JPH05506989A - 新規Ｔ細胞リンパ腫ｃＤＮＡクローン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　新規Ｔ細胞リンパ１ｌｃＤＮＡクローン発明の分野 本発明は新しいＤＮＡ配列、遺伝子組換えＤＮＡ分子、Ｔ細胞の発生に表現され る新規膜横断蛋白質をつくりだすプロセス、および実質的に純粋な形態での新規 膜横断蛋白質に関するものである。より詳しくは、本発明は適切な宿主と、これ ら宿主内でつくりだされた組み込み膜蛋白質の２つの新しい蛋白質で表現される 新しいＤＮＡ配列に関するものである。本発明によるこれらＤＮＡ配列および遺 伝子組換えＤＮＡ分子は、各々が以下の特徴のうちの少なくとも２つを有する新 規蛋白質を遺伝コードで指定している点に特徴がある：（１，）Ｔリンパ腫細胞 で表現されている、（２）通常の胸腺、活性化肺臓細胞、あるいは腸関連リンパ 系組織により表現されている、（３）卵巣組織、通常の肝臓、あるいは不死化ま たはガン性細胞株で表現されている、（４）胚発生に表現されている、そして／ または（５）複数の膜にまたがった領域を有している。以下の開示から理解され るであろうように、これらＤＮＡ配列、遺伝子組換えＤＮＡ分子、およびＴ細胞 の発生に表現される新規蛋白質および実質的に純粋な形での新規Ｔ細胞蛋白質を つくりだすためのプロセスはＴ細胞発生の調整の操作において有益であり、腫瘍 の転移病巣の局所化においても有益である。本発明はまた、本発明による蛋白質 上でのエピトープに結合する新規の抗体を提供し、これらの抗体を、この新規蛋 白質を表現する特殊な細胞タイプに対する薬品あるいはその他の試薬を確認、特 定するために使用することを提供するものである。

技術の背景 免疫システムの開発においては、Ｔリンパ球は胸腺に入って分化および成熟する 前駆体幹細胞から誘導される。多くの遺伝子はＴ細胞がその胸腺内部で発生の異 なった段階を通過する時に活性化されるか、あるいは抑制される。例えば、それ らの細胞はこの期間中にその表面にＩＬ−２受容体、ＣＤ４、および／またはＣ Ｄ８を獲得する。これらの分化標識はＴ細胞の発生および／または機能にとって 重要である。多くの遺伝子生成物は発生中のＴリンパ球における表現のレベルに おいて増大される。これらには抗原に対するＴ細胞受容体と同様標１１１ｉＣＤ ４およびＣＤ８を含んでいる。他の多くの抗原は、リンパ球におけるその正確な 機能が知られる前にＴ細胞標識としての役割を果してきた。ごく最近、Ｔ細胞抗 原ｐｇｐ１が胸腺リンパ球が胸腺に入るのを助け、そのためＴ２Ｏ０（ＣＤ４５ ）は細胞内標識するための成分としての役割を果すことが見出された。別のＴ細 胞標識で、ｒｈｙ　１はなおそれに関連した機能は知られていない。

５Ｌ１２．４細胞はＣＤ４　ＣＤＢ二重ネガティブ表現型を示し、従って、発生 の比較的初期の段階では胸腺リンパ球に類似している。さらに、それらはＴ細胞 受容体アルファサブユニットは表現しない。しかしながら、５Ｌ１２．４細胞は 、胸腺上皮単層上で共生培養を行った後、その表面上にＣＤ４およびＣＤ８を安 定−して表現させることができる。　ＴＣＲ−アルファｍＲＮＡもまたこうした 処理後に表現される。このように５Ｌ１２．４細胞は分化および成熟を受ける能 力を有していることは明らかである。こうした独特なイン・ビトロ生物学的系は ある程度、胸腺の微環境に擬態される。

遺伝子の数は発生中の胸腺リンパ球に先ず表現されることが確認されている。こ れらの遺伝子の多くは、例えば以下のような、免疫システムでの機能を果すＴ細 胞前駆体として表現されねばならない蛋白質でコード化する＝１）抗原識別に必 要な抗原に対するＴＣＲ；　２）それらの細胞がサイトカインＩＬ２に対応する 細胞より表現されねばならないＣＤ２５　（ＩＬ２受容体）　；　３）　ＣＤ３ 　、　ＣＤ４　、　ＣＤＳ、　ＣＤ４５などの抗原識別中にシグナル導入のため に重要な遺伝子生成物、４）遺伝子生成物のあるものは目標器官への胸腺リンパ 球移入に関与する、モして５）　Ｔ細胞活性化に関与する遺伝子生成物（フォー ルケスおよびパードール、文長生立盈歩旦：２０７−２６４　（１９８９）　； フード等、（１９８５）鳳１．赳、　２２５＝２２９　；ローテンベルブおよび ルゴ、Ｄｅｖｅｌｏ　、　Ｂｉｏｌ　月２．１−１７　（１９８５）　；アドキ ンス等、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、５　：３２５−３６５　（１９８７ ）　、クラブツリー、並工王之ス困：３４３−３５５　（１９８９）　；クオン およびワイスマン、扛匹工Σ痣Ｉ　Ａｃａム」≧Ｌ１鎧赳：　１９６３−１９６ ７（１９８９）　）。表現された遺伝子の異なった組み合わせを表現する胸腺リ ンパ球サブセットには著しい異質性がある。いろいろなタイプの胸腺リンパ球の すべてにおいてではないが、その多くにおいて、遺伝子表現が詳しく分析されて おり、そして、Ｔ細胞の発生および移入において機能を果すコード化生成物、特 に数値的にはあまり現れない、一時的プロジェニター胸腺リンパ球において表現 されるものをコード表現する遺伝子の確認が未だなされていないようである。

胸腺リンパ球の広範な異質性のために、発生中に起きる遺伝子表現のカスケード を特徴づけるのに十分な数と純度で分画されたプロジェニター胸腺リンパ球を得 るのは実際的には不可能である。こうした理由から、リンパ腫および白血病細胞 がリンパ系の発生における遺伝子表現の研究において広範に利用されていた（グ リーブス、サイエンス２３４　：　６９７−７０４（１９８６）　；ハンリーー ハイドおよびリンチ、Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｉｍｍｕｎｏ１４　：　６２１−６４９ 　（１９８６）　）　、がなりの量の文献が数値的にあまり現れない一時的プロ ジェニター細胞が悪性腫瘍への形質変換の対象となっていること、そしてさらに 、形質変換された目標細胞の特性の一部が腫瘍細胞内に保持されていることを示 唆している。腫瘍細胞における予期されない遺伝子表現は過去においては往々に して形質変換における異常として簡単に片づけられた。しかしながら、造血組織 腫瘍細胞における「異常な」遺伝子表現を注意深く分析した結果、こうした遺伝 子を表現する通常のプロジェニター細胞の稀なサブセットが明らかになった（グ リーブス、サイエンス２３４　：　６９７−７０４（１９８６）　；　ハンリー ーハイドおよびリンチ、Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｔｍｍｕｎｏｌジ挫工旦：　１．９ ９６−２００４　（１９８８）　）　。

ひとつの個体から取り出されたマウスおよびヒトのリンパ腫細胞株の異質性は個 々の細胞が到達している成熟の程度の違いの結果であると考えることができる。

確立されたＴリンパ腫細胞株の異質性は限定された数の特性だけが異なっている 密接に関連した細胞クローンを得るために利用された。ヘントリック等（ヘント リック等、工木イ」−１：３０８　：　１４９−１５３（１９８４）　）は減法 クローニング法を用いて、ＴおよびＢ細胞はほば１００の遺伝子の表現が異なっ ているという推定を行った。密接に関連したＴリンパ腫細胞がそれよりもっと少 ない遺伝子の表現において異なっているだけかもしれない可能性がある。こうし た細胞クローンは、限られた数の特性だけが異なっている明確に定義されそして 安定した表現型を有する細胞の純粋な集団を操作する可能性を提供した。本願に おいてはこうした密接に関連した細胞集団を提供するために５Ｌ１２Ｔリンパ腫 モデル・システムが開発され、使われる（ヘイズ等、江旦」２ハ匹肛亜：５９７ −６０１　（１９８６）　；マツクリート等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 旦：　１７８４−１７９０　（１９８４）　；マツクリート等、Ｌ」里工旦匪二 り江旺７４　：　８７５−８８２　（１９８５）　；マツクリート等、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３　：　６９８９−６９９３（１ ９８６）　；之二ｊ及！、ム」江り１恒ｄ、　１６６　：　１７０２−１７１５ （＋９８７）　）。

発明の詳細な説明 本発明は新規ＤＮＡ配列、遺伝子組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）分子、Ｔ細胞の発 生において表現される新規Ｔ細胞蛋白質をつくるためのプロセス、実質的に純粋 な形態での新規Ｔ細胞蛋白質およびそれら新規蛋白質に結合する抗原を提供する ものである。

より詳細には、本発明は適切な宿主とそれら宿主でつくられる新規Ｔ細胞蛋白質 で表現される新規ＤＮＡ配列に関するものである。本発明はまた、実質的純粋な 形態での新規膜横断蛋白質、こうした膜横断蛋白質をコード化するｒＤＮＡ分子 、そしてそれら新規膜横断蛋白質をつくるためのプロセスを提供する。本発明の ＤＮＡ配列および遺伝子組換えＤＮＡ分子は、それらがＴリンパ腫細胞により表 現され、少なくとも以下の特性のひとつを有しているという特徴を有している＝ （１）正常の胸腺、活性化肺臓細胞、あるいは腸関連リンパ系組織において表現 されている、（２）卵巣組織、正常の肝臓において、および／または胚発生の段 階固有の方法で表現されている、（３）複数の膜横断領域を有する新規膜横断蛋 白質をコード表現している。

別の側面として、本発明は胸腺上皮単層上での共生培養後にＳＬｌ、２．４細胞 で誘導できる、本明細書ではＬｏｖとも称せられる新規遺伝子、１９．５を提供 する。本発明はまた、Ｌｏｖ　ｃＤＮＡ配列に基づくオリゴペプチドに対するポ リクローナル抗体も提供する。共生培養後の５Ｌ１２．４細胞集団から分離され た細胞クローンは表面蛋白質レベルと同様ｍＲＮＡで高いレベルのＬｏｖ表現を 示すので、Ｌｏｖの誘発は安定していると思われる。、Ｌｏｖ遺伝子はマウス染 色体１６にマツプされている。Ｌｏｖ遺伝子生成、物は発生段階的に調整され、 Ｔ細胞の発生において一定の役割を演じる。

５Ｌ１２．４ｃＤＮＡライブラリーは、関連する姉妹リンパ腫細胞株、５Ｌ１２ ．３に対する減法ハイブリダイゼイションを経て分離される６つの新規ｃＤＮＡ から構成されている。５Ｌ１２．３細胞はＳＬｌ２．４より未成熟段階で胸腺リ ンパ球の特性を有している。ｃＤＮＡクローンの１つである１９．５は５Ｌ１２ ．４において表現されるが、５Ｌ１２．３細胞においては表現されない、この配 列はＬｏｖ（μｙｍｐｈｏｉｄ［リンパ系］およびｏｖａｒｉａｎ　［：卵巣コ 細胞表現）と名づけられている）。これにより目標の蛋白質は高度に親水性のよ うであり、コンピュータ分析によると、４つの膜横断領域を含んでいる。Ｌｏｖ 　ｃＤＮＡあるいは目標の蛋白質配列と他の知られている配列の間に有意の相同 は認められていない。Ｌｏｖは、例えば、ヒト、噛歯類、ウサギ、アシ力などの は乳類、および鳥類に保持されており、転写は卵巣および腸関連リンパ系組織（ ＧＡＬＴ）　、および胸腺において高度に表現されるようである。Ｌｏｖ表現と その生物系における誘導可能性、およびこの遺伝子のマウス染色体による局所化 を本明細書中に開示する。

こうしたＤＮＡ配列および遺伝子組換えＤＮＡ分子を提供することにより、本発 明はまた、これらの配列を含んでいたり、あるいは欠いている細胞を確認するた めのプローブおよび方法と、これらの配列を欠いている細胞にその配列を提供す る手段とを提供する。さらに、本発明は、細胞に投与された場合、あるいはアン チセンスＲＮＡをコード表現しているＤＮＡを該ＤＮＡ配列を含んでいる細胞に 投与した場合、本発明による新規蛋白質をコード表現しているＲＮＡと結合して 、その合成を妨げるアンチセンスＲＮＡをつくりだすアンチセンスＲＮＡ配列を 提供することによってそれら新規配列の表現を抑制する手段を提供する。本発明 による蛋白質のいずれかに対する抗原がリガンドのそれら蛋白質への結合を阻止 し、これら蛋白質を表現している細胞の標的薬品あるいはその他の試薬（ラベル など）に利用できることは、本開示から当業者には明らかであろう。

限られた数の組織でだけ見いだされる転写を確認する、本明細書中ではＴｅａと も表現されるｃＤＮＡクローン、２０．５も提供される。Ｔｅａ転写はＴ細胞ミ トゲンＣｏｎＡを使って活性化された肺臓リンパ球内で誘導される。活性化Ｔ細 胞で表現される他の知られた遺伝子とは違って、Ｔｅａ遺伝子は膜を何回も通過 する蛋白質をコード表現するように思われ、一方、Ｔ細胞の活性化において誘導 される多数の既知の組み込まれた膜蛋白質は単一膜にひろがった蛋白質である（ クラブツリー、（１９８９）サイエンス２４３　：　３５５−３６１）である。

本発明はまた、新規膜横断蛋白質およびＴ細胞の発生、腫瘍形成表現型の調整に おいて利用でき、また、自己免疫疾患におけるＴ細胞の活性化の阻止においても 有益である実質的に純粋な形態での新規膜横断蛋白質をつくりだすプロセスを提 供する。

２つの関連Ｔリンパ腫細胞クローン間で異なって表現される新規のｃＤＮＡクロ ーンは減法−栄養強化分画スクリーニングを用いて分離された。それからｃＤＮ Ａが分離された５Ｌ１２゜４細胞は発生の中間段階において胸腺リンパ球の特性 を有しており、同系動物において顕著な結節外卵巣腫瘍を引き起こす、同じ腫瘍 から取り出された姉妹細胞である５Ｌ１２．３は別の表現型を有しており、より 進行性のつよい、拡散性リンパ腫をつくりだす。これら５つの新規遺伝子のうち の４つは正常胸腺、活性化肺臓細胞、あるいは腸関連リンパ系組織において表現 される。新規ｃＤＮＡ配列及び新規ｃＤＮ＾クローンに関する目標蛋白質配列を 第３，１３図および２０−２３に示す。新規１９．５ｃＤＮＡクローンは正常な 胸腺、腸関連リンパ系組織および卵巣組織におけるｍＲＮＡを検出する。目標蛋 白質は推定４つの膜横断領域を有している。転写の表現は新規ｃＤＮＡクローン に対する検出可能なｍＲＮＡ相補を欠いている３つの異なったＴリンパ腫細胞株 と融合した５Ｌ１２．４細胞から形成される体細胞ハイブリッドで抑制される。

このトランス−ネガティブ調整はその遺伝子の表現が抑制メカニズムによって調 整されることを示唆している。

図面の簡単な説明 第１図はノーザン・プロットによる５つの異なった５Ｌ１２．４−固有−ｃＤＮ Ａクローンを示している。

第２図は４つの異なった５Ｌ１２．４固有ｃＤＮＡクローンのサザーンプロット ・ハイブリダイゼイションを示している。

第３図はＤＮＡ及び１９．５ｃＤＮＡクローンの目標蛋白質配列を示している。

Ａ、ＤＮＡ配列および目標アミノ酸配列は二重ストランド化シーケンシングを用 いて得られたものである。遺伝子配列を組み立てるため、および目標アミノ酸配 列を調製するためにミクロジェニー（ベックマン）が用いられた。Ｂ、サブクロ ーニングのためのｃＤＮＡ内の拘束箇所とシーケンシング手法が示されている。

オーブン・リーディング・フレームは点線の水平線で示しである。両方のスタン ドとも、完全なインサートとプライマーを用いた４つのサブクローンからプラズ ミドｐＴ７Ｔ３のＴ３およびＴ７領域および１つの合成オリゴヌクレオチド・プ ライマーまでで配列されている。目標の蛋白質の物理的属性を調べ、Ｃに示され ているスケッチを作成するために、ＰＣジーン・ソフトウェア・プログラム５Ｏ ＡＰ。

ＨＥＬＩＸＭＥＭ、　ＭＯＮＯＴＮＹオヨびＲＡＯＡＲＧＯ５が用いられた。

第４図は体細胞ハイブリッド内の１９．５および２０．２ｃＤＮＡおよび正常な マウスの組織における１９．５の表現パターンを示している。

第５図は１９．５ｃＤＮＡに対して相補型の配列がヒトの卵巣悪性腫瘍細胞株に 含まれていることをノーザン・プロットで示している。

第６図は１９゜５に対する相補型の配列が種々の曙乳物種に存在しており、した がって、進化の過程で保持されることを、サザーン・プロットで示している。

第７図はＬｏｖの両方の転写が共生培養によって誘発されることをノーザン・プ ロットで示している。

第８図は５Ｌ１２．４のＬｏｖの表面表現に関する蛍光抗体分析を示している。

第９図は１９．５抗体の免疫抗原に関する特殊性を示している。

第１Ｏ図は胸腺上皮細胞によるＬｏｖ蛋白質の誘発可能性を示している。

第１１図はＬｏｖ表現の安定性をノーザン・プロットおよびＦＡＣ５分析で示し ている。

第１２図はＬｏｖの染色体１６への局所化を示している。

第１３図はＤＮＡとクローン２０．５ｃＤＮＡの目標の蛋白質配列を示している 。

第１４図はＴｅａ遺伝子表現を示している。

第１５図は活性化肺臓リンパ球におけるＴｅａ遺伝子誘発の動力学的原理を示し ている。

第１６図は２０．５およびＥＲＲｃＤＮＡ配列の配列を示している。

第１７図はＴｅａ目標蛋白質配列とマウス自己指向性レトロウィルス受容体配列 との配列を示している。

第１８図はＴｅａおよびＲｅｃ−１遺伝子の目標蛋白質生成物の物理的属性を示 している。

第１９図は種々の種から取り出したＤＮＡのサザーン分析と染色体８上でのＴｅ ａ遺伝子を位置を特定するための遺伝子組換え近交型ＤＮＡの分析を示している 。

第２０図はクローン１９．１ｃＤＮＡのＤＮＡと目標蛋白質配列を示している。

第２１図はクローン１９．２ｃＤＮＡのＤＮＡと目標蛋白質配列を示している。

第２２図はクローン１９，４ｃＤＮＡのＤＮＡと目標蛋白質配列を示している。

第２３図はｐＮＥｏ／ＴｆＲ−ＮＣの系統図を示している。

第２４図はｐＭＡＭｎｅｏ−Ｂｌｕｅの系統図を示している。

発明の詳細な説明 本明細書中に述べられている発明をもっと良く理解できるように、以下に詳しく 説明する。

説明においては、以下の用語が用いられる。

ここで用いられるｒ宿主Ｊという用語は、原核生物ばかりでなく、イーストや糸 状菌、および植物および動物細胞などの真核生物なども意味している。

「原核生物」という用語は本発明による膜横断あるいは遺伝子組換えＴ細胞蛋白 質（ｒｔＴＣＰ）を表現するためにＤＮＡで形質転換され得るすべてのバクテリ アを意味している。

「真核生物」という用語は、本発明による膜横断あるいは遺伝子組換え膜横断Ｔ 細胞蛋白質を表現するためにＤＮＡで形質転換することが可能なすべてのイース ト菌、菌類、動物および植物細胞を意味している。

本発明によるＴ細胞蛋白質のためのＤＮＡはいかなる哨乳類種からでも取り出す ことができる。必要なのは、Ｔ細胞蛋白質のための遺伝子配列がその原核生物あ るいは真核生物の有機体組織内で表現されることだけである。好ましいのはマウ スからのＴＣＰ蛋白質を表現するＴ細胞ＤＮＡである。特に好ましいのは複数の 動物種（例えば、マウス、ウサギ、アシ力、あるいはヒトなど）の間で免疫学的 交雑が可能なＴ細胞ＤＮＡの配列である。

本発明のＴ細胞蛋白質のいずれかをコード遺伝子組換えＤＮＡ分子は、この分野 における通常の技術を知っている人々に広く知られている手法のいずれかを用い て、宿主の形質転換を行うために用いることができる。特に好ましいのは、原核 生物の形質転換を目的として、本発明によるＴ細胞蛋白質に関するコーディング 配列を含んだベクターの使用である。

本発明のＴ細胞遺伝子組換え蛋白質（ＴＣＰ）は先天Ｔ細胞蛋白質のアミノ酸と 比較して、その両側面端に多いかあるいは少ないアミノ酸を含むことができる。

「実質的純粋ｊという言葉は、本発明の膜横断Ｔ細胞蛋白質に対して使った場合 、ポリペプチドは、通常はその自然の状態でＴ細胞蛋白質と結合していて、定常 的および再現可能な電気泳動あるいはグロマトグラフイー的応答、溶出特性、そ して抗原活性を抑制してしまう他の蛋白質とは基本的に無関係であることを意味 している。「実質的純粋」という意味には、Ｔ細胞蛋白質とその他の化合物の人 為的、あるいは合成混合物を排除することは含まれていない。

融合された、操作可能に結合された遺伝子を調製し、それらをバクテリア内で表 現するための方法は知られており、例えば、本願に引例として採用されている米 国特許＆４．．３６６、２４６に示されている。ここに示されている遺伝子構成 および方法は原核生物あるいは真核生物宿主内で膜横断細胞蛋白質を表現するた めに用いることができる。

原核生物宿主には太ＩＩ１．主ノーよｍ、セラチア・マルセッセ之ス、および１ ＬｉＬなどの、グラム陰性菌およびダラム陽性菌を含む。

真核生物宿主はＭｆヱ・パストリスなどのイースト菌あるいは哺乳動物の細胞を 含んでいる。

一般的に、挿入されたＤＮＡ断片の効率的な転写を容易に行わせるようにするプ ロモーター配列を含んだ表現ベクターはその宿主との関連で用いられる。表現ベ クターは典型的に、複製開始点、プロモーター、ターミネータ−１および形質転 換される細胞に表現型選択を行うことができる特殊な遺伝子を含んでいる。形質 転換される宿主は、最善の細胞培養を行うために公知の手段に従って発酵、培養 させることができる。

本発明で用いることができるプロモーターの例としては、ｒｅｃ　Ａ　、　ｔｒ ｃ、　ｌａｃ、　ｔａｃ１バクテリオファージ・ラムダｐＲあるいはｐＬ＋　Ｍ ＭＴＶ、　ＳＶ４０などを含むが、これだけには限られない。本発明で用いるこ とができるプラスミドあるいはバクテリオファージのいくつかの例は「マニアテ イス等、ｊＬテ２Ｌｐ−−ニング、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラト リーズ、１９８２　Ｊに紹介されており、その他のものも当業者には知られてお り、簡単に確かめることができる。

本発明は、例えば、溶原性ファージを用いた遺伝子素材の転写など、この分野で 公知のいずれかの他の方法で述べられた、あるいは変更された方法で行う、そし て膜横断Ｔ細胞蛋白質の遺伝子を表現している原核生物あるいは真核生物を生み 出すどの宿主に対しても適用できる。

遺伝子はその鋳型あるいはメツセンジャーＲＮＡを通じてひとつのペプチドの特 性を有するアミノ酸の配列をコード表現するＤＮＡ配列である。ｃＤＮＡという 用語は、介在配列が取り除かれた遺伝子を含んでいる。ｒＤＮＡという用語は、 イン・ビト旦でｃＤＮＡあるいはゲノム性ＤＮＡ配列をスプライシングすること により遺伝子組換えされた分子を意味する。

クローニング伝播体は、プラスミドかファージＤＮＡ、あるいは、その個所でＤ ＮＡの基本的な生物学的機能を損なわずに確定可能な方法でＤＮＡ配列が切断さ れるエンドヌクレアーゼを１つ、あるいは少数含んでいることで特徴づけられ、 形質転換された細胞の確認のために使用するのに適した標識を含んでいる宿主細 胞内で複製できるその他のＤＮＡ配列である。

標識は、例えば、テトラサイクリン抵抗、ネオマイシン抵抗、あるいはアムビシ リン抵抗である。「ベクター」という用語はクローニング伝播体の意味で使用さ れることが時々ある。

伝播体の表現は、クローニング伝播体に似ているが、通常、ある種のコントロー ル配列によるコントロール下で、宿主内に一定の構造遺伝子を表現することがで きる伝播体である。

膜横断Ｔ細胞蛋白質のために膜横断Ｔ細胞ゲノムで形質転換された宿主は膜横断 Ｔ細胞ポリペプチドおよび蛋白質をつくりだすために特に有用である。

遺伝子組換えＴ細胞蛋白質はＴ細胞蛋白質のアミノ酸配列全体で構成される場合 もあるし、特定の決定子だけで構成される場合もある。Ｔ細胞遺伝子組換え蛋白 質で免疫化された動物はその遺伝子組換え、あるいは自然由来のポリペプチド上 にあるエピトープと結合する抗体をつくりだす。従って、Ｔ細胞を含有した遺伝 子組換え蛋白質の商業的な生産は実行可能である。

「固体」という用語は、すべての動物、好ましくは哺乳類そして、噛歯類、ネコ 、イヌ、ウシ、あるいはヒトが特に好ましい。

探知可能なラベルは検出できるものであればどんな分子であっても差し支えない 。通常用いられている探知可能ラベルは°゛Ｐ、”Ｃ１゛“Ｉ、”Ｈおよび°Ｓ などの放射性ラベルが含まれるが、これらだけに限られるものではない。ビオチ ンでラベルしたヌクレオチドはニック翻訳、酵素あるいは化学的な手段でＤＮＡ あるいはＲＮＡに組み込むことができる。ビオチン化されたプローブはアビジン ／ストレプトアビジン、蛍光、酵素あるいはコロイド性金共役を用いてハイブリ ッド化した後に検出される。核酸も他の蛍光化合物、免疫検出性蛍光誘導体、あ るいはビオチン類似物を使ってラベルすることができる。核酸は蛋白質を取りつ ける手段でラベルすることもできる。放射性あるいは蛍光性ヒソトンＨに結合し た核酸、酵素（アルカリフォスファターゼおよびパーオキシダーゼ）、あるいは −木繊結合（ｓｓＢ）蛋白質も使用することができる。

従って、本発明は本発明による膜横断蛋白質に関するプローブ、および本発明に よるＴ細胞蛋白質の天然リガンドの結合に対する抑制子として、および１つの薬 品あるいはラベルを目標とした伝達システムとして、反膜横断Ｔ細胞蛋白質抗体 を使えるようにする。

５Ｌ１２Ｔリンパ腫細胞株から誘導された２つの細胞クローンが遺伝子表現にお いて知られている差と、同系宿主動物における腫瘍を発生させる上でのその異な った能力に基づいて、新規のそれぞれ違って表現された遺伝子の分離のために選 ばれた（ヘイズ等、加Ｌエム」工旦匹皿：５９７−６０１　（１９８６）　；マ ツクリート等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４４　：　１７８４−１７９ ０　（１９８４）　；マツクリート等、Ｊ、Ｎａｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、 ７４　：　８７５−８８２（１９８５）：マツクリート等、ヒ四二上蛙１．　Ａ Ｃ５蛙工陣シ」以層競：　６９８９−６９９３　（＋９８６）　；シーゲル等、 Ｊ、　Ｅｘ　Ｍｅｄ　１６６　：　１７０２−１７１５　（１９８７）　、ウニ インロス等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ，ｅｓｅａｒｃｈ　４Ｅし４８０４−４８０９　 （１９８５）　；ウィルキンソン等、ＥＭＢＯＪ、７−二１０１−１０９（１９ ８８）および表現型の要約に関しては表１参照）。５Ｌ１２，３細胞株はＴ細胞 機能に必要な遺伝子はほとんど表現しない。

そして、それは同系動物においては非常に悪性であり、拡散。

進行性腫瘍を形成する。それとは対照的に、５Ｌ１２，４細胞はＴＣＲ−アルフ ァの除＜　ＴＣＲ／ＣＤ　３複合体のすべての成分に対してｍＲＮＡ５を表現し 、いくつかの観点で、この細胞は胸腺リンパ球の発生の中間段階での胸腺リンパ 球に似ている。５Ｌ１２．４細胞は腫瘍発生性がはるかに低く、顕著な結節外腫 瘍を誘発する。雌の宿主動物においては、腫瘍が形成される第１の箇所は卵巣で ある。新規の膜横断蛋白質は腫瘍細胞を卵巣に向かわせることに関与している。

新規ｃＤＮＡクローンが腫瘍発生性、ホーミング特性、および成熟状態において 異なっている２つの細胞株から分離される。

これらのｃＤＮＡは腫瘍を発生させる２つの細胞株の異なった能力に関係する生 成物をコード表現する、モして／またはＴ細胞において機能を果たす遺伝子を示 す。本発明は５Ｌ１２．４Ｔ細胞クローンで優先的に表現され、姉妹細胞クロー ンである５Ｌ１２．３では検出できない程のレベルで、あるいは非常に弱くしか 表現されない遺伝子を示す５つの新規ｃＤＮＡクローンの分離およびその特性に ついて開示している。ｃＤＮＡクローンは減法ハイブリダイズプローブと古典的 な差別化スクリーニングとの組み合わせで得られた。２つの細胞クローン間で異 なって表現される遺伝子を示す新規ｃＤＮＡクローンが開示されている。

関係する遺伝子のすべては組織の限定的なサブセットで表現される。一部の転写 はリンパ系細胞でも見いだされるが、一連の異なった表現を示すａｃＤＮＡのう ちの２つの配列（１９，５および２０．５）は遺伝子生成物が正常のマウス卵巣 組織、胸腺、腸関連リンパ系組織、膵臓、および肝臓に表現される新規の複数の 膜にまたがっている蛋白質であることを示唆している。

１つの配列はヒトの卵巣悪性腫瘍および正常組織ともハイブリダイズされた。

上に本発明を一般的に述べたが、以下の具体例を参照すれば、さらによく理解で きるであろう。これらの事例は説明のためだけで提供されるのであって、特に他 の指定がない限りそれらに限定することは意図されていない。

例１ 細胞の分離、特徴付け、および培養 Ａ、　リンパ腫細胞株 Ｔリンパ腫細胞株５Ｌ１２．１．５Ｌ１２，３．５Ｌ１２．４およびそれらの間 でつくられた体細胞ハイブリッドの分離、特徴付け、および培養についてはヘイ ズ等、ｎム」工Ｃａｎｃｅｒ　３８　：　５９７−６０１　（１９８６）　；マ ツクリート等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４４　：１７８４−１７９０ 　（１９８４）　；マツクリート等、Ｊ　Ｎａｔ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ亙： ８７５−８８２　（１９８５）　；マツクリート等、２二と一一に源ＪよＡｃａ ｄ　’Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：６９８９−６９９３およびワインロス等、Ｃａｎ ｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４５　：　４８０５−４８０９　（１９８５）に詳 しく述べられており、これらのすべては本願に引例として組み込まれている。

５Ｌ１２．３および５Ｌ１２．４細胞クローンの表現型を表１に要約して示す。

転写表現、表面蛋白質表現、腫瘍原性、および腫瘍のタイプはノーザン分析、フ ロー・サイトメトリー、およびクローン化細胞の同系動物への一イ＞二Ｉ：！ｆ 注入によってそれぞれ判定された。ＴＣＲ−β１．０および１．３ｋｂ転写は（ Ｄ）−Ｊ−ＣおよびＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃ配列をそれぞれコード表現する。

グルココルチコイド応答は１ｍＭデキサメタシン中でのその細胞の成長によって 判定された。

表１ ＳＬ１２．４および５Ｌ１２．３細胞クローンの表現型特性５Ｌ１２．４　５Ｌ １２，３ ｒｈｙ−１＋　＋　＋　＋　＋ ＴＣＲ−アルファ　−＋ ＴＣＲ−β１．Ｏｋｂ＋− ＩＩＲＮＡ　１．３ｋｂ　−− ＣＤ３−イプシロン　＋　十／− 表　面　ＴｈＢ　＋　− 表　現　ＴＬ　十＋ Ｍｅｌ−１４＋ＮＴ グルココルチコイド　ＳＲ 感　性 腫瘍原性　低　高 腫瘍タイプ　結節外　拡散 Ｒ＝細胞溶解に抵抗性のある細胞 Ｓ＝細胞溶解の影響を受けやすい ＳＡＫ　８細胞（ガッソンおよびプールジェオイス、Ｊ　Ｃｅ１ｌＢｉｏｌ　９ ６４０９−４１５　（１９５３）はガツソン博士から入手した。

リンパ腫細胞はｌＯ％仔仔ウシ血清、グルタミン、ペニシリン、およびペニシリ ンおよびストレプトマイシンを加えたダルベツコの修正イーグルス培養液で培養 された。ヒト卵巣悪性腫瘍細胞株２００Ｂ　（ディサエア等、Ａｍ工Ｊ　０ｂｓ ｔｅｔ工ユ胆坦且月、４　：　９７９−９８９　（１９７２）　）およびＣ０Ｌ Ｏ３１６（ウツズ等、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３９　：　４４４９−４４５９ ））が５％子ウシ血清、グルタミン、および１％ファンギーバクト（アーヴイン ・サイエンティフィック社、カリフォルニア州すンタ・ＣＡ、）でを加えたＰＲ ＭＩ　３１６で培養された。これらの細胞がＲＮＡを作成するために用いられた 場合、１ｍ１２あたり５−８Ｘ１．Ｏ。

個の細胞数程度の密度で指数関数的に成長している時期に取り出された（ウィル キンソン、およびマツクリート、ＥＭＢＯＪ、７　：　１ｏｔ−１０９，（１９ ８８））。ＢＡＬＢ／　ｃマウスから取り出された膵臓リンパ球が３ＸＩＯ°個 の細胞／ｍＱの条件下でシードされ、ＲＮＡを取り出す前に２日間１０ｕｇ／＋ Ｑ　ＣｏｎＡで刺激を与えられた。

Ｂ、５Ｌ１２．４細胞および胸腺上皮単層の共生培養ＳＬ］、２．４細胞および 胸腺上皮単層の共生培養条件。要約すると、５Ｌ１２．４細胞は３日間の共生培 養後の最終的な濃度が１×１０°細胞／ｍｌとなるような密度でシードされた。

　置あるいはＴＥＰ　Ｉは３日目までには溶融状態になった。この細胞はｌＯ％ 胎仔性仔ウシ血清を含み、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを 加えたダルベツコの修正イーグル培養液で３７℃の温度下で培養された。

Ｃ，２０，５表現検討のための細胞株 ２０．５表現検討においては、以下の供給源からの細胞株が用いられた。胎仔性 悪性腫瘍Ｆ９およびＰＣＣ４（バーンスタイン等、力■且工Ｎ担ユ、」旦回工」 逗り一回襲−測：　３８９９−３９０３（１９７３）　、脳下垂体腫瘍Ａｒｔｚ ｏ　（ブアナッシーシ等、２二によ凰葺工紅封、鋭肚」鎧、旦：　１１８４−１ １９２　（１９６２）　）　、胸腺上皮ＴＥＰＩ　（ビアズリ−等、肚Ｘ二上蛙 ｈ］−史籾工」≧Ｌ−以述ユよびＭＥＦがフレッシュニー（フレッシュニー、（ １９８３）　Ｉｎ工Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、アラン 、Ｒ，リス社、ｐｐ９９−１１０）に従って調製された。これらの細胞は１０％ の胎仔性仔ウシ血清、グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシンを加 えたダルベツコの修正イーグル培養液で培養された。

ＲＮＡを調製するために用いられた細胞は１ｍ１２あたり５−８×１０゛個の細 胞を含んでいる培養基から指数関数的成長期に取り出された。ＢＡＬＢ／　ｃマ ウスから取り出された膵臓リンパ球が上に述べたのと同様のＲ，ＰＭＩＩ６４０ 内で３ＸＩＯ“でシードされ、ＲＮＡを取り出す前に、１０ｕｇ／ｄ　ＣｏｎＡ を使って６゜２４、４８あるいは７２時間刺激を与えられた。

例２ クローニングおよびスクリーニングの手法二本鎖（ｄｓ）　ｃＤＮＡ　（Ｇｕｂ ｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｇｅｎｅ　２５　：　２６３−２６９　（ １，９８３）　）を調製するために、５Ｌ１２．４細胞からのポリ（Ａ）”　ｍ ＲＮＡが用いられた。　ＥｃｏＲＩリンカ−が前もってメチル化されたｄｓ　Ｄ ＮＡに加えられた。脱リン化うムダｇｔｌｏアーム（ストラタジーン）がｃＤＮ Ａに結合されて、メーカーの指示に従って、ストラタジーン・パッケージング抽 出液を用いて、ラムダ・ファージにパッケージ化された（フイヌ等、Ｉｎ　Ｄ、 　Ｇｌｏｂｅｒ（ｅｄ）、ＤＮＡ　Ｃ１ｏｎｉｎ　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　：　 Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、英国（１９８４）　）。

減法ハイブリダイゼーションが、基本的にはへラドリック等（Ｎａｔｕｒｅ　３ ０８　：　１．４９−１５３　（１９８４）　）　、ティンバーレイク、Ｄｅｖ 、Ｂｉｏｌ、　７８　：　４９７−５０３　（１９８０）　）が述べた方法に従 って行われた。一本領ｃＤＮＡは１１００ｕ／ｄのアクチノマイシンＤの存在下 で２５０二〇〇″’ＰｄＣＴＰ（アマ−ジャム）を用いて１０ｍｇポリ（Ａ）” 　５Ｌ１２４　ＲＮＡから調製され、５Ｌ１２．３細胞からの２５ｍｇポリ（Ａ ）十を使って、８−の体積で、６８℃の温度下、１８時間、１２６０のロット（ １リツトルあたリモル×秒）にハイブリダイズされた。ハイブリダイゼーション 後、ｓｓ　ｃＤＮＡはヒドロキシアパタイト・カラムを通じてグロマトグラフイ ーによって集められた。出発時の５Ｌ１２．４．ｃＤＮＡのｌｕｇから、約１２ ０ｎｇ（３×１０“ｃｐｍを含んでいるインプットｃＤＮＡの１２％）が回収さ れ、ｌフィルターあたり２０．０００のラムダｇｔｌｏファージを含んでいる２ つの１５０ｍｍニトロセルロース・フィルターをプローブするために用いられた 。この５Ｌ１２，４ラムダｇｔｌｏライブラリーからの２つの二重フィルター・ リフトの内の第一のものは５Ｌ１２．３ｍＲＮＡからのすべてのｃＤＮＡを使っ てプローブされ、第二のものは前に述べたような５Ｌ１２．４減法強化ｃＤＮＡ でプローブされた。用いられた手法はフィルムス等が用いたのと同様であった。

　（別個に調製したサブトラクトされたプローブを用いて）、この悪疫純化ラム ダ・ファージ・クローンは５Ｌ１２．４固有のものと確認され、その後、５Ｌ１ ２．３細胞からではなく５Ｌ１２．４細胞からのｍＲＮＡに対してだけ、ハイブ リダイズされることを確認するために、ノーザン分析が行われた。ｃＤＮＡイン サートは低融点アガロース（Ｋｅｎ参照）で分離された制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｌ およびＢｇｌｎで消化することによってラムダＤＮＡから取り除かれ、Ｈｉｎｇ ｍおよびＢａｍ旧によって消化されたブラズミド・ベクターｐＴ７／Ｔ３　（ベ テスダ・リサーチ・インスティテユート）にサブコローンされた。Ｅｃｏ旧部位 はすべての分離株で損傷されるので、ＥｃｏＲＩを持ったファージからのインサ ートについては、実験を行うことはできなかった。　（クジエル等、Ｎｕｃｌ、 　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１５　：　３１８１　（１９８７）参照。）例３ ノーザン・プロット分析 Ａ、　一般的手順 総細胞性ＲＮＡが上に述べた様に修正された（ウィルキンソン等、ＥＭＢＯＪ　 ７　：　１ｏｔ−１０９（１９８８）　）グアニジン・イソシアネート法（マニ アチス等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　Ａ撫堕コ上り山恒匣旦、 コールド・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ− 、ニューヨーク州（１９８３）参照）によって細胞株および組織から分離された 。ノーザン分析のために、１０ｕｇのＲＮＡがホルムアルデヒドを含んでいる１ ％アガロース・ゲル内で電気泳動され、ニトロセルロース膜に移された（メイン コス、ワール、Ａｎａｌ、Ｂｊ、ｏｃｈｅｍ、１３　：　２６７−２８４　（１ ９８４）　）。

アクリジン・オレンジ染色（マニアティス等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎ 　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、コールド−ハーバ−・ラボラト リ−・プレス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州（１９８３） 　）および、アクチン、ＣＨＯ−Ａおよび／またはシクロフィリンｃＤＮＡとの ハイブリダイゼーションによって、ＲＮＡのまったく同じ負荷および移動につい ての評価が行われた。１０％硫酸デキストランおよび５０％ホルムアミドの存在 下で、４２℃の温度下、１２−１８時間、ランダム・プライムされたくアマ−ジ ャム）”Ｐラベル化ｃＤＮＡインサートとハイブリダイズされ、段階的に洗浄さ れ、最後に、４２−５０℃の温度下で、０．ＩＸ　５ＳＰＥ、　０．１％ＳＤＳ 内で３０分間洗浄された。ラベル化されたプローブを除去するために、０、ＩＸ 　５ＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳを用いて９０℃の温度下で洗浄され、室温まで 温度が下がったら、空気乾燥して、再度ハイブリダイズされるまで、真空下で保 存された。

Ｂ、Ｌｏｖ　（１９，５）　ＲＮＡのノーザン分析５Ｌ１２．４細胞は共生培養 後取り出され、４Ｍグアニジンイソチオシアネート、１Ｍ２−メルカプトエタノ ール、および２４關酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）で溶解された。その後、溶解 物は５．７Ｍ塩化セシウム／２ｍＭ　ＥＤＴＡの層上に置かれ、４℃の温度下で 、１８時間、３８０００ＲＰＭで遠心分離された。次にＲＮＡペレットをＴＥ緩 衝液内に再び懸濁させ、クロロボルム／ブタノールで２度抽出した。１０ｕｇの ＲＮＡが１％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲルの各レーン内で電気泳動され 、ニトロセルロース膜上に移された。このノーザン・プロットを、アマ−ジャム 類のランダム・プライム・ラベリング・キットを用いて０Ｐでラベルされていた Ｌｏｖ遺伝子のｃＤＮＡ遺伝子のｃＤＮＡインサートとハイブリダイズされた。

ハイブリダイゼーションは、１０％硫酸デキストランおよび５０％ホルムアルデ ヒドの存在下で、４２℃の温度下、１２−１８時間行う様にされた。その結果で きるオートラジオグラムを、走査レーザー密度計測によって、Ｌｏｖの変化に関 する分析が行われた。共生培養後、アクチンと誘発されていないＣＨＯ−Ａで再 度のハイブリダイゼーションを行って、見掛けの誘発をＲＮＡ負荷に関して正常 化した（マツクリート等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　８３　：　６９８９−６９９３　（１９８６）　）　。

それにより、報告された数値は、未処理の５Ｌ１２．４細胞と比較して、共生培 養内のＬｏｖ表現が修正倍率だけ増大された数値となっている。

Ｃ，２０，５（Ｔｅａ）　ＲＮＡのノーザン・ブ０’／ト分析総細胞性ＲＮＡが ５Ｌ１２，４．５Ｌ１２．３およびＢａ１ｂ／　ｃ　マウスからの新鮮な組織標 本から、上に述べたグアニジンイソチオシアネート法で分離された。細胞質ある いは核ＲＮＡが上に述べた方法で調製された。ノーザン分析を行うため、１０ｕ ｇのＲＮＡが１％ホルムアルデヒド・アガロース・ゲル内で電気泳動され、ニト ロセルロース膜に移された（マニアテイス等、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉ ｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、　：Ｉ−ルド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリ−・ブス、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク 州および、メインコスおよびワール（１９８４）　Ａｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、 　１３　：　２６７−２８４）。

例４ サザーン・プロット分析 Ａ、　一般的手順 総細胞性ＤＮＡが細胞、Ｔリンパ腫およびマウス−ハムスタ一体細胞ハイブリッ ドから分離され、他の種から取り出した組織は提供業者の指定する条件に従って 、図に示されている制限酵素を使って消化された。消化されたＤＮＡの１０マイ クログラムを０．７％アガロース・ゲルの各レーンに入れて、電気泳動させ、基 本的には上述（メインコスおよびワールＡｎａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、’　１３　 ：　２６７−２８４８４　（１９８４）　）されているようなナイトラン・サポ ートのプロットされ、ノーザン・プロット分析の場合に述べたのと同様にハイブ リダイズされ、洗浄された。

Ｂ、２０．５のサザーン・プロット分析２０．５のサザーン・プロット分析が、 以下に記す点を除いては上に述べたのと同様に行われた。

総細胞性ＤＮＡが５Ｌ１２．４細胞、マウスおよびハムスターの肝臓および体細 胞ハイブリッドから分離された。ヒヨコおよびヒトの肝臓からのＤＮＡはカリフ ォルニア州バロ・アルドのグロネテック社から入手した。このＤＮＡは提供業者 の指示に従って事例に記載されている制限酵素を使って消化された。消化された ＤＮＡの１０ｕｇが０．８％アガロース・ゲルの各レーンに与えられ酢酸トリス 緩衝液内で最低４８時間電気泳動され。ナイトラン・サポートに移されて、ノー ザン・プロット分析に関して述べられたのと同様にハイブリダイズされ、洗浄さ れた。他の種からのＤＮＡを含んでいるプロットは最初軽く洗い、最後に２ＸＳ ＳＰＥを用いて室温で洗浄された。

例５ 減法強化分画スクリーニングを用いての新規ｃＤＮＡの分離５Ｌ１２．４細胞に よって、あるいは５Ｌ１２．３におけるよりもより多く表現される新規ｃＤＮＡ クローンが特定され、例１−４に述べられているのと同様の方法で分離された。

４０，０００個の遺伝子組換えｇｇｔｌｏファージの最初のスクリーニングでは わずか１１の候補が得られただけで、そのうちの８つはサブトラクトされたプロ ーブを用いて再スクリーニングを行った後に回収されたもので、６つの異なった 遺伝子生成物を示しているようである。５つのｃＤＮＡクローンの特徴付けが行 われた。　５Ｌ１２．４および５Ｌ１２．３細胞からのノーザン・プロットは分 離されたｃＤＮＡが第１図に示されているように、５Ｌ１２．３および５Ｌ１２ ．４細胞において異なって表現されることを示した。対応する５Ｌ１２．４７細 胞に固有のｃＤＮＡクローンからの精製されたインサートがラベルされ、ノーザ ン・プロットをプローブするために用いられた。上に述べたように、各レーンは ５Ｌ１２．４および５Ｌ１２．３からの総細胞性ＲＮＡをｌ　Ｏｕｇ含んでいた 。このプロットはその後、上に述べた放射性物質でラベルしたｃＤＮＡインサー トでプローブされた。矢印は１８ｓおよび２８　Ｓ　ｒＲＮＡ転写のそれぞれの 移動度を示している。各レーンに負荷された５Ｌ１２．３および５Ｌ１２．４の 量は、例３の場合と同様、ＣＨＯ−Ａ　ｃＤＮＡでハイブリダイゼイションで判 定して、同じであった。

ｃＤＮＡクローンの一部は５Ｌ１２．４細胞（１９，５および２０．５）だけで 表現されたのに対して、他のもの（１９，１，１９，２および１９．４）は５Ｌ １２．４でより多く表現された。ｃＤＮＡのいくつかはいろいろな転写サイズを 示したが、これはそれらの転写が異なった部位で開始されたり、終了したり、切 断されたりする可能性のあること、あるいはそれらの転写が密接に関連した遺伝 子から誘発される可能性のあることを示唆している。

ｃＤＮＡクローンは両方の５Ｌ１２細胞株に存在している低コピー数あるいは単 一コピー遺伝子に対応している。　５Ｌ１２．３細胞株は１２．５および２０． ５転写の検出可能な表現を欠いているので、その転写不在を説明するために、我 々はその遺伝子が消去されたのか、あるいは再構成されたのかを調べてみた。５ Ｌ１２．４および５Ｌ１２．３細胞、そして正常な肝臓ＤＮＡからのゲノム性Ｄ ＮＡがＥｃｏＲＩ、　ＨｉｎｄＩＩＩあるいはＰｓｔｌで消化され、ｃＤＮＡク ローンに対する精製インサート・プローブを用いて分析された。第２図は５Ｌ１ ２，４固有ｃＤＮＡクローンのサザーン・プロット・ハイブリダイゼイションを 示している。　ＡＫＲマウス肝臓、ＳＬｌ、２．３゜５Ｌ１２４およびＳＡＫク ローン化Ｔリンパ腫細胞株、および５Ｌ１２，３ｘｓＬ１２４．５ＡＫＸＳＬ１ ２，４．５ＡＫＸＳＩ、１２．３ハイブリツド細胞からのゲノム性ＤＮＡ（ル− ンあたりｌｏｕｇ）がＥｃｏＲＩを用いて消化され、例４で述べたｃＤＮＡクロ ーンでハイブリダイズされたサザーン・プロットにより分析された。（ラムダＨ ｉｎｄｍ消化ＤＮＡの共生培養により判定された）キロベース・ペアでのフラグ メント・サイズを欄外に示す。１つ、あるいは複数の制限フラグメントがそれら プローブで確認されたが、これは対応する遺伝子がマウス・ゲノムの低コピー数 で両方の細胞株に存在していることを示している。ハイブリダイゼイションの強 度はすべてのレーンでほぼ同じであったが、これは、それらの遺伝子が５Ｌ１２ ，３細胞ＤＮＡに同じ量、そして、４つの異なった酵素（第２図）を用いての検 出可能な配列変更なしに存在していることを示している。したがって、Ｓ　Ｌ　 １２細胞クローンにおける遺伝子の表現における違いは細胞固有の調整機能に関 係しており、特定の遺伝子の喪失や、検品可能な程度の配列変更とは関係がない 可能性がある。しかしながら、５Ｌ１２．３細胞における小規模な配列変更ある いは点変異の可能性を完全に否定することはできない。

５Ｌ１２．４固有ｃＤＮＡクローンは新規遺伝子を示している。１．９．１゜１ ９．２．１９．５および２０．５ｃＤＮＡクローンの配列は完全に確認されてい る。公表されている配列との有意の類似性は存在していない。これらの配列は第 ３．１３．２０．２１図および第２２図に示されている。

１９．４配列は部分的に判定されているだけであるが（３，６ｋｂの約２．８Ｋ ｂ”）　、ＤＮＡデータ・バンクにおいて、転写サイズ、表現レベル、および組 織パターンなどで、配列上の重要な類似性は確認されていない。さらに、ｃＤＮ Ａクローンのいずれも知られているＴ細胞遺伝子、ＡＲＫ細胞株で表現されるこ とが知られている腫瘍遺伝子、あるいはレトロウィルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ）遺伝子と、転写サイズ、あるいは表現の頻度などにおいて対応していない。（ 萩原等、Ｊ、　Ｔｍｍｕｎｏｌ、　１３８　：　２５１４−２５１７゜（１９８ ７）　；ヘラクツオード等、Ｊｌ遣工徂劇よ工：　３６５２−３６６３（１９８ ６）　；レッグレア等、ＥＭＢＯＪ　５　：　３２２７−３２３４　（＋９８６ ）　；ムシンスキ等、サイエンス２２０　：　７９５−７９８　（１９８３）　 ；ヤグー等、Ｃｅ１ｌ　４２　：　８１−８７　（１９８５）　；クイント等、 Ｊ、Ｖｊｒｏｌ。

３９：　１−１０（１９８１）　；セルトン等、ＥＭＢＯＪ　４　：　１７９３ −１７９８（１９８５）　）。

これらによって確認されたｃＤＮＡおよび転写のサイズとオープン・リーディン グ・フレーム（ＯＲＦ４）の長さを表２に示す。

表２ ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡ転写のサイズ 井Ｊ　旦Ｊ　皿、ｊ　１９５ ｃＤＮＡインサート サ　イ　ズ”　１．６　３．２　３．９　１．２転　写　８．４ ＊　ｃＤＮＡインサート・サイズはキロベース（ｋｂ）ベアで示されており、Ｄ ＮＡ配列の分析で判定された。

＃ｋｂで示されている転写サイズは、資料および方法に述べられているホルムア ルデヒド・アガロース・ゲル内での１８３および２８ＳリボゾームＲＮＡへのそ れぞれの遊走によって概略判定された。

の略。そのＤＮＡ配列はＰＲＦの位置を特定するためのマイクロジェニー社製ソ フトウェアを用いて調べられた。表中の−は長いＯＲＦが発見されなかったこと を示している。１９．４の場合のＬＯＲＦ２４００ｂｐのデータは、配列情報が 不完全なので、予備的なものである。

＋＋　１９．２のｃＤＮＡは４５０ｂｐより長いＯＲＦを２つ含んでいる、再検 査してみれば、実際にはつながっていて、従って９２０ｂｐである可能性もある 。

転写およびｃＤＮＡインサート・サイズの比較に基づいて、我々は、いずれのｃ ＤＮＡも十分な長さではないと判断している。

１９．１ｃＤＮＡの１．６ｋｂ　ＤＮＡ配列は長いＯＲＦはまったく含んでおら ず、ｐｏｌｙＡ索を有しており、３つの未翻訳配列を示しているらし−い、　１ ９．２ＤＮＡは長さが３．５ｋｂであるが、比較的短い０ＲＦ（４７１ｂｐ’　 。

表２）である。１９．４ｃＤＮＡの部分的な配列は２．４ｋｂのＯＲＦを示して いる。１９．４の場合と同様、１９．５ｃＤＮＡクローンはコード配列を含んで いるようであり、はとんど゛全長にひとしい。

例６ １９．５ｃＤＮＡの分析 １９．５ｃＤＮＡクローンは複数の膜にひろがった蛋白質をコード表現するよう である。　１９．５ｃＤＮＡおよび目標アミノ酸配列を第３Ａ図に示す。配列化 の基本方針を第３ｂ図の示す。ｃＤＮＡ配列は１９．５クローンにコーディング 領域全体が存在していることの以下のようないくつかの証拠を提供している。ｌ ）目標開始位置の前、そして目標とされる３つの未翻訳領域内部のすべての３つ のリーディング・フレームに停止信号がある；２）目標メチオニン開始部位が最 善の翻訳開始部位（３０）のためのＣＸＣＡＵＧ　Ｇ　（ＸはＡ、Ｃ，Ｇあるい はＵのいずれでもあり得る）コザック・コンセンサス配列により取り囲まれてい る；３）終止コードンの３つにポテンシャル・ポリアデニル化信号、ＡＴＴＡＡ Ａ　（３１）に存在している。

誘導されたアミノ酸配列は３２，９８１ドルトンという目ｅｌ（未修正）蛋白質 サイズを示し、第３Ａ図に星印で示されている２つのポテンシャル・グリコジル 化部位を示している。目標アミノ酸配列はグリコジル化あるいはホスホリル化の いずれか、あるいは両方で変更できる分子量の正確な予測値を提供する。インテ リジエニテイツクス社製ソフトウェア・プログラムを用いて、４つの疎水性で膜 を越えて広がっている可能性のある領域が確認されている（第３Ａ図で下線を付 している）。信号配列は確認されなかった。目標蛋白質の物理的な属性に基づい て考えられる膜関連構造のスケッチを第３Ｃ図に示す。目標とされる構造はニコ チン酸アセチルコリン受容体ａのなごりであり、蛋白質あるいはＤＮＡ配列の類 似性は認められなかった。第３図は１９．５ｃＤＮＡクローンのＤＮＡおよび目 標蛋白質配列を示している。パネルＡは二本鎖シーケンシングを用いて得られた ｃＤＮＡ配列および目標アミノ酸配列を示している。ＤＮＡ配列を組み立て、目 標アミノ酸配列を調製するためにマイクロジェニー（ベックマン）が使用された 。パネルＢはサブクローニングのために用いられたｃＤＮＡ内部の制限部位を示 している。オープン・リーディング・フレームは垂直の点線で示されている。両 方の鎖とも完全なインサートと４つのサブクローンからプラズミドｐＴ７Ｔ３の Ｔ３およびＴ７に対するプライマーと１つの合成オリゴヌクレオチド・プライマ ーを用いて配列が決められた。目標蛋白質の物理的な特性を調べ、パネルＣに示 されているスケッチを作成するために、ｐｃジーンノソフトウエア・プログラム ：　５ＯＡＰ、　ＨＥＬＩＸＭＥＭ。

Ｎ０ＶＯＴＮＹ、　ＲＡＯＡＲＧＯ５が用イラれた。

例７ 体細胞ハイブリッドにおける１９．５遺伝子表現のネガティブ調節 ５Ｌ１２．３および５Ｌ１２゜４細胞株における１９．５に関連した転写の異な った表現について、５Ｌ１２．３および５Ｌ１２．４細胞の融合によっでつくら れた体細胞ハイブリッド（ＳＬ１２，３　Ｘ　５Ｌ１２．４）を用いて調べられ た。これらのハイブリッドは、それらが通常安定した、そしてほぼ四倍体に近い 染色体数を有しているので特に有益である。この５Ｌ１２．３　Ｘ５Ｌ１２．４ ハイブリツド細胞は７９個の染色体を有しており、数年間の期間にわたってどの 染色体も失われていない。第４Ａ図は１９．５転写の表現が５Ｌ１２，３　ｘＳ Ｌ１２，３ハイブリツド細胞で強く抑制されていることを示している。さらに、 ５Ｌ１２．４細胞および他の２つのＴリンパ腫細胞株、１９．５ｍＲＮＡ　（第 ４Ａ図）の表現を欠いている５ＡＫ８あるいは５Ｌ１２．１の間の融合も、第４ Ａ図に示すような検出可能な１９．５転写を欠いたハイブリッド細胞をもたらす 。

３つの体細胞ハイブリッドのすべてにおける１９．５遺伝子表現の量が少ないこ とは、第２Ｓ図に示されているようにＬ１２゜３および５Ｌ１２．４細胞株から のＤＮＡを比較するサザーン・プロットがバンド・サイズや強度において検出可 能な相違を示すことができなかったからであって、遺伝子の喪失や重要な遺伝子 配列変更によるものではない。さらに、５Ｌ１２．４の親が寄与した遺伝子を含 んでいる染色体がそれらの細胞のほぼ四倍体の染色体と細胞核タイプの安定性を 与えられた３つの独立したハイブリッドにおいて失われた。　１９．５ｃＤＮＡ によって示される遺伝子は５Ｌ１２．４細胞と１９．５遺伝子表現を欠いている ３つの異なったＴ細胞細胞株の間の体細胞融合体においてネガティブに調節され る。これらの結果は、５Ｌ１２．３によってつくられされた遺伝子の異なった表 現に関与している可能性があることを示唆している。同様に、ＴＣＲ−ベータお よびＣＤ３−デルタ転写が５Ｌ１２．３細胞内に存在するネガティブ因子によっ て調節されることが示された。５Ｌ１２．４細胞との融合パートナ−として３つ の異なったＴリンパ腫細胞が用いられ、そして３つの融合のすべてで検出可能な １９．５ｍＲＮＡを表現することができないので、ネガティブ因子が１９．５遺 伝子表現に関与している可能性がある。１９．５対立遺伝子の変異、あるいは５ Ｌ１２．４親細胞からの多少の消失が異なった細胞供給源から誘導されたこれら ３つの融合体において起きる可能性がある。

異なった直線配列の細胞間の体細胞ハイブリッドの研究において、分画に固有な メツセージがもはや蓄積されない表現型消滅という現象が観察されている（ダビ ッドソン、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、団狙酊ユ亙：　１９５−２１８　（１，９７４）　；ハイマンおよびス トーリングズ、Ｉｍｍｕｎｏ　ｅｎｅｔ、ｉｃｓ　６　：　４４７−４５８　（ １９７８）　）　、同じ直線配列の密接に関連した細胞間で形成されたハイブリ ッドにおいて、表現型消滅は頻繁に起きる現象ではない。直線配列状の体細胞ハ イブリッドにおいて抑制が起きる場合、それは通常、特定の、その親細胞株の１ つで表現されるトランスアクトする抑制因子にその原因がめられる。成長ホルモ ン遺伝子の場合、体細胞ハイブリッドにおける抑制は特定のポジティブ・アクチ ベーター、ＧＨＦ　］上に間接的に行われる例８ ＳＬ１２．４クロ一ン固有配列の組織分布１９．５に対応する遺伝子が普遍的に 表現されるのか、組織に固有な形態で表現されるのかを調べるために、種々のマ ウス組織から取り出されたＲＮＡが調べられた。第４図は体細胞ハイブリッドに おける１９．５および２０．２ｃＤＮＡおよび正常マウス組織における１９．５ の表現パターンを示している。第１図および例３に述べられたようにノーザン・ プロットが作成された。

パネルＡは１９．５および２０．２の表現に関しての評価が行われた５Ｌ１２． ３．５Ｌ１２．４．５ＡＫ８および５Ｌ１２．１親細胞株およびハイブリッド細 胞からのＲＮＡを示している。パネルＢは正常組織およびＢａ１ｂ／　ｃマウス から取り出された器官からのＲＮＡを示している。転写サイズはアクチン、サイ クロフィリン、１８および２８ＳリボゾームＲＮＡによるそれぞれの遊走に基づ いて予測された。１．９．５ｃＤＮＡは１．７および１．５ｋｂの２つの転写に ハイブリダイズされた。これらのプロットはランダム・プライムした１９．５ｃ ＤＮＡインサートによりプローブされ、その後、すべてのレーンがほぼ同量のＲ ＮＡを含んでいることを再確認するためにＣＨＯ−Ａ、アクチンおよび／または サイクロフィリン（ｃｐ）によってプローブされた。このＣＰコントロールは、 正常の細胞からのＲＮＡを評価する際、正常の組織に対してはアクチンより信頼 性の高いＲＮＡ負荷の測定方法であるように思われた。

プロッティング前のゲルのアクリジン・オレンジ染色により同じように負荷され るように思われた。

少量の１９．５ｍＲＮＡがＧＡＬＴ　（バイエル板細胞を含む腸関連リンパ系組 織）、脳、心臓および肺に存在しており、卵巣においては転写は非常に豊富であ る（第４Ｂ図）。１９．５転写は肝臓や腸では検出できなかったしく第４Ｂ図） 、膵臓、來丸、骨髄、休止肺臓リンパ球、あるいはＴ細胞ミトゲンＣｏｎ　Ａに より活性化された肺臓リンパ球においては検出できなかった。

１９．５に関連する転写は非分画胸腺リンパ球において検出されないしく第４Ｂ 図）、精製ＣＤ４　ＣＤ８二重陰性胸腺リンパ球においても検出されないが、ｍ ＲＮＡは胸腺全体と（第４Ｂ図）、ひとつの胸腺上皮細胞株（置）に存在してい る。したがって、胸腺基質細胞が転写を表現する可能性がある。

新規ｃＤＮＡクローンのいくつがはその表現においてリンパ系直接配列だけに限 定されないｍＲＮＡを示している。この知見は正常の脳細胞でも表現されるｒｈ ｙ−１およびＣＤ４などの知られたＴ細胞機能を有している他の遺伝子（ロンバ ーブ等、Ｍｏ１Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、８　：　２２２４−２２２８　（１９８８ ）　、および、胸腺の皮質上皮細胞にも見いだされるプレＢ細胞ネオプラズムの ためのマーカーである抗原６Ｃ３（アドキンス等、Ａｎｎ、ＲｅｖＩｍｍｕｎｏ ｌ、５　：　３２５−３６５　（１９８７）　）と類似している。５Ｌ１２．４ 細胞株は受容者である雌の動物（１４）の９５％の卵巣において顕著な結節外腫 瘍を誘発するので、正常の卵巣および卵巣性悪性腫瘍細胞株における１９．５転 写の表現はまぎられしい。対照的に、５Ｌ１２，３Ｔリンパ腫細胞は卵巣におい ては定着しない拡散性腫瘍を形成しくマクリード等１．Ｌ」（互、工引匹旦しユ 几匹コ５８７５−８８２　（１９８５）　）　、それらは１９．５転写を表現し ない。ひとつの知られたヒトＢ−リンパ腫（バーキッツ）はしばしば卵巣に転移 する（ハリソン、Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃ ｉｎｅ第１１版、ブラウンワルド等による編集、マグロウヒル社、ニューヨーク 州、（１９８７）　）　、　１９．５ｃＤＮＡは２つの異なったヒト卵巣悪性腫 瘍細胞株にハイブリダイズするので、１９．５遺伝子生成物が卵巣に定着して成 長していくことを可能にするその遺伝子を認知したり、あるいはそれを特定の場 所に導く機能がある。１９，５ｍＲＮＡが完全な胸腺リンパ球あるいは分画二重 ネガティブ胸腺リンパ球において見つからないとしても、その遺伝子が胸腺リン パ球の稀なサブセットに表現されたり、あるいは胎仔または成人のリンパ造成中 に一時的にだけ表現される可能性がある。インーサイツ・ハイブリダイゼイショ ン研究で、１９．５に関連した転写を表現する胸腺、卵巣および心臓内の細胞の タイプが明らかになるであろう。

表３は５つのｃＤＮＡクローンのすべてについて行われた表現研究の結果を要約 して示しである。

以下余白 表３ マウス組織における新規ｃＤＮＡクローンに間するｍＲＮＡの表現ＳＬ１２．４ 　＋＋　＋＋＋　＋　＋ 胸　腺　＋　＋＋＋　＋＋＋　＋ 肺臓リンパ球　−十−− ＣｏｎＡ”　＋　＋＋　＋＋　− ノーザン分析で評価された新規ｃＤＮＡに対して相補性のある転写の対応表現。

＋はプローブが示された組織からの転写を検出したことを意味する。すべての場 合で、マウス組織からの転写は５Ｌ１２−４細胞株からのＲＮＡと共に共遊走し た。−は５Ｌ１２．４細胞におけるより少なくとも１０−２０倍以下であること を示している。

５つのＣＤＮＡクローンのうちの４つはリンパ系組織で転写を検出する：　１９ ．１．１９．２．１９．４および１９．５は胸腺で検出可能なレベルに表現され る。　＋９．１．１９．２および１９．５の表現はＣｏｎ　Ａで刺激を与えた膵 臓リンパ球内で誘発されている：および１９、ｌ、　１９．２および１９．５は ＧＡＬＴにおいて表現される。いくつかの非リンパ系組織は１９．２および１９ ．５ｃＤＮＡプローブ（第４Ｂ図および表３）にハイブリダイズする転写を含ん でいる。

ヒト卵巣悪性腫瘍細胞株は１９，５ｃＤＮＡに相補性のある配列を表現する。マ ウス卵巣組織では高いレベルの１９．５遺伝子の表現が見られたので、卵巣悪性 腫瘍細胞株について、１９．５配列が存在するかどうかが調べられた。第２図に 示しであるように、５Ｌ１２．４細胞と２つの卵巣悪性腫瘍細胞株からの完全な ＲＮＡｌｏｕｇのノーザン・プロットがプローブされた。左側のプロットの最終 的な洗浄は、室温で２ＸＳＳＰＥを使って行われ、右側に示されている同じプロ ットがその後で０．２　Ｘ　５ＳＰＥを用いて室温で行われ、その結果、ヒトの ＲＮＡを含んでいるレーンからシグナルが喪失されたが、マウスから取り出され た５Ｌ１２．４ＲＮＡを含んでいるレーンからの喪失は認められなかった。

２つの確立されたヒト細胞株２００８およびＣ０ＬＯ３１６からのＲＮＡがノー ザン分析で評価され、１９．５ｃＤＮＡプローブ（第５図）にハイブリダイズす る１、７ｋｂ転写を含んでいることが認められた。中胚葉由来の細胞がその転写 を表現するという知見は、これらの細胞が正常な卵巣の重量の少ないパーセント しか構成していないので、多少、意外な結果である（それらは卵巣の外部表面上 の１つの細胞の厚みの層で見出される）。卵巣基質細胞もこの遺伝子を表現する 。１９．５ｃＤＮＡにハイブリダイズする転写の存在は、１９．５ｍＲＮＡをコ ード表現するものに関連した遺伝子はヒト・ゲノム内で見出されることを示唆し ている。

いるかどうかをアシ力、ハムスター、マウス、およびヒトからのＤＮＡのサザー ン・プロットをプローブすることによって判定するために、ＰｓｔＩで消化され た上に述べた供給源からのＤＮＡｌｏｕｇのサザーン・プロットがランダム・プ ライムされた°゛Ｐでラベルした１９．５ｃＤＮＡインサートでプローブされた 。これらのプロットは室温でｌＸ５ＳＰＨの最終的な厳格さで洗浄された。ヒト ＤＮＡを含んでいるレーンは比較的高いバックグランドを有している。レーンの 右側への点はマウス・プローブとグロス−ハイブリダイズする再現可能な程度に 検出できるＤＮＡフラグメントを示している。これらのＤＮＡのすべては単純な パターンのハイブリダイゼイションを示し、このことはこの遺伝子が哺乳動物種 に保持されていることを示唆している（第６図）。第６図に示されているように 、ラット、ウサギ、キツネザル、およびオラヌータンＤＮＡでも検出されている 。

このように、１９，５ｃＤＮＡクローンで示される遺伝子は哺乳動物の間に保持 されているようである。この遺伝子が保持されていることは、それが重要である が、まだ確認されていない機能を有しているかもしれないことを示唆している。

新規ｃＤＮＡプローブで認められる転写の豊富さは直接には確認されていない。

しかし、ノーザン・プロットでの比較で、１９．２と１９．５は比較的豊富では なく、コピー数はＴＣＲ−ベータｍＲＮＡの場合より少ない。５Ｌ１２．４細胞 からクローンされた遺伝子のうちの４つは胸腺で検出可能な程度に表現され、活 性は正常のリンパ系組織および恐らくＴ細胞個体発生において調節される遺伝子 の分離にとって有益である。

本レポートで述べられている新規ＤＮＡクローンのいずれもこれまでに明らかに されている遺伝子配列に対応するものではない。ＰＣジーン社のプログラムであ るプロサイト（インテリジェニティック）が、ポテンシャル・ヌクレオチドある いはＤＮＡ結合部位、亜鉛フィンガー、リューシン・ジッパ−１酵素活性部位、 細胞標的部位、あるいは構造蛋白質、の受容体、サイトカイン、および成長因子 の特徴について、１９．２゜１９．４．１９．５および２０，５ｃＤＮＡで示さ れる目標蛋白質を調べるために用いられた。現在の時点で、我々はこれらが潜在 的にどのような機能を果たす可能性があるかについての何の手掛かりももってい ない。

以下の理由から、これらの遺伝子が分画という事態に関与する生成物をコード表 現している可能性がある。ｌ）これらの遺伝子が胸腺リンパ腫変異の別の段階を 示しているらしい５Ｌ１２．３および５Ｌ１２．４細胞クローンに異なって表現 される；２）これらの遺伝子はそれらの表現において繊維特異性を示す；３）　 １９．１．１９．２および１９．４遺伝子表現はＴ細胞ミトゲンＣｏｎ−Ａによ り活性化された牌臓Ｔ細胞に誘発される。　４）　２０．５および１９．５関連 遺伝子が初期の胚で段階に固有な方法で表現される。

それら一連の新規ｃＤＮＡクローンが興味深い表現パターンおよび調節を示す遺 伝子によりコード表現される。これらは細胞分画、Ｔリンパ腫の特定の場所への 誘導、そして形質転換されたＴ細胞プロジェニターの腫瘍原性特性を規制する分 子メカニズムを調べる上で有益であろう。これらのｃＤＮＡクローンはまた、こ れら新規Ｔ細胞遺伝子を持っている細胞の場所を特定するためのプローブとして 、そして、かなり純粋な新規Ｔ細胞蛋白質の供給源としても有益である。

例９ Ｌｏｖに対するポリクローナル抗体の生産ＵＣ５Ｄコア社で、１４アミノ酸オリ ゴペプチドが合成された。

構成されたペプチドの配列はに−Ｇ＊−Ｈ−Ａ−Ｄ−Ｒ−Ｅ−Ｑ−Ｅ−８−Ｅ− Ｅ−Ｅ−Ｖである。この配列はＬｏｖの目標とされるＣ−終止末端の最後の１３ のアミノ酸を示しており、それに担体への接合の指標として使用するための“Ｃ グリシンが追加されている。このペプチド２ｍｇが３０分をかけてグルタルアル デヒドをゆっくり加えて、４ｍｇの担体蛋白質キーホール・リンプツト・ヘモチ アニン（ＫＬＨ）にリンクされた。次に１品夜、ＰＢＳに対して透析された。免 疫化の前に２匹の雌ニューシーラント・ホワイト・ウサギ（ホルバーツー年齢６ カ月）から１０−の血清が得られた。次に、この動物に対してフロイント・コン プリート・アジュバントの存在下で接合ペプチドが注射された。フロイント・イ ンコンプリート・アジュバントでの０．２＋ｎｇペプチドの次のブースター注射 は４週間後に行われたＥＬＩＳＡによる抗Ｌｏｖ抗体を生産するするために血清 のウィークリー・テスト・ブリードの評価が行われた。

例１Ｏ Ｌｏｖ抗血清の分析 Ｌｏｖを認識する抗体の存在がＦＬＩＳＡアッセイによってモニターされた。オ リゴペプチドおよびＫＬＨがウェル内のＥＬＩＳＡ板上で間接乾燥された。次に 、その抗血清の種々の希釈液が加えられ、２時間、反応のために放置された。プ ロット内に洗浄した後、サンプルは二次抗体（西洋ワサビパーオキシダーゼにリ ンクされたヤギ抗−ウサギＩｇＧ　（Ｆｃ）　）の１　：　１０００希釈液内で ２時間培養された。西洋ワサビパーオキシダーゼは基質としてのＨｌｏｌおよび ＯＰＤを利用して比色反応の触媒としての役割を果す。その結果は自動ＥＬＩＳ Ａリーダーで分析された。抗体の力価が定常状態に達した時、これらのウサギは 貧血状態を呈した。細胞成分を用いたＥＬＩＳＡアッセイで、細胞は音波処理に よって溶解させた。４５０００ｇで３０分、溶解物を遠心分離することによって 膜分画が分離された。次に、膜とシトソリツク分画はＥＬＩＳＡウェルで一晶夜 乾燥された。

例１１ 蛍光抗体分析 １０“共生培養あるいは未処理ＳＬ］、２．４細胞を２０ｕｌの緩衝液Ａ（５％ 胎児性仔ウシ血清および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ　）内に懸濁 させた。次にＬｏｖに対する抗血清を１　：　１００希釈液５０ｕ１を加えて、 氷上で３０分間培養させた。緩衝液Ａ中で３回洗浄した後、それらの細胞を氷上 で、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１ＯＯＯに希釈）でさらに３０分間培養した。相 互作用の特殊性についてのテストが行われた実験においては、その抗血清をそれ らの細胞に加える前に、等しい体積の１ｍｈ／ｍＱオリゴペプチド溶液がその抗 血清に加えられた。これらの細胞は４８８ｎｍの間隔でレーザー光を発している サイトフルオグラフ５０Ｈ蛍光活性化細胞ポーター上で分析された。死んだ細胞 はヨウ化プロビジウムで染色して排除した。５０００個の細胞を分析して、結果 をヒストグラムで表した。

例１２ Ｌｏｖ蛋白質の免疫沈澱反応 バーロウおよびレインがＩｎ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒ　Ｍａｎｕａｌコールド・スプリング・ハーバ−・プレス、ニューヨーク州 （＋９８８）で述べた手順に従って、免疫沈降反応に関する研究が行われた。細 胞はメチオニンを含んでいない媒体内で４時間、”Ｓメチオニンでラベルされた 。次にこれらの細胞はＲＩＰＡあるいはＮＰ４０溶解緩衝液内で溶解された。溶 解物は予め免疫された血清５０ｕｌを追加して氷上で１時間培養し、交差反応性 蛋白質がブドウ球菌アウレアス（カルバイオケム社提供）を用いて免疫沈降され た。次に、５ｕｌの免疫血清が加えられ、１時間の培養後、免疫沈降された。次 に、素材を洗浄して、５ＤＳ−ＦＡＧＥゲル上で電気泳動させた。エンハンスメ ント後、当業者には公知の方法でオートラジオグラフィックのためにフィルムに 露出させた。

例１３ Ｌｏｖの遺伝子マツピング 中国ハムスタースフ９２体細胞ハイブリッドの作成および特徴付けについてはこ れまでにも述べられている（コザック、（１９８３）　Ｊ　Ｖｉ工劇よ弧：　３ ００−３０３）。これらのハイブリッドが１．０ｋｂ１９．５ｃＤＮＡインサー トでプローブされた時に各種に特有のパターンを与える酵素であるＰｓｔｌで完 全に消化された。消化されたＤＮＡは２５ボルトで７２時間、０．８％ガロース ・ゲル上で電気泳動させ、ナイトラン膜上に移した。次に、上の操作で得られた プロットがＳａｐラベル化Ｌｏｖ　ｃＤＮＡでプローブされ、コダックＸＡＲフ ィルムに露出された。Ｌｏｖにハイブリダイズしているマウス染色体成分の証拠 がいくつかの細胞株で観察され、その結果をコンピュータで分析して、Ｌｏｖマ ウス染色体局在化のための最善の候補が判定された。

例１４ 胸腺上皮単層上での共生培養後、Ｌｏｖ表現が５Ｌ１２．４細胞で誘発される。

置　（グリムチャー等、ジ眠」旦　Ｊ−ハ１旦ルＩユ、二：１．−１．１（１９ ８３）　）およびＴＥＰＩ　（ビアズリ−およびヘイズＮａｔ１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０　：　６００５−６００９　（＋９８３）　）は５Ｌ１ ２．４細胞で安定したＣＤ４およびＣＤ８遺伝子を誘発できる２つの不死性胸腺 上皮細胞株である。置あるいはＴＥＰＩ単層のいずれかの上で３日間、５Ｌ１２ ．４細胞が共生培養された後、ＬｏｖｍのｍＲＮＡが評価された。第７図のノー ザン・プロットは、両方のＬｏｖの転写（１，７゜１．５ｋｂ）が共生培養に対 応して誘発されることを示している。

両方の胸腺上皮細胞株はこの誘発を導き出すことができるが、置共生培養後のＬ ｏｖの表現はＴＥＰＩと比較して、その強度が高い（表４）。示されている数値 は密度計測による分析後の５つの個別の実験の平均値および標準誤差を示してい る。さらに、５Ｌ１２．４細胞におけるＬｏｖ　ｍＲＮＡのレベルの増大は刺激 を与える胸腺単層後にも継続している。非胸腺付着細胞（ＭＭＥ　：乳房上皮細 胞株およびＡＫＲＩ−２Ｂ：線維芽細胞株）は５Ｌ１２．４細胞におけるＬｏｖ 表現には誘発的影響を及ぼさない。ＬｏｖｃＤＮＡの５′および３′領域に対応 する１００ｂｐフラグメントがノーザンをプローブするために用いられた。両方 のプローブともＬｏｖの両方の転写を認識する。

表４ 置およびＴＥＰＩ共生培養後の遺伝子表現の比較１丞工ＣＣ置　’　ｃｃ　ＴＥ ＰＩ ＣＤ４　１．１±０．１　１．９±０．３ＣＤ８　１．５±０．１　２．８±０ ．５ＴｃＲ−ｃｃ　２．０±０．１　１．５±０．２Ｌｏｖ　３．７±０．３　 ２．９±０．２ＣＤ４　、　ＣＤ８　、　ＴＣＲ−ｃｃ、　１９．５　（Ｌｏｖ ）で次々にハイブリダイズされ、最後にアクチン／ＣＨＯ−Ａでハイブリダイズ されたノーザン・プロットから得られたオートラジオグラムがレーザー密度計測 でスキャンされた。この密度計測シグナルが負荷されたＲＮＡの量のコントロー ルとしてアクチン／ＣＨＯ−Ａを用いて正常化された。報告された数値は誘発さ れたｍＲＮＡのハイブリダイゼイション強度を誘発されていないｍＲ，ＮＡで割 った比率を示している（したがって、それらの数値は未処理５Ｌ１２．４細胞で 検出されたものの平均倍増加士ｍＲＮ＾蓄積の平均値の標準誤差を示している） 。

胸腺上皮単層上でこれらの細胞を共生培養すると、５Ｌ１２．４細胞の変異が引 き起こされるようである。本明細書においては、新規遺伝子、　Ｌｏｖもこの措 置後に５Ｌ１２．４内で誘発されるらしいことを示した。Ｌｏｖの配列はコード 表現された目標蛋白質が複数の膜にまたがった領域を複数含んでいる表層分子で ある可能性を示唆している。メツセージ（３−４倍の誘発）とＬｏｖの表面表現 における両方の増大が胸腺上皮上での共生培養後に観察された。　Ｌｏｖ表現の これらの誘発も、共生培養後に分離されたクローンが組織培養の数か月後にも高 いＬｏｖ表現を維持したという点で、安定しているように思われる。

この誘発の規模は比較的小さいので、その誘発が転写によるものか、転写後のメ カニズムによるものかを判定するための核ランーオン実験を行うことはできない 。

Ｌｏｖ　ｍＲＮＡは１．７ｋｂおよび１．５ｋｂの２つの転写サイズで構成され ている。これらの転写の両方とも５Ｌ１２．４細胞の共生培養胸腺上皮単層上に 同じように誘発される。さらに、両方の転写はＬｏｖ　ｃＤＮＡからの５′およ び３′プローブによって認識される。

これらの転写が別の開始部位、切断、ポリアデニル化シグナル、あるいはその他 のメカニズムから発生するのかどうかは分かっていない。しかしながら、Ｌｏｖ を表現するテストされた別の成人組織（例えば、卵巣、心臓）においては大きな 方の転写だけが観察される。さらに、発達中のマウスの胚の内部には、１５日目 までに両方の転写の表現から大きな方の転写だけを表現する傾向へのずれが存在 しているようである。

１．７ｋｂ転写だけが成長した動物における機能性蛋白質に関するコード表現を 行っている可能性がある。

例１５ ＳＬ１２．４細胞膜上でＬｏｖ蛋白質が検出可能Ｌｏｖに対する抗体は５Ｌ１２ ．４細胞の細胞質膜に見出されるエピトープを認識する。Ｌｏｖの最後の１３の アミノ酸に対するポリクローナル抗体がウサギで、抗原としての合成ペプチドに 対して形成された。これらの抗体は５Ｌ１２．４細胞の細胞質膜にむすびついて いる抗原を認識する。第８図はＬｏｖの表面表現に関する５Ｌ１２．４細胞の蛍 光抗体分析を示している。これらのヒストグラムは免疫血清で染色された５Ｌ１ ２．４細胞の蛍光と免疫前血清で染色した５Ｌ１２．４細胞との対比を示してい る。透析可能にされた細胞を顕微鏡で調べることにより、抗体の結合が細胞質膜 上でだけ観察され、細胞質は染色しなかった。また、姉妹リンパ腫細胞クローン 、５Ｌ１２．３の蛍光性データも示されている。５Ｌ１２．３細胞はＬｏｖに対 してｍＲＮＡは表現せず、その細胞表面でＬｏｖ表現はまったく示さなかった。

この抗原に対する免疫血清抗体の結合も免疫性オリゴペプチドを適量加えること で阻止された（第９図）が、不適切なオリゴペプチドでは阻止されなかった。５ Ｌ１２．４細胞の、サイトソリツク（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ）分画ではなく膜調製 もＥＬＩＳＡで評価した場合、Ｌｏｖ蛋白質を示した。

Ｌｏｖのカルボキシ端末に対応する合成オリゴペプチドに対して形成される抗体 は、５Ｌ１２．４細胞の表面に見出されるエピトープをＩ８識する。関連した細 胞株でＬｏｖ　ｍＲＮ、Ａを表現しない５Ｌ１２．３は蛍光で評価した場合、蛋 白質も表現しない。Ｌｏｖ蛋白質の免疫沈降に関する研究が行われたが、免疫前 血清との異常な量の特定されない相互作用が行われるようである。

Ｌｏｖ蛋白質が恐らくそれほど豊富でない（これらの細胞におけるｍＲＮＡの基 準表現に対比した場合）という事実は、これらの実験をさらに複雑にした。それ にも拘らず、５Ｌ１２．４およびＦ６（高いＬｏｖレベルを表現している細胞ク ローン）内の”３５Ｓ−メチオニン・ラベリング上に３つの固有の帯が存在して いるが、５Ｌ１２．３細胞においては存在していないようである。これら３つの 帯もその特殊なオリゴペプチドを競合的に追加した後に消失する。３２ｋｄｂ帯 はＬｏｖバックボーンの目標分子量と関係している。２２ｋｄ帯は切断による生 成物である可能性があり、一方、５０ｋｄ帯はＬｏｖの解糖形態を示している可 能性がある。

例１６ Ｌｏｖの表面表現の誘発 Ｌｏｖの表面レベルでの表現も胸腺上皮単層上での３日間の共生培養後に誘発さ れた。ＦＡＣ５分析が５Ｌ１２．４細胞上で３日間の共生培養後に行われた。第 １Ｏ図は胸腺上皮の処理後、５Ｌ１２．４上での検出可能な量のＬｏｖ蛋白質が 誘発されることと示している。このヒストグラムは刺激を与えた５Ｌ１２．４と 刺激を与えていない５Ｌ１２．４での抗血清とブレブリードとの対比を示してい る。置上で共生培養された５Ｌ１２．４細胞を未処理の５Ｌ１２．４細胞を比較 した場合の結果も示されている（下側のグラフ）。これらのグラフは対数スケー ルを用いて表示されている。ＴＥＰ　Ｉ細胞もＬｏｖ誘発に関して同様の反応を 示した。

胸腺上皮単層上で予め共生培養された細胞クローンはより高いレベルの１９．５ の基底表現を示した。ある種の細胞においては、共生培養はより高いレベルのＬ ｏｖをもたらした。置あるいはＴＥＰ　ｒ上での共生培養後、多数の細胞クロー ンが５Ｌ１２．４から分離された。クローニングは限界希釈法で行われた。例え ば、Ｆ６は置単層上で３日間共生培養された後の５Ｌ１２，４細胞集団から誘導 クローニングされた細胞である。これらの細胞クローンは数か月間、刺激性の胸 腺上皮を含まない正常の媒体で培養された。Ｆ６上の表面蛋白質に関するＲＮＡ およびＦＡＣＳ分析の両方のノーザン分析とも、この細胞クローンが親の５Ｌ１ ２．４細胞におけるより、安定的により高いレベルのＬｏｖ表現を有しているこ とを示している。分離、テストされた他の細胞クローンはいろいろな量のＬｏｖ 表現を示した。胸腺上皮単層上でのこれらの細胞クローンをさらに共生培養して もＬｏｖ表現は有意に増大しない。

例１７ 染色体の局在 ゲノム性ＤＮＡが特定のセットのマウス染色体を含んでいるハムスター−マウス 体細胞性ハイブリッド細胞から調製された。ＰｓｔＩ制限酵素消化の制限パター ンはハムスターとマウスとの間では違っていた（第１２図、レーン１，２）。Ｌ ｏｖでプローブしたこれらのハイブリッド細胞のサザーン・プロットは少数のハ イブリッドだけがマウス・パターンのハイブリダイゼーションを含んでいること を示した（第１２図）。多数のこうしたハイブリッド細胞株に関するサザーン分 析に基づいて、最良の相関関係が得られたのはマウス染色体１６に関してであっ た。サンプル番号７７はそのマウス由来成分が染色体１６であるハイブリッド細 胞である。表５は染色体Ｉ６がテストされたハイブリッド細胞中でＬｏｖに関す る不一致度が一番受ないことを示している。Ｌｏｖ遺伝子はさらに染色体１６の 特定の領域にマツプされた。

以下余白 表５ 特定のマウス染色体と一連のマウス−ハムスタ一体細胞ハイブリッドにおける■ 、ｏｖ遺伝子の存在との間の一致度の分析 １　５　６　４　３　３８．９ ２　６　６　１　４　２９．４ ３　２　７　４　１　３５．７ ４　５　９　３　１　２２．２ ５　２　９　７　０　３８．９ ６　６　５　１　５　３５゜３ ７　５　４　２　５　４３．８ ８　４　８　５　２　３６．８ ９　５　９　４　１　２６．３ １０　１　９　８　．０　４４，４ １１　０　１０　８　０　４４．４ ＋２　２　４　２　４　５０．０ １３　６　７　．３　３　３１，６ １４　３　９　４　１　２９．４ ＋、７　５　４　１　４　３５゜７ １８　５　６　２　３　３１．２ １９　４　５　３　５　４７、Ｉ Ｘ　６　８　３　２　２６．３ マウス−ハムスタ一体細胞ハイブリッドを用いての１９．５（Ｌｏｖ）遺伝子の マツピング。記号は２０．５ｃＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーションで 検出された左側のカラムの番号で示される特定のマウス染色体の存在（／＋）あ るいは不在（／−）に関連してのマウスＬｏｖ制限フラグメントの存在（＋／） あるいは不在（−／）を示している。不一致観察の回数は十／−および−／十の 観察回数の合計である。＊これらのいずれのハイブリッドも核型化されていなか った。それらは別の標識に関連してタイプ分けされたもので、したがって、例外 が染色体の間違った配列であるということはあり得る。

例１８ Ｌｏｖ蛋白質の免疫沈降反応 Ｌｏｖ蛋白質のサイズを決定するために、免疫沈降反応に関する研究が行われた 。新しく合成された総蛋白質をラベルするための°°Ｓと表面蛋白質を合成する ための“１°■の両方が用いられた。両方のウサギからの前免疫血清は特定され ない横縞を有していた。溶解物には多数の横縞が存在しているが、少数の特定の 横縞が確認されている。分子量が２２および３２ｋｄに対応する２つの横縞は− Ｓメチオニンにラベルされた５Ｌ１２．４細胞に固有のようである。前免疫血清 、あるいは５Ｌ１２．３細胞からつくられた溶解物のいずれにも、両方の横縞共 存在しなかった。しかしながらこれら２つの横縞は”１８１でラベルされた細胞 においては認められないが、その代わりに、５０ｋｄの横縞が５Ｌ１２．４に認 められるが、５Ｌ１２．３細胞では認められなかった。バックグランドの横縞の 量を減らすことが試みられた（例えば、ＩｇＧ分画の硫酸アンモニウム沈降、合 成オリゴペプチドと結合したセファロース・カラム上での抗体の親和性純化、Ｌ ｏｖを高度に表現する因子としてのクローンＦ６の使用）が、観察された非特定 相互作用を減らすことには成功しなかった。

したがって、Ｌｏｖ遺伝子はその細胞表面上で表現される蛋白質をコード表現す る。さらに、ＬｏｖのレベルはこれらＴリンパ腫細胞株の成熟段階と関係してい るように思われる。胸腺上皮での共生培養後、５Ｌ１２．４細胞が二重ポジティ ブ（：Ｄ　＋　ＣＤｓ十表現型にシフトされるばかりでなく、これらの細胞にお けるＬｏｖ表現もかなり増大する。Ｌｏｖはいずれの既知の配列とも類似性を持 たない新規のｃＤＮＡおよび蛋白質である。Ｔｈｙ−１およびＴ−２００などの 多くの他のＴ細胞標識は、それらの機能が確認される前に開示されている。Ｌｏ ｖはＴリンパ腫細胞株から分離されたのであるが、他の細胞タイプもこの遺伝子 を表現することができる。Ｌｏｖの表現パターンが考えられる機能を理解するた めの手掛かりを与えてくれるかもしれない。

最も高いレベルのＬｏｖ　ｍＲＮＡを表現している組織は胸腺、腸関連リンパ系 組織（ＧＡＬＴ）　、および卵巣である。最初の２つの座はリンパ球が見出され る正常の部位である。５Ｌ１２．４が同系マウスに注入された際、卵巣が腫瘍が 形成される最初の場所であることは興味深い。さらに、卵巣°は広範なリンパ組 織を含んでいる。バイエル板とも呼ばれるＧＡＬＴ細胞は高内皮管（ｅｎｄｏｔ ｈｅｌｉａｌ　ｖｅｓｓｅｌ）に制限されており、それらを通過するためには抗 原Ｍｅｌ−１４が必要である。５Ｌ１２．４細胞はその細胞表面にＭａｌ−１４ を表現し、したがって、小腸のこれら特殊化された場所に存在する可能性がある 。Ｌｏｖは細胞の表面に表現されるので、それはリンパ球を特定の場所に向かわ せる上で一定の役割を果す可能性がある。Ｌｏｖはリンパ球および胸腺リンパ球 群全体で検昌されなかった。おそらく、それはＴ細胞の少数の特定サブセットで は表現されず、主要な特性ではないのである。５Ｌ１２．４は数値的にはあまり 頻繁には現れない正常胸膀リンパ球を示しているのかもしれない。

例】９ ｃＤＮＡライブラリーの構成と２０．５遺伝子のスクリーニング他のクローンと 同様、ｃＤＮＡライブライ−の構成と２０．５遺伝子のためのスクリーニング、 例１−４までの場合と同様に行われた。ｃＤＮＡインサートは制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩｌおよびＢｇＩＩＩで消化することによってラムダＤＮＡから取り除かれ、 プラグミド・ベクターｐＴ７／Ｔ３　（ベテスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社 ）にサブクローンされた。

例２０ ２０．５あるいはＴｅａのＤＮＡ配列分析制限エンドヌクレアーゼ・マツプが判 定され、フラグメントがｐＴ７Ｔ３にサブクローンされ、そのプラグミドを塩化 セシウム上で精製して、シーケナーゼ試薬（Ｕ、　Ｓ、バイオケミカル社、オハ イオ州クリーブランド）を用いて二本鎖ジデオキシ配列法によって直接、配列決 定された。この配列の一部は宿主プラグミドに対するプライマーを用いて判定さ れ、ｃＤＮＡに対してのＵＣ５Ｄキャンサー・センター・コア・モルキュラー・ バイオロジーの施設で作成された。両方のＤＮＡ鎖ともその全体の配列が決定さ れ、すべての配列は繰り返し行われた少なくとも２つの相互作用において判定さ れた。重複配列情報を集めてそのＤＮＡ配列の最初の分析を行うためにマイクロ ジェニー社のコンピュータ・プログラムが用いられた。

例２１ ２０．５の遺伝子マツピング チャイニーズ・ハムスター×マウス体細胞ハイブリッドの作成と特徴付けはこれ までにもホーガン等によって、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ且：　１０５５−１０５６　（１ ９８８）に述べられている。ＮＦＳ／Ｎ系マウスがミツドランド州ベテスダのＮ ＩＨ１天然資源部から入手された。Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕ ｓマウスは最初、デンマーク、スキーヴエで捕らえられた、に、ポーター博士（ ＮＣＩ、　ＮＩＨ１契約番号Ｎｏ、　ｌ　−ＣＢ　２−５５８４　）がミツドラ ンド州ロックビルのへイゼルトン・ラボラトリーズで飼育していたマウスから取 り出された実験コロニーから入手された。実験動物をつくりだすために、ハイブ リッドＮＦＳ／Ｎ　ＸＸ、ｔｘ、成長雌個体（複数）は阿８ｍ、成長雄成長上戻 し交配された。ＤＮＡはマウスの肝臓から抽出され、Ｓａｃ　ＩおよびＢａｍ旧 で消化され、０．４％アガロース・ゲル内で、４８時間、２４ボルトで電気泳動 され、ナイロン膜（ハイボンドＮ＋、アマージャム社）に移された。膜はじ°Ｐ ］ラベルした２０．５ｃＤＡＮおよび染色体８上に存在しているＤＮＡポリメラ ーゼＢ遺伝子を示している４３８ｂｌ）プローブでハーイブリダイズされた（マ ツダブライド等、イン・プレス）。

膜は上に述べたのと同様に洗浄、プローブされた。同じマウスからの腎臓サンプ ルが澱粉ゲルでの電気泳動後、組織化学的染色によって標ＲＧｒ−１とＥｓ−１ の遺伝に関してタイプ分けされた（リソンおよびホプキンス、”Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ　ｏｆ　ＥｎｚｙｍｅＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、”　、ノース・ホーランド・パブリッシング社、アムステル ダム（１９７６）　）。

例２２ ２０、５ｃＤＮＡクローンの分離とＤＮＡ配列ｇｇｔｌＯ（１６，２４）　テ（ ７）４０．ＯＯＯ＋７）メンバー　１’構成され６ＳＬ１２．４ｃＤＮＡライブ ラリーを５Ｌ１２．３ｍＲＮＡに対して減法処理した５Ｌ１２．４ｃＤＮＡを使 って、そして、同時に上に述べたような総５Ｌ１２．３ｃＤＮＡを使って複製フ ィルター（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ　ｆｉｌｔｅｒｓ）でスクリーニングした。この スクリーニング法は２０．５遺伝子の特徴付けを行うために用いられた。下に述 べるような表現特性に基づいて、このｃＤＮＡクローンはＴｅａ　（ＩＣｅｌｌ 　ｅａｒｌｙａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ　：　Ｔ細胞早期活性化遺伝子） と命名された。

このクローンからのインサートが両方の鎖で二本鎖法によって配列決定され、そ の配列が第１３図に示されている。　ｃＤＮＡインサートは長さが２３９７塩基 対で、塩基対４０９から始まって１７６９まで伸びている単−長オープン・リー ディング・フレームを含んでいる。ｃＤＮＡはポリアデニル化シグナル配列、あ るいはポリＡトラクトを含んでいない。２０．５ｃＤＮＡ配列は複数の膜に広が った蛋白質を予報する。第１３図は４９．５７キロドルトン（未修正）を有する 目標とされる蛋白質の目標４５３アミノ酸配列を示している。このｃＤＮＡ配列 は、目標Ｎ端末メチオニン・コードンが最善の翻訳開始部位であるコザック・コ ンセンサス配列（ＧＸＣＡＵＧ　Ｇ　：ここでＸはＡ、Ｕ、ＧあるいはＣのいず れか）に取り巻かれており、目標とされる５′および３′未翻訳領域は３つのリ ーディング・フレームのすべてに複数のストップ・コードンを含んでいるので、 コーディング領域全体を含んでいるようである。目標蛋白質の物理的属性はマイ クロジェニー社およびＰＣ遺伝子プログラムを用いて分析された。第１３図に３ つのＮ−グリコシレージョンの可能性がある部位を星印で示しである。この目標 蛋白質は９つの高度の親水性を有する領域（第１３図の下線部分）を持っており ；そのうちの７つはインテリジェネティックス社のソフトウェア・プログラム５ ＯＡＰ、　ＨＥＬＩＸＭＥＭ、　Ｎ０ＶＯＴＮＹおよびＲＡＯＡＲＧＯＳを用い た分析に基づいて、膜を横断してひろがっている領域の特性を有していることが 分かっている。

このＴｅａ遺伝子はＴリンパ腫細胞と正常の膵臓から採取したＴリンパ系細胞と では異なって表現される。２０．５ｃＤＮＡクローンで認識される転写の表現に ついての評価が行われた。第１４図はＴｅａ遺伝子表現を示す。コーディング領 域全体を含んでいる精製インサートはランダム・プライミングで°゛Ｐを使って ラベルされ、内部で各レーンが５Ｌ１２．４細胞、５Ｌ１２．３細胞、上に述べ た細胞株あるいは正常Ｂａ１ｂ／　ｃマウスからの組織からの総細胞性ＲＮＡ　 （あるいは、パネルＢの場合、細胞質あるいは核ＲＮＡ　）を１０ｕｇ含んでい るノーザン・プロットをプローブするために用いられた。ノーザン・プロットの オートラジオグラムをパネルＡ−Ｄに示す。パネルＡは５Ｌ１２．３細胞株内の Ｔｅａ　ｍＲＮＡと５Ｌ１２．４細胞株内でのそれとの比較を示している。

パネルＢは５Ｌ１２．４細胞からの総細胞性、細胞質性および核ＲＮＡにおける Ｔｅａ　ｍＲＮＡ表現を示している。パネルＣは文中に述べられている一連の細 胞株におけるＴｅａ　ｍ、ＲＮＡ表現を示しており、パネルＤはＢａ１ｂ／　ｃ マウスからの上に述べた正常組織から採取したＲＮＡを含んでいる（ＧＡＬＴは 腸に関連したリンパ系組織である）、各パネルに示されているキロベース（ｋｂ ）での転写のサイズはＢＲＬ標識および１８および２８Ｓ内因性リボゾームＲＮ Ａに対するそれぞれの遊走によって推定された。アクリジン・オレンジ染色およ び°゛ＰＰサイクロフイリンｙｃ）および／または°”　Ｐ−Ｃｈｏ−Ａラベル ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって、すべてのレーンにおけるＲＮＡ の負荷と転写に関する評価が行われた。

２０．５ｃＤＮＡプローブは５Ｌ１２．４細胞内には存在しているが、Ｔリンパ 腫細胞には存在していない４ｋｂおよび７ｋｂ程度の２つの転写を認識した（第 １４Ａ図）。それらが両方とも細胞質内で見出される成熟した転写であるかどう か、あるいはその大きな方のＲＮＡが核前駆体であるかどうかを調べるために、 これらの２つの転写の細胞内での位置について調べられた。両方の転写とも細胞 質内に見出されるので、それらはいずれも十分に処理されたＲＮＡであるように 思われる（第１４Ｂ図）。

別の転写過程、転写の別の切断、あるいは別のポリアデニル化シグナルなどから 発生するのかもしれない。成長した細胞質性転写（７およびｋｂ）はｃＤＮＡク ローンより大きい。したがって、ｃＤＮＡは、それはコーディング領域全体を含 んでいるように思われるが、十分な長さではない。両方の転写とも、ｃＤＮＡク ローンの５′（ヌクレオチド１から３８０）および３′（ヌクレオチド２００５ から２３９４　）領域につくられたプローブで検出され、これはｃＤＮＡが２つ の異なった転写を結びつけたクローニング・アーチアクトではないことを示して いる。２つの成熟したＲＮＡに加えて、いくつかのより大きな、それ程たくさん はない転写が、切断されていない、あるいは部分的に切断された核前駆体である 可能性がある核および総細胞性ＲＮＡ標本に存在している（第１４Ｂ図）。胚（ Ｆ９およびＰＣ４）、乳腺上皮（ＭＭＥ）および神経（ＡＴｔ２０）由来のいく つかのマウス細胞株が、Ｔｅａ　ＲＮＡに関して調べられた。これらの細胞株の いずれも検出可能なレベルのＴｅａ　ＲＮＡを表現しない。それとは対照的に、 胸腺上皮（ＴＥＰＩ）および腺維芽細胞（３Ｔ３゜ＭＥＦ）由来の細胞株はＴｅ ａ　ｍＲＮＡを含んでいるが、それは５Ｌ１２．４Ｔリンパ腫細胞における方が はるかに豊富である（第１４Ｃ図）。

正常の組織およびリンパ系直線配列の細胞がＴｅａ遺伝子を表現するかどうかを 調べるために、マウス組織ｍＲＮＡからつくられたノーザン・プロットが調べら れた。胸腺、休止膵臓、できるレベルのＴｅａ　ｍＲＮＡを含んでいない（第１ ４Ｄ図）。しかしながら、Ｔｅａ転写はＴ細胞ミトゲン・コンカナバリンＡ（Ｃ ｏｎＡ、第１４Ｄ図）で活性化された正常の膵臓細胞では誘発された。ＣｏｎＡ は通常外来性抗原を適切に与えると、通常、細胞クローンに特有の方法で肺臓Ｔ 細胞の活性化を模擬的に行うために用いられる。肝臓はテストされたうちではか なりの量のＴｅａ　ｍＲＮＡを表現した唯一の非リンパ系組織である。Ｔｅａ転 写は腸、胃、卵巣（第１４Ｄ図）、脳、心臓、肺、腎臓、膵臓、あるいは事大で は誘発された。したがって、Ｔｅａ遺伝子表現は活性化膵臓細胞、胸腺上皮細胞 、Ｔリンパ腫細胞および肝臓など、少数の細胞タイプに限定されている。

例２３ Ｔｅａ　ｍＲＮＡの誘発 Ｔｅａ　ｍＲＮＡの誘発をさらに調べるために、ＣｏｎＡが膵臓リンパ球に加え られてから６，２４．４８および７２時間後に作成された。

第１５図は活性化膵臓リンパ球内におけるＴｅａ遺伝子の作用メカニズムを示し ている。Ｔ細胞ミトゲンＣｏｎ　Ａによる活性化後の上に述べた時間に取り出さ れた休止および活性化膵臓細胞からのＲＮＡのノーザン分析が行われた。第１５ 図、パネルＡは７２時間の時、パネルＢはＲＮＡと、各レーンで負荷されたｎ＋ ＲＮ＾の対応する量のを示すためにコントロール・プロブ・サイクロフィリン（ Ｃｙｃ）と共に示している。Ｃｙｃ飄ＲＮＡの場合と違って、ｒＲＮＡはアクリ ジン・オレンジ染色で評価した場合と同様、各レインにおいて同様であった。こ れらＴｅａ転写は休止膵臓リンパ腫においては検出されないが、６時間後には検 出可能になり、約４８時間後にピークに達する。アクリジン染色で評価を行った 場合、各レーンにおけるＲＡＮの総量は同じであったが（１０ｕｇ）　、それぞ れにおけるリボゾーム対ｍＲＮＡの比率は、総転写１０ｕｇあたりのアクチン、 ＣＨＯ−Ａおよびサイクロフィリン転写が増加するので、Ｔ細胞活性化の過程で 変化するらしい（第１５図）。しかしながら、Ｔ細胞活性化中にこれらのコント ロールに対するＴｅａ遺伝子表現が誘発されることは明らかである。

例２４ ２０．５ＤＮＡおよびアミノ酸配列のマウスのエコトロピックレトロウィルス（ ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ）受容体との類似性バイオネット社 のデータ・ベースを用いての類似性に関する研究の結果、２０．５ｃＤＮＡと前 に述べた他のＤＮＡ配列との間に有意の配列類似性は認められなかった。しかし ながら、この配列をマウスエコトロビッグ　レトロウィルスｃＤＮＡクローン（ ＥＲＲ）　の最近の報告（アルブリットン等、Ｃｅ１ｌ　５７．６５９−６６６ 　（１９８９）　）と比較して、配列上のかなりの同一性が認められた。エコト ロピック　レトロウィルス受容体をコード表現する遺伝子はＲｅｃ−１と命名さ れた。第１６図は２０．５ｃＤＮＡ配列のＥＲＲｃＤＮＡ配列との比較を示して いる。第１６図は２０．５およびＥＲＲｃＤＮＡ配列の列を示している。第１６ 図、パネルＡで、配列分析の対象に含まれているＥＲＲおよび２０．ｃｃＤＮＡ 配列の領域は垂直線で示しである。各ｃＤＮＡのオープン・リーディング・フレ ームが示されている。パネルＢに、２０．５のｃＤＮＡ配列全体が各線の対の上 側の直線に示されており、ＥＲＲ（ｂｐ２４２５）のｃＤＮＡ配列は最初の４０ ０の塩基対を欠いており、多対の底部に示されている。水平線は配列の同一性の 位置を示している。

マイクロジェニー社のソフトウェアを用いて、最も類似性の高い配列の直線配列 ができたｇａｐｓとの比較が行われた。明らかに重複しているｃＤＮＡの領域に ついてだけ、同一性がその％で示されている。なお、２０．５ｃＤＮＡは３′端 末でずっと長く、ＥＲＲｃＤＮＡは５′端末でずっと長い。

２つのｃＤＮＡのスケッチ（第１６図）はＥＲＲｃＤＮＡが５′端末でより長く 、２０．５ｃＤＮＡ配列は３′端末でずっと長いこと、そして２つのｃＤＮＡの 全体的な長さはほぼ同じであることを示している。それぞれのコーディング領域 は各ｃＤＮＡクローンのクロスハツチされた部分で示されている。このＤＮＡ直 線配列は２０゜５の重複した領域（ｂｐ　１から２０４７）間の全体的なりＮＡ 配列特性を示しており、ＥＲＲｃＤＮＡ　（ｂｐ４００から２４２５）は５９％ 、そして２０．５ｃＤＮＡのひとつの領域（ｂｐｌｏｌｌ−１０８８）の同一性 が８０％である。２０．５ｃＤＮＡ配列の５′−兆≦Ｌ二ｒｌユ仁久領域（ｂＰ 　１がら４１０まで）はＥＲＲｃＤＮＡ配列の重複する５′コーデイング領域と ６８％の配列同一性を有しており、このことはこれ２つの遺伝子が共通の配列か ら誘導されたことを示している。

目標されたＴｅａ蛋白質は形質導入された蛋白質、イオン・チャンネル、および 糖トランスポーターはどの複数の膜にまたがった領域を有する他の蛋白質との構 造的類似性を有している。しかしながら、ＥＲＲｃＤＮＡから誘導されたＥＲＲ 目標蛋白質を例外として、これらの遺伝子群との有意な配列類似性、あるいは他 の知られている蛋白質配列との有意の類似性は認められなかった。ＥＲＲ蛋白質 を有するＴｅａ目標蛋白質のひとつの直列配列はアミノ酸配列がかなり同一の２ つの領域を示す（第１７図）。第１７図はマウスエコトロピック　レトロウィル ス受容体を有するＴｅａ目標配列の直線配列を示している。パネルＡで、ライン ・スケッチは比較された２つの蛋白質生成物の領域を示しており；　Ｔｅａ蛋白 質はアミノ酸１−４０４の範囲で広がっており、ＥＲＲ蛋白質はアミノ酸２０４ −６０３の範囲で存在している。パネルＢで、２つの目標蛋白質の直線配列が、 上側は２０，５　ｃＤＮＡ、下側はＥＲＲｃＤＮＡによって予報されるアミノ酸 配列を示している。括弧はかなりのアミノ酸同一性を示す２つの領域の境界線を 示しており、領域１は１９２アミノ酸に関して８１．３％の同一性があり、領域 ２は７９アミノ酸に対して５１．９５の同一性を示す。括弧で示される領域ｌは ８１％の配列同一性および１９３アミノ酸に対して９１％の類似性を有している 。アミノ酸の保存性に関する違い（トリトル・Ｒ，Ｏｆ　Ｕｒハ」耐愈りユエエ 」咀り四」匣」Ｌ工凪Ｌｌｌ工血匹蝋１吐凹ａｃｉｄ　ｓｅ　ｕｅｎｃｅｓエユ ニバーシティ・サイエンス・ブック、カリフォルニア州ミル・バーレイ１９８６ ）は２つの点で示されており、アミノ酸の同一性はそれら２つの間の長めの点線 で示されている。

Ｔｅａ予報遺伝子生成物とは対照的に、このＥＲＲ蛋白質はより大きく、１３− １４目標膜横断拡大領域を有している。さらに、それはより短い親水性カルボキ シ−末端および同様の長さのアミノ−末端を有している。これらの蛋白質の予報 カルボキシ−およびアミノ−末端が配列上で最も相違を示している。

ＥＲＲおよび他の複数膜横断蛋白質と同様、Ｔｅａ遺伝子生成物はシグナル配列 を含んでいない。こうした比較はかなりの程度のアミノ酸類似性を示すが、それ でも、これら２つの蛋白質は明きらかに別の遺伝子生成物である。

第１８図は図の説明に書かれているような物理的属性を調べるためにＰＣ遺伝子 プログラムを用いてつくられた目標蛋白質構造のスケッチを示している。第１８ 図はＴｅａおよびＲｅｃ−４遺伝子の目標蛋白質生成物の物理的な属性を示して いる。パネルＡはＴｅａ目標蛋白質のモデルを示している。太い線はＥＲＲとの かなりの類似性を有している２つの領域を示している。インテリジェニティック ス社からのＰＣジーン・ソフトウェア・プログラム：　５ＯＡＰ、　ＨＥＬＩＸ ＭＥＭ、　Ｎ０ＶＯＴＮＹ、　ＲＡＯＡＲＧＯ５を用いて、示されたモデルをつ くるために＠種蛋白質の物理的属性が調べられた。パネルＢは疎水性比較のため に分析された２つの目標（ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）蛋白質（Ｔｅａ蛋白質について はアミノ酸ｌ−４，０３，ＥＲＲについてはＥＲＲ蛋白質）のその領域を示して いる。

パネルＣはＴｅａ目標蛋白質（上）およびＥＲＲ目標蛋白質（下）の疎水性を示 している。

概略図示されているモデルはＥＲＲ蛋白質とのかなりの類似性を示す領域を強調 して示している。ＥＲＲは細胞表面蛋白質をコード表現するので、我々は重複領 域における２つの目標蛋白質のアミノ酸１−４０１．　ＥＲＲ蛋白質のアミノ酸 ２０４−６００）の疎水性を比較した。第１８図の上部の線画はこの疎水性プロ ットで比較された２つの蛋白質の領域を示している。これらの比較は４０１の隣 接アミノ酸をその対象として含んでおり、いちじるしい類似性を示す。したがっ て、Ｔｅａ遺伝子の生成物が細胞表面蛋白質である可能性はある。

このＴｅａ遺伝子は高級を椎動物で保持されているようである。これらＴｅａ遺 伝子配列が進化の過程で保持されているかどうかについて判断するために、ヒト 、ハムスター、マウス、およびヒヨコからのＤＮＡが、２０．５ｃＤＮＡプロー ブとのクロス・ハイブリダイゼイションに関してテストされた。サザーン・プロ ットをプローブするために十分な長さのｃＤＮＡクローンが用いられた際、テス トされたすべてのゲノム性ＤＮＡに関して検出可能なハイブリダイゼイションが 起きた（第１９図）。第１９図は異なった種のＤＮＡのサザーン分析および染色 体８のＴｅａ遺伝子の場所を特定するための遺伝子組換え近親交配ＤＮＡの分析 を示している。両方のパネルの°１ＰでラベルされたｃＤＮＡプローブは２０， ５ｃＤＮＡオゾンのほとんど全長に近い長さのＢａ１Ｉフラグメントであった。

パネルＡは「素材および方法Ｊに述べられているＢａ１ｌフラグメントでプロー ブされたヒト、ハムスター、マウスおよびヒヨコからのＰｓｔｌ消火ＤＮＡのハ イブリダイゼイション・パターンを示すオートラジオグラムを示している。パネ ルＢは遺伝子組換え近親交配動物から取り出された肝１１ＤＮＡのオートラジオ グラムを示している。第１９図は上に述べたいくつかの遺伝子組換え動物、およ びＳａｃ　Ｉで消化されたＮＦＳ／　Ｎ　１５！ＤＮＡから得られたハイブリダ イゼイションのパターンの例を示している。

検出されたＤＮＡフラグメントのいずれかがＲｅｃ−１遺伝子から誘導されたか どうかをテストで確認するために、２０，５ｃＤＮＡクローン（ＥＲＲｃＤＮＡ 配列とは非常に異なっている）の３′領域に対するプローブは同じ大きさのＤＮ Ａフラグメントにハイブリダイズすることが認められた。これらの結果は異なっ た３′末端により検出された配列も進化の過程で保持されること、そして他の種 のＤＮＡに対するクロス−ハイブリダイゼーションが２つのｃＤＮＡクローンの 間で最も違った配列をもたらすことを示している。前のセクションのデータと一 緒に得られた二のデータは、これらのＴｅａ遺伝子が他の種で見出されるＥＲ， Ｒとは異なった蛋白質をコード表現することを示している。カルボキシルおよび アミノ末端のアミノ酸配列の相違はこれら２つの蛋白質が別の機能を持っている 可能性を示唆している。

例２５ 染色体８に対するＴｅａ遺伝子のマツピングＥＲＲ遺伝子生成物はウィルス性受 容体として機能するので、他の知られている後傾受容体（コザツク、（１９８３ ）ユムニ！工ｏ１４８　：　３００−３０３）のひとつをコード表現することが 分かつている染色体上にあるかどうかについて判断するために、Ｔｅａ遺伝子が マツプされた。チャイニーズ・ハムスターおよびマウス細胞間の間につくられる いくつかの異なった体細胞ハイブリッドはそれぞれ限られた数の異なったマウス 染色体を保持している。Ｔｅａ遺伝子をマツプするためにこれらの遺伝子が用い られた（ホーガン等、（１９８８）よムーＸ上ロ象工匹：　１０５５−１０５６ ）。

ハイブリッド細胞からの０ｓｔｌ消化されたＤＮＡのサザーン分析は２１のハイ ブリッドのうち、７のハイブリッドがマウスに固有のＤＮＡフラグメントを含ん でいた。オイジテイブ・ハイブリダイゼイションを有している知られているマウ ス染色体成分とマウス固有ＤＮＡフラグメントの比較は最も大きな相関関係はマ ウス染色体８どのものであることを示している（表８）。

以下余白 表６ ハイブリッドの数 マウス　染色体１個あたりの 、Ｓ≧二亡Ｌし←−ＤＮＡ八イへリダイゼイション　＋ｆ二＝二歪に一印【−ｘ 二２１ツー」二２二辷　：Ｌどニニ　」二／〉二　−二１４１　５　９　２　４ 　３０．０ ４　４　３　２　３　２５．０ ５　２　１１　５　２　３５．０ ６　６　６　１　６　３６．８ ９　４　１０　３　４　３３．３ １０　０　１１　７　２　４５．０ １４　１　１０　５　２　３８．９ １５　４　０　０　８　６６．１ １６　３　９　２　４　３３．３ １７　６　４　０　７　４１．２ １８　６　６　１　４　２９．４ １９　５　７　２　５　３６．８ Ｘ　５　８　２　６　３８．１ マウス−ハムスタ一体細胞ハイブリッドを用いてのＴｅａ遺伝子のマツピング。

符号は２０．５ｃＤＮ＾プローブによるハイブリダイゼイションで検出された左 欄の番号で示される特定のマウス染色体の存在（ｌ十）あるいは不在（／−）に 関連するマウスＴｅａ拘束フラグメントの存在（十／）あるいは不存在（−７） を示す、不一致観察回数は；／−と−／＋との合計である。

本これらのハイブリッドはいずれも抜型ではない。それらはｓｌ！識別にタイプ 分けされているので、＋／−ハイブリッド細胞が染色体８のフラグメントを含ん でいたり、あるいは少ない割合の細胞がその染色体を含んでいることはあり得る 。

−／＋の例外は染色体８の一部を含んでいるが、Ｔｅａ遺伝子を含んでいる領域 を欠いている可能性がある。

こうした観察を確認し、さらに認識を広げるために、種間戻し交配によって、染 色体８上にＴｅａが位置付けられた。

５ｓｔＩで消化されたＤＮＡは、ＮＦＳ／　Ｎ　マウスが１０．０．７．４およ び５．５ｋｂのクロス反応性横縞を形成することを示した。Ｍｌｍ。

成熟ＤＮＡは１０．６．４および５．５ｋｂ、フラグメントをつくる。第１９Ｂ 図はＮＦＳ／ＮＸＭ、　ｒｎ、成熟Ｆ１マウスとＭ、　ｍ、成熟個体との戻し交 配における２０，５ｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼイションのパターンを示 している。染色体８を用いてのこの拘束フラグメント長多形性の分離パターンは 、この遺伝子がｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅ−Ｐｏｌｂ−１−Ｔｅａ−Ｅｓ−１（表７ および８）という遺伝子配列でＧｒ−１およびＥｓ−１に結合されていることを 示した。

表７ 種間戻し交配の５７プロジエニーにおけるＰｏ１ｂ　Ｇｒ−１およびＥｓ−１と いう対立形質によるＴｅａハイブリダイジング・フラグメントの分離。

ＮＦＳ　Ｎ　・立　ノ　の　本 ヱ皇区　！　Ｇｒ−Ｉ　Ｔ旦」　辷ユヱｌス例１親　＋　十＋　＋　２２ 組換え　−ｍ−＋９ 遺伝子　十　十−一〇 ＊＋＝対立形質を継承；−＝対立形質を継承せず。

以下余白 表８ 遺伝子組換え １旦丞１亙　ｎｌ　ｃＭ土ｑ ＰｏＪ、ｂ、　Ｇｒ−１６１５７１０，５＋／−４，１Ｐｏ１．ｂ、　Ｔｅａ　 ８１５７　１４．Ｏ＋／−４，６Ｇｒ−１、Ｅｓ−１１６１５７２８，０＋／− ５，９Ｐｏｌｂ、　Ｅｓ−１２２１５７３８，６非有意ａ、ｃｅｎｔｉｍｏｒｇ ａｎ（ｃＭ）の距離と各遺伝子座の標準誤差はサンプル・サイズｎにおける組換 え遺伝子の数がらのグリーン（１９）によって計算。

ｂ、１０３の戻し交配マウス（２２，３ｃＭ＋／−４，２）で総数２４の組換え 遺伝子に関して、さらに４６のマウスがＴｅａおよびＥｓ−１に関してタイプ分 けされた。

染色体８上でのＴｅａ遺伝子の位置はこの遺伝子がＥＲＲをコード表現し、染色 体５に局在化されているＲｅｃ−１遺伝子とは別のものであることの証拠を提供 している。それはまた、それがまだ染色体にマツプされていないＡ／１０ウィル スに対する受容体に関連しているかどうかを判定する十分なデータがないにせよ 、染色体ｌに局在化されているＭＣＦレトロウィルス受容体である可能性を完全 に否定する。

７０種類の遺伝子あるいは遺伝子生成物は、抗原提供細胞の表面の抗原と自己− 組織適否性の組み合せに反応してＴ細胞が活性化されると、表現が増えることが 知られている。レクチン、カルチウム、カルシウム１ｏｎｏｐｈｏｒｅあるいは Ｔ＃胞受容体に対する抗体など抗原に対するポリクローナル活性化因子は抗原に より誘発される反応に似た反応を引き起こす。これらの「活性化」遺伝子の一部 は細胞サイクルのＧ、とＧ１の間の推移に関与している。一部のものはシトキン をコード表現およびその受容体、核調節蛋白質をコード表現し、別のものはイオ ンと栄養を細胞に運んでそれらを成長させる働きに関与している。少なくとも、 ２６通りのＴ細胞「活性化Ｊ遺伝子生成物は細胞膜に存在していることが確認さ れている。

２０．５はＴ細胞活性化の過程で複数膜横断蛋白質をコード表現する可能性を有 しているクローン化遺伝子あるいはｃＤＮＡの最初の例である。

Ｃｏｎ、Ａあるいは抗原によって開始される肺臓子細胞活性化はペクチンあるい は抗原を与えてから数分以内に始まり、約７−１４日間続く。遺伝子表現の変化 はこの活性化の全期間・を通じて起きる。クラブツリーは遺伝子表現におけるこ うした変化をウィルス遺伝子活性化との類似性を手がかりに分類した（即時、早 い、遅い、および非常に遅い）。クラブツリーの基準から、Ｔｅａ　ｍＲＮＡが 通常の休止Ｔ細胞では検出できるレベルではほとんど見当たらず、６時間以内に 検出可能なレベルに増大し、約２４時間でピークに達するので、Ｔｅａは早い遺 伝子である。Ｔｅａ遺伝子の機能はまだ分がっていない；それはシグランル、あ るいはシグナル形質導入因子である小型の分子を形質導入するのがもしれないし 、あるいは未確認のりガンドに対する受容体として機能しているのかもしれない 、このＴｅａ蛋白質の比較的長いカルボキシ末端はシグナル形質導入因子として 機能しているのかもしれないが、こうした推測を支える証拠は存在していない。

５Ｌ１２．４Ｔリンパ腫細胞および多数の他のＴおよびＢ腫瘍細胞はこの遺伝子 を表現せず、Ｔｅａ遺伝子表現は細胞の成長に必要ではない。しかしながら、我 々の研究は正常なＴ細胞がＴ細胞の活性化を伴う正常な細胞の増殖を受ける上で Ｔｅａ遺伝子表現を必要としている可能性を完全には否定しなかった。この遺伝 子の表現との相互作用が、リウマチ病やその他のＴ細胞を媒介とする免疫性疾患 など自己免疫疾患におけるＴ細胞の活性化を阻止する可能性はある。

Ｔｅａ蛋白質とＥＲＲ蛋白質の驚くべき類似性は、少なくとも、４つの種類のマ ウス・レトロウィルス受容体が一般的に定義され、ただ１つだけが分子的にクロ ーンされているので、Ｔｅａ遺伝子生成物がマウス・レトロウィルス性受容体を して機能している可能性を示唆している。染色体８にＴｅａ遺伝子を局在化する と、Ｔｅａが遺伝子組換え自己指向性ＭＣＦウィルス受容体をコード表現すると いう可能性は排除し、それが染色体８に局在化されていたアムホトロビック（ａ ｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）なレトロウィルス受容体をコード表現するという可能性 を提起する。マウス組織において漠然と表現されるＲｅｃ−１遺伝子（ＥＲＲを コード表現する）とは対照的に、Ｔｅａ遺伝子はより限定的な組織分布を有して いる。Ｔｅａ遺伝子がレトロウィルス受容体として機能する蛋白質をコード表現 すると、限定的組織分布はリンパ系連鎖に拘束されているレトロウィルスの特性 を提供する可能性がある。受容体が媒介する拘束の前例はＣＤ４をその主要受容 体をして用いるヒトのレトロウィルスＨＩＶである。しかしながら、細胞固有受 容体はマウス・レトロウィルスの組織特性に全体的に関与してはいないらしい。

レトロウィルスにより示される組織指向性はＬＴＲの組織特性、ｇｐ７ｏ　ｅｎ Ｖ蛋白質のバリエーション、細胞因子および／または何らかの細胞表面受容体の 表現など、一連の複雑な要因によりもたらされる可能性がある。ウィルスに関す るＥＲ，Ｒ結合部位が確認されると、その部位がＴｅａ蛋白質との高度の類似性 を有する領域の内部かどうかを判定することが可能になる。

Ｔｅａ蛋白質がウィルス受容体として機能しているかどうかを判定するためには ウィルス性結合および感染研究が必要である。

ＥＲＲ遺伝子生成物への高度の類似性にも拘らず、ＴｅａおよびＥＲＲ予報（ｐ ｒｅｄｉｃｔｅｄ）蛋白質の物理的属性にはかなりの違いがある。それらは異な った染色体にマツプし、その組織表現パターンも異なっている。これら両方の遺 伝子の自然な細胞性機能は分かっていないので、これら２つの蛋白質問に存在し ているかもしれない機能的類似性について判定するためには、一層の研究が必要 である。保持されるアミノ酸と保持されないアミノ酸の分析はＥＲＲ蛋白質とＴ ｅａ遺伝子生成物の類似した機能や異なった機能についての一層の洞察をもたら してくれるであろう。特に、この新しい遺伝子群およびそれら２つの分子間で高 度に保持されるＤＮＡの領域を確認するにより、この遺伝子群の新しいメンバー についての研究も可能になるであろう。

ｐＴ７Ｔ３−１９．１　（寄託光６８２９８）　、ｐＴ７Ｔ３−１９．２（寄託 光６８２９９　）、ｐＴ７Ｔ３−１９．４　（寄託光６８３００．６８３０１． ６８３０２）　、ｐＴ７Ｔ３−１９．５（寄託光６８３０３）　、およびｐＴ７ Ｔ３−２０．５　（寄託風６８３０５）は、１９９０年４月１３日に、米国マリ −ランド州ロッグビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴ ＣＣ）に寄託された。この寄託は米国、および本願に対応する出願が申請される 米国外の国々の特許法およびそのほかの規制に基づいて利用できる。この寄託が 利用できることは、本願、この出願の部分や継続に基づいて発行させるいずれか の特許を損なって、本願の発明を実施する権利を提供することは意味しない。

以上に、本願を十分に述べたので、この分野の通常の技術に通じているひとには 、ここに述べた発明の製品および反意から逸脱することなしに、多くの変化およ び修正を行うことができることは明らかであろう。

ＦＩＧ、　Ｉ ＦＩＧ、　２ １９．１　１９．２　１９．５　２０．２ＦＩＧ、　３Ａ−１ ＴＴＡＧＴＣＡＡＧＴＣＴＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＧＣＴＧＣＡＣＣＴＣＡ ＧＡＡＧｎＧＧＡＣＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＴ　８４０ＬｅｕＶａｌＬｙｓＳｅｒ ＡｒｇＬｅｕＡｒｃ＋ＬｙｓＧｌｙＣｙｓＴｈｒＳｅｒＧ１ｕＶａｌＧｌｙＬｅ ｕＬｅｕＬｙｓＨｉｓ　（２６３j ＴＡＴＣＴＴＡＣＴｎＣＡＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＡ ＡＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＧＴＧ　１０８０工ＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＡＴ丁ＴＴＣＣＧＧＧＴＡＧＡＴＡＣＣ丁ＴＣＡＡ　、　１１８４ オーブンづ−ディング・フレーム ＦＩＧ、　４ａ ＦＩＧ、　４ｂ ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　１２ ｃＤＮＡ及び２０．５　（ＴＥＡ）の目標蛋白質配列ｃ＋ｃ＋ｃ＋ｔｃ＋　ｔｃ 　ｔｔｔｃｃ　ｔｃａ　ｔｃｃ＋ｃ　ｔ９ｃｃｃ　ｔｇｃ＋　ｃｃ　ｔｃ　９９ ｔ　ｔａ　ｔｃ＋ｑｃ　Ｃ（１（hｃｃ　ｔｔｔｃ＋ｃ　ｔａ　ｔｑｃ　ｔｃ＋ ａａ　ｔｔｔａｑｃ　ｔ９ｔｇｃ＋９ｃｃ　ｔｔｃ　ａｔｃ　ａｃ　ｔ９ｃ＋ｃ 　ｔｃ＋ｃ＋ａａ　ｔｃ　ｔｃａ　ｔｃｃｔｃ＋　ｔｃａ　ｔａ　ｔｃ＋狽モ＝ @ｔａ９ｑｔａ　ｃｃ＋ｔｃｃａｃ＋ｔｔｔｔｔｃａａａａｃ　（ｌｔａｃ　ｔ ｔＣａａａａ　ｔＱａａ　ｔｔａＣａ　Ｃ　ｔ（１（ｌ　ｔＣ　ｔＱ（ＩＣａ（ ｌａ（ｌｔａ　ｔＣbａ（ｌａｃｔｔｃ　ｔｔｔ９ｃｃ ＣＩＣＩＣｌ　ｔ（ｌａａ　ｔａａ　ａ　ｔ　ｔｔ　ｔ　ｔａＣａ　ＩＩＪｃ　 ｔａ　ｔ　ｔａａ　ｔａ　ｔＣ　Ｃ　ｔ（１（ＪｔＣＣ　ｔ狽b　ｔＣ　ｔｔｔ Ｑ　ｔｃＡＴＧＧＴＧＧ　ＣＴＧＧＧＴ門　ＶＡＧ Ａ　ＧＣＡＡ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　Ｇ　Ａ　ＧＡ　Ａ　ＣＣＡ　Ｃ　ＣＴＴＣＴＧ 　Ａ　ＧＡ　Ａ　ＣＧＧＡＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡＴＣＴＡ　Ｃf　ＧＧＧ　ＣＴＧ ＧＣＧ　ＧＣＴＴＴＡＡＳＡＲＥＰＰＳＥＮＧＴＳＩＹＧＡＧＧＦ一Ｇ　ＧＧＣ ＴＴＴＧＡ　ＣＴＧＣＡＴＴＧＣＡ　ＡＣＡＡ　ＣＣＧＧＴＧＡＡ　ＧＡＧＧＴ ＴＣＧＧＡＡＴＣ　ＣＡ　ＣＡＡＡＡ　ＧＧＣＧ`ＴＣＣＣＣＡ ＧＦＤＣＩＡＴＴＧ　Ｅ　ＥＶＲＮＰＱＫＡ　ＩｌＴｎＡＡ　ＣＧＣＴＴＡＴＧ ＡＴＧＣ　ＣＴＴＡ　ＣＴＡ　Ｃ　ＣＴＣＣＴＧＧ　Ａ　ＴＧＡ　Ｇ　Ａ　ＡＡ 　Ａ　ＧＴＣＣＡ　ＣＴＣＣＣ`ＧＴＣ　Ｇ　ＣＧＴＴＴＧ 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本発明はまた、かなり純粋な形態での新規膜横断蛋白質、該膜横断蛋白質をコー ド表現するｒＤＮＡ分子および、その新規膜横断蛋白質をつくるためのプロセス を提供する。本発明によるＤＮＡ配列および遺伝子組換えＤＮＡ分子は、それら がＴリンパ腫細胞により表現され、少なくとも、以下の特性のひとつを有する点 において、特徴づけられる＝（１）正常な胸腺、活性化肺臓細胞、あるいは腸関 連リンパ系組織において表現される、（°２）卵巣組織、正常な肝臓および／ま たは段階固有な方法で、胚発達の段階において表現される、そして（３）複数の 膜にわたって広がっている新規膜横断蛋白質をコード表現する。

国際調査報告　ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２５１８１＋ｌ？＋’＋ａｌ−１１ａｌＡ ｅｍｌ！ＩＩ＠ＡＩＦＣｒＡＥ９１ノ’０２５１ＢＳｅｒｉａｌ　Ｈｏ、ＰＣＴ ／ＬＩＳ９１／１６２５１８　＾ｔｔａｃｈ＋ｍｅｎｔ　５ｈｅｅｔ　１＾ｒｔ ｕｎｉｔ１８５Ｃａｎｔｉｎｕａｔｉロｒ＋ｏｆＳｅｃｔｉｏｎＶ工Ｉｌｌ　Ｃ １ａｉ＋ｓ　５．　ｄｒｓｗｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｏｌｙｐ ｅｐｔｉｄｐｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｆｉｇｕｒ■@１３゜ ＩＶ、　Ｃ１ａｉ＋ｍ　６．　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　 ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｆｉｇｕ窒■@２の。

Ｖ、　Ｃｌａｉｍ　フ、ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐｏｌ ｙｐｅｐｔｉｄｅ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｌ　ｆｉｇｕｒｅ　Q１゜ Ｖｌ、Ｃｌａｉｍ　＆、　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｔｈ＋＋　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　ｐ ｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｆｉｇｕｒ■@２２゜ ５ｅｒｉａｌ　Ｎｏ、ＰＣＴ　ｕｓ９１／の２５１８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１９．５，２０．５，１９．１，１９．２，１９．３および１９．４からな る群から選択される遺伝子でコード表現されるＴ細胞蛋白質のアミノ酸配列でか らなる遺伝子組換えポリペプチド。 ２．実質的に純粋な形態の、特許請求の範囲第１項のポリペプチド。 ３．該Ｔ細胞蛋白質がＴリンパ腫のＤＭでコード表現される、特許請求の範囲第 １項あるいは第２項のポリペプチド。 ４．該アミノ酸配列が第３図に示されている核酸配列によりコード表現される、 特許請求の範囲第１項のポリペプチド。 ５．該アミノ酸配列が第１３図に示されている核酸配列でコード表現される、特 許請求の範囲第１項のポリペプチド。 ６．該アミノ酸配列が第２０図に示されている核酸配列によりコード表現される 、特許請求の範囲第１項のポリペプチド。 ７．該アミノ酸配列が第２１図に示されている核酸配列によりコード表現される 、特許請求の範囲第１項のポリペプタイド。 ８．該アミノ酸配列が第２２図に示されている核酸配列でコード表現される、特 許請求の範囲第１項のポリペプタイド。 ９．特許請求の範囲第４項から第８項のＴ細胞蛋白質のいずれかをコード表現す るＤＮＡ配列からなる表現伝播体。 １０．該表現伝播体が、操作可能な連鎖において、以下の要素で構成される宿主 で複製能力を有するプラスミドである、特許請求の範囲第９項の表現伝播体。 ａ）複製の発生源 ｂ）プロモーター、および ｃ）Ｔ細胞蛋白質に関するコード表現を行うＤＮＡ配列１１．該表現伝播体が、 操作可能な連鎖で、以下のもので構成されている、特許請求の範囲第１０項の表 現伝播体；ａ）複製の原核生物性発生源、 ｂ）原核生物性プロモーター、 ｃ）膜横断Ｔ細胞蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列１２．該表現伝播体がｐＭ ＡＭｎｅｏ，ｐＮＥＯ／Ｔｆｒ−ＮＣおよびｐＭＡＭ／ｎｅｏ／Ｔｆｒ−ＮＣか らなる群から選択される、特許請求の範囲第１０項の表現伝播体。 １３．Ｔ細胞蛋白質をコード表現するＤＮＡ配列からなるベクター。 １４．該ベクターがプラスミド、ファージおよびコスミッドでからなる群から選 択される、特許請求の範囲第１３項のベクター。 １５．該ベクターがＡＴＣＣ寄託間Ｎｏ．６８２９８を有するｐＴ７Ｔ７−１９ ．１である、特許請求の範囲第１４項のベクター。 １６．該ベクターがＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６８２９０を有するｐＴ７Ｔ７−１９． ２である、特許請求の範囲第１４項のベクター。 １７．該ベクターがＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６８３００−６８３０２を有するｐＴ７ Ｔ７−１９．４である、特許請求の範囲第１４項のベクター。 １８．該ベクターがＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６８３０３を有するｐＴ７Ｔ７−１９． ５である、特許請求の範囲第１４項のベクター。 １９．該ベクターがＡＴＣＣ寄託Ｎｏ．６８３０５を有するｐＴ７Ｔ７−２０． ５である、特許請求の範囲第１４項のベクター。 ２０．該遺伝子組換えＤＮＡ分子が特許請求の範囲第４−８項のＴ細胞蛋白質の いずれかをコード表現するＤＮＡ配列からなる、遺伝子組換えＤＮＡ分子で形質 転換される宿主。 ２１．大腸菌である、特許請求の範囲第２０項の宿主。 ２２．以下のステップからなるＴ細胞をつくるための方法：ａ）Ｔ細胞蛋白質を コード表現するＤＮＡ配列で宿主を形質転換する； ｂ）該ＤＮＡ配列を表現する；そして ｃ）該Ｔ細胞蛋白質を回収する。 ２３．免疫学的に有効な量の特許請求の範囲第２２項の方法で生産される膜横断 Ｔ細胞蛋白質からなる、個々の抗体で膜横断Ｔ細胞蛋白質を誘発するのに有益な 医薬品組成物。 ２４．該抗原が遺伝子組換えＴ細胞蛋白質である、特許請求の範囲第２３項の医 薬品組成物。