JPH06503476A - ヒトレトロウイルスレセプター及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトレトロウィルスレセプター及びそれをコードするＤＡ 本発明は、ウィルス学および分子遺伝学の分野に属し、マウスのレトロウィルス レセプター分子の塩基配列に非常に類似したヒト蛋白質であるＨＩ３蛋白質分子 、それをコードするＤＮＡ、この蛋白質分子の合成方法、及びレトロウィルスの 感染を防止又は治療するためにこの蛋白質を利用する方法に関する。また本発明 は、マウスのホモローブからのアミノ酸残基をヒトレトロウィルスレセプターへ の置換と、このＤＮＡを発現するヒト細胞がマウスのレトロウィルスベクターに よる感染に対する感受性、及び遺伝子トランスファーに対する感受性を付与され る方法に関する。

背景技術の説明 ウィルスは細胞に付着することによって細胞に感染する。これは感受性ある細胞 上のレセプター分子とウィルスの表面の分子の間の特異な相互作用を必要とする 。多くのウィルス特異な細胞質レセプターは同定されており、そしてこれらのレ セプター分子のほとんどは他の公知の細胞機能を有する。ヒト免疫不全ウィルス （ＨＩＶ−１）は、ＣＤ４分子と結合する（Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｎａｔｕｒｅ、３１２．　７６３−７６７　（１９８４）；　Ｋｌａｔｚｍａ ｎｎ、Ｄ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１２、７６７　（１９８４）；　Ｍａｄｄｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．４２．９３−１０４　（１９８６））　ｏ　Ｅｐｓ ｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウィルス（ＥＢＶ）は補体レセプタープロティン（ＣＲ２） に結合する（Ｆｉｎｇｅｒｏｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．４５１０−４５１４　（１９８４）） 。ヒトライノウィルスは、細胞粘着分子ＩＣＡＭ−１に結合する　（Ｇｒｅｖｅ 　Ｊ、Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．５６．８３９　（１９８９）；５ｔａ ｕｎｔｏｎ、　Ｄ、　Ｅ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃｅ１ｌ、　５６．８４９　（１ ９８９））。狂犬病ウィルスは、アセチルコリンレセプターに結合する（Ｌｅｎ ｔｚ、　Ｔ、Ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１５．　１８２　（１９８２））。

レオウィルスはアドレナリン性β受容体に結合する（Ｃｏ、　Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２． １４９４　（１９８５））。単純ヘルペスウィルスは、繊維芽細胞成長因子レセ プターを結合サイトとして用いると見られている　（Ｋａｎｅｒ、　Ｒ，Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４８．１４１０−１４１３　（１９９０ ））。

これらのウィルス結合蛋白質またはレセプターの発現は、ウィルス感染に対する 感受性を決定する強い要素である。この結合はターゲット細胞にウィルスエンベ ロープを融合させるために必要である。この融合は、細胞表面、またはレセプタ ー仲介エンドサイトシスの後の酸性化エンベロープで行われると思われる　（Ｗ ｈｉｔｅ　ｅｔ　ａｌ、。

０ｕａｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１６．１５１−１９５　（１９８ ３））　。融合の後に、ウィルスコアが細胞質に入り、そしてウィルスの複製プ ロセスが開始される。

ヒト免疫不全ウィルス（以下ＨＩＶと略す）の場合、ウィルスがヒトの細胞に入 るためには、ＣＤ４以外の細胞表面分子も重要と思われる研究は最近発表されて いる。まず、ヒト繊維芽細胞とヒトの脳由来の細胞などのＣＤ４分子を含まない 細胞は、ＨＩＶによってｉｎ　ｖｉｔｒ。

で感染することができることから、異なるウィルスレセプターが存在することを 示唆する。さらに、ＣＤ４遺伝子でトランスフェクションを行ってその表面にＣ Ｄ４分子を発現させたマウスの細胞は、ＨＩＶに対してしばしば抵抗力がある。

このことは、ＣＤ４か存在するだけてはＴ−（Ｔ　Ｖに感染するのに十分ではな いことを示唆する。

ＨＩＶの主なターゲット細胞は、ＣＤ４”Ｔリンパ球である。Ｔリンパ球の周期 の大部分は非分裂休止細胞であり、　ｉｎ　ｖｉｔｒｏてＨＩＶによって感染さ せるには、例えばマイトジェンレクチンによって、これらの細胞を［活性化Ｊさ せなければならない。このことも、細胞上のＣＤ４分子の存在だけではＨＩ　Ｖ 感染への感受性にとって十分てはないという考え方を支持する。

マウスのレトロウィルスレセプター ＨＩ　Ｖ及びＥＢＶと同じように、環境栄養性マウス白血病ウィルス（Ｅ−Ｍｕ ＬＶ）の感染に対する細胞の感受性は、膜レセプターとウィルスエンベロープと の結合状態によって決定することもてきる。ｅｎｖ遺伝子によってエンコードさ れる　Ｅ−ＭｕＬＶエンベロープ蛋白質（ｇｐ７０　）はマウスの細胞の膜に対 して活発に結合するか、Ｅ−ＭｕＬＶに対して非許容的な他の哺乳動物の膜に対 しては結合が弱い（ＤｅＬａｒｃｏ　ｅｔ　ａｔ、　Ｃｅ１ｌ、　８．３６５− ３７１　（１９７６））　。さらに、［ニーＭｕＬＶのｇ９７０分子は、異なる パターンの感染性を有する他のＭｕＬＶサブグループのウィルスのエンベロープ 蛋白質とは構造上具なる　（Ｌｅｖｙ、　Ｊ、　Ａ、、　５ｃｉｅｎｃｅ。

１８２、　１１５１−１１５３　（１９７３）；　Ｅｌｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、　２６７、２３−２８　（＋９７７））。Ｅ−ＭｕＬＶと他の ＭｕＬＶサブグループの間で造られたキメラウィルスは、ｅｎｖ遺伝子供与体の ホスト範囲を得る（　Ｃｏｎｅ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．６３４９−６３５３　（１９８４ ））。

ウィルスの干渉分析に基づいて、以下の４種の特徴的なＭｕＬＶレセプターがす でに仮定されてし）る。

（ａ）　Ｅ−ＭｕＬＶに対する１、セブター、（ｂ）野生型両栄養性ＭｕＬＶに 対するレセプター、（ｃ）　ＥＭｕＬＶ由来組替えウィルス、例えば「ミンク細 胞フォーカス誘導Ｊ　ＭＣＦ　（Ｍｉｎｋ　Ｃｅ１ｌ　Ｆｏｃｕｓ−１ｎｄｕｃ ｉｎｇ）ウィルス、に対するレセプター、（ｄ）両栄養性ＭｕＬＶ由来組替えウ ィルス（こ対するレセプター（Ｒｅ１ｎ、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ、１３６．　１４４−１５２　（１９８４））　。

マウスの第１次リンパ球を非許容チャイニーズハムスターの肝臓細胞と融合させ て形成された／％イブ１ノ・ラド細胞は、Ｅ−ＭｕＬＶ感染に対する感受性を有 し、膜（こｇｐ７０を結合させる　（Ｇａｚｄａｒ、　Ａ、Ｐ、、　Ｃｅ１１． 比９４９−９５６　（１９７７））。多くのこれら／％イブリ・ノドの染色（本 を分析することによって、推定（ｐｕｔａｔ　ｉｖｅ）Ｅ−ＭｕＬＶレセプター 遺伝子かマウスの染色体５の上のＲｅｃ−１遺伝子座（こ帰属することが確認さ れた（　Ｏｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７４．６０−６２　（１ ９７８）；　Ｒｕｄｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、　１ ４８．４５１−４６５　（１９７Ｂ　））。細胞膜の界面活性剤可溶化によって ｇｐ７０特異の結合活性を失ってしまうため、Ｒｅｃ−１＋こよってエンコード された蛋白質の精製は成功して０な’ｖ）（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、、５８．　９００−９０８　（１９８６））　。

ウィルス感染に対する感受性の単遺伝子座への帰属：よ、単一遺伝子がレセプタ ー蛋白質をエンコードするとり・う仮説と一致する。さらに、ハイブリッド細胞 系統へのＭｕＬＶ感染は、非許容細胞におけるレセプター遺伝子の発現がその細 胞にＭｕＬＶ感受性をもたせることができることを示す。これらの二つ観察によ って、マウスのＤＮＡをトランスフェクションによって非許容細胞にトランスフ ァーし、次いでεＭｕＬＶ感染に対する感受性を獲得した受容細胞から推定レセ プター遺伝子を回収できることが分かる。似たような手法として、神経成長因子 レセプター　（Ｃｈａｏ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２．４１８ −４２１　（１９６６））、ＣＤ　８　（Ｌｉｔｔｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ ｅ１１．４０．２３７−２４６　（＋９８５））、ＣＤ　４　（Ｍａｄｄｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　４２．９３−１０４’（１９８５））のような他 の細胞膜蛋白質をエンコードする遺伝子をクローニングする方法が使われている 。

最近、マウスの環境栄養性レトロウィルスレセプター（ＥＲＲ）をエンコードす るｃＤＮＡクローンが同定された（　Ａｌｂｒｉｔｔｏｎ、　Ｌ、Ｗ、　ｅｔ　 ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、　５７．６５９−６６６　（＋９８９））。この研究は、 ヒトのＥＪ細胞において単一のマウス遺伝子が発現することによってＥＭｕＬＶ 感染に対する感受性が得られることを証明した。さらに、この遺伝子はＲｅｃ− １（環境栄養性ウィルス感染性と関係するマウスの染色体５上の遺伝子座）を規 定していると考えられる（　Ｄｉｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２７４ ．６０−６２　（１９７８）；　Ｒｕｄｄｌｅ　ｅｔ　ａｌ、、　、Ｌ　Ｅｘｐ 、　Ｍｅｄ、、　１４８．４５１−４６５　（＋９７８））。

ＥＲＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４）蛋白質の予想アミノ酸配列のハイドロパッチ プロット（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｐｌｏＤが、１４個の潜在的なトランスメン プラン領域を含有する非常に疎水性の蛋白質を明らかにした（Ｅｉｓｅｎｂｅｒ ｇ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１、　Ｂｉｏｌ、、　１７９．１２５−１４２ 　（１９８４））。このような構造は蛋白質が膜にあることを強く示唆する。こ の蛋白質は、ＣＤ４蛋白質に結合するＨ　Ｉ　Ｖ　ｇｐ１２０　に類似する態様 で、Ｅ−ＭｕＬＶ　ｇｐ７０に特異的に結合する真のレセプターとして機能する ことによって感染を可能にすると見られる（Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｃ ｅ１ｌ、　４７．３３３−３４８　（１９８６）；　ＭｃＤｏｕｇａｌｅｔ　ａ ｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３７．３８２−３８５　（１９８６））。蛋白質 とウィルスエンベロープｇｐ７０の間の物理的関係を示すことによって、提案さ れたウィルスレセプターとしての役割を立証することができる。

細胞表面へのウィルスの付着におけるＥＲＲ蛋白質の役割とは別に、ＥＲＲ蛋白 質はターゲット細胞の膜へのウィルスエンベロープ融合にとっても重要と思われ る。

５ｅｎｄａｉウイルス　（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌ ｏｇｙ、１３１゜５１８−５３２　（１９８３））、ＨＩ　Ｖ　（Ｍａｄｄｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１１．４２、９３−１０４　（１９８５））、及び血漿 膜に融合する２つのウィルス（Ｈａｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、 　２０５．６４０−６４６　（１９６５）；　５ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅ ｌｌ、　４９．６５９−６６８　（１９８７）；　Ｍａｄｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 、　Ｃｅ１１．４７．３３３−３４８　（１９８６））に関する研究により、ウ ィルスの融合を仲介する膜蛋白質の存在が立証された。

血漿膜に融合するメカニズムは、Ｅ−ＭｕＬＶの場合のものと似ていると言われ ている（Ｐｉｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

、　５７．１０４８−１０５４　（１９８６））。ウィルスの融合における蛋白 質の潜在的役割は、結合するウィルスｇｐ７０とは異なる作用を有するか、ある いは付加的な作用を有すると思われる。

ＧｅｎＢａｎｋとＮＢＲＦのデータベースを通して行ったコンピューター検索に よっても、正常細胞の新陳代謝におけるＥＲＲ蛋白質の機能を分類、あるいは同 定するのに有用な予想蛋白質に類似する配列は見つからなかった。脂質二層構造 体をまたがってイオンまたは糖分を輸送するためのゲートチャンネル、又はポン プとして機能する複数のメンブレンスバニング領域を有する蛋白質は同定されて いるが、Ｂｅ５ｔＦｉｔアルゴリズム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｎｕｃｌ、　Ｒｅｓ、、　１２．３８７−３９５　（１９８４）を用いて、ＥＲ Ｒ蛋白質とこれらの蛋白質のいくつかの予想アミノ酸配列とを直接比へても、い かなる重要な配列類似性も見つからなかった（Ａｌｂｒｉｔｔｏｎ　、　Ｌ、Ｗ 、　ｅｔ　ａｔ、、　（＋９８９）、同上））。

Ｔ細胞の発生、ホーミング又は免疫応答で活動する生成物をエンコードする多く の遺伝子はまだ同定されていない。新しい機能を同定できる新規なＴ細胞のｃＤ ＮＡクローンを単離するために、ＭａｃＬｅｏｄ、　Ｃ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、は 、単一個体から得られ、数種の特徴において異なっており、明確で安定した表現 型を持つ二つ密接に関連した　Ｔリンパ腫細胞クローンを用いた（　ＭａｃＬｅ ｏｄ、　Ｃ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　ｔｏ 、　３６６３−３６７４　（１９９０））　。このモデルシステムは、５Ｌ１２ 　Ｔリンパ腫として知られている（　ｆｌａｙｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ｌｎｌ　、 １．　Ｃａｎｃｅｒ、３８．　５９７−６０１　（＋９８６）：　ＭａｃＬｅｏ ｄ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４４．　１７８４−１７９０　（ １９８４）；　ＪＮＣＩ、　７４．８７５−８８２　（１９８５）；　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．６９８９−６９９３ 　（＋９８６）；　Ｃｅ１ｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　＆　Ｄｉｆｆｅｒ。

１、２７１−２７９　（＋９９０））。単一の５ＬＩ２　Ｔリンパ腫細胞系統に 由来した二つの細胞クローンは、遺伝子発現において知られているそれらの相違 点と同系のホスト動物における腫瘍誘起能力の違いに基づいて選ばれた（Ｍａｃ Ｌｅｏｄ。

Ｃ，Ｉ、、　ｅｔ　ａｌ、、　ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ　＆　Ｄｉｆｆｅｒ、　１ ．２７１−２７９　（１９９０））。５Ｌ１２．３細胞は、Ｔ細胞機能のために 必要とされる遺伝子を非常に少数しか発現せず、同系動物に対して非常に腫瘍形 成能が高い（ＭａｃＬｅｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＮＣｌ、　７４．８７５−８ ８２　（１９８５）；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ Ａ、　８３．６９８９−６９９３　（１９８６））。これと対照的に、シスター クローン５Ｌ１２．４の細胞は、ＴＣＲ−α以外のＴ細胞レセプター遺伝子−Ｃ Ｄ３複合体の全ての構成要素のためのｍＲＮＡを発現し、発生の中間段階にある 胸腺リンパ球に類似している（ＭａｃＬｅｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．６９８９−６９９３　（ １９８６）；　Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭＢＯＪ、、　７．１ ０１１０９　（１９８８））。５Ｌ１２．４細胞の腫瘍形成能は、５Ｌ１２．３ 細胞よりかなり低い（ＭａｃＬｅｏｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ＪＮＣＩ、　７４．８ ７５−８８２　（＋９８５））。

消去式富交雑試験（５ｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｅ ｎｒｉｃｈｅｄ　ｐｒｏｂｅ）　（Ｈｅｄｒｉｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ、　３０８．１４９−１５３　（１９８４）；　ＭａｃＬｅｏｄ　ｅｔ　ａ ｔ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、ｌ、２７１−２７９　（＋９９０）；　Ｔｉ ｍｂｅｒｌａｋｅ、　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、　７８．４９７−５０３　（１９ ８０））と従来の分別スクリニング法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｅｒｅｅ ｎｉｎｇ　）　（Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　２ｎｄ　Ｅｄ、 、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　＋９８９）とを組合せた方法が 、シスタークローン５Ｌ１２．３で検出されず、５Ｌ１２゜４のＴ細胞クローン で優先的に発現する遺伝子を表現するｃＤＮＡクローンを得るために、ＭａｃＬ ｅｏｄ　ｅｔ　ａｔ、によって使われた。転写として同定されたＤＮＡクローン 、２０．５はごく一部の組織で発見された。このクローンによって発現された遺 伝子は、ＴＥＡ　（Ｔ細胞初期活性化、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　５を参照）と命 名された。ＴＥＡ転写は、Ｔ細胞マイトジェン、コンカナバリンＡ　（Ｃｏｎ　 Ａ）と共にｉｎ　ｖｉｔｒｏで活性化されたＢａ１ｂ／ｃマウス牌臓細胞で誘発 される。Ｔ細胞活性化の間に誘発された多くの公知の膜内注性蛋白質（単一のメ ンブレンスバニング（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎ　ｉｎｇ）蛋白質）と対照 的に、ＴＥＡ遺伝子は複数回膜を横切る蛋白質をエンコードすると見られている （Ｃｒａｂｔｒｅｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３．３５５−３６１　（１９８ ９））。

抗原（自己組織適合性分子と組み合わせて用いる）、レクチン、カルシウムイオ ノフォアのようなポリクローン活性化剤、又はＴＣＰに対する抗体のいずれかに 応じてＴ細胞が賦活されるときに、７０個の遺伝子または遺伝子生成物が発現で 増加することが知られている　（Ｃｒａｂｔｒｅｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４ ３．３５５−３６１　（１９８９））ｏこれらの賦活遺伝子の一部は細胞周期進 行に関係し、その他の賦活遺伝子は、サイトキン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）及びサイ トキンレセプター、並びに核調節蛋白質をエンコードし、さらにその他の賦活遺 伝子は、細胞の生長に備えるために細胞にイオンおよび栄養を輸送する。少くと も２６個のＴ細胞賦活遺伝子生成物は、細胞膜に局在化している（　Ｃｒａｂｔ ｒｅｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３．３５５−３６１　（１９８９））。

クローン２０．５の例（ＭａｃＬｅｏｄ、　Ｃ，Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅｌ ｌＧｒｏｗｔｈ　＆　Ｄｉ［ｅｒ、ｌ、　２７＋−２７９（１９９０））のよう に、ＴＥＡ遺伝子は、Ｔ細胞賦活の間に誘発される複数のトランスメンブランス パニング蛋白質のエンコードを行なう能力を有するクローン遺伝子（ｃＤＮＡ） の最初の例である（　Ｃｒａｂｔｒｅｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３．３５５ −３６１　（１９８９））　ｏ　Ｔ　ＥＡのｍＲＮＡは正常の休止Ｔ細胞におい てほとんど検出てきないが、６時間で検出可能な水準に増え、牌臓細胞のＣｏｎ 　Ａ刺激作用の後に約２４時間で最高になるため、ＴＥＡは初期遺伝子である。

ＴＥＡ遺伝子の作用はまだ知られていないが、シグナルの導入、あるいはシグナ ルトランスデユーサ−である小さい分子の輸送をするか、未特定の配位子のレセ プターとして作用する可能性がある。推定ＴＥＡ蛋白質の若干長い末端カルボキ シル基は、シグナルトランスデユーサ−として作用すると思われる。多数のＴお よびＢ腫瘍細胞系統はＴＥＡを発現しないため、その発現は明らかに細胞発育の ために絶対に必要なものではない。しかしながら、正常のＴ細胞（非腫瘍性）は 、免疫反応における正常な増殖のためにＴＥＡの発現を必要とする。

２０．５ｃＤＮＡの配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５　）は、上述したマウスのＥ ＲＲｃＤＮＡクローン（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３）　（Ｒｅｃ−１遺伝子）に著 しく類似する。これはＴＥＡ遺伝子生成物がマウスのレトロウィルス受容体とし て作用することを示唆する。マウス組織のいたる所で発現されるＲｅｃ−１遺伝 子に比べて、ＴＥＡ遺伝子の発現は、非常に限られた組織部分で行なわれる（Ａ ｌｂｒｉｔｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９（同上））。ＴＥＡ遺伝子生成物 がレトロウィルス受容体であるならば、この限られた組織分布は、レトロウィル スがリンパ系統の細胞に集中するレトロウィルスの組織特異性に対応している可 能性がある（Ｑｕｉｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　３９．１− ＩＱ　（１９８１））。最近、レトロウィルスがターゲット細胞に入るために細 胞膜透過酵素蛋白質を用いるという報告がある。ＥＲＲのトランスメンブレント ポロジーは、ある種の膜輸送蛋白質（酵母菌のアルギニン、ヒスチジン及びコリ ンのための透過酵素）のものと類似している（■目ｅ、　Ｒ，Ｇ、　ｅｔ　ａｔ 、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３５２．６６６−６６７　（１９９１））。実際、ＥＲ Ｒ蛋白質が陽イオン性アミノ酸のトランスポーターとして機能することが、２つ の研究グループによって解明された（　Ｋｉｎ、　Ｊ、　Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｎａｔｕｒｅ、　３５２．７５２−７２８　（＋９９１）；　Ｗａｎｇ、　Ｈ ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ。

３５２、７２９−７３１　（１９９１））。実際、これはクローン化された最初 の哺乳類アミノ酸トランスポーターであり、レセプターとしてトランスメンブラ ンチヤンネル蛋白質を利用したウィルスの最初の例であった。これに関連して、 テナガザルの白血病ウィルスの感染に対して感受性を有するヒト　ＣＤＮＡ塩基 配列は真菌中のリン酸塩輸送蛋白質の一部に類似するという研究がある（　Ｖｉ ｌｅ、　ｅｔ　ａｌ、。

（＋９９１）　（同上））。Ｔｅａか透過酵素をもエンコードするかどうかは、 まだ解明されていない。

ＨＩＶは、明らかにＣＤ４蛋白質を一次しセブターとして用いることにより、レ セプター仲介の組織を制限するウィルスの一例である。しかしながら、細胞特異 なレセプターが組織特異性の唯一の決定因子であるとは言えない。レトロウィル スの組織親和性は、因子の複合体によるものと見られ、例えばＬ　Ｔ　Ｒ（ｌｏ ｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｓ）の組織特異性、細胞質因子、ウィル スｅｎｖ蛋白質における変異、適当な細胞表面レセプターの発現などの因子かあ る（　Ｋａｂａｔ、　Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｏ ｕｎｏｌ、。

１４８、　１−３１　（１９８９））。ＴＥＡエンコード蛋白質がウィルスのレ セプターとして作用するかどうかを決めるために、ウィルスの結合および感染の 研究が必要である（　Ｒｅ１ｎｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１３６． １４４−１５２（１９８４））。

ＴＥＡとＥＲＲの間の高い類似性にもかかわらず、２つの遺伝子は、染色体の所 属位置が異なり、予測蛋白質生成物も組織発現パターンにおいて異なる。しかし ながら、この新しい遺伝子ファミリーの同定、及びこのファミリーの２つのメン バーの間に高度に保存されているＤＮＡ配列の領域の同定により、新しいファミ リーメンバーを発見することができる。

遺伝子工学的に作られたキメラレセプターは、すでに知られている。例えばＲｉ ｅｄｅｌ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２・Ｉ、　６２８−６７ ０　（１９８６）を参照。しかしながら、レトロウィルスのために遺伝子工学的 に作られたキメラレセプター（例えばマウスのレトロウィルスによるヒト細胞の 感染を許容するようなキメラレセプター）については、まだ報告された例はない 。このようなキメラレセプターは、遺伝子療法に有用である。遺伝子療法に対し て益々関心か高まるにつれて、ヒトの細胞に外生遺伝子をより効率的かつより安 全に導入する方法か広く研究されている。

遺伝子のトランスファーを達成する比較的効率的な方法は、レトロウィルス仲介 の遺伝子トランスファーである（　Ｇ１１ｂｏａ、　Ｅ、、　Ｂｌｏ−Ｅｓ５ａ ｙｓ、　５．２５２−２５８　（１９８７）；　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｄ、Ａ、ｅ ｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３１０．　４７６−４８０　（＋９８４）；　Ｗｅ ｉｓｓ、Ｒ，Ａ、ｅｔ　ａｌ、、ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ、　１９８５））。ヒトの細胞への遺伝子トランスファー用ベクターとして 、一群のレトロウィルス（組替え両栄養性レトロウィルス）が広範に研究された （　Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ、　８１．６３４９−６３５３　（１９８４）；　Ｄａ ｎｏｓ、　０．　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　［ＪＳＡ、　８５．６４６０−６４６４　（＋９８８））。臨床使用を妨 げるおそれがあるこの試みに固イ■の安全性に関する問題は、複製不能にされた レトロウィルスも組替えの過程で野性型突然変異体を生成できることがあるとい うことである。このような変調により、遺伝的に修正することを意図していない 細胞および組織にもレトロウィルスが感染するおそれかあることになる。これに より、一般の病気になる可能性かある。本発明はまたこれらのニーズおよび問題 に対してなされたものである。

発明の要約 本発明者は、マウスのＥＲＲとＴＥＡとに非常に類似しており、それゆえ（こｌ ニドレトロウィルスレセプターとして作用する細胞膜蛋白質をエンコードすると みなされる新規なヒトＤＮＡ配列（Ｈｌ３）をすでに発見し、り１ｊ−ン化した 。このようなヒトレトロウィルスレセプターは、ＡＩＤＳのようなしく・ロウイ ルスに起因する病気において治療法の関与のために標的として作用することかて きる。Ｔ、　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　１８ ５．１０−１７　（１９９１）、及びＭｅｒｕｅｌｏ　ｅｔ　ａｌ、の米国特許 出願第０７７６２７、９５０号（１９９０年１２月１４日出願）を参照。これら の文献は全て本明細書に参照として合体した。

Ｈ１３遺伝子の部分配列は、米国特許出願第０７／６２７．９５０号（１９９０ 年１２月１４日出願）に記載さており、本明細書においてｒＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ，Ｉ　Ｊとして示す。そして、推定アミノ酸配列順序は、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、 　２である。この配列は、７−２と命名したｃＤＮＡクローンを配列決定（ｓｅ ｑｕｅｎｃｉｎｇ）することによって得られた。

Ｈｌ　３　（ＳＥＱ　ＩＤＮ０．　７）の完全な長さの配列は、オーバーラッピ ングクローン１１および３−２（概略的に図１５で示す）を配列決定することに よって得られた。Ｈ１３ＤＮＡは、広い範囲のヌクレオチドおよびアミノ酸配列 においてＥＲＲ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３）及びＴＥＡ（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、 ５　’）に類似する。ｃＤＮＡ配列からは、いくつかの推定メンプランスパンニ ング領域を含有する非常に疎水性の蛋白質を予想する。完全な長さの８１３分子 から予想されたアミノ酸配列（ＳＥｏ　１０　Ｎｏ、　８　）は、ＥＲＲ（ＳＥ Ｑ　ＩＩＩ　Ｎｏ、４）及びＴＥＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６）のアミノ酸配 列と類似である。ヒト遺伝子は染色体１３にマツプされ、哺乳類及び鳥類種に保 有されると見られる。予想Ｆ（１３蛋白質は、６２９個のアミノ酸を有し、約６ ８　ｋＤａの予想分子量を有する。この蛋白質は、同種のマウスのＥＲＲ蛋白質 より７つ多いアミノ酸を有する。

本発明は、８１３分子又はその機能的誘導体をエンコードする遺伝子配列を含む 組換えＤＮＡ分子（ＳＥＱ　ＩＤＮ０．７）に関する。

本発明はさらに、組替えＤＮＡ分子を含有する発現ベクター、及びベクターでト ランスフオーム又はトランスフェクトした宿主に関する。

本発明はまた、ＨＩ　３と命名されたヒトレトロウィルス受容体分子、ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ、８の配列又はそれに近（Ａ相同、又はその機能的誘導体（元々会合 するヒト起源の不純物を実質的に含有しない）に関する。

本発明のもう１つの実施例は、ＨＩ　Ｖ　−１のようなレトロウィルスによる細 胞の感染を防止する方法に関し、この方法は、ウィルスを有効量の１１１３蛋白 質分子又（よその機能的誘導体に接触させることにより、ウイルスカ（細胞に付 着するのを防止し、もって感染を抑制することからなる。

本発明はＨＩ　Ｖ−１のようなレトロウィルスが被験者に感染するのを防止、抑 制又は処理する方法に関し、この方法は、有効量のＨ１３分子又はその機能的誘 導体を被験者に投与することからなる。

本発明はさらに、ポリクローナル、モノクローナル及びキメラ抗体を含むＩ（１ ３分子又はそのエピトープ１こ対して特異な抗体に関する。もう１つの実施例は 、）（ＩＶ−１のようなレトロウィルスが被験者に感染するのを防止、抑制又は 処理する方法に関し、この方法は有効量の抗体を被験者に投与することからなる 。

レトロウィルスが被験者に感染するのを防止、抑制又は処理するのに有用な組成 物を製造する本発明の方法（よ、（ａ）それのＨＩ　３蛋白質又はその機能的誘 導体をエンコードする発現可能な形式の組替えＤＮＡ分子を与え、（ｂ）培養液 で蛋白質又はその機能的誘導体を宿主細胞で発現し、（ｃ）培養液からの蛋白質 又はその機能的誘導体を得ることによって生成する。この方法は、好ましくは蛋 白質又はその機能的誘導体の追加の精製をも含む。この方法は、バクテリア又は 、真核、好ましくは哺乳類の宿主細胞で実施することができる。

本発明はまた、レトロウィルス感染を防止、抑制又は処理するのに有用な製剤を 与え、この製剤は、ＨＩ　３蛋白質分子又はその機能的誘導体、又はＨｌ３に対 して特異な抗体、及び医薬用に許容しえるキャリアを含む。

本発明のなおいっそうの目的は、ＨＩ３蛋白質をエンコードするＤＮＡ配列をキ ャリアする遺伝子単独で、またはＣＤ４遺伝子と組み合わせてトランスフオーム した遺伝子導入実験動物を与えることである。この遺伝子導入動物はヒトレトロ ウィルス感染のモデルとして用い、アンチウィルス療法のテストを行うことがで きる。

正常なまたは突然変異体の８１３遺伝子を同定するか、細胞または組織に付帯す るＨＩ３蛋白質の定性または定量する本発明の方法は、ＡＩＤＳ又はある種の白 血病のようなヒトレトロウィルス感染への感受性を同定する方法として用いるこ とができる。

本発明はさらに、キメラレトロウィルス受容体蛋白質をエンコードするＤＮＡ分 子を与え、このＤＮＡ分子は（ａ）第一の動物種のレトロウィルス受容体蛋白質 ■をエンコードする第一のヌクレオチド配列、及び（ｂ）そこに、第二の動物種 のレトロウィルス受容体蛋白質１１をエンコードする２番目のヌクレオチド配列 からの十分な数のヌクレオチドを置換したものであり、この置換するヌクレオチ ドは、レセプター蛋白質Ｉ＋に結合し、レセプター蛋白質Ｉに結合しないレトロ ウィルスを結合する能力をキメラレトロウィルス受容体蛋白質にもたらし、キメ ラ蛋白質をレトロウィルスのためにレトロウィルス受容体として作用させること ができる。

上記ＤＮＡ分子で第一のヌクレオチド配列は、好ましくは、ヒトＨＩ　３　ＤＮ Ａ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、　７）のコーディング部分を含む。いっそう好まし くはＤＮＡ分子は、キメラＨ１３／　ＥＲＲキメラ蛋白質をエンコードし、第二 のヌクレオチド配列は、マウスのＥＲＲＤＮＡ　（５ＥＱＩＤＮ０．３）のコー ディング部分を含む。そして、置換ＥＲＲヌクレオチドは、１Ｉｅ２１４、Ｌｙ ｓ２２２．　Ａｓｎ　２２３．５ｅｒ２２５、　Ａｓｎ　２２７．　Ａｓｎ２３ ２．　Ｖａ１２３３．　Ｔｙｒ２３５．　ＧＩｕ２３７．　１ｉｅ３１３、　Ａ ｓｐ３１４．　Ｇｌｙ３１９．　Ｇｌｎ　３２４．　ＧＩｕ３２８　及びこれら の組合せからなる群から選ばれたアミノ酸残基をエンコードするヌクレオチドで ある。

上記ＤＮＡ分子は、発現ベクターでも良い。本発明はまｔこ、このベクターから トランスフオームまたはトランスフェクトした宿主を含む。好ましくは、宿主は 哺乳類の細胞である。

本発明はまた、上記ＤＮＡ分子によってエンコードされたキメラレトロウィルス 受容体蛋白質分子を与える。

本発明はまた、通常はレトロウィルスベクターに感染されない種Ｉの細胞に、レ トロウィルスベクターによる感染の感受性、又はレトロウィルス仲介遺伝子トラ ンスファーに感受性を与える方法に関し、この方法は、（ａ）上記キメラレセプ ターをエンコードする発現可能なりＮＡ分子で種■の細胞をトランスフオームし 、（ｂ）細胞の表面の上でキメラレトロウィルス受容体蛋白質を発現し、 もって細胞をレトロウィルスベクターによる感染に感受性あるようにする工程を 含む。この方法においては、細胞は好ましくはヒトの細胞であり、レトロウィル スは好ましくはマウスレトロウィルス及び環境栄養性なマウスの白血病ウィルス であり、キメラレセプターは好ましくはキメラＨ１３／ＥＲＲ蛋白質である。

本発明の別の実施例は、遺伝子治療に使用のための種Ｉの細胞に遺伝子を導入す る方法を与える。この方法は（ａ）導入遺伝子を受容するための細胞を培養する 。

（ｂ）上記のキメラレトロウィルス受容体をエンコードするＤＮＡ分子で細胞を トランスフオームし、よってキメラレトロウィルス受容体蛋白質を有する細胞を 与えて、（Ｃ）種１の細胞に伝染することが通常はできないレトロウィルスベク ターを細胞に感染させる。レトロウィルスのウィルスは、キメラレセプターを発 現する細胞に伝染する能力があり、さらにレトロウィルスベクターは、導入され る遺伝子を運ぶ。そして、 （ｄ）レトロウィルスベクターによって運ばれた遺伝子を細胞で発現させて、 よって、遺伝子を導入する。この方法においては細胞は、好ましくはヒトの細胞 である。そしてレトロウィルスは、好ましくはマウスレトロウィルス及び環境栄 養性なマウスの白血病ウィルスである。そして、キメラレセプターは、好ましく はキメラＨＩ３／ＥＲＲ蛋白質である図１は、コート配列及び非コード配列を含 むＨＩ３ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７　）、及びＨＩ３蛋白質の予想蛋 白質配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８　）を示す。

図２は、ＨＩ３及びＥＲＲｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。

７　ａｎｄ　３　）の１つのストランドの整列を示す概略図である。配列は、Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓコンピューターグループ配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｄｅ ｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、 　１２，３８７−３９５　（１９８４））を使って分析された。

図３は、ＨＩ３、ＥＲＲｌ及びＴＥＡから推定されたアミノ酸配列の整列を示す 。縦の線は、配列の同一性を示す。点は同一性の不足を示す。２重点は、僅かな アミノ酸変化を表す。配列は図２と同様に分析された。カッコ内に示されている のは、細胞外領域３（残基２１０−２４９）及び細胞外領域４（残基３１０−３ ３７）に相当するＨＩ３の配列である。

図４は、ヒト　（ＣＣＬ１２０．　ＣＣＬ　１１９．５ｕｐＴＩ、　Ｈ９，ＭＯ ＬＴ４）、ハムスター（ＣＨＯ−に１）及びマウス（Ｂａｌｂ／ｃ　ｔｈｙｍｏ ｃｙｔｅｓ。

ＢＩＯＴ６Ｒ）から由来するＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡのハイブリデイゼーソヨンパ ターンを示すオートラジオグラムであり、マウスのＥＲＲｃＤＮＡのＫｐｎｌ− Ｋｐｎｌフラグメント（３９ｏ　ｂｐ　）で検知したものである。

図５は、ＨＩ　３　ｃＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ，Ｉ　）を有する幾つかの種 のＤＮＡサザンプロット分析を示すオートラジオグラムである。ハイブリッド化 されたＤＮＡは、ヒトの（ＣＣＬ１２０．　ＣＣＬ１１９．５ｕｐＴ１．　Ｈ９ ，ＭＯＬＴ４）及びハムスター　（ＣＨＯ−Ｋｌ　）　？ウスｔｈｙｍｏｃｙｔ ｅｓ　（Ｂａｌｂ／ｃ又はＢＩＯＴ６Ｒ）由来のＥｃｏＲＩ−消化ＤＮＡであっ た。

図６は、１１１３遺伝子発現を示すオートラジオグラムである。示されたヒトの 細胞系統に由来したＲＮＡが、ＨＩ　３　ｃ　ＤＮＡ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ， りとハイブリッド化された。

図７はヒト　（ＣＥＭ、　Ｈ９，ＭＯＬＴ４．５ｕｐＴｌ、　ＣＣＬ１２０．　 ＣＣＬ１２０）、ハムスター（ＣＩＩＯＫｌ）及びマウス（ＲＬ１２　）由来の ＲＮＡのハイブリデイゼーションパターンを示すオートラジオグラムであり、マ ウスのＥＲＲｃＤＮＡのＫｐｎ　１Ｋｐｎ　Ｉフラグメント（３９０ｂｐ　）で 検知したものである。

図８は、ＥＲＲｃＤＮＡを有する抵抗性細胞のトランスフェクションにより、マ ウス環境栄養性レトロウィルスへの感染に対する感受性の獲得を示す。ハムスタ ーＣ１（０に１細胞へＥＲＲｃＤＮＡのトランスフェクションの後に、マウスの レトロウィルス受容体遺伝子を発現するトランスフェクシントが、マウスの照射 白血病ウィルス（ＲａｄＬＶ　）に感染した。２週間後に、ウィルスのプローブ を使ってノーザンプロット分析を行ない、細胞上澄みの逆転写酵素（ＲＴ）活性 が測定された。

図９は、ＨＩ　３、ＥＲＲｌおよびＴＥＡの予想蛋白質のバイトロバシープロッ トを示す。縦軸は、ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラム（Ｊａｍｅｓ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＣＡＢＩＯ３４，１８１１８６（１９８８））から得られ たハイドロバチシテ４　（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ　）値を与える。

図１０は、ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥプログラムを使って分析されたＨ 　Ｉ　３の予想蛋白質の抗原性を示すグラフである。非常に抗原性を有するペプ チド（アミノ酸残基３０９−３６７　）の１つは、図１４で示されたＡｃｃｌ− ＥｃｏＲ１フラグメントを使うことによって調製した。

図１１は、グルタチオン−３−）ランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と［（１３蛋白質 を含む融合蛋白質の合成を示すポリアクリルアミドゲルエレクトロフェログラム を示す。

融合蛋白質は、融合蛋白質として抗原を発現するプラスミド　ｐＧＥＸ−２Ｔへ ＨＩ　３　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの　１８０　ｂｐ　Ａｃｃｌ−ＥｃｏＲＩフラグメン トを連結し、イソプロピル−ｂｅｔａ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ　 ）の添加によって引き起こさｔｌ、またゲルタチオンーセファローズクロマトグ ラフィーを使って精製して、調整された。

図１２は、ヒト染色体１３へのＨｌ　３遺伝子マツピンゲを示す。オートラジオ ダラム（図１２Ａ）はＨＩ３ｃＤＮＡ　（ＳＥｏ　１０　ＮＯ，Ｉ）で検知した しトーハムスタ一体細胞ハイブリッドからのＥｃｏＲｌ−消化ＤＮＡのハイブリ デイゼーン３ンパターンを示す。レーンｌおよび＋１は、それぞれヒトとハムス ターからのＤＮＡを含有する。図１２Ｂの表に示されるように、レーン２−１０ は、染色体由来のＤＮＡを含有する。

図１３は、ＨＩ３及びＥＲＲ遺伝子、及び４つのギメラ構造の遺伝子構造の概略 図である。種々の構造をトランスフェクトされたヒトの細胞へのＥ−ＭｕＬＶの 感染性も示されている。

図１４は細胞外領域３と呼ばれるＨ　１３およびＥＲＲの部位配列（ヌクレオチ ドおよびアミノ酸）の比較を示す。ＳＥＱ　ＩＤ　８０．７及びＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、８及び図１を参照。レセプター蛋白質のこの領域は、ヒト及びマウス配列 の間で最もかけ離れている。配列は、Ｇｅｎｅｔ　ｉｃｓコンピューターグルー プ配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　、１．ｅｔ　ａｌ、 、　Ｎｕｃｌ、　ＡＣｉｄｓ　Ｒｅｓ、　１２．３８７−３９５　（＋９８４） ）を使って配列した。

図１５は、ＨＩ３配列が得られたいくつかのｃＤＮＡクローン、及びそれらとマ ウスのＥＲＲホモローグどの一般的構造上の関係を示す概略図である。クローン ７−２　（Ｈ−１３，７−２）は完全なＨＩ３　ＤＮＡ配列の一部を表す。この ＨＩ３クローンは最初に配列決定され、５ＥＱＩＤＮｏ、１及びＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ、２を得た。クローン１−１（１１１３，１−１）及びクローン３−２　（ ８１３，３−２’）は各々ＨＩ３配列の一部を含有する。これらの３つのクロー ンを組み合わせることにより、完全なＨＩ３　ＤＮＡ（ＳＥＱＩＤＮｏ、７）及 びアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　８０．８　’）が得られた。

好ましい実施例の説明 本発明は、マウスの内在性レトロウィルスレセプター（ＥＲＲ）及びＴ細胞初期 活性化抗原遺伝子（ＴＥＡ）と相同であり、ＨＩ３と呼ばれた蛋白質をエンコー ドするＤＮＡ分子に関する。本発明者は、感受性ある細胞にそｔｌらか入ること を防止するようにヒトレトロウィルスを結合させるために、■］１３蛋白質又は その機能的誘導体を、好ましくは蛋白質の溶液状にして、使う方法に想到した。

正常なまたは突然変異体のＨＩ　３遺伝子を同定するか、細胞または組織と会合 する）（Ｉ　３蛋白質の存在または量を測定する本発明の方法は、ＡＩＤＳ又は ある種の白血病の場合のように、ヒトレトロウィルス感染に対する感受性を同定 する方法として用いることができる。

本発明の一実施例は、それか元々会合するヒトの起源の不純物を実質的に含有し ない天然のＨＩ３蛋白質に関する。本発明の別の実施例は、組替え■（１３でエ ンコードした蛋白質に関する。用語［実質的に他の蛋白質を含有しない」は、重 量基準で元々会合する他の蛋白質及び糖蛋白質の少くとも９０％、好ましくは少 くとも９９９６か除去されるように精製され、もって他の蛋白質及び糖蛋白質か 実質的に存在しないことを示す。それは、Ｈ１３蛋白質を含有する細胞、組織又 は流体に、蛋白質に対して反応性を有するモノクローナル抗体を担持する免疫吸 着材カラムのような蛋白質精製手段を施すことによって達成することができる。

別法として、アンモニウム硫酸塩沈殿と分子篩クロマトグラフィー及びイオン交 換クロマトグラフィーのような標準の方法を組合せることによって精製すること もできる。

本発明のＨＩ３蛋白質は、様々な細胞または組織源から生化学的にか物理化学的 に精製することができる。天然の１１１３蛋白質の調製のためにヒトリンパ細胞 のようなヒトリンパ器官およびリンパ細胞のような組織が好ましい。また、固相 支持体上で所望の配列を有するポリペプチドを合成し、次いで支持体から分離す る方法は周知である。

Ｈ１３遺伝子は単離又は合成することができるので、Ｈ１３ポリペプチド又はそ の機能的誘導体は、原核生物又は所望に応じ非哺乳類性真核生物中の哺乳類性の 他の蛋白質または糖蛋白質を実質的に含有せずに合成することができる。本発明 によって意図したように、哺乳類の細胞中（例えば、トランスフェクトされたＣ ｏＳ、　ＮＩＨ−３Ｔ３又はＣＨＯ細胞）で組替え方法によって生成されたＨＩ ３蛋白質分子は、天然の蛋白質配列又はその機能的誘導体である。天然の蛋白質 又は糖蛋白質は、組替え方法によって生成された場合、元々会合する他の蛋白質 及び糖蛋白質を実質的に含有しない。

本発明の好ましい実施例においては、化学合成又は組替えＤＮＡ技術により、感 染を防止するためにＨＩＶへの結合に対して十分に高い親和性を保持したまま、 好ましくはできるだけ小さいＨ１３分子のフラグメントを生産する。ＨＩ３の好 ましいフラグメントは、細胞外領域３及び細胞外領域４を含む。ウィルスレセプ ターとしての機能の為に、ＨＩ３蛋白質の細胞外フラグメントはヒトにレトロウ ィルスを結合することが予想されている。

このペプチドのいっそう小さいフラグメントを生産することによって、当業者は 、公知の結合抑制アッセイを使って、感染性の防止に対して十分に高い親和性を 存するレトロウィルスを結合する能力がある極小のペプチドを過度の実験なしで 容易に同定することができる。比較的短いペプチドは、比較的大きい蛋白質に対 して、（１１比較的大きい安定性および拡散性を有し、（２）比較的少ない免疫 原性を有するという、２つの利点を有する。

潜在的なレセプター（すなわち、レトロウィルスがターゲット細胞に入る場所） としてのＩ１３を同定することにより、レトロウィルスがどのように細胞に入る か説明する重大なメカニズムを解明することができる。レトロウィルス摂取を防 止することができる「擬態者」又は「囮Ｊである特異なＨ１３レセプターを利用 することにより、レトロウィルス感染及びそれと関連した病気の広がりを抑制す ることができる。

本発明のヒト■］１３蛋白質とマウスのＥＲＲとがアミノ酸配列（８７，６％　 同定）および構造（１４トランスメンブレンスパンニング（ｓｐａｎ旧口ｇ）領 域）に関して類似する程度にもかかわらず、Ｉ１３はＥ−ＭｕＬＶに検出可能に 結合することができない。

本発明者は、感染に対する感受性が種によって相違することを利用をして、Ｈ１ ３アミノ酸残基をエンコードする塩基をマウスのＥＲＲのアミノ酸をエンコード する塩基で置換することによって、キメラレトロウィルスレセプター蛋白質をエ ンコードするＤＮＡ分子を組み立てとともに分析する。これにより、細胞のＥ− ＭｕＬＶへの感染に対する感受性のために存在しなければならない重要なアミノ 酸の同定をすることができる。

本発明のキメラマウス−ヒトＥ−ＭｕＬＶレセプターは、原核又は非嘩乳類の真 核細胞中の哺乳類起源の他の蛋白質または糖蛋白質を実質的に含存しないように 、合成することができる。しかしながらキメラＨ１３／ＥＲＲ蛋白質分子は、組 替え方法によって生成し、ヒトの細胞中で（最も好ましくは哺乳類の細胞中で） 発現させるのが好ましい。

マウスのＥＲＲ配列に重要なアミノ酸残基が存在する為に、本発明のキメラレセ プターは、レセプターを発現するヒトの細胞又は他の非マウス細胞にマウスのＥ −ＭｕＬＶに感染する能力を授ける。

ＨＩ３中の対応する場所でＥＲＲの１つ以上のアミノ酸残基を適切に置換するこ とによって、当業者は、公知の結合抑制アッセイを用いて、単−又は複数のアミ ノ酸置換を過度の実験なしで同定することがでる。このアミノ酸置換により、非 マウス細胞、好ましくはヒトの細胞にＥ−ＭｕＬＶを感染させるのに十分に高い 親和性を有するＥ−ＭｕＬＶに結合することができるキメラレトロウィルス受容 体を得ることができる。

ＨＩ３細胞外領域３およびＨＩ３細胞外領域４は、ウィルス結合を修正するのに 最も敏感な位置であると思われる。従って、細胞にＥ−ＭｕＬＶ感受性を授ける ために、１−（＋　３のこれらの領域のアミノ酸残基を置換するのが好マシイ。

領域３は、位ｆｌ　２１ｏ及び２５０　（ＳＥＱ　１ＯＮｏ、７）残基ヲ含む。

アミノ酸残基２１１ヒ２４２　ＣＳＥＱ　１ＯＮｏ、４）の間で、ＥＲＲの対応 する領域における１つ以上のアミノ酸残基を置換するのか好ましい。Ｈ１３の領 域４は、残基３１−３３７　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７）を含む。アミノ酸残基 ３０３　及び３３０　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４）の間で、ＥＲＲの対応する領 域における１つ以上のアミノ酸残基を置換するのが好ましい。

１つの残基と４つの残基の間で置換するのが好ましい。たった１つのアミノ酸の 置換でも、キメラレセプター蛋白質のウィルス特異性を変える可能性がある。Ｉ １３およびＥＲＲの細胞外領域３および領域４において異なる残基および位置を 以下の表１に示す。

表１ Ｖ２１４　１２１４　Ｖ２１４　Ｉ２１４Ｅ２２２　Ｋ２２２　Ｅ２２２　Ｋ２ ２２Ｅ２２３　Ｎ２２３　Ｅ２２３　Ｎ２２３Ｇ２２５　３２２５　Ｇ２２５　 ５２２５Ｌ２３３　Ｎ２２７　Ｌ２３３　Ｎ２２７Ｅ２３９　Ｎ２３２ Ｇ２４０　Ｖ２３３ Ｐ２４２　Ｙ２３５ Ｖ２４４　Ｅ２３７ Ｈｌ　３のウィルス結合特異性を変更する別の方法は、ＥＲＲの残基に相当しな いＩ１３（細胞外領域４内）中の１つ以上の「余分」アミノ酸残基を除去するこ とである。好ましくは、ＨＩ３の位置３２６から位置３３１　（ＳＥＱＩＤ　Ｎ Ｏ，Ｉ　）に１つの残基と６つの残基との間で置換する。最も好ましくは、これ らの６つの残基を全て除去する二とである。

非マウス細胞を、ＥＲＲ蛋白質てはなく本発明のキメラレセプターまたは置換さ れたレセプターでトランスフェクトする主な利点は、免疫原性か非常に少ないと いうことである。従って、例えばマウスレトロウィルスに感染するヒトの細胞が 、実質的にヒトの配列を含み、マウスレトロウィルスによって感染性を授けるた めに必要とされたマウスのレトロウィルス受容体配列のごく少数の必要なアミノ 酸残基だけを有するキメラレセプターを発現するようにする。Ｅ−ＭｕＬＶか結 合することができるレセプターを担持する細胞が同じヒト被験者に頻繁に導入さ れる場合、キメラレセプターがほとんどヒトに由来するという事実は、ヒト以外 の起源のレセプター配列に由来する配列に対する望ましくない免疫学的反応機会 を減少させる。もしＥＲＲ蛋白質の大部分がこのために使われたならば、ヒト被 験者は、注射された細胞の上の外来エピトープに免疫学的に反応し、遺伝子治療 におけるこれらの細胞の有用性を低減する。

免疫原性のこの欠如は、注入されたレトロウィルスにより感染した細胞の生存及 び治療の効力にとって重要である。例えば骨髄細胞または肝細胞を使う遺伝子治 療において、細胞をサイトカインでｉｎ　ｖｉｔｒｏで操作し目的とする遺伝子 を担持するヘクターに感染させるのが普通である。このような細胞は非常に短命 で、非常に短命な治療学的変化を与えた。例えばＷｉｌｓｏｎ、　Ｊ、Ｍ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７ ．８４３７−８４４１　（１９９０）を参照。このような細胞上に免疫原性のあ るエピトープを付加すると、ｉｎ　ｖｉｖｏでのそれらの半減期はさらに短くな るＥＲＲ／ＨＩ３ギメラ蛋白質だけでなく　ＨＩ　３蛋白質が、多種の細胞、特 にＴリンパ球および単球／マクロファージ血統の細胞において、完全な膜蛋白質 として細胞表面で発現することかでき、これは、ＨＩＶ−１およびＨＴＬＶ川の ような公知のヒトレトロウィルスのｉｎ　ｖｉｔｒｏの向性ど−ｉする。従って 、キメラレセプターにより、ヒト中のこれらの血統の細胞（マウスレトロウィル ス感染に灯して通常は抵抗力がある）はＥ　−Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖに感染することか できる。

本発明が有用なウィルス感染が、ＨＩ　Ｖ−Ｌ　ＨＩ　Ｖ−２、ＩＩＴＬＶ−１ ，ＩＩＴＬＶ−２等の白血病を引き起こすヒトＴリンパ球常等性ウィルス及び他 のヒトしトロウィルスを含む。

Ｗｅｉｓｓ、　Ｒ，、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　ＲＮＡ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓ ｅｓ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９ ８５を参照。本発明は、細胞質レセプターとし、てＨｌ　３に付着するか、ＨＩ ３依存メカニズムを経て細胞に入る全てのしトロウィルスを包含する。

上記のＨｌ　３又はその機能的誘導体をエンコードする遺伝１“慣造体は、遺伝 子治療に使うことができる。注入さｈた細胞か優先的に内在性細胞人口に取って 代わる条件の下で、病気に対する感受性か高い異常なＩ−■１３分子は、）Ｔ　 Ｉ　３蛋白質でトランスフＬり１・された所望の血統の細胞（例えば造血細胞） の注入により置換することができる。

組替えキメラＥＲＲ／）（１３分子をエンコードする遺伝子の構造は、遺伝子治 療に特に有用である。組替え両栄養性レトロウィルスは、例えば酵素欠陥を治す ために、ヒトの細胞に効率的に遺伝子を導入するのに有用なベクターだと認識さ れている。Ｃｏｎｅ、　Ｒ，Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８１．６３４９−６３５３　（１ ９８４）、及びＤａｎｏｓ、　Ｏ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 ＡＧａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５．６４６０−６４６４　（１９８８）を参 照。ウィルスのエンベロープ蛋白質ｇｐ７０のレセプター特異性に依存して、こ のようなウィルスの宿主は異なり、いくつかはヒトの細胞を識別する。Ｃｏｎｅ 　ｅｔ　ａｌ、（同上）及びＤａｎｏｓ　ｅｔ　ａｔ、　（同上）は、ヒトの細 胞に伝染してヒトゲノムＤＮＡにランダムに結合する両常等性なレトロウィルス を生成するパッケージング細胞系を生成した。このようなベクターは、ニューロ ンに組織化学的に検出可能なマーカー遺伝子を移入するために使われた。Ｐｒ１ ｃｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４．１５６−１６０　（１９８７）を参照 。

安全性の理由のために、遺伝子治療に使うレトロウィルスベクター目的の細胞に のみ感染することができる、治療中の個体中の細胞に全般的な感染を引き起こさ ないことが重要である。過去において、これは一般に、ヘルパー欠如ウィルス調 整法またはブサイパッケージンク配列欠損突然変異体等を使うことによって達成 された。本発明は、限られたマウスの宿主範囲を有する有能なＥ−Ｍ【ルＶベク ターの使用を許す点において、先行技術のアプローチと比較して改善された安全 基準を与える。ベクターに感染するこれらの細胞だけが、本発明のキメラレセプ ターの発現能力を与えられる。

しｌ・ロウイルスを使う遺伝子トランスファーは、一般に裸のＤＮＡのとのトラ ンスフェクションより効率的であるか、いくつの細胞は、レトロウィルスによっ て容易に感染されず、このような細胞に新しい遺伝子を導入するためのベクター としてしｌ・ロウイルスを使うことは困難である。本発明によると、ヒトレトロ ウィルスによって感染可能でないかその表面上に十分なレトロウィルス受容体蛋 白質を持たない為に非常に低い効率だけ感染可能であるヒトの細胞は、Ｈｌ　３ 遺伝子又はその機能的誘導体で１−ランスフェクトされ、ＨＩ３蛋白質の発現に より、ｌノトロウイルスレセブターが細胞表面に現われる。

目的とする遺伝子を細胞に永久に移入するために、このよ・）なトランスファー 子を運ぶし１へレトロウィルスベクターに感染することかできる。このタイプの 操作は、ＭｕＬＶの感染に感受性ないハＩ、スター細胞をこのウィルスに感受性 があるようにするために、行われた（以下の記載及び実施例ＩＶを参照）。ハム スター細胞中のＥＲＲ遺伝子（ＨＩ３ホモローグ）のトランスフェクションおよ び発現に続いて、これらの細胞は、ＭｕＬＶに感染する可能性があって、そして ＭｕＬＶ仲介遺伝子トランスファーのためにターゲットとして作用する可能性が ある。レトロウィルスを介した遺伝子トランスファーの一般的議論については、 例えば、ＧｉＩｂｏａ、　Ｅ、、　Ｂｌｏ−Ｅｓ５ａｙｓ　５．２５２−２５８ 　（１９８７）；　Ｗｉｌｌｉａｍｓ。

Ｎａｔｕｒｅ、　３１０．４７６−４８０　（＋９８４）を参照。

本発明は類似のレセプター特異性のあるいかなる環境栄養性マウスのレトロウィ ルスまたは他のいかなる哺乳類レトロウィルス（細胞レセプターとして本発明の ＥＲＲ及びキメラＨｌ　３／　ＥＲＲ分子に結合するか、あるいはＥＲＲに依存 するメカニズムを経て細胞に入る）も包含する。

より一般的に言えば、本発明は、１つの動物種の細胞か通常は伝染されないレト ロウィルスに感染するために、その種の選ばれた細胞を許容化するためにキメラ レトロウィルス受容体を生成する一般的思想に関する。従って例えは、もしチン パンジー細胞がマウスレトロウィルスとの結合を許すチンパンジーレトロウィル ス−マウスのレトロウィルスのキメラレセプターを発現するならば、マウスレト ロウィルスはチンパンジー細胞に伝染することかできる。例えばＨＩ　３分子の アミノ酸配列の特異な変化によって、多数のどのウィルスにも感受性を与えるレ セプター分子をつくることができる。従って、与えられたヒト又はヒト以外のレ トロウィルスに対して適するように、異なるキメラＨ１３に基づく構造を構築す ることかできる。当業者は過度の実験なしに容易に多くのレトロウィルスおよび キメラレセプターのいずれかにもこの教示を適用することができる。

当業者は、いかにして過度の実験なしに任意の種または細胞からＥＲＲまたはＨ Ｉ３に類似のレトロウィルス受容体をエンコードするＤＮＡを得るかを知ってい る。

まずＥＲＲまたはＨＩ３の配列に基づくプローブを使う目的とする種属または細 胞種のｃＤＮＡライブラリー（例えば、チンパンジーＴ細胞ｃＤＮＡライブラリ ー）を、当業界において普通の方法を使うことによりスクリーニングする。次に 、「新しいＪレトロウィルス受容体の配列を得るために、ハイブリッド化するＤ ＮＡをクローン化して、そして配列決定する。目視によって、または以下に説明 するコンピュータープログラムの助けをかりて、新しいレトロウィルス受容体蛋 白質の配列がＥＲＲまたはＨｌ　３と異なる領域を同定することができる。特に 、細胞外領域領域３またはに４に注目する。観察された配列相違に基づいて、上 記の教示を使うことによって、新しいレセプターと公知のレセプターの間にキメ ラレセプターが形成されるように、１つ以上のアミノ酸置換を存する配列をつく ることができる。キメラレセプターは、次いて選択した細胞で発現することがで き、その機能は、容易に従来のウィルス結合アッセイまたはウィルス感染性アッ セイを使うことによって試験することができる。

さらに本発明によると、その自然のレセプターに結合しないように、ウィルスの レセプター付着位置を変更することができる。例えば、Ｈｒｖ−ｔのＣＤ４結合 領域の配列の変化させることにより、ＣＤ４保有細胞に対してこのウィルスを非 感染性にすることができる。対応する変化をＨＩ　３に導入して、この突然変異 体ＨＴＶが結合するようにすることかできる。このようにして、適当な変異レセ プターを担持する細胞にのみ結合するが、ＨＩＶ−１の正常なターゲットには結 合しない安全なＨＩＶ調整を行うことかできる。

本発明の別の実施例による方法および構造は、無傷のＣＤ４発現に依存する正常 な細胞の発達過程中断することなしにＣＤ４を介して感染可能な骨髄細胞を生成 するのに使うことができる。この実施例で、キメラＨＩ３／ＣＤ４分子は、骨髄 細胞で発現され、次いてマウスの２９７０分子に組み込まれたＨ　Ｉ　ＶのＣＤ ４結合領域を有するＥ−ＭｕＬＶレトロウィルスベクターに感染する。

チンパンジー細胞または細胞血統の中に、無傷又はキメラのヒトＨＩ３配列が発 現することにより、ＨＩＶ感染がＡＩＤＳのような症状に発展する可能性がある 。それによって、チンパンジーのサル免疫不全ウィルスへの感染より進歩したＡ ＩＤＳの動物モデルが得られる。

同じ細胞の表面上に１つより多い無傷かキメラのレトロウィルス受容体分子を発 現させることも、本発明の範囲内である。従って最初のレトロウィルス受容体、 例えばＥＲＲによって、ヒトの細胞は、１つのウィルス株にｉｎ　ｖｉｔｒｏで 一過性に感染することができ、サイトカイン成長または区別因子の慎重な使用に よって操作することかできる。このような細胞は、受容体に導入することができ る。所望の時に、２番目の遺伝子工学的に作られたレセプターに結合する第２の ウィルスを個体に導入すると、第２のレトロウィルス受容体を担持する導入され た細胞だけが感染する。

本発明の好ましい動物被験者は、哺乳動物である。用語「哺乳動物」は、哺乳網 に所属する個体を意味する。

本発明は、ヒト被験者の治療に特に有用であるが、家畜の病気にも使用すること ができる。

また、ＨＩ３又はキメラレセプターの可溶体のみならず、本明細書に記載した全 ての用途のために類似のバイオ活性を有する機能的誘導体も含まれる。さらに、 ＨＩ３の写しから得られるＨ　Ｉ　３の活性体及び全てのＨｌ　３活性を存する 全ての突然変異蛋白質も本発明の対象である。通常は）・ランスメンブレン蛋白 質であるレセプターの可溶体の生産方法は、当業界において周知である。例えば 、Ｓｍ１ｔｈ、　Ｄ、ｔ（、ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３８．１７ ０４−１７０７（１９８７）　、Ｆｉｓｈｅｒ、　Ｒ，Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．７６−７８（１９８８）、１ｉｕｓｓｅｙ、　Ｒ，Ｅ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．７８−８１　（１９８８）、Ｄ ｅｅｎ、に、Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３１．８２−８４　（１ ９８８）　、　Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ、Ａ、ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、３３ １．　８４−８６　（１９８８）、及びＧｅｒｓｈｏ旧１．１．Ｍ、　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５．４ ０８７−４０８９　（＋９８８）を参照。これらの文献は全て参照として本明細 書に合体した。このような方法は、一般にｌ・ランスメンブレン部分を除去する ためにレセプター蛋白質をエンコードするＤＮＡの先端切断法に基づき、無傷の レトロウィルス又はレトロウィルスの蛋白質又は糖蛋白質のような特定のりガン トと相互作用する能力かある細胞外領域を無傷のままにしておく。

本発明の目的のために、可溶性Ｈ１３又はその機能的誘導体かし１〜ロウイルス への結合を可能にするＨＩ３の結合位置の要素を含むことは、重要である。８１ ３分子は、多くのアミノ酸残基を存し、それらの僅かだけがウィルスの認識およ び結合に決定的に関与する。

本明細書において論したように、本発明の８１３蛋白質またはペプチドは、さら に薬設計ために、例えば、免疫原性を減少させるか、溶解性を向上させるか、デ リバリ−を高めるか、クリアランスまたは劣化を防止するために、変更すること ができる。

本発明のさらに別の実施例は、Ｈ１，３蛋白質の「機能的誘導体」を与える。用 語「機能的誘導体」は、）（１３蛋白質の「フラグメント」、「変異体」、「ホ モローブ」又は「化学的誘導体」を意味する。機能的誘導体は、本発明によって 使用できるＩ］１３蛋白質の機能の少くとも一部を保持する。

ＨＩ３蛋白質の「フラグメントＪは、比較的短いペプチド分子のいかなるサブセ ットでもよい。

ＨＩ３の「変異」は、全体のペプチド又はフラグメントに実質的に類似する分子 を言う。変異のペプチドは、当業界で周知の方法を使って、直接化学合成により 適宜調製することができる。

一方、ペプチドのアミノ酸配列変異は、合成されるペプチドをエンコードする　 ＤＮＡにおける、突然変異によって調製することかできる。このような変異は、 例えはアミノ酸配列内の残基の除去、挿入または置換を含む。除去、挿入及び置 換を任意に組合せることにより、所望の活性を有する最終的な構造を得ることか できる。明らかに、変異のペプチドをエンコードするＤＮＡにおいて作られる突 然変異体は読み取り枠を変えてはならず、また２番目のｍＲＮＡ構造を生成する 可能性がある相補的な領域をつくらないのか好ましい。ヨーロッパ特許公告７５ ．４４４号を参照。

遺伝子のレベルで、これらの変異は、ペプチド分子をエンコードするＤＮＡ中の ヌクレオチドの特定部位の突然変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄ ＮＡ、　２．１８３　（１９８３）に例示）によって調製し、もって変異をエン コードするＤＮＡを生成し、次いで組替え細胞培養中にＤＮＡを発現させること により調製するのが普通である。変異は、典型的には非変異のペプチドと同じ定 性的な生物学的活性を示す。特に、特定部位の突然変異誘発を使って、ＥＲＲに 由来する重要なアミノ酸残基を有する１１１３分子を生成することかできる。

一般に特定部位の突然変異誘発は、まず、関連したペプチドをエンコードするＤ ＮＡ配列を配列内に含む一本鎖のベクターを得ることによ、って行う。所望の突 然変異した配列を担持するオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｃｒｅａ　ｅｔ　 ａｌ、の方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７ ５゜５７６５　（１９７８））で一般に合成する。このプライマーは、次いで一 本鎖の蛋白質配列含有ベクターどアニールし、Ｅ、　ｃｏｌｉポリメラーゼＩク レノウフラグメントのようなりＮＡ−重合酵素にさらして変異保有ストランドの 合成を完Ｙする。従って２番目のストランド中の突然変異した配列は、所望の突 然変異を担持する。このへテロ二重鎖ヘクターを、適当な細胞をトランスフオー ムするために使い、突然変異した配列配列を担持する組替えベクターを含むクロ ーンを選ぶ。突然変異した蛋白質領域は取り除き、蛋白質生産用の適当なベクタ ー（一般的に、適当な宿主のトランスフォーメーションに使用することができる 発現ベクター）内に置く。

末端挿入の例は、組替え宿主から得た成熟したペプチド分子の分泌を容易にする ために、ペプチド分子のＮ−末端に宿主細胞に非相同又は相同なシグナル配列を 融合させることを含む。

変異体の別の群は、蛋白質分子中の少くとも１つ（好ましくはただ１つ）のアミ ノ酸残基が取り除かれて、異なる残基がその位置に導入されたものである。蛋白 質の化学的性質および構造に関する詳細な説明のために、５ｃｈｕｌｚ、　Ｇ、 Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒ ｕｃｔｕｒｅ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１ ９７８　、　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、Ｅ、、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、　５ｔｒ ｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＰｒｏＤｅｒｔｉｅｓ及びＷ、Ｈ， Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｅｏ、　１９８３　を 参照。これらの文献は全て参照として本明細書に合体した。

本発明の蛋白質またはペプチド分子内ですることができる置換の種類は、異なる 種の相同の蛋白質（Ｓｃｈｕｌｚ　ｅｔａｌ、　（同上）の表１〜２及びＣｒｅ ｉｇｈｔｏｎの図３〜９に示す）の間のアミノ酸変化の頻度を分析することによ り判定することができる。このような分析に基づいて、控えめな（ｃｏｎｓｅｒ ｖａｔｉｖｅ）置換は、本明細書において以下の５つの群のいずれがの中で交換 を行うと定義する。

１、無極性又はわずかに極性を存する小さな脂肪族残基：　ａｌａ、　ｓｅｒ、 　ｔｈｒ　（ｐｒｏ、　ｇｌｙ）。

２、極性を有する負に荷電された残基及びそれらのアミ　ド　：　ａｓｐ、　ａ ｓｎ、　ｇｌｕ、　ｇｌｎ。

３、極性を有する正に荷電された残基：　ｈｉｓ、　ａｒｇ、　ｌｙ４、大きい 脂肪族の非極性の残基：　ｍｅｔ、　Ｉｅｕ、　ｉｌｅ、　ｖａｌ・　Ｃｙｓ　 ０ ５、大きい芳香族の残基　ｐｈｅ、　ｔｙｒ、　ｔｒｐ。

上記の括弧中の３つのアミノ酸残基は、蛋白質の構造において特別の役割を有す る。Ｇｌｙはいがなる側鎖も有さない唯一の残基てあり、従って配列に柔軟性を 付与する。Ｐｒｏは、そのまれな幾何学的構造の為に、配列をき〜）く拘束する 。Ｃｙｓは蛋白質の折り畳みに重要なジスルフィド結合の形成に関与することが できる。この点に関して、５ｃｈｕｌｚ　ｅｔ　ａｌ、が１上記群１及び２を合 併している二とに注意せよ。Ｔｙｒは、水素結合ポテンシャルの為にＳｅｒ、　 Ｔｈｒ等といくらか類似性を存する。上記群の中ではなくそれらの間における余 り小さくない置換を選ぶことによ−〕で機能的又は免疫学的な性質の相当な変化 は起こされる。この置換は以下のことを維持する上で大きな効果の差がある。

（ａ）例えばシート状または螺旋状のコンブすメーションのような置換領域にお けるペプチド骨格の構造（ｂ）ターゲット部位における分子の電荷または疎水性 （ｃ）側鎖の嵩張り。

二のような置換の例は、（ａ）　ｇｌｙ及び／又はｐｒｏの別のアミノ酸による 置換、又はｇｌｙ又はｐｒｏの除去または挿入、（ｂ）親水性の残基（例えば、 ｓｅｔまたはｔｈｒ）と疎水性の残基（例えば、ｌｅｕ、　ｉｌｅ、　ｐｈｅ、 　ｖａｌ又はａｌａ）との置換、（ｃ）　ｃｙｓ残基と他の残基との置換、（ｄ ）正電荷を有する側鎖（例えば、ｌｙｓ、　ａｒｇ、又はｈｉｓ　）を有する残 基と負の電荷を有する残基（例えば、ｇｌｕあるいはａｓｐ）との置換、（ｅ） 嵩張る側鎖（例えば、ｐｈｅ　）を有する残基とこのような側鎖を有しない残基 との置換である。

本発明によるほとんどの除去、挿入及び置換は、蛋白質又はペプチド分子の特徴 に大きな変化を生じさせないものである。しかしながら、予め置換、除去又は挿 入の正確な影響を予想することが難しい場合には、その影響が普通のスクリーニ ングアッセイ（イミューノアッセイ又はバイオアッセイ）によって評価すること は、当業者にとって想到できるものである。例えば、変異体は、輿望的にはペプ チド分子をエンコードする核酸、組替え細胞培養中における変異核酸の発現、及 び必要に応じ細胞培養からの精製（例えば、少くとも１つのエピトープに結合す ることによって変異体を吸収するために、カラムの上に特定の抗体を使用する免 疫アフィニティークロマトグラフィー）によって作る。

ＨＩ３又はキメラＨＩ３蛋白質、ＨＩ３の精製物又はその変異体を含む細胞溶解 物の活性は、所望の特徴に合った適当なスクリーニングアッセイによりスクリー ニングすることができる。例えば、蛋白質分子の免疫学的な性質、例えば所定の 抗体への結合性、の変化は、競合する種類の免疫アッセイによって測定する（以 下に詳説）。本明細書に記載するように、ウィルス感染性のような生物学的活性 は、適当なバイオアッセイでスクリーニングする。

酸化還元性、熱的安定性、疎水性、蛋白質分解への感受性、キャリアとの凝集性 又は多量体形成性のようなペプチド性質の変更は、当業者に周知の方法で試験す る。

ＨＩ３蛋白質の「ホモローブ」とは、分子全体又はそのフラグメントに実質的に 類似する非天然の分子に関するものである。

Ｈ１３蛋白質の「化学的誘導体Ｊは、通常は蛋白質の一部でない付加的な化学成 分を含有する。ペプチドの共有結合性の変更も、本発明の範囲内である。このよ うな変更は、目標とするペプチドのアミノ酸残基と、選ばれた側鎖または末端残 基と反応することができる存機誘導化剤とを反応させることによって、分子内に 導入することができる。

ンステイン残基は、最も一般的にα−ハロアセテート及び対応するアミン（例え ば、２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応して、カルボキシメチル 又はカルボキシアミドメチルの誘導体を与える。システィン残基はまた、プロモ トリフルオロアセトン、αブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、ク ロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジ ルジスルフィド、メチル−２−ピリジルジスルフィ）：、　ｐ−クロロマーキュ ＩＪ　−４−二トロフェノール、又はクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキサ− １゜３−ジアゾールとの反応によって誘導される。

ヒスチジン残基は、ヒスチジン側鎖に対して比較的に特異性を有するジエチルプ ロカーボネートとのｆｌｌ＋５．５−７．０での反応により誘導される。パラブ ロモフェロアシル臭化物も有用であり、ｐＨ６，０のＯ，ＩＭ　カコジル酸ナト リウム中で反応を行うのか好ましい。

リシン末端残基およびアミノ末端残基は、琥珀酸又は他のカルボン酸無水物と反 応する。これらの薬剤にょる誘導は、リシン残基の電荷を逆にする効果を存する 。α−アミノ含有残基を誘導する他の適当な試薬は、イミドエステルを含む。メ チルピコハンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、　ク ロロボロハイドライド（ｃｈｌｏｒｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）　、）リニトロ ベンゼンスルホン酸、０−メチルイソ尿素、２．４−ペンタンジオン、及びグリ オキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応を含む。

アルギン残基は、１つ又はいくつかの従来の試薬（なかでもフェニルグリオキザ ール、２，３−ブタンジオン、１．２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリン ）との反応によって変性される。アルギニン残基の誘導には、グアニジン官能基 のＰＫａが高い為に反応をアルカリ性条件下で遂行することが必要である。さら にこれらの試薬は、リジンの基及びアルギニン−ε−アミノ基と反応することか できる。

芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシン 残基にスペクトルラベルを導入することに特に関心を持って、チロシン残基の特 異な変性自体を広範囲にわたって研究した。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミ ジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ０−アセチルチロシン種 および３−二トロ誘導体を生成する。

カルボキシル側基（アスバチル又はグロタミル）は、１−シクロへキシル−３− （２−モルフオリニル−４−エチル）カルボジイミドまたはｌ−エチル−３−（ ４−アゾニア−４，４−ジンメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボジ イミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−ＮＲ）との反応によって選択的に変性される。さらにア スパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応により、 アスバチギン及びグルタミン残基に変オ）る。

グルタミン残基及びアスパラギン残基はしばしば対応するグルタミル残基および アスパルチル残基にアミド分解される。一方、これらの残基は、穏やかに酸性の 条件下でアミド分解される。これらの残基のどちらの態様も本発明の範囲内であ る。

二官能性薬剤による誘導は、ペプチドを非水溶性支持体マトリックスまたは池の 高分子キャリアに架橋するのに有用である。一般に使用する架橋剤は、１．１− ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニールエタン、　ゲルタールアルデヒド、Ｎ −ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ　ｅｓｔｅｒｓｌ例えば、４−ａｚｉ ｄｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ　ａｃｉｄとのエステル、ホモ三官能性イミドエステル 、３．３’　−ｄｉ　ｔｈｉｏ−ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉ ｏｎａｔｅ）のようなｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−ｒ−ステル、及びｂ　ｉ 　ｓ　−Ｎ−ｍａ　ｌ　ｅ　１ｍ１ｄｏ−１，８−ｏｃｔａｎｅのような二官能 性なマレイミドを含む。ｍｅｔｈｙｌ−３−［（ｐａｚｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｄ ｉｔｈｉｏ］ｐｒｏｐｉｏｉｍｉｄａｔｅのような誘導化剤は、光の存在下で架 橋物を生成する能力がある光活性化性中間体を与える。一方、ｃｙａｎｏｇｅｎ 　ｂｒｏｍｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓのような 反応性を有する非水溶性マトリックス及び反応性を存する基質（米国特許３．９ ６９．２８７号、同３．６９１．０１６号、同４．１９５．１２８号、同４、２ ４７．６４２号、同４．２２９．５３７号及び同４．３３０．４４０に記載され ている）は、蛋白質の固定化のために使用する。

他の変更は、フロリン及びリジンの水酸化、セリン又はトレオニン残基の水酸基 の燐酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル力（ Ｔ、　Ｅ。

Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍ ｏ１ｅｃｕｌｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、 、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ｐｐ、７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端ア ミンのアセチル化、および場合によっては、Ｃ−末端力ルホキシル基のアミド化 である。

このような誘導された成分は、溶解性、吸収性、生物学的半減期等を改善しえる 。このような成分はまた蛋白質等の望ましくない副作用を除くか低減することが できる。このような影響を及ぼす能力がある成分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏ ｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、第１６巻、　Ｍａ ｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｅａｓｔｏｎ、　ＰＡ　（１９８０） に開示されている。

組替えＤＮＡ技術の一般的原則を発表する標準的な文献としては、Ｗａｔｓｏｎ 、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　 ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、第１巻及び第１Ｉ巻、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／ＣｕＣｕｍｍ１ｎ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ、出版社、Ｍｅｎｌｏ　Ｐａ ｒｋ、　ＣＡ（１９８７）　、Ｄａｒｎｅｌｌ、　Ｊ、Ｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ。

１ｏｇｙ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｂｏｏｋｓ、　Ｉｎｃ 、　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ、ニューヨーク、　Ｎ、Ｙ、　（１９８６）　、Ｌｅｗ ｉｎ、　Ｂ、Ｍ、、Ｇｅｎｅｓ　ＩＩ。

Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、出版社、ニューヨーク、　Ｎ、Ｙ、　（ １９８５）　、Ｏｌｄ、　Ｒ，Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　 ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏ ｎ　ｔｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、　Ｕｎｉｖｅｒ ｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｐｒｅｓｓ出版社、バークレイ、　Ｃ Ａ　（１９８＋）　、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ １ｅｃｕＩａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８９）が挙げられる。これらの 文献は参照として本明細書に合体した。本発明の組替えＤＮＡ分子は、例えばＤ ＮＡ又はＲＮＡ合成のような、様々な方法のいずれかにより、又はより好ましく はＤＮＡ組替え技術の適用により、生成することができる。

用語「クローニングＪは、特定の遺伝子又は他のＤＮＡ配列をベクター分子に挿 入するためのｉｎ　ｖｉｔｒｏの組換え技術を使用することを意味する。所望の 遺伝子を首尾よくクローン化するために、ＤＮＡフラグメントを生成し、フラグ メントをベクター分子に結合し、複合したＤＮＡ分子を宿主細胞に導入し、受容 体宿主細胞からターゲット遺伝子を有するクローンを選ぶ方法を使用することか 必要である。

用ｉｔｉ　ｒ　ｃＤＮＡＪは、ＲＮＡ依存ＤＮＡ重合酵素（逆転写酵素）の作用 （こよって、ＲＮＡテンプレートから生成された相補的または転写ＤＮＡを意味 する。従って、ｒｃＤＮＡクローン」は、クローニングベクターに担持され、注 目するＲＮＡ分子と相補的な二重鎖ＤＮＡ配列を意味する。

用語１’ｃＤＮＡライブラリー１は、生体の全体の発現ｂ■吐なＪｆツムを含む ｃＤＮＡ挿入物を含有する組替えＤＮＡ分子の集ｌ）を意味する。このようなｃ ＤＮＡライブラリーは、当業者に公知の方法により調製することができ、このよ うな方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｔ、、Ｍｏ１ｅｃｔ目ａｒ　Ｃ ＩｏｎｉＢ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　（同上）に記載され ている。一般的に、ＲＮＡをまず生体の細胞から単離し、そのゲノムから特定の 遺伝子をクローン化するのが望ましい。本発明の目的に好ましいのは、哺乳類の 細胞系である。

Ｈ１３１００一部を表すオリゴヌクレオチドは、相同の遺伝子の存在のスクリー ニング及びこのような遺伝子のクローニングに有用である。このようなオリゴヌ クレオチドを合成する技術は、ＷＩＪ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇ、　 Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　２１．１０１ −１４１　（１９７８）に開示されている。

遺伝暗号は劣化するので、特定のアミノ酸をエンコードするために１つより多い コドンを使ってもよい。（Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　（同上 ）を参照）遺伝暗号を使って、各々アミノ酸をエンコードする能力がある１つ以 上の異なるオリゴヌクレオチドを同定することができる。実際、特定のオリゴヌ クレオチドが実際のＸＸＸエンコード配列を構成するという確率は、異常な塩基 対形成の関係と、真核細胞で特定のコドンを特定のアミノ酸をエンコードするた めに使用する頻度とを考慮に入れることによって請求めることができる。このよ うな「コドン使用法」は、　Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ １ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１８３．１１２　（＋９８５）に開示されている。Ｌａ ｔｈｅの［コドン使用法ｊを使って、Ｈ１３１００エンコードする能力がある理 論的に「最も確率の高い」ヌクレオチド配列を含有する単−又は−組のオリゴヌ クレオチドを同定する。

アミノ酸配列が単一のオリゴヌクレオチドのみによりエンコードされることがあ るが、−組の類似するオリゴヌクレオチドのいずれかによりアミノ酸配列をエン コードできることが多い。重要なことに、この組のオリゴヌクレオチドの全ては ペプチドフラグメントをエンコードする能力かあるオリゴヌクレオチドであり、 従って潜在的にペプチドフラグメントをエンコードする遺伝子と固しすりゴヌク レオチド配列を含有するが、この組の唯一のすリゴヌクＬ、オチドたけが、遺伝 子のヌクレオチド配列と全く同一のヌクレオチド配列を含有する。このオリゴヌ クレオチドが組の中に存在し、そして組の他のオリゴヌクレオチドの存在下でも ＤＮＡにハイブリッド化する能力があるので、蛋白質をエンコードする遺伝子を クローン化するために川−のオリゴヌクレオチドを使用するのと同じ方法で分別 していないすリボヌクレオチドの混合物を使用することかできる。

Ｈ１３フラグメントをエンコードする能力かある理論的に［最も確率の高いＪ配 列を含有するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの組は、「最も確率の 高い」配列又はその組にハイブリッド化する能力がある相補的なオリゴヌクレオ チド又はオリゴヌクレオチドの組の配列を同定するのに使用する。このような相 補的な配列を含有するオリゴヌクレオチドは、ＨＩ３遺伝子（Ｓａｍｂｒｏｏｋ 　ｅｔ　ａｔ、　（同上））を同定単離するためのプローブとして使用すること かできる。

ＨＩ　３遺伝子のフラグメントをエンコードする能力がある適当なオリゴヌクレ オチド又はオリゴヌクレオチドの組（又はこのようなオリゴヌクレオチドまたは オリゴヌクレオチドの組に相補的であるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオ チドの組）は、上記の方法を使うことによって同定し、合成し、そして、当業界 で周知の方法によってＤＮＡ　（より好ましくは、ＨＩ３遺伝子を発現する能力 かある細胞から得られたｃＤＮＡ調整物）に対してハイブリット化する。［最も 確率の高いＪＨ１３ペプチドのコードづけ配列に相補的な一本鎖のオリゴヌクレ オチド分子は、当業者に周知の方法（Ｂｅｌａｇａｊｅ、Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＢｉＱｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４．５７６５−５７８０ 　（１９７９）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｅｔ　ａｌ、、Ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｉｎ　ｔｈｅＣｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　Ｇｅｎ ｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ｎ１ｅｒｌｉｃｈ、　Ｄ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ 、、　Ｅｄｓ、　Ａｃａｄ、　Ｐｒｅｓｓ、　ＮＹ　（１９７６）；　Ｗｕ、　 Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｍｏ１ ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　２１．１０１−１４１　（１９７８）；　Ｋｈｏｒａｎａ 、Ｒ，Ｇ、、５ｃｉｅｎｃｅ、２０３．　６１４−６２５　（１９７９））　で 合成することができる。またＤＮＡ合成は、自動合成器を使用して行うことがで きる。核酸のハイブリダイゼーションの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ 、　（同上）　；　Ｈａｙｍｅｓ。

Ｂ、Ｄ、、　ｅｔ　ａｌ、Ｉｎ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅ ｓｓ、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ（１９８５））に記載されている。これ らの文献は、本明細書に参照として合体した。上記のような技術またはそれと類 似の技術により、ヒトのアルデヒド脱水素酵素のための遺伝子（Ｈｓｕ、　Ｌ、 Ｃ，、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．３７７ １−３７７５　（＋９８５　））；フィブロス・クチン、（５ｕｚｕｋｉ、　Ｓ 、。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｅｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、　Ｊ、　４． ２５１９−２５２４　（＋９８５））、ヒト力ストロゲンレセブター遺伝子（Ｗ ａｉｔｅｒ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８２．７８８９−７８９３　（１９８５））　、組織型プ ラスミノーゲンアクティベータ（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、、　ｅｔ　ａｔ、、　 Ｎａｔｕｒｅ、　３０１．２１４−２２１　（１９８３））、およびヒトのター 人胎盤アルカリ性フォスファターゼに相補的なりＮＡ　（Ｋａｍ、　Ｗ、、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．８７１５−８７１９　（１９８５））のクローニン グが可能になった。

ＨＩ３遺伝子をクローン化する別法では、ＤＮＡ　（より好ましくはＨ１３を発 現する能力がある細胞から得られたｃＤ　Ｎ　Ａ　）を発現ベクターにクローニ ングすることによって発現ベクターのライブラリーを調製する。次いて、抗Ｈｌ 　３抗体に結合するとともに、ＨＩ３蛋白質またはペプチドと同じアミノ酸配列 又はそのフラグメントを有するポリペプチドをエンコードする能力があるヌクレ オチド配列を有する蛋白質を発現することができるメンバーを得るために、ライ ブラリーのスクリーニングを行う。この実施例では、ＨＩ３蛋白質を発現する能 力がある細胞からＤＮＡ又はｃＤＮＡを抽出し精製する。精製されたｃＤＮＡは 、打設、エンドヌクレアーゼによる消化等により切断し、ＤＮＡ又はｃＤＮＡフ ラグメントのプールを形成する。このプールのＤＮＡ又はｃ　ＤＮＡフラグメン トを発現ベクターにクローン化して、各々が独特のクローン化されたＤＮＡ又は ｃＤＮＡフラグメントを含有する発現ベクターのゲノムライブラリーを生成する 。

用語「ベクター」は、プラスミド又はバクテリオファージから得られたＤＮＡ分 子であって、その中にＤＮＡのフラグメントを挿入又はクローニングすることが できるものを意味する。ベクターは１つ以上のユニーク制限部位（ｕｎｉｑｕｅ 　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　５ｉｔｅ）を含有し、クローン化された配列か複製 可能な特定の宿主又は媒体生物において自律性複製をすることができる。

「発現ベクター」は、適当な転写及び／又は翻訳コントロール配列の存在の為に 、ベクターにクローン化されてＤＮＡ又はｃＤＮＡ分子を発現する能力があり、 よってポリペプチドまたは蛋白質を生成するベクターである。発現ベクターが適 当な宿主細胞に導入されると、クローン化された配列の発現が起こる。原核発現 ベクターを使用する場合、適当な宿主細胞は、クローン化された配列を発現する 能力があればいかなる原核細胞でもよい。

同様に真核発現ベクターを使用する場合、適当な宿主細胞は、クローン化された 配列を発現する能力があればいかなる真核細胞でもよい。重要なことに、真核Ｄ ＮＡは介在配列を含有するかもしれず、かつこのような配列は原核細胞中で正し く処理することができないので、原核ゲノム発現ベクターライブラリーを生成す るために、Ｈ２Ｓを発現する能力がある細胞から得たｃＤＮＡを使用するのか好 ましい。ｃＤＮＡを生成し、ゲノムライブラリーを作製する方法は、Ｓａｍｂｒ ｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（同上）に記載されている。

用語「実質的に純粋Ｊとは、本発明のいかなる蛋白質またはペプチド、あるいは このような蛋白質またはペプチドをエンコードするいかなる遺伝子も、他の蛋白 質または遺伝子を実質的に含有しておらず、また自然界では通常見られない汚染 物や、自然界では見られない形態で存在する汚染物を含有しないことを意味する 。

ポリヌクレオチド分子の［機能的誘導体ｊとは、Ｈ１３蛋白質の「フラグメント 」、「変異体」または［類似体１をエンコードするポリヌクレオチド分子を意味 する。このような機能的誘導体は、ヌクレオチド配列に関してＨＩ　３をコード する配列に「実質的に類似」しているものでもよく、それによってＨＩ３蛋白質 に類似する活性を有する蛋白質をエンコードする。一方、ポリヌクレオチ１−の １機能的誘導体」は、その機能（例えば、蛋白質を発現する能力又は相補的なポ リヌクレオチド分子とハイブリット化する能力）を保持する化学的誘導体でもよ い。このような化学的誘導体は、核酸ハイブリデイゼーノコンアッセイによりＨ １３配列を検出する分子プローブとして有用である。

２つの分子中のアミノ酸の配列が実質的に同じであるならば、両分子は「実質的 に類似する」と言う。実質的に類似するアミノ酸分子は、類似する生物学的活性 を有する。従って分子の一方が他方にない付加的なアミノ酸残基を含有するとし ても、あるいはアミノ酸残基の配列が同一でないとしても、この［類似するＪと 言う用語を本明細書で使用しているように、２つの分子が類似する活性を仔する ならば、それらは変異体であるとみなす。

本発明のＴ（＋　３蛋白質又はキメラＥＲＲ／Ｈ１３蛋白質、あるいはその機能 的誘導体をエンコードするＤＮＡ配列は、従来の技術（例えば、連結用のブラン ト末端またはスタツガード末端、適当な末端を得る制限酵素消化、望ましくない 接合を避けるための適当なアルカリ性］すスファターゼによる処理のような付着 端（ｅｏｈｅｓｉｖｅ　ｅｎｄ）の注入、適当なりガーゼによる連結）によりベ クターＤＮＡと組み換えすることかできる。このような操作のだめの技術はＳａ ｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、（同上）に記載されており、当業界におい て周知である。

ＤＮＡのような核酸分子は、転写及び翻訳を調節する情報を含有するヌクレオチ ド配列を含有し、このような配列がポリペプチドをエンコードするヌクレオチド 配列に「機能的に結合する」場合、ポリペプチドを［発現する能力がある」と言 うことができる。機能的な結合とは、調節ＤＮＡ配列と発現すべきＤＮＡ配列と が遺伝子発現を可能にする態様で連結することを言う。遺伝子発現に必要な調節 領域の正確な性質は、生体ごとに異なるが、一般にプロモーター領域を含む。プ ロモーター領域は、原核生物においてプロモーター（ＲＮＡの転写の開始を指示 する）、及びＲＮＡに転写されたときに蛋白質合成の開始を合図するＤＮＡ配列 の両方を含む。このような領域は、通常は転写および翻訳の開始に関与する５− 非コード配列（ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等）を含む 。

必要に応じて、非コード配列３゛を上記の方法で得ることかできる。この領域は 、停止およびポリアデニル化（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ　）のような、 転写停止調節配列用に保持することができる。蛋白質をコードするＤＮＡ配列に 自然に隣接する領域３゛を保持することによって、転写停止シグナルを与えるこ とができる。転写停止シグナルが発現宿主細胞中で満足に機能しない場合、宿主 細胞中で機能的な領域３′に置換することができる。

一つの核酸分子の２つの配列が、同じＲＮＡ転写体上へ転写できるか、あるいは 一方の配列で始まったＲＮＡ転写体が２番目の配列まで伸びることができるよう に連結している場合、再配列は［機能的に連結しているＪと言う。従って、ＤＮ Ａ又はＲＮＡのプロモーター配列及び池の「２番目のｊ配列のような２つの配列 は、もしプロモーター配列で始まる転写が機能的に連結した２番目の配列のＲＮ Ａ転写体を生成するならば、機能的に連結していることになる。［機能的に連結 するＪために２つの配列が隣同士である必要はない。

「プロモーター」は、ＲＮＡ重合酵素に結合して「機能的に連結した」核酸配列 の転写を促進する能力があるＤＮＡ又はＲＮＡ分子の領域である。「プロモータ ー配列」は、ＲＮＡ重合酵素によって転写されるＤＮＡ又はＲＮＡのストランド に見られるプロモーターの配列である。この機能的プロモーターは、［プロモー ター配列Ｊを介在する二重螺旋の分子の上記ストランドに８！能的に連結する核 酸分子の転写を指示する。

ある種のＲＮＡ重合酵素はこのようなプロモーターに対して高い特異性を示す。

バクテリオファージＴ７　、Ｔ３及び５Ｐ−６のＲＮＡ重合酵素は特によくキャ ラクタリゼーソ１ンされており、高いプロモーター特異性を示す。

これらのＲＮＡｔ合酵素の各々に対して特異なプロモーター配列はまた、二重鎖 ＤＮＡテンプレートの２つのストランドの１方だけを利用（例えば転写する）す るように、重合酵素に指示する。いずれのストランドを転写するかの選択は、プ ロモーター配列の配向によって決定する。３゛水酸基末端にヌクレオチド５゛ホ スフエートを付加するだけてＲＮＡか酵素的に重合するので、この選択により転 写の方向が決定する。このような重合酵素認識配列は、Ｗａｔｓｏｎ、　Ｊ、Ｄ 、　ｅｔ　ａｌ、、（同上）に記載されている。本発明のプロモーター配列は、 原核性、真核性又はウィルス性のいずれでもよい。適当なプロモーターは抑制型 であり、より好ましくは構成型である。強いプロモーターが好ましい。

本発明は、原核又は真核細胞中のＨＩ３蛋白質（又は機能的誘導体）又はキメラ ＨＩ３蛋白質の発現を包含すが、好ましい発現は真核細胞中であり、最も好まし くはヒトの細胞中ての発現である。原核細胞（例えば、Ｅ。

ｃｏｌｉ、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔ ｏｍｙｃｅｓ等）中で本発明のキメラ蛋白質を発現するために、配列をエンコー ドするＨＩ３を機能的原核のプロモーター（その例は当業界において周知である ）に機能的に連結することが必要である。原核細胞中の適当な発現は、遺伝子エ ンコード配列の上流にリポソーム結合部位が存在することを必要とする。例えば 、Ｇｏｌｄ、　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３５．３６５−４０４　（１９８１）を参照。

ＨＩ３蛋白質（又はその機能的誘導体）又はキメラＨＩ３蛋白質を原核細胞（例 えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ、　Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 、　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｅｔ　ａｔ、）中で発現するために、配列をエ ンコードするＨＩ３を、機能的な原核プロモーターに機能的に連結する必要があ る。構成プロモーターの例として、バクテリオファージの　ｉｎｔプロモーター 、ｐＢＲ３２２のβ−１ａｃｔａｍａｓｅ遺伝子のｂｌａプロモーター、ｐＢＲ ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロ モーター等が挙げられる。誘導ヤ原咳プロモーターの例として、バクテリオファ ージ１（Ｐ、及びＰつ）の主な左右のプロモーター、Ｅ、　ｃｏｔｌのｔｒｐ、 ｒｅｃＡｌｌａｃｅ、Ｉａｃｌおよびｇａｌプロモーター、α−アミラーゼ（Ｕ ｌｍａｎｅｎ、Ｉ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ、１６２． 　１７６−１８２　（＋９８５））、　Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓの５−２８−特異 プロモーター（Ｇｉｌｍａｎ、　Ｍ、１．、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｇｅｎｅ　３２ ．１１−２０　（＋９１９４））、　［１ａｃｉｌｌｕｓのバクテリオファージ のブロモ−クー（Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、、Ｉ、、Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　ＮＹ　（１９８２））、及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｅ ｅｓプロモーター（Ｗａｒｄ、　Ｊ、Ｍｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇｅ ｎｔ、　Ｇｅｎｅｔ　２０３．４６８−４７８　（＋９８６　））等が挙げられ る。原核プロモーターは、Ｂ、Ｒ，Ｃ１１ｃｋ　（Ｊ、ｌｎｄ。

Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ、　ｌ、　２７７−２８２　（１９８７））　、Ｃｅｎａｔ ｉｅｍｐｏ、　Ｙ　。

（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８．５０５−５１６　（１９８６））　、及びＧｏｔ ｔｅｓｍａｎ、　Ｓ、、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　１８．４１５− ４４２　（＋９８４乃に記載されている。

原核細胞中の適当な発現はまた、遺伝子エンコード配列の上流にリポソーム結合 部位が存在することを必要とする。このようなリポソーム結合部位は、例えばＧ ｏｌｄ、Ｌ、ｅｔ　ａｌ、（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３５．　３ ６５−４０４　（＋９８１））によって開示された。

真核宿主としては、イースト、昆虫、菌類、哺乳類の細胞等が挙げられ、これら はｉｎ　ｖｉｖｏまたは組織培養中のいずれでもよい。哺乳類の細胞は、正しい 部位で正しい折り畳みまたはグリコリル化するように矯正することを含む蛋白質 分子の翻訳後の修正機構を存する。宿主として作用な哺乳類の細胞としては、Ｖ ＥＲＯ又はＣｌｌ０ような繊維芽細胞由来の細胞、ハイブリドーマＳＰ２１０− Ａｇ　１４又はマウスのミエローマＰ３−Ｘ６３Ａｇ８のようなリンパ由来の細 胞、又はこれらの誘導体が挙げられる。好ましい哺乳類の細胞は、遺伝的に欠陥 ある細胞の機能をｉｎ　ｖｉｖｏで置換しようとする細胞である。骨髄細胞は、 造血又は免疫システムの不全を遺伝子学的に治療するのに好ましい哺乳類の細胞 宿主に対して、多くのベクター系がＨＩ３の発現のために利用可能である。宿主 の性質によって、多種の転写翻訳調節配列を使用することができる。調整シグナ ルが高レベルの発現を存する特定の遺伝子と会合している場合、転写翻訳調整シ グナルを、アデノウィルス、ウシ属の乳頭腫ウィルス、５１ｍ１ａｎウイルス（ ＳＶ）等のようなウィルス源から得ることができる。一方、アクチン、コラーゲ ン、ミオシン等のような哺乳類の発現生成物から得たプロモーターを使用するこ ともできる。遺伝子の発現を調節できるように、抑制または活性化作用を育する 転写開始調節シグナルを選ぶことができる。なかでも興味があるのは、温度を変 えることによって発現を抑えたり、開始したりすることができるように、温度に 敏感になっている調節シグナルであり、あるいは化学的調整（例えば、代謝物） のできる調節シグナルである。

イースト宿主細胞に対して、イースト遺伝子発現システムのいずれも利用するこ とが１きる。これらは、イーストがグルコースリッチな媒体中で成長するときに 多量に生成される解糖酵素をコードする活発に発現された遺伝子からのプロモー ター及び停止要素を含む。公知の解糖遺伝子はまた、非常に効率的な転写制御シ グナルをも与えることができる。例えば、ホスホグリセリン酸ギナーゼ遺伝子の プロモーター及びターミネータ−シグナルを利用することができる。

昆虫中のＩ−（＋　３又はキメラＨｌ　３分子の生産は、当業者に知られている 方法により、ＨＩ３を発現するように設計されたバキュロウィルスを昆虫宿主に 感染させることによって行うことができる。従って、一実施例においては、ＨＩ ３をエンコードする配列をウィルスのポリヘトリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）蛋 白質の調節領域に機能的に連結することができる（Ｊａｓｎｙ、　５ｃｉｅｎｃ ｅ、　２３８．１６５３　（１９８７））。組替えバキュロウィルスに感染させ れば、培養した昆虫細胞又は生きている昆虫自体は、全蛋白質生産の２０〜５０ ％の量のＨＩ　３蛋白質を生成することができる。生きている昆虫を使う場合、 イモ虫は現在本発明によりＩ（１３を大規模に生産するのに好ましい宿主である 。

上記の通り、真核宿主中のＨＩ　３蛋白質の発現は、真核調節領域の使用を必要 とする。一般に、このような領域はＲＮＡ合成の開始を指示するのに十分なプロ モーター領域を含む。好ましい真核プロモーターは、マウスメタノチオネイン■ 遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ、　Ｄ、　ｅｔａｌ、、　Ｊ、　Ｍｏ１．　 Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎ、　Ｉ、　２７３−２８８　（＋９８２））、ヘルペスウィ ルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　Ｃｅ１１３１、３５５ −３６５　（＋９８２　））　、ＳＶ４０の初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓ＋ 、　Ｃ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　（ロンドン）、　２９０．３０４−３ １０（１９８＋））　、イーストｇａｌ　４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔ ｏｎ、Ｓ、Ａ、ｅｔ　ａｔ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ 、７９．　６９７１−６９７５　（１９８２）　、５ｉｌｖｅｒ、Ｐ、Ａ、ｅｔ 　ａｌ、、Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．５９５１−５９５５　（１９８４）　 ）を含む。

広く知られているように、真核ｍＲＮＡの翻訳は、最初のメチオニンをエンコー ドするコドンにより始められる。このために、真核プロモーターとＨＩ３又はキ メラ蛋白質をエンコードするＤＮＡとの間の結合には、メチオニン（ＡＵＧ）を エンコードする能力があるいかなる介在コドンか確実に含有されていないのが望 ましい。このようなコドンが存在すると、融合蛋白質（ＡＵＧコドンか、ＤＮＡ 配列をエンコードするＨ　１３と同じ読み取り枠内に存在する場合）又はフレー ム−シフト突然変異（ＡＵＧ遺伝暗号が、配列をエンコードするＨ　１３と同じ 読み取り枠内に存在しない場合）が形成されてしまう。

ＨＩ３又はキメラレセプターをコードする塩基配列及び機能的に連結したプロモ ーターは、非複製ＤＮＡ　（又はＲＮＡ）分子（線状分子、又はより好ましくは 共有結合性の閉環状分子のいずれでもよい）として、受容原核または真核細胞に 導入することができる。このような分子は自律性複製ができないので、導入され た配列の一過性の発現によりＨＩ３蛋白質が発現するであろう。一方、導入され た配列を宿主染色体に統合することにより、永久的発現か起こる可能性もある。

一実施例においては、宿主細胞染色体に所望の遺伝子配列を統合する能力がある ベクターを使用する。導入されたＤＮＡを安定的に染色体に統合した細胞は、発 現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つ以上のマーカーを導入す ることによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に、原栄養 性抗生物質又は鋼等の重金属のような殺生物剤に対する耐性を付与することがで きる。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきＤＮＡ遺伝子配列に直接連結す るか、同時にトランスフェクションによって同じ細胞に導入することかできる。

単一の連鎖結合蛋白質ｍＲＮＡの最適な合成のために、付加的な要素を必要とす ることがある。これらの要素は、スプライシングングナルとともに、転写プロモ ーター、エンハンサ−及び集結コドンを含むことができる。このような要素を統 合するｃＤＮＡ発現ベクターは、　Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ １．　Ｂｉｏｌ、３．２８０　（１９８３）によって記載されたものを含む。

別の実施例においては、導入された配列は、受容体宿主中において自律復製をす ることかできるプラスミド又はウィルスベクターに合体する。多種のベクターの いずれも、この目的に使用することかできる。好ましい真核プラスミドは、ＢＰ Ｖ、ワクシニアウィルス、　ＳＶ４０．２−ミクロンサークル等又はこれらの誘 導体を含む。このようなプラスミドは当業界において周知である（Ｂｏｔｓｔｅ ｉｎ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｍｉａｍｉ　Ｗｎｔｒ、　ＳＹｍｐ、　１９． ２６５−２７４　（１９８２’）：　Ｂｒｏａｃｈ、　、］、Ｒ，，Ｉｎ：　Ｔ ｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅＹｅａｓｔ　Ｓａｃ ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎ ｃｅ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　 Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ＮＹ、　ｐｐ、　４４５−４７０　（＋９８１）；　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ， 、Ｃｅ１ｌ　２８．２０３−２０４　（＋９８２）＋　Ｂａ１ｌｏｎ、　Ｄ、Ｐ 、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．　１ ０．３９−４８　（１９８０）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｃｅ１ｌ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒｅａｔｉｓｅ、Ｖｏｌ 、３．Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ 、ｐｐ、５６３−６０８　（＋９８０））。

好ましい真核プラスミドは、ＢＰＶ、ワクシニアウィルス、ＳＶ４０．２−ミク ロンサークル等又はこれらの誘導体を含む。このようなプラスミドは当業界にお いて周知である（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｉａｍｉ　Ｗ ｎｔｒ、　ＳＹｍｐ、　１９．２６５−２７４　（１９８２）　；　Ｂｒｏａｃ ｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｉｎ：　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ 　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ 　ａｎｄ　１ｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　４ ４５−４７０　（１９８１）　；　Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、Ｒ，、Ｃｅ１１　２８ 、　２０３−２０４　（＋９８２）；　Ｂｏｌｌｏｎ、Ｄ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、、 １．　Ｃ１１ｎ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　０ｎｃｏ１．１０．３９−４８　（１９ ８０）；　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、。

Ｉｎ：　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｔｒ ｅａｔｉｓｅ、　Ｖｏｌ、　３、　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ａｃａ ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ”ｌ’、　５６３−６０８　（１９８０））　。

ＣＩ（０細胞中で本発明の８１３又はキメラレセプター蛋白質の一過性の発現を させるために好ましいベクターは、ｐＳＧ５又はｐＣＤＭ８発現ベクターである 。

一旦構造体を含有するベクター又はＤＮＡ配列が発現のために調製されると、ベ クター又はＤＮＡ構造体は、適当な方法（トランスフォーメーション、トランス フェクション、接合、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿及びポリカチ オン（例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ　）デキストラン）の塗布のよう な生化学的方法、及びエレクトロボーレーション、直接微量注射及びマイクロプ ロジェクト砲撃（Ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　 ）　（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０　（４８５ ８）：　１５３８　（１９８８））等のような機械的方法によって、適当な宿主 細胞に導入することかできる。

ベクターの導入の後に、ベクターを含有する細胞を成長させるために選ばれた選 択培地で受容細胞を成長させる。クローン化された遺伝子配列の発現により、Ｈ Ｉ　３又はキメラ■１１３蛋白質が生産されるか、あるいは細胞の表面上で発現 することになる。

所望に応じ、発現した■］１３又はキメラ蛋白質を単離し、抽出、沈殿、クロマ トグラフィー、親和性クロマトグラフィー、電気泳動法等のような公知の方法に よって精製する。例えば、細胞を遠心分離法によりまたは適当なバッファーとと もに捕集し、溶菌し、得られた蛋白質を、ＤＥＡＥ−セルロース、ホスホセルロ ース、ポリリボシチジル酸−アガロース又はヒドロキシアパタイト上でのカラム クロマトグラフィー法、又は電気泳動法又は免疫沈澱法によって単離する。一方 、キメラ蛋白質は、ＥＲＲ−誘導アミノ酸置換を含有する蛋白質と反応する抗Ｈ １３抗体のような特異な抗体を使用することによって、単離することができる。

このような抗体は、周知の方法て得ることかできる。

さらに、本発明の遺伝子構造体の操作により、特定のウィルス結合領域をＨＩ３ 蛋白質のトランスメンブレン部分及び細胞質内部分の上に移植したり、別の分子 のトランスメンブレン部分及び細胞質内部分の上にＨＩ３のレトロウィルス結合 領域を移植することかでき、それによって別種のキメラ分子を生成することにな る。

本発明はまた、遺伝子導入非ヒト真核動物（好ましくは、マウスのような藁歯類 ）に関し、その生殖細胞及び体細胞は、ヒトレトロウィルスレセプターとして作 用することができるＨＩ３蛋白質又はその機能的誘導体をコードする本発明のゲ ノムＤＮＡを含有する。ＨＩ３ＤＮＡは、胎児の段階（好ましくはｌ細胞、すな わち受精した卵母細胞段階で一般的には約８細胞段階より遅くない）において、 遺伝子導入すべき動物又はその動物の祖先に導入する。本明細書に使用する用語 「トランスジーン」は、動物のゲノムに合体して動物中で発現し、遺伝子導入動 物内で蛋白質を生成する遺伝子を意味する。

種々の方法により、このような遺伝子を動物の胎児のゲノムに導入して染色体的 に結合、発現させることができる。１つの方法は、自然に起こるように胎児に遺 伝子をトランスフェクトして、遺伝子は発現が生じる遺伝子座で染色体に合体し た遺伝子導入動物を選ぶものである。発現を確実にする他の方法は、胎児へ導入 する前に遺伝子又はその制御配列を修正することである。１つのこのような方法 は、すでに修正した遺伝子を含有するベクター（上記参照）で胎児をトランスフ ェクトすることである。他の方法は、誘導型又は構成りに作用するプロモーター （合成であるか、真核又はウィルス由来であるかにかかわらず）のコントロール 下で転写を行う遺伝子）を使うか、１つ以上の塩基対の置換、除去又は付加（上 記参照）によって活性化された遺伝子を使うことである受精した卵母細胞段階に おいて所望の遺伝子配列を導入することにより、トランスジーンが遺伝子導入動 物の全ての生殖細胞および体細胞の中に存在するとともに、全てのこのような細 胞中で発現するポテンシャルを存することを確実にする。遺伝子導入「始祖（ｆ ｏｕｎｄｅｒ）Ｊ動物の生殖細胞中にトランスジーンか存在するということは、 全てのその子孫かそれらの生殖細胞および体細胞の全てにおいてトランスジーン を担持することを意味する。始祖動物中に胎児の後期段階でトランスジーンを導 入すると、始祖のいくらかの体細胞血統中にトランスジーンか限定的にしか存在 しないことになる。しかしながら、慣例通りに始祖の生殖細胞からトランスジー ンを引き継ぐこの始祖動物の全ての子孫は、それらの生殖細胞および体細胞の全 てにトランスジーンを担持する。

全ての体細胞および生殖細胞が本発明のＤＮＡを含有しているとは限らないキメ ラ嘩乳動物（ヒト以外）、例えは遺伝子導入哺乳動物を生成するプロセスにおい て桑実胚の細胞の幾つかがトランスフェクトされる時に生成される動物もまた、 本発明の範囲内である。

遺伝子導入したヒト以外の哺乳動物を生成する技術（米国特許・Ｌ７３６．８６ ６号）は、本発明の遺伝子導入したヒ［へ以夕）の哺乳動物の生産に使用するこ とかてきる。Ｐａ　１ｍ１ｔｅｒ、　Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ａｎｎ、　ＲｅＶ、　 Ｇｅｎｅｔ、　２０．４６−９９　（ｔ９８Ｇ）に記載された種々の技術もまた 、使用することができる。これらの文献は参照のために本明細書に含ませる。

Ｆ（１３遺伝子を担持する動物は、ヒトレトロウィルスの感染又はＨＩ３分子を レセプターとして使用する細胞に感染するレトロウィルスにより生ずる病気を防 止、抑制叉は治療する化合物又は他の治療モダリティ−をテストするために使用 することができる。これらのテストは、本発明の遺伝子導入動物に投与するウィ ルスの量を調整する能力の為に、非常に敏感にできる。このような動物は、同じ ヒトレトロウィルスの病気の診断方法をテストするモデルとしても作用する。こ のような病気としては、ＡＩＤＳに限らず、ＨＴＬＶにより引き起される白血病 等がある。本発明の遺伝子導入用動物はまた、細胞培養のための細胞源として使 うこともできる。

本発明の遺伝子導入用動物モデルは、多大のコストをかけてヒトの免疫システム の適当な細胞と各々の個体のマウスを再増殖させることを必要とするｒ　５ＣＩ ＤマウスＪモデルより多くの経済的利点を有する（　ＭｃＣｕｎｅ、　Ｊ、　Ｍ 。

ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４１．１６３２−１６３９　（１９８８ ））。

本発明はまた、ＨＩ３蛋白質のエピトープに対して特異な抗体にも関する。追加 の実施例では、レトロウィルスの感染を防止又は治療するために、あるいは細胞 、細胞又は組織の抽出物又は生物学的流体中のＨＩ３蛋白質の存在を検出するか 、その量または濃度を測定するために、本発明の抗体を使う。

用語「抗体Ｊは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ 抗体及び抗イデイオタイプ抗体（ａｎｔｉ−１ｄ　）を含むものとする。

ある抗体が分子と特異的に反応してその分子との結合が可能であるならば、その 抗体はその分子と「結合する能力がある」と言うことができる。用語「エピトー プ」は、分子のうち、その抗体と結合する能力がある部分を意味し、また抗体に よって識別することもてきる。通常エピトープ又は「抗原基Ｊは、アミノ酸また は砂糖側鎖のような化学的な分子表面の活性基からなり、特異な三次元構造とと もに特異な電荷特性を有する。

用語［抗原」は、抗体によって結合される能力がある分子又は分子の一部であり 、その抗原のエピトープに結合することができる抗体を合成するように動物を誘 起するることかできるものである。抗原は、１つ以上のエピトープを有していて もよい。上記の特異な反応により、抗原はその対応する抗体と非常に選択的に反 応するが、他の抗原によって呼び起こされる多くの他の抗体とは反応しない。

ポリクローナル抗体は、抗原により免疫化された動物の血清から得られる種々の 抗体分子の集合体である。

モノクローナル抗体は、特異な抗原に対する抗体の実質的に均一な集合体である 。ｍＡｂは当業者に公知の方法て得ることかてきる。例えばＫｏｈｌｅｒ及びＭ ｉｌｓｔｅｉｎ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７　（１９７５）　、及び米国特許４． ３７６゜１１０号を参照。このような抗体としては、　ＩｇＧＳＩｇＭ、ＩｇＥ 、　ＩｇＡ及びこれらのサブクラスを含む免疫グロブリン′７：ｊスのものであ ればよい。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマは、ｉｎ　ＶｉｔｒＯて叉 はｉｎ　ｖｉｖｏで培養することかできる。これは現在高力価のｍＡｂをｉｎ　 ｖｉｖ。

で生産するのに好ましい方法である。簡単に言うと、個体のハイブリドーマから 得た細胞をプリスタン感作Ｂａ１ｂ／ｃマウスに組織内注射し、所望のｍＡｂを 高濃度で含（■する腹水流体を生成する。アイ゛ツタイブＩｇＭ　又は　１８Ｇ のｍＡｂｓは、当業者に周知のカラムクロマトグラフィー法を使って、このよう な腹水流体または培養液上清から精製することができる。

キメラ抗体は、異なる動物種から得られる異なる部分からなる分子であり、例え ば、マウスのｍＡｂから誘導される可変部及びヒトの免疫グロブリンネ変部を有 する部分）である。キメラ抗体およびこれを生産する方法は、当業界において公 知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８１．６８５１−６８５５　（１９８４ ）　、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ　Ｃｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１４．２６８ −２７０　（１９８５）　、Ｓｕｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８４．２１４−２１８　（１９８７）　、Ｂ ｅｔｔｅｒｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０．１０４１１０４３　（ ＋９８８）　、Ｂｅｔｔｅｒ、　Ｍ、　Ｄ、、国際特許公開Ｗ　０９１０７４９ ４号を参照。これらの文献は参照として本明細書に合体した。

抗イデイオタイプ（ａｎｔｉ−１ｄ）抗体は、一般に抗体の抗原結合部位に関連 するユニーク決定基を識別する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの源と同じ種及 び遺伝子タイプ（例えば、マウス株）の動物に抗１ｄを生成するｍＡｂにより免 疫させること）二よって調製することができる。免疫した動物は、これらのイデ ィオタイプ抗原決定基に対する抗体（抗１ｄ抗体）を生成することにより、免疫 抗体のイディオタイプ抗原決定基を識別する。

抗１ｄ抗体はまた、さらに別の動物に免疫反応を引き起こして、いわゆる抗−抗 １ｄ抗体を生成する［免疫原Ｊとしても使用することができる。抗−抗１ｄは、 抗Ｉｄを引き起こした元のｍＡｂに構造上の類似性を有してイテモよい。従って 、ｍＡｂのイディオタイプ抗原決定基に対する抗体を使うことによ−）て、同一 の特異性を有する抗体を発現する他のクローンを同定することかできる。

従って、本発明のＨＩ　３蛋白質に反して生成されたｍＡ　ｂは、適当な動物、 例えばＢａ１ｂ／ｃマウスにおいて、抗１ｄ抗体を生じさせるために使うことか できる。このような免疫を与えられたマウスの牌臓細胞は、ｍＡｂを分泌する抗 １ｄノ飄イブリドーマを生成するのに使う。さらに抗ＩｄのｍＡｂは、キーホー ルカサガイヘモソアニ〕・（にＬ　Ｈ）のようなキャリアに結合して、付加的な りａ　ｌ　ｂ／Ｃマウスに免疫させることかできる。これらのマウスの血清は、 ＨＩ３蛋白質のエピトープに対して特異なオリジナルのｍＡｂの結合性を有する 抗−抗１ｄ抗体を含有する。

従って、抗１ｄのｍＡｂは、ＨＩ３蛋白質のエピトープのような自己のイデオタ イプエピトーブ、すなわち［イディオ１・−ブＪ　（評価しているエピトープに 構造上類似する）を存する。

用語「抗体」はまた、無傷の分子とともにそのフラグメント（例えは抗原に結合 する能力かあるＦａｂ及びＦ（ａｂ）２）を含む。Ｆａｂ及びＦ　（ａｂ’　） ｚのフラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを存さず、循環流動から比 較的速く透明化し、かつ無傷の抗体よりも特異的な組織結合性を有することがで きる（Ｗａｈｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｎｕｃｌ。

Ｍｅｄ、　２４．３１６−３２５　（＋９８３））。

本発明に有用な抗体のＦａｂ及びＦ　（ａｂ’　）２及び他のフラグメントは、 無傷の抗体分子について本明細書に記載した方法によって、ＨＩ３蛋白質の検出 及び定量のために使用することかできる。このようなフラグメントは典型的（こ は、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）又はペプシン（Ｆ　（ａｂ ｏ）２フラグメントを生成するため）のような酵素を使って、蛋白質の開裂によ って生成する本発明の抗体又はそのフラグメントは、表面または細胞内にＨＩ３ 蛋白質（又はＨＩ３から得られるエピトープを存するキメラレセプター）を発現 する細胞の存在を定量的又は定性的に検出するのに使うことができる。これは、 蛍光的にラベリングした抗体を用いる免疫蛍光法と、光学顕微鏡、流動細胞計測 法又は蛍光定量法による検出との組み合わせによって、行うことができる。

本発明の抗体は、ＨＩ３蛋白質のｉｎ　５ｉｔｕな検出のために、免疫蛍光又は 免疫電子顕微鏡検査と同様に、組織学的に使用することができる。１ｎｓｉｔｕ 検出は、組織学的な試料（細胞又は組織）を被験者から取り、本発明のラベリン グした抗体をこのような試料に与えることにより、行うことができる。抗体（又 はフラグメント）は生物学的試料に塗布するか載せるのが好ましい。このような 方法の使用により、ＨＩ３蛋白質の存在だけでなく検査中の組織におけるその分 布をも決定することができる。本発明を使って、多種の組織学的な方法（染色法 のような）のいずれもｉｎ　５ｉｔｕ検出のために修正することかできることは 、当業者であれば容易に分かる。

その上、本発明の抗体は、生物学的試料中に可溶性ＨＩ３分子か存在するか否か を検出するのに使うことができる。このように使用する場合、その抗体は、ヒト のレトロウィルス感染を防止又は治療するために被験者に治療上使用したＨ　Ｉ 　３蛋白質又はその誘導体の存在及び量をモニターする手段として作用する。

■１１３蛋白質のこのような免疫アッセイは、典Ｖ的には生物学的試？４（例え ば生物学的流体、組織抽出物、新たに収穫したリンパ球又は白血球のような細胞 、又は組織培養でインキュベートされた細胞）を、ＨＩ３蛋白質を同定できるよ うに、検出可能にラベリングした抗体の存在下でインキュベートし、当業界で周 知の任意の技術で抗体を検出することからなる。

生物学的試料は、例えば、ニトロセルロースやその他の固体支持体など、細胞、 細胞粒子又は可溶性蛋白質を固定化できる固相支持体、すなわちキャリア上で処 理してもよい。そして支持体を次いで適当なバッファーで洗浄し、さらに検出可 能にラベリングしたＨＩ３に特異な抗体で処理することができる。固相支持体は 、次いて未結合の抗体を除去するためにバッファーで洗浄することかできる。前 記固体支持体上に結合したラベルの量は、従来の方法によって検出することがで きる。

用語［同相支持体Ｊ又は「キャリアｊは、抗原又は抗体を結合することかできる いかなる支持体も含むものとする。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラ ス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、 アミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、天然及び変成セルロース、ポリアクリルアミド 、斑れい岩及びマグネタイト等か挙げられる。キャリアは、本発明の目的のため にある程度可溶性でも不溶性でもよい。連結した分子か抗原または抗体に結合可 能であれば、支持体材料は、いかなる形状であってもよい。従って、支持体のコ ンフィギユレーション（ｃｏｎｆ　ｉｇｕｒａｔ　１ｏｎ）は、ビーズのような 球状、試験管の内面のような円筒形状、またはロッドの外面のような円筒形状の いずれでもよい。一方、支持体の表面は、シート又はテスト帯片のように平らで よい。抗体または抗原を結合するために多くの他の適当なキャリアが当業者に知 られており、またキャリアに適するか否かは普通の実験によって確かめることが できる。

所定のロフトの抗Ｈ１３抗体の結合活性は、周知の方法により判定することがで きる。各々の判定に有効かつ最適なアッセイ条件は、当業者であれば通常の実験 により決定することができる。

特定の状況下で普通に或いは必要な工程として行うような他の工程（洗浄、攪拌 、振盪、ろ過等）をアッセイに付加してもよい。

ＨＩ３に特異な抗体を検出可能にラベリングすることかできる方法の１つは、抗 体を酵素に連結し、酵素イミューノアッセイ（ＥＲＡ）で使用するものである。

この酵素は、後で適当な基質にさらされると基質と反応して、分校光度法、蛍光 定量法又は視覚手段によって検出可能な化学的成分を生成する。抗体に検出可能 にラベリングするために使用することができる酵素としては、リンゴ酸脱水素酵 素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、イーストアル コール脱水素酵素、α−グリセリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸塩イノメラ ーゼ、ホースラディシュパーオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、アス パラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレア ーゼ、ウニアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェート脱水素酵素、グ ルコアミラーゼ、アセチルコリンエストラーゼ等があげられるが、これらに限定 されない。検知は、酵素の色素生産性な基質を使用する比色分析法で行うことか できる。検知はまた、基質の酵素反応の程度を同様に作ったスタンダードと視覚 的に比較することによっても、行うことができる。

種々の他の免疫アッセイを使って、検知を行うことができる。例えば、抗体また はそのフラグメントに放射能的にラベリングすることによって、ＨＩ３蛋白質を ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により検出することができる。ＲＴＡは、Ｗｏ ｒｋ、　Ｔ、Ｓ、、　ｅｔ　ａｌ、、”　Ｉ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｔｅｃｈｎ ｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　。

Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏ１ｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ　（１９７Ｂ）（こお１するｒ　Ａｎ　Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　 ｔｏ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ　Ａｓ５ａｙ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓＪ　、　Ｔ、　Ｃｈａｒｄの章に良く説明されている。この文献 は本明細書に参照として合体する。放射性子イソトーブは、ガンマカウンター、 液体のシンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィのような手段に よって、検出することかできる。

抗体に螢光化合物をラベリングすることもできる。螢光ラベルした抗体を適当な 波長の光に曝すと、蛍光によりその存在を検出することができる。最も一般的に 使用される螢光ラベリング化合物は、フロオレセインイソチオソアネート、ロー ダミン、フィコエリトリン、フィコンアニン、アロフィコシアニン、０−フタル アルデヒド及びフルオレサミン等である。

抗体はまた、蛍光発光性金属（例えば、１ｓ２Ｅ、その他のランタニド系列金属 ）を使って、検出可能にラベリングすることができる。これらの金属は、ジエチ レントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の ような金属キレート化基を使用して、抗体に付加することができる。

抗体はまた、化学ルミネセント化合物に結合させることによって検出可能にラベ リングすることができる。化学ルミネセント標識抗体か存在するか否かは、化学 的反応の過程で生ずるルミネセンスを検出することによって判定する。特に有用 な化学ルミネセントラベリング化合物の例は、ルミオール、イソルミオール、　 ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃａｃｒｉｄｉｎｉｕｍエステル、イミダゾール、アクリジ ン塩及びシュウ酸エステル等である。

同様に、本発明の抗体をラベリングするために生物発光化合物を使用することが できる。生物発光は、触媒作用を存する蛋白質により化学発光反応の効率か増大 する生物系に見られる種類の化学発光である。生物発光蛋白質か存在するか否か は、ルミネセンスを検出することによって決定する。ラベリングの目的で重要な 生物発光化合物は、ロシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。

本発明の抗体分子は、イムノメトリックなアッセイ（［二位置Ｊ　（ｔｗｏ　５ ｉｔｅ）又は「サンドインチ」アッセイとしでも知られている）に使用するのに 適する。典型的なイムノメトリックなアッセイにおいては、大量のラベリングさ れていない抗体（又はそのフラグメント）を固体の支持体に結合させ、大量の検 出可能にラベリングされた可溶性抗体を添加し、固相抗体、抗原及びラベリング した抗体により生成した３元系複合体の検知及びその定量をする。

典型的なかつ好ましいイムノメトリックなアッセイは、同相に結合した抗体をま ずテストする試料と接触させて、２元系固相抗体−抗原複合体の形成によって試 料から抗原をＵ抽出する）ｒ順方向のｊアッセイを含む。適当なインキュベーシ ョン期間の後に、流動性試料の残基（場合によっては未反応抗原を含有する）を 除去するために固体支持体を洗浄し、次いで未知量のラベリングした抗体（「リ ポータ−分子Ｊとして作用）を含有する溶液と接触させる。ラベリングされてい ない抗体を介して固体支持体に結合した抗原とラベリングした抗体とか複合体を 形成するための２回目のインキュベーション期間の後に、固体支持体を再び洗浄 し、未反応のラベリングｊ、た抗体を除去する。

本発明の抗原に対して有用となり得る別の種類の「サンドイッチ」アッセイにお いては、いわゆる「同時の」および［逆のＪアッセイを使用する。同時アッセイ では、固体支持体に結合した抗体及びラベリングした抗体をテストする試料に同 時に付加するので、単一のインキュベーション工程があるだけである。インキュ ベーションか完了した１麦、固体支持体を洗浄して、流動性試料及び複合化して いないラベリングされた抗体の残基を除去する。次いで固体支持体に結合したラ ベリングした抗体の存在を従来の［順方向の１サンドイツチアツセイと同様に、 決定する。

［逆Ｊ了ツセイにおいては、ラベリングした抗体の溶液を流動性試料にまず段階 的に添加し、次いで適当なインキュベーション期間の終了後に固体支持体に結合 したラベリングしていない抗体を添加する。第二のインキュベーションの後に、 固相を従来の方法で洗浄して、テストする試料の残基及び未反応のラベリングさ れた抗体の溶液を除去する。次いで「同時の」又は「順方向の」アッセイと同様 にして、固体支持体に結合したラベリングした抗体を判定する。

本発明によると、被験者内を循環する抗体（８１３蛋白質に対して特異）を診断 することができる。これは、本発明の蛋白質又はその機能的誘導体を使って、丑 記イミューノアッセイにより行うことができる。

同様の原則に基づいて、レトロウィルスは検出可能な親和性を有する細胞レセプ ターに結合するので、Ｈ１３蛋白質又はその機能的誘導体をリガン１−とじて使 い、生物学的試料中の［（Ｉ３に結合できるヒトレトロウィルスの存在を検出す ることができる。このようなアッセイにおいては、イミューノアッセイと同様に 、蛋白質又はその機能的誘導体を非可溶性支持体又はキャリアに結合することが できる。次いでレトロウィルスを存すると思われる生物学的試料（例えば血清） を８１３含有支持体に接触させ、ウィルスをそのレセプター材料に結合させる。

結合したウィルスの存在は、多くの周知の方法のいずれか、例えば、ウィルスに 特異な検出可能にラベリングした抗体を添加する方法により、判定する。ＨＩ　 ３蛋白質に対して親和性を有するウィルスの蛋白質または糖蛋白質のようなウィ ルス成分が生物学的試料中に存在するのを検出するために、同じアッセイを使用 することかできる。一方、ウィルス又はその蛋白質は、Ｈｌ　３分子のウィルス 結合部分に対して特異な抗体を用いる競争アッセイ１こおいて、ラベリングし測 定することができる。

本明細書に使用しているように、感染の「防止」とは、臨床的な発病の前にＨｌ 　３の蛋白質、ペプチド誘導体又は抗体（上記参照）を投与することを意味する 。従って、例えばレトロウィルスとの最初の接触の前に製剤を投与することによ り、病気の「防止ｊをすることができる。投与はウィルスとの最初の接触の後で もよいが、実際の発病より前に行わなければならない。

［治療Ｊとしては、臨床的な発病の後に保護製剤を投与することが挙げられる。

例えば、病気の治療の例として、レトロウィルスの感染の後に本発明のＨ１３の 蛋白質又はペプチドまたはＨＩ３抗体を投与することにより、ウィルスの広がり を遅延化又は抑制することが挙げられる。

本発明のＨＩ３の蛋白質、ペプチドまたは抗体は、例えば局所的な感染を治療す るか、あるいはこのような感染を有するか又は敏感な被験者の全身感染を治療す るために、所期の目的を達成する任意の手段により投与することができる。例え ば、免疫を抑制された個体は、レトロウィルスの感染および病気に対して特に感 受性がある例えば、皮下投与、静脈投与、陵内投与、筋肉内投与、ｌｌＩ腔内投 与、鼻腔内投与、頭蓋内投与、皮下投与、舌下投与等の種々の非経口投与により 、投与を行うことができる。それとは別に又は同時に、経口投与をし、でもよい 。非経口投与は、ポーラス注入またはゆるやかな環流により行うことができる。

本発明の製剤を使う追加的な態様は、局所的な塗布である。この投与方法は、あ る種のレトロウィルス感染の治療において特に重要である。本発明の蛋白質、ペ プチド及び製剤は、軟膏のように局所的に塗布するビヒクル（皮膚に適合すると ともに活性成分を患部に直接投与する手段となる）に含有させることができる。

活性成分のキャリアは、スプレー可能な形態又はスプレーできない形態のいずれ でもよい。スプレーできない形態は、局所的な塗布の助けになるキャリアを含有 し、好ましくは水より大きな動的粘度を有する半固形状又は固形状である。適当 な態様は、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉末、リニメント等 であるが、これらに限定されない。必要に応じて、これらを殺菌したり、補助剤 （防腐剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、又は浸透圧等に影響を与える塩等）と混 合してもよい。非スプレー性の局所的な塗布製剤に好ましいビヒクルは、ポリエ チレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００’）のような軟膏の基剤、ＨＥ Ｂクリームのような従来のクリーム、ジェル、石油系ゼリー等を含有する。

全身的又は局所的な投与（特に粘液膜や肺に対して）に適するのは、スプレー可 能なエアロゾル製剤（好ましくは活性成分は固体状又は液体状の不活性キャリア 材料と混合されている）である。エアロゾル製剤は、本発明の蛋白質又はペプチ ドの他に、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、芳香剤、酸化防止剤等を含有してもよい 。エアロゾル投与用に、本発明の活性成分をスクイーズボトル又は適当な弁及び 作動系を有する加圧容器に充填してもよい。作動又は服用の間に再充填する弁室 とともに、計量弁を使用するのが好ましいか、これらはいずれも当業界において 周知である。

局所的塗布のために、本発明の化合物の有効量を患部（例えば、皮膚の表面、粘 膜等）に投与するのか好ましい。１回の塗布量は、一般に（ａ）治療する面積に より、（ｂ）予防的使用か治療的使用かにより、（Ｃ）症状の烈しさにより、ま た（ｄ）使用する局所的ビヒクルの性質により、約０．００１　ｍｇから約１　 ｇまで変化する。好ましい局所的製剤は、基剤（好ましくはＰＥＧ−１０００で ある）ｌｃＣ当たり約０．０１　ｍｇ〜約５０ｍｇの活性成分を使用する軟膏で ある。

レトロウィルス感染を防止、抑制又は治療する典型的な方法は、１日又は数日乃 至１週間又は約６か月までの期間にわたって有効量の０１３蛋白質又はその機能 的誘導体を投与することである。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏて又はｉｎ　ｖｉｖｏて１回に投与する量は、年齢、性別、健 康状態、摂取者の体重、同時に治療を行う場合その種類及びその頻度、及び所望 する効果の性質等に依存する。以下に示す効果的投与量の範囲は限定的ではなく 、好ましい投与量の範囲を示すものである。しかし当業者により容易に理解され るように、最も好ましい１回の投与量は、個々の被験者に合わせて決める。

各々の治療に必要とされる全投与量は、１回で又は複数回に分けて投与すること ができる。蛋白質又はその機能的誘導体、又は抗体は、単独で又は他のウィルス 感染用の治療薬あるいはウィルス病の他の症状に対する治療薬とともに投与する ことができる。

Ｈ１３蛋白質又はその機能的誘導体、又は抗体の有効量は、体重１ｋｇ当たり、 約ｏ、ｏｌμｇ〜約１００　ｍｇテあり、好ましくは約１０μｇ〜約５０ｍｇで ある。

一実施例においては、全身的又は子宮内投与により、本発明のペプチドをレトロ ウィルス感染を有すると思われる妊婦に投与する。この治療は、例えばＨＩＶの 広がりから胎児を守ることを目的とする。一方、本発明の製剤は、膣内に存在す るかもしれない伝染性レトロウィルスから新生児を守るために、出産中に膣内に 投与することもてきる。

非経口投与用製剤は、殺菌した水性又は非水性の溶液、懸濁液、及びエマルジョ ンを含み、これらは当業界において公知の補助剤又は賦形剤を含有してもよい。

タブレットやカプセルのような製剤も普通の方法により調製することができる。

本発明の蛋白質、ペプチド又は抗体を含有する製剤は、所期の目的を達成するの に効果的な量の蛋白質、ペプチド又は抗体を含有する全ての組成物を包含する。

さらに、製剤は、医薬用に許容しえる適当なキャリア（例えば賦形剤、及び調剤 」ニ使用できる製剤中の活性化合物の処理を容易にする補助剤）を含有してもよ い。

製剤はまた注射又は経口投与に適する溶液でもよく、これは、賦形剤とともに約 ０．０１〜９９％、好ましくは約２０〜７５％の活性成分（すなわちＨ１３蛋白 質又は抗体）を含有する。経口投与用の製剤の例としては、タブレノ１−及びカ プセルが挙げられる。直腸に投与することができる製剤の例としては、座薬か挙 げられる。

本発明は、被験者中の正常又は突然変異のＨ１３蛋白質又はｍＲＮＡの存在及び レベルを評価する方法を提供する。個体中にＨＩ３遺伝子が存在しないことある いはより典型的には僅かしか発現しないこと、又は突然変異Ｆ（１３の存在を知 ることにより、レトロウィルス感染に対する抵抗力、従ってＡＩＤＳ又はある種 の白血病又は他のしｌ・ロウイルスを介した病気に対する抵抗力を予測すること かできる。一方、Ｈｌ　３の過剰な発現により、レトロウィルス感染に対する感 受性が高くなっていることを予測することかできる。

さらにＥＲＲまたはＨｌ　３のｍＲＮＡの発現はウィルスにより引き起こされた 腫瘍細胞系で増えるので、ｍＲＮＡ又はレセプター蛋白質の発現のレベルは、そ れ以外に検知不能なウィルス感染を知る有用な尺度となる。従って、本発明は、 ８１３ｍのＲＮＡ　（以下参照）又は蛋白質（上記のとおりイミューノアノセイ を使用）を測定する手段を提供することによって、被験者においてヒトのしトロ ウィルスにより感染したかトランスフオームされた細胞を検出する手段を提供す る。

被験者の細胞中に■］１３のＤＮＡ又はｍＲＮＡが存在するか否かをテストする ために、ＨＩ３のＤＮＡ配列の種々の部分をエンコードするオリゴヌクレオチド プローブを使用する。好ましいプローブは、Ｈ１３１００少くとも１２個、好ま しくは少なくとも１５個のヌクレオチドをエンコードする核酸配列を検知するも のである。このようなプローブを使って、定性的又は定量的なアッセイを行うこ とかできる。例えば、細胞または組織の製剤中に８１３ｍＲＮＡの発現を測定す るために、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　）分析法（以下参照）を使用する。

二のような方法は、個体から得た非常に少量のＤＮＡを用い、次いて選択的な増 大法を用いて、行うことができる。精製した核酸フラグメントを増量することが できる組換えＤＮＡ方法は以前から知られている。典型的にはこのような方法は 、ＤＮＡ又はＲＮＡのベクターに核酸フラグメントを導入し、ベクターをクロー ンにより増量し、次いて増量した核酸フラグメントを回収することからなる。こ のような方法の例は、Ｃｏｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、米国特許４．２３７．２２４ 号、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ、　（同上）に記載されている。

最近、このような所望の核酸分子の濃度を向上することかできるｉｎ　ｖｉｔｒ ｏの酵素法が公表された。この方法は、「重合酵素連鎖反応」またはｒ　Ｐ　Ｃ ＲＪ　（Ｍｕｌｌｉｓ、　Ｒ。

ｅｔ　ａｌ、、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　０ｕａｎ ｔ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｌ、２６３−２７３　（１９８６）　；　Ｅｒ１ｉｃｈ　 Ｈ，ｅｔ　ａｔ、、ヨーａ−，パ特許５０゜４２４号、同８４．７９６号、同２ ５８．０１７号、同２３７．３６２号、Ｍｕｌｌｉｓに、。ヨーロッパ特許２０ １．１８４号、Ｍｕｌｌｉｓ　Ｋ、　ｅｔａｔ、、米国特許４．６８３．２０２ 号、Ｅｒ１ｉｃｈ　ｔ（、、米国特許４，５８２、７８８号、５ａｉｋｉ　Ｒ， ｅｔ　ａｌ、、米国特許４．６８３．１９４号）と呼ばれる。

重合酵素連鎖反応により、特定の核酸配列が予め精製されておらず、特定の試料 中の単一のコピーにだけ存在する場合でも、その特定の核酸配列の濃度を選択的 に増やす方法が得られる。この方法は、−重螺旋又は二重螺旋のＤＮＡを増幅す るのに使うことができる。この方法の要点は、テンプレートに依存せずに重合酵 素を介して所望の核酸分子を復製するプライマーとして作用する２つのオリゴヌ クレオチドプローブを使用することであるＰＣＲ法の２つのオリゴヌクレオチド プローブの正確な性質は、二の方法を成功させるのに重要である。周知のように 、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子は、分子のホスフェート基の５′−３“結合により与 えられる指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を有する。ＤＮＡ又はＲＮＡ の配列は、第１の配列の末端５　ホスフェ　ｈ基と第２の配列の末端３゛水酸基 どの間にホスホジエステル結合を形成することにより、連結される。重合酵素に 依存する核酸分子の増幅は、核酸分子の末端３°水酸基に５°ヌクレオチドトリ ホスフｆｆ−−１−を付加することによって進行する。従って、重合酵素の作用 により、核酸分子の末端３°基か延びる。

これらの同作の特性は、ＰＣＲのオリゴヌクレオチドプローブを選択するときに 利用する。増幅を望む特定の核酸配列を挟む配列と同−又は相補的な配列を含有 するように、ＰＣＲ方法のプローブのオリゴヌクレオチド配列を選ぶ。

特に、「第一」のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、所望の配列の３′に位 置するオリゴヌクレオチド配列にハイブリッド化することができるように、選ぶ 。一方、「第二」のプローブのオリゴヌクレオチド配列は、所望の領域に対して ５′の位置にある配列と同じオリゴヌクレオチド配列を含有するように、選ぶ。

両プローブとも３゛水酸基を存するので、核酸合成のためにプライマーとして作 用することができる。

ＰＣＲにおいて、ハイプリデイゼーソヨンおよび核酸重合用の条件と、二重鎖分 子の変性を生じさせる条件との間で、反応条件をくり返す。反応の最初の工程で 、存在しえるいかなる二重螺旋の分子も変成するために、試料の核酸を一時的に 加熱し、次いで冷却する。「第一１及び「第２」のプローブを次いで所望の核酸 分子より非常に高い濃度で試料に添加する。ハイブリデイゼーションおよび重合 用の条件下で試料をインキュベートするとき、第一のプローブは、増幅すべき配 列に対して３°の位置において試料の核酸分子にノ）イブリッド化する。試料の 核酸分子が最初に二重螺旋であった場合、２番目のプローブは、増幅が望まれる 配列の補体である配列に対して３゛の位置において、核酸分子の相補的なストラ ンドにハイブリッド化する。重合酵素を添加すると、第一のプローブ及び（核酸 分子が二重螺旋の場合）第２のプローブの３°末端は伸びる。第一のプローブの 延長により、所望の核酸の正確な配列を有するオリゴヌクレオチドか合成される 。２番目のプローブの延長により、所望の核酸の補体の正確な配列を有するすり ゴヌクレオチドか合成される。

第一のプローブの延長生成物は必然的に第二のプローブの配列に相補的な配列を 含有し、従って第二のプローブの延長生成物を生成するためのテンプレートとし て作用することかできるので、ＰＣＲ反応は、特異な核酸配列の指数関数的な増 幅をすることができる。同様に、２番目のプローブの延長生成物は必然的に第一 のプローブの配列に相補的な配列を含有し、従って第一のプローブの延長生成物 を生成するためのテンプレートとして作用することかできる。従って、重合及び 変性のサイクルを行うことによって、所望の核酸分子の濃度の幾何学的増加を達 成することかできる。ＰＣＲの説明は、Ｍｕｆｔｉｓ。

Ｋ、Ｂ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｖｍｐ、　０ｕａｎｔ、 　Ｂｉｏｌ、　５１．２６３−２７３　（＋９８６）　：　５ａｉｋｉ、　Ｒ， に、、ｅｔ　ａｔ、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

３、１００８−１０１２　（１９８５）　：およびＭｕｌｌｉｓ、　Ｋ、Ｂ、、 ｅｔ　ａｌ。

、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５５．３３５−３５０　（＋９８７） にある。

以上本発明を一般的に説明したが、以下の実施例を参照すればさらに容易に本発 明を理解することかできる。

しかしなから、本発明の範囲は実施例により限定するも以下の研究に次の細胞系 を使用した。

ｉｌｌ　ＣＣ１，＋２０　（ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬＩ２０）　、ヒトのＢ　＋ｙｍ ｐｈｏｂ＋ａｓｔｏｉｄ細胞系。

＋２１　ＣＣＬｌ１９　（ＣＥＭ　５ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬｌ１９　）　、ヒトの Ｔ　ｌｙｍｐｈ。

ｂｌａｓｔｏｉｄ細胞系。

（３ｉ　５ｕｐＴｌ　、ヒトのｎｏｎ−ＨｏｄｇｋｉｎＴ　ｌｙｍｐｈｏｍａ細 胞系。

＋４１　Ｈ９、ＨＵＴ７８から得た単一の細胞クローンで、ヒトの皮膚Ｔ細胞１ ｙｍｐｈｏｍａ細胞系。

＋５１　ＭＯ！、Ｔ４　（ＡＴＣＣ＃　ＣＲＬＩ５８２　）　、ヒトの急性リン パ芽白血病細胞系。

＋６１　８Ｏ３（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５４３）　、ヒトの骨肉腫細胞系。

（７１Ｈｅ　ｌ、ａ　（ＡＴＣＣ＃　ＣＣｌ２）　、ヒトの上皮様ガン細胞系。

＋８１　Ｃｌ−１０−Ｋｌ　（ＡＴＣＣ＃６１　）、チャイニーズハムスターの 卵巣細胞系。

＋９１　ＢＩＯＴ６Ｒ，ＢＩＯ，Ｔ　（６Ｒ）のマウスの放射線誘起胸腺腫α０ １　ＲＬ１２、Ｃ５７ＢＬ／６Ｋａマウスの放射線誘起胸腺腫。

スクリーニング ヒトのＣＥＭ及びＩ！ＵＴ　７８　Ｔ−ｃｅｌｌのｃＤＮＡライブラリー　（ｌ ａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ）を、クロンチック・ラボラトリーズ・インク（カリフォ ルニア州、パロ・アルド）から得た。

ヒトのリンパ球Ｃｏ５ｍ１ｄライブラリーを、ストラタジーン（カリフォルニア 州、ラジョーラ）から得た。これらのライブラリーは、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｌ、の方法（ＭａｎｉａｔｉｓＴ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ、１５．８ ８７−７０１　（１９７８））でスクリーニングした。ＥＲＲのｃＤＮＡの全開 放読取り枠を含有するＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲ１フラグメントは、アルブリットン 博士及びカニンハム博士（マサチューセッツ州、ボストンのバーバート・メディ カル・スクール）より得た。このＤＮＡはニック翻訳により約２　ｘ　Ｉ　Ｏ” 　ｃｐｍ／μｇの特異活性を有するように３２Ｐでラベリングし、ハイブリディ ゼータ９ン・プローブとして使用した。

サザンプロット分析 Ｂ１１ｎ、　Ｎ、ｅｔ　ａｌ、　（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　３． ２３０３−２３０８　（＋９７６））が記載したようにして、比較的大量のＤＮ Ａを細胞から調製し、パムペノ及びメルエロ（Ｐａｍｐｅｎｏ、　Ｃ，Ｌ。

ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５８．２９６−３０６　（１９８６）） によって修正した。制限エンドヌクレアーゼ消化、アガロースゲル電気泳動法、 ニトロセルロースへのトランスファー（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅ ｌｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｋｅｅｎｅ、−：Ｌ　−／Ｎ　ンブシャー州）、ハイブリ ディゼーション及び洗浄は、Ｐａｍｐｅｎｏ、　Ｃ。

Ｌ、ｅｔ　ａｌ、（同上）、及びＢｒｏｗｎ、　Ｇ、　Ｄ、　ｅｔ　ａｌ、、　 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　２７．２３９−２５１　（＋９８８）に記載 の通りにした。

ノザンプロット分析 全細胞質ＲＮＡを、酸グアニジニウム・チオシアネート−フェノール−クロロホ ルム法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、　Ｐ、　ｅｔａｔ、、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｍ、、　１６２．１５６−１５９　（＋９８７））で細胞から単離した。

ＤＮＡを、１％のホルムアルデヒド・アガロース・ゲルの中で電気泳動させ、ニ ドラン（Ｎｙｔｒａｎ）フィルターにトランスファージた（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ ｒ　＆　５ｃｈｕｅＩｔ、Ｉｎｃ、、　Ｋｅｅｎｅ、　Ｎｅｗ　Ｉｌａｍｐｓｈ ｉｒｅ）　ｏ　ハイブリディゼーション及び洗浄は、Ａｍａｒｉ、　Ｎ、　Ｍ、 　Ｂ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１、　Ｂｉｏｌ、、　７．４１５９ −４１６８　（１９８７）の方法により行った。

ＤＮＡ塩基配列の分析 陽性のファージからのｃＤＮＡクローンを、プラズミソドベクターｐＢｌｕｅｓ ｃｒｉｐｔ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲ１部位に再クローニングした 。プラスミドの一方向除去をエキソヌクレアーゼＩＩ＋およびＳｌ　ヌクレアー ゼを用いることによって行ない、そしてシーケンナーゼ試薬（５ｅｑｕｅｎａｓ ｅ　ｒｅａｇｅｎｔｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、米国オハイオ 州クリーブランド）を用い、チェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒ、　Ｆ、 　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ、　７４：５４６３−５４６７　（１９７７））によってを配列決定を行な った。部分消化コスミドＤＮＡを検出するために、すでにほかで記載されている ように（Ｅｖａｎｓ、　Ｇ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏ ｌ、、　１５２：　６０４−６１０　（１９８７））　、Ｔ３またはＴ７プロモ ーター特異なオリゴヌクレオチドを用いて、陽性のコスミドインサートの制限地 図を決定した。ニスミド中のＢＣａＲｌ−ＥｃｏＲｒまたはＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄｌｌ！フラグメントを、　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ又は　ＰＳｐｏｒｔ　Ｉ　 （ＧＩＢＣＯＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）にサブクローニン グし、プライマーとして合成オリゴヌクレオチドを用いて、エキランとエキソン ーイントロン連結の配列を決定した。配列の編集と分析は、ジェネティックス社 のコンピューターグループの遺伝子塩基配列分析ソフトウェアパッケージ（Ｄｅ ｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：　３Ｂ？−３９５（１９８４））を 用いて行なった。

実施例Ｉ＋ ＨＩ３のＤＮＡおよび予想蛋白質配列 コーディング配列の５°及び３°末端の非コード配列を含む完全なＨＩ３ヌクレ オチド配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア）をＩＦＩに示す。この配列は、もともと クローン７−２（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１）から得た部分配列を含むが、当初はＳ ＥＱ　ＩＤ　Ｎ０！のヌクレオチド１−６および＋０９９−１１０２が間違って 決定されていた。図１は、ヌクレオチド配列（ＳＥＱ　１０　Ｎ０８）から予想 された完全なアミノ酸配列を示している。

この配列は、当初記載されたＮ末端基Ｐｒｏ−ＧｌｙとＣ末端基Ｐｒｏを除いた 部分アミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を含むが、これも当初間違ってヌ クレオチド配列から予想されていた。

Ｉ（１３、ＥＲＲ及びＴＥＡの間のヌクレオチド配列の比較を図２に示し、そし てアミノ酸配列の比較を図３に示す。

比較した配列の間には非常に高い相同性があり、例えば、ＨＩ　３どＥＲＲのＤ ＮＡの間に８７．６％の相同があり、Ｈｌ　３とＴＥＡアミノ酸との間に５２． ３％の相同かあるヒト細胞中のＨＩ３遺伝子の存在および発現種々の種の細胞か ら取り出されたされたＤＮＡのサブん分析（５ｏｕｔｈｅｒｎ　ａｎａｌｙｓｉ ｓ　）によって、ＥＲＲのｃＤＮΔＤＮＡブ（図４）及びＨＩ　３のｃＤＮＡ（ 図５）とハイブリッド化できるＤＮＡが、ＣＣＬ１２０、　ＣＣＬ１２０．５ｕ ｐＴ１　、Ｉｔ−９およびＭＯＬＴ−４を含む５種類のヒト細胞系の細胞と、ハ ムスター細胞（ＣＨＯ−Ｋｌ）およびとマウスの細胞（正常なりａｌｂ／ｃマウ ス胸線細胞胸腺中に存在することかわかった。ＨＩ３遺伝子の発現は、）（Ｉ　 ３のｃＤＮＡプローブを用いてノーザン分析（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　ａｎａｌｙｓ ｉｓ）て試験した。プローブは、１ＩｅＬａ　、　５ｕｐＴ１　、　ＮＯ３とＣ ＣＬ１１９細胞から得たＲＮＡにおけるおよそ９ｋｂの転写を検出した（図６） 。このＲＮＡはまたマウスのＥＲＲのｃＤＮＡプローブを用いて検出された（図 ７）。

実施例ＩＶ ハムスター細胞へのマウスレトロウィルスレセプターのｃＤＮＡのトランスフェ クション マウス環境栄養性レトロウィルスに感染することがないハムスターＣＩ（０細胞 に、燐酸カルシウムを用いて、選択可能なマーカーブラズミッドＤＮＡＰ（ｐＳ Ｖ２Ｎｅｏ）と共にマウスレトロウィルスレセプター（ＥＲＲ）のｃＤＮＡをト ランスフェクションした（Ｗｉｇｌｅｒ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｅ１ｌ　 １４・７２５−７３１　（１９７８））。そしてレセプター遺伝子を発現するト ランスフェクタントか、マウスの放射線白血病ウィルス（ＲａｄＬＶ）によって 感染した。感染の二週間後に、上清の逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定した（Ｓｔ ｅｐｈｅｎｓｏｎ、　Ｊ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　４８：　７ ４９−７５６　（１９７２））。モしてＲＮＡを調製した後のウィルスプローブ を用いて、ノーザンプロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ）分析を行なった。

図８に示すように、レセプター遺伝子を発現しない未感染のＣ］（０細胞で検出 されたＲＴ活性は、組織培地（バックグランド）の活性と差かなかった。これは 細胞がＭｕＬＶによって感染しなかったことを意味する。

ＥＲＲのｃＤＮＡを用いたトランスフェクションによって、トランスフェクショ ンされた細胞上清のＲＴ活性は、バックグランドより著しく大きかった（図８） 。

ＭｕＬＶウィルスプローブは、トランスフェクタントから作られたＲＮＡにおけ る転写を検出したが、トランスフェクションしなかったＣＨＯ細胞では転写が検 出されなかっだ。これは、ＥＲＲのｃＤＮＡを用いてトランスフェクトされた細 胞が環境栄養性マウスの白血病ウィルスに対する感受性を獲得することができる ことを示している図９に示すように、予想蛋白質が非常に疎水性であるため、す べての予想蛋白質（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）を有するＨＩ３含有融合蛋白質を 生成することは非常に困難である　、。それゆえ、蛋白質に存在する抗原性エピ トープを予想するために、ＰＥＰＴＩＤＥＳＴＲＵＣＴＵＲＥというプログラム を用いてコンピューター分析を行なった（Ｊａｍｅｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃ ＡＢＩＯ３４：　１８１−１８６　（１９８８））。図１ＯはＨＩ３蛋白質配列 の抗原性プロフィールを示す。

高い抗原性を有する部分（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２　（アミノ酸残基３０９−３ ６７）　）をエンコードするＤＮＡ配列は、制限酵素ＡｃｃｌおよびＥｃｏＲｌ て切断し、　１８０　ｂｐのＡｃｃｌ−ＥｃｏＲ１フラグメントを生成すること によって調製されていた。ＨＩ３のｃＤＮＡのこのフラグメントが、読み取り枠 （Ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅｓ　）の発現を許容するために、グル タチオン−５−トランスファラーゼ（ＧＳＴ）と共に融合蛋白質として抗原を発 現することがてきるｐＧＥＸ−２Ｔプラスミドベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　 ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のクローニング部位に結合する（軸重り 、　Ｄ、Ｂ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｇｅｎｅ、　６７：３１−４０　（１９８８） ）。

培養液にイソプロピル−β−がラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することに よって、融合蛋白質を誘導し、グルタチオンセファ０−ズ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏ ｎｅ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂクロマトグラフイー　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により精製した（図１１を参照）。精 製した融合蛋白質は、抗血清を得るために、完全フロイドアジュバントと共にウ サギに皮下および筋肉内に注射した。

抗血清がＨＩ３蛋白質とそれのエピトープ的なフラグメントに特異的に結合する のが観測された。

ヒト細胞からの膜蛋白質は、標準の技術によって調製、し、ポリアクリルアミド ゲル電気泳動法によって単離し、ウェスタンプロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ　Ｂ ｌｏｔ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）をするためにニトロセルロース上にプロットする 。ＨＩ３特異な抗体がこれらのプロット上で蛋白質と結合することか観測された 。

ヒト−ハムスタ一体細胞ハイブリッドのパネルからのＤＮＡを含有する染色体プ ロット　（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｂｌｏｔｓ。

Ｂｉｏｓ　Ｃａｒｐ、、　Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ、　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ）を 用いて、ＨＩ３遺伝子の染色体の位置を決定した（Ｋｏｕｒｉ、　Ｒ，Ｅ、　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ、　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、　５１：　１０ ２５　（１９８９））　、ヒト−ハムスターハイブリッド細胞に残されたヒト染 色体と８１３のｃＤＮＡの発現とを比較することにより、ＨＩ３遺伝子をヒト染 色体１３にマツプしく図１２を参照）。染色体１３に関連するヒト遺伝子（また その中に突然変異によって引き起こす病気）には以下のものがある：網膜芽細胞 腫、骨肉腫、ウィルソン病、Ｌｅｔｔｅｒｅｒ−Ｓｉｗｅ病、Ｄｕｂｉｎ−Ｊｏ ｈｎｓｏｎ症候群、凝血因子■自およびＸ、コラーゲンＩＶα１とα２ｉＪｌ、 Ｘ線感度、リンパ球シトシル蛋白質−１，頚動脈小体腫瘍−１、プロピオニル− ＣｏＡカルボキノラーゼ（サブユニット）等である。

マウスＥＲＲ配列とヒトＨＩ３配列との間からいくつかのキメラ分子・を生成し 、キメラｌ−キメラＩＶと命名した。特に、ＨＩ　３のｃＤＮＡの４つの領域か 、図１３に示すように共通の制限部位の利用に基づいて置換されたこれらのＤＮ Ａ配列を、ｐＳＧ５あるいはｐＣＤＭ８の発現ヘクターを用いて、一時的にチャ イニーズハムスター卵！％　（ＣＨＯ）細胞系にトランスフェクションした。

−二日後Ｅ−ＭｕＬＶ感染をサポートする能力について、これらのトランスフェ クシントを試験をした。細胞は２ＢＡＧと命名した組替えモロネイ（Ｍｏ１ｏｎ ｅｙ）　ＥＭｕＬＶに感染した（　Ｐｒ１ｃｅ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４１５６−１６０　（ ＋９８７）　）。この組替えウィルスは、選択可能なマーカーと検出可能な生成 物をもたらすβ−ガラクトノダーゼとネオマイシンホシホトランフエラーゼ（ｎ ｅｏ’）遺伝子をも含有していた。そして、口ｅｏ　’発現トランスフェクシン トを選択する濃度０．６　ｍｇ／ｍｌの抗生物質Ｇ４１８か存在する、選択的な 条件下で、細胞は成長し、２週後にたくさんのＧ４１８耐性コロニーがカウント された。

これらの結果は、本質的にＥ−ＭｕＬＶ感染のためのＥＲＲ遺伝子の部位がＮｃ ｏｌ−ＢｓｔＸＩ制限部位の範囲内で位置し、細胞外領域３に含まれていること を示す。図１３の上のラインに示す細胞りｉ領域３は、図１４で示すように、ヒ トとマウス配列の間で最も相違しているレセプター蛋白質の領域である。図１〜 ３に示した配列より由来した図１４の配列は、ジエネテイックスのコンピュータ ーグループの塩基配列分析ソフトウエアパツケ−（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ、　 ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：　３８７−３９５ 　（１９８４））を用いて整列した。

次に、オリゴヌクレオチド関連突然変異生成を用いて、細胞外領域３内に個々の アミノ酸置換基を含有するキメラ分子を生成した。これらのキメラ分子は上記の ようにしてトランスフェクトし、トランスフエクタント細胞をＥ−ＭｕＬＶによ る感染に対する感受性について、上記ように試験した。

上記研究の結果、元のアミノ酸配列をマウスのＥＲＲ蛋白質中の対応する位置か ら１〜４個のアミノ酸の間で置換することによって、ヒトの８１３分子はＥ−Ｍ ｕＬＶに結合する能力を得ることがわかる。

以上の通り本発明の詳細な説明したが、均等なパラメーター、濃度及び条件の広 い範囲において、本発明の精神及び範囲を逸脱することなしに、かつ過度の実験 なしに、本発明を実施することができることは、当業者であれば容易に理解でき る。

本発明を特定の実施例により説明したが、さらに変更することができることは容 易に理解できる。この出願は、本発明の原理に従ういかなる変更、使用又は修正 、並びに本発明が属する技術分野において公知又は通常行われる変更もカバーす る。

上記実施例の説明により本発明の一般的性質は明らかであり、現在の知識を用い れば、本発明の一般的思想を逸脱することなしに具体的実施例を容易に変更及び ／又は種々の用途に適合するようにすることかできる。従って、このような修正 及び変更は、開示された実施例の均等物の範囲内である。本明細書において使用 する用語は説明の目的で使用したものであり、本発明を制限するものではない。

シーケンスリスト （１）一般情報 （ｉ）出願者、　メルエロ　ダニエル ヨシモト　タカユキ （ｉ　ｉ）発明の名称：　ヒトレトロウィルスレセプター及びそれをコードする ＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）シーケンスの数　８ （ｉｖ）連絡住所・ （Ａ）受信人：　ブローディ・アンド・ネイマーク （Ｂ）ストリート：　４１９　セブエンスストリート、Ｎ、Ｗ。

（Ｃ）都市：　ワシントン （Ｄ）国・　米国 （Ｅ）郵便番号：　２０００４ （ｖ）コンピューター可読形式 （Ａ）媒体種類・　フロッピディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ｐｃ互換機（Ｃ）オペレティングシステム： ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３ （Ｄ）ソフトウェア。

Ｐａｔｅｎｔｌｎリリース＃１．２４ （ｖ　ｉ　）本出願データ （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願口。

（Ｃ）分類 （ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報・ （Ａ）名前：　シミュエル・リナット （Ｂ）登録番号・　３３，９４９ （Ｃ）参照／摘要番号　メルエロー１ （ＩＸ）電話通信情報。

（Ａ）を話番号：２０２　６２８−５１９７（２）ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ、ｌの情 報 （ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ　１１０２　ベースペア （Ｂ）種類　核酸 （Ｃ）ストランド・　シングル （Ｄ）配置・　線形 （１１）分子タイプ　ｃ　ＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）特色 （Ａ）名前／キー　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーション　１．．１１０２ （Ｘｌ）シーケンス記述　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１（中略） （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２の情報 （ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ　３６７　アミノ酸 （Ｂ）種類　アミノ酸 （Ｄ）配置：　線形 （ｉｉ）分子タイプ、　蛋白質 （ｘ　ｉ）ソーケンス記述・　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２（中略） （４）ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ、３の情報 （ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ：　２４２５　ベースベア （Ｂ）種類：　核酸 （Ｃ）ストランド・　シングル （Ｄ）配置・　線形 （１１）分子タイプ：　ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）特色 （Ａ）名前／キー　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーション：　１９９．．２０６４（ｘｉ）シーケンス記述：　ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、３（中略） （５）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４（７）情報（ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ、　６２２　アミノ酸 （Ｂ）種類・　アミノ酸 （Ｃ）ストランド：　シングル （Ｄ）配置・　線形 （ｉ　ｉ）分子タイプ：　蛋白質 （ｘｉ）シーケンス記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、４（中略） （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５（７）情報（ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ・　２３９７　ベースペア （Ｂ）種類：　核酸 （Ｃ）ストランド：　シングル （Ｄ）配置・　線形 （１１）分子タイプ：　ｃＤＮＡ （ｉ　ｉ　ｉ）特色・ （Ａ）名前／キー　ＣＤ５ （Ｂ）ロケーション：　４１０．．１７６８（ｘｉ）シーケンス記述：　ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ、５（中ｌ５） （７）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６の情報 （ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ：　４５３　アミノ酸 （Ｂ）種類：　アミノ酸 （Ｃ）ストランド：　シングル （Ｄ）配置二　線形 （ｉ　ｉ）分子タイプ：　蛋白質 （ｘ　ｉ）シーケンス記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６（中略） （２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７の情報 （ｉ）シーケンス特徴 （Ａ）長さ：　２１５７　ベースベア （Ｂ）種類：　核酸 （Ｃ）ストランド・　シングル （Ｄ）配置二　線形 （ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ （ｉ　１ｉ）特色。

（Ａ）名前／キー　ＣＤ５ （Ｂ）ｒ３’ｒ−ンｑン：　Ｉ　４８．．２０３４（ｘｉ）シ　’ｒンｘ記述： 　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７（中略） （２）ＳＥＱ　ＪＤ　Ｎｏ、８の情報 （］）ノーケンス特徴 （Ａ）長さ、６２９　アミノ酸 （Ｂ）種類　アミノ酸 （Ｃ）ストランド− （Ｄ）配置　線形 （１１）分子タイプ　蛋白質 （ｘ　ｉ）　’ｙ　−’ｙーンス記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ．８（以後省略） Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｄｅｄｕｃｅｄ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ　Ｓｅ ｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｒ　ＨＩ３　ｃＤＮＡｉ、ｌ、　２−ｃ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｒ　ＨＩ３．　ＥＲＲａｎｄ　ＴＥＡ　Ｄｅｄｕｃｅｄ 　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｋｂ −１−ｊ Ｖｉｒｕｓ　−＋　−＋ ｋｌ１ ５．０− ２．０− １．７− Ｍｅ辷１ｉｕｍ　２１４６ ！Ｉ　ｌ　ｚ　３　ｓｓｓ　７　ｓｔ　シｅｕ　Ｄ＋　ス　ゴ　４５１７１　ラ 　１り　Ｕ２４、キメラＨ１３／ＥＲＲキメラ蛋白質をエンコードす補正書の翻 訳文の提出書（特許法第１８４条の８）平成５年６月１４日１障１

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｈ１３蛋白質またはその機能性誘導体をエンコードするヌクレオチド配列か ら実質的になること特徴とするＤＮＡ分子。
2. ２．ヌクレオチド配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７を含有することを特徴とする請求 項１に記載のＤＮＡ分子。
3. ３．前記ＤＮＡ分子が発現ベクターであることを特徴とする請求項１に記載のＤ ＮＡ分子。
4. ４．請求項３に記載のベクターを用いてトランスフォーメーション、またはトラ ンスフェクションを行なったことを特徴とする宿主。
5. ５．前記宿主が哺乳類細胞であることを特徴とする請求項４に記載の宿主。
6. ６．人間由来の不純物を実質的に含まない蛋白質分子Ｈ１３であって、アミノ酸 配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８又はその機能性誘導体を含むことを特徴とする蛋白 質分子Ｈ１３。
7. ７．レトロウイルス感染の抑制方法において、請求項６に記載の蛋白質分子また はその誘導体の有効量に前記レトロウイルスを接触させ、もって細胞に前記ウィ ルスが付着するのを前記蛋白質分子によって防止させることにより、レトロウイ ルス感染を抑制することを特徴とする方法。
8. ８．前記ウィルスはヒト免疫不全ウィルスであることを特徴とする請求項７に記 載の方法。
9. ９．前記接触をｉｎ　ｖｉｖｏで行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
10. １０．レトロウイルス感染を防止または治療するのに有用な製剤において、請求 項６に記載の蛋白質分子又はその機能性誘導体と、薬剤上許容し得るキャリアと を含むことを特徴とする製剤。
11. １１．請求項１０に記載の組成物の有効量を投与することを特徴とする被験者に 対してレトロウイルス感染を防止または治療する方法。
12. １２．請求項６に記載の蛋白質分子またはその誘導体に特異的であることを特徴 とする抗体。
13. １３．前記抗体がモノクローナルであることを特徴とする請求項１２に記載の抗 体。
14. １４．レトロウイルス感染を防止、抑制または治療するのに有用な製剤において 、請求項１２に記載の抗体と薬剤上許容し得るキャリアとを含むことを特徴とす る製剤。
15. １５．被験者に対するレトロウイルスの感染を防止または治療する方法において 、請求項１４に記載の製剤の有効量を被験者に与えることを特徴とする方法。
16. １６．被験者に対するレトロウイルスの感染を防止または治療するのに有用なＨ １３蛋白質の合成方法において、（ａ）発現可能な形態で請求項１に記載のＤＮ Ａ分子を準備し、 （ｂ）培養液中で宿主細胞に前記ＤＮＡ分子を発現させ、もってＨ１３蛋白質を 生成し、 （ｃ）前記培養液から前記Ｈ１３蛋白質を得ることを特徴とする方法。
17. １７．請求項１６に記載の方法において、さらに（ｄ）前記Ｈ１３蛋白質を精製 する ことを特徴とする方法。
18. １８．試料中にヒトレトロウイルス、レトロウイルスの蛋白質またはそれから派 生するペプチドが存在するか否かを検出する方法において、前記レトロウイルス 、レトロウイルスの蛋白質またはそれから派生するペプチドはＨ１３蛋白質への 結合能力を有し、 （ａ）請求項６に記載のＨ１３蛋白質又は機能性誘導体の存在下で、前記レトロ ウイルス、蛋白質又はペプチドを含有すると思われる前記試料をインキュベート し、（ｂ）前記レトロウイルス、レトロウイルスの蛋白質又はレトロウイルスの ペプチドを、前記Ｈ１３蛋白質又は機能性誘導体と結合させ、 （ｃ）前記Ｈ１３蛋白質又は機能性誘導体と結合した前記レトロウイルス、レト ロウイルスの蛋白質又はレトロウイルスのペプチドを検出し、 もって前記試料中の前記レトロウイルス、レトロウイルスの蛋白質又はレトロウ イルスのペプチドの存在を検出することを特徴とする方法。
19. １９．試料中のＨ１３蛋白質エピトープに特異的な抗体の存在を検出する方法に おいて、 （ａ）請求項７に記載のＨ１３蛋白質又は機能性誘導体の存在下で前記抗体を含 有すると思われる前記試料をインキュベートし、 （ｂ）前記抗体をＨ１３蛋白質又は機能性誘導体と結合させ、 （ｃ）前記Ｈ１３蛋白質又は機能性誘導体と結合した前記抗体を検出し、 もって前記試料中の前記抗体の存在を検出することを特徴とする方法。
20. ２０．実質的に全ての生殖細胞および体細胞がＨ１３（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．８ ）又はその機能性誘導体をエンコードするＤＮＡ塩基配列を含有することを特徴 とするヒト以外の遺伝子導入哺乳動物。
21. ２１．前記ＤＮＡ分子が前記哺乳動物又は前記哺乳動物の祖先に胚の段階で導入 されていることを特徴とする請求項２０に記載の遺伝子導入哺乳動物。
22. ２２．キメラレトロウイルスのレセプター蛋白質をエンコードするＤＮＡ分子に おいて、 （ａ）第一の動物種のレトロウイルスレセプター蛋白質Ｉをエンコードする第一 のヌクレオチド配列と、（ｂ）第二の動物種のレトロウイルスのレセプター蛋白 質ＩＩをエンコードする第二のヌクレオチド配列からの十分な数のヌクレオチド であって、前記第一のヌクレオチド配列内に置換されたヌクレオチドとを含有し 、前記置換ヌクレオチドは、前記キメラレトロウイルスのレセプター蛋白質に、 レセプター蛋白質Ｉには結合しないがセプター蛋白質ＩＩには結合するレトロウ イルスと結合する能力を付与し、もって前記キメラ蛋白質が前記レトロウイルス 用のレトロウイルスレセプターとして作用できるようにすることを特徴とするＤ ＮＡ分子。
23. ２３．前記第一のヌクレオチド配列が、ヒトのＨ１３のＤＮＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ．７）のコーディング部分を含むことを特徴とする請求項２２に記載のＤＮ Ａ分子。
24. ２４．キメラＨ１３／ＥＲＲキメラ蛋白質をエンコードする請求項２に記載のＤ ＮＡ分子において、前記第二のヌクレオチド配列が、マウスのＥＲＲのＤＮＡ（ ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：３）のコーディング部分を含み、前記置換ＥＲＲヌクレオチ ドは、Ｉｌｅ２１４，Ｌｙｓ２２２，Ａｓｎ２２３，Ｓｅｒ２２５，Ａｓｎ２２ ７，Ａｓｎ２３２，Ｖａｌ２３３，Ｔｙｒ２３５，Ｇｌｕ２３７，Ｉｌｅ３１３ ，Ａｓｐ３１４，Ｇｌｙ３１９，Ｇｌｎ３２４，Ｇｌｕ３２８及びそれらの組み 合わせからなる群より選ばれたアミノ酸残基をエンコードするヌクレオチドであ ることを特徴とするＤＮＡ分子。
25. ２５．前記ＤＮＡ分子は発現ベクターであることを特徴とする請求項２２に記載 のＤＮＡ分子。
26. ２６．請求項２５に記載のベクターを用いてトランスフォーメーションまたはト ランスフェクションを行なったことを特徴とする宿主。
27. ２７．前記宿主は哺乳動物細胞であることを特徴とする請求項２６に記載の宿主 。
28. ２８．請求項２２に記載のＤＮＡ分子によってエンコードされたことを特徴とす るキメラレトロウイルスレセプター蛋白質分子。
29. ２９．請求項２３に記載のＤＮＡ分子によってエンコードされたことを特徴とす るキメラレトロウイルスレセプター蛋白質分子。
30. ３０．請求項２４に記載のＤＮＡ分子によってエンコードされたことを特徴とす るキメラレトロウイルスレセプター蛋白質分子。
31. ３１．通常種Ｉの細胞に感染することができないレトロウイルスベクターによる 感染及びレトロウイルス仲介の遺伝子導入に対して種Ｉの細胞に感受性を持たせ る方法において、 （ａ）請求項２２に記載の発現可能なＤＮＡ分子で種Ｉの細胞のトランスフォー メーションを行ない、（ｂ）培養液中で前記細胞の表面上にキメラレトロウイル スのレセプター蛋白質を発現し、 もって前記レトロウイルスベクターの感染に対して前記細胞に感受性を持たせる ことを特徴とする方法。
32. ３２．通常ヒトの細胞に感染することができないレトロウイルスベクターによる 感染及びレトロウイルス仲介の遺伝子導入に対してヒトの細胞に感受性を持たせ る方法において、 （ａ）請求項２３に記載の発現可能なＤＮＡ分子でヒトの細胞をトランスフォー メーションし、 （ｂ）培養液中で前記ヒトの細胞の表面上にキメラレトロウイルスのレセプター 蛋白質を発現し、もって前記レトロウイルスベクターによる感染及びレトロウイ ルス仲介による遺伝子の導入に対してヒトの細胞に感受性を持たせることを特徴 とする方法。
33. ３３．ヒトの細胞に感染することができない環境栄養性マウス白血病ウイルスベ クターによる感染及びレトロウイルス仲介の遺伝子導入に対してヒトの細胞に感 受性を持たせる方法において、 （ａ）請求項２４に記載の発現可能なＤＮＡ分子でヒトの細胞をトランスフォー メーションし、 （ｂ）培養液中で前記ヒトの細胞の表面上にキメラＨ１３／ＥＲＲレトロウイル スのレセプター蛋白質を発現し、もって前記環境栄養性マウスの白血病ウイルス ベクターによる感染に対してヒトの細胞に感受性を持たせることを特徴とする方 法。
34. ３４．遺伝子治療に用いる種Ｉの細胞に遺伝子を導入する方法において、 （ａ）前記導入遺伝子を受容する細胞を培養し、（ｂ）請求項２２に記載のＤＮ Ａ分子で前記細胞をトランスフォーメーションし、もって前記細胞にキメラレト ロウイルスのレセプター蛋白質を付与し、 （ｃ）通常種Ｉの細胞に感染することのできないレトロウイルスベクターを前記 細胞に感染させ、前記細胞に感染できる前記レトロウイルスは前記キメラレセプ ターを発現し、さらに前記レトロウイルスベクターは導入すべき遺伝子を運び、 （ｄ）前記レトロウイルスベクターによって運ばれた遺伝子を前記細胞で発現さ せ、もって前記遺伝子を導入することを特徴とする方法。
35. ３５．遺伝子治療に用いるヒトの細胞に遺伝子を導入する方法において、 （ａ）前記導入遺伝子を受容するヒト細胞を培養し、（ｂ）請求項２３に記載の ＤＮＡ分子で前記細胞をトランスフォーメーションし、もって前記細胞にキメラ レトロウイルスのレセプター蛋白質を付与し、 （ｃ）通常はヒトの細胞に感染することのできないレトロウイルスベクターに対 して前記細胞を感染させ、前記ヒトの細胞に感染することのできる前記レトロウ イルスベクターは前記キメラレセプターを発現し、さらに前記レトロウイルスベ クターは導入すべき遺伝子を運び、（ｄ）前記レトロウイルスベクターによって 運んだ遺伝子を前記ヒトの細胞で発現させることを特徴とする方法。
36. ３６．遺伝子治療に用いるヒトの細胞に遺伝子を導入する方法において、 （ａ）前記導入遺伝子を受容するヒト細胞を培養し、（ｂ）請求項２４に記載の ＤＮＡ分子で前記細胞をトランスフォーメーションし、もって前記細胞にＨ１３ ／ＥＲＲキメラレトロウイルスのレセプター蛋白質を付与し、（ｃ）通常はヒト の細胞に感染することのできない環境栄養性マウスのレトロウイルスベクターに 対して前記細胞を感染させ、前記ヒトの細胞に感染することのできる前記レトロ ウイルスベクターは前記Ｈ１３／ＥＲＲキメラレセプターを発現し、さらに前記 レトロウイルスベクターは導入すべき遺伝子を運び、 （ｄ）前記レトロウイルスベクターによって運んだ遺伝子を前記ヒトの細胞で発 現させることを特徴とする方法。