JPH05504475A - 細胞試料において特定の核酸配列を検出する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ゲノムＤＮＡを有する水性の細胞試料に含まれている特定の核酸配列 を検出する方法に関するものである。

発明の背景 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介しご二次的に増幅するために、細胞からＤ ＮＡを放出させる数種の方法が報告されている。通常、まず最初に、細胞の成分 を可溶化する洗浄剤及び別にＤＮＡに結合して残っているタン）＜り質を消化す るタンパク質分解酵素で処理することにより、細胞から細胞ＤＮＡを精製する。

通常、この工程に続いて、有機溶媒でそのＤＮＡを抽出する。最後１こ、抽出し たＤＮＡを核酸のエタノール沈澱析出のような工程で残留有機溶媒から分離する 。

最近、ＰＣＲは、９５℃で水中において細胞を溶解してＤＮＡを放出した組織培 養細胞で行われている（Ｓａｉｋｉらの論文、Ｎａｔｕｒｅ、　３２４：　１６ ３−１６６　（１９８６））。しかし、この方法は、はとんどの細胞ＤＮＡが不 溶性の形態で残るという理由から、十分ではない。また、ＰＣＲを用いて、アル カリとともに加熱し、遠心分離して全血から得た上清に残ったＤＮＡを増幅する （Ｋｏｇａｎらの論文、Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　３１７：７８５ −９９０　（１９８７））。この方法で困難なのは、ＰＣＲ反応混合物に加える ことができる上清液の量、つまり標的ＤＮＡの量が、上清液のインヒビターによ り制限されることである。この問題は、ＤＮＡ増幅を行う標的が、旧Ｖのような 感染因子（Ｏｕ　ｅｔらの論文、５ｃｉｅｎｃｅ、２３９：　２９５−２９７　 （１９８Ｂ＞）又は宿主生物における転入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）のよう な試料細胞の副次的な画分にのみ存在する場合、特１こ重要になる。

発明の要約 現在、ポリラーゼ連鎖反応によって特定の核酸配列の存在を直接分析することが できる方法で、ＤＮＡを細胞から放出させられることが見出された。

本発明の実施態様において、本発明は、最初に、細胞外タンパク質を実質的に含 まない液体培地に細胞を分離することにより、リンフ　Ｎ＋球のような細胞から ゲノムＤＮＡを放出させることを企図するものである。次いで、この細胞を少な くとも約１０５℃の温度に、少なくとも約５分間さらす。

続いて、放出されたゲノムＤＮＡを、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応により、 特定の核酸配列の存在を調べるために分析することができる。

この方法は、二本鎖ゲノム核酸の鎖を分離する工程、分離された一本鎖を、２種 のプライマー、ｄＮＴＰｓ及びポリメラーゼ酵素を含むブライマーエクステンシ ョン反応混合物を用い、プライマーが特定の配列とハイブリッド化し、かつ各プ ライマーのエクステンション生成物が、酵素によって合成されるような条件下で 処理する工程を含む。

このようにして形成したブライマーエクステンション生成物を、−木調に分離す る。この−末鎖を、再び前記ブライマーエクステンション混合物を用い、プライ マーハイブリッド形成及びエクステンションのための同じ条件下で、処理し、ブ ライマーエクステンション生成物を形成する。増幅生成物の存在は、特定の核酸 配列の存在を示す。好ましい実施態様においては、ＰＣＲ生成物の検出は、ハイ ブリッド化条件下で、該生成物を、親和性ラベル化ポリヌクレオチド及びランタ ン系列元素ラベル化ポリスクレオチドを用いて処理することにより行うことがで きる。それぞれのラベル化ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ生成物の一本鎖ＤＮＡの 異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びランタン系列元素との結合 を有するＤＮＡ二本鎖を形成することができる。

このように形成されたラベル化ＤＮＡ二本鎖を、結合条件下で、ＤＮＡ二本鎖の 親和性ラベルと結合できる固相親和性吸着剤で処理し、固相ランタン系列元素ラ ベル化ＤＮＡ二本鎖を形成する。形成された固相ランタン系列元素の量を測定す る。

図面の簡単な説明 この記述部分は、図面の内容を構成するものである：図ＩＡは、ポリヌクレオチ ドプローブＳ９のラベル化に使用された修飾ンチジン残基を示している。

図ＩＢは、ポリヌクレオチドＳ９をラベルするのに使用されたユウロピウムキレ ート化合物（Ｗ２０１４）を示している。修飾シチジン１ナノモルを、０．５モ ル炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，８）３００μＩに溶かした。各アミノ基当たりキレー ト化合物Ｗ２Ｏ１４のイソチオノアナートをｌＯ〜２０当量この混合物に加え、 ＰＨを約１０に調整した。約１６時間反応させた後、ラベル化Ｓ９プローブをカ ラムクロマトグラフィーで単離した。

図２は、ＮＨ，−修飾デオキシシチジンホスホルアミジト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａ ｍｉｄｉｔｅ）の合成に関するスキームを示している。

らなるＤＮＡ又はＲＮＡの単一ユニットである。この塩基は、グリコシドの炭素 （ペントースの１′位）を介して糖部分と結合しており、この塩基と糖の化合物 がヌクレオシドである。このヌクレオシドがペントースの３′又は５′位に結合 しているリン酸基を含む場合、これをヌクレオチドという。

ｍＪＥＮ（ｂｐ）　：　二本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ ）、又はシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の共同関係をいう。

る。遺伝子は、ＲＮＡ又はＤＮＡの何れか一方である。

相補的塩基：　ＤＮＡ又はＲＮＡが二本鎖構造を取る場合に、通常、対になる複 数のヌクレオチドである。

相補的ヌクレオチド配列：　ＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖分子におけるヌクレオチ ドの配列であって、他の一本鎖のヌクレオチドの配列と、必然的に生じる水素結 合によって特異的にハイブリッド化するのに十分な程、相補的であるものをいう 。

保存された：　あるヌクレオチド配列が、前もって選んだ配列の正確な相補体に 対し、選択的にハイブリッド化する場合、ヌクレオチド配列は、前もって選んだ （参考）配列に関して、保存されている。

ハイブリッド形成じ　相補的な塩基対の間に水素結合が形成されることにより、 実質的に相補的なヌクレオチド配列（核酸の鎮）が対合し、二本鎖又はヘテロ二 本鎖が形成されることをいう。その特異性、すなわち、２種の相補的ポリヌクレ オチドの間の選択的な相互作用であって、拮抗的に阻害されるものである。

常のヌクレオチドさ置換できる程度に十分類似する、プリン又はビリミヂンをい この実施態様において、本発明は、細胞から核酸、特にゲノムＤＮＡを放出させ る方法を提供する。一般に、この方法は下記の工程を組み合わせたものである二 ｌ）ゲノムＤＮＡを有する細胞のような標的細胞を、アルブミン、免疫グロブリ ン、フィブリノーゲンなどの細胞外タンパク質から、水性培地に分離する工程＝ ｌ！）分離した細胞を、少なくとも約１０５℃の温度に、少なくとも約５分間、 さらす工程である。

そのように放出された核酸を、広い範囲の核酸ハイブリッド形成を要求する分子 生物学的な技術で使用することができる。例えば、ノーインプロット法、サウザ ンプロット法、ブライマーエクステンション法（ＰＣＲ）などの技術を使用する 方法を含む、核酸ハイブリッド形成を基礎とする診断法に用いるコントロール試 料又は標準を、本願明細書に記載した方法を用いて製造することができる。また 、細胞から核酸を放出させる本発明の方法は、核酸ハイブリッド形成による診断 法の試料を調製するのにも使用することができる。例えば、細胞から放出された 核酸で、病原体の特定の核酸の存在を分析することができる。

“病原体の特定の”核酸とは、ウィルス、細菌、真核性寄生体などのような病原 体のゲノムの一部を形成するヌクレオチド配列である。典型的なウィルスとして 挙げることができるのは、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）のタイプＩ、 タイプ■、又は旧Ｖ−１及び旧Ｖ−２のようなヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ） 　、ポリオウィルス、アデノウィルス、バラインフルエンザウィルス、麻疹ウィ ルス、流行性耳腺炎ウィルス、呼吸器合胞体（Ｒ３）ウィルス、インフルエンザ ウィルス、ウマ脳を髄炎ウィルス、豚コレラウィルス、ニワトリニーキャッスル 病ウィルス、！Ｉ痘ウィルス、狂犬病ウィルス、ネコ及びイヌジステンパーウィ ルス、ネコ白血病ウィルス、ヒトサイトメガロウィルス、Ｃ型肝炎ウィルスなど がある。細菌性病原体リンゲンス（Ｃ，ｐｅｒｆｒ＋ｎｇｅｎｓ）、Ｂ、アンド ラン（Ｂ、　ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、Ｙ６．ペスチＩｓ。

ｐｅｓｔｉｓ）　、Ｐ、ムルトシダ（Ｐ、　ｍｕｒｕｔｏｃｉｄａ）、Ｖ、］レ ラ（Ｖ、　ｃｈｏｌｅｒａｅ）　、Ｎ、メニンギチテ゛ス（Ｎ、　ｍｅｎｉｎｇ ｉｔｉｄｅｓ）　、Ｎ、ゴノルヘア（Ｎｏｇｏｎｏｒｒｈｅａ）、Ｈ，インフル エンザ（Ｈ。

（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属などの免疫無防備状轢の患者に日和見感染を引き 起こすものがある。

一部の具体的な寄生体のゲノムのヌクレオチド配列を決定する方法は、当該技術 分野で周知である。実際に、多くの病原体のゲノムのヌクレオチド配列の有用な 部分が報告されている。群及び／又はタイプの特定のヌクレオチド配列を、当該 技術分野で周知なように、所望のアッセイ特異性の水準に応じて使用すること細 胞外タンパク質から細胞を分離する方法は、当該技術分野で周知であり、良く知 られているように、分離する細胞のタイプに対応している。“細胞外タンパク貢 “とは、血液中において細胞に含まれないで存在するタンパク質分子を意味する 。この細胞外タンパク質として挙げることができるのは、免疫グロブリン、アル ブミン、フィブリノーゲン、トランスフェリン、リポタンパク質、α、−マクロ グロブリン、ハプトグロブリンなどである。

通常、分離される細胞は、血液中に存在するもの、又はその特定の亜集団にある ものである。この分離される細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単核白血球／マクロファ ージ系列の細胞などのリンパ球であることが好ましい。特に重要な循環する細胞 の亜集団は、細胞表面のＣＤ４レセプターで定義される、すなわちＣＤ４陽性細 胞である。

細胞と接触している水性培地が、約８０ｍｇ／ｎ　１未満、好ましくは約４０ｍ ｇ／ｓ　１未満の細胞外タンパク質しか含まない場合、その細胞は“分離”され たという。水溶液中のタンパク質濃度を測定する方法は、周知である（例えば、 ｌｏｗｒｙらの論文、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　１９３二２６５−７５　 （１９５１）参照）。

好ましい実施態様において、分離された細胞は、実質的に赤血球細胞、及び／又 は細胞遊離のヘモグロビン（生理的な条件下でヘムから誘導されたポルフィリン 化合物を含む）を含まない細胞である。“実質的に含まない”とは、存在するヘ マチンの量が、標準的なフェノール／エタノール抽出工程で精製されたＤＮＡと 同じ試料でのＰＣＲ反応と比較して、ＰＣＲ反応が約１０％より高くは阻害され ない、好ましくは約５％未満しか阻害されない量をいう。分離された細胞が、赤 血球細胞を実質的に含まず、及び／又は分離された細胞試料にあるすべて細胞が 溶解した場合に、得られる溶液のヘマチン濃度が、１０マイクロモル、好ましく は５マイクロモル、さらに好ましくは１．０マイクロモル、かつ最も好ましくは ０．８マイクロモル未満になる程度にしかヘモグロビンを含まない細胞であるこ とが好ましい。

循環する白血球及びその亜集団を分離する、多く方法が知られている。好ましい 方法として、密度勾配遠心分離法、ゾーン遠心分離法及びアフィニティークロマ トグラフィーがある。

遠心分離法により血液からリンパ球を分離するの有用な培地には、水性フィコー ル（ｆｉｃｏｌｌ）　（共重合スクロース及びエビクロロヒドリン）、又は水性 フィコール及びナトリウムトリジエート（ｓｏｄ　ｉｕｍｔｒ　１ｚｏａｔｅ） があり、このような培地は、前もって混合された形態で、さまざまな販売者（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａ ｙ、　ＮＪ、を含む。）から入手することができる。

別法として、リンパ球の特異的細胞表面リガンドを認識するレセプター、又はリ ンパ球の特異的細胞表面レセプターによって認識されるリガンドを使用するアフ ィニティークロマトグラフィーによって、リンパ球を血液から分離することがで きる。例えば、リンパ球の亜集団によって発現されるＣＤ４レセプターに対する 抗体分子を、固体マ）ＩＪフックス結合させ、次いで全血又はそのリンパ球を含 む部分と混合することができる。このように形成した固相／液相結合反応混合物 を、固体マトリックス結合抗体分子が、試料中に存在するＣＤ４陽性リンパ球と 結合し、固相複合体を形成するのに十分な、通常、予備的に決めた時間、維持す る。通常、細胞を溶解させない水性緩衝液、好ましくは等張緩衝液で洗浄するこ とにより、細胞外タンパク質を含む結合反応混合物の他の成分から、この固相複 合体を分離する。このようにして分離した細胞を、この細胞に結合している抗体 分子から分離し、又は分離せずに、本願明細書に記載したように加熱処理するこ とができる。

ＣＤ４陽性リンパ球の分離に有用な抗体には、にｕｎｇ及びＧｏｌｄｓｔｅｉｎ の米国特許第４．３８１．２９５号に開示されたものがある。

ＨＩＶ感染リンパ球を、旧Ｖ　ｇｐ１６０外膜前駆体タンパク質又は旧Ｖ感染リ ンパ球の表面に発現したＨＩＶ　ｇｐＬ２０外膜タンパク質と結合するレセプタ ーとして、ＣＤ４を使用して分離することができる。前記のとおりに、ＣＤ４レ セプターを使用して、旧Ｖ感染細胞を、固体マトリックスと結合させる。この固 体マトリックスは、続いて赤血球、溶解した赤血球から放出されたヘモグロビン （細胞に拘束されていないヘモグロビン）及び細胞外タンパク質を含む試料の残 留部分から分離することができるものである。ＣＤ４レセプターを製造し、かつ 使用する方法は、国際特許出願Ｎｏ、　ＰＣＴ／１ｌｓ８８１０３５９２　（公 開Ｎｏ、　ｗｏ　８９１０３８１４３）に開示されている。

ＣＤ４陽性リンパ球は、固体マトリックスと結合したＣＤ４によって、結合され ることができるリガンドを使用する類似する方法で分離することができる。有用 なＣＤ４結合リガンドには、ＨＩＶ　ｇｐ１６０外膜前駆体タンパク質及び旧Ｖ 　ｇｐ１２０外膜タンパク質がある。

有用な固体マトリックスは、当該技術分野で周知である。このような材料として 挙げることができるものには、架橋デキストラン（商標：　５ＥＰＨＡＤＢＸ、 入手先：Ｐｈａｍａｃｉａ　Ｐｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ、　Ｎ、Ｊ、　）　、アガロース、直径約１ミクロン〜約５ｍｍのポリス チレンのビーズ（入手先：　Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆ　 Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）　、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋 ポリアクリルアミド、ニトロセルロース又はナイロンを基本とするウェブ（例え ば、シート、小板又はかい状物）、オレ管（ｏｒｅ　ｔｕｂｅｓ）もしくは、ポ リスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル又はポリカーボネートから作られ たような、プレート又はマイクロリフドルプレートのウェルがある。

好ましいマトリックスは、常磁性又は磁性であって、好ましくはポリスチレン、 ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート又はポリプロピレンのような、プラスチック 又は樹脂で被覆されたく埋包された）粒子又はビーズ（例えば、鉄含有粒子）で ある。ここで磁性とは、磁化され、あるいは磁化されることができ、又は磁場の 影響を受けやすいことをいう。典型的な磁性ビーズには、商標・ＤＹＮＡＢＥ八 ＤＳ（Ｄへｎａ　１社）のものがあり、これは抗体で被覆された超常磁性の直径 ４．５ミクロンのポリスチレンビーズである。磁性粒子の磁性特性を利用して、 この粒子に結合した細胞を、細胞外タンパク質から分離する工程の間、保持する ことができる。

２、細胞の加熱処理 分離した細胞を、少なくとも約１０５℃で、好ましくは少なくとも約１１０℃で 、さらに好ましくは少なくとも約１１５℃で加熱する。通常、この温度は１２５ ℃未満とすることが必要である。

この細胞を、前記温度に、少なくとも約５分間、好ましくは少なくとも約１０分 間、さらに好ましくは少なくとも約１５分間さらす。通常、約２５〜３０分間よ りも長くしないことが必要である。

この加熱は、大気圧を越える蒸気圧のもとで行い、通常この圧力を約１０〜約２ ０気圧、さらに好ましくは、通常約１３〜約１７気圧、通常約１５気圧とするこ とが好ましい。

通常、この加熱処理は、試料を殺菌するのに十分な時間、温度及び大気圧を越え る圧力で、分離された細胞をオートクレーブ処理することにより達成する。好ま しい実施態様において、この加熱処理は、加熱処理の間に変性して一本鎖になる 放出された核酸が、冷える間にプライマーとハイブリッド化するように、核酸プ ライマーの存在下で行う。

３、増幅法・ポリヌクレオチドブライマーの調製プライマー、プローブ及び核酸 フラグメント、又はブライマーエクステンションにより合成されるセグメントと 関連して本願明細書で使用される用語“ポリヌクレオチドは、２以上の（好まし くは３よりも多い）デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子 と定義する。その正確な大きさは、使用の最終的な条件に順次依存する、多くの 因子に依存している。

本願明細書で使用される用語“プライマー”とは、核酸制限消化物から精製する か、又は合成して製造される、合成の開始点として作用することができるポリス クレオチドをいう。この開始点としての作用は、核酸の鎖と相補的なブライマー エクステンション生成物の合成を誘導する条件、すなわち、ヌクレオチド、及び ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素などの重合因子が存在し、かつ適当な温度及び ｐＨである条件下に置かれた場合に生じる。このプライマーは、最大効率を得る ためには一本鎖であることが好ましいが、一方、二本鎖であってもよい。二本鎖 である場合、最初にプライマーを処理して、エクステンション生成物の調製に使 用する前に、その鎖に分離する。このプライマーが、ポリデオキシリボヌクレオ チドであることが好ましい。プライマーは、重合因子の存在下でエクステンショ ン生成物の合成を開始させるために十分長くなければならない。プライマーの正 確な長さは、温度及びプライマーの供給源などの多くの因子に依存する。例えば 、標的配列の複雑さに応じて、さらに少ないヌクレオチドを含むこともできるが 、通常、ポリヌクレオチドブライマーは、１５〜２５又はそれ以上のヌクレオチ ドを含む。短いプライマー分子は、一般に、より低温を必要とし、鋳型と十分に 安定なハイブリッド複合体を形成する。

本発明のプライマーは、合成又は増幅により検出されるそれぞれの特定配列の異 なる鎮と“実質的に”相補的であるように選択する。このことは、プライマーが 十分に相補的であって、そのそれぞれの鋳型（標的）鎮と選択的にハイブリッド 化するものでなければならないことを意味する。したがって、このプライマー配 列は正確な鋳型の配列を反映しなくともよい。例えば、相補的でないヌクレオチ ドフラグメントを、その鎮と実質的に相補的であるプライマーの残部を有する、 そのプライマーの５゛末端と結合することができる。このような相補的でないフ ラグメントは、通常、エンドヌクレアーゼ制附部位をコードする。他方、プライ マー配列が、合成又は増幅される鎮の配列と十分な相補性を有し、これと選択的 にハイブリッド化し、それによりポリヌクレオチド合成条件下でエクステンショ ン生成物を形成するならば、相補的でない塩基又は長い配列を、プライマーに散 在させることができる。

このポリスクレオチドブライマーを、例えば、ホスホトリエステル又はホスホジ エステル法のような適当な方法を用いて調製することができる（Ｎａｒａｎｇら の論プライマーのヌクレオチド配列の選択は、使用する第２プライマーと関連す る核酸上のそのハイプリント形成部位などの因子に依存する。数種のプライマー 配列を選択し、標的配列を最終的に検出する際に、本質的に等しく十分に機能す ることが認められる場合であっても、殆どの適用において、この標的の保存され た部位からこれらの配列を選択することが懸命である。さらに、このプライマー 配列を、その適当な機能を妨げるヘアピンループを取り得る構造、ならびにプラ イマー−ブライマーハイブリッドを生じさせ、所望のブライマーエクステンショ ン反応での効果的な使用を再び妨げる相補的配列について分析しなければならな い。

しかし、一般に、検出すべき特定の標的配列が与えられた場合、当業者が多くの プライマー対を設計できると期待することができ、そのうち幾つかのものは、ブ ライマーエクステンション反応において本質的に等しい効率で機能するであろう 。したがって、本件出願で提供する配列は、本発明の範囲を制限するものではな く、単にブライマーエクステンション反応を成功させるために、前記の好ましい 基準を満たすことが認められたプライマ一対の例と解釈しなけらばならない。

検出する配列が、二本鎖ゲノムＤＮＡの形態である場合、最初に、通常、融解す ることにより、−末鎖に変性させる。このＤＮＡを、予備的に選択したヌクレオ チド配列を有する第１ポリヌクレオチド合成プライマーで、このＤＮＡを処理す る（と接触させる）ことにより、第１ブライマーエクステンション反応を行う。

第１プライマーは、特定のヌクレオチド配列（好ましくは、その長さが少なくと も約１０ヌクレオチド、さらに好ましくは、その長さが少なくとも約２０ヌクレ オチド）に対してハイブリッド化することにより、第１プライマーエクステンン ヨン反応を開始することができる。この反応は、第１プライマー（好ましくは前 もって決めた量）を、ゲノムＤＮＡを有する試料の核酸（好ましくは前もって決 めた量）と混合し、第１ブライマーエクステンション反応混合物を形成すること により達成する。この混合物を、ポリスクレオチド合成条件下に、第１ブライマ ーエクステンション反応生成物を構成するのに十分な、通常、前もって定める時 間、維持する。次に、この生成物を、予備的に選択したヌクレオチド配列を有す る第２ポリヌクレオチド合成プライマーで処理することにより、第２プライマー エクステンンヨン反応を行う。第２プライマーは、第１生成物に見出されるヌク レオチド配列（好ましくは、その長さが少なくとも約１０ヌクレオチド、さらに 好ましくは、その長さが少なくとも約２０ヌクレオチド）に対してハイブリッド 化することにより、第２反応を開始することができる。この反応は、第２プライ マー（好ましくは前もって決めた量）を、第１生成物（好ましくは前もって決め た量）と混合し、第２プライマーエクステンション反応混合物を形成することに より達成する。この混合物を、ポリヌクレオチド合成条件下に、第２プライマー エクステンション反応生成物を構成するのに十分な、通常、前もって定める時間 、維持する。

他の戦略では、その対象を、ゲノムｄｓＤＮＡのアンチセンス鎮又はｍＲＮＡを 逆転写酵素反応することにより生成したポリヌクレオチドのような目的とする特 定の核酸配列のポリスクレオチド相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を検出するこ とに置く。このような相補体を生成する方法は、当該技術分野においては周知で ある。この相場体に、前記第２ブライマーエクステンション反応を行う。

このブライマーエクステンション反応を、適当な方法を用いて実施する。一般に 、この反応は、好ましくはｐＨ６〜９、さらに好ましくはｐＨ６〜８．５、かつ 最も好ましくはｐＨ約８の緩衝水溶液で行う。モル過剰のプライマー（ゲノム核 酸に関し、通常、プライマー二鋳型−約１０’：１）を、鋳型鎮を含む緩衝液と 混合する。

大きなモル過剰は、工程の効率を改善するので好ましい。ポリヌクレオチドブラ イマーが、長さ約２０〜２５ヌクレオチドである場合、通常の割合は、ゲノムＤ ＮＡの１００　ｎｇ〜６μｇ当たり、各プライマーは５０　ｎｇ〜１μｇ１好ま しくは２５０μｇの範囲である。

また、適量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、　ｄＡＴＰ、 　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰも、合成反応混合物に加え、得られた溶液 を約９０℃〜１ｏｏ℃で、約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間、加熱する。

加熱時間経過後、溶液をブライマーハイブリッド形成に好ましい、室温に冷やす 。この冷やした混合物に、ブライマーエクステンション反応を誘導又は触媒的に 作用する適当な試薬を加え、この反応を当該技術分野で公知の条件で生じさせる 。この合成反応は、室温から誘導剤がもう十分に機能しなくなる温度までの範囲 で行う。したがって、例えば、ＤＮＡポリメラーゼを誘導剤として使用する場合 、一般に温度は約４０を未満とする。

誘導剤（酵素を含む）は、ブライマーエクステンション生成物の合成を達成する よう機能する化合物又はシステムであればよい。この目的に適する酵素として挙 げることができるものに、例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＬ　Ｅ 、　ｃｏｌｉＤＮΔポリメラーゼ１のフレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、 Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、他の入手可能なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、及 び熱安定性酵素を含む他の酵素があり、これらの酵素は、適当な方法でヌクレオ チドの結合を促進し、各核酸鎖き相補的なブライマーエクステンション生成物を 形成するものである。

一般に、この合成は各プライマーの３“末端で始まり、合成終了まで鋳型鎮に沿 って５′方向に進み、異なる長さの分子を生成する。しかし、合成を５°末端で 始め、３°方向に進める誘導剤で、前記と同じ方法を用いてもよい。

新ｊ〜く合成された釦及びその相補的核酸鎖は、検出すべき特定の核酸配列の標 識として作用できるように、二本鎖を形成する。

好ましい戦略では、第１及び第２ブライマーエクステンション反応は、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における第１及び第２ブライマーエクステンション反応 である。

ＰＣＲを、同時的なサイクルで、すなわち、特定の混合物により、前記第１及び 第２プライマーエクステンション反応を実施することにより行う。各サイクルは 、ポリヌクレオチドの合成とそれに続く、形成された二本鎖ポリヌクレオチドの 変性を含むものである。特定の核酸配列を増幅する方法及びシステムは、Ｍｕｌ ｌｉｓらの米国特許第４．６８３．１９５号及び第４．６８３．２０２号ならび にＧｅ１ｆａｎｄらの米国特許’！　４．８８９．８１８号に開示されている。

二本鎖核酸配列分子を有する分離さね、加熱処理された細胞の試料に存在する特 定の核酸配列を検出する方法は、下記の工程を有するものである：（ａ）二本鎖 核酸分子の鎖を分離して、−末鎖の鋳型を形成する工程：（ｂ）−重鎖鋳型を（ １）２種のポリヌクレオチドプライマー及び（■）酵素を含むブライマーエクス テンション反応混合物で処理する工程であって、（１）２種のポリヌクレオチド ブライマーは、■のプライマーから合成されたエクステンション生成物が、それ を相補的核酸鎖から分離する場合に、他のプライマーのエクステンション生成物 の合成の鋳型として役立つことができるように、特定の配列の異なる釦とともに ハイブリッド化するのに十分なほど相補的であるように選択されたものであり、 （ｉｉ）酵素は、前記−末鎖鋳型からブライマーエクステンション生成物を生成 できるものであり、かつ、 前記処理が、プライマーが特定の配列とハイブリッド化し、各プライマーのエク ステンション生成物が酵素の作用により合成されるような条件下で行われ、前記 生成物が、各−末鎖鋳型と相補的である工程；（Ｃ）工程（ｂ）で形成されたブ ライマーエクステンション生成物を、それらが合成され一本鎖分子を生成する鋳 型から分離する工程：（ｄ）工程（Ｃ）で生成された一本鎖分子を工程α））の ブライマーエクステンション混合物と混合し、ハイブリッド化条件下に、ブライ マーエクステンション生成物が、工程（Ｃ）で形成された一本鎖分子を鋳型とし て使用して合成される程度の、前もって定めた時間、維持するような処理を行う 工程；（ｅ）工程（ｄ）で形成されたブライマーエクステンション生成物の存在 により、分離された細胞に特定の核酸配列が存在することを検出する工程である 。

増幅された核酸生成物の検出を、広範囲の周知の技術で行うことができる。好ま しい実施態様において、増幅生成物は、ゲル電気泳動で分子量に基づき分離する ことができ、次いで分離された生成物を、ゲルに存在する溶解された増幅生成物 の目立たない種を観察できるようにする核酸特異性染料を使用することにより、 視覚化する。ゲル電気泳動で分解した場合に特定の分子量を有する、特定の増幅 生成物の存在は、該ポリヌクレオチドがＤＮＡ二本鎖に存在し、ＰＣＲ反応でプ ライマーとして作用し、標的ヌクレオチド配列を含む目立たないヌクレオチド配 列を有する核酸の多くのコピーを生成したことを示している。多くの核酸特異性 染料が存在し、それらは電気泳動で分離された核酸を視覚化するのに適している が、銀染料又は臭化エチジウム染料が好ましい。

増幅核酸を検出するのに適した他の方法には、周知の方法がある。放射性ラベル を使用する方法が十分に確立されている（参照例：　Ｈａｍｅｓ　Ｂ、　Ｄ及び １１ｇｇ１ｎｓ　Ｓ。

Ｊ、（編集者）　＜１９８５＞、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚ ａｔｉｏｎ、　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ@ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ　０ｘｆｏｒｄ、　ｌｌａｓｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，）　ｏ酵素をプロ ーブと結合させる方法（参照例＝Ｊａｂｌｏｎｓｋｉらの論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ＋ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８６）　１４：６１１５−６１２８＞又 は蛍光性ラベル（Ａｇｒａｗａｌ　らの論文、（１９８６＞　Ｎｕｃｌｅ＋ｃ　 Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　１４：６２２７−６２４５）又は時間−解像蛍光光 度計を利用する方法（参照例：　５ｙｖａｅｎｅｎらの論文、１ｌｕｃｌｅｉｃ Ａｃ＋ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ（１９８６）、　１４：５０３７−５０４８又は０ ｓｅｒらの論文、Ｎｕｃｌａ＋ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１６：１１８ １−１１９６）が、ハイブリッド形成を介して核酸を検出する周知の研究方法を 橋成し、これらの方法を増幅標的ＤＮＡを含む試料に選択的に適用することがで きる。さらに、標的ＤＮＡとハイブリッド化したラベル化プローブ（Ｇｅｎ　Ｐ ｒｏｂｅ社、　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　（１９８９））におい てアクリジニウムエステルの保護を含む化学ルミネセンス分析は、ラベル化核酸 を使用して特に相補的核酸を検出する他の手段を構成する。これら各種の方法は 、十分な標的核酸が与えられれば、標的核酸の存在を、プローブＤＮＡ、すなわ ちポリヌクレオチドプローブ又はプローブと結合した、広い範囲のいずれかの有 効なラベルによって示すことができるということが当該技術分野において確立さ れている。

ＤＮＡに存在するラベル化ヌクレオチド残基は、ＤＮＡそれ自体をラベル化し、 したがって、分析する試料に存在する他の核酸から差別化可能にする。ＤＮＡに ふけるラベルの存在の検出及びそれによる特定のＤＮＡ配列の検出工程は、ＰＣ Ｒ生底物又はＰＣＲ生戊生金物む二本鎖の一部として存在しないラベル化ｄＮＴ ＰからＤＮＡを分離する工程を含む。

好ましい実施態様において、親和性に基づく収集分析法（ＡＢＣａｓｓａｙ　ｍ ｅｔｈｏｄ）を使用して、ポリヌクレオチドＰＣＲ生成物を検出する（参照例： 　５ｙｖａｅｎｅｎらの論文、（１９８６）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ、　１４：５０３７−５０４８）　ｏこの方法において、一対のプ ローブを、標的核酸配列を含むＤＮＡ鎮又はＰＣＲ生成物に存在するその相補体 とハイブリッド化させる。プローブの１つを、形成されたハイブリッドを固相上 で分離させることができる親和性ラベルと結合させる。一対のプローブの第２　 （シグナル）プローブを、ブライマーエクステンション生成物を検出可能にする ラベル（本願明細書で時折、シグナル発生手段のリポータ−基という。）と結合 させる。通常、このようなラベルには、放射活性原子、化学的に修飾されたヌク レオチド塩基、ユウロピウムのようなランタン系列元素などがある。

親和性ラベルは、他の分子全体、すなわち抗体のようなレセプター又は抗原のよ うなリガンドと特異的に（選択的に）結合することができる分子全体をいう。

通常、使用される親和性ラベルにはビオチンがあり、例えば、ＤＮＡに対するそ の結合方法が知られている（Ｓｈｅｌｄｏｎらの論文、（１９８６）　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ−μｓＡ工８３：　９０８５−９０８９）。

ビオチンは、ストレプトアビジン又はアビジンに強く結合するが、また、抗ビオ チン抗体も相補的結合剤として利用してもよい。他の親和性ラベルには、その抗 体が簡単に作られ、かつ親和性ラベル対における第２成分として使用することが できるジニトロフェノールがある。他の小さな分子、例えば、ジゴキシン（また 、抗ジゴキシン抗体を第２成分として使用してもよい。）もこのようなシステム において、同様に適している。したがって、このようなシステムは、本発明の出 願に従ったＤＮＡを分離し、標的核酸を放出させる手段を提供する。

このＡＢＣ分析法において、親和性ラベル化オリゴヌクレオチドは、試験対象と なる特定の核酸とハイブリッド化し、親和性ラベルを含む複合体（ＤＮＡ二本鎖 ）を形成する。次にこのように形成した親和性ラベル化ＤＮＡ二本鎖を、親和性 ラベルと特異的に結合する試薬を含む親和性吸着剤と結合させる。この試薬は、 固体（水に不溶性）の支持体と機能的に結合する。有用な固体マ）　ＩＪフック ス、当該技術分野で周知のものである。このような材料には、架橋デキストラン （商標：　５ＥＰＩＩＡＤＥＸ、入手先：　ＰｈａＩｌａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ ｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ、　）　、アKロ ース、直径約１ミクロン〜約５１１Ｉｆｆ＋のポリスチレンのビーズ（入手先： 　ＡｂｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ 、　ＩＬ）、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロ セルロース又はナイロンを基本とするウェブ（例えば、シート、小板又はかい状 物）、もしくは、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから作られた、チューブ、プ レート又はマイクロリットルプレートのウェルがある。

シグナルプローブを、検出する特定の核酸配列を含むＤＮＡｍとハイブリッド化 させることにより、このＤＮＡ二本鎖が検出可能になる。親和性ラベル化プロー ブとシグナルプローブの双方を、検出する特定の核酸配列を含むＤＮＡとハイブ リッド化した場合、シグナルプローブ及び親和性ラベルを含むＤＮＡ二本鎖が形 成される。

用語“ハイブリッド化条件”及びそれと文法的に等しい用語は、維持する時間と ともに使用する場合、この混合物の反応物の濃度及び含まれている反応物と関連 してハイブリッド形成反応混合物を、そのポリヌクレオチドが標的（特定の）核 酸配列とアニールし、一本ｍＤＮＡを形成するのに十分な時間及び温度条件に置 くことを示している。ハイブリッド形成を達成するのに必要とされるこのような 時間及び温度条件は、当該技術分野で周知であるように、ハイブリッド化するポ リヌクレオチドセグメントの長さ、目的とするハイブリッド形成の緊縮性（ｓｔ ｒｉｎｇｅｎｃｙ）及びハイブリッド形成反応混合物においてハイブリッド形成 の速度に影響を与えるであろう塩又は付加的な反応物の存在に依存している。所 定のハイブリッド形成反応混合物でハイブリッド形成条件を最適化する方法が、 当該技術分野で周知である。

通常のハイブリッド化条件には、５〜９のｐＨ値に緩衝化した溶液を使用するこ と、及び１８〜７０℃の温度で、０．５分間〜２４時間行うことが含まれている 。

ハイブリッド形成を、周知のように均−又は不均一な構成で行うことができる。

均一なハイブリッド形成反応は、溶液において全体的に生じる。そこではポリヌ クレオチドプローブ及びハイブリッド化される核酸配列（標的）の双方ともが、 溶液中に可溶性の形態で存在する。不均一な反応には、反応培地に不溶性で、プ ローブ又は標的核酸の何れかと結合しているマトリックスを使用する。

親和性及びシグナルラベルを含むＤＮＡ二本鎖を、吸着剤を混合し、この結合反 応混合物を、親和性ラベルが、その親和性吸着剤と結合するのに十分な時間、結 合条件下に維持することにより、親和性吸着剤と結合させる。次いで、結合した ＤＮＡ二本鎖を、通常、洗浄することにより結合していない物質と分離する。

“結合条件”とは、ｐｉ（値、塩濃度、温度、及び親和性ラベルと親和性吸着剤 の特異的結合因子との特異的（選択的）結合を促進する結合反応混合物のような パラメーターの組合せをいう。このような条件は、当該技術分野で周知である、 親和性ラベルと親和性吸着剤の特別な組合せに依存する。通常、結合条件は約１ 分間〜１４時間、好ましくは約５分間〜約９０分間の前もって定めた時間内で、 検出できる結合を促進するように選ぶ。

好ましい実施態様において、第１及び篤２ポリヌクレオチド合成プライマーは、 レトロウィルス長終末反復ゲノム部位の一部と相補的であり、これが一対のプラ イマーを用いることにより、多くのＤＮＡセグメントの増幅を可能にする。

他の好ましい実施態様において、２対のプローブ（１対がそれぞれＰＣＲ増幅工 程で生成したＤＮＡの個々の鎖に関するものである）を利用し、これにより所定 のＰＣＲ増幅生成物から得られるシグナルを２倍にする。

ともかく、親和性ラベル化オリゴヌクレオチドプローブ及びシグナルラベル化オ リゴヌクレオチドプローブは、検出するＤＮＡ鎖の十分に異なる部位と相補的な 核酸配列を有する。これらのプローブは、双方とも前記鋼とハイブリッド化して 双方のラベルを有するラベル化されたＤＮＡ二本鎖を形成する。このブローブー ハイブリッド形成部位は、隣接する、近接する又は部分的に重複するヌクレオチ ド塩基により規定することができる。このプローブは、約１〜約２０ヌクレオチ ド塩基離された部位とハイブリッド化するのが好ましい。

ｄＮＴＰの一部と機能的に結合するか、又は存在する放射活性元素は、ＤＮＡブ ライマーエクステンション生成物の検出を促進する有用なラベル化手段を提供す る。

通常の放射活性元素は、β線放射を生じるものである。３Ｈ，Ｃ”、ｐ３２及び ３５３のようなβ線を放射する元素は、β線放射−放射活性元素ラベルに存在す る。

しかし、また、ヨウ素のアイソトープ１２５又は１３１のようなＴ線放射体も、 ラベル化オリゴヌクレオチドに使用してもよい。

放射能活性ラベル化ｄＮＴＰｓに替わるものは、化学的に修飾さね、金属錯化剤 、ビオチン含有基、蛍光性化合物などを含むｄＮＴＰｓである。

有用な金属錯化剤は、ランタン系列元素及び芳香族β−ジケトンにより形成され るランタン系列元素キレート化合物である。ランタン系列元素は、ＥＤＴＡ−類 似化合物のようなキレート形成化合物を介して、核酸又はポリヌクレオチドと結 合し、蛍光性ランタン系列元素複合体を形成する（米国特許第４．３７４．１２ ０号及び第４、５６９．７９０号、ならびに公開された国際特許出願Ｎｏ、　Ｅ ＰＯ１３９６７５及びＮｏ、　ＷＯ８？１０２７０８を参照のこと）。好ましい ランタン系列元素は、ユウロピウムである。

ビオチン又はアクリジンエステル−ラベル化オリゴヌクレオチド及びポリヌクレ オチドにおけるそれらの使用が開示されている（米国特許第４．７０７．４０４ 号、公開された国際特許出願Ｎｏ、　ＥＰ０２１２９５１及びヨーロッパ特許第 ００８７６３６号を参照）。

有用な蛍光性標識化合物には、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）　、 ロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）　、タフサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）な どがある。

特定の核酸配列の存在を検出する他の研究方法では、ブライマーエクステンショ ン反応で使用されるデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ　）は、前 記のようなシグナルラベルを含む。

したがって、本発明は、血液試料に含まれている特定の核酸配列を検出する方法 を企図するものであって、この方法は下記の工程を有する：（ａ）水性培地に、 血液試料から抹消血単核（ＰＢＭ）細胞を分離し、それにより８０ｍｇ／悶１未 満の濃度で細胞外タンパク質を含む混合物を形成する工程：（ｂ）前記混合物を 、約り０５℃〜約１２５℃の温度で、少なくとも約１０分間加熱し、これにより 、加熱処理試料を形成する工程：（Ｃ）加熱処理試料の一部に、特定の核酸配列 の相補体の合成開始を可能にする第１ポリヌクレオチド合成プライマー、及び該 特定の核酸配列の合成開始を可能にする第２ポリヌクレオチド合成プライマーを 使用するポリメラーゼ連鎖反応を少なくとも１回行う工程； （ｄ）ハイブリッド化条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を、親和性ラベル 化ポリヌクレオ壬ド及びランタン系列元素ラベル化ポリヌクレオチドで処理する 工程：ここで前記の各ポリヌクｌ／オチドは、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一 本鎖ＤＮＡの異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びランタン系列 元素ラベルさの結合を有するＤＮＡ二本鎖を形成することができる：（ｅ）前記 ＤＮＡ二本鎖を、結合条件下で、ＤＮＡ二本鎖の親和性ラベルと結合できる同和 親和性吸着剤で処理し、次いで、固相ランタン系列元素ラベル化ＤＮＡ二本鎖を 形成する工程：及び （ｆ）形成された固相ランタン系列元素ラベル化ＤＮＡ二本鎖の量を測定する工 程である。

好ましい実施態様では、親和性ラベルはビオチンであり、同和親和性吸着剤は、 水に不溶性の固体マトリックスと結合したストレプトアビジン又はアビジンであ り、かつランタン系列元素ラベルはユウロピウムである。

Ｃ０組換えＤＮＡ及び形質転換細胞 さらに本発明は、旧Ｖウィルスゲノム又はプロウィルスゲノムと機能的に結合し たトランスファー（シャトル）ベクターを含む組換えＤＮＡ　ｂＤＮＡ）を企図 するものである。該１１１Ｖゲノムは、複製機能不全、すなわち、転写及び翻訳 を介してそれ自身が増殖できないものである。この旧Ｖゲノムは、コア抗原開始 コドン（ｇａｇ一部位遺伝子）、ゲノムからｍＲＮＡを発生させるウィルススプ ライスドナーシグナル、及びＣ１ａ　Ｉエンドヌクレアーゼ制限部位を１以上含 まないような遺伝子欠損変異を含んでいる。それぞれのこれらの特性は、プラス ミドｐＨＸＢ２ｃＧの旧Ｖゲノムにおいて、ヌクレオチド位置８４７から１１２ 〜１１５塩基上流に規定される部位に対応するウィルスゲノムに位置するヌクレ オチド配列によって規定されている（Ｍｕｅｓｉｎｇらの論文、Ｎａｔｕｒｅ、 　３１３：４５０−４５８＜１９８５）及びＢｕｙａｄｅｒらの論文、勤ｙ稈と ３２６　：６６２−６６９　（１９８７）を参照）。

また、前記ｒＤＮＡで形質転換された細胞をも企図する。この細胞が、そのゲノ ムの中に統合された単−ｒＤＮＡを約３未満、好ましくは約２未満、さらに好ま しくは１個含むのが好ましい。

困旌例 下記の実施例は、本発明の範囲を詳細に説明することを意図するものであって、 その制限を意図するものではない。

１、　ＨＩＶ−陽性コントロール細胞の調製細胞株ＣＯ５−１０−１１，１は、 ウィルス複製機能を不全にする変異を含むＨＩＶ−１ゲノムの単一の完全なコピ ーを含んでいる。この株は、ＨＩＶ感染細胞のモデルとして役立ち、かつこれら の研究で使用された旧Ｖ　ＤＮＡの供給源である。

変異ＨＩＶ−Ｉ　ＤＮＡヲ、）ＩＩＶ−１＜７）ＨＴＬＶ−１１１Ｂ　０）ｐＨ ＸＢ２ＣＧ　’：ｆラスミ）’カラ発生すｆた。このプラスミドは、ウィルスコ ア抗原の開始コドンから４１塩基対下流に、メチル化感受性制限エンドヌクレア ーゼＣ１ａ　ｌのための独特な切断部位を含む。遺伝子銀行データライブラリー は、遺伝子コンピュータ群の配列分析ソフトウェアを増補する（バージョン６． ０．１９８９年２月、受入れ番号ＫＯ３４５５，ライスコンシン大学、ランタン 、ライスコンシン）。標準的な技術を用いて、ダムＥ、ｃｏｌｉを形質転換し、 形質転換株を増幅し、かつそこからプラスミドＤＮＡを分離することにより、非 メチル化ｐＨＸＢ２ｃＧを生成した。分離されたｐＨＸＢ２ｃＧ　１．２μｇを 、Ｃ１ａＩを用いて切断し、次いでこのＣｌａ　１部位を取り囲む配列を、ｐＨ ８の緩衝液５０マイクロリツトル（ＮａＣＩ　６００　ｍＭ、　ＭｇＣＩｚ　１ ２　ｍＭ、　ＥＤＴＡ　１　ｍＭ、　Ｔｒｉｓ　１０　ｍＭ、温度３０℃）に溶 かしたエンドヌクレアーゼＢａ１３１　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａ ｂｓ）　１単位を用いて除去した（Ｍａｎｉａｔａｓらの論文を参照：　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、 　［：ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｎ、　Ｙ、）@ｏ　１分、２ 分、５分、１０分、及び３０分の時点で、反応の２０％を除き、かつフェノール 及びクロロホルムの混合物を用いて抽出することにより、消化を止めた。エタノ ールにおける沈澱により濃縮した後、Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼを使用して、消化さ れたプラスミドＤＮＡ５をつなぎ、閉じた環状分子を生成する。リガーゼを不活 性化した後、欠失されたヌクレオチドを持たない分子を切断するために、つない だ分子を細菌の個々のコロニーを生育させ、変異プラスミドを分離した。プラス ミド１０は小さな欠損を有し、かつ精製され、さらにＤＮＡ配列決定法で特徴を 調べたｐ）ＩＸＢ２ＣＧにおいて、ヌクレオチド配列位置８４７から少なくとも １１２塩基対で、かつ１１５塩基未満で、上流部分を削除することにより、Ｃ１ ａ　Ｉ制限部位、コア抗原開始コドン及び旧νゲノムからウィルスｍＲＮＡを発 生させるスプライスドナーシグナルを除去した。

変異株ＩＯプラスミドＤＮＡＩμｇを、薬剤６４１８に対する耐性標識を運ぶｐ ＳＶ２ネオプラスミド１０　ｎｇと七もに、ＣＯ５−７細胞１０００．０００個 （ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５１）に導入し、Ｇ４１８４００μｇ／ｍ　Ｉとして数 週間選択した後、耐性コロニーの細胞を分離した。

いくつかのコロニーは非常に多く生育し、細胞ＤＮＡを得た。サウザンプロット 分析法を行った結果、ＣＯＳクローン１０〜１１が、旧Ｖ　ｇａｇ部位の完全な コピーを含んでいた。３ＳＳメチオニンを用いたこの細胞株のタンパク質の代謝 的ラベル化、及びＡＩＤＳＴｗ３．者の血清を用いた免疫沈澱法（ｉｍｍｕｎｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行った結果、ＨＩｖ抗原は検出可能な水準では 発現されていなかった。この株を再度クローン化し５、クローン（：ＯＳ　１０ −１１．１を特徴付け、サウザン分析法でハブロイドゲノムにつきＨＩＶ標的配 列の単一コピーが含まれていることを検出した。

２、プロウィルス旧Ｖ−Ｉ　ＤＮＡを標的きするプライマーの合成下記の配列を 有する２種のプライマー８１及びＳ、を調製した：Ｓ、：　５’　ＧＧＡＡＣＣ ＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣ３’Ｓ２　：　５°　ＧＧ丁ＣＴＧＡＧＧＧＡＴ［ ：ＴＣＴＡＧ　３′各プライマーを、器具製造者のマニュアルにある標準的なプ ロトコールに記載されているホスホルアミシト化学を用いて、遺伝子アセンブラ −（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で合成した。

合成されたそれぞれのオリゴヌクレオチドの分離を、下記の分離用ポリアクリル アミドゲル電気泳動を介して行った。すべてのオリゴヌクレオチドを、１．３μ Ｍの規模で合成した。

下記のとおりに脱保護を行った。プログラム終了後、支持体をカセット幅の末端 を有するエツペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ）に入れた。このカ セットを、エッペンドルフ遠心器において、少なくとも４．０００ｒｐｎ＋で簡 単に遠心分離した。濃水酸化アンモニウム溶液１　ｍｌを加え、この管を煮沸台 に置き、５５℃に２４時間保った。このカセットから水酸化アンモニウム溶液を 除き、新しい管に移し、再度、遠心分離し、全ての水酸化アンモニウム溶液を回 収した。水を加えて、容量を２゜５ｍｌに調整した。次いで、溶出緩衝液として Ｈ２Ｏを使用し、ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅ ｃｈｎｏｌｏｇｙ）上で、脱保護されたオリゴヌクレオチドを操作して、水酸化 アンモニウム溶液を８．０と交換した。このオリゴヌクレオチドを、高速真空装 置（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ））において、蒸発させ乾燥物とした。

オリゴヌクレオチドの精製を、本質的１ごＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 　−Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　（１９８２）　”　（Ｅｄ、　Ｍ ａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉ■刀A　Ｃｏ１ｄ Ｓρｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ）の詳細に基づき行った。

１０％尿素−ポリアクリルアミドゲル（尿素３０％、ポリアクリルアミド１０％ ）を調製し、Ｉ　ＸＴＢＥを電気泳動緩衝液とし、３４０ｖで３０分間前操作を 行った。オリゴヌクレオチドをＨ，０６０μＩに懸濁し、染料混合物（ホルムア ミド９５％、ＥＤＴＡｌｏ　ｍＭ、ブロムフェノールブルー　０．０１％、キシ レノールブルー０．０１％）と混合した。過剰量の尿素をＩ　ＸＴＢＥで置き換 えて除去した。試料をゲルの上部（ゲルの全長を越える。）に加え、このゲルを 、下部の染料バンドがゲルの下部の縁に移動するまで、３４０ｖで作用させた（ １．５時間）。このゲルを外して、ＵＶ−投影用ＴＬＣ−シートに置き、対象と するバンドが位置する長い波長のＩＩＶ−ランプを使用した。このバンドを剃刀 の刃を使って注意深く除いた。続いて、このオリゴヌクレオチドを、エピゲルロ ーシステム（エビ遺伝子）においてＩ　ＸＴＢＢを使用して、ゲルからＤＥＡＥ セルロースに溶出させた。Ｉ　ＸＴＢＥ　！ｌｌ液液おいて１００ｖをがけて、 少なくとも２時間後、オリゴヌクレオチドを、このＤＥＡＥセルロース沈澱から 溶出させ、Ｍｇ［：Ｉａ　１０　ｍＭを加えて、良好な回収を確保した。オリゴ ヌクレオチドをＥＤＴＡ　１００　フィクロモルを加えた２０　ｍＭ　ＨＥＰＥ Ｓ　（ｐＨ７，５）　１　ｍｌに再慧濁し、溶出液古して同じ緩衝液を用い、２ 個の分離ＮＡＰ−５カラムで処理した。オリゴヌクレオチドの濃度を、ブランク としてＨＥＰＥＳ−ＥＤＴＡ緩衝液を使用し、かつ１０．　Ｄ。

がオリゴヌクレオチド３３μｇ／１ｍｌに対応すると計算して、Ｕシー分光光度 計において２６Ｏｎ＋ｎで測定することにより、測った。

表１に、本発明を説明するために用いた、病原体誘導核酸の検出用プライマー及 びプローブとして使用したオリゴヌクレオチドを示す。

表ル トロウィルス検出分析法に使用するプライマー及びプローブとまた＝二四ｔ Ｐｉ　５’−ＣＡＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣ５＋Ｐ２　５’−Ａ ＧＴにＣＣＴＧＧ入ＧＧＧＴＴＡＧＣＴＧ　コ’Ｐ３　５’−ＯＪ’Ｈ，−ＣＩ ＡＣＴＴＴＴＡＧＣＣＡＧＣＣＣＣλＣＣＡＡＴＧＡＧＧＡＡＴ　ｂ　ｉ　ｏ　 −プａ−ブＰ４　５’−（ＩＨ２−Ｃ）４゜ＧＡＧＧＡＡＡＡＴＧＴ’ｒＴＣＣ ＣＡＣＡＴＣＧＡＣＣＡＴＴ℃　Ｅｕ−プｏ−ブ■ｙ５Ｌ四ｋ Ｐ５　５’−ＴＧＣＡＧＣＴ（、ＧＣＣＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣ５＋Ｐ６　５’− ＴＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡ’ｌ’ｒＧＴＧＧＣＣＴＣコ１Ｐ７　５’−ＣＴＡＧＣ ＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＧＡＣＣ（ＩＨ２−Ｃ）Ｃｂｉｏ−プｏ−ブ Ｐ８　５’−（）ｆＨ２−Ｃ）、。ＧＧＣＡＡＧＣＴｒＴＣＣＣＣＣＡＡＴにＣ ＡＣＴＡＴＴＣＥｕ−プｏ−ブＫＩＶ−２ＬＴ１’ｌ’ Ｐ９　５　’　−ＣＣＡＣＧＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴｒＡＡＡにＡＣＣＴＣ５＋Ｐ ＩＯ５’−人ＴＴＴＴＣＣＴにＣＣＴＣＧＧｆｆｌ’ＣＣＣ入λＡＧ　３１Ｐｉ ）　５’−ＣＴＴＡＡＧＡＣＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧ　５’Ｐ１４　５　’ 　−ＴにＴＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧ　３　’Ｓｌ　５’−ＧＧＡＡＣ ＣＣＡＣＴＧＣＴＴ〜−ＣＣ５’Ｓ２　５’−ＧＧＴＣＴＧ入ＧＧＧＡＴＣＴＣ ＴＡＧ　３１５１１　５’−ＣＡＣＡＣＴＡＣ’Ｉ’ｒＧＡＡＧＣＡＣＴＣ入入 ＧＧＣ入入ＧＣ（ＩＨ２−Ｃ）Ｃｂ’ｉ　ｏ−プローブＳ９　５’−（ＩＨ２− Ｃ）、、ＡＣＣ八（ＪＧＴＣ入Ｃ八Ｃ入へＣ入にＡＣＧＧにＣＡ　Ｅｕ−プロー ブ省略記号　５°、５゛−ブライ７−１３°、３゛−プライマー；　ｂｉｏ−プ ローブ、ビオチン化プローブ；Ｅｌｌ−プローブ、ユウロピウム−プローブ塩基 １２４−２９１） ４−　ＨＩＶ−Ｉ　ＰＯＬ　（Ｒａｔｎｅｒらの論文、、　ＡＩＤＳ　Ｒｅｓ、 、　３：５７−６９　（１９８７）塩基４７４２−４９１７） 塩基５０６−６０５） ３、ユウロピウムでラベル化したポリヌクレオチドポリヌクレオチドＳ９を、ユ ウロピウムでラベル化した。このラベル化を、最初に、アミノ修飾デオキシシチ ジンホスホルアミシト（図ＩＡ）を合成し、この修飾デオキシシチジンを含むポ リヌクレオチドを合成し、さらに、ユウロピウムを得られたポリヌクレオチドに カップリングすることにより行った。

ａ、アミノ修飾デオキシシチジンホスホルアミシトの合成このＩＨ２−修飾デオ キシシチジンホスホルアミシトの合成に関する全体的なスキームを図２に概念的 に示した。ピリジン、テトラヒドロフラン及びアセトニトリルを、水素化カルシ ウム上で７時間、還流することにより乾燥し、その後、蒸留した。トリエチルア ミン及びジイソプロピルエチルアミンを固体の水酸化カリウム上で還流し、蒸留 した。

テトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦＸ３　）＋２０　）を、乾燥ア セトニトリルと共蒸発させ、最終濃度を０．５Ｍとした。

テトライソブロピルジシロシルジコリデート（ｄｉｃｈｏｒｉｄａｔｅ）　（Ｔ ＩＰＤＳｉＣＩｚ）を、Ｍａｒｋｉｅｗｉｃｚの論文（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｐｅ ｓ、、　２４１：１７３−１８Ｈ１９７９）の記載に従って合成し、かつ（２− シアノエトキン）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロホスピンをＣ１ａｕ ｓｅｎらの論文（Ｒｅｃｌ、　Ｔｒａｒ、　Ｃｔｕｍ、　Ｐａｙ−Ｈａｓ、　１ ０４：１１９−１２２（１９８５））の記載に従って合成した。商業的に入手可 能な試薬は、すべてＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ 、　Ｗｌ）又はＳｉｇ＋ｎａ社（ＳＬ　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から購入した。

薄層クロマトグラフィー（Ｔ１．Ｃ）を、予め被覆したンリカゲルプレート（Ｍ ｅｒｃｋ。

６０　Ｐ２５４）上で、下記溶媒系を使用して行った：Ａ、　ＭｅＯＨ／ＣＨＣ ］３（１０：９０　Ｖ／Ｖ）；　Ｂ。

ＭｅＯ）１／ＣＨＣｌ　−（２０：８０ν／Ｖ）；Ｃ，ｎ−ブａハ／−ル／Ｎｔ １３７ｔ＆Ｈ２０（６５：１５：５　Ｖ／Ｖ）又ハＤ。

ｎ−ヘキサン／酢酸エチル／トリエチルアミン（６０：３０：１０　Ｖ／Ｖ）。

短カラムクロマトグラフィー分離をシリカゲル（４０〜６３μｍ、　Ｍｅｒｃｋ 　Ｇ　６０）を用いて行った。

ＮＭＲスペクトルを、内標準としてＴＭＳを、又は外標準として８５％リン酸を 用い、ジェオ口（Ｊｅｏｌ）　ＪＮＭ　６ｘ４００分光計により記録した。

表題の化合物を、乾燥ピリジン（２００ｏｗｌ）に溶かしたデオキシシチジンヒ ドロクロリド（１）（５，２７ｇ、　２０　ｍｍｏｌ）及びＴＩＰＤＳｉＣＩｚ （８，２ｇ＋　２６　ｍｍｏｌ）から出発して、合成した。室温（ＲＴ）で−晩 攪拌した後、反応を前記溶媒系を用いてＴＬＣにより、調ｍｍｏｌ）及び乾燥ジ イソプロピルエチルアミン（５，５ａ＋１．３２　ｍｍｏｌ）を加えた。この反 応混合物を室温で一晩攪拌し、赤い反応混合物（３）を、飽和ＮａＨＣＯｓ溶液 に注ぎかつＣＨＣｌ５　（３ｘ２００　ｍｌ）で抽出することにより処理した。

有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させた。次いで、この残渣を、短シリカゲ ルカラムクロマトグラフィー（移動相において、エタノール２％を含むＣＨＣｌ 、）で精製した。

収率：　１０．２５　ｇ　（８２％）、溶媒系ＡにおけるＲ、　−０，６０：　 ’ＨＮＭＲ；　（ＣＤＣｌ２）：　７．８４＜ｄ、　２Ｈ，Ｊ＝８．３　Ｈｚ） ；　７．８１　（ｄ、　ＩＨ，Ｊ＝７．８Ｈｚ）　Ｈ，：　７．３０　（ｄ、　 ２Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）G　５，９８ （ｄ、　１）１．　Ｊ＝７．８Ｈｚ）　Ｈ６；　５．９０　（ｔ、　ＩＨ）　Ｈ ，’　；　４−５０〜３．７０（鶴４Ｈ）　ＩＩ、’　＋ＨC’　＋Ｈｓ’ ；　２．６０〜２．２０　（ａ２Ｈ）　Ｈｚ’　；　２．４２　（ｓ、　３Ｈ） 　トシル、１．２０〜０．９０　（ｍ、　２８Ｈ）。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｏｕｎｄ　Ｔａｂｌｅ　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｓ、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌ盾■奄モ≠■ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、”　Ｋｏｎｓｔａｎｚ　（Ｆ、Ｒ，Ｇ、）、　３２ 頁（１９８６）からのアブストラクト）　（７，０ｇ。

１４、９　［１０１）、及び１．６−ジアミツヘキサン（１７，３ｇ、　１４９ 　ａｉｏｌ）を、乾燥ピリジン（２００ｍｌ）に溶かした。この反応混合物を６ ０℃で、１８時間攪拌した。ＴＬＣを行っＣＨＣｌ、との間に分配することによ り処理した。合わせた有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、シリカゲルで フラッシュクロマトグラフィーを行って精製し、エタノール１５％を含αＨＣ１ ，で最初に溶出し、次いでエタノール３５％、トリエチルアミン３％を含αＨＣ ｌ５で溶出した。

収率：６．２７　ｇ　（７４％）−オイル、溶媒系ＣにおけるＲ、＝０．５３： 　ＩＨＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）：　７．７５　（ｄ、　ＩＨ）　Ｈｓ：　ｅ、　ｔ ｏ　（ｔ、　ＩＨ）　Ｈ，’　；　５．５８　（ｄ、　ＩＨ）　Ｈｓ：　４．３ ８　（ｑA　ＩＨ）　Ｈｚ　’ ；　４．１５〜３．７０　（ｍ、　３Ｈ）　Ｈ，’　＋　Ｈ，’　；　３．４３ 　（ｍ、　２Ｈ）；　２．７０　（ａ　２Ｈ）；　２．５５`２．２５ （ａ　２Ｈ）　Ｈｔ　’　；　１．６５〜１．２０　（ａ　８Ｈ）；　１．２０ 〜０．９０　（ａ　２８Ｈ）。

した。

化合物（４）（６，０ｇ、　１０．５　ｍｌ）を、乾燥ピリジン（５０ｍｌ）の 溶かし、乾燥ミリジンとともに共蒸発させ、トリフルオロ酢酸無水物（３，３ｇ 、　１５．７５　ｏｎｏｌ）を加えた。

この混合物を室温で３０分間攪拌し、標準的な重炭酸塩−クロロホルム抽出法に より処理した。有機相を蒸発させ、トルエンと共蒸発させ、この残渣を、乾慢テ トラヒドロフラン（２００ｍｌ）に溶かした。

この溶液に、アセトニトリル（５０ｍｌ、　２５　ｍｍｏｌ）に溶かしたＴＲＡ Ｐ　０．５　Ｍを加え、この混合物を室温で５分間攪拌しまた。この間に、溶媒 系ＡでＴＬＣを使用して調べた結果、（５）から（６）への完全な転換が起こっ ていた。

この反応混合物を、再び蒸発させて乾燥物とし、ピリジン（２Ｘ　１００　ｍｌ ）とともに２回、共蒸発させ、乾燥ピリジン（１００ｍｌ）に溶かした。塩化ジ メトキシトリチル（４，７５ｇ、　１４　ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を室温 で、６時間攪拌した。

標準的に処理した後、有機相を蒸発させ、トルエンとともに共蒸発させ、シリカ ゲルカラムクロマトグラフィー（移動相としてエタノール３％を含むＣＨＣｌ、 　）で分離した。

収率：　５．１１　ｇ　（６７％）オイル、溶媒系へにおけるＲｆ＝０．５１　 、’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＬｓ）：８．０５　（ｄ、　ＬＨ）　ＮＨＣＯＦ−；　７ ．７０　（ｄ、　２Ｈ，Ｊニア、５　Ｈｚ＞　Ｉｓ；　６．１４　（ｔ、　ＬＨ ）　Ｈ１’@；　５゜ ７ｏ　（ｄ、　ＬＨ，Ｊ＝７．５　Ｈｚ）　Ｈ＠：　４．６６　（Ｑ、　ｌ１ｌ ）　Ｌ　’　；　３．９５〜３．７５　（ａ＋、　２Ｈ）　g４’　、　Ｈｓ　 ’ ；３．３７　（ｔ、　２Ｈ）；　３．２９　（ｔ、　２Ｎ）；　２，５０〜２． ２３　（ｍ、　２８）　Ｈｚ’　；　１．６２〜１．３０　i＋ｓ。

８Ｈ）；１．１５〜０．９　（ｍ、　２８Ｈ）。

ロメタン（５０ｍｌ）に溶かした。この混合物を、０℃に冷却し、ジイソプロピ ルエチルアミン（４４６ｇ、　３４．５帥Ｏ１）、続いて（２−シアノエトキシ ）−Ｎ、　Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスフィン（３，２５ｇ、　１３． ８　ｍｍｏｌ）を加え、該混合物を室温で、３０分間攪拌した。この反応に続き 、溶媒系りでＴＬＣを行った。（８）の完全な消費が観察された。この混合物を 重炭酸す）＋Ｊウム冷飽和溶液（２００ｍｌ）に注ぎ、Ｃ）１２Ｃ１２で抽出し た。合わせた有機相を蒸発させ、トルエンとともに共蒸発させ、短シリｈ’ｆル カラムクロマトクラＶイ（”キサ７／ＣＨ＊Ｃ１２／ＥｔＪ３０：５０：２０Ｖ ／Ｖ）で精れた。

収率：５．５　ｇ　（８６％）、　溶媒系りにおけるＲ　Ｔ＝０．６７　、”Ｐ 　ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２）：　１４９．４１及び１４９．４６゜ ラベル化ユウロピウムキレート化合物をオリゴヌクレオチドに結合させるために 、プローブの５゛末端で、アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体（＋ｎｏ ｄＣ化合物８化合物８反 用した。オリゴヌクレオチドにラベルを結合させて修飾したヌクレオチドを含む 残渣を伴う合成を、他のＢ−シアノエチルアミヂトについて使用された方法と類 似した方法で行い、シチジン誘導体く図ＩＡ）を遺伝子アセンブラ−上の開いた 位置に配置した。分離されたオリゴヌクレオチドの純度を、ＦＰＬＣカラム（Ｐ ＥＰ　ＲＰＣ　ｌｌＲ５１５、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ）で、グラジェント溶出（緩衝液Ａ，　ＴＥＡＡｌｏｏ　ｍＭ．　 ＭｅＣＮ　１０％：　緩衝液Ｂ．　ＴＥＡＡ　Ｉｏｏ　ｍＭ．　ＭｅＣＮ　３０ ％，勾配二〇〜１００％Ｂ、５０分間，流速１　ｍｌ／分）で、調べた。この検 出を、２６０　ｎ１１１でモニターすることにより行った。

Ｃ．ユウロピウムによるオリゴヌクレオチドＳ９のラベル化Ｅｕ　３　＋ーキレ ート化合物をオリゴヌクレオチドに結合させるために、プローブの５゛末端で、 アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体く“修飾Ｃ”、”ａ＋ｏｄｃ”）で の延長を利用した。

オリゴヌクレオチドＳ９の配列は次のとおりである：Ｓ９　５°　（ａｏｄｃ） 　４．　ＡＣＣＡＧＡＧＴＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＧＧＧＣ　３’なお、この Ｓ９は、前記実施例で詳細に説明したように、合成し、かつ精製したものである 。

このオリゴヌクレオチドＳ９を、蒸留水５００μＩに懸濁し、この溶液を、蒸留 水と平衡させたＮＡＰ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ）を通した。蒸留水で溶出し、溶出液（　１　ｍｌ）を集めた後 、これを蒸留水を用いてＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を通し、溶出液（１．５ｍ１）を集めた。

蒸留水をブランクとし、オリゴヌクレオチドの濃度はくμｇ／ｍｌ）を３３ＸＡ （Ａは、２６０　ｎｍにおける記録された吸光度）と計算し、ＵＶ分光光度計で ２６０　ｎｍの光学密度を測定することにより、オリゴヌクレオチドＳ９の濃度 を測った。

オリゴヌクレオチド（１０ナノモル）を、サバント（Ｓａｖａｎｔ）高速真空濃 縮装置を使用しｔ、蒸発させて乾燥物とし、蒸留水５０μｍに再懸濁した。Ｉ　 Ｍ　Ｎａ．ＣＤ３（はぼ２．５μｍ　；炭酸ナトリウムの最終濃度は５０　ｍＭ ）を加えることにより、ｐＨを９．５に調節した。次いで、４００倍のモル過剰 のＥｕ”キレート化合物Ｗ２Ｏ１４　（ヨーロッパ特許第８８８５０２１８．４ 　（公開番号０２９８３９　、出願日１９８８年６月６日、出願人Ｋｗｉａｔｋ ｏｗｓｋｉら）のスキームの化合物１３参照：及び図ＩＢにも示されている。） を加え、この反応混合物を４℃に一晩保った。

続いて、この反応混合物を、ＤＮＡ　Ｇｒａｄｅ　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０ 　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のカラム（５０ 　Ｘ　１ｃｍ）にかけ、ＥＤＴＡ　５０　ＩＩＩＭを含むｐＨ７、　５の１０　 ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液と平衡にし、かつ溶出した。画分（２０　Ｘ　１　ｍｌ＞ を集め、２６０　ｎｍでモニターした。各両分１ｍｌにデルフィアエンハンスメ ント（Ｄｅｌｆｉａ　Ｅｎｈａｎｃｅａ＋ｅｎｔ）溶液（米国特許第４．　５６ ５．　７９０号．　１９８６年１月２１日発行）１ｍｌと混合し、アークス（Ａ ｒｃｕｓ）蛍光計（Ｐｈａｒ＋ｔ＋ａｃｉａ　Ｗａｌｌａｃ）を使用して蛍光を 測定することにより、Ｅｕのプロフィールを測定した。最初の主要なピークを有 する両分を集め、回収されたユウロピウム修飾オリゴスクレオチドの量を、ＵＶ 分光光度計により測定した。

Ｅｕ−ラベル化オリゴヌクレオチドＳ９を希釈して、Ｐ．ＤＴＡ　５０　ｓｋｌ を含むｐＨ７．　５の１０　０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ！ｉ衝液中の濃度５．６μＩ／ ｍｌとし、０、５ｍｌに等分して一２０℃で貯蔵した。

ビオチン分子を核酸に結合させるために、ＤＮＡプローブの３′末端の終わりか ら２番目の位置で、アミノ置換シチジンモノヌクレオチド誘導体（“修飾Ｃ”） の残基を使用した。

修飾Ｃを含むオリゴヌクレオチドＳｌｌの配列は次のとおりである：オリゴヌク レオチド別１を、標準プロトコールに記載されたポスポルアミシト化学を用いて 遺伝子アセンブラ−上で合成した。

このオリゴヌクレオチドＳｌｌを、蒸留水５００μｌに懸濁し、この溶液を、蒸 留水と平衡させたＮＡＰ−５カラムに通した。続いて、このカラムを蒸留水で溶 出し、溶出液（１ｍ１）を集めた。集めた溶出液を、同様の方法で、蒸留水を用 いてＩＩＡＰ−１０カラムを通した。蒸留水をブランクとし、ＵＶ分光光度計で ２６０　ｎｍの光学密度を測定することにより、溶離液の濃度を測った。オリゴ ヌクレオチドの濃度を、μ）；７ｍ　Ｉ　＋　３３　Ｘ、２６０　ｎｍにおける 吸光度の関係を用いて計算した。

次に、この試料を、エツベンドルフ管に移し、サバント高速真空濃縮装置を用い て、乾怪物にした。蒸留水５０μｌで再懸濁した後、ＩＭ　ＮａｚＣＯ−（はぼ ２．５μＩ；炭酸ナトリウムの最終濃度は５０　ｍＭ＞を加えることにより、Ｐ Ｉ（を９．５に調節した。適当な量（２〜５　Ｉ＋！ｇ）のビオチンアミドカプ ロエートＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｓｉｇｍａ、分子量４５４） を、乾慢Ｎ、１１−ジメチルポルムアミド（ＤＭＦ）１００μｌに溶かした。４ ０倍のモル過剰の活性ビオチンアミドカプロニー）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステルのＤＭＦ溶液を、修飾ＣオリゴヌクレオチドＳｌｌ溶液と混合し、室 温で３時間おいた。

この反応生成物を、蒸留水で希釈して５００μｌとし、ＥＤＴＡ　５０　ｍＭを 含むｐＨ７，５の１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液と平衡にし、ＮＡＰ−５カラム をとおした。このカラムを同じ緩衝液で溶出し、この溶出液（１ｍｌ）を集め、 同様な方法でＥＤＴＡ　５０μ閘を含むｐＨ７，５の１０　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩 衝液を使用して、再びカラム（ＮＡＰ−１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏ　Ｉｏｇｙ）をとおした。最終的な溶出液の容量は１．５ａ＋ ｌであった。

ｂ、ＢＳＡのビオチン化 生血ｆｉフルフミ７　（ＢＳＡ、　Ｓｉｇ＋ｎａ　Ａ−７９０６，分子量６７、 ０００　）　１０　ｍｇ　ヲ、５０　ｍＭＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９，５）溶液１ｍ ｌに溶かした。分離容器において、ビオチンアミドカプロエートＮ−ヒドロキシ スクシンイミドエステル（Ｓｉｇ＋ｎａ、分子量４５４）を、乾燥Ｎ、Ｎ−ジメ チルホルムアミド（ＤＭＰ）　２００μｌに溶かした。

５０倍モル過剰の活性ビオチンエステルを該ＢＳＡに加え、反応を室温で３゛時 間行った。続いて、この反応混合物に、ＮａＣｌ０，９％及びアジ化ナトリウム ０．５％を含む１０　ｍＭ　ｔｌＥＰＥｓ緩衝液（ｐｆｌ　７．５　）を加えて ２．５＠Ｉに希釈し、同じ緩衝液で平衡にし、Ｐト１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をとおした。この工程を、それぞ れの操作毎にもとの溶出液の半分を用いて、新しく調製したＰＤ−，１０カラム でビオチン化ＢＳＡを再度クロマトグラフィー処理することにより繰り返した。

精製された生成物を、使用するまで＋４℃で貯蔵した。

５、ストレブトアビジマイクロタイトレーションの調製ナンク（Ｎｕｎｃ）高結 合性プレートを、ＮａＣ１０，９％及びアジ化ナトリウム０．０５％を含む５０ 　ｍＭ　Ｋ２８ＰＯ４緩衝液（ｐＨ９，０）で、１００　ｎｇ／ｍｌに希釈した ビオチン化Ｂ５Ａ２００μｌ／ウエルで被覆する。次に、このプレートを６回洗 浄しくブレート洗浄器及び洗浄溶液（Ｄｉｌｆｉａ、　Ｐｈａｒ＋ｎａｃｉａ　 ｗａｌｌａｃ））　、アッセイ緩衝液（口１１ｆｉａ。

Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｗａｌｌａｃ）で２μｌ／ｍｌに希釈されたストレブトア ビジ（ＢＲＩｌ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ。

ＭＯ＞の溶液（ウェル当たり２００μｌ）を加え、そのプレートを室温で３時間 インキュベートし、最後に、使用する前に６回洗浄した。

フィコール−ハイバク５ｍｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ）　５＠Ｉを、１５　ｍｌ遠心分離管に入ね、抗凝固処理した血液 （５ｍｌ）を、このフィコール−ハイバクの上部に注意深く乗せ、２５０Ｏｒｐ ｍで、２０分間、卓上型遠心分離器で遠心分離した。

血漿を除き、リンパ球の帯をパスツールピペットで集めた。このリンパ球を、１ ｘｓｓｃ　（塩化ナトリウム０．１５　Ｍを含む０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ ム緩衝液（ｐＨ７，５＞１０ｍ１に入汰計数した。次に、この細胞を１５００　 ｒｐ＠で５分間遠心分離することにより集め、Ｉ　Ｘ５ＳＣ１容量で再懸濁し、 最終濃度を細胞１０６個／ｓｌとした。

臨床試料を、溶解工程（実施例７）を行うまで、この濃度で凍結して、維持した 。

ＣＯＳ　１０−１１．１細胞を使用して、定量的な測定を行うために、健康な提 供者のフィコール精製細胞の解凍懸濁液でこれらの細胞の希釈液を調製した。こ の調製は、細胞を混合し、エッペンドルフ遠心分離器で遠心分離し、得られたペ レットを、溶解工程（実施例７）で使用できるように１０００．０００個／ＩＩ ＩＩの濃度に懸濁した。

ｂ、常磁性ビーズ分離 旧Ｖ−陰性提供者からの血液１ｍｌに、実施例１に記載された方法と類似する方 法で調製した１１９３７　ミエローマ細胞から誘導し、かつ細胞１個当たり切形 （ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）プロウィルス旧ｖ−ＤＮＡを１ゲノム含む細胞を色々な 数（０，５０及び５００）で含むリン酸緩衝食塩水１ｍｌに混合した。

適切なコントロールを行うことにより、■９３７から誘導された細胞を除く全て の成分を含む管を準備した。混合後、ヒ）ＣＤ４レセプターと共有結合した抗体 を含む商業的に入手できるダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、製品番号１１１ ０６）を、２０倍の過剰（１００μｌ　９１％液）で容管に入れ、振盪しながら ３０分間インキュベートした。

このビーズを磁石を用いて分離し、最終的に、溶解工程（実施例７参照）に用い るために、ｌ　ｘＳＳＣ０，５ｍｌに懸濁した。

７、溶解工程 細胞斐濁液（総細胞数２５０．０００個）を等量（２５０μｍ）ずつ、滅菌した ０、５ａ＋１エツペンドルフ管に入ｔ’Ｌ、４．０００　ｒｐｍで２分間、エッ ペンドルフ遠心器で遠心分離した。上清を除いた後、蒸留水３０μｍ及び関連す るプライマ一対（１０ｍｋｌ）ＩＪス　ＨＣＩ　ｆｆＥ衝液（ｐＨ７，７）に入 れたもの）の混合物を加え、細胞ペレットを再懸濁した。

）１１Ｖ−−プロウィルスＤＮＡの存在を確認するため細胞を分析する場合、Ｈ ＩＶのＬＴＲ部位とハイブリッド化し、その部位の一部の合成を開始することが できる、下記プライマーを使用する： ５’　ＧＧＡＭ：ＣＣＡＣＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣ３’　（Ｓｌ）及び５’　ＧＧ ＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴ（：Ｔ［ＴＡＧ　３’　（Ｓ２）次にその細胞を、１２１ ℃で１０分間（若干の研究では２０分間）、オートクレーブ処理し、実施例８に 従って増幅する。

８増幅工程 この増幅を伴う工程は、試料の交差的な汚染を避けるために、二次的なハイブリ ッド形成工程用に設計された所から分離された領域で行った。

ＰＣＲを介す増幅工程の前に、ＰＣＲマスター（Ｍａｓｔｅｒ）混合物を、下記 のように調製した。１＠Ｉにつき、７２０　ｕｌ　（２ｘ）の増幅緩衝液（２０ ｓＭトリスー１１ＣＩ、ｐ）１８．４　成分ＮａＣ］　１００　ｆｆ１Ｍ、　Ｍ ｇＣ］、　５　ｍＭ、ゼラチン０．４　ａ＋ｇ／ｍｌ及び４００　ｄＮＴＰ（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））４００　μＭ及び １４０　μｌ　ＴＡＱボリメラーセ（１０ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，４：成 分ＫＣＩ　３００酬、　ＤＤＴ　２威１！ＤＴＡ　１００μＭ、ゼラチン２００ μｇ／ｍ　！及びグリセロール５０％）を含む。この混合物を、使用するまで氷 の上に置いた。

新しく再懸濁したリンパ球をオートクレブで処理し、次に実施例７に記載したよ うに氷の上で冷却した。その後、この消化物をエッペンドルフ遠心分離器で簡単 に遠心分離しペレット濃縮水とした。ＰＣＲマスター混合物７０μｌを、容管に 加え、次いで軽質鉱油（Ｓｉｇｍａ、　Ｍ−３５１６）１００μｌを加えた。そ の管にキャップをして、よく混合し、エッペンドルフ装置で再び遠心分離した。

次に、この管をサーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）に 移した。この装置には、次の熱サイクルがプログラムされていた：９５℃５０秒 ；５５℃２分間；７３℃２分間である。これを３０サイクル実施した。各ウェル に鉱油を１滴加えることにより、効果的な熱移動が達成された。

サイクル終了後、試料をサーモサイクラ−から取り出し、ＡＢＣ分析を行うため に分離ゾーンに移動した。分離ゾーンに移すまで、管を開けないように注意した 。

９、ハイブリッド形成及び検出 ハイブリッド形成をする前に、溶液を次のように混合した。

ノゾブリッド形成溶液１ｍｌ当たり、５００μｌの２×ハイブリツド形成緩衝液 ストツク（ＮａＣＩ　１．　Ｉ　Ｍ、　ＥＤＴＡ　２２０４Ｍ及Ｕ′ｒｗｅｅｎ −２００，１％を含む１１０　ｍＭ　ＨＥＰ［ＥＳ緩衝液）、蒸留水４８０μｌ 、ビオチンイ１３ＳＡ（５，６μｇ／ｍ１）１０　μｌを加えた。

増幅生成物ｌＯμＩを、０．５＠Ｉエツペンドルフ管に移した。この移動された 溶液を、９５℃で８分間加熱し、氷上で２分間冷却し、（エッペンドルフ遠心分 離器を使用して）遠心分離した。次に、ハイブリッド形成溶液９０μｌを加え、 混合し、遠心分離した。この混合物をインキュベーター内に、５５℃で１時間維 持した。続いて、ハイブリッド形成反応混合物（１００μｌ）を、実施例５で調 製したストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートのウェルに移した。溶 液（アッセイ緩衝液、Ｄｅｌｆｉａ　Ｐｈａｎｏａｃｉａ　Ｗａｌｌａｃ、最終 的なＮａＣｌ濃度が１モル／リットルとなるように塩化ナトリウムを供給する。

）１００μｌを、各ウェルに加え、そのプレートを振盪しながら、室温で１時間 インキュベートした（プレート振盪、ＰｈａｒｍａｃｉａＷａｌｌａｃ）。次い で、このプレートを洗浄溶液（前記部分参照）を使用し、プレート洗浄器で６回 洗浄した。最後の洗浄溶液を除去した後、各ウェルにエンハンスメント溶液（Ｄ ｅｌｆｉａ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　１ｌａｌｌａｃ、　ｃａｔ、　Ｎｏ、１２ ４４−１０５）　２００　μｍ加えた。

このデルフィアエンハンス溶液及びその使用については、米国特許第４．５６５ ．７９０号（１９８６年１月２１８発行）に開示されている。簡単に述べると、 ２−ナフトイルトリフルオロアセトン（２−ＮＴＡ）　１５μ閣、トリオクチル ホスフィンオキシト（ＴＯＰＯ）５０μｍ及びトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−４ ０００，１％を含み、フタル酸カリウム水素塩を用いて、ｐＨ３，２に調整した ０、１Ｍ酢酸緩衝液を含む溶液２００μｌを加えることにより、ユウロピウムを 放出させ、ラベルの蛍光性を増加させた。このマイクロタイタープレートを、再 び室温で２５分間振盪し、次いで、γルクスＴＲ−蛍光計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ 　Ｗａｌｌａｃ）を使用して蛍光を測定し、時間−解像蛍光を測った。遅延時間 ５０マイクロ秒と計測時間２５０マイクロ秒を伴う１秒間の総測定時間で、キセ ノンフラッシュランプ（１００ＯＨｚ）を使用するシグナル光計数時間解像蛍光 計により、様々な表示時間に蛍光を測定した。この時間解像蛍光計及び関連する 機器を用いる方法は、米国特許第４．０５８．７３２号に開示されているもので あって、試料を短時間のレーザーパルスで励起させ、ノイズ源からの蛍光を遮断 した場合のみに、蛍光を測定するものである。

表２は、フィコール−ハイバク分離（実施例６Ａ）及び実施例７に記載された加 熱処理を組み合わせた場合に得られる標準曲線を示す。この加熱処理は、健康な 供給者から分離されたリンパ球２５０．０００個をバックグラウンドとして希釈 した一連のＣＯ５１０−１１，１細胞について、オートクレーブ処理を１０分間 行うことにより、実施した。しかし、この場合、試料をプライマーＳ、及びＳ、 （表１）を用いて、ＰＣＲ増幅を行い、旧Ｖの特定の核酸を、ＡＢＣサンドイッ チ分析法（実施例９）において、ユウロピウムラベル化５９及びビオチン化３１ １を使用して検出した。

表２ 表２のデータは、この分析法が、１０００．０００個のバックグラウンドから僅 か５個の細胞にあるＨＩＶを検出するのに十分な程の感度であり、バックグラウ ンド細胞１０００、０００個当たり、１０−１１．Ｉ　ＣＯＳ細胞５個〜４０個 の範囲でほぼ直線的な値を示すことを示している。各データは、３回の独立した 分析の平均値である。細胞を１１５℃で３０分間加熱した場合、同じような結果 が得られた。

表３は、プロウィルスＤＮＡを含む各種濃度のＣＯＳ　１０−１１．１細胞を最 初にヒト血液試料に加え、磁性ビーズ（実施例６Ｂ）に共有結合している抗ＣＤ ４抗体と反応する表面結合ＣＤ４レセプターを介して、分離した場合に得られた データを示す。

表３ 試料　血液に加え、次いで、　加熱処理、ＰＣＲ１Ｓ０４細胞を分離した　ＡＢ Ｃ後のＣＰＳプロウィルスＨＩＶ−ＤＮＡ を含む■９３７細胞 実際の臨床試料について本発明の有用性をさらに試験するために、約１０６個の 細胞を含むリンパ球試料８検体を、ＩＩＩＶ（に感染したそれぞれの人から得た 。これらの試料を、牛胎児血清４０％及びＤＭＳＯＩＯ％を含む培地中で凍結さ せ、細胞２５０゜００個ずつに分割した。ＰＣＲを行う前に、８２０３０μＩに 再懸濁し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、　５分間）してベレット化した。）ＩＩ Ｖ−１感染者から得たリンパ球試料（試験あたり２５０．０００個）を、実施例 １０に記載されたＰＣＨに基づ＜　ＡＢＣハイブリッド形成分析法で複製するこ とにより試験した。血清が陰性の健康者３人から得た細胞を陰性コントロールと して使用した。陰性の３検体の平均値から得た二重平均シグナル（５７５７ＣＰ Ｓ）を、この分析の陽性を区別する基準とした。表４は、旧ソ−１感染患者から 得た試料が、この分析において全て強い陽性シグナルを出し、最も低い陽性のシ グナルが陰性コントロールの６倍以上であることを示している。

表４ 臨床試料からのＨＩＶ、−１核酸の検出シグナル　平均シグナル 患者＃　感染／非感染　（ＣＰＳ）　（ＣＰＳ）　＋／−１非感染　５７６１ ２　〃　７７５９ ３　〃　５６４４ ４　感染　８１５２０ ７８３６６　８００３９　＋ ５　〃　９９９６０ １０６３６５　１０３１６３　＋ ６　〃　８１５２０ ７２４００　７６９６０　＋ ７　”　９３３９０ １６６４８３　１２９９３７　＋ ８　〃　５７２０３ ９４６１０　７５９０６　＋ ９　〃　４７０５４ ２９２２７　３８１４０　＋ １０　〃　２０４１４１ ２１０６３０　２０７３８５　＋ １１　〃　１６９２０８ １７０７８７　１６９９９７　＋ 同様に、旧Ｖ陽性提供者から得た臨床サンプルの一部から、フィコール−ハイバ ク遠心分離法に従って、細胞を分離し、本発明の方法に従った前処理として、オ ートクレーブ処理を１０分間行った。表５は、陽性を示す全ての試料を明らかに する、この分析の結果を示すものである（この分析における陰性コントロールは 、５８４１ＣＰＳである。） 陰性コントロール：５８４１ＣＰＳ シグナル　平均シグナル 患者＃　感染／非感染　（ＣＰＳ）　（ＣＰＳ）　＋／−１感染　１１１０４７ １６４６９４　１３７８７１　＋ ２　〃　１５０５２０ １９６７３２　１７３．６２６　＋ ３　”　２７４９７８ １７７５７２　２２６２７５　＋ ４　〃　３３０３０１ ３６９２３１　３４９７６６　＋ ５　”　１９２５９４ ５５６６７　９７２５６　＋ ６ノ’１０５８４３ ８８６７０　９７２５６　＋ ７　〃　２１３４１１ ２１８０９０　２１５７５０　＋ ８　〃　２２５４５１ ２９２７１８　２５９０８４　＋ ９　”　１１９１３１ １２７４０４　１２３２６７　＋ １０　”　１１９３１１ １１０９５０　１１５１３１　＋ １１　〃　２７７１１１ ２９２２５３　２８４６８２　＋ １２　〃　１３０６８８ １９４８７９１６２７８４　十 １３　”　２８９０５１ ２３８５７９２６３８１５　十 １４　〃　２１６３２７ ２５６１１？　２３６２２２　十 １５　〃　１２４１８１ １１６８２９１２０５０５　＋ １６　〃　７９０１０ ９９７６４８９３８７　十 １７　”　８６００５− ７０３５０　７８１７７　＋ ＨＴＬＶ−Ｉ＋　ウィルスを、５゛及び３゛のＰＣＲプライマーとして表１のオ リゴヌクレオチドＰ１及びＰ２、ビオチン化プローブＰ３、ユウロピウムラベル 化Ｐ４　（表１）を用い、実施例７の加熱前処理法を使用して、細胞（ＡＴ（： Ｃ零ＣＲＬ８０６６）において特異的に検出した。要約すると、細胞を所定の溶 液に入れる前に、細胞（水中に細胞２５ｏ、　ｏｏｏ個）を加熱処理し、遠心分 離した。この溶液には、１０ｍＭ１−ＩＪス−ＨＣｌ　ｐＨ８，４（成分ＭｇＣ Ｉｚ　２．５　ｍＭ、　ｄＮＴＰ’　ｓ　２００　ｍＭ、ゼラチン０．２　ｍｇ ／ｍｌ、　ＮａＣｌ　５０　ｍＭ）及びＰＣＲプライｙ−ｐｌ及びＰ２　（表１ ）各０．５μＭならびにＴＡロポリメラーゼ１単位（Ｐｅｒｋｉ−Ｅｌｍｅｒ　 Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）が含まれ、総容量は１００μｌであっ た。

９５℃５０秒、６３℃２分間、７３℃２分間のサイクルを２７サイクル実施する プログラムを用いて、サーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　（：ｅｔ ｕｓ）を稼働させた。

ビオチン化プローブＰ３及びユウロピウムラベル化プローブＰ４　（表１）を用 いて、１１ＴＩ、Ｖ−１１ウィルスを検出した他は、前記工程で調製した総ＰＣ Ｒ混合物の１０％を、八８［ザンドイッチハイブリッド形成（実施例９）におい て分析した。

へＢＣサンドイッチハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表６Ａに示す ように通常のリンパ球２００．０００個を含む試料の感染細胞数が極めて少なく とも検出を可能にする。

表６Ａ ＨＴＬＶ−ＩＩ検出アッセイ １．２　６．８８４ ２４　１１．１２１ ４８　２５．７１５ ７２　３８．１７６ ９６　４８．８５５ １４４　７８．３８７ １９２　１００．８０７ １）表示された感染細胞数を、通常のリンパ球２００．０００個と混合した。

２）前記のとおり時間−解像蛍光計により測定した結果、２００．０００個の通 常リンパ球により、１分間あたり３７７の計測数が得られた。表示したＵＰＳは 、バックグラウンド値を引いた後の３試料の平均である。

ｂ、ＨＴＬＶ−１ノ検出 ＨＴＬＶ−Ｉ　ウィルスを、５゛及び３“のＰＣＲプライマーとして表１のオリ ゴヌクレオチドＰ５及びＰ６、ビオチン化プローブＰ７及びユウロピウムラベル 化Ｐ８　（表１）を用い特異的に検出ｊ−た。

要約すると、細胞試料を溶液に入れる前に、細胞（水中に細胞２５０．０００個 ）を加熱処理し、遠心分離した。この溶液には、１０ｍＭ）ＩＪス−）１［：Ｉ 　ｐＨ８，４（成分Ｍｇｃ１２２．５　ｍＭ、　ｄＮＴＰ’ｓ　２００　ｔｔＭ 　、ゼラチン０．２　ｍｇ／ｍｌ、　Ｎａ１ｌ　５０　ｄ）及びＰＣＲプライ７ −Ｐ５及びＰ６　（表１）各０．５ｕ−ならびにＴＡロポリメラーゼ（Ｐｅｒｋ ｉ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）　１単位が含まわへ総 容量は１００μｌであった。反応混合物を含む管を、９５℃５０秒、６０℃２分 間、７３℃２分間のサイクルを３０サイクル実施するプログラムを用いて、サー モサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ＞でインキュベートした 。

ビオチン化プローブＰ７及びユウロピウムラベル化プローブＰ８　（表１）を用 いて、ＨＴＬＶ−１ウィルスを検出した他は、前記工程で生成したＰＣＲ混合物 の１０％を、ＡＢＣサンドイッチハイブリッド形成（実施例９）で分析した。

ＡＢＣサントイツナハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表６Ｂに示す ようにリンパ球の試料において感染細胞数が極めて少なくとも検出を可能にする 。

表６Ｂ ＨＴＬＶ−１臨床試料 試料　ＩＡ　１１．５０６ 試料　２Ａ　１７，５０７ 試料　３Ａ　３５，１２３ 試料　４Ａ　２８８，９５０ 試料　５Ａ（非感染）　１．　２４０ サケ精子ＤＮＡ　９４６ １０ＨＴＬＶ−Ｉｔ　感染細胞　１，１７５ＨＶＴ　１０２　（ＡＴＣＣ＃Ｔ　 Ｉ　Ｂ　１６２）の１０−１００　細胞　６０，０００ １）前記のとおり時間−解像蛍光計により測定された１分間あたりの計測数。

ｃ、ＨＩＶ−２の検出 ）１１Ｖ−２ウイルスを、５゛及び３′のＰＣＲプライマーとして表１のオリゴ ヌクレオチドＰ９及びＰｌｏ、ビオチン化プローブｐＨ及びユウロピウムラベル 化Ｐ１２（表１）を用い、旧Ｖ−２感染ＭｏＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ葬ＣＲＬ１ ５８２）から分離したＤＮＡにおいて特異的に検出した。要約すると、ＤＮＡを 細胞から分離し、実施例７の加熱前処理法を使用して、表示された細胞と同じ量 に希釈した。このＤＮＡを所定の溶液と混合した。この溶液には、１０−トリス −ＨＣｌ　ｐＨ８，４Ｃｌｅｔ分ＭｇＣｌ２２．５　ｍＭ。

ｄＮＴＰ’　ｓ　２００　、ｌｊＭ　、ゼラチン０．２　ｍｇ／ｍ１．　ＮａＣ ｌ　５０　ｍＭ＞及びＰＣＲＣラブ７−ＰＬ及びＰ２　（表１）各０．５ｕＭな らびにＴＡＱポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗ ａｌｋ、　ＣＴ）　１単位が含まｔ′Ｌ、総容量は１００μｍであった。反応混 合物を含む管を、９５℃５０秒、６５℃２分間、７３℃２分間のサイクルを３０ サイクル実施するプログラムを用いて、サーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ　（：ｅｔｕｓ）でインキュベートした。

ビオチン化プローブｐＨ及びユウロピウムラベル化プローブＰ１２（表１）を用 いて、旧シー２ウィルスを検出した他は、前記工程で生成した総ＰＣＲ混合物の １０％を、ＡＢＣサンドイッチハイブリッド形成（実施例９）で分析した。

ＡＢＣハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表６Ｃに示すようにＤＮＡ が極めて少なくとも検出を可能にする。分析を行う前に、ＨＩＶ−２感染ＭｏＬ Ｔ−４細胞から分離されたＤＮＡを、酵素生産者の指示書に従って制限エンドヌ クレアーゼＥｃｏ　Ｒ１で消化した。

表６０ （Ｃｅｌｌ　Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ） １　１０．４２５ ５　３８．９６９ １０　５３．４１３ ２５　９４．０９３ ５０　１６４．８１０ １００　２４３．５３２ ２５０　３０２．９０４ ｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２））に記載されているフェノール抽出を 使用して、ＨＩＶ−２感染ＭｏＬＴ−４細胞（ＡＴＣＣ霧ＣＲＬ１５８２）から 分離したＤＮＡの細胞当量（２）前記のとおり時間−解像蛍光計により測定され た１分間あたりの計測数。

ｃ、ＨＩＶ−１の検出 ＨＩＶ−１ウイルスを、５′及び３゛のＰＣＲプライマーとして表１のＰＣＲプ ローブＰ１３及びＰＬ４　、ビオチン化プローブＰ１５及び１７ならびにユウロ ピウムラベル化Ｐ１６及びＰＩ３（表１）を用い、ＣＯ３１０−１１細胞におい て特異的に検出した。要約すると、ＤＮＡを細胞から分離し、実施例７の加熱前 処理法を使用して、表示された細胞当量と同じ量に希釈した。このＤＮＡを所定 の溶液と混合した。この溶液には、１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ｐ）Ｉ　８．４　 （ｄ分ＭｇＣｌ２２．５　ｍＭ、　ｄＮＴＰ’　ｓ　２００．１４Ｍ　、ゼラチ ン０．２　ｍ３／ｍ！、　ＮａＣ１５０ｍＭ）及びＰＣＲプライマーＰ１３及び ＰＬ４（表１）各０．５μＭならびにＴＡＱポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉ−Ｅｌｍ ｅｒ　Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）　１単位が含まれ、総容量は１ ００μｍであった。反応混合物を含む管を、９５℃５０秒、６５℃２分間、７３ ℃２分間のサイクルを３０サイクル実施するプログラムを用いて、サーモサイク ラ−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）でインキュベートした。

ビオチン化プローブＰ１６及びＰＩ３（表１）を用いて、十及び−ＰＣＲ増幅鎮 増幅量した他は、前記工程で生成したｍＰｃＲ混合物の１０％を、実施例９に従 ったＡＢＣサンドインチハイブリッド形成で分析した。

ＡＢＣハイブリッド形成と組合わせた加熱前処理は、表６０に示すように各試料 におけるバックグラウンドとして非感染リンパ球２５０．０００個の間にある極 めて数が少ない細胞の検出を可能にした。

（１）非感染リンパ球２５０．０００個を含むサンプルに存在する感染ＣＯＳ　 １０−１１細胞の数。

（２）時間−解像蛍光計により測定された１分間あたりの計測数の試料３検体の 平均値。

１３、細胞溶解の温度効果 特定のゲノムＤＮＡ配列を検出する能力にあける温度前処理の効果を更に試験す るために、分離された細胞を１１５℃で１０分間前処理し、実施例１０に記載し た方法を使用して１００℃で１０分間行った前処理と比較した。この研究の結果 （そのデータを表７に一般的に示した。）によると、１００　℃で前処理を行う と、平均バックグラウンドを越えるシグナルの発生は無かったが、１１５℃で前 処理を行うと平均バックグラウンドを越えるシグナルが発生した。したがって、 細胞を１１５℃で前処理するさ分析法の感度を十分に増加させ、これにより試料 で検出できる特定のゲノムＤＮＡ配列の量を低下させることができる。

表７ 予備処理の温度の効果９ １　６５６２’　３９２６５ ’　３　３７１１　３７８２３ 平均　５９０９　２２５６０ 平均のバック グラウンド値　８１１５ ７８ヱＡ １、ＨＩＶ−１陰性リンパ球のバックグランドで希釈した）ＩＩＶ−Ｉ　ＩＩｉ 性コントロール細胞（［：０ＳＩＯ−１１，１細胞）　（比率ＣｌＸｌ０’）２ 、前記のとおり時間−解像蛍光計により測定された１分間あたりの計測数（ＣＰ Ｍ）。

１を血清タンパク質にょるＰＣＲ分析法による検出の阻害細胞の特定の核酸配列 を検出する能力に対する血清タンパク質の効果について試験を行った。ヒトリン パ球２５０．０００個のバックグランドに混合したＣＯＳ　１０−１１．１細胞 ５０個を含むように、細胞外（血清）タンパク質を実買的に含まない細胞試料を 調製した。異なる量（１０μｍ又は３５μりの血清を、幾つかの試料で水と置き 換え、表８に示すようにそれぞれ細胞外血清タンパク質を約２９％（Ｖ／Ｖ）及 び１００％（Ｖ／Ｖ）を含むＰＣＲ反応混合物を調製した。実施例１ｏに記載さ れているように緩衝液、ｄＮＴＰ、プライマー及びポリメラーゼを加えた後、こ の試料を１１５℃で３０分間加熱することにより前処理した。オイルを被せ、Ｐ ＣＲを３０サイクル行った。表８に示すようにこの研究の結果は、血清タンパク 質の存在が、ＰＣＲ分析法において陰性コントロール（バックグラウンド）の値 にさえ達成することを阻害する。同じ結果が、血清に代えて血漿を使用しても得 られた。

２９％ν／Ｖ血清　１００％ν／Ｖ血清　実質的に＃１　＃２　＃１　＃２　含 有せず ６６７　７４４　３３７　４４８０　４７．１５１４３８　５０３　４１９　６ ６３　２９．２８５４９１　６０３　４８６　５５３　３３．０７４５３２　６ １７　４１４　１８８９　３６．５０３陰性細胞 １、実施例９に記載された時間−解像蛍光計により測定された１分間あたりの計 測数。

これまでの記載及び実施例は、説明を意図するものであって、制限を行うもので はない。本発明の思想及び範囲における他の変形が、さらに可能であり、当業者 にとってこのことは容易に明らかになることである。

国際調査報告

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．血液試料に含まれている特定の核酸配列を検出する方法であって、含有する 細胞外タンパク質が８０ｍｇ／ｍｌ未満の水性培地に、ゲノムＤＮＡを有する細 胞を分離する工程、及びこの細胞を少なくとも約１０５℃の温度に、少なくとも 約５分間さらす工程を含む方法。
2. ２．血液試料から細胞を分離する手段として密度勾配遠心分離法を使用する請求 の範囲第１項記載の方法。
3. ３．血液試料から細胞を分離する手段として、固体の支持体に付着させた、該細 胞に結合する抗体を使用する請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．固体の支持体が、常磁性体である請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．固体の支持体がビーズの形態である請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．固体の支持体がビーズの形態である請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．加熱処理時間が、５〜２０分間である請求の範囲第１項記載の方法。
8. ８．抗体が、ＣＤ４細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の範 囲第３項記載の方法。
9. ９．抗体が、ＣＤ８細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の範 囲第３項記載の方法。
10. １０．抗体が、ＣＤ２細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の 範囲第３項記載の方法。
11. １１．抗体が、ＣＤ３細胞表面レセプターと特異的に反応するものである請求の 範囲第３項記載の方法。
12. １２．分離された細胞の加熱処理を、１０５℃〜１２５℃の範囲の温度で、少な くとも約１０分間行い、これにより加熱処理試料を形成する請求の範囲第１項〜 第１１項のいずれか１項記載の方法。
13. １３．加熱処理試料の一部に、特定の核酸配列の相補体の合成開始を可能にする 第１ポリヌクレオチド合成プライマー、及び該特定の核酸配列の合成開始を可能 にする第２ポリヌクレオチド合成プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を 少なくとも１回行う、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．ハイブリッド化条件下で、ポリメラーゼ連鎖反応生成物を、親和性ラベル 化ポリヌクレオチドプローブ及びリポーター基ラベル化ポリヌクレオチドプロー ブ（それぞれのプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応生成物の一本鎖ＤＮＡの異な る異なる部位とハイブリッド化して、親和性ラベル及びリポーター基との結合を 有するＤＮＡ二本鎖を形成することができる。）で処理し、このＤＮＡ二本鎖を 、結合条件下で、ＤＮＡ二本鎖の親和性ラベルと結合できる固相親和性吸着剤で 処理し、次いで、固相リポーター基ラベル化ＤＮＡ二本鎖を形成し、かつこの固 相リポーター基ラベル化ＤＮＡ二本鎖の量を測定する、請求の範囲第１３項記載 の方法。
15. １５．前記親和性ラベルが、ピオチンである請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．前記親和性ラベルが、固相抗ジニトロフェニル抗体と結合するジニトロフ ェニル化核酸である請求の範囲第１４項記載の方法。
17. １７．前記リポーター基が、酵素である請求の範囲第１４項記載の方法。
18. １８．前記リポーター基が、放射活性アイソトープである請求の範囲第１４項記 載の方法。
19. １９．放射活性アイソトープが、３２Ｐ、３５Ｓ及び１２５Ｉからなる群より選 ばれる請求の範囲第１８項記載の方法。
20. ２０．リポーター基が、蛍光性ラベルである請求の範囲第１４項記載の方法。
21. ２１．蛍光性ラベルが、ランタン系列元素である請求の範囲第２０項記載の方法 。
22. ２２．ランタン系列元素がユウロピウムである請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．リポーター基が、アクリジニウムエステルである請求の範囲第１４項記載 の方法。
24. ２４．特定の核酸配列が、病原体の特定の核酸配列である請求の範囲第１３項記 載の方法。
25. ２５．病原体の特定の核酸配列が、ヒトレトロウィルス病原体に対応する配列で ある請求の範囲第２４項記載の方法。
26. ２６．プライマー及びプローブが、血液ボーン（ｂｏｒｎｅ）病原菌に対し、特 異的である請求の範囲第１３項記載の方法。
27. ２７．プライマー及びプローブが、ヒト免疫不全ウィルスに対し、特異的である 請求の範囲第１３項記載の方法。
28. ２８．プライマー及びプローブが、ヒトリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｔｏｒｐｉｃ） ウィルスタイプＩに対し、特異的である請求の範囲第１３項記載の方法。
29. ２９．第１ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列 を有し： ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＡＴＣＣＴＧＣ第２ポリヌクレオチドプライマー が、下記式に対応するヌクレオチド配列を有する： ＴＡＧＧＧＡＡＧＣＣＡＴＴＧＴＧＧＣＣＴＣ請求の範囲第２８項記載の方法。
30. ３０．プライマー及びプローブが、ヒトリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｔｏｒｐｉｃ） ウィルスタイプＩＩに対し、特異的である請求の範囲第１３項記載の方法。
31. ３１．前記ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列 を有し： ＣＡＡＣＡＡＴＴＡＧＣＡＧＣＣＧＴＣＣＴＣ第２ポリヌクレオチドプライマー が、下記式に対応するヌクレオチド配列を有する： ＡＧＴＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＴＡＧＣＴＧ請求の範囲第３０項記載の方法。
32. ３２．前記特定の核酸配列が、ＨＩＶ−２特異性であり、第１ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し：ＣＣＡＣＧＣＴＴＧ ＣＴＴＧＣＴＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣ第２ポリヌクレオチドプライマーが、下記式 に対応するヌクレオチド配列を有する： ＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＣＴＣＧＧＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧ請求の範囲第１３項記載 の方法。
33. ３３．前記特定の核酸配列が、ＨＩＶ−１特異性であり、第１ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し：ＣＴＴＡＡＧＡＣＡ ＧＣＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧ第２ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応す るヌクレオチド配列を有する： ＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＡＴＡＡＡＣＣＣＧ請求の範囲第１３項記載の方法。
34. ３４．前記特定の核酸配列が、ＨＩＶ−１特異性であり、第１ポリヌクレオチド プライマーが、下記式に対応するヌクレオチド配列を有し：ＧＧＡＡＣＣＣＡＣ ＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣ第２ポリヌクレオチドプライマーが、下記式に対応するヌ クレオチド配列を有する： ＧＧＴＣＴＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＧ請求の範囲第１３項記載の方法。
35. ３５．水性培地のｐＨ値が、６．０〜８．５の範囲である請求の範囲第１３項記 載の方法。
36. ３６．細胞からゲノムＤＮＡを放出させる方法であって、含有する細胞外タンパ ク質が８０ｍｇ／ｍｌ未満の水性培地に、ゲノムＤＮＡを有する細胞を分離する 工程、及びこの分離細胞を少なくとも約１０５℃の温度に、少なくとも５分間さ らす工程を含む方法。
37. ３７．水性培地に含まれる細胞外タンパク質が４０ｍｇ／ｍｌ未満である請求の 範囲第３６項記載の方法。
38. ３８．細胞からゲノムＤＮＡを放出させる方法であって、（ａ）ヘモグロビン及 び赤血球を実質的に含まず、含有する細胞外タンパク質が８０ｍｇ／ｍｌ未満で ある水性培地に、ゲノムＤＮＡを有する細胞を分離する工程；及び（ｂ）この分 離した細胞を、少なくとも１０５℃の温度で、少なくとも５分間、大気圧を越え る蒸気圧にさらす工程を含む方法。
39. ３９．温度が１１０〜１２５℃の範囲であり、加熱処理時間が１５〜３０分間で ある請求の範囲第３８項記載の方法。
40. ４０．複製機能不全ヒト免疫不全ウィルスゲノムに機能的に結合したＤＮＡトラ ンスファーベクターを含む組換えＤＮＡ分子。
41. ４１．前記ゲノムが、ｇａｇ−部位遺伝子を発現できないものである請求の範囲 第４０項記載の組換えＤＮＡ分子。
42. ４２．前記ゲノムが、ゲノムからｍＲＮＡを生じさせるスプライスドナーシグナ ルを含まない、請求の範囲第４０項記載の組換えＤＮＡ分子。
43. ４３．請求の範囲第４０項記載の単一組換えＤＮＡ分子を、そのゲノムに組込ん だ細胞。