.: 147
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgcacttccc acgtcctggg a
210> SEQ ID NO.: 148
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex8F
<400>
cattggggaa gagcctcccc
210> SEQ ID NO.: 149
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex8R
<400>
gcctgcaagg ggtgaggccg
210> SEQ ID NO.: 150
<211> 20 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex12F
<400>
actggcatca gcacgtgacc
210> SEQ ID NO.: 151
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex12R
<400>
cgtgtgtcta tccggccacc
210> SEQ ID NO.: 152
<211> 20
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex16F
<400>
gcgctttcct gccgtgacca
210> SEQ ID NO.: 153
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Ex16R
<400>
cctgtccagg agaaaaagtg aac
210> SEQ ID NO.: 154
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido MutI771TF
<400>
cagtagcgtg agggctctgt caa
210> SEQ ID NO.: 155
<211> 19
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido Mut2389+4A>GR
<400>
ctgggggacc ggccggcgc
210> SEQ ID NO.: 156
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtcaagctg ggtgctgagg cag
210> SEQ ID NO.: 157
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtcaagctg gttgctgagg cag
210> SEQ ID NO.: 158
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtcaagctgg gtgctgaggc a
210> SEQ ID NO.: 159
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtcaagctgg ttgctgaggc a
210> SEQ ID NO.: 160
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggtccctcgc agagtgtcac tgt
210> SEQ ID NO.: 161
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggtccctcgc actgtgagag cca
210> SEQ ID NO.: 162
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtccctcgca gagtgtcact g
210> SEQ ID NO.: 163
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gtccctcgca ctgtgagagc c
210> SEQ ID NO.: 164
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccgtcggggg cctggatgtc t
210> SEQ ID NO.: 165
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cccgtcgggg tctggatgtc t
210> SEQ ID NO.: 166
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cccgtcgggg gcctggatgt ctc
210> SEQ ID NO.: 167
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcccgtcggg gtctggatgt ctc
210> SEQ ID NO.: 168
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggttggtg aagaagaggt aggcg
<210> SEQ ID NO.: 169
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cggttggtga agaaagaggt aggcg
<210> SEQ ID NO.: 170
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gccggttggt gaagaagagg taggcga
<210> SEQ ID NO.: 171
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggttggtg aagaaagagg taggcga
<210> SEQ ID NO.: 172
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221 > oligonucleótido
<400>
actggaagct ggcgggacca cag
<210> SEQ ID NO.: 173
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcactggaag ctgggaccac agg
<210> SEQ ID NO.: 174
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgtggtccc gccagcttcc agt
<10> SEQ ID NO.: 175
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cctgtggtcc cagcttccag tgc
<210> SEQ ID NO.: 176
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcgggagttc cccagtcagt c
<210> SEQ ID NO.: 177
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcgggagttc accagtcagt c
<210> SEQ ID NO.: 178
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggcgggagtt ccccagtcag tcc
<210> SEQ ID NO.: 179
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggcgggagtt caccagtcag tcc
<210> SEQ ID NO.: 180
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccccatcggt aagcgcgggc cgg
<210> SEQ ID NO.: 181
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccccatcggt aggcgcgggc cgg
<210> SEQ ID NO.: 182
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggcccgcg cttaccgatg ggg
<210> SEQ ID NO.: 183
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggcccgcg cctaccgatg ggg
<210> SEQ ID NO.: 184
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaaaagaggc tggcccaccc ctt
<210> SEQ ID NO.: 185
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaaaagaggc ttctccttgg ccg
<210> SEQ ID NO.: 186
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aaaagaggct ggcccacccc t
<210> SEQ ID NO.: 187
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
aaaagaggct tctccttggc c
<210> SEQ ID NO.: 188
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgccttcccg tgctcaccca cagcc
<210> SEQ ID NO.: 189
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cgccttcccg tgttcaccca cagcc
<210> SEQ ID NO.: 190
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggctgtgggt gagcacggga aggcg
<210> SEQ ID NO.: 191
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggctgtgggt gaccacggga aggcg
<210> SEQ ID NO.: 192
<211> 25 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actatctcca ccgtggtgag cccag
<210> SEQ ID NO.: 193
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
actatctcca ccatggtgag cccag
<210> SEQ ID NO.: 194
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgggctcac cacggtggag atagt
<210> SEQ ID NO.: 195
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgggctcac catggtggag atagt
<210> SEQ ID NO.: 196
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gggctctgtc cattgtcctc cccat
<210> SEQ ID NO.: 197
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gggctctgtc cactgtcctc cccat
<210> SEQ ID NO.: 198
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atggggagga caatggacag agccc
<210> SEQ ID NO.: 199
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
atggggagga cagtggacag agccc
<210> SEQ ID NO.: 200
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgcaacatgg ctagagactg ccggg
<210> SEQ ID NO.: 201
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgcaacatgg ctggagactg ccggg
<210> SEQ ID NO.: 202
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcaacatggc tagagactgc egg
<210> SEQ ID NO.: 203
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gcaacatggc tggagactgc cgg
<210> SEQ ID NO.: 204
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgctgatgac ggtgtcatag gaa
<210> SEQ ID NO.: 205
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgctgatgac gatgtcatag gaa
<210> SEQ ID NO.: 206
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gctgatgacg gtgtcatagg a
<210> SEQ ID NO.: 207
<211> 21
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<900>
gctgatgacg atgtcatagg a
<210> SEQ ID NO.: 208
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tccaaacttc actccatctc aag
<210> SEQ ID NO.: 209
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tccaaacttc agtccatctc aag
<210> SEQ ID NO.: 210
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cttgagatgg agtgaagttt gga
<210> SEQ ID NO.: 211
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cttgagatgg actgaagttt gga
<210> SEQ ID NO.: 212
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gccaagtgga ctgcgacaac ggctc
<210> SEQ ID NO.: 213
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<404>
gccaagtgga ctacgacaac ggctc
<210> SEQ ID NO.: 214
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gagccgttgt cgcagtccac ttggc
<210> SEQ ID NO.: 215
<211> 25 <212> polinucleótido
<113> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gagccgttgt cgtagtccac ttggc
<210> SEQ ID NO.: 216
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgctggcca gggacatgag gagct
<210> SEQ ID NO.: 217
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctgctggcca ggtacatgag gagct
<210> SEQ ID NO.: 218
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctcctcat gtccctggcc agcag
<210> SEQ ID NO.: 219
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agctcctcat gtacctggcc agcag
<210> SEQ ID NO.: 220
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctcgccgcgg cggggactgc aggta
<210> SEQ ID NO.: 221
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctcgccgcgg cgaggactgc aggta
<210> SEQ ID NO.: 222
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tacctgcagt ccccgccgcg gcgag
<210> SEQ ID NO.: 223
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tacctgcagt cctcgccgcg gcgag
<210> SEQ ID NO.: 224
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaccatcttg gaggatgaaa agagg
<210> SEQ ID NO.: 225
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gaccatcttg gacgatgaaa agagg
<210> SEQ ID NO.: 226
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido <400>
cctcttttca tcctccaaga tggtc
<210> SEQ ID NO.: 227
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cctcttttca tcgtccaaga tggtc
<210> SEQ ID NO.: 228
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gttttcctcg tcagatttgt ccttgca
<210> SEQ ID NO.: 229
<211> 27
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gttttcctcg tcacatttgt ccttgca
<210> SEQ ID NO.: 230
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ttttcctcgt cagatttgtc cttgc
<210> SEQ ID NO.: 231
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ttttcctcgt cacatttgtc cttgc
<210> SEQ ID NO.: 232
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ttgtccttgc agtcggggcc acta
<210> SEQ ID NO.: 233
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ttgtccttgc agacggggcc accat
<210> SEQ ID NO.: 234
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtccttgca gtcggggcca cca
<210> SEQ ID NO.: 235
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tgtccttgca gacggggcca cca
<210> SEQ ID NO.: 236
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agcccagtag cgtgagggct ctgtc
<210> SEQ ID NO.: 237
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
agcccagtag cgagagggct ctgtc
<210> SEQ ID NO.: 238
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gacagagccc tcacgctact gggct
<210> SEQ ID NO.: 239
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
gacagagccc tctcgctact gggct
<210> SEQ ID NO.: 240
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tcgccttgct cctcgccgcg gcggg
<210> SEQ ID NO.: 241
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tcgccttgct ccccgccgcg gcggg
<210> SEQ ID NO.: 242
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cccgccgcgg cgaggagcaa ggcga
<210> SEQ ID NO.: 243
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cccgccgcgg cggggagcaa ggcga
<210> SEQ ID NO.: 244
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
acggctacag ctacccctcg gtgag
<210> SEQ ID NO.: 245
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cggctacagc taccccctcg gtgag
<210> SEQ ID NO.: 246
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctcaccgagg ggtagctgta gccgt
<210> SEQ ID NO.: 247
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctcaccgagg gggtagctgt agccg
<210> SEQ ID NO.: 248
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cccaggagac gtgctgtgag tcccc
<210> SEQ ID NO.: 249
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220> <221> oligonucleótido
<400>
cccaggagac gtactgtgag tcccc
<210> SEQ ID NO.: 250
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggggactcac agcacgtctc ctggg
<210> SEQ ID NO.: 251
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ggggactcac agtacgtctc ctggg
<210> SEQ ID NO.: 252
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctccccatcg gtaagcgcgg gccgg
<210> SEQ ID NO.: 253
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ctccccatcg gtcagcgcgg gccgg
<210> SEQ ID NO.: 254
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggcccgcg cttaccgatg gggag
<210> SEQ ID NO.: 255
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccggcccgcg ctgaccgatg gggag
<210> SEQ ID NO.: 256
<211> 25
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
ccagtacatg aagctggtgg gaga
<210> SEQ ID NO.: 257
<211> 25 <212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
tcttgatctt ggcctgggga cagag
<210> SEQ ID NO.: 258
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cagtacatga agctggtggg agg
<210> SEQ ID NO.: 259
<211> 23
<212> polinucleótido
<213> secuencia artificial
<220>
<221> oligonucleótido
<400>
cttgatcttg gcctggggac aga
Claims (7)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Método in vitro para diagnosticar hipercolesterolemia familiar que comprende detectar, como mínimo, la mutación 313+1insT en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.
-
- 2.
- Método, según la reivindicación 1, que comprende además la detección de la mutación 313+1G>C.
-
- 3.
- Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, que comprende además la detección de la mutación Q71 E.
-
- 4.
- Método, según la reivindicación 1, que comprende además detectar una mutación seleccionada entre: (-23)A>C, 1054 del11, 108delC, 1197del9, 1207de1T, 1432delG, 191-2delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399de15ins4, 338dell6, 509insC, 675dell5, 684dup12, 941-39C>T, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X, T433N, 818de18, 1423delGC/insA, 1204insT, 451de13, G516X, 2389+4A>G, 1815del11, 1186+5G>A, T740M, I771T, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G(-2)R, E579D, S205C, D200V, V766E, L(-6)P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [1587-5de15;1587de131].
-
- 5.
- Método, según la reivindicación 1, que comprende hibridar los oligonucleótidos que tienen las secuencias SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59 con el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.
-
- 6.
- Método, según la reivindicación 1, que comprende detectar un grupo de mutaciones que comprende: 313+linsT, 313+1G>C y Q71E en el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1, a partir de una muestra biológica de un individuo.
-
- 7.
- Kit para diagnosticar hipercolesterolemia familiar en una muestra biológica de un individuo, que comprende los oligonucleótidos que tienen las secuencias: SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 59 que hibridan con el gen del r-LDL representado por SEQ ID NO: 1.
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-
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