RU2627115C2 - Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний - Google Patents
Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний Download PDFInfo
- Publication number
- RU2627115C2 RU2627115C2 RU2015155617A RU2015155617A RU2627115C2 RU 2627115 C2 RU2627115 C2 RU 2627115C2 RU 2015155617 A RU2015155617 A RU 2015155617A RU 2015155617 A RU2015155617 A RU 2015155617A RU 2627115 C2 RU2627115 C2 RU 2627115C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- type
- hereditary
- syndrome
- biochip
- stage
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7057—(Intracellular) signaling and trafficking pathways
- G01N2800/7066—Metabolic pathways
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
- G01N2800/7057—(Intracellular) signaling and trafficking pathways
- G01N2800/7066—Metabolic pathways
- G01N2800/7076—Amino acid metabolism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями, включающий детекцию точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа и наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно. Изобретение позволяет диагностировать наследственные заболевания в кратчайшие сроки. 2 ил., 5 табл.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, а именно к молекулярно-генетическим методам одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутов: 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, тирозинемии 1А типа и наследственной глухоты.
Данные проведенных многолетних медико-генетических исследований в области наследственных болезней населения Республики Саха (Якутия) показали на накопление мажорных мутаций, характерных для якутской этнической группы, во много раз превышающие частоты в мировых популяциях. Эти исследования дополнены демографическими сведениями, свидетельствующими о достаточно высоком уровне изоляции, что обуславливает высокую гомогенность популяции (см. Респираторный дистресс-синдром у новорожденных - новый клинический признак у якутских больных с 3-М синдромом? / Н.Р. Максимова, А.Н. Ноговицына, А.Л. Сухомясова, В.А. Аргунов // Педиатрия. - 2009. - №3, Т. 87. - С. 53-57; Пузырев. В.П. Наследственные болезни у якутов / В.П. Пузырев, Н.Р. Максимова // Генетика. - 2008. - №10. - С. 1308-1314; Сухомясова, А.Л. Аутосомно-доминантная миотоническая дистрофия в Республике Саха (Якутия): автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.15 / Айталина Лукична Сухомясова. - Томск, 2005. - 22 с.).
В таблице 1 приведены частоты наследственных болезней в популяциях по всему миру, где показано, что распространенность заболеваний варьируется в зависимости от популяции. Например, в популяции якутской этнической группы частоты носительства врожденной глухоты 1А типа, 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии достаточно велики, что свидетельствует об острой проблеме выявления носительства данных заболеваний у здорового населения для снижения генетического груза населения Республики Саха (Якутия).
Известно, что 3М синдром (OMIM 273750) - наследственный синдром низкорослости, среди населения России найден только в популяционной выборке у якутов (см. Клиническая характеристика синдрома 3-М у якутских пациентов и подходы к ДНК-диагностики в Республике Саха (Якутия) / Н.Р. Максимова, А.Н. Ноговицына, И.А. Николаева [и др.] // Медицинская генетика. - 2007. - №12, Т. 6. - С. 35-38). Аутосомно-рецессивный тип наследования. Ген CUL7 состоит из 26 экзонов и кодирует белок Cullin 7. Мутация - 4582insT.
SOPH синдром (OMIM 614800) - синдром низкорослости с колбочковой дисфункцией, атрофией зрительных нервов и пельгеровской аномалией лейкоцитов. Вызывается мутацией в гене NBAS (5741 G→А) (в результате аминокислотной замены R1914H).
Наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия (OMIM 250800) - наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, проявляющееся цианозом кожных покровов и слизистых, одышкой, головной болью, умственной отсталостью. Вызвано мутацией гена диафоразы (DIA1), с. 806 С→Т, приводящей к замене Pro269Leu фермента NADH-цитохром-b5-редуктазы.
Тирозинемия 1А типа (OMIM 276700) - заболевание аминокислотного обмена (аминоацидопатия), обусловленное недостаточностью фумарилацетоацитат гидролазы, приводящей к тяжелой патологии печени и почек. Заболевание вызвано мутацией в 13 экзоне гена FAH, замена 1090 G>C, приводящей к замене Glu 364Gln в гомозиготном состоянии.
Несиндромальная глухота 1А типа (OMIM 220290) - врожденная глухота, генетической причиной которой является мутация IVS1+1G>A в гене GJB2, локализованном в хромосомной области 13q11-q13 и кодирующий коннексин 26 (Сх26).
Наследственные заболевания не излечимы и единственным способом снижения частоты данных заболеваний является их профилактика. Для осуществления их диагностики на практике в настоящее время используются методы ДНК-диагностики, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и ПЦР-ПДРФ. К сожалению, современные методы рутинной ДНК-диагностики не позволяют широко их внедрить в программы скрининга населения из-за сложности, дороговизны и длительности выполнения анализов.
Известен способ выявления мутаций в гене GJB2, сопровождающихся развитием несиндромальной аутосомно-рецессивной глухоты (см. RU №2317547, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, опубл. 20.02.2008), включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции и амплификацию одновременно трех участков гена GJB2 в смеси трех пар последовательностей олигонуклеотидов: (35delG) (F) 5' cttttccagagcaaaccgccc 3', (R) 5' tgctggtggagtgtttgttcac 3'; (167delT) (F) 5' atgagcaggccgactttgtctg 3' (R) 5' gtgggagatggggaagtagtga 3'; (235delC) (F) 5' acgatcactacttccccatctc 3'; (R) 5' actaggagcgctggcgtggac 3', фланкирующих области с возможным содержанием мутаций 35delC.
Способ диагностики 3М синдрома в якутской популяции методом ПЦР (см. RU №2315310, МПК G01N 33/50, C12Q 1/68, опубл. 20.01.2008) предусматривает использование оригинальных праймеров для выявления мутации 4582 insT (Arg 1528 Ser) в гене Куллин 7 (CUL7), характерной для якутской популяции, с последующим проведением ПДРФ-анализа и использованием рестриктазы Hinfl.
Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека (см. RU №2458131, МПК C12N 15/11, C12Q 1/68, C12N 15/12, C12N 15/55, опубл. 10.08.2012), которая представляет собой биочип для детекции мутаций и полиморфизмов генов. При этом тест-система представлена набором олигонуклеотидов, позволяющих выявлять точковые мутации в генах FAN SERPINA1, которые вызывают соответственно тирозинемию 1 типа и недостаточность альфа-1-антитрипсина.
Кроме того, известен способ диагностики мутации Pro269Leu (С. 806 С-Т) в гене DIA1, ответственной за развитие метгемоглобинемии I типа методом лигазной реакции (см. заявку RU №2007143468, МПК C12Q 1/68, C12Q 1/48, опубл. 10.06.2009).
Недостатком известных решений является то, что они позволяют проводить диагностику лишь на единичные заболевания по отдельности, при этом достаточно трудоемкие, требуют больших затрат на реактивы и расходные материалы, кроме того, характерны длительной продолжительностью времени для проведения анализа, в особенности тех способов, которые основаны на методе ПЦР-ПДРФ, и, как результат, достаточно труднодоступны для широкого круга населения, для скрининга популяций и всех желающих.
По данным анализа литературных источников и проведенного патентного поиска, способов одновременной диагностики частых наследственных заболеваний, мутаций (4582insT, 5741G/A, P269L, IVS1+1G>A, 1090G>C): 3M синдрома, SOPH синдрома, тирозинемии 1 типа, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа, наследственной несиндромальной глухоты 1А типа с использованием способов на основе биочипов не выявлено из уровня техники.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание способа одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутской популяции, такие, как 3М синдром, SOPH синдром, наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия, тирозинемия 1А типа и наследственная глухота.
Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в создании биочипа и способа его использования для исследования ДНК человека на наличие мутаций, позволяющего диагностировать наследственные заболевания в кратчайшие сроки и, тем самым, повышающего общедоступность диагностических работ для населения.
Для решения поставленной задачи способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями для детекции точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH, и GJB2, вызывающих, соответственно, 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа, наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, включает следующие стадии:
1) проведение двухстадийной мультиплексной ПЦР с использованием специфичных для каждого участка генов праймеров и флуоресцентно меченых праймеров для второй стадии ПЦР;
2) проведение реакции гибридизации полученных продуктов ПЦР;
3) обработку результатов анализов с помощью сканера для регистрации флуоресцентных сигналов с гибридизованных на биочипе ампликонов;
4) интерпретация результатов.
При этом набор праймеров для первой стадии амплификации участков генов CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2 составляют олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' AAGGATATCCAGGAGGTATGCACT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAAT 3', (R) 5' TCTTGAGCTTCGTCTTCTGAGTTTCTT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CAGGACCCGCCTAGGAGCGCAGGA 3', (R) 5' GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' CCACACGTCAGCTTACCTGGTCTCTC 3', (R) 5' CGTGCCCGGCCCTCAGAAGACGAAGC 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' CCTCACCTGTTATGATGACTTCATC 3'.
Для второй стадии полимеразной цепной реакции праймерами являются олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' Cy5-TCTCCACTGAGTGAGTGATCAGCAT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAA 3', (R) 5' Cy5-GTCTTAATAGCCTTTCT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CCGCGCTTCCTCCCGACGCAG 3', (R) 5' Cy5-GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' TTCGTGAATGAGGAGATGATCCGGG 3', (R) 5' Cy5-GGGAAGGCAGGCGTACTGGATCATG 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' Cy5-CAGCAGAAACTTCCTGGTCTGACCAT 3'.
Кроме того, на этапе гибридизации полученных продуктов полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными мишенями на биочипе, используется биочип, мишенями для иммобилизации на котором являются олигонуклеотиды: 5' NH2-CGTCTCAAAAGAAAAAAAAAAAGGTA 3', 5' NH2-
CGTCTCAAAAGTAAAAAAAAAAAGGTA 3'; 5' NH2-TGGAAGCCCGTAAAGAG 3', 5' NH2-TGGAAGCCCATAAAGAG 3'; 5' NH2-AGGAGGAGCCGCTGGTGCTG 3', 5' NH2-AGGAGGAGCTGCTGGTGCTG 3'; 5' NH2-GCTCCATGTTGGAACTGTCGTGG 3', 5' NH2-GCTCCATGTTGCAACTGTCGTGG 3'; 5' NH2-CCCGACGCAGGTGAGCCCGC 3', 5' NH2-CCCGACGCAGATGAGCCCGC 3'.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Совокупность признаков изобретения обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение молекулярно-генетического способа одновременной диагностики наследственных заболеваний, наиболее часто встречаемых заболеваний среди якутов.
Основной отличительной особенностью заявленного решения является использование биочипа, на поверхности которого иммобилизованы олигонуклеотиды, которые позволяют одномоментно диагностировать пять наследственных заболеваний, характерных для якутской популяции: 3М синдром, SOPH синдром, наследственная энзимопеническая метгемоглобинемия, тирозинемия 1А типа и врожденной глухоты.
Состав мутаций, выявляемых с помощью биочипа, оптимизирован и строго специфичен для этнических групп населяющих Россию на протяжении долгого времени. Таким образом, эффективность и информативность генетической диагностики наследственных заболеваний с применением данного биочипа гораздо выше, чем с применением имеющихся аналогов.
Учитывая недостатки классических методов диагностики данных заболеваний в настоящее время, существует потребность в разработке быстрого, легкого в исполнении и экономически эффективного метода ДНК-диагностики, для осуществления которого не требуется дорогостоящего оборудования, но при этом позволяющего проводить диагностику с высокой чувствительностью и специфичностью.
В настоящем техническом решении предложено использование биочипа для ДНК-диагностики частых наследственных заболеваний - 3М синдрома, SOPH синдрома, наследственной энзимопенической метгемоглобинемии, тирозинемии 1А типа, и врожденной глухоты.
В ходе исследований было установлено, что именно с отбором исследуемых мутаций связана эффективность и информативность диагностики на конкретной территории, которые увеличиваются за счет того, что для диагностики взяты самые распространенные и специфичные для этой территории мутации.
Преимуществами настоящего решения являются: высокая чувствительность и специфичность, значительная быстрота и легкость исполнения диагностики, не требуемая высококвалифицированного специально обученного персонала и дорогостоящего оборудования, относительно низкая себестоимость одного анализа (на одну мутацию), возможность использования, как для диагностики взрослых индивидуумов, так и в пренатальном скрининге.
При этом существует возможность выявить носительство мутации, как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии.
Данный способ включает в себя несколько аспектов:
1) набор праймеров для амплификации участков генов Cul7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию, тирозинемию 1А типа, врожденную глухоту, соответственно. Последовательности праймеров изложены в таблицах 2а и 2б.
2) биочип для выявления мутаций в вышеописанных генах, вызывающие соответствующие наследственные заболевания, с иммобилизованными на нем олигонуклеотидными мишенями (маркерами). Последовательности мишеней представлены в таблице 3.
3) тест-система включает набор для проведения двухстадийной мультиплексной ПЦР, в составе которого имеется набор специфичных для каждого участка генов праймеров и флуоресцентно меченых праймеров для второй стадии ПЦР, а также набор для гибридизации, включающий в себя сам биочип с мишенями.
Заявленное изобретение позволяет проводить диагностику одновременно по пяти мутациям (4582insT, 5741G/A, P269L, IVS1+1G>A, 1090G>C) на одном биочипе, позволяя идентифицировать мутацию, как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии, которые наиболее распространены на территории республики Саха (Якутия) среди якутской этнической группы (см. таблицу 4).
Дизайн праймеров тест-системы для осуществления ПЦР проводился, отталкиваясь от решения фланкировать целевые участки генов, где один из праймеров в каждой паре для проведения второй стадии мультиплексной ПЦР являются флуоресцентно мечеными. Праймеры для второй стадии ПЦР подбирались с учетом того, чтобы в конечном результате были получены преимущественно одноцепочечные флуоресцентно меченые продукты, комплементарные мишеням, иммобилизованным на подложке биочипа. Для этого в каждой паре праймер для второй ПЦР, содержащий флуоресцентный краситель добавляется в молярном избытке по отношению ко второму праймеру и выбирается из цепи, последовательность которой комплементарна последовательности мишеней на биочипе. При этом в качестве флуоресцентной метки используется краситель Cy5, относящийся к циановым красителям. Возможно использование также и других, например FAM, HEX, ALEXA и т.д.
В качестве подложки биочипа было принято решение использовать предметное стекло стандартных размеров. Поверхность стекла хорошо поддается химической обработке и модификации реактивными группами для крепления на нем мишеней. Для активации необходимо формирование реактивного альдегидного слоя на поверхности при помощи силановых соединений, которые являются линкерами между неорганической поверхностью и органической структурой реактивных соединений. Ковалентное крепление мишеней выполняется путем формирования оснований Шиффа между амино-модифицированными олигонуклеотидными мишенями и альдегидными группами на поверхности стекла. Печать биочипов выполняется печатающей станцией, например как Piezoarray от Perkin Elmer, бесконтактным способом принтинга.
Мишени подбирались в соответствии с участком ДНК с искомой мутацией, а также с диким типом данного гена.
Диагностика на тест-системе на основе биочипа включает в себе следующие этапы:
1. Отбор проб.
Геномная ДНК выделяется классическим методом хлороформной экстракции из венозной крови, сухой крови на фильтровальной бумаге и буккального соскоба.
2. Проведение амплификации ПЦР, состоящей из двух этапов (стадий): ПЦР1 и ПЦР2. Оба этапа ПЦР являются мультиплексными, с использованием пяти пар праймеров, позволяющих амплифицировать участки ДНК, содержащие сайты мутаций, ответственных за развитие всех пяти заболеваний. Второй этап ПЦР отличается от первого этапа продуктами ассиметричной амплификации, которые должны быть флуоресцентными и одноцепочечными для гибридизации их с мишенями на биочипе.
При этом рекомендуется использовать образцы ДНК с концентрацией 1-300 нг/мкл.
Для каждого образца готовится рабочая смесь, включающая в себя амплификационный буфер, содержащий ПЦР буфер и смесь dNTP, смесь праймеров для ПЦР1, ДНК-полимеразу, тестируемую ДНК для первого этапа, и продукт ПЦР1 для второго этапа. Общий объем смеси должен составлять 25 мкл.
Реакция первого этапа ПЦР проводится по следующей программе:
Программа для второго этапа ПЦР:
3. Проведение реакции гибридизации.
Одноцепочечные, флуоресцентно меченые продукты второго этапа ПЦР наносятся на поверхность биочипа для формирования гибридов специфично связанных водородной связью комплементарных участков ампликона и мишеней на биочипе с использованием гибридизационного буфера в условиях водяной бани при температуре от 40°C до 60°C в течение 1 часа. Осевшие на слайд в процессе гибридизации ампликоны с комплементарной последовательностью, выделяют свечение, которое и являются опорным объектом при регистрации результатов.
После гибридизации биочип промывается в дистиллированной воде для удаления неспецифично связанных продуктов.
4. Обработка результатов анализа.
Для визуализации гибридов, ампликонов соединенных с пробами на биочипе, необходим сканер для регистрации флуоресцентных сигналов с гибридизованных на биочипе ампликонов, например Scan Ri, Perkin Elmer. Биочип совместим со всеми сканерами для чипов стандартного размера 75×25×1 мм.
5. Интерпретация результатов.
Для анализа результатов используется персональный компьютер с программой, разработанной производителем сканера, с индивидуально заданными параметрами. Основным условием для правильного вывода результата является наличие сигналов в поле дикого типа, что является контролем прохождения всех этапов реакции.
Для снижения вероятности ошибки поле анализа представлено на биочипе в четырех повторах.
Заявленное решение иллюстрируется чертежами, где на фигуре 1 показана схема расположения мишеней на биочипе, а на фигуре 2 - пример результата анализа ДНК с мутантной гомозиготой P269L в гене DIA1.
В схеме мишеней обозначены (см. фиг. 1): 1 - поле, содержащее мишени дикого типа, 2 - поле, содержащее мишени мутантного типа, 3 - контрольная полоса, 4 - 3М синдром, 5 - SOPH синдром, 6 - метгемоглобинемия 1 типа, 7 - глухота, 8 - тирозинемия. При этом все мишени должны быть нанесены в вертикальных дублях. Зоны А1-А5 представляют собой мишени, соответствующие дикому типу генов по исследуемым мутациям. Зоны В1-В5 соответствуют мутантным аллелям. Зона С1-С5 является маркером для позиционирования координатной маски (двумерной координатной сетки, отражающей положение точек на графическом изображении, полученном при сканировании).
Критерием правильности работы тест-системы является наличие сигналов в поле дикого типа, что является контролем прохождения всех этапов реакции. Все сигналы в поле дикого типа должны присутствовать для всех образцов ДНК, за исключением случаев анализа образцов ДНК мутантной гомозиготы. В этом случае в мутантном поле должны светиться точки, отсутствующие в поле дикого типа.
При визуальном анализе должны быть учтены следующие условия:
1) вывод о наличии мутации основывается на сравнении интенсивности сигналов топографически сходных точек в полях А1-А5 и В1-В5. То есть, А1 и B1, А2 и В2, A3 и В3, А4 и В4, А5 и В. Положительным сигналом в «мутантном поле» считается сигнал, интенсивность которого равноценна или отличается от интенсивности топографически соответствующей точки в поле «дикого типа» не более, чем в два раза. При этом возможны следующие варианты результатов (на примере полей А1 и В1):
1. присутствие сигнала в А1 и отсутствие в В1. Вывод: гомозигота - дикий тип по мутации 4582insT в гене CUL7;
2. присутствие сигналов и в А1 и в В1. Вывод: гетерозигота по мутации 4582insT в гене CUL7;
3. отсутствие сигнала в А1 и присутствие в В1. Вывод: гомозигота по мутации 4582insT в гене CUL7.
В случае дикого типа по всем анализируемым мутациям все точки в зоне А1-А5 должны давать положительные сигналы при этом не должно быть положительных сигналов в зоне В1-В5.
2) Если в поле дикого типа отсутствует более одной пары точек, и при этом нет сигнала в поле мутаций, то результаты анализа считаются недействительными для интерпретации. В этом случае рекомендуется повторение ПЦР.
На примере результата анализа ДНК с мутантной гомозиготой P269L в гене DIA1 (см. фиг. 2) в координатах A1, В1 выставлены точки мутаций - 4582insT, CUL7, А2, В2 - мутации 5741G>A, NBAS, A3, В3 - мутации P269L, DIA1, А4, В4 - IVS1+1G>A, GBJ2, А5, В5 - 1090G>C, FAH, в гомозиготном и гетерозиготном состоянии соответственно, полоса С представляет контроль гибридизации. В данном случае визуализируются сигналы в координатах В3, что указывает на мутацию в гомозиготном состоянии.
В виду высокой частоты встречаемости данных наследственных заболеваний исключительно на территории Республики Саха (Якутия) и труднодоступности диагностики их в других регионах России, заявленное решение может быть успешно внедрено в клиническую практику.
Claims (5)
- Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний на основе использования биочипа с иммобилизованными на его поверхности олигонуклеотидными мишенями для детекции точковых мутаций в генах CUL7, NBAS, DIA1, FAH и GJB2, вызывающих 3М синдром, SOPH синдром, наследственную энзимопеническую метгемоглобинемию 1 типа, тирозинемию 1 типа, наследственную несиндромальную глухоту 1А типа, соответственно, включающий следующие стадии:
- - двухстадийной мультиплексной полимеразной цепной реакции с использованием специфичных для каждого участка гена праймеров в ходе первой стадии ПЦР и флуоресцентно меченых праймеров на второй стадии полимеразной цепной реакции, при этом для первой стадии полимеразной цепной реакции праймерами являются олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' AAGGATATCCAGGAGGTATGCACT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAAT 3', (R) 5' TCTTGAGCTTCGTCTTCTGAGTTTCTT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CAGGACCCGCCTAGGAGCGCAGGA 3', (R) 5' GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' CCACACGTCAGCTTACCTGGTCTCTC 3', (R) 5' CGTGCCCGGCCCTCAGAAGACGAAGC 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' CCTCACCTGTTATGATGACTTCATC 3'; для второй стадии полимеразной цепной реакции праймерами являются олигонуклеотиды: для 3М синдрома (F) 5' CCCTCAGCTTGCAGGTACGTCTGA 3', (R) 5' Cy5-TCTCCACTGAGTGAGTGATCAGCAT 3'; для SOPH синдрома (F) 5' TTGTTCTAACTCATTAACACTTGCTGAA 3', (R) 5' Cy5-GTCTTAATAGCCTTTCT 3'; для наследственной несиндромальной глухоты 1А типа (F) 5' CCGCGCTTCCTCCCGACGCAG 3', (R) 5' Cy5-GCCGGGCAACCGCTCTGGGTCTC 3'; для наследственной энзимопенической метгемоглобинемии 1 типа (F) 5' TTCGTGAATGAGGAGATGATCCGGG 3', (R) 5' Cy5-GGGAAGGCAGGCGTACTGGATCATG 3'; для тирозинемии 1 типа (F) 5' GGAGCCAGAAAACTTCGGCTCCATG 3', (R) 5' Cy5-CAGCAGAAACTTCCTGGTCTGACCAT 3';
- - гибридизации полученных продуктов полимеразной цепной реакции с олигонуклеотидными мишенями на биочипе, при этом мишенями, используемыми для иммобилизации на биочипе, являются олигонуклеотиды: 5' NH2-CGTCTCAAAAGAAAAAAAAAAAGGTA 3', 5' NH2-CGTCTCAAAAGTAAAAAAAAAAAGGTA 3'; 5' NH2-TGGAAGCCCGTAAAGAG 3', 5' NH2-TGGAAGCCCATAAAGAG 3'; 5' NH2-AGGAGGAGCCGCTGGTGCTG 3', 5' NH2-AGGAGGAGCTGCTGGTGCTG 3'; 5' NH2-GCTCCATGTTGGAACTGTCGTGG 3', 5' NH2-GCTCCATGTTGCAACTGTCGTGG 3'; 5' NH2-CCCGACGCAGGTGAGCCCGC 3', 5' NH2-CCCGACGCAGATGAGCCCGC 3';
- - регистрации флуоресцентных сигналов с гибридизованных на биочипе ампликонов;
- - интерпретации результатов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155617A RU2627115C2 (ru) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015155617A RU2627115C2 (ru) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015155617A RU2015155617A (ru) | 2017-06-29 |
| RU2627115C2 true RU2627115C2 (ru) | 2017-08-03 |
Family
ID=59309545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015155617A RU2627115C2 (ru) | 2015-12-24 | 2015-12-24 | Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2627115C2 (ru) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739889C1 (ru) * | 2020-04-22 | 2020-12-29 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ диагностики мутации 35delG (rs80338939) гена GJB2 |
| RU2746055C1 (ru) * | 2020-04-22 | 2021-04-06 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ диагностики мутации c.-23+1G>A (rs80338940) гена GJB2 |
| RU2819985C1 (ru) * | 2024-03-15 | 2024-05-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова" | Способ диагностики варианта SOPH c.5741G>A в гене NBAS |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111785323A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-16 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种基于遗传疾病致病基因的分析系统及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458131C1 (ru) * | 2010-12-07 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта | Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека |
-
2015
- 2015-12-24 RU RU2015155617A patent/RU2627115C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2458131C1 (ru) * | 2010-12-07 | 2012-08-10 | Федеральное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта | Тест-система для определения мутаций в генах фумарилацетоацетат гидролазы и альфа-1-антитрипсина человека |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NOGOVITSYNA A.N. et al. Genetic Testing for Hereditary Diseases with Autosomal-Recessive Type of Inheritance in the Republic of Sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 89-100NOGOVITSYNA A.N. et al. Medical-genetic service of the population republic of sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 4-13MAKSIMOVA N. et al. Neuroblastoma amplified sequence gene is associated with a novel short staturesyndrome characterised by optic nerve atrophy and Pelger-Huet anomaly. J Med Genet. 2010 Aug; 47(8): 538-548. Epub 2010 Jun 24ИВАНОВА О.Н. и др. Наследственная тирозинемия I типа. Тихоокеанский медицинский журнал. 2013; 4: 107-108PAVLOVA K.K. et al. Neonatal Screening for Cystic Fibrosis in Republic Sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 141-146. * |
| RU 2458131 C1, 10.07.2011NOGOVITSYNA A.N. et al. Genetic Testing for Hereditary Diseases with Autosomal-Recessive Type of Inheritance in the Republic of Sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 89-100NOGOVITSYNA A.N. et al. Medical-genetic service of the population republic of sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 4-13MAKSIMOVA N. et al. Neuroblastoma amplified sequence gene is associated with a novel short staturesyndrome characterised by optic nerve atrophy and Pelger-Huet anomaly. J Med Genet. 2010 Aug; 47(8): 538-548. Epub 2010 Jun 24ИВАНОВА О.Н. и др. Наследственная тирозинемия I типа. Тихоокеанский медицинский журнал. 2013; 4: 107-108PAVLOVA K.K. et al. Neonatal Screening for Cystic Fibrosis in Republic Sakha (Yakutia). Yakut Medical Journal. 2014; 2(46): 141-146. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2739889C1 (ru) * | 2020-04-22 | 2020-12-29 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ диагностики мутации 35delG (rs80338939) гена GJB2 |
| RU2746055C1 (ru) * | 2020-04-22 | 2021-04-06 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ диагностики мутации c.-23+1G>A (rs80338940) гена GJB2 |
| RU2819985C1 (ru) * | 2024-03-15 | 2024-05-28 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова" | Способ диагностики варианта SOPH c.5741G>A в гене NBAS |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015155617A (ru) | 2017-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU718670B2 (en) | Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of HLA types | |
| US8980555B2 (en) | Rapid genotyping analysis and devices thereof | |
| US20150322526A1 (en) | Composition, kit, and method for diagnosing adhd risk | |
| Chiou et al. | Array-based resequencing for mutations causing familial hypercholesterolemia | |
| RU2627115C2 (ru) | Способ одновременной диагностики наследственных заболеваний | |
| CN111560428B (zh) | 检测线粒体DNA rs3937033单核苷酸多态性的物质的用途 | |
| US9057103B2 (en) | Method for detecting mutations at IL28B and ITPA | |
| JP6596724B1 (ja) | 白髪の遺伝的素因の判定方法 | |
| JP6053681B2 (ja) | イヌの緑内障を診断する方法及びキット | |
| Chiou et al. | Detection of common sequence variations of familial hypercholesterolemia in Taiwan using DNA mass spectrometry | |
| EP2471949A1 (en) | Method for the identification by molecular techniques of genetic variants that encode no D antigen (D-) and altered C antigen (C+W) | |
| CN106868128B (zh) | 一组辅助诊断乳腺癌的生物标记物及其应用 | |
| KR20170049768A (ko) | 피부 색상 및 흑화 민감도 진단용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
| JP2021065123A (ja) | シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法 | |
| WO2021053383A1 (en) | Method for preventing progression to metabolic syndrome | |
| JP2007166962A (ja) | アルツハイマー病の予測または診断の方法 | |
| CN110305947A (zh) | 染色体长片段插入的检测方法及基于MassARRAY平台的长片段插入检测方法 | |
| US11939630B2 (en) | Fluorescent PCR method for detecting HLA-B*15:02 allele and specific primer probe combination thereof | |
| RU2798695C1 (ru) | Способ диагностики мукополисахаридоз-плюс синдрома | |
| NL2029449B1 (en) | Fluorescent pcr method for detecting hla-b*15:02 allele and specific primer probe combination thereof | |
| KR20170051748A (ko) | 피부 보습 진단용 단일염기다형성 마커 및 이의 용도 | |
| US8216787B2 (en) | Biomarker for successful aging without cognitive decline | |
| RU2617936C2 (ru) | Способ экспресс-анализа генетического полиморфизма для выявления генетической предрасположенности к раку молочной железы | |
| WO2015129018A1 (ja) | イヌの緑内障を診断する方法及びキット | |
| JP2021073993A (ja) | イヌ白内障の検査方法、イヌ白内障の検査をするための試薬、及びイヌ白内障の検査キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20171116 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20191225 |
|
| NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20211215 |