JP2021065123A - シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】個人のシワ・タルミの遺伝的素因を正確かつ簡便に判定する手段を提供すること。【解決手段】被験者から採取したDNA含有試料について、１種又は２種以上の特定の塩基配列における３６番目の位置の一塩基多型（SNP）部位のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。【選択図】なし
Description
本発明は、シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法に関する。より詳しくは、シワ・タルミに関連する一塩基多型(SNP)を検出することによる、シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法、及び該方法に用いるキットに関する。
皮膚のハリや弾力性は加齢とともに減少していくが、このハリや弾力性に主に関与しているのが真皮のコラーゲンである。老化に伴う皮膚のシワやタルミは、真皮のコラーゲンの減少に加え、ヒアルロン酸の減少、異常な弾性線維の蓄積等によるものとされており、真皮の線維芽細胞の機能の低下がその原因と考えられている。一般的に、シワ・タルミの生じ易さには個人差があることが知られており、近年ではシワ等の生じ易さを判別する様々な方法が検討されている。例えば、特許文献１、２では、特定の遺伝子や一塩基多型（SNP）をマーカーとすることにより個体のシワ等の肌の形状に対する素因を診断する方法が開示されている。しかしながら、これらに開示されている方法では、シワ・タルミの評価は表面上の測定値を用いるのみであり、その潜在的なシワ・タルミの生じ易さという生物学的なパラメータを対象としておらず、シワ・タルミの生じ易さの判定精度が十分なものではなかった。
本発明の課題は、個人のシワ・タルミの遺伝的素因を正確かつ簡便に判定する手段を提供することにある。
本発明者らは、年齢・性別が異なるサンプル提供者を対象にゲノムワイド関連解析(GWAS)を用いて一塩基多型(SNP)を網羅的に解析したところ、シワ・タルミの遺伝的素因（シワ・タルミの生じ易さ）に関連する一塩基多型(SNP)と遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
[１] 被験者から採取したDNA含有試料について、以下の(a1)〜（a11)の1種又は2種以上の一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
(a1) 配列番号1に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs115495415で特定されるSNP）
(a2) 配列番号2に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs10440086で特定されるSNP）
(a3) 配列番号3に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs9388359で特定されるSNP）
(a4) 配列番号4に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs11777753で特定されるSNP）
(a5) 配列番号5に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7865502で特定されるSNP）
(a6) 配列番号6に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs2505084で特定されるSNP）
(a7) 配列番号7に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7945278で特定されるSNP）
(a8) 配列番号8に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs1729388で特定されるSNP）
(a9) 配列番号9に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs12284381で特定されるSNP）
(a10) 配列番号10に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs61896561で特定されるSNP）
(a11) 配列番号11に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs4963488で特定されるSNP）
[２] 被験者から採取したDNA含有試料について、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
[３] [１]又は[２]に記載の方法により判定された結果に基づいて、被験者のシワ・タルミの遺伝的素因の程度に応じたシワ・タルミの予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法。
[４] 配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、及び／又は、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定するためのキット。
[５] SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現変化を指標とする、シワ・タルミの予防及び／又は改善剤のスクリーニング方法。
[６] SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現を制御する素材を含有する、シワ・タルミの予防及び／又は改善用組成物。
[１] 被験者から採取したDNA含有試料について、以下の(a1)〜（a11)の1種又は2種以上の一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
(a1) 配列番号1に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs115495415で特定されるSNP）
(a2) 配列番号2に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs10440086で特定されるSNP）
(a3) 配列番号3に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs9388359で特定されるSNP）
(a4) 配列番号4に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs11777753で特定されるSNP）
(a5) 配列番号5に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7865502で特定されるSNP）
(a6) 配列番号6に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs2505084で特定されるSNP）
(a7) 配列番号7に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7945278で特定されるSNP）
(a8) 配列番号8に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs1729388で特定されるSNP）
(a9) 配列番号9に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs12284381で特定されるSNP）
(a10) 配列番号10に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs61896561で特定されるSNP）
(a11) 配列番号11に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs4963488で特定されるSNP）
[２] 被験者から採取したDNA含有試料について、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
[３] [１]又は[２]に記載の方法により判定された結果に基づいて、被験者のシワ・タルミの遺伝的素因の程度に応じたシワ・タルミの予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法。
[４] 配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、及び／又は、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定するためのキット。
[５] SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現変化を指標とする、シワ・タルミの予防及び／又は改善剤のスクリーニング方法。
[６] SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現を制御する素材を含有する、シワ・タルミの予防及び／又は改善用組成物。
本発明の方法によれば、被験者の生体試料に存在するゲノム由来のDNAに含まれる一塩基多型（SNP)のアレルを検出することにより、該被験者がシワ・タルミになる遺伝的素因を有するか（シワ・タルミが生じ易いか）を正確かつ簡便に判定することができる。よって、この判定結果に基づき、シワ・タルミの予防や改善のための対策を早期に講じることができる。
１．シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法
本発明のシワ・タルミの遺伝的素因の判定方法は、被験者から採取したDNA含有試料について、以下の(a1)〜（a11)の1種又は2種以上の一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む。
(a1) 配列番号1に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs115495415で特定されるSNP）
(a2) 配列番号2に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs10440086で特定されるSNP）
(a3) 配列番号3に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs9388359で特定されるSNP）
(a4) 配列番号4に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs11777753で特定されるSNP）
(a5) 配列番号5に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7865502で特定されるSNP）
(a6) 配列番号6に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs2505084で特定されるSNP）
(a7) 配列番号7に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7945278で特定されるSNP）
(a8) 配列番号8に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs1729388で特定されるSNP）
(a9) 配列番号9に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs12284381で特定されるSNP）
(a10) 配列番号10に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs61896561で特定されるSNP）
(a11) 配列番号11に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs4963488で特定されるSNP）
本発明のシワ・タルミの遺伝的素因の判定方法は、被験者から採取したDNA含有試料について、以下の(a1)〜（a11)の1種又は2種以上の一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む。
(a1) 配列番号1に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs115495415で特定されるSNP）
(a2) 配列番号2に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs10440086で特定されるSNP）
(a3) 配列番号3に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs9388359で特定されるSNP）
(a4) 配列番号4に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs11777753で特定されるSNP）
(a5) 配列番号5に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7865502で特定されるSNP）
(a6) 配列番号6に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs2505084で特定されるSNP）
(a7) 配列番号7に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7945278で特定されるSNP）
(a8) 配列番号8に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs1729388で特定されるSNP）
(a9) 配列番号9に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs12284381で特定されるSNP）
(a10) 配列番号10に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs61896561で特定されるSNP）
(a11) 配列番号11に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs4963488で特定されるSNP）
上記の(a1)〜（a11)のSNPを含む塩基配列（［］内はSNPを表す）を表１に示す。
後述の実施例のゲノムワイド関連解析（GWAS)結果に示すように、上記(a1)〜（a11)のSNPは、p値が1×10-5未満となるものであり、シワ・タルミの遺伝的素因と統計学的に関連が示唆されたものである。また、本発明において特定された上記の(a1)〜（a11)のSNPが、近傍(100kb以内）に存在するか、当該SNPにより発現が変動することが文献的に知られている遺伝子として、下記表２に示すSH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3が同定された。よって、本発明によれば、被験者から採取したDNA含有試料について、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因の判定方法が提供される。
一塩基多型（single nucleotide polymorphism：SNP、以下、「SNP」と記載する場合がある）とは、一般的には、遺伝子の塩基配列が1箇所だけ異なる状態及びその部位をいう。また、多型とは、一般的には、母集団中1%以上の頻度で存在する２以上の対立遺伝子（アレル）をいう。本発明における「SNP」は、当業者が自由に利用可能な公開されたデータベースである米国国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information ：NCBI)のSNPデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/）に登録されたSNPであって、そのリファレンス番号であるrs番号により特定できる。
本明細書において「アレル」とは、あるSNP部位において取りうる、互いに異なる塩基を有するそれぞれの型をいう。また、本明細書において「遺伝型」とは、あるSNP部位において、対立するアレルの組み合わせをいう。あるSNP部位において、前記組み合わせである遺伝型には3つの型があり、同じアレルの組み合わせをホモ型とよび、異なるアレルの組み合わせをヘテロ型という。例えば、(a1)のrs115495415で特定されるSNPにおいて対立するアレルの組み合わせである遺伝型には、A/A型、A/G型、G/G型の3つの型が存在する。
本発明の判定方法において、「一塩基多型（SNP)のアレルを検出する」とは、そのSNPのアレルの塩基の種類を同定することを意味し、「一塩基多型（SNP)のアレルを検出する」の態様には、当該SNPの一方のアレルを検出すること、当該SNPの両方のアレルを検出すること、当該SNPの遺伝型を同定することを含むものとする。
本発明の判定方法においては、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有する（シワ・タルミが生じ易い）と判定する。具体的には、(a1)〜（a11)の一塩基多型(SNP)において、下記表３に示すリスクアレルが、少なくとも一方のアレルにおいて検出されれば、該リスクアレルが検出されない場合と比較して、シワ・タルミの遺伝的素因を有する（シワ・タルミが生じ易い）、例えば、年齢に相応しないシワ・タルミが発生する可能性が高く、将来シワ・タルミになる可能性が相対的に高いと判定でき、シワ・タルミの遺伝的素因を有する（シワ・タルミが生じ易い）程度が高いと判定できる。
例えば、(a1)のrs115495415で特定されるSNPの場合は、その遺伝型がG／G型であることが、A／G型又はA／A型である場合よりもシワ・タルミが生じ易いことを示し、その遺伝型がA／G型であることが、A／A型である場合よりもシワ・タルミが生じ易いことを示す。すなわち、G／G型、A／G型、A／A型の順で、シワ・タルミの生じ易さが高いことを示す。
本発明の判定方法において、被験者の人種は、特に限定はされないが、好ましくは東アジア人、より好ましくは日本人である。ここで、東アジア人とは、日本、朝鮮、中国、台湾及びモンゴルの人々のいずれかを起源に持つ人をいう。
本発明の判定方法において用いるDNA含有試料としては、被験者より採取されたDNAを含有する生体試料であれば、特に限定されない。DNA含有試料に含まれるDNAは、ゲノムDNAであることが好ましいが、検出するSNPが、プロモーター等の非転写領域や、イントロン等のRNAスプライシングにより除かれる領域以外の、mRNA中に存在する領域に位置するSNPである場合には、ゲノムDNAの代わりにmRNAやtotal RNAを含む生体試料を使用してもよい。DNA含有試料としては、例えば、ゲノムDNAを採取可能な任意の体液、分泌液、組織、細胞、組織や細胞の培養物等を使用することができ、具体的には、被験者の唾液、血液、尿、喀痰、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、口腔（内頬）粘膜ぬぐい液、涙腺分泌液、汗、毛髪、爪、皮膚、粘膜、皮膚付着後に剥がしたテープストリップ等が挙げられるが、容易性及び低侵襲性の点から、唾液が好ましい。当該試料は、一般的な臨床検査で行われている方法に従って採取し、公知の抽出方法、精製方法を用いて調製することができる。その際、市販のゲノムDNA抽出キットを使用することができる。
SNPの検出及びSNPの型の判定（SNPタイピング）の方法は、特に制限されず、例えばアレル特異的プライマー（及びプローブ）を用い、PCR法等により増幅し、増幅産物の多型を蛍光又は発光によって検出する方法など、公知の方法により行うことできる。例えば、PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)法、PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)法、PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide)法、ダイレクトシークエンス(direct sequencing)法、ASO(Allele Specific Oligonucleotide)ハイブリダイゼーション法、ASP-PCR(Allele Specific Primer-PCR)法、Snapshot法、ARMS(Amplification Refracting Mutation System)法、TaqMan PCR法、インベーダー法、MALDI-TOF/MS法、RNase A切断法、DOL(Dye-labeled Oligonucleotide Ligation)法、TDI（Template-directed Dye-terminator Incorporation）等が挙げられる。上記方法はいずれも当業者に周知の方法であり、また、SNPの型の判定のための試薬やキットも市販されており、例えば、TaqMan SNP Genotyping Assays (Thermo Fisher Scientific社製）等を用いることができる。
上記の判定方法により得られた結果は、被験者がシワ・タルミの予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を選択する上で有用な指標となり、例えば、シワ・タルミの遺伝的素因を有する（シワ・タルミが生じ易い）と判定された被験者は、年齢に関係なく、シワ・タルミを予防する対策を推奨できる。よって、本発明の別の側面によれば、上記の判定方法により得られた結果に基づいて、被験者のシワ・タルミの遺伝的素因（シワ・タルミの生じ易さ）の程度に応じたシワ・タルミの予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法もまた提供される。
２．シワ・タルミの遺伝的素因の判定用キット
上記のSNPの検出及びタイピング方法では、各方法に応じたプローブやプライマーが使用される。このようなプローブやプライマーもまた本発明の範囲に包含され、キットとして提供できる。
上記のSNPの検出及びタイピング方法では、各方法に応じたプローブやプライマーが使用される。このようなプローブやプライマーもまた本発明の範囲に包含され、キットとして提供できる。
プローブとしては、上記のSNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判別できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列の36番目の塩基を含む連続する少なくとも10塩基以上、好ましくは15塩基以上の配列又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。プローブの長さは好ましくは15〜40塩基、より好ましくは20〜35塩基である。また、プローブは、適当な標識物質で標識されていてもよく、標識物質としては、例えば、酵素(ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等)、蛍光物質（FITC、RITC、Cy3、Cy5等）、発光物質（ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニン等）、放射性同位元素（3H、14C、32P、125I、131I等）、ビオチン、ジゴキシゲニン、タグ配列を含むポリペプチド等が挙げられる。あるいは、蛍光物質の近傍に該蛍光物質の発する蛍光エネルギーを吸収するクエンチャー（消光物質）がさらに結合されていてもよい。
また、プローブは固相に固定されていてもよい（DNAアレイ）。DNAアレイは、同一平面上に配置した多数のプローブに対してサンプルDNAをハイブリダイズさせ、当該平面をスキャンすることによって、各プローブに対するハイブリダイズを同時に検出することが可能である。よって、多数のSNP部位を同時に解析するには、DNAアレイは有用である。アレイに搭載するプローブとなるオリゴヌクレオチドは、通常in situで合成される。例えば、リソグラフィー方式（Thermo Fisher Scientific社）、インクジェット方式(Agilent社)、ビーズアレイ方式(Illumina社)等によるオリゴヌクレオチドのin situ合成法が知られている。
また、プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列の36番目の塩基を含む領域を増幅したり、シークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマーは、該SNP部位を含む領域のDNAを鋳型として、該SNP部位に向かって相補鎖合成を開示することができるオリゴヌクレオチドであればよく、このようなプライマーの長さは10〜30塩基が好ましく、15〜25塩基がより好ましい。プライマーは、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、SNP部位の上流または下流の位置に設定することができる。
当業者であれば、SNP部位を含む周辺DNA領域の塩基配列情報を基に、解析手法に応じたプローブ及びプライマーを設計することができる。また、プローブ及びプライマーとなるオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの合成法として当技術分野で公知の方法、例えば、ホスホロアミダイト法、H−ホスホネート法等により、通常用いられるDNA自動合成装置を利用して合成することが可能である。
本発明のキットには、上記のプローブ及びプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドを少なくとも含んでいればよい。また、当該キットには、必要に応じて、DNA抽出用試薬、PCR用緩衝液やDNAポリメラーゼ等のPCR用試薬、染色剤や電気泳動用ゲル等の検出用試薬、固定化担体、標識物質、標識の検出に用いられる基質化合物、陽性や陰性の標準試料、キットの使用方法を記載した指示書等を含めることもできる。なお、キット中の試薬は溶液でも凍結乾燥物でもよい。
３．シワ・タルミ予防及び／又は改善剤のスクリーニング方法
上述のとおり、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3は、上記の(a1)〜（a11)のSNPが、その近傍(100kb以内）に存在するか、SNPにより発現が変動することが文献的に知られている遺伝子である。
上述のとおり、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3は、上記の(a1)〜（a11)のSNPが、その近傍(100kb以内）に存在するか、SNPにより発現が変動することが文献的に知られている遺伝子である。
よって、本発明の別の側面によれば、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子(以下、「シワ・タルミ感受性遺伝子」という）の発現変化を指標とする、シワ・タルミの予防及び／又は改善剤のスクリーニング方法が提供される。
本発明のスクリーニング方法は、シワ・タルミ感受性遺伝子の発現の評価に適切な細胞を用いる方法であれば、特に限定はされないが、典型的には、細胞におけるシワ・タルミ感受性遺伝子の発現量を測定する方法が挙げられる。より具体的には、本発明のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で上記シワ・タルミ感受性遺伝子を発現する細胞を培養し、同細胞におけるシワ・タルミ感受性遺伝子の発現量を測定する工程、被験物質の非存在下（対照）における同細胞におけるシワ・タルミ感受性遺伝子の発現量を測定する工程、被験物質の存在下で測定した発現量が、被験物質の非存在下で測定した発現量に比べて有意に増加又は減少した場合に、当該被験物質をシワ・タルミの予防及び／又は改善剤の候補物質として選択する工程を行うことにより、行うことができる。
本発明において、被験試料及び対照試料におけるシワ・タルミ感受性遺伝子の発現量は、当業者に公知の任意の方法により測定することができ、また、測定は、各方法の常法に従って実施すればよい。遺伝子の発現量とは、遺伝子の転写産物であるmRNA量をいう。mRNA量の測定は、所望のmRNA量を測定できる方法であれば特に限定されず、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば、シワ・タルミ感受性遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとした遺伝子増幅法、又は、シワ・タルミ感受性遺伝子にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプローブとしたハイブリダイゼーション法を利用することができる。具体的には、RT-PCR法、リアルタイムRT-PCR法、マイクロアレイ法、ノーザンプロット法、ドットブロット法、RNアーゼプロテクションアッセイ法などが挙げられる。上記の方法に用いるプライマーやプローブは、標識し、当該標識のシグナル強度を調べることによりmRNA量を測定することができる。なかでも、リアルタイムRT-PCR法はRNAを直接サンプルに使用でき、遺伝子増幅過程を光学的に測定することで増幅に必要な温度サイクルの回数から遺伝子定量が可能である上で好ましい。なお、上記の方法に用いるプライマー及びプローブはシワ・タルミ感受性遺伝子の塩基配列をGenBank等のデータベースより取得し、当該塩基配列に基づいて当業者であれば適宜設計し、調製することができる。各方法について様々なプロトコルが報告されており、当業者であれば公知のプロトコルに従い、又は公知のプロトコルを適宜修正や変更を行い実施することができる。
また、本発明のスクリーニング方法の別の態様として、シワ・タルミ感受性遺伝子を発現する細胞として、レポーター遺伝子をシワ・タルミ感受性遺伝子の転写調節領域に作動可能に連結したプラスミドを導入した細胞を用い、レポーター遺伝子の発現量を測定してもよい。レポーター遺伝子としては、例えばGFP遺伝子、GUS遺伝子、LUS遺伝子等が挙げられる。
スクリーニングに用いる被験物質は、主に医薬品及び／又は飲食品に利用できる成分を対象とし、例えば、動・植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品；天然に生じる分子（例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、ステロイド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど）；あるいは天然に生じる分子の合成アナログ又は誘導体（例えば、ペプチド擬態物など）；及び天然に生じない分子（例えば、コンビナトリアルケミストリー技術等を用いて作製した低分子有機化合物）；ならびにそれらの混合物などを挙げることができる。また、被験物質としては単一の被験物質を独立に試験しても、いくつかの候補となる被験物質の混合物（ライブラリーなどを含む）について試験をしてもよい。複数の被験物質を含むライブラリーとしては、合成化合物ライブラリー、ペプチドライブラリーなどが挙げられる。
上記スクリーニング方法により選択されるシワ・タルミの予防及び／又は改善物質は、化粧品、医薬品、医薬部外品、飲食品等のシワ・タルミの予防及び／又は改善用組成物への配合成分として使用できる。よって、本発明のさらなる別の側面によれば、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現を制御する素材を含有する、シワ・タルミの予防及び／又は改善用組成物が提供される。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）シワ・タルミの遺伝的素因（シワ・タルミの生じ易さ）に関連する一塩基多型(SNP)の同定
本試験を実施するにあたり、同意書、シワ・タルミに関するアンケート、及び遺伝型判定について、自社における倫理審査委員会によって承認を受けた。同意書のサインにて同意を受けたサンプル提供者よりサンプル採取を行い、遺伝型判定、アンケート解析、及びゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。
本試験を実施するにあたり、同意書、シワ・タルミに関するアンケート、及び遺伝型判定について、自社における倫理審査委員会によって承認を受けた。同意書のサインにて同意を受けたサンプル提供者よりサンプル採取を行い、遺伝型判定、アンケート解析、及びゲノムワイド関連解析(GWAS)を行った。
(1) DNAサンプル
自社社員をDNAサンプル提供の対象者とした。このうち募集に応じた643人（男性259人、女性384人）の唾液を採取した。採取した唾液からMaxwell RSC Stabilized Saliva DNA Kit（プロメガ社製）を使用してゲノムDNAを抽出し、DNAサンプルを得た。
自社社員をDNAサンプル提供の対象者とした。このうち募集に応じた643人（男性259人、女性384人）の唾液を採取した。採取した唾液からMaxwell RSC Stabilized Saliva DNA Kit（プロメガ社製）を使用してゲノムDNAを抽出し、DNAサンプルを得た。
(2) 遺伝型の決定
得られたDNAサンプルについて、アジア人のゲノムに見られる頻度の高いSNP解析用プローブが搭載された遺伝型解析用チップAxiom(登録商標) Genome-Wide CHB 1 & CHB 2 Array（Thermo Fisher Scientific）を用いて遺伝型の決定を行った。遺伝型データはAxiom Analysis Suite 4.0（Thermo Fisher Scientific）を用いて得た。
得られたDNAサンプルについて、アジア人のゲノムに見られる頻度の高いSNP解析用プローブが搭載された遺伝型解析用チップAxiom(登録商標) Genome-Wide CHB 1 & CHB 2 Array（Thermo Fisher Scientific）を用いて遺伝型の決定を行った。遺伝型データはAxiom Analysis Suite 4.0（Thermo Fisher Scientific）を用いて得た。
(3)クオリティコントロール
PLINK 1.9（www.cog-genomics.org/plink/1.9/）を利用して、遺伝型データから未確認血縁性を除去するために、PI_HAT=0.25以上の個体ペアを検出し、それぞれのペアについて、個体Call Rate値の悪い個体を解析対象から除外した。
PLINK 1.9（www.cog-genomics.org/plink/1.9/）を利用して、遺伝型データから未確認血縁性を除去するために、PI_HAT=0.25以上の個体ペアを検出し、それぞれのペアについて、個体Call Rate値の悪い個体を解析対象から除外した。
PLINK 1.9（www.cog-genomics.org/plink/1.9/）を利用して、遺伝型データから多次元尺度構成法によるクラスタリングを実施し、また、出身地に関するアンケートデータと合わせて、日本人由来の個体を選択した。クオリティコントロールにより解析対象として選択した個体数は631個体（男性255人、女性376人）であった。
(4) 表現型データ
シワ・タルミに関するアンケート項目は、「眉間のシワ」、「額外側部のシワ」、「目頭のシワ」、「目じりのシワ」、「ほうれい線」、「口角のシワ」、「目もとのタルミ」の7項目それぞれについて、見た目の老化度を6段階に分けた画像から、現在の自分と近しい画像を１つ回答するものであり、各回答は間隔尺度として扱った。
シワ・タルミに関するアンケート項目は、「眉間のシワ」、「額外側部のシワ」、「目頭のシワ」、「目じりのシワ」、「ほうれい線」、「口角のシワ」、「目もとのタルミ」の7項目それぞれについて、見た目の老化度を6段階に分けた画像から、現在の自分と近しい画像を１つ回答するものであり、各回答は間隔尺度として扱った。
(5) 関連解析
遺伝型データと表現型データとの関連性について、R 3.6.1 (https://cran.r-project.org/)を利用して、構造方程式モデリング（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＳＥＭ）によって評価した。具体的には、図1のように、7項目のシワ・タルミに関する表現型データは、個人における潜在的なシワ・タルミの生じ易さという生物学的なパラメータとしての「シワ・タルミ要因」という潜在変数からの影響を受けて、観測されるものと仮定する。また、その「シワ・タルミ要因」は、遺伝型データのマイナーアレルの本数、及び年齢、性別、日光曝露傾向に関するアンケートの回答等から影響を受けると仮定して構造方程式モデリングを行い、前記マイナーアレルの本数の回帰係数のp値を評価した。前記構造方程式モデリングにより算出したp値が1×10-5未満となるSNP11個を表現型との関連性があるものとして抽出した。
遺伝型データと表現型データとの関連性について、R 3.6.1 (https://cran.r-project.org/)を利用して、構造方程式モデリング（Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｅｑｕａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ：ＳＥＭ）によって評価した。具体的には、図1のように、7項目のシワ・タルミに関する表現型データは、個人における潜在的なシワ・タルミの生じ易さという生物学的なパラメータとしての「シワ・タルミ要因」という潜在変数からの影響を受けて、観測されるものと仮定する。また、その「シワ・タルミ要因」は、遺伝型データのマイナーアレルの本数、及び年齢、性別、日光曝露傾向に関するアンケートの回答等から影響を受けると仮定して構造方程式モデリングを行い、前記マイナーアレルの本数の回帰係数のp値を評価した。前記構造方程式モデリングにより算出したp値が1×10-5未満となるSNP11個を表現型との関連性があるものとして抽出した。
表現型との関連が示唆されたSNPについて、HaploReg v4.1（https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php）を利用して、SNPの近傍の遺伝子(100kb以内）、及び当該SNPにより発現が変動することが文献的に知られている遺伝子のアノテーションを行った。
(6) 結果
以上の解析から、シワ・タルミの遺伝的素因（シワ・タルミの生じ易さ）と関連性があり、個人のシワ・タルミの生じ易さを判定できるSNPとして11個のSNPを特定した（表４）。特定した各SNPのSNP ID（NCBI dsSNP)、当該SNPが存在する染色体番号及び物理位置、アレル及びリスクアレルの塩基、遺伝型のp値を示す。p値の欄において、それぞれのｐ値は10を底とする指数形式で表示され、符号Eの前後に記載された数値はそれぞれｐ値を指数形式で表示した際の仮数部と指数部を示す。
以上の解析から、シワ・タルミの遺伝的素因（シワ・タルミの生じ易さ）と関連性があり、個人のシワ・タルミの生じ易さを判定できるSNPとして11個のSNPを特定した（表４）。特定した各SNPのSNP ID（NCBI dsSNP)、当該SNPが存在する染色体番号及び物理位置、アレル及びリスクアレルの塩基、遺伝型のp値を示す。p値の欄において、それぞれのｐ値は10を底とする指数形式で表示され、符号Eの前後に記載された数値はそれぞれｐ値を指数形式で表示した際の仮数部と指数部を示す。
また、当該SNPの近傍の遺伝子(100kb以内)（表４、遺伝子(I)）、及び当該SNPにより発現が変動することが文献的に知られている遺伝子（表４、遺伝子(II))としてSH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3を見出した。
本発明の方法により、サンプル提供者がシワ・タルミの遺伝的素因を有するかどうか、将来シワ・タルミが発生する可能性の有無や程度を、正確かつ簡便に判定することができる。よって、その判定結果に基づき、サンプル提供者にカスタマイズしたシワ・タルミ予防や改善のための化粧品やサプリメントを提供すること、またシワ・タルミ予防や改善のためのケア方法に関するカウンセリングやアドバイスを行うことが可能となる。
Claims (6)
- 被験者から採取したDNA含有試料について、以下の(a1)〜（a11)の1種又は2種以上の一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
(a1) 配列番号1に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs115495415で特定されるSNP）
(a2) 配列番号2に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs10440086で特定されるSNP）
(a3) 配列番号3に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs9388359で特定されるSNP）
(a4) 配列番号4に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs11777753で特定されるSNP）
(a5) 配列番号5に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7865502で特定されるSNP）
(a6) 配列番号6に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs2505084で特定されるSNP）
(a7) 配列番号7に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs7945278で特定されるSNP）
(a8) 配列番号8に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs1729388で特定されるSNP）
(a9) 配列番号9に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs12284381で特定されるSNP）
(a10) 配列番号10に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs61896561で特定されるSNP）
(a11) 配列番号11に示される塩基配列の36番目の塩基におけるSNP（SNP:ID rs4963488で特定されるSNP） - 被験者から採取したDNA含有試料について、SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子に関連する一塩基多型（SNP）のアレルを検出する工程と、検出されるアレルの塩基の少なくとも一つがリスクアレルである場合に、該被験者がシワ・タルミの遺伝的素因を有すると判定する工程を含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定する方法。
- 請求項１又は２に記載の方法により判定された結果に基づいて、被験者のシワ・タルミの遺伝的素因の程度に応じたシワ・タルミの予防及び／又は改善作用を有する化粧料及び／又は飲食品を該被験者に提供する、化粧料及び／又は飲食品の提供方法。
- 配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む10塩基以上の配列、又はその相補配列を有するプローブ、及び／又は、配列番号1〜11のいずれかに示される塩基配列において、36番目の塩基を含む領域を増幅することのできるプライマーを含む、シワ・タルミの遺伝的素因を判定するためのキット。
- SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現変化を指標とする、シワ・タルミの予防及び／又は改善剤のスクリーニング方法。
- SH3RF3、SEPT10、FAM19A1、NKAIN2、KIAA1462、INCENP、SCGB2A1、SCGB1D1、SCGB1D2、SCGB2A2、SCGB1D4、PTPN2、MTAP、RAB3IL1、及びFADS3からなる群より選択される1種又は2種以上の遺伝子の発現を制御する素材を含有する、シワ・タルミの予防及び／又は改善用組成物。
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