JPH03502522A - インターロイキン‐２レセプターおよびヒトリンパ向性レトロウイルスの遺伝子発現を調節する遺伝子およびそれらにコードされるタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−２レセプターおよびヒトリンパ向性レトロウィルスの遺伝子 発現を調節する遺伝子およびそれらにコードされるタンパク質米国法典３５．８ ２０２（Ｃ）の規定に従って、アメリカ合衆国政府がこの発明について権利を有 することをここに承認する。この発明の基金の一部はＮＩＨから拠出されている 。

１、序　論 本発明はＲｐｔ−１（調節タンパク質Ｔリンパ球−１）と呼ばれる遺伝子に関す る。このものは活性化ＣＤ４′″細胞に比較して休止ＣＤ４＋インデユーサーＴ 細胞によって高レベルで発現される。本発明はまたかかる遺伝子によってコード される、ｒｐｔ−１タンパク質と呼ばれるタンパク質にも関する。ｒｐｔ−ｔは 、インターロイキン−２レセプターα鎖遺伝子のプロモーター領域によってまた はヒトリンパ向性レトロウィルスの長い末端重複のプロモーター領域によって指 示される遺伝子発現を調節する。本発明のタンパク質および核酸はエイズのよう な免疫疾患の診断および治療に価値がある。

２、発明の背景 ２．１．　Ｔ細胞遺伝子発現 インデューサー下細胞、細胞障害性Ｔ細胞およびサプレッサーＴ細胞のクローン によって生成された細胞タンパク質およびウィルスタンパク質の分析によれば、 各Ｔ細胞のサブセットは抗原による活性化の前後に特定のタンパク質合成パター ンを特定するよう遺伝子的にプログラムされていることが示される（Ｎａｂｅｌ 、　Ｇ、ら、１９８１、　Ｃｅ１ｌ　２３：１９−２８；　Ｆｒｅｓｎｏ、　Ｍ 、ら、１９８２．　　Ｃｅ１ｌ　３０ニア０７−？１３；　Ｚａｇｕｒｙ、　Ｄ 、ら、１９８６．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３１：８６０−８６３）。

例えば後天性免疫不全症候群（エイズ）、　　ＨＩＶ−１に関連したレトロウィ ルスの発現レベルは、感染したインデューサー下細胞の活性化によって著しく増 大す□　る　（Ｚａｇｕｒｙ、　　Ｄ、ら、１９８６．　５ｃｉｅｎｃｅ　２３ １＋８６０−８６３；Ｋｌａｔｚｍａｎｎ、　Ｄ、とＧｌｕｃｋｍａｎ、　Ｊ、 　Ｃ，，１９８６，Ｉｍｍｕｎｏｌ。

Ｔｏｄａｙ　７：２９１−２９６；　Ｎａｂｅｌ、　Ｇ、とＢａｌｔｉｍｏｒｅ 、　Ｄｏ、１９８７゜Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７１１−７１３；　Ｔａｎｇ−Ｓ ｔａｒｋｓｅｎ、　Ｓ、　Ｅ、　、１９８７．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：６８４５）。休止お よび活性化されたＴ細胞における遺伝子発現を調節する細胞内タンパク質は記載 されている（例えばＮａｂｅｌ、　Ｇ、とＢａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｄ、、１９８ ７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７１１−７１３；　Ｔｏｎｇ−３ｔａｒｋｓｅｎ 、　　Ｓ、Ｅ、ら、１９８７．　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓ ｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　８４：６８４５）。

２．２．インターロイキン−２レセプターＴ細胞は造血細胞の免疫調節に影響す る種々のポリペプチドを分泌しており、そしてそれ自体その細胞表面にある特異 なレセプターと相互作用するホルモンペブチドによる調節を受は易い。インター ロイキン−２は本来Ｔ細胞増殖因子と呼ばれ、マクロファージ由来インターロイ キン−１の存在下で抗原またはレクチンによって活性化されたＴリンパ球で合成 され分泌されて、そして特異的な高アフィニティ膜レセプターと相互作用して生 物学的作用を及ぼす（Ｓｍｉｔｈ、　Ｋ、Ａ、、１９８０゜Ｉｍｍｕｎｏｌ、　 Ｒｅｖ、　　５１：３３７−３５７；　Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、　　Ｊ、ら、１ ９８３゜Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０ ：６９５７−６９６１）　ｏインターロイキン−２レセプター（ＩＬ−２ｒ、Ｔ ａｃ抗原）は休止期のＴリンパ細胞やＢリンパ細胞の表面には存在しない。特異 的な抗原またはマイトジェンにより活性化されると、Ｔ細胞増殖がオートクリン メカニズムにより媒介され、それにより活性化された細胞がインターロイキン− ２（１１、−２）を分泌しそしてまた■Ｌ−２の細胞表面レセプタ・−（ＩＬ− ２ｒ）を発現する（Ｍｉｅｒ、　Ｊ、　Ｗ、とＧａ１ｌｏ、　Ｒ，Ｃ，，１９８ ０，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　　７７：６１３４；　Ｒｏｂｂ、　 Ｒ，Ｊ、ら、１９８１゜Ｊ、　　ＥＸＩＴ、　Ｍｅｄ、　　１５４：１４５５； 　Ｌｅｏｎａｒｄ、　Ｗ、　　Ｊ、　　ら、１９８２゜Ｎａｔｕｒｅ　　３００ 二２６７；　　Ｍｅｕｅｒ、　　　Ｓ、　　　Ｃ，ら、　　１９８４．　　　Ｐ ｒｏｅ、　　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８Ｉ：１５０９；　Ｔｓｕｄｏ、　 Ｍ、ら、１９８４．　　Ｊ。

ＥＸＩＩｌ、　Ｍｅｄ、　　１６０：６１２−６１７；　Ｗａｌｄｍａｎｎ、　 Ｔ、　　Ａ、ら、１９８４゜Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０：１４５０−１ ４６６）。

ＩＬ−２とその細胞表面レセプターとの相互作用により継続的なＴ細胞増殖を生 じる（Ｇｒｅｅｎｅ、　Ｗ、Ｃ，とＬｅｏｎａｒｄ、Ｗ、Ｊ、、１９８６．Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、４：　　６９−９５；　　Ｓｍ１ｔｈ、　　Ｋ、 　　Ａ、、１９８４．　　Ａｎｎ、　　Ｒｅｖ、　　Ｉｍｏ＋ｕｎｏ１．　２： 　３１９−３３３）。ＩＬ−２ｒを測定するとリンパ集団の免疫活性化の状態に 関する情報が得られる。これはフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡を用いて 細胞表面上のＩＬ−２ｒを測定することにより行われている。ＩＬ−２レセプタ ーを明確に限定するモノクローナル抗体を用い、パーキット・リンパ腫（Ｗａｌ ｄｍａｎｎ、　Ｔ、Ａ、ら、１９８４、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６０： １４５０−１４６６）　、毛状細胞白血病（Ｗａｌｄｍａｎｎら上記；Ｋｏｒｓ ｍｅｙｅｒ、　Ｓ、　Ｊ、ら、１９８３゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８０：４５２２−４５２６）　、およびヒトＴ細 胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）−Ｉ関連成人Ｔ細胞白血病（Ｄｅｐｐｅｒ、　Ｊ 、Ｍ、ら、１９８４．　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１３３＋１６９１−１６９５）を含むある種のＢ細胞またはＴ細胞悪性物のよう な数多くの免疫異常（ＧｒｅｅｎｅとＬｅｏｎａｒｄ、上記；Ｄｅｐｐｅｒ、　 Ｊ、　Ｍ、　　ら、１９８４．　Ｊ、　Ｉｍｒｒ＋ｕｎｏ１．１３３：１６９１ −１６９５）において、ＩＬ−２ｒの発現が変化していることが報告されている 。普通のブレーＢまたはＴ細胞急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）のいくつかの場 合においては悪性細胞はインビトロ活性化後にＩＬ−２ｒを発現するよう誘導さ れ（Ｔｏｕｗ、　１．ら、１９８５．　Ｂｌｏｏｄ６６：５５６−５６１；　Ｔ ｏｕｗ、　　１．ら、１９８６．　　Ｂｌｏｏｄ　６８：ｌ０８８−１０９４； Ｍａｔｓｕｏｋａ、　Ｍ、らの１９８６．　Ｌｅｕｋ、　Ｒｅｓ、　１０：５９ ７−６０３）、またある場合にはインターロイキン−２が続くインビトロでの新 性物前駆細胞のコロニ・−形成を刺激した（Ｔｏｕｗ、　１９８５．上記；　Ｔ ｏｕｗ、１９８６．上記）。

Ｔ細胞慢性リンパ球白血病の幾人かの患者の白血病細胞は外部からのインターロ イキン−２に対するレセプターを有し、良好な増殖性応答を有することが示され た（ｌＪｃ、ｈｉｙａｍａ、　Ｔ、ら、１９８５．　Ｊ、　Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖ ｅｓｔ、　７６：４４６−４５３；　Ｔｓｕｄｏ、　Ｍ、、１９８６．　Ｂｌｏ ｏｄ　６７：３１６−３２１）　、しかし、成人Ｔ細胞白血病細胞に関連するＨ ＴＬＶ−１は構造的に高レベルの細胞表面ＩＬ−２ｒを発現するが、インターロ イキン−２に対しては全熱もしくは非常にわずかしか増殖性応答を有しなかった （Ｌｌｃｈｉｙａｍａ、１９８５、上記＋Ａｒｙａ、　Ｓ、　Ｋ、　ら、１９８ ４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２３：１０８６−１０８７）。Ｅｂｅｒｔ　らは（１９ ８５，Ｃｌ１ｎ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｉｍｍｕｎｏ−ｐａｔｈｏｌ、　３ ７＋２８３−２９７）　Ａ　Ｉ　Ｄ　Ｓウィルスを有する患者からのＴ細胞はそ の細胞が活性化された場合でさえＩＬ−２ｒを細胞表面に発現する能力に欠ける と報告している。

インターロイキン−１のようなＴ細胞活性化の第２のシグナルは単球または他の 補助細胞から付与され、モしてＴＬ−２の分泌に必要である（Ｓｅｈｍｉｄｔｋ ｅ、　Ｊ。

ＲｏとＨａｔｆｉｅｌｄ、　　Ｓ、、１９７６、　　Ｊ、ＩｍｍｕｎｏＬ、　　 １１６：３５７；　Ｍａｉｚｅｌ。

Ａ、　　Ｌ、　　ら、１９８１．　　Ｊ、　　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　　ｆ５３ ：４７０；　Ｗｉｌｌｉａ＋ｎｓ。

Ｊ、　Ｍ、　　ら、１９８５．　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３５：２２ ４９）。

２．３．ヒト免疫不全ウィルス粒子およびその他のヒトレトロウィルス レトロウィルスは、エンベロープのあるＲＮＡ腫瘍ウィルスである（概説として Ｈａｙｗａｒｄ、　Ｗ、　Ｓ、とＮｅｅｌ。

Ｂ、　　　Ｇ、、１９８１．　　　Ｃｕｒｒ、　　　Ｔｏｐ、　　　Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、　　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　　９１：２１７−２７６参照）。このウ ィルス粒子は宿主細胞原形質膜に由来する外膜エンベロープに封入されたリボ核 タンパク質コアからできている。ウィルスエンベロープ糖タンパク質は外側のエ ンベロープから突き出ている。ウィルスゲノムは一本鎖ＲＮＡ分子から成ってい る。

レトロウィルスの長い末端重複領域（ＬＴＲ）はプロウィルスＤＮＡの両端にあ りそして３つの明確なセグメントから成っている。すなわちＵ３　　（ゲノムＲ ＮＡの３°由来）、Ｒ（ゲノムＲＮＡの短い末端重複）、およびＵ５　　（ゲノ ムＲＮＡの５゛由来）。レトロウィルスＲＮＡ合成のプロモーターはＵ３領域内 のＬＴＲ内に存在すると思われる（同上）。いくつかのＨＴＬＶの単離物のＬＴ Ｒ領域は分析されている（Ｓｏｄｒｏｓｋｉ。

Ｊ、ら、１９８４．　　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｔ−Ｃｅｌｌ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ／ ＬｙｍｐｈｏｍａＶｉｒｕｓ、　Ｇａ１ｌｏ、　　Ｒ，Ｃ，ら編、Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａＴＯｒＹ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｌ）ｒｉｎ ｇ　ｈｒｂｏｒ＋　ＮｅＷ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、　１４９−１５５）。

ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−Ｉ［は関連しているがある種の白血病およびリン パ腫に関係する明らかなヒトレトロウィルスである。ＨＴＬＶ−Ｉは成人Ｔ細胞 白血病に病因として関わっている（Ｇａｌｌｏ、　Ｒ，Ｃ，とＷｏｎｇ−３ｔａ ａｌ、　Ｐ、、１９８２．　Ｂｌｏｏｄ　６０：５４５；　Ｇａ１ｌｏ、　Ｒ， Ｃ，，１９８４，ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｒｖｅｙｓ、　Ｖｏｉ、３．　Ｆｒ ａｎｋｓ、　Ｌ、　Ｍ、ら編、０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘ ｆｏｒｄ、　ｐｐ、１１３−１５９）　ＯＨＴＬＶ−Ｉ［は毛状細胞白血病のＴ 細胞変種を有する患者で初めて確認された（Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、　Ｖ、 Ｓ、　　ら、１９８２、５ｃｉｅｎｃｅ　２１８：５７１）。両ウィルスともヒ トＴ細胞向性があり、他の細胞変化を惹起するのに加えインビトロで感染Ｔ細胞 を形質転換する能力がある（Ａｒｙａ、　Ｓ。

Ｋ、ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：９２７−９３０およびその引用論 文を参照）。

ＡＩＤＳの原因は現在ではヒト免疫不全ウィルスｌ型（ＨＩＶ−１）と呼ばれる レトロウィルスであり、同じレトロウィルスサブグループであるウィルスをそれ ぞれ独立して単離した３グループ（Ｌｅｖｙ、　Ｊ、　Ａ、　　ら、１９８４、 ５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０）によって以前はＨＴＬＶ−Ｉ（Ｃａｌｌｏ、 　　Ｒ，Ｃ，ら、１９８４．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：５００．　　Ｐｏｐｏ ｖｉｃ。

Ｍ、ら、１９８４．５ｃｉｅｎｃｅ　２２４　：４９７）、　Ｌ　Ａ　Ｖ　（Ｂ ａｒｒｅ−３ｉｎｏｕｓｓｉ。

Ｆ、ら、１９８３．　５ｃｉｅｎｃｅ　２２０：８６８；　Ｆｅｏｒｉｎｏ、　 Ｐ、　Ｍ、　　ら、１９８４、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５＋６９）およびＡＲＶ（ Ｌｅｖｙ、　Ｊ、　Ａ、ら、１９８４、５ｃｉｅｎｃｅ　２２５：８４０）と呼 ばれていた。ＨＩＶ−１はＴ４＋ヘルパーＴリンパ細胞に感染すると思われ、モ してＴ４抗原がこのウィルスのレセプターかレセプターの構成物であることを示 唆する証拠がある（Ｄａｇｌｅｉｓｈ。

Ａ、　Ｇ、ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６３；　Ｋｌａｔｚｍａ ｎｎ、　Ｄ、　　ら、１９８４、　　Ｎａｔｕｒｅ　３１２ニア６７）。

、ＨＩＶ−ｉのＲＮＡゲノム構造は記載されており（Ｒａｔｎｅｒ、　Ｌ、ら、 １９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１３：２７７−２８４）　、そしみ取り枠）、３ ’−ｏｒｆ　（Ｇｕｙ、　Ｂ、　　ら、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３３０：２ ６６−２６９）、ａｒｔ／ｌｒｓ＋！：ｔａｔ（Ｋａ、ｏ、　　Ｓ、−Ｙ、ら、 １，９８７．　Ｎａｔｕｒｅ３３０　：４８９−４９３）遺伝子が包含される。

ＡＩＤＳは細胞性免疫反応の減退から主に生ずる重い免疫不全を特徴とする病気 である（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ、　Ｍ、ら、１９８１、　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　　Ｊ、 　Ｍｅｄ、　３０５：１４２５；　Ｍａｓｕｒ、　　Ｊ、ら、１９８１、　Ｎ、 　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　３０５：１４３１）。免疫不全の状態とは、Ｔ 、（ヘルパーＴ）リンパ球の減少、正常なＴ４＋：Ｔ、＋細胞割合の逆転、リン パ球減少症およびしばしばＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｉｎｉｉによって おこされる日和見感染を特徴とする。患者によってはリンパ腫またはカボジ肉腫 の発生が高い。この疾患は通常致命的である。

３、発明の要約 本発明は活性化されたＣＤ４”細胞に比較して休止期のＣＤ４“ヘルパー／イン デュサーＴ細胞によって高レベルで発現される、Ｒｐｔ−１（調節タンパク質Ｔ リンパ球−１）と呼ばれる遺伝子に関する。本発明はまた、かかる遺伝子によっ てコードされるタンパク質であって、インターロイキン−２レセプター（ＩＬ− ２ｒ）α−鎖遺伝子のプロモーター領域によって、またはヒト免疫不全ウィルス ｌ型（ＨＩＶ−１）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ−Ｉ）およびＨＴＬ Ｖ−■のようなヒトリンパ向性レトロウィルスの長い末端重複のプロモーター領 域によって指示される遺伝子発現を調節するｒｐｔ−１タンパク質と呼ばれるタ ンパク質にも関する。特にｒｐｔ−１タンパク質は、ＩＬ−２ｒα鎖遺伝子のプ ロモーターによるかまたはＨＩＶ−１の長い末端重複のプロモーターによって制 御される遺伝子発現をダウンーレギュレイトする。本発明のタンパク質および核 酸はＡＩＤＳのような免疫疾患の診断および治療に価値がある。

本発明の以下に記載される詳細な例においては、Ｒｐｔ−１遺伝子およびそれが コードする分子量約４１．０１１０ダルトンの細胞内タンパク質が記載される。

ｒｐｔ−１タンパク質は活性化ＣＤ４１Ｔ細胞によって選択的に発現され、そし てＩＬ−２ｒおよびＨＩＶ−１の遺伝子発現をダウンーレギュレイトすることが 示される。

３゜１．定　義 ｂｐ　　　　＝塩基対 ＣＡＴ　　　＝クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ ＣｏｎＡ　　　”’コンカナバリンＡ ＦＡＣ３＝蛍光活性化セルソーター ＦＩＴＣ＝フルオレセインイソチオシアネートＨＢＢ　　　＝ヘモグロビンｂ鎖 ＨＩＶ　　　＝ヒト免疫不全ウィルス ＨＴＬＶ　　＝ヒトＴ細胞白血病つィルスＩＬ　　　　＝インターロイキン ＩＬ−２ｒ＝インターロイキン−２レセプターｋｂ　　　　＝キロ塩基対 ＫＬＨ−キーホールリンペットヘモシアニンＬＴＲ＝長い末端重複 ＰＢＳ　　　＝リン酸緩衝食塩水 ＰＨＡ　　　＝フィトヘマグルチニン ＲＦＬＰ　　＝ＤＮＡ断片の成分酵素に対する多型性Ｒｐｔ−１−調節タンパク 質Ｔリンパ球−１Ｔ　Ｐ　Ａ　　　＝　１２−０−テトラデカノイルホルボール １３−アセテート ＴＳＡ＝１−リス食塩水アジド ４、図面の説明 第１Ａ図：リンバ球クローンにおけるＲｐｔ−ｉの発現。

各細胞型からの５．αｇのポリ（Ａ）’ＲＮＡを１．５９６アガロースゲルで電 気泳動し、ニトロセルロースに移し、そしてｐｃＤ−ｒｐｔ　１の３．７ｋｂｅ ＤＮＡ挿入物のニックトランスレーションにより調製された３ｊｌｐ標識プロー ブとハイブリッド形成させた。細胞の種類は次のとおりである、すなわちＭＯＰ Ｃ３１５，マウスミエローマ（レーンａ）　；　Ｃ１，ＮＫ　１．１．　Ｔｈｙ ｌ”ナチュラルキラー細胞クローン（１／−ンｂ）　；　Ｃ１，Ｌｙ２３．４． 　ＣｏｎＡ存在下（レーンＣ）またはＣｏｎＡ非存在下（レーンｄ）のサプレッ サーＴ細胞クローン；　Ｃ１，Ｌｙｌ−Ｔｌ、　ＣｏｔｉＡ非存在下（レーンｅ ）およびＣｏｎＡ存在下（レーンｆ）のヘルパーＴ細胞クローン；およびＣ１， Ｌｙｌ−Ｎ５．　ＣｏｎＡ非存在下（レーンｇ）およびＣｏｎＡ存在下（レーン ｈ）のヘルパーＴ細胞クローン。ＲＮＡは活性化１５時間後に得られた。デンシ トメータースキャニングでの測定によると、標準化のための内部対照としてアク チンｍＲＮＡレベルが用いられｔ：場合でもレーンｆおよびｈの放射性シグナル の強度はそれぞれレーンｅおよびｇの約５０％である。分子量マーカーは６００ ０．１７６５．１４２６および９２０塩基に相当する。

第１Ｂ図：異種リンパ球集団におけるＲｐｔ−１の発現。

牌臓細胞（レーンａ）または胸腺細胞（レーンｂ）からの５μｇのポリ（Ａ）” ＲＮＡを前記のようにしてＲｐｔ−１挿入物とハイブリット形成させた。

第１Ｃ図二Ｔ細胞クローンＣ１，＋、ｙｉ−ＴＩの活性化後のＲｐｔ−ｉ発現の 時間的経過。抗原（ＴＮＰ−ＢＧＧ　：　）リニトロフェニル−ウシガンマグロ ブリニノ）および牌臓付着細胞での刺激後、図に示される時点（時間）にＣ１， ｔ、ｙｔ−’ｒｉから総ＲＮＡ５μｇを得た。ノーザンブロットはＲｐｔ−１の ５°側１．３ｋｂ　ＲｓａＩ−ＸｂａＩ　７ラグメント（コー　ド領域）に相当 するニックトランスレーションしたプローブ（上図）と、およびガンマインター フェロンに相当するニックトランスレーションしたプローブ（下図）と、ハイブ リッド形成させた。

第２図：　　ｐｃＤ−ｒｐｔｌの挿入物の制限地図およびコード領域の配列。こ の配列はマキサム・ギルバート法（１９７７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５６０−５６４）によって決定し、二本 鎖とも完全に確認された。制限地図には、決定された配列の長さおよび方向を示 すための矢印およびありうるポリアデニル化部位を示す星印が包含される。ＴＣ Ｒ７−ＤおよびＴＣＲ７−Ｆ２は部分的なｃＤＮＡクローンでありそしてＴＣＲ ７−Ｘは完全な長さのｃＤＮＡクローンである。メタルフィンガー（ｍｅｔａｌ 　ｆｉｎｇｅｒ）形成に関与している可能性のある、予測アミノ酸配列中のシス ティン残基およびヒスチジン残基はＯで囲っである。第１番目のメチオニン、予 測した最も親水性の領域（アミノ酸残基番号２０５−２１０）および推定上の核 局在シグナル（アミノ酸番号２６８−２７６）はボックスで囲んだ。

第３図：予測されたｒｐｔ−１タンパク質の親水性プロット（Ｈｏｐｐ、　Ｔ、 とＷｏｏｄｓ、　Ｋ、、１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｅｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７８　：　３８２４−３８２８）。水平線より上の 部分は親水性で、下の部分は疎水性である。プロットの上に印をつけたシスティ ン残基およびヒスチジン残基の対（第２図上、円で囲ったもの）を含むありうる フィンガー構造を下方のパネルに示す（Ｍｅ　：金属）。ｒｐｔ−１において予 測されるもっとも親水性の高い領域（ＫＫＥＫＫ、Ｅ）（黒いボックス部）の位 置ならびにＳＶ４０ラーン′Ｆ抗原（Ｎ　Ｌ　Ｘ５ａｂａ、ｔｉｎｉ、　Ｄ、　 Ｄ、ら、１，９８２．　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　９２：ｌ−１９）の核局在化シグナルと同様のザブ配列を示す。

第４Ａ図：抗−Ｋ　Ｋ　Ｅ　Ｋ　Ｋ　Ｅ抗体を用いるマウス牌臓細胞抽出物のウ ェスタンプロット。分子量マーカー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｅａｉ　Ｃｏ、） は５８．０００−４４８．５００および３６．５００ダルトンに相当する。

第４Ｂ図：ＣＯ５７ｍ６細胞をｐｃＤ−ｒｐｔ−１（ＣＯ５−ｒｐｔｌ”）また はｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（ＣＯ５−ｒｐｔｌｆｓ）の６μｇでトランスフ５ク ションした。抗−■ぐＫＥＫＫＥ抗体とインキュベート後の各細胞集団の一部分 に関するＦＡＣＳ蛍光プロフィ−・ルを示す。ＣＯ５７ｍ６細胞の両群からのＲ ＮＡのスロットプロット分析によると同量のｍＲＮＡＪ（Ｒｐｔ−１プローブと ハイブリッド形成したことが明らかになった。

第４Ｃ図二両細胞集団の免疫蛍光も蛍光顕微鏡を用いて検査した。ＣＯＳ　−ｒ ｐｔ−１，）ランスフェクタントは顕微鏡写真で示される様に穎著な核蛍光を示 した。ＣＯ５−ｒｐｔ−１ｆｓでトランスフェクションした細胞では核蛍光を検 出できなかった。

第５図：肝臓のサザンプロット分析。Ｃ５７Ｂｌ／６（Ｂ）、ＤＢＡ（Ｄ）、Ｃ １，Ｌｙｌ、−ＴＩ（ＢＡＬＢ／ｃ）、および親株ＢとＤから一つくられ、番号 を付けた組換え近文株（ＢＸＤ）　（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 、　Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｍａｉｎｅ）（Ｔａｙｌｏｒ、　Ｂ、　Ａ、。

１９８１　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｖａｒｉａｎｔｓ　ａｎｄ　５ｔｒａｉｎｓ 　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ　Ｍｏｕｓｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　 Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　ｐｐ、３９７−４０７）からのゲノムＤＮ ＡをＨｉｎｄＩ［で消化した。ゲノムＤＮＡは０．７％のアガロースゲルで分析 しそしてゼータ（Ｚｅｔａ）プローブ膜（Ｂｉｏ　Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ 、　ＣＡ）にプロットした。フィルターを、ｐｃＤ−ｒｐｔｌの５゛側１．３ｋ ｂ　Ｒｓａｌ−Ｘｂａ　Ｉフラグメント（コード領域）のニックトランスしノー ジョンにより調製された！２Ｐ標識プローブとハイブリッド形成させた。

第６Ａ図：クローンＡｒ−５（左図）およびクローンＡｒ−５ｖ（中央の図）に よるｒｐｔ−１およびＩＬ−２ｒα発現の間接免疫蛍光染色およびＦＡＣＳ分析 。Ａｒ−５のＩ　Ｌ　−２ｒα蛍光はバックグラウンド程度で対照抗体を用いて 得られたものと同じ程度であった。組換えＩＬ−２での刺激２４時間後、Ａｒ− ５ｖの一部分をｐｃＤ、ｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓまたはｐｃＤ−ｒｐｔｌの６μｇ で４８時間トランスフェクションし、次にＦＡＣ３分析（右図）により表面ＩＬ −２ｒαを測定した。ｐｃＤ−ｒｐｔｌでトランスフェクションした細胞の約ｌ ／３（斜線）はもはや有意なしベルのＩＬ−２ｒａを発現していないが、ｐＣＤ −ｒｐｔｌｆｓ（左図、Ａｒ−５のＩＬ−２ｒαＦＡＣ３のプロフ、イールと比 較）。ｐｃＤ−ｒｐｔ　ｌｆｓでトランスフェクションした細胞が発現するＩＬ −２ｒαのレベルは（右図）　、ｐｃＤやｐｃＤ−β−ガラクトシダーゼでトラ ンスフェクションした細胞と有意な相違はなかった。全体で２５０μｇのＲＮＡ のスロットプロット分析では、ｐｃＤ−ｒｐｔ　ｌおよびｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ でトランスフェクションした細胞は高レベルのＲｐｔ−１ｍＲＮＡを含有するが ｐｃＤ（またはｐｃＤ−β−ガラクトシダーゼ）ではそうではないことが示され た。これらトランスフェクシントはすべて同様のレベルのＩＬ−３ｍＲＮＡを含 有していた。

第６Ｂ図：　ＣＯ３７ｍ６細胞、休止期および活性化ＥＬ−４細胞およびＪｕｒ ｋａｔ細胞のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）アッ セイ。

Ｔ細胞はＣＡＴアッセイの２０時間前に活性化した。ＣＡＴ反応混合物を２０分 間インキュベートした。下記プラスミドでトランスフェクション後の結果を示す １００３７ｍ６細胞：４μＨのＩＬ２ｒｐＣＡＴ　（細菌性クロラムフェニコー ル遺伝子（ＣＡＴ）の上流にＩＬ−２ｒαブーモーターを含有するプラスミド） および６μｇのｐｃＤ−ｒｐｔｌ　（レーンｌ）もしくはｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ 　（レーン２）のいずれかで同時トランスフェクション；３μｇのｐＬＴＲ−Ｉ 　ＣＡＴ　（ＣＡＴの上流にＨＩＶ−ｉ　ＬＴＲを含有するプラスミド）および 、６μｇのｐｃＤ−ｒｐｔｌ（レーン３）もしくはｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（レ ーン４）のいずれかで同時トランスフェクション；２μｇのｐｓＶ２ＣＡＴおよ び６μｇのｐｃＤ−ｒｐｔｌ　（レーン５）もしくはｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（ レーン６）のいずれかで同時トランスフェクション。ＥＬ−４細胞：５Ｂｇのｐ ＬＴＲ−Ｉ　ＣＡＴおよび４μｇのｐ　Ｓ　Ｖ　７　ｆｄｔａｔとのみ同時ｌ・ ランスフェクション（レーン７．１０）、またはこれに加えｐｃＤ−ｒｌ）ｔｌ 　（レーン８．１１）もしくはｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ（レーン９．１２）のいず れかの６μｇで同時トランスフェクション。Ｊｕｒｋａｔ細胞：５ＢｇのｐＬＴ Ｒ−Ｉ　ＣＡＴおよび２μｇのｐＳ　Ｖ　７　ｆｄｔａｔとのみで同時トランス フェクション（レーン１３．１６）　、またはこれに加え３ＢｇのｐｃＤ−ｒｐ ｔｌ　（Ｌ／−ン１４．１７）またはｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（レーン１５．１ Ｂ）のいずれかで同時トランスフェクション。ｒｐｔ−１の阻害作用はｐＣＤ− ｒｐｔｌ量が半分（３μｇ）の時も２倍（９μｇ）の時にも見られ、そしてこれ はインディケータ−とｐｃＤ−ｒｐｔ　ｌプラスミドとの量比が前記と同じであ る限りは、用いられたインディケータ−とｐＣＤ−ｒｐｔｌプラスミドの量の如 何にはよらなかった。ｐｃＤベクターを共に使った同時トランスフェクションで は転写因子に対するプロモーター同士の競合ゆえに低いＣＡＴ活性レベルか示さ れた。ｐＣＤ−ｒｐｔｌとの同時トランスフェクション後のクロラムフェニコー ル転換（％）は、同じＣＡＴプラスミドと共にｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓでの同時ト ランスフェクション後に得られたクロラムフェニコール転換の割合（％）として 表わす。

ｐｃＤ−ｒｐｔ　ｌｆｓ同時トランスフェクションで得られたクロラムフェニコ ール転換（％）の値を１とする。レーン７．１０．１３および１６はＴ細胞活性 化の対照として包含される。ＣＡＴプラスミドでトランスフェクションしなかっ た細胞からの抽出物は全＜ＣＡＴ活性を示さなかった。各実験を３−５回くりか えした。各実験で得られたクロラムフェニコール転換％絶対値の標準誤差は平均 の３０％以下であった。

５、発明の詳細な記載 本発明は活性化ＣＤ４＋細胞に比較して休止ＣＤ４”ヘルパー／インデューサー Ｔ細胞により高レベルで発現される、Ｒｐｔ−１（調節タンパク質Ｔリンパ球− １）と呼ばれる遺伝子に関する。本発明はまたかかる遺伝子によりコードされて おり、インターロイキン−２レセプター（ＴＬ−２ｒ）アルファ鎖遺伝子のプロ モーター領域によるか、またはヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）、ヒト Ｔ細胞白血病ウィルス（Ｔ−Ｉ　Ｔ　ＬＶ）−１、およびＨＴ　Ｌ　Ｖ　−ＩＩ のようなヒドリニッパ向性レトロウィルスの長い末端重複（ＬＴＲ）のプロモー ター領域により指示される遺伝子発現を調節するｒｐｔ−１タンパク質と呼ばれ るタンパク質にも関する。

特に、ｒｐｔ−ｉタンパク質はＩＬ−２ｒアルフア鎖遺伝子のプロモーターによ るかまたはＨＩＶ−１のプロモーターにより制御される遺伝子発現をダウンレギ ュレートする。本発明のタンパク質および核酸はＡＩＤＳのような免疫障害の診 断および治療に価値がある。

以下に述べる本発明の詳細な態様においては、Ｒｐｔ−１遺伝子およびそれがコ ードする分子量約４］、０００ダルトンを有する細胞内タンパク質が記載される 。ｒｐｔ−１タンパク質は活性化されたＣ　Ｄ　”Ｔ細胞によって選択的に発現 され、そしてＩＬ−２ｒおよびＨＩＶ−２の遺伝子発現をダウンレギュレートす ることか示される。

５．１．　Ｒｐｔ−！遺伝子の単離 任意の哺乳類細胞を、可能性としては１．Ｒｐｔ−１遺伝子の分子クローニング のための核酸源として用いることができる。Ｒｐｔ−１遺伝子の単離には、たと えばＩＬ−２ｒまたはＨｌＶ−１の遺伝子発現のダウンレギュレーションのよう な、Ｒｐｔ−１に関連する構造または性質、または活性を示すタンパク質を：〕 −ドするＤＮＡ配列の単離が包含される（下記５．５項参照）。ＤＮＡは、当業 者に知られた標準的な方法によりクローン化ＤＮＡ　（例えばＤＮＡ、ｒライブ ラリー」）から、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の 哺乳類細胞から精製されたゲノムＴ、）　Ｎ　Ａまたはそのフラグメントのクロ ーニングによって得ることができる　（たとえば、Ｎａｎ１ａｔｉｓら、１９８ ２．　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ、 　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　Ｇｌｏｖｅ ｒ。

Ｄ、　Ｍ、　（編）、１９８５．　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

ＭＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ７．０ｘｆｏｒｄ、　Ｌｌ、　Ｋ、、　Ｉ、■巻 参照）。

ゲノムＤＮＡに由来するクローンはコード領域の他に調節およびイントロンＤＮ Ａ領域を含有しうる。ｃＤＮＡに由来するクローンはエクソン配列のみを含有し よう。その起源が何であろうと、Ｒｐｔ−１遺伝子は遺伝子増殖のための適当な ベクター内に分子的にクローン化されるべきである。

ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングに於ては、ＤＮＡフラグメントが 生成され、その一部が所望のＲｐｔ−１遺伝子をコードしているであろう。ＤＮ Ａを種々の制限酵素を用いて特定の部位で切断することができる。あるいはまた 、ＤＮＡをフラグメントにす　。

るためにそのＤＮアーゼをマンガン存在下で用いることができ、また例えば音波 処理によるように、物理的にＤＮＡを切断することもできる。次に、アガロース およびポリアクリルアミドゲル電気泳動およびカラムクロマトグラフィーを包含 するがそれらに限定されない標準的技法により、線状ＤＮＡフラグメントを分子 量に従って分離することができる。

ひとたびＤＮＡフラグメントが生成されると、Ｒｐｔ−１遺伝子を含有する特定 のＤＮＡフラグメントを多数の方法で同定することができる。例えばある量のＲ ｐｔ−１遺伝子またはその特異的なＲＮＡ、またはそのフラグメントが利用可能 で、それを精製し標識化することができれば、生成したＤＮＡフラグメントを標 識化プローブとの核酸ハイブリダイゼーションにより選抜することができる（Ｂ ｅｎｔｏｎ、　Ｗ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，，１９７７゜５ｃｉｅｎｃｅ　１ ９６：１８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、およびＨｏｇｎｅｓｓ。

Ｄ、　１９７５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、 Ａ、　７２：３９６１）。

プローブと実質的に相同のこれらＤＮＡフラグメントはハイブリダイズす′るで あろう。もし精製Ｒｐｔ−１特異的プローブが利用できない場合は、最初の選択 方法として、Ｒｐｔ−１に富む核酸フラクションをプローブとして用いることが できる。−例（下記６．１゜３項参照）として、活性化Ｔ細胞により発現された メツセージを取り去ったＴ細胞ｃＤＮＡであるプローブを用いることができる。

制限酵素消化およびもし利用できれば既知の制限地図にしたがって予想されるも のとのフラグメントの大きさの比較により適当なフラグメントを同定することも 可能である。最初の選択の後に、以下に記載されるように、遺伝子の性質、また は発現された産物の物理的、化学的または免疫学的性質に基づいて、さらに選択 を行うことができる。

また、Ｒｐｔ−１遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーションによるｍＲＮＡの選択 とそれに続くインビトロ翻訳により同定することもできる。この方法に於ては、 ハイブリッド形成により相補性ｍ、　Ｒ，Ｎ　Ａを単離するのにフラグメントが 用いられる。このようなりＮＡフラグメントは利用可能な精製Ｒｐｔ−ＩＤＮＡ 、またはＲｐｔ−１配列に富むＤＮＡ　（例えば、休止Ｔ細胞に富むｃＤＮＡ） であることができる。単離されたｍＲＮＡのインビトロ翻訳産物の免疫沈降分析 または機能アッセイ（例えば、ＩＬ−２ｒまたはＨＩＶ−１プロモーターマクロ フアージ誘引、活性化、結合に関して）によりｍＲＮＡが同定され、従ってＲｐ ｔ−１配列を含有する相補性ＤＮＡフラグメントが同定される。さらに、細胞か ら単離されたポリゾームを、ｒｐｔ−１タンパク質特異的な固定化抗体に吸着さ せることによって特異的なｍＲＮＡを選択できる。（吸着されたポリゾームから ）選択されたｍＲＮＡを鋳型として用いて、放射性標識Ｒｐｔ−１ｃＤＮＡを合 成することができる。次いで、放射性標識ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡをプローブと して使って、Ｒｐｔ−ＩＤＮＡフラグメントを他のゲノムＤＮＡフラグメントの 中か・ら同定することができる。

Ｒｐｔ−１ゲノムＤＮＡを単離する以外の方法には、遺伝子配列自体を既知配列 から化学的に合成すること、またはＲｐｔ−１遺伝子をコードするｍＲＮＡに対 するＣＤＮＡを作成することが包含されるがこれに限定されるわけではない。例 えば、Ｒｐｔ−１遺伝子のｃＤＮＡクローニングのためのＲＮＡを、Ｔ細胞のよ うな免疫細胞を包含するがそれに限定されない細胞から単離することができる。

他の方法も可能でありそしてそれは本発明の範囲内である。

次に同定および単離された遺伝子を適当なりローニングベクターに挿入すること ができる。画業上知られた多数のベクター宿主系を用いることができる。使用可 能なベクターにはプラスミドまたは修飾されたウィルスが包含されるがそれらに 限定されるわけではない。

しかしベクター系は使用される宿主細胞と適合しなければならない。このような ベクターには、ラムダ誘導体のようなバクテリオファージ、またはＰ　Ｂ　Ｒ３ ２２またはｐＵＣプラスミドまたはｐ　ＣＤ　／　Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇプ ラスミド（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，およびＢｅｒｇ、　Ｐ、、　１９８３．　Ｍ ｏｌ。

Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３　：　２８０−２８９）誘導体のようなプラスミド が包含されるがそれらに限定されるわけではない。形質転換、トランスフェクシ ョン、感染、エレクトロポレーションなどによって、組換え分子を宿主細胞に導 入することができる。

特定の実施態様に於ては、ＣＤ４”ヘルパーＴ細胞／インデューサー細胞により 選択的に発現されるｃＤＮＡ挿入物を含有する構築されたサブライブラリーから の選択により、休止Ｔ細胞内で発現されるＲｐｔ川遺用子をクローン化すること ができる。このような方法を下記６．１．１　６．１．４項に記述する。

別法では、「ショットガン」法で適当なりローニングベクターに挿入後、Ｒｐｔ −１遺伝子を同定および単離することができる。クローニングベクターへの挿入 の前に、例えば、分子量による分画によってＲｐｔ−１遺伝子を増強することが できる。

Ｒｐｔ−１遺伝子を、適当な宿主細胞の形質転換、トランスフェクション、また は感染に使用できるクローニングベクターに挿入すると、その結果多コピーの遺 伝子配列が生成される。詳細な実施態様に於ては、クローニングベクターとして ｐｃＤベクターを用いることができる（Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇベクター；　 Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，およびＢｅｒｇ、　Ｆ、、　１９８３．　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２８０−２８９）　、例えば相補性付着末端を有す るクローニングベクターにＤＮＡフラグメントを連結することによって、クロー ニングベクターへの挿入を行うことができる。しかしながら、もしＤＮＡをフラ グメントに切断するのに用いられた相補性制限部位がクローニングベクターに存 在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。このよう な修飾には、一本ｌＤＮＡ末端をさらに消化するかまたは一本鎖末端を充填する ことによって平滑末端を生成させることが包含され、かくしてこれら末端が平滑 末端として連結できる。あるいはまた、Ｄ・ＮＡ末端・＼のヌクレオチド配列（ リンカ−）の結合によって任意の所望の部位をつくり出すことができる。これら の連結されたリンカ−は制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な 化学合成オリゴヌクレオチドからなることができる。別法では、切断したベクタ ーおよびＲｐｔ−１遺伝子をホモポリメリックティリングによって修飾すること ができる。

クローン化されたＲｐｔ−１遺伝子は、ＤＮＡそれ自体の性質または、代わりに そのコードするタンパク質の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づく多く の方法で同定することができる。例えば、ＤＮＡそれ自体は、標識化プローブに 対するプラークまたはコロニー核酸ハイブリダイゼーションによって検出できる （Ｂｅｎｔｏｎ、　Ｗ、およびＤａｖｉｓ、　Ｒ，、１９７７、５ｃｉｅｎｃｅ 　１９６：１８０；　Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、およびＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ 、、　１９７５．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：　３９６１）　、ま た、その発現された産物の性質に基づくアッセイによってＲｐｔ−１遺伝子の存 在を検出することもできる。例えば、ｒｐｔ−１について知られているのと同様 のまたは同一の、電気泳動での移動、等電点電気泳動での挙動、タンパク分解的 消化地図、ＩＬ−２ｒまたはＨＩＶ−１プロモーター・活性のポストレギュレー ション、または抗原性を有するタンパク質を生産するｃＤＮＡクローン、または 適合するｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンを選択することができ る。ｒｐｔ−１に対する抗体が利用できれば、ＥＬＩＳＡ（エンザイムリンクト イムノソルベントアッセイ）型の方法で、標識化抗体の推定Ｒｐｔ−１合成りロ ーンへの結合によって、ｒｐｔ−１タンパク質を同定できる。

詳細な実施態様に於ては、単離されたＲｐｔ川遺用子、ｃＤＮＡ、または合成り ＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換することに よって、多コピーの遺伝子を生成させることかできる。

従って、その形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し 、そして必要ならば単離された組換え体ＤＮＡから挿入遺伝子を回収することに よって、遺伝子を大量に得ることができる。

特定の実施態様に於ては、大規模発現させるにはｐｅＤベクター（Ｏｋａｙａｍ ａ、　Ｈ，およびＢｅｒｇ、　Ｐｌ、　　＋９８３゜Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、　３＋２８０−２８９）のＲｐｔ−１ｃ　Ｄ　ＮΔクローンを、ｃｏｓ 　ｃサル腎臓）細胞にトランスフェクションさせることができる（下記６．１． ８項参照）。

究極の目的が、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなウィルス発現 ベクターに遺伝子を挿入することであるならば、Ｒｐｔ−１遺伝子を組み込んだ 絹換えＤＮＡ分子を、その遺伝子の側面がウィルス配列で挟まれるように修飾で き、それによってウィルスに感染した細胞中でゲノムでの組換えが可能となって その結果遺伝子をウィルスゲノム中に挿入することができる。

Ｒｐｔ−ＩＤＮＡ−含有クローンを同定、増殖、および収穫した後、下記５．４ ．１項に記載されたようにしてそのＤＮＡ挿入物を特性決定することができる。

Ｒｐｔ−１遺伝子の遺伝子構造が判明すると、本発明に於て最適に利用するため にその構造を操作することが可能である。例えば、タンパク質の発現を増加させ るために、もともと備わっているプロモーターに加えて、またはその代わりにプ ロモーターＤＮＡをＲｐｔ−１コ一ド配列の５”側に連結することができる。多 くの操作が可能であり、そしてそれらは本発明の範囲内である。

５、．２．　Ｒｐｔ−１遺伝子の発現 ｒｐｔ−１タンパク質またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を適当な 発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必 要なエレメントを含有するベクター中に挿入することができる。必要な転写およ び翻訳シグナルはもともとのＲｐｔ−１遺伝子および／またはその隣接領域から 供給されることもできる。種々の宿主ベクター系がタンパク質、コード配列を発 現させるのに利用できる。これらには、ウィルス（例えば、ワクシニアウィルス 、アデノウィルスなど）感染咄乳類細胞系：ウイルス（例えばバキュロウィルス ）感染昆虫細胞系：酵母ベクターを含有する酵母のような微生物、またはバクテ リオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換され た細菌、が包含されるがそれらに限定されるわけではない。これらのベクターの 発現エレメントはその強度および特異性が変動する。使用される宿主−ベクター 系に応じて、多数の適当な転写および翻訳エレメントの任意の一つを用いること ができる。

例えば、哺乳類細胞系でクローニングする場合は、哺乳類細胞ゲノムから単離さ れたプロモーターまたは哺乳類細胞中で増殖するウィルスから単離されたプロモ ーターを使用することかできる。挿入配列の転写を引き起こすためには、組換え ＤＮＡまたは合成技法によって作成されたプロモーターを用いることもてきる。

また挿入されたタンパク質コード配列を効率的に翻訳するには特異的な開始シグ ナルも必要である。これらのシグナルにはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が　 ゛包含される。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を包含する完全なＲｐｔ− １遺伝子を適当な発現ベクターに挿入する場合は、翻訳制御シグナルを更に加え る必要はない。しかしながら、Ｒｐｔ−１コ・−ド配列の一部分のみが挿入され る場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来翻訳制御シグナルが付与されねばなら ない。さらに挿入物全体の翻訳を保証するには開始コド〉・はタンパク質コード 配列と読み枠が一致しなければならない。

このような外来翻訳制御シグナルおよび開始コドンは天然および合成両方の種々 な起源のものであることができる。

適当な転写／翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列からなるキメラ遺伝 子を含有する発現ベクターを構築するには、ＤＮＡフラグメントのベクターへの 挿入に関して既に述べた任意の方法を用いることができる。このような方法には インビトロ組換えＤＮＡおよび合成技法、およびインビボ組換え（遺伝的組換え ）が包含されうる。

Ｒｐｔ−１遺伝子挿入物を含有する発現ベクターは３つの一般的な方法によって 確認することができる。すなわち（ａ）ＤＮＡ、−ＤＮＡハイブリダイゼーショ ン、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（Ｃ）挿入配列 の発現。最初の方法に於ては、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は 挿入されたＲｐｔ−１遺伝子と相同の配列を含有するプローブを用いるＤＮＡ− ＤＮＡハイブリダイゼーションによって検出できる。第２の方法に於ては、組換 えベクター／宿主系はベクターへの外来遺伝子の挿入によって引き起こされた特 定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、 形質転換表現型、バキュロウィルスに於ける閉塞体形成）の有無に基づいて確認 および選択することができる。例えば、もしＲｐｔ−１遺伝子がベクターのマー カー遺伝子配列内に挿入されるならば、Ｒｐｔ−１挿入物を含有する組換え体は マーカー遺伝子機能の欠如によって確認することかできる。第３の方法に於ては 、組換え体によって発現される外来遺伝子産物をアッセイすることによって、組 換え発現ベクターを確認することができる。このようなアッセイは遺伝子産物の 物理的、免疫学的、または機能的な性質に基づ（ことができる。

ひとたび特定の組換えＤＮＡ分子が同定および単離されると、画業上知られたい くつかの方法がその増殖に使用できる。ひとたび好適な宿主系および増殖条件か 確立されると、組換え発現ベクターを大量に増殖および調製することができる。

本発明の実施例で詳述する特定の実施態様に於ては、Ｒｐｔ−１ｃＤＮＡ挿入物 を有するｐｅＤベクターをＣＯ８細胞にトランスフェクションすることができる 。この細胞内でＲｐｔ−１ｃＤＮＡ挿入物が発現されてｒｐｔ利タンパク質が生 産される。しかしながら、本発明はＣＯ８細胞に於けるｐｃＤベクターからのＲ ｐｔ−１発現に限定されるわけではない。既に説明したように、使用できる発現 ベクターには少数例をあげれば以下のベクターまたはそれの誘導体が包含される がそれらに限定されるわけではない。ワクシニアウィルスまたはアデノウィルス のようなヒトまたは動物ウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス；酵 母ベクター；バクテリオファージベクター（例、ラムダ）、およびプラスミドお よびニスミドＤＮＡベクター、など。

さらに、挿入配列の発現を調節するかまたはキメラ遺伝子産物を特定の所望の様 式で修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。ある種のプロ モーターからの発現を特定のインデュサーの存在下に高めることができる。した がって、遺伝子工学的に作成されたｒｐｔ利タンパク質の発現を制御することが できる。さらに、それぞれ異なった宿主細胞は、翻訳および翻訳後のタンパク質 のプロセシングおよび修飾に関して特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。確 実に異種の発現タンパク質に対し所望の修飾およびブロモジ〉・グを行うために 、適当な細胞系または宿主系を選択することができる。例えば、第２図の推定ア ミノ酸配列を有する４１．３ｋｄ　ｒｐｔ−１タンパク質を生産するには、細菌 系での発現を用いることができる。別の実施態様に於ては、異種ｒｐｔ−１タン パク質の「自然な」コンホーメーションを保証するために、哺乳類ＣＯ３細胞を 用いることができる。さらに、種々のベクター／宿主発現系が種々の程度でタン パク分解的切断のようなプロセシング反応を行うことができる。種々にプロセシ ングされた多くのかかるｒｐｔ−１タンパク質を生成させることができ、そして これらは本発明の範囲内にある。

５．３１発現された遺伝子産物の同定および精製Ｒｐｔ−１遺伝子を発現する組 換え体が−たん同定されると、その遺伝子産物を分析しなければならない。これ はその産物の物理的、免疫学的、または機能的性質に基づくアッセイによって行 うことができる。

ｒｐｔ−１タンパク質が−たん同定されると、このものはクロマトグラフィー（ 例えば、イオン交換、アフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフ ィー）、遠心分離、溶解度の相違、を包含する標準的な方法によって、またはタ ンパク質精製に関する任意の他の標準的な技法によって単離および精製すること ができる。

また、組換え体によって生産されるｒｐｔ利タンパク質が−たん同定されると、 組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から、このタンパク質のア ミノ酸配列を推定することができる。結果として、このタンパク質を当業上知ら れた標準的な化学的方法によって合成することができる（例えば、Ｈｕｎｋａｐ ｉｌｌｅｒ。

Ｍ、ら、１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１０５−１１１参照）。

本発明の詳細な実施態様に於ては、このようなｒｐｔ−１タンパク質は、それが 組換えＤＮＡ技法によって生成されるかまたは化学合成法によって生成されるか に関わらず、実質的に第２図に示すようなアミノ酸配列のすべてまたは一部分を 主要′アミノ酸配列として含有するタンパク質を包含するがそれに限定されるわ けではない。またこのアミノ酸配列には機能的に等価のアミノ酸残基が配列内の 残基と置換されてサイレントな変化を起こしているような変化した配列が包含さ れる。

例えば、一つまたはそれ以上の配列内アミノ酸残基を、同様の極性を示し機能的 に等価な作用をする別のアミノ酸により置換して、結果としてサイレントな変化 を生成させることができる。配列内でのアミノ酸の代替物はそのアミノ酸が属す るクラスの他のアミノ酸から選択することができる。例えば、非極性（疎水性） アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニル アラニン、トリプトファンおよびメチオニンが包含される。極性中性アミノ酸に はグリシン、セリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン、およ びグルタミンが包含される。

陽性荷電（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが包含 される。陰性荷電（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が包 含される。翻訳中または翻訳後に例えばグリコジル化、タンパク分解的切断など によって特別に修飾されたｒｐｔ−１タンパク質も本発明の範囲に含まれる。

５．４．　Ｒｐｔ−１遺伝子およびタンパク質の構造Ｒｐｔ−１遺伝子およびタ ンパク質の構造は当業上知られた種々の方法により分析することができる。

５　、４．１．遺伝子分析 Ｒｐｔ−１遺伝子に相当するクローン化ＤＮＡまたはＣＤＮＡはサザンハイプリ ダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

Ｅ、　Ｍ、、１９７５．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：　５０３−５１ ７）、ノーザンハイブリダイゼーション（例えば、Ｆｒｅｅｍａｎら、１，９８ ３゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０　： 　４０９４−４０９８参照）、制限エンドヌクレアーゼマツピング（Ｍａｎｉａ ｔｉｓ、　Ｔ、、１９８２、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮｅｗＹｏ ｒｋ）　、およびＤＮＡ配列分析を包含するがそれらに限定されない方法によっ て分析することができる。

Ｒｐｔ−１特異的ブロー・ブとのサザンハイプリダイゼーションによって、種々 の種類の細胞におけるＲｐｔ−Ｘ遺伝子を検出することができる。一つの実施態 様に於て、Ｒｐｔ−１の遺伝子的連結を判定するのにサザンハイプリダイゼーシ ョンを使用できる（下記６．２項参照）。Ｒｐｔ−１遺伝子の発現を判定するた めにはノーザンパイプリダイゼーション分析を用いることができる。発育や活性 の種々の状態にある種々の種類の細胞をＲｐｔ−１発現に関して検査することが できる。サプレッサーまたは細胞溶解性Ｔ細胞によるのではなくてインデュサー １゛細胞によるか、またはナチュラルキラー細胞によるＲｐｔ−１発現を証明す るものであるかかる技法およびその結果を、下記６．１．５および６．２項で述 べる。用いられた特異的なＲｐｔ−１プローブに対して所望度合の関連性を有す る核酸の検出を確保するために、サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション の両方のハイブリダイゼーション条件の厳密さを加減することができる。

Ｒｐｔ−１遺伝子の遺伝子構造を大まかに決定するために制限エンドヌクレアー ゼマツピングを用いることができる。特定の実施態様に於ては、下記第２図に示 す１制限地図を得るために、制限酵素での切断を用いることができる。制限エン ドヌクレアーゼ切断によって得られた制限地図をＤＮＡ配列分析によって確認す ることができる。

当業上知られた任意の方法によってＤＮＡ配列分析を行うことができる。このよ うな方法にはマキサム（ＭａＸａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）の方 法（１９８０゜Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５：４９９−５６０）、ザン ガーのジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、　　Ｆ、ら、１９７７、　Ｐｒｏｅ、　Ｎ ａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３）　、 まｔ：は自動化ＤＮＡシークエネーター（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）の使用が包含されるがそれら に限定されるわけではない。Ｒｐｔ−１遺伝子の代表的なもののｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 配列は、実質的には第２図に示されそして下記６．２項に詳述される配列を包含 する。

５　、４．２．タンパク質分析 ｒｐｔ刊タンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡ配列からの推定によるか、またはそ の代わりに例えば自動化アミノ酸シークエンサーを用いたタンパク質の直接配列 決定により導くことができる。ｒｐｔ−１タンパク質の代表的なもののアミノ酸 配列は、実質的には第２図に示されそして下記６．２項に詳述される配列を含有 する。

ｒｐｔ−ｉタンパク質配列は親水性分析によってさらに特性決定することができ る（Ｈｏｐｐ、　Ｔ、およびＷｏｏｄｓ。

Ｋ、、　１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、７８：３８２４）。

親水性プロフィールは、ｒｐｔ−１タンパク質の疎水性および親水性領域、およ びかかる領域をコードする遺伝子配列の対応する領域の同定に用いることかでき る。

ｒｐｔ−１タンパク質の代表的なものの親水性プロフィールを第３図に示す。

特異的な二次構造が想定されるｒｐｔ利の領域を同定するために、二次的構造分 析（Ｃｈｏｕ、　Ｐ、およびＦａｓｍａｎ。

Ｇ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２２２）を行うことも できる。

他の構造分析法を用いることもできる。これらにはＸ線結晶学（Ｅｎｇｓｔｏｍ 、　Ａ、、　１９７４．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ。

１１ニア−１３）およびコンピューターモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ。

Ｒ１およびＺｏｌｌｅｒ、　Ｍ、（編）、　１９８６．　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇ ｒａｐｈｉｃｓａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ、　ｉｎ　Ｃｕ ｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ ｌｏｇｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ−ｔｏｒｙ 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）が包含され るがそれらに限定されるわけではない。

５．５．インターロイキン−２レセプターおよびヒトリンパ向性レトロウィルス の遺伝子発現の調節ｒｐｔ利タンパク質は、インターロイキン−２レセプターノ ブロモ−９−４’タハＨＩ　Ｖ　−１、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−ＩＩのよ うなヒトリンパ向性レトロウィルスのＬＴＲのプロモーターによって指示される 遺伝子発現のレベルを調節する機能を有する（下記６．２項および６．３項参照 ）。Ｒ１）ｔ−１遺伝子の発現は転写がＩＬ−２ｒプロモーターの制御下（特に ＩＬ−２ｒα鎖の制御下）にあるかまたはＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲプロモーターの制 御下にある遺伝子の発現の低下をもたらす。

ＩＬ−２ｒβ鎖またはＨＴＶタイプ２ＬＴＲまたは類似のレトロウィルスのＬＴ Ｒのプロモーターのようなプロモーターの制御下にある遺伝子発現もまた本発明 のｒｐｔ−１タンパク質によって調節できると考えられる。

５．６．抗ｒｐｔ−１抗体の生産 ｒｐｔ−１タンパク質を認識する抗体を生産することができる。かかる抗体はポ リクローナルまたはモノクローナルでありうる。

画業上知られた種々の手順をｒｐｔ利に対するポリクローナル抗体の生産に使用 できる。特別の実施態様に於ては、第２図に示されるｒｐｔ利分子分子ピトープ に対するウサギポリクローナル抗体は下記６．１．６項に記述されるようにして 得られる。抗体の生産には、種々の宿主動物に天然型ｒｐｔ−１タンパク質また は合成物またはそのフラグメントを注射して免疫することかできる。これらの動 物にはウサギ、マウス、ラット等が包含されるがそれらに限定されるわけてはな い。種々のアジュバントを免疫応答を高めるために宿主動物の種に応じて使用で きる。アジュバントにはフロイント（完全または不完全）アジュバント、水酸化 アルミニウムのような鉱物ゲル、界面活性物質例えばリソレシチン、プルロニッ クポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリン ベットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ　 Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・バルブム（Ｃｏ ｒｙｎｅｔ＋ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）のような使用可能なヒトアジュ バントが包含されるがそれらに限定されるわけではない。

ｒｐｔ−１に対するモノクローナル抗体は、培養した連続細胞系による抗体分子 の生産を与える任意の技術を用いることにより調製できる。これらの技術にはＫ ｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９ ５−４９７）によって最初に記述されたハイブリドーマ技術、およびもっと最近 のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３．　　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４ニア２）およびＥＢＶ−形質転換技術（Ｃｏｌｅら 、１９８５．　Ｍｃｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄ　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、　　Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　　Ｉｎｃ。、　　ｐｐ 、７７−９６）が包含されるがそれらに限定されるわけではない。

分子のイディオタイプを含有する抗体フラグメントは既知の方法によって生成で きる。例えばかかるフラグメントには以下のものが包含されるがそれらに限定さ れるわけてはない：抗体分子のペプシン消化によって生成しうるＦ　（ａｂ’　 ）２フラグメント、Ｆ　（ａｂ’　）２フラグメントのジスルフィド橋の還元に よって生成しうるＦ　ａｂ’　　フラグメント、およびパパインおよび還元剤で 抗体分子を処理することによって生成しうる２ＦａｂまたはＦａｂフラグメント 。

５．７．　ｒｐｔ−１関連誘導体、類似体、およびペプチドｒｐｔ−１に関連す る誘導体、類似体およびペプチドの生産および使用も意図されており、それらは 本発明の範囲内にある。所望の免疫原性または抗原性を有するかかる誘導体、類 似体またはペプチドは、例えばイムノアッセイに於いて、免疫化のために、治療 上の目的などに用いることができる。例えばＩＬ−２ｒまたはＨＩＶプロモータ ー指示遺伝子発現のダウンレギュレーションのような所望のｒｐｔ−１の性質を 保持し、あるいはまたそれを阻害するかかる分子は、かかる性質のそれぞれイン デューサーとしてまたはインヒビターとして用いることができる。５．５および ６．１．８項に挙げた他のアッセイが包含されるがそれらに限定されない当業上 知られた方法によって、ｒｐｔ−１関連誘導体、類似体、またはペプチドを所望 の活性に関して検査できる。

本発明のｒｐｔ利関連誘導体、類似体およびペプチドは当業上知られた様々な方 法で生産できる。このような生産をもたらす操作は遺伝子またはタンパク質レベ ルで行うことができる。例えば、クローン化Ｒｐｔ−１遺伝子は当業上知られた 多数の任意の方法で修飾することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら、１９ ８２　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　ｏ　Ｒｐｔ− １配列をインビトロで、制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な部位で切断し、 所望の場合はさらに酵素的に修飾し、単離し、そして連結することができる。ｒ ｐｔ−］関連誘導体、類似体、またはペプチドをコードする遺伝子の生産におい ては、修飾された遺伝子が、所望のｒｐｔ−１特異的活性をコードする遺伝子領 域内に、翻訳終止シグナルに中断されることなく、ｒｐｔ利と同じ翻訳の解読枠 になることが確保されるよう注意が払われるべきである。

さらに、Ｒｐｔ−１遺伝子をインビトロまたはインビボで突然変異させて、翻訳 、開始、および／または終止配列を生成させおよび／または破壊するが、あるい はコ・−ド領域に変化を生成させ、そして／または新たな制限エンドヌクレアー ゼ部位を形成させるかまたは既に存在する部位を破壊させ、さらにインビトロ修 飾を促進することができる。突然変異誘発のための当業上知られた任意の方法を 用いることができ、このような方法にはインビトロ特定部位の突然変異誘発（Ｈ ｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、　Ｃ，ら、１９７８．　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅ ｍ、　２５３：６５５１）、ＴＡＢ　（商標）リンカ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） の使用、などが包含されるがそれらに限定されない。

ｒｐｔ−１配列の操作はタンパク質レベルでも行うことができる。多数の化学的 修飾のいずれでも既知の技法によって行うことができ、これらには臭化シアン、 トリプシン、キモトリプシン、パハイン、ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨｉによる 特異的化学的分解；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシン存在 下の代謝的合成−などが包含されるがそれらに限定されない。

さらに、ｒｐｔ利関連類似体およびペプチドを化学的に合成することができる。

例えば、遺伝子発現の所望の調節を仲介するｒｐｔ−１の一部分に相当するペプ チドをＤＮＡシンセサイザー（例、Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＭｏ ｄｅｌ　３８０Ａ）を用いて合成することができる。

５．８．　ｒｐｔ−１の使用 ５．８．１．診　断 ｒｐｔ−１タンパク質、その類似体、誘導体、およびサブ配列、および抗−ｒｐ ｔ−１抗体は診断に用途を有する。

本発明の分子はイムノアッセイのようなアッセイに用いて、Ｔリンパ球活性化に 影響をおよぼす種々の状態、病気および障害の検出、予知、診断あるいは監視を 行うことができる。例えばＴ細胞中に発現されるｒｐｔ−１の量は、Ｔ細胞活性 の尺度である細胞表面のＩＬ−２ｒの量（下記６．２０項、第６Ａ図参照）に逆 比例すると思われる。したがって詳細な実施態様においては、ｒｐｔ、−１に対 する抗体は患者組織または血清検体中のｒｐｔ−１の存在をアッセイするのに使 用でき、ここでｒｐｔ−ルベルの減少はＩＬ−２ｒ細胞表面発現およびＴ細胞（ 免疫）活性化の増加を示すものである。他の実施態様においては、ｒｐｔ−１発 現増加が検出されることは１’　Ｌ　−２ｒの細胞表面発現の減少のシグナルと して見ることができ、このことは低いＴ細胞応答および活性化に対するＴ細胞の 相対的抵抗を示すものでありうる。

先天的および後天的免疫不全、自己免疫疾患（例えば全身性紅斑性狼癒、リウマ チ様関節炎および糖尿病Ｉ型）、および種々の癌のような種々の免疫異常は、患 者の検体中に見られるｒｐｔ−１を含む種々の免疫機能メディエータ−のレベル による分類をやりやすいと考えられる。かかる分類は免疫異常の予知および診断 において非常に高い価値がある。

使用できるイムノアッセイには、少数例をあげれば、ラジオイムノアッセイ、Ｅ ＬＩＳＡ（エンザイムリンクトイムノソルベントアッセイ）、「サンドイッチ」 イムノアッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセ イ、補体固定アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ 、プロティンＡイムノアッセイ、および免疫電気泳動アッセイ、のような技法を 用いる競合および非競合アッセイ系が包含されるがそれらに限定されない。

Ｒｐｔ−１遺伝子および、相補配列を含む関連核酸配列およびサブ配列はハイブ リダイゼーションアッセイにも用いることができる。Ｒｐｔ−１核酸配列、また はその配列を少なくとも約１５ヌクレオチド含有するサブ配列はハイブリダイゼ ーションプローブとして使用できる。

ハイブリダイゼーションアッセイは上記のようなｒｐｔ−１発現の変化と関連す る状態、障害または疾患を発見、予知、診断または監視するのに使用できる。例 えば、患者の末梢血液リンパ球中の全ＲＮＡをＲｐｔ−１ｍＲＮＡの存在に関し てアッセイでき、ここでＲｐｔ−１ｍ　Ｒ，ＮＡの存在あるいはその量は免疫異 常に関連したＴ細胞活性化の状態を示すものである。

５．８．２．治　療 本発明のｒｐｔ−１タンパク質、その類似体、誘導体、およびサブ配列、抗−ｒ ｐｔ−１抗体、およびＲｐｔ−１核酸およびそのサブ配列はその転写がＩＬ−２ ｒプロモーターまたはヒトリンパ向性レトロウィルスのＬ　Ｔ　Ｒプロモーター によって制御される配列によりコードされる産物の発現に関連する疾病または障 害の治療に使用できる。例えば、Ｒｐｔ−１コー　ド配列を造血幹細胞に組み入 れてエイズ患者の遺伝子療法に用いることができ、そこでＲｐｔ利か発現され、 ＨＩＶ−ＩＬＴＲ指示の遺伝子発現の低下が惹起される。他の実施態様において は、ｒｐｔ−１は白血病患者のＨＴＬＶ＝ＩまたはＨＴＬｖ−■の遺伝子発現を 調節するのに使用できる。ｒｐｔ−１分子の適切な標的輸送を果すためには、ｒ ｐｔ−１タンパク質重体を抗−核タンパク質抗体または抗−ＤＮＡ抗体と接合さ せることもできる。

種々の放出系が知られており、そしてそれらをｒｐｔ−１及び関連分子の治療的 放出に使用することができる。

例えばリポソーム内カプセル化、細菌による発現など。

導入のための他の方法には、皮肉、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下および鼻内経 路が包含されるがそれらに限定されない。

本発明の別の実施態様に於ては、ｒｐｔ−１、関連分子、またはｒｐｔ−１機能 を阻害することが示されるｒｐｔ−１に対する抗体を、例えば化学療法や放射線 照射によって免疫反応抑制された患者のＴ細胞活性を増大させる試みに使用でき る。

６、Ｒｐｔ川遺用子およびそのコードするタンパク質のクローニングおよび特性 決定 この項における例として、我々は活性化ＣＤ”’＼ルバー／インデューサーＴ細 胞に比較して休止Ｔ細胞によって選択的に発現される調節タンパク質Ｔリンパ球 −１（Ｒｆ）ｔ−Ｉ）遺伝子について記載する。このものは新規な細胞内のタン パク質（分子量４］、、０００ダルトン）で、インターロイキン−２レセプター α鎖（ＩＬ〜２ｒα）遺伝子のプロモーター領域により、およびヒト免疫不全ウ ィルス１型（ＨＩＶ−１）の長い末端重複のプロモーター領域により指示される 遺伝子発現をダウンレギュレーションする。ｒｐｔ−ルベルは、ＣＤ４＋Ｔ細胞 の活性化および後天性免疫不全症候群（エイズ）の臨床的症状をもたらすＨＩＶ −１の複写と逆の相関関係にあることを我々のデータは示している。

付加的な実験においては、ヘルペスシンプレックスウィルスチミジンキナーゼま たはＳＶ４０のプロモーターによってではなく、ＨＴＬＶ−ＩｆまたはＨＴＬＶ −Ｉのプロモーターによって制御される遺伝子発現のｒｐｔ−１による特異的な 調節を示す。

６．１．材料および方法 ６　、１．１．細　胞 ここで用いられたＴ細胞クローンの出所や維持についてはすでに記載されている （Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，、らの１９８３、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１５７：１９０６−１９］７；　Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，。

らの１９８４．　Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｍｅｄ、　１５８：　１８８１−１８９４ ）。簡単に述べるとＣ１，Ｌｙｌ−ＴＩとＣ１，ＩＪＩ−Ｈ５はインデュサーＴ 細胞クローン（同上）である。Ｃ１，ＮＫ−４１はナチュラルギラー細胞クロー ン（Ｎａｂｅｌ、　Ｇ、らの１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　７８：　１１５７−１１６１）そして Ｃ１，ＬＹ２３．４はサプレッサーＴ細胞クローン（Ｆｒｅｓｎｏ、　Ｍ、らの １９８１゜Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１５３：１２６０−１２７４）　、　Ａ ｒ−５はアーソネイ）　（ａｒｓｏｎａｔｅ）反応性インデューサーＴ細胞クロ ーン（Ｒａｏ、　Ａ、らの１９８３．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１５９： １２４３−１２５８）である。Ａｒ−５ｖは構造的に高いレベルのＩＬ−２ｒα を発現するＡｒ−５の変種である（Ｂｏｅｈｒｉｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍから 供給されたＩ　Ｌ−２ｒα鎖に対するモノクローナル抗体ＡＭＴ−１３を用いる 免疫蛍光法によって測定）。

Ａ、、ｒ−５ｖは抗原の非存在下で組換えＩ　１．−２　（Ｇｅｎｚｙｍｅ）に よって活性化されるがＡｒ−５ｖはそうではない。活性化はＡＭＴ−１３により 完全に阻止される。Ａｒ−５ｖは、もしＩＬ−２によって、または抗原と■Ａｄ マクロファージによっ°Ｃ活性化さねなければ、検出できるレベルのＸ　Ｔ、　 −２を生成し、こい。Ｊｕｒｋａｔ　（Ｎａｂｅｌ、　Ｇ。

およびＢａｌｔｊｍｏｒｅ、　Ｄ、の１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７１ Ｌ−７１３，）はヒトの細胞系であり、モしてＥｌ、−４はマウスのＴ細胞系で あるｏｃＯ３−７ｘ丁＋６は５Ｖ−４０によって形質転換されたサル腎臓ゴー皮 細胞系である（Ｑｋａｙａｍａ、　Ｈ４およびＢｅｒｇ、　Ｐ、の１９８３．　 ｆ、（ｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　３：２８０−２８９）。

６．１，２．　Ｔ細胞の活性化 休止Ｔ細胞クローンは抗原（Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，らの１９８３、　Ｊ 、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１５７：１９０６−１９１７；　Ｃｌａｙｂｅｒｇｅ ｒ、　Ｃ，らの１９８４．　Ｊ、　ＥＸｐ、　Ｍｅｄ、　１５８：１８８１−１ ８９４；　Ｎａｂｅｌ、　Ｇ、らの１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：　１１５７−１１６１；　Ｆｒｅｓ ｎｏ、　Ｍ、　　らの１９８１．　Ｊ、　Ｈｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１５３：１２ ６０−１２７４）によってまたは５μｇ／−のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）お よび１０ｎ、ｇ／ｍｊ’の１２−〇−テトラデカノイルホルボールＩ３−アセテ ート（ＴＰＡ、）を加えることによって活性化された。Ｊｕｒｋ、ａｔ細胞はＴ 　Ｐ　Ａ　（４０ｎ　ｇ／−）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡＸＩＯμｇ ／　ｍｌ　）の添加によって活性化された。ＥＬ−４細胞は同量のＴＰＡおよび Ｐ　ＨＡにカルシウムイオノフオアＡ２３１８７（５μｇ／ｒｎ１）を加えるこ とによって活性化された。

６．１．３、Ｔ細胞プローブ作成 Ｉ、細胞（線維芽細胞腫）からのおよび２ＰＫ３（Ｂ細胞リンパ腫）からのポリ （Ａ）”ＲＮＡを調製しそして以前に記載（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ、らの１９ ７９．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９；　Ｆｒｅｅｍａ ｎ、　Ｇ、　Ｊ、らの１９８３．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０　：　４０９４−４０９８）されて いるようにしてＣＩ、Ｌｙｌ、−ＴＩ細胞（活性化２２時間後）から得られたＬ ＡＰ標識したｅＤＮＡとハイブリッド形成させた。ヒドロキシアパタイトクロマ トグラフィ・−によって精製した残留−重鎖ｅＤＮＡをＭＯＰＣ３１５（Ｂ細胞 ミエローマ）からのポリ（Ａ）”ＲＮＡとハイブリッド形成させそして一重鎖フ ラクションをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによって再び単離した。

６．１．４．　Ｔ細胞ｃＤＮＡライブラリーの構築ＣＩ、ｌ、ｙｌ−’ｒｔ　（ 活性化２２時間後）由来のポリ（Ａ）”ＲＮＡをｐｃＤベクター中に３．８Ｘ１ ０’の独立クローンのＣＤＮＡライブラリーを調製するのに用いた（Ｏｋａｙａ ｍａ。

Ｈ３およびＢｅｒｇ、　Ｐ、の１９８２．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　２：１６１−１７０；　Ｏｋａｙａｍａ、Ｈ，およびＢｅｒｇ、　Ｐ、の１９ ８３．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　３：２８０−２８９）　。０．５　ｋｂ−２０ｋｂｃ　ＤＮＡ挿入 物を含む、寸法で選択したサブライブラリー、１１．３００コロニーをニトロセ ルロース上に希薄に塗布しそして次に前記Ｔ細胞特異的プローブで探索した（Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ。

らの１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　 Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。ハイブリッド形成したコロニーを取り出してさらに分析し た。

６　、１．５゜核酸プロッティングおよびハイブリダ・ｒゼーション ＲＮＡスロットおよびノーザンブロッＹ・は記載（Ｃｔ＋ｉｒｇｗｉｎ、　　Ｊ 、らの１９７９．　　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８：５２９４−５２９９） されているようにして行った。所定の実験のあらゆる検体に同量の総ＲＮＡを用 いた。サザンブロツトはＧａ１ｔら（１９８４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　 ２：１４８−１５５）に記載されるようにして行った。

６　、１．６．　ウェスタンプロット分析マウス牌臓細胞（１０７−１０”　） をＰＢＳで２度洗浄し、１−の溶解緩衝液（Ｐ　Ｂ　Ｓ中１％ＮＰ−４０，０， ０２％ＮａＮ、）　、１．０μｌのフェニルメチルスルホニイルフルオライド（ ＰＭＳＦ）（１ｍｌのメタノール中３４．８■）および２０μｌのヨードアセト アミド（０，５−の蒸留水中に３６．２■）中に再懸濁した。この混合物を氷上 ３０分インキュベートしそしてポリアクリルアミドゲルに負荷した。ダニ／バク 質がポリアクリルアミドゲルセルロースシー）　（Ｔｏｗｂｉｎ，　Ｈ．らの１ ９７９．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｉｌ。

Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｌ！．Ｓ．Ａ．　７６：４３５０−４３５４）に移った 後、そのフィルターをプロ・パインディング（ｐｒｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）タンパ ク質（トリス食塩アジド（ＴＳＡ）中５％乳タンパク質、１％ウシ胎児血清）お よびウサギＩｇＧ（１：２００血清希釈度）と１時間インキュベート・した後１ ２Ｍｉ標識したヤギ抗ウサギ抗体と３０分間インキュベートした。上記ウサギＩ ｇＧはｒｐｔ−　１タンパク質のもっとも親水性部分に相当する合成ペプチド（ ＫＫＥＫＫＥ）に接合したキーホールリンベットヘモシアニン（ＫＩ。

Ｈ　）で免疫することにより得られた。フィルターをｒＳＡで洗浄しオートラジ オグラフィーのために露出させた。

６、］、、７．プラスミド 前記の寸法選択ＣＤＮＡライブラリー（Ｓｈｅｎ，　Ｆ．−Ｗ。

らの１９８５．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ ．　８２　：　７３６０−７３７３）の１１．　３００コロニーのうち２３０コ ロニーか上記Ｔ細胞ｃＤＮＡプローブとハイブリッド形成した。ハイブリッド形 成したコロー二からプラスミドｐｃＤ−ｒｐｔ−４を得た。ｐｅＤ−ｒｐｔ−Ｉ 　Ｄ　Ｎ　ＡはＴ細胞（６．２項参照）中に発現された３．７ｋｂ　ＲＮＡとハ イブリッド形成した。

ｐｃｎ−ｒｐｔ　ｌｆｓはｐｃＤ−ｒｐｔｌをＢｓｔＥＩ［で消化し、Ｔ４ポリ ヌクレオチドキナーゼで平滑末端どなしそして再連結することにより得られたｐ ＣＤ−ｒｐｔｌＯフレームシフト突然変異体である。突然変異はＤＮＡ整理配列 によって確認された。ｐＳＶ２ＣＡＴは細菌性クロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子（Ｇｏｒｍａｎ，Ｃ．　Ｍ．　　らの１９８ ２，　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ．　２：１０４４−１０５１）の上流に あるＳＶ４０エンハンサ−プロモーター領域を含有する。プラスミドＩＬ−２ｒ ｐＣＡＴはＣＡＴの上流にヒトＩＬー２ｒαプロモーター債域を含有する（Ｌｅ ｏｎａｒｄ，　Ｗ．　Ｊ．らの１９８５，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０　：　６３ ３−６３９）。プラスミドｐＬＴＲ−Ｉ　ＣＡＴはＨＩＶ−１（７）長い末端重 複（Ｌ　Ｔ　Ｒ　）（ヌクレオチド−４６３から＋８０まで）のＵ３およびＲ領 域を含有する（Ｔａｎｇ−Ｓｔａｒｋｓｅｎ。

Ｓ．　Ｅ．らの１９８７，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　　Ｓｃｉ． 　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８４：６８４５；　Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒ，　Ｒ ．らの１９８５．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７＋４８７−４９２）。ｐ　Ｓ　Ｖ　 ７　ｆｄｔａｔはＨＩＶ−１のｔａｔタンパク質の発現ベクターである（同上） 。

６　、　ｉ．　ａ．細胞系のトランスフェクションおよびクロラムフェニコール ７゛セチルトランスフエラー・−ゼアッでイ Ｄ　Ｅ　Ａ．　Ｅ−デギストラン法（Ｑｕｅｅｎ，　Ｃ．およびＢａｌ　ｔ　ｉ ｍｏｒｅ。

Ｄ．の１９８３，　Ｃｅｌｌ　３３ニア４１−７４８）を用いて付着細胞（１ｏ ６細胞／′トランスフエクシヨン）および懸濁液中で増殖した細胞（１０７細胞 ／トランスフエクシヨン）をトランスフェクションした。トランスンエクシ３ン ４８時間後にＣＡＴ溶解物を凍結融解法（Ｇｏｒｍａｎ，　Ｃ．　Ｍ．　　らの １９８２、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ．　２：ｍ０４４−１０５１）に より調製した。反応混合物中のアセチルコエンザイムＡの最終濃度が３ｍＭであ るということを除いでは既述（同上）されでいるようにして、各溶解物から同量 のタンパク質（１アッセイ当り約２　００−　３　００μｇタンパク質）を用い てアッセイを行った。反応混合物は、薄層クロマトグラフィーにより、種々の時 点でクロラムフェニコールからアセチル化形へ．の転換％につぃて評価した。実 験はアッセイの直線範囲内で行い、精製ＤＮＡの異なるバッチを用い３回から５ 回反復した。ＣＡＴプラスミドでトランスフェクションしなかった細胞からの抽 出物はＣＡＴ活性を全黙示さなかった。Ｒｐｔ−１ｃＤＮＡ挿入物の発現はタン パク質レベル（ＦＡＣＳによる）およびＲＮＡレベル（Ｔ細胞中に内在している ｒｐｔ−　１とのハイブリッド形成を避けるために、ハイブリダイゼーシ・コン ブローブとしてｐｅＤベクターからのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いる スロットプロットによる）で確認した。ｐｃＤ−ｒｐｔｌでトランスフェクショ ンしたＣＯ８細胞およびＪｕｒｋａｌ細胞は組換えタンパク質を発現したが、ｐ ｃＤ−ｒｐｔ）、ｆｓでトランスフェクションしたものはそうではなかった。Ｆ ”　Ａ　ＣＳ分析によるとＪｕｒｋａｔ細胞の活性化は組換えタンパク質のレベ ルを有意には変えなかった。サザンプロット分析によるとどの場合にも等借景の プラスミドがトランスフェクションされていることか示された。

６．１．９．免疫蛍光 ｒｐｔ−１＋細胞をカバーグラスに載せ、０．５　％グルタルアルデヒドと３０ 秒インキュベートし、洗浄しそしてウサギ抗−Ｋ　Ｋ　Ｅ　Ｋ　Ｋ、　Ｅ抗血清 のＩｇＧフラクションと最終濃度１　：　２００で４°Ｃで４０分間インキュベ ートした。次に細胞をＩＸＰＢＳで２度洗浄し、ローダミン接合ヤギ抗ウサギＩ ｇＧ（１：１００希釈）を加えた（ＣｏｏｐｅｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ、　Ｇｌ ｅｎｄａｋ、　ＣＡ　）。

細胞表面抗原：　’ｒｈｙｉ”およびＩｇ＋の膵臓細胞（Ｆｒｅｓｎｏ。

Ｍ、らの１９８２．　Ｃｅ１ｌ　３０ニア０７−７１３；　Ｃｌａｙｂｅｒｇｅ ｒ、　Ｃ，らの１９８４、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　　１５８：１８８１− １８９４；　Ｆｒｅｓｎｏ、　Ｍ、らの１９８１、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１５３：１２６０−１２７４）をＡＭＴ−１，３かあるいはＬ３Ｔ４かあるい はＬｙ２モノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、　Ｍｏｕｎ ｔａｉｎｖｉｅｗ、　ＣＡ）のいずれかとインキコベートし、３回洗浄しそして フルオレセインイソチオシアネー）（ＦＩＴＣ）−ヤギ抗ラットＩｇＧ（１：２ ００希釈ＸＣａｐｐｅ１．　Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、　ＰＡ）とインギュベー １−　シた。ＦＡＣ３で分析した各細胞集団の蛍光強度をｌｏｇｉｏ目盛りで示 す（第４および６図）。図に示されているように、細胞をフルオレセインには４ ２０−４９Ｏｎｕｎそしてローダミンは５００−５９０ｎｍのバリアフィルター を有する蛍光顕微鏡写真（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＭＴ２）を用いて可視化した。

６．２．結　果 抗原またはＴ細胞マイトジェン、コンカナバリンＡによる活性化後、Ｔ細胞クロ ーンＣ１，Ｌｙｌ−Ｔ）は１回または２回の分裂をし゛Ｃインデュサー特異的タ ンパク質を分泌する（Ｎａｂｅｌ、　Ｇ、　　らの１９８１．　Ｃｅ１ｌ　２３ ：１９−２８；Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒ、　Ｃ，らの１９８４．　Ｊ、　Ｅｘｐ、 　Ｍｅｄ、　　１５８：１８８１−１８９４）。寸法で選択したＣ１．Ｌｙｌ− Ｔｌ　ｐｃＤ　ｃ　ＤＮＡライブラリーの１１．３００コロニーのうち２３０が Ｔ細胞中で発現された遺伝子が富化されたｃＤＮＡプローブに対してハイブリッ ド形成した。これら挿入物のうちのひとつ、Ｒｐｔ−１（調節タンパク質Ｔ細胞 ）と呼ばれるものはインデューサー細胞クローン（第１Ａ図、レーンｅ−ｈ）に 存在する３、７ｋｂｍＲＮＡとハイブリッド形成したが、サプレッサーＴ細胞ク ローン（第１Ａ図、レーンＣおよびｄ）、ナチュラルキラー細胞クローン（第１ Ａ図、レーンｂ）または細胞溶解性Ｔ細胞クローン（第１Ａ図、レーンａ）とは ハイブリッド形成しなかった。発現はＴ細胞クローンの長期間の増殖に依存する ものではない。なぜならＲｐｔ−１プローブは膵臓および胸腺の新たに外植した リンパ球からの３．７ｋｂ　ＲＮＡにハイブリッド形成したからである（第１Ｂ 図）。

休止インデューサーＴ細胞（第１Ａ図、レーンｅおよびｇ）は活性化のインデュ サーＴ細胞（第１Ａ図、レーンｆおよびｈ）よりも高いレベルのＲｐｔ−Ｉ　Ｒ ＮＡを示した。抗原および膵臓付着細胞を用いるｃｉ、ｔｙｉ、−ＴＩの活性化 期間中のＲｐｔ川発用の時間的経過を分析すると、！ｉ’ｐｔ−！転写は活性化 後４−８時間は検出されないことか示された（第１．　Ｃ図の上図）。γインタ ーフェロ：、−ＲＮ　Ａのノー・ザンプロット分析で示されているよ・）に（第 １Ｃ図の下図）、Ｔ細胞特異的遺伝子を含む我々が調査し７た他の遺伝子の発現 は活性化期間中なし２か、あるいはもっと普通には増加する。

完全な長さのＲｐＬ−１りＩノーンｅＤＮＡ挿入物の完全なＭＷ配列はマクサム ・ギルバー　ト法（Ｍａ、ｘａｔｐ、、　Ａ、　Ｍ。

およびＧ１１ｔ＋ｃｒｔ、　Ｗ、の１９７７、　Ｐｒｏｅ、　ＮａｔＨ，Ａｅａ ｄ、　Ｓｅｉ。

［１，Ｓ、Ａ、　７４：５６０−５６４）を用いて決定し、た。合計３７００ｂ ｐの配列は、読み取り枠３５３アミノ酸（１６５か６１２２６まで）（第２図） 、一つづいて数値のあり・うるポリアデニル化シグナルを有する非常に長い２４ ６６ｂｌ）の３°側非翻訳領域を含育する。この読み取り枠の第１番目のメチオ ニンは真核生物翻訳開始シグナルの同意と合致するサブ配列によってコードされ ている（Ｋｏｚａｋ、　Ｍ、の１９８４゜Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　 １２＋８５７−８７２）ｏ予測されるタンパク質は分子量４１．３３０ダルトン を有し、電荷は相対的に中性であり（ｐｌは６．２９）、そしてありうるＮ一連 結グリコシル化部位（アミノ酸残基番号３０から３２）を有する。

しかしながら、明らかなシグナル配列または膜包含領域（Ｓａｂａｔｉｎｉ、　 Ｄ、　Ｄ、らの１９８２．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９２：１−１９） がないので、膜結合タンパク質ではなさそうである。

ｒｐｔ−１タンパク質のもっとも親水性が高いと予測される領域（Ｈｏｐｐ、　 Ｔ、とＷｏｏｄＳ、　Ｋ、の１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８　：　３８２４−３８３８）（第２ および３図）相当する合成ペプチド（ＫＫＥＫＫＥ）に対して生成された放射性 標識抗体を用いるマウス膵臓細胞抽出物のウェスタンプロット分析（６，１，６ 項に記載のようにして）では、予測した分子量のタンパク質が示された（第４Ａ 図）。フルオＬ／セイン接合抗ＫＫＥＫＫＥ抗体を用いる免疫蛍光分析を用いて 、異なるリンパ球系におけるｒｐｔ−１の発現を測定した（６．１．９項参照） 。

膵臓１ｇ″′細胞（Ｂ細胞）の０．３％未満、ｌ、Ｙ２”Ｔ細胞の２％未満、そ してＬ３Ｔ４”細胞の７８−９１％がｒｐｔ−Ｘ陽性であった。

ｒｐｔ利のカルボキシル末端側はシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）ラージＴ抗 原の核局在シグナルと同様のサブ配列（ＴＶＰＱＫＲＫＲＴ　：　７ミノ酸残基 番号２６８から２７６、第２図）を有しており（第３図ＸＫａｌｄｅｒｏｎ、　 Ｄ、らの１９８４゜Ｃｅ１ｌ　３９：４９９−５０９）、このものは核エンベロ ープ内のレセプターと相互作用しうる（Ｇｏｌｄｆａｒｂ、　Ｄ、　Ｓ、　　ら の１９８６、　Ｎａｔｕｒｅ　３２２：６４１−６４４）　ｏ抗−ＫＫＥＫＫＥ 抗体を用いる免疫蛍光法によって測定しモしてＦＡＣ３分析によって検出（第４ Ｂ図）すると、発現ベクターｐｃＤ−ｒｐｔ−ｔでトランスフェクションしたＣ Ｏ３７ｍ６細胞はｒｐｔ−１発現陽性であったが、ｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（ｒ ｐｔ−１のフレームシフト突然変位体、６．１．７項参照）でトランスフェクシ ョンしたものはそうではなかった。顧微鏡での観察によると核が圧倒的に染まっ ていた（第４Ｃ図）。

ｒｐｔ−１タンパク質のアミノ末端側はシスティン残基対を有しており（第２お よび３図）、これは次のようなパターンである： ＣＹＳ−Ｘ２−ＣＹＳ−ＸＩ　５−Ｃｙｓ−Ｌ−Ｃｙｓ−Ｘ、　５−Ｃｙｓ−Ｌ −Ｃｙｓ。

これらのシスティン残基は細胞内環境という条件を考えるとジスルフィド橋の形 成には関わっていなさそうである。システィン残基のこの機構は金属結合および 遺伝子発現調節にかかわるタンパク質の顕著な特徴である（Ｂｅｒｇ、　Ｊ、の １９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：４８５−４８７記載の総説参照）。システ ィン残基は亜鉛のような金属に結合し、一方、間にあるアミノ酸は突き出して指 のような突起をつくると考えられている。ｒｐｔ−１タンパク質は二通りの指の 形をつくる可能性がある（第３図）。

第二次構蓬アルゴリズムでは（Ｈｏｐｐ、　Ｔ、とＷｏｏｄｓ、　Ｋ。

の１９８１．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、 　７８：３８２４−３８２８；　Ｃｈｏｕ、　Ｐ、　Ｙ、とＦａｓｍａｎ、　Ｇ 、　Ｄ、の１９７８．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４７：２５１−２７６）、システィン対を含有する領域は疎 水性でベータシート配置をしているが、一方舟状突出を表わす介在セグメントは 親水性であるベータターンを包含することが予測される（第３図）。ｒｐｔ−１ タンパク質内には付加的な一組のシスティン残基があり、それに続いてメタルフ ィンガーを形成する可能性のある一対のヒスチジンがある（第３図）。

Ｒｐｔ−１遺伝子がＴ細胞機能に影響すると考えられる任意の遺伝子座に存在す るか否か判定するために、Ｃ５７Ｂ１／６（Ｂ）株およびＤ　Ｂ　Ａ　（Ｄ）株 から得られた組換え近文系株に存在するＤＮＡ断片の制限酵素に対する多源性（ ＲＦＬＰ）を用いてＲｐｔ−１の遺伝子連結の位置を決定した。ゲノムＤＮＡを ＨｉｎｄＩＩＩで消化しそして５゜側の１．３　ｋｂ　Ｒｐｔ−１：］−ド領領 域入物（Ｒｓａｒ−Ｘｂａｌフラグメント）をハイブリダイゼーションプローブ として使った。８株ＤＮＡ消化では大きな１０ｋｂバンドおよび小さな９．５． ４．２．１および０．８ｋｂバンドが示されるが一方り株ＤＮＡでは大きなバン ドは９ｋｂで小さなバンドは１２、ｌＯおよびｌｋｂであるので、各ＢＸＤ株は 親の超厚を明白に決定できようし、２６ＢＸＤ株の遺伝子地図と相互に関連され よう。この分析によると染色体７上のヘモグロビンｂｉ遺伝子座（ＨＢＢ）に連 結していることが示される（第５図）。

Ｌ３Ｔ４＋インデュサーＴ細胞（Ｌｙ２”Ｔ細胞ではない）上のＩＬ−２ｒαの 発現に影響する多量現象もＢＸＤ系を用いてＨＢＢ遺伝子座に位置される（Ｋａ ｗａｍｕｒａ、　Ｈ。

らの１９８６．　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１６３：１３７６−１３９０）　 、異なったＴ細胞クローン上のｒｐｔ−１およびＩＬ−２ｒα発現間の関係を分 析すると、逆の相関関係が示される（第６Ａ図）。さらに、ｐｃＤ−ｒｐｔｌｆ ｓ　ｃＤＮＡ、　　ｐｃＤまたはｐｃＤ−ベーターガクラトシダーゼでトランス フェクションされたものはそうではないがｐｃＤ−ｒｐｔｌでトランスフェクシ ョンされたＴ細胞はＩＬ−２ｒαのレベルの減少を示す（ＦＡＣ３分析によって アッセイ、第６Ａ図）。これらトランスフェクシントをスロットプロット分析す るとＩＬ−２ｒｍＲＮＡは減少するがＩＬ−３ｍＲＮＡレベルは変化しないこと が確認された。以下に記載する実験はＲｐｔ−１でトランスフェクション後のＩ Ｌ−２ｒα発現の阻害がＩＬ−２ｒα遺伝子発現に対するｒｐｔ　−１の直接作 用を反映するものか否か判定するために行った。

ｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓ　（第６Ｂ図、レーン１と２：６．１．８項参照）、ｐｃ ＤまたはｐｃＤ−ベーターガクラトシダーゼに比較してｐＣＤ−ｒｐｔｌでの同 時トランスフェクションではＣＯ３７ｍ６細胞（第６Ｂ図、レーン１と２）のヒ トＩＬ−２ｒαプロモーターによって指示される遺伝子発現の３−５倍ダウンレ ギュレーションが生じた。

これと対照的に、ＳＶ４０エンハンサーープロモーター（プラスミドｐ　Ｓ　Ｖ 　ｚ　ＣＡ　Ｔ　）　（第６Ｂ図、レーン５と６）およびアデノウィルスチミジ ンキナーゼプロモーターにより指示される遺伝子発現にはｐｃＤ−ｒｐｔｌ　） ランスフエクションはなんの影響も及ぼさなかった。

我々は他のインデューサー特異的細胞遺伝子およびレトロウィルス遺伝子におよ ぼすｒｐｔ−１の作用を調査した。ｐｃＤ−ｒｐｔｌｆｓでなく　ｐｃＤ−ｒｐ ｔｌでの同時トランスフェクションではＣＯ３７ｍ６細胞（第６Ｂ図、レーン３ と４）におけるＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ指示の遺伝子発現が３倍阻害された。また我 々はＴリンパ球を用いてこれらの同時トランスフェクションアッセイを行った。

休止Ｔ細胞は内因性ｒｐｔ−１を含有しており、そしてＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲはこ れら細胞中でバックグラウンドに近いレベルで発現される（Ｎａｂｅｌ、　Ｇ、 　　とＢａｌｔｉｍＯｒｅ。

Ｄ、の１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７１１−７１３；　Ｔｏｎｇ−Ｓｔ ａｒｋｓｅｎ、　Ｓ。

Ｅ、らの１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ 、Ａ、　８４　：　６８４５）。ＨＩＶ−ＩＬＴＲの発現のベースラインし・ベ ルが（ＩＬいので、外来ｃＤＮＡでのトランスフェクション後の発現阻害を検出 することは困難である。それゆえ我々はＨＩＶ−１ｈランスアクチベータータン パク質ｔａｔの存在下におけるＨＩＶ−ＩＬＴＲ指示遺伝子発現におよぼすｒｐ ｔ−１の作用を検査した。ＨＩＶ−１ｔａｔの存在下で休止Ｊｕｒｋａｔおよび Ｅ　Ｌ−４細胞系で３倍の阻害が観察された（第６Ｂ図）。しかしながらこれら Ｔ細胞系の活性化後ではＨＩＶ−１ｔａｔの存在下においても非存在下において もＨＩＶ−Ｉ　ＬＴＲ指示遺伝子発現の阻害は見られなかった（第６Ｂ図）。

上記したと同様の同時トランスフェクション実験において、我々はヘルペスシン プレックスウィルスチミジンキナーゼまたはＳＶ４０のプロモーターによってで はなくヒトレトロウィルスＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＩ。

■−■のプロモーターによって制御される遺伝子発現のｒｐｔ−ｔによる特異的 な調節を示した。

６．３．論　考 アミノ末端側のありうる金属結合フィンガー（Ｂｅｒｇ。

Ｊ、の１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３２：４８５−４８７参照）およびカルボ キシル末端部分の電荷を帯びたアミノ酸が支配的な部分（Ｌｅｇｒａｉｎ、　Ｍ 、　　らの１９８６．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　　１４：３０５ ９−３０７３；　Ｋｅｅｇａｎ、　Ｌ、　　らの１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２ ３１：６９９−７０４；　Ｈｏｐｅ、　Ｊ、と５ｔｒｕｈ１．　Ｋ、の１９８６ ．　Ｃｅ１ｌ　４６：８８５−８９４）は遺伝子発現を調節するいくつかのタン パク質の特徴である。ｒｐｔ−１タンパク質のアミノ末端側とカルボキシル末端 側の特性の顕著な違いはアフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）の転写因子ＩＩ ＩＡ　（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、らの１９８５゜ＥＭＢＯＪ、　４：１６０９−１ ６１４）の場合におけるように少なくとも２つの機能的ドメインを示しうる。す なわちタンパク質を特定の核酸群に標識輸送するアミノ末端ドメイン、および調 節活動を及ぼすカルボキシ末端ドメイン。

ｒｐｔ−１はシスに作用する負の調節エレメントによって、あるいはエンハンサ −またはアクチベーター配列に結合するタンパク質との競合によってＩＬ−２ｒ αおよびＨＩＶ−１の発現に影響をおよぼしうる。ｒｐｔ−１は配列が類似して いると報告（Ｆｕｇｉｔａ、　Ｔ、らの１９８６゜Ｃｅ１ｌ　４６：４０１−４ ０７）されているＩＬ−２ｒαおよびＨＩＶ−１プロモーター領域に直接結合し うる。

我々は、ヒトＩＬ−２ｒαプロモーターによって指示される遺伝子発現レベルの 低下は（転写開始部位のシフトよりむしろ）完全な長さを有するＲＮＡレベルの 低下に帰せられうることをＳｌマツピング分析により判定している。遺伝子発現 の減少はＣＡＴアッセイでは３−５倍減だけであったが、この阻害は生理学的に は大きい。なぜなら、ｒｐｔ−１でトランスフェクションされた細胞のかなりの フラクション（約ｌ／３）がＩＬ−２による活性化に必要な細胞表面レベルのＩ Ｌ−２ｒαをもはや提示しないからである（第６Ａ図；　ＬｅｔｈｅＢｉｃｈ− Ｔｈｕｙ　らの１９８７．　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　１３９：ｆ５５０− １５５６）。

ヒトＩＬ−２ｒαによって、およびＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−！およびＨＴＬＶ− ＩＩのＬＴＲによって指示される遺伝子発現のｒｐｔ−１による調節は、この組 換え産物が種をこえて生物学的に活性であることを示している。抗−ＫＫＥＫＫ Ｅ抗体を用いるＪｕｒｋａｔ細胞（ヒトＴ細胞系）のＦＡＣ３分析により、活性 化後１６時間そのレベルを検出できない関連タンパク質を検出した。

ＨＩＶ−１関連の疾患の顕著な特徴は、感染力レベルの低い感染の証拠と一致し て自覚症状のない期間が相対的に長いことである（Ｋｌａｔｚｒｃ＋ａｎｎ、　 Ｄ、　　とＧｌｕｋｍａｎ。

Ｊ、　Ｃ，の１９８６．　Ｉｍ＋ｎｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　７：２９１−２９ ６）　ａＨＩ　Ｖ−１潜伏のひとつの説明は、休止期のＴ細胞におけるＮＦ−カ ッパＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｋａｐｐａ　Ｂ；　Ｎａｂｅｌ、　Ｇ 。

どＢａｌｔｉｍｏｒｅ、　Ｄ、の１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ　３２６：７１Ｎ− ７１３；　Ｔｏｎｇ−３ｔａｒｋｓｅｎ、　Ｓ、　Ｅ、らの１９８７．　Ｐｒｏ ｅ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８４　：　６４８５）のし・ベルが低いことである。活性化 した１′細胞はＮＦ−カッパＢ因子あるいは機能的等偽物のレベルか高まってお り２これらがＩ−ｆ　Ｘ　’Ｖ−１エン・・＼ンサー配列と相互作、１してＨＩ 　’Ｖ−，，ｌ　Ｌ、、ＴＲｉ廿示′ｊ！！、転子発現レベルの増大を誘導する （同上）。刺激されたＴ細胞におけるＨ　Ｘ　Ｖ−・Ｉ　ＬＴＲ指示遺伝子発現 をｒｐｃ利がダウンレギュレイトできないという観察は活性化状態においてはＮ Ｆ−カッパＢが支配的であることを示唆している。

休止ＣＤ４”Ｔ細胞におけるＲｐｔ−１遺伝子の発現はＨＩＶ−１の潜伏状態に ついてもうひとつの理由を提供してくれる。かなりの量のｔａｔタンパク質の存 在下でさえ、ｒｐｔ−ｉは直接ＨＩＶ−１遺伝子発現を阻害（第６Ｂ図）し、そ して効率的なＩＬ−２仲介による活性化に必要なＩＬ−２ｒαの表面レベルでの 発現を阻止する（Ｌｅｔｈｅ　Ｂｉｃｈ−Ｔｈｕｙらの１９８７．　Ｊ、　　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　　１３９：１５５０−１５５９）　（第６図ＡおよびＢ）。こ れらの活性結果は、免疫系を細菌およびウィルスに露出した後、抗原決定基によ り特異的に活性化されるＣＤ４＋細胞クローンへのＨＩＶ’−１仲介による破壊 に対する制限となる筈である１、残ったＣＤ４”クローンにおけるＲｐｔ−１発 現により、ＩＬ−２による２次的活性化およびＨＩＶ−Ｉの効率的な発現が封じ られ、そのことが慢性的なＨＩＶ・−・ｌ感染にもかかわらず、ＣＤ４”Ｔ細胞 の破壊が遅い説明となろう。インデューサーＴ細胞におけるｒｐｃ−ｉレベルは ＡＸＤＳの臨床的な注状の原因であるＨ７　Ｖ−１複製増加と逆相関関係にある という可能性がある。

７゜微生物の寄託 プラスミドｐｃＤ−ｒｐｔ−１を担持するエシェリヒア・コリ株Ｍ　Ｃ１０６１ を１９８８年１月２８日イリノイ州ＰｅｏｒｉａのＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＮＲＲＬ）に寄 託し、受託番号Ｂ−１８２９７が付与された。

本発明は寄託された微生物によって範囲を限定されるものではない。なぜなら寄 託された態様は本発明の一局面のひとつの説明として意図されたものにすぎず、 機能的に同等の任意の微生物がこの発明の範囲内にある。事実、ここに示したり 記述しことに加え本発明の種々の改変が前出の記載および図面から当業者には明 らかであろう。かかる改変は本発明の範囲に該当することが意図される。

またヌクレオチドに付与された全ての塩基対の寸法は概数であり、説明の目的で 用いられることも理解されるべきである。

特表千３−５０２５２２　（１日） ト　　！　　Ｑ　　ト　　望　　０　　さ　　マ　　０　　ト　　ず　　０　　 さＮ　　い　　ロ　　□ｎ＜　　　ロ　　−　　マ　　Ｃ■　　ヘ　　マＦＩＧ 、’４８ ＦＩＧ、’１ｃ ＦＩＧ、５ 国際調査報告 ｍｍｍｂｏ、ｌＡｌ０１．ｔａｌ、１ｌｌｌ　ＮｅＰｃ”””日９１００５５０ １Ｍ１．３Ｍ７．Ｉ１．Ｊ−静、１゜１．い喝ＰＣＴノ；ＵＳＳり１０１）”Ｓ ’５０

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に第２図に示される配列を含有してなる核酸配列または少なくとも約 １５ヌクレオチドを含有してなるそのサブ配列。
2. ２．ｃＤＮＡ配列を含有してなる請求の範囲１記載の配列。
3. ３．ゲノムＤＮＡ配列を含有してなる請求の範囲１記載の配列。
4. ４．請求の範囲１記載の核酸配列に相補的なＲＮＡ配列。
5. ５．第２図に示される核酸配列と実質的に相同の配列を含有してなる核酸配列ま たはそのハイブリダイゼーション可能な部分。
6. ６．請求の範囲１記載の配列を含有してなる組換え微生物。
7. ７．請求の範囲５記載の配列を含有してなる組換え微生物。
8. ８．細菌からなる請求の範囲６記載の組換え微生物。
9. ９．細菌からなる請求の範囲７記載の組換え微生物。
10. １０．請求の範囲１記載の配列を含有してなる組換え核酸ベクター。
11. １１．請求の範囲５記載の配列を含有してなる組換え核酸ベクター。
12. １２．ｐｃＤ−ｒｐｔ−１からなる組換えＤＮＡベクター。
13. １３．請求の範囲１０または１１記載の核酸ベクターを含有する細胞からなる組 換え細胞。
14. １４．請求の範囲１２記載の組換えＤＮＡベクターを含有する細胞からなる組換 え細胞。
15. １５．哺乳動物性である請求の範囲１３記載の組換え細胞。
16. １６．哺乳動物性である請求の範囲１４記載の組換え細胞。
17. １７．細菌である請求の範囲１３記載の組換え細胞。
18. １８．細菌である請求の範囲１４記載の組換え細胞。
19. １９．ＮＲＲＬに寄託されそして受託番号Ｂ−１８２９７を有するエシェリヒア ・コリである請求の範囲１８記載の組換え細菌、またはその突然変異体、組換え 体、または遺伝子工学的に作製された誘導体。
20. ２０．実質的に第２図に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含有してな るｒｐｔ−１タンパク質、またはその誘導体、またはエピトープを含有するその フラグメント。
21. ２１．分子量約４１，０００ダルトンを有する請求の範囲２０記載のタンパク質 。
22. ２２．インターロイキン−２レセプタ−α鎖遺伝子のプロモーターにより制御さ れる遺伝子発現のレベルを調節する能力があることを特徴とする、請求の範囲２ ０記載のタンパク質、またはその誘導体またはフラグメント。
23. ２３．ヒトリンパ向性レトロウイルスの長い末端重複のプロモーターにより制御 される遺伝子発現のレベルを調節する能力があることを特徴とする、請求の範囲 ２０記載のタンパク質、またはその誘導体またはフラグメント。
24. ２４．レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスＩ型である請求の範囲２３記載の タンパク質。
25. ２５．レトロウイルスがヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型である請求の範囲２３記 載のタンパク質。
26. ２６．レトロウイルスがヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型である請求の範囲２３ 記載のタンパク質。
27. ２７．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲２２記 載のタンパク質。
28. ２８．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲２３記 載のタンパク質。
29. ２９．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲２４記 載のタンパク質。
30. ３０．組換え細菌により生産される請求の範囲２０記載のタンパク質。
31. ３１．組供え哺乳動物細胞により生産される請求の範囲２０記載のタンパク質。
32. ３２．請求の範囲２０記載のタンパク質のエピトープに対する抗体。
33. ３３．請求の範囲２０記載のｒｐｔ−１タンパク質をコードする核酸配列を、ｒ ｐｔ−１タンパク質の有効量が細胞内で発現されるように細胞に導入することか らなる、インターロイキン−２レセプタ−α鎖遺伝子のプロモーターによって制 御される遺伝子発現を調節する方法。
34. ３４．請求の範囲２０記載のｒｐｔ−１タンパク質をコードする核酸配列を、ｒ ｐｔ−１タンパク質の有効量が細胞内で発現されるようにヒトリンパ向性レトロ ウイルス感染細胞中に導入することからなる、ヒトリンパ向性レトロウイルスの 長い末端重複のプロモーターによって制御される遺伝子発現を調節する方法。
35. ３５．レトロウイルスがヒト免疫不全ウイルスＩ型である請求の範囲３４記載の 方法。
36. ３６．レトロウイルスがヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ型である請求の範囲３４記 載の方法。
37. ３７．レトロウイルスがヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ型である請求の範囲３４ 記載の方法。
38. ３８．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲３３記 載の方法。
39. ３９．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲３４記 載の方法。
40. ４０．その調節が遺伝子発現のレベルを低下させるものである請求の範囲３５記 載の方法。