JP3418401B2 - トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法 - Google Patents
トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法Info
- Publication number
- JP3418401B2 JP3418401B2 JP50833395A JP50833395A JP3418401B2 JP 3418401 B2 JP3418401 B2 JP 3418401B2 JP 50833395 A JP50833395 A JP 50833395A JP 50833395 A JP50833395 A JP 50833395A JP 3418401 B2 JP3418401 B2 JP 3418401B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- probe
- seq
- dna
- chlamydia
- target dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
クラミジア属の微生物は、真核細胞の真正細胞内寄生
虫である。それは宿主細胞で生育増殖し、細胞の細胞質
に封入体（inclusion）を形成し宿主の臨床的症状の原
因となる。 クラミジア属は３つの異なる種からなる。即ち、Chla
mydia psittaci,Chlamydia trachomatis,Chlamydia pne
umoniaeである。これらの種のうち、Chlamydia trachom
atis及びChlamydia pneumoniaeは結膜炎、トラコーマ生
殖器感染、肺炎などの病気の原因となるヒトに一般的な
病原菌である。 Chlamydia trachomatisを検出するために、臨床標本
を真核細胞培養単層の上に接種し、48時間以上インキュ
ベートし、その後ヨウ素又はギムザで染色する。Chlamy
dia trachomatis抗原を検出するために、及びクラミジ
ア感染に反応して産生される抗体を検出するために、種
々の免疫蛍光アッセイも使用される。クラミジア抗原の
検出のための免疫蛍光の使用には、クラミジアを含む疑
いのある臨床標本を、クラミジア抗原に対するフルオレ
セインイソチオシアネート（FITC）で標識したモノクロ
ーナル抗体に接触させることが含まれる。 抗クラミジア抗体の検出のための免疫蛍光技術にはミ
クロ免疫蛍光（MIF）及び間接免疫蛍光が含まれる。MIF
アッセイは、顕微鏡のスライドに精製した微生物を固定
することにより行う。MIF及び間接免疫蛍光の両者は、
患者の標本中の生物に対する抗体の検出のための試薬と
してクラミジアを利用する。MIFはガラススライドに固
定した精製クラミジアを利用し、一方間接免疫蛍光は感
染細胞の核の周囲の細胞質内封入体として組織培養細胞
中で生育しているクラミジアを利用する。クラミジア種
の検出のために酵素免疫アッセイも使用される。これら
の方法のすべてが労力と時間を要する。 Chlamydia trachomatisを含む種々の病原菌を検出す
るための有用である可能性のある方法として、ドットブ
ロット、スロットブロット、サザンブロット、溶液ハイ
ブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション
などの核酸ハイブリダイゼーション技術が提案されてき
た。Mullisらの米国特許第4,683,195号明細書に述べら
れているようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法をま
た種々の病原菌の検出のために使用することが提案され
てきた。 HoganらによるPCT出願の国際公開第88/03957号明細書
（1988年６月25日公開）は核酸ハイブリダイゼーション
技術を使用する非ウイルス生物の検出を提出している。
この方法は、識別することが求められている特定の非ウ
イルス生物に独特であるとして選択したリボソームRNA
の一領域に相補的であるオリゴヌクレオチドを構築する
ことを含む。Hoganの出願は、Chlamydia trachomatisの
検出に有用であり得て、E.coli rRNAの塩基60−105、1
75−210、600−635、830−870の配列にそれぞれ対応
し、及びE.coli 23SRNAの塩基275−320、330−365、11
60−1190、1450−1490、1510−1545、1710−1750の配列
にそれぞれ対応する16S及び23SリボソームRNAに対する
配列を含むオリゴヌクレオチド配列を提出している。該
出願はまた、多数の他の非ウイルス生物に対するプロー
ブを提出している。 リガーゼ連鎖反応（LCR）として知られる核酸増幅の
ための別の方法は、本発明の背景として更なる関心が持
たれる。LCRでは、２つの１次（primary）プローブ（第
１プローブ及び第２プローブ）及び２つの２次（second
ary）プローブ（第３プローブ及び第４プローブ）を含
むプローブ対を、いずれも標的に対しモル過剰で使用す
る。第１プローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブ
リダイズし、第２プローブは標的鎖の第２のセグメント
にハイブリダイズし、１次プローブが５′リン酸基−
３′水酸基の関係で互いに隣接し、リガーゼが２つのプ
ローブを共有結合的に融合産物に融合又は連結できるよ
うに第１セグメント及び第２セグメントが隣接する。更
に、同様の隣接様式で第３プローブ（２次プローブ）は
第１プローブの一部にハイブリダイズでき、第４プロー
ブ（２次プローブ）が第２プローブの一部にハイブリダ
イズできる。勿論、標的が初めから２本鎖ならば、２次
プローブもまず第１に標的の相補鎖にハイブリダイズす
るであろう。１次プローブの連結鎖が標的鎖から離れる
と、１次プローブの連結鎖は第３プローブ及び第４プロ
ーブにハイブリダイズする。第３プローブ及び第４プロ
ーブは連結し相補的な２次連結産物を形成する。連結産
物が標的又は標的の相補鎖のどちらか一方に機能的に等
価であることを理解することは重要である。ハイブリダ
イゼーション及び連結のサイクルを繰り返すと、標的配
列が増幅される。この技術は、1989年６月16日公開のK.
Backmanの欧州特許出願公開第320308号明細書及び1991
年７月31日公開のK.Backmanらの欧州特許出願公開第439
182号明細書により完全に述べられている。両明細書は
引用により本明細書に含まれるものとする。 現在利用できる技術にもかかわらず、Chlamydia trac
homatisを検出するために感度が良く、迅速で、特異的
で、再現性のある技術が必要である。 発明の概要 本発明は、Chlamydia trachomatisからの標的DNAの特
異的検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブに関す
る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、長さが
10ないし約50ヌクレオチドで、配列番号１、６、11、16
又は21記載の配列に対し、本明細書記載のハイブリダイ
ゼーション条件下でこのような配列又はその相補鎖にハ
イブリダイズするために十分な相補性又は相同性を有す
る。十分な相補性又は相同性のためには一般的に約80％
ないし100％の相補性又は相同性が必要とされる。典型
的にはより短いプローブには高いパーセンテージが必要
とされ、より長いプローブには低いパーセンテージでも
有用である。長さが15ないし40、通常は約20−25ヌクレ
オチドの範囲のプローブが好ましい。このようなオリゴ
ヌクレオチドプローブは少なくとも２種のChlamydia tr
achomatisの血清学的変異株、好ましくは３種以上、理
想的には10種以上を検出するが、クラミジア属の他の生
物を含む他の関連生物とは実質的に交差反応を起こさな
い。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドプローブの
好ましい例は配列番号２−５、７−10、12−15、17−20
及び22−25のプローブである。 本発明はまた、本明細書記載のプローブセット１（配
列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−1
0）、プローブセット３（配列番号12−15）、プローブ
セット４（配列番号17−20）及びプローブセット５（配
列番号22−25）、並びにそのコンビネーション、サブコ
ンビネーションを含むChlamydia trachomatisからの標
的DNAを検出する２種以上、好ましくは４種のオリゴヌ
クレオチドプローブの組成物に関する。 本発明のもう一つの特徴は、Chlamydia trachomatis
からの標的DNAの検出方法に関するが、該方法は、Chlam
ydia trachomatisからの標的DNAを含む疑いのあるサン
プルを供給する段階と、本明細書記載の配列番号１、
６、11、16又は21の配列の一つとハイブリダイズさせる
ために上記のオリゴヌクレオチドプローブとサンプルDN
Aをハイブリダイズさせる段階（ここでオリゴヌクレオ
チドプローブは好ましくは直接的に又は間接的に信号を
発生できるレポーター基で標識されるものとする）と、
更にハイブリッドを検出することにより、通常はレポー
ターにより産生される信号を検出することにより標的DN
Aの存在を測定する段階を含む方法である。 本発明の更に別の特徴は、上記の標識したオリゴヌク
レオチドプローブによりリガーゼ連鎖反応（LCR）を使
用してChlamydia trachomatisからの標的DNAを増幅し検
出する方法を提供することである。該方法は一般的に、
標的DNAを含む疑いのあるサンプル及び本発明の４種の
プローブセットの１つ以上を供給する段階（ここで好ま
しくはプローブセットの少なくとも１つのプローブが検
出することができるレポーター基で標識されるものとす
る）、更にリガーゼ連鎖反応を行い、レポーター基を検
出する段階を含む方法である。LCRの特に好ましい変法
では、標的依存性補正段階に先立ってプローブが互いに
連結できないように修飾された形でプローブを準備す
る。好ましい一つの方法として、修飾されたプローブセ
ットが連結する前に充填されなければならない少なくと
も一つのギャップを含むという方法がある。標的依存性
様式でのギャップの充填は、適当なデオキシヌクレオチ
ド三リン酸（１種又は複数）を供給し、更にポリメラー
ゼ試薬を供給することで達成されるが、デオキシヌクレ
オチド三リン酸は４種全部よりは少ないものとする。 その後、少なくとも一度、以下の段階を行う。プロー
ブセットを標的DNAを含む疑いのあるサンプルと混合す
ること、ハイブリダイズした標的とハイブリダイズした
プローブを変性させること、変性させたプローブを変性
させた標的DNAにハイブリダイズさせること、もしプロ
ーブ修飾が存在すれば、それを鋳型依存性様式で補正
し、それにより隣接したプローブを産生させること、リ
ガーゼを使用して隣接プローブを連結し再構成プローブ
を形成させること、再構成プローブ中の標識を検出する
こと。本明細書で使用する「補正（correction）」とい
う用語は、欧州特許第439,182号明細書と同じ意味で使
用する。 本発明の更に別の特徴は、Chlamydia trachomatisの
検出に有用なキットを含むというものである。該キット
は、本発明のプローブセットを１種以上、リガーゼ試
薬、ポリメラーゼ試薬、１種以上であるが４種全部では
ないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む１種以上の適
当な容器を含む。典型的には、プローブセットからの少
なくとも一つのプローブは標識又はレポーター基を有す
るが、これが無くとも検出は可能である。 図面の簡単な説明 図１はChlamydia trachomatis MOMP特異的な標的DNA
とそれぞれの標的に並列されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブを示す。 図２はChlamydia trachomatisの潜在プラスミド特異
的な標的DNAとそれぞれの標的に並列されたオリゴヌク
レオチドプローブを示す。 図のプローブセット１−４で、CZはカルバゾール由来
ハプテンを表し、ADはアダマンタン由来ハプテンを表
す。プローブセット５で、Ｂはビオチン残基を表し、Ｆ
はフルオレセイン残基を表す。これらの標識を本明細書
で更に述べる。 図と配列表の配列はプローブの正確な配列を示すが、
同様の特徴（例えば、C.trachomatisDNAの検出）を有す
るプローブが得られるそれらの配列の修飾又は変異も本
発明の範囲内と精神内であると認められることを理解す
べきである。 発明の詳細な説明 本発明のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１−15）
（図１）は、Baehr,W.ら、Proc.Nat′l.Acad.Sci.（US
A）,85,4000−4004（1988）により報告されたChlamydia
trachomatisの主要外膜蛋白質（MOMP）をコードする遺
伝子由来である。該遺伝子は少なくとも1120ヌクレオチ
ドの長さであり、典型的には生物あたり１コピー存在し
ている。本発明の配列番号16−25、図２に対応する他の
オリゴヌクレオチドは、Chlamydia trachomatisに見出
だされた潜在プラスミド由来である（Hatt,C,ら、Nucl.
Acids Res.16（９）:4053−4067）。潜在プラスミドは
典型的には生物あたり７−10コピー存在し、7498塩基対
の長さであり、幾つかの読取り枠を含んでいる。 本発明で使用されるリガーゼ連鎖反応（LCR）の変法
は、本明細書でA,B（１次プローブ）、Ａ′,B′（２次
プローブ）と命名した２対のプローブを使用する。Ａ′
はＡに実質的に相補的であり、Ｂ′はＢに実質的に相補
的である。DNAの逆平行の性質の故に、プローブＡとプ
ローブＢ′は本明細書で「上流」プローブと命名し、そ
れぞれのパートナーB,A′に近接した３′末端を有し、
プローブＢとプローブＡ′は「下流」である。プローブ
対の一つの少なくとも一つのプローブは初めは、ハイブ
リダイズしたプローブを「非平滑末端」にし、及び／又
は２種のプローブ二重鎖のリガーゼに触媒される融合の
ための適切な基質ではないものにする「修飾」末端を含
む。「修飾末端」は、その相補的プローブに関してより
も連結点に関して定められる。他の「修飾末端」は公知
であり、本発明の範囲内であるが、本明細書で述べる全
部の「修飾末端」は、塩基を欠失しプローブ対が標的配
列にアニールされるとき、上流のプローブと下流のプロ
ーブの間に「ギャップ」を生じる。これらの修飾末端の
存在は、標的の無いときに相補的プローブ二重鎖の相互
の平滑末端連結によって生じる偽陽性信号を減少させ
る。 次に修飾の「補正」を行い、プローブを連結可能なも
のとする。本明細書で使用する「補正」という用語は、
標的依存性様式で２種の１次プローブ又は２種の２次プ
ローブをそれぞれのパートナーに連結可能なものとする
方法を指す。標的、標的の相補鎖、それらから産生され
るポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブ
だけが「補正」される。「補正」は使用される修飾末端
の型により幾つかの方法で達成される。ギャップ充填に
よる補正を本明細書で例示する。この方法は鋳型依存性
ポリメラーゼと必要なデオキシヌクレオチド三リン酸
（dNTP）を使用し、上流プローブを伸展させ、その末端
を下流プローブに隣接させる。必要なdNTPは標的配列に
基づいて決定される。 本明細書で使用される「連結点」又は「連結予定点」
は、鋳型依存性様式で連結される２種のプローブパート
ナー間の特異的な位置を指す。それは，「補正」された
プローブが３′水酸基−５′リン酸基の関係でそのパー
トナーに隣接して存在する部位である。４種のLCRプロ
ーブの各セットの場合、２種の「連結点」がある。即
ち、１次プローブパートナーのための点と２次プローブ
パートナーのための点である。慣用のLCRでは、２つの
連結点は互いに向き合い、プローブ対が互いにハイブリ
ダイズするとき平滑末端二重鎖を形成する。本発明の実
施態様で使用されるLCR法では、連結点は互いに向き合
うものではなく、ギャップのために１以上の塩基により
互いに離れている。連結の正確な点は、選択される配列
により異なるものであり、それ故各実施態様の中で更に
記述する。 各プローブは、慣用のヌクレオチドホスホルアミダイ
ト化学及びApplied Biosystems,Inc.,（Foster City,C
A）;DuPont,（Wilmington,DE）；又はMilligen,（Bedfo
rd,MA）から入手できる装置を使用して慣用的に合成で
きるデオキシリボ核酸（DNA）を含む。リガーゼによる
連結に必要な、適当なプローブの５′末端のリン酸化は
当業界公知であるキナーゼ又は市販の合成試薬によって
達成できる。プローブにおいて１つ以上のリボヌクレオ
チド残基を使用することがまた望ましい。 一般的に、本発明を実行するにあたり有用なLCR法は
変性とその後の以下の繰り返しの段階を含む。即ち
（ａ）修飾されたプローブを標的にハイブリダイズさせ
ること（及び標的相補鎖が存在する二重鎖ならば、標的
の相補鎖にハイブリダイズさせること）、（ｂ）プロー
ブを連結可能にするために標的依存性様式で修飾を補正
すること、（ｃ）補正されたプローブをそのパートナー
に連結し融合産物又は連結産物を形成させること、
（ｄ）標的から連結産物を解離させ、ハイブリダイゼー
ション、補正、連結の各段階を繰り返し、所望の標的配
列を増幅することである。（ａ）（ｃ）（ｄ）の段階は
全ての実施態様で基本的に同じであり、一緒に論じるこ
とができる。（ｂ）段階は使用する修飾の型によって異
なり、ギャップ充填だけを本明細書で論じる。 プローブの標的（必要により標的の相補鎖）へのハイ
ブリダイゼーションは当業界で広く公知であり、欧州特
許出願公開第320308号明細書で説明されている。プロー
ブの長さ、プローブの濃度、実験条件の厳格さは全てハ
イブリダイゼーションが起こる程度及び速度に影響を与
える。好ましくは、プローブは所望の特異性をもたらす
ために十分な長さである。即ち、サンプルにおいて非標
的配列にハイブリダイズ可能なことを避けるために十分
な長さである。典型的には、15ないし100塩基のオーダ
ーのプローブがこの目的に合う。現在、約15ないし約40
の長さのプローブが好ましい。 プローブは化学量論的に反応することが予期されるの
で、ほとんど等モル濃度で加えられる。一般的に各プロ
ーブは約5nMないし約90nMの範囲の濃度で存在する。好
ましくは約10nMないし約35nMである。典型的な反応容量
である200μＬでは、これは各プローブを約1.2×1012な
いし約４×1012分子加えることに等しい。200μＬ当た
り約２×1012分子が良好な出発点であったが、反応容量
は変更できる。各反応のために使用するプローブの最適
量も、行う必要のあるサイクル数と反応容量で変わる。
所定のサイクル数で最適の信号を与えるためのプローブ
濃度は当業者によって容易に決定される。 「ハイブリダイゼーション」条件又は「ハイブリダイ
ジング」条件は一般的に核形成（uncleation）及びアニ
ーリングを促進する条件として定められる。しかし、こ
のようなアニーリングはかなり予測できる様式で温度、
イオン強度、プローブの長さ、プローブのG:C含量など
の幾つかの原因に依存することは当業界公知である。例
えば、反応温度を下げるとアニーリングを促進する。プ
ローブのいかなるセットにとっても融解温度即ちTmは幾
つかの公知の方法のいずれによっても決定できる。典型
的には、診断への適用では融解温度よりわずかに引きハ
イブリダイゼーション温度を使用する。イオン強度即ち
「塩」濃度はまた融解温度に大きな影響を与える。なぜ
なら、小カチオンはホスホジエステル骨格上の負電荷を
打ち消して二重鎖の形成を安定化する傾向があるからで
ある。典型的な塩濃度はカチオンの種類と価数に依存す
るが、当業者に容易に理解される。同様に、高G:C含量
と長いプローブの長さはまた二重鎖形成を安定化するこ
とが知られている。なぜなら、A:Tペアが２つの水素結
合をもつのに対しG:Cペアは３つの水素結合をもつから
であり、より長いプローブはプローブを保持する、より
多くの水素結合をもつからである。このように高G:C含
量とより長いプローブの長さは融解温度を上昇させて
「ハイブリダイゼーション条件」に大きな影響を与え
る。 ある診断への適用のためにプローブを選択すると、G:
C含量及び長さを知り説明することができ、「ハイブリ
ダイゼーション条件」を正確に決定できる。イオン強度
は典型的に酵素活性のために最適化されるので、変わり
得る唯一の要因は温度である。特異性を改善するため
に、ハイブリダイゼーション温度をプローブのTmより僅
かに低い温度に選択する。典型的にはTmより２−10℃低
い温度に選択する。このようにある特定のプローブセッ
トとシステムのための適切な「ハイブリダイゼーション
条件」を得ることは当業者の通常の技術の範囲内であ
る。 プローブの提供の後、本発明で使用されるLCR法の次
の段階は「隣接した」プローブを産生する特異的な補正
段階である。この段階の次に一つのプローブを隣接パー
トナーに連結する。このようにして、各補正１次プロー
ブをその関連した１次プローブに連結し、各補正２次プ
ローブをその関連した２次プローブに連結する。DNAポ
リメラーゼを使用して補正を成し得る。各サイクル毎に
追加のポリメラーゼを加える必要性を無くする熱安定性
DNAポリメラーゼが最も好ましい。「隣接したプロー
ブ」の連結は「再構成されたプローブ」を産生する。酵
素による連結は２つの隣接したプローブを共有結合で結
合させる好ましい方法なので、「連結（ligation）」と
いう用語を本明細書で使用する。しかし、「連結」は一
般的用語であり、２つのプローブを共有結合で結合させ
るいかなる方法を含むと理解すべきである。酵素連結の
一つの代替法は、欧州特許出願公開第324616号明細書に
記載の光連結である。 好ましい酵素連結段階を可能なものとする条件及び試
薬は一般的に当業者に公知である。本発明で有用な連結
試薬には、T4リガーゼ、並びに欧州特許第320308号明細
書と欧州特許第373962号明細書で教示のE.coliDNAリガ
ーゼ及びThermus thermophilusDNAリガーゼ（例えばATC
C27634）などの原核生物リガーゼが含まれる。後者のリ
ガーゼは、LCRの熱サイクルの間で活性を保持する能力
を有するので現在では好ましい。熱安定性のリガーゼが
無ければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを加えなけ
ればならない。Rabinら、J.Biol.Chem.261:10637−1647
（1986）によって報告されているDrosophilaのDNAリガ
ーゼなどの真核生物のリガーゼもまた有用である。 連結後、連結（再構成）鎖を標的から解離し（例え
ば、融解）、LCRの慣用法のように工程を数回繰り返
す。繰り返しサイクル数は１ないし約100回の間であり
得る。現在、約15ないし約70回が好ましい。 相補的（２次）プローブにハイブリダイズするとき
に、連結予定点から離れた末端が他の望ましくない連結
反応に加わらないようにプローブを設計することが望ま
しい。このため、粘着末端又は平滑末端は避けるべきで
ある。このような末端を使用しなければならないとき
は、５′末端リン酸基を避け、除去し、又はブロックす
べきである。オリゴヌクレオチドプローブを合成する
（これらは通常５′末端リン酸基を有しない）かホスフ
ァターゼ酵素を使用して末端リン酸基を（例えば、DNA
の制限消化により産生されたオリゴヌクレオチドから）
除去することにより以上のことを達成できる。あるい
は、プローブの「間違った」外部末端の連結を、「ホッ
ク（hook）」残基又はマーカー残基でプローブの少なく
とも一つのプローブの末端をブロックして防止できる。
このことは以下に詳細に述べる。 上述したように、４種のプローブを使用すると、連結
したプローブ又は再構成プローブはそれ自体、更なるサ
イクルで標的と等価の鋳型として働き、指数関数的増幅
をするので、最大の増幅が可能となる。米国特許第5,18
5,243号明細書に述べられているように、検出手段とし
て一本鎖上で伸展し連結した２種のプローブを使用する
ことも可能となる。こうした繰り返し段階で（相補的プ
ローブの存在しないとき）線形増幅が生ずる。当業者な
らば連結対のためのプローブセットから適切なプローブ
対（例えば、プローブＡ及びB;又はプローブＢ′及び
Ａ′）を容易に選択できる。 増幅後、増幅した配列を当業界公知の多数の方法で検
出できる。非標識プローブは、重量又は長さに基づくゲ
ル上での分離と当業界公知の適切な色素による染色の
後、検出できる。より典型的には、検出は、標識した連
結産物から連結していない標識したプローブを分離させ
た後、分画フラクションの一つにおいて標識量を測定し
て行える。分離は電気泳動、免疫クロマトグラフィーな
どのクロマトグラフィー、濾過、下記の好ましい特異的
リガンド捕捉法、又はこれらの方法の組合わせによって
行える。標識プローブには直接又は間接的に検出可能な
レポーター基又は標識が含まれる。直接標識には色原
体、酵素のような触媒、蛍光化合物、発光化合物、化学
発光化合物、及び32P又は3Hなどの放射性元素が含まれ
る。間接標識には、下記のような特異的結合リガンドが
含まれる。 特に好ましい態様では、ハプテンすなわち「ホック」
は、少なくとも２種のプローブの利用できる外側の末端
（融合産物の反対側末端）にレポーター基として結合す
る。「ホック」は結合パートナーに親和性を有するリガ
ンド又は部分である。典型的にはホックには、融合産物
の一端（例えば、第１上流プローブＡの５′末端及び第
２下流プローブＡ′の３′末端）で、固相上にコートし
た抗体又はアビジンなどの特異的結合試薬によって固定
化されうる抗原又はハプテンが含まれる。他端（例え
ば、第１下流プローブＢの３′末端及び第２上流プロー
ブＢ′の５′末端）でホックは抗体−酵素結合体などの
標識又は標識システムによって認識されうる別の抗原又
はハプテンを含む。 ホックとしては、特に限定されないがハプテン（下記
のような）、相補的ポリヌクレオチド「テール」領域、
レクチン／炭水化物対、酵素及び補酵素、及び当業界公
知の他のものが例示される。 多数の異なるハプテンが当業界公知である。ハイブリ
ダイゼーション又は連結を妨害しないならば、実質的に
いかなるハプテンをも本発明で使用できる。幾つかの代
表的ハプテンには、多数の薬剤（例えば、ジゴキシン、
テオフィリン、フェンサイクリジン（PCP）、サリチル
酸塩等）、T3、ビオチン、フルオレセイン（FITC）、ダ
ンシル,2,4−ジニトロフェノール（DNP），ブロモウラ
シルなどの修飾ヌクレオチド、Ｎ−アセチル−７−ヨー
ド−２−フルオレニルアミノ（AIF）基を加えて修飾し
た塩基、及び多数の他のものが含まれる。本明細書で述
べるハプテンのあるものは、本出願人の係属中の1991年
12月17日出願の米国特許出願第07/808,508号（アダマン
タン酢酸）及び米国特許出願第07/808,839号（カルバゾ
ール及びジベンゾフラン）、本出願人の係属中の1992年
３月27日出願の米国特許出願第07/858,929号（アクリジ
ン）及び米国特許出願第07/858,820号（キノリン）に開
示されている。上記したハプテンに関する各出願の開示
内容はすべて引用により本明細書に取り込まれるものと
する。 ハプテンをプローブに加える方法は多数文献で公知で
ある。Enzo Biochemical（New York）及びClontech（Pa
lo Alto）の両者はプローブ標識技術を述べ、市販化し
ている。例えば、第１級アミンは、３′−アミン−ON
CPGTM（Clontech,Palo Alto,CA）を使用して３′オリゴ
末端に結合させることができる。同様に、第１級アミン
は、Aminomodifier II （Clontech）を使用して５′オ
リゴ末端に結合させることができる。アミンは、慣用の
活性化及び結合化学を使用して種々のハプテンと反応で
きる。更に、共に係属中の1990年12月11日出願の米国特
許出願第625,566号及び1990年12月20日出願の米国特許
出願第630,908号はそれぞれ５′及び３′末端でプロー
ブを標識する方法を教示している。上記の共に係属中の
出願は引用により本明細書に取り込まれるものとする。 1992年６月25日公開の国際公開第92/10505号及び1992
年７月９日公開の国際公開第92/11388号はそれぞれ５′
及び３′末端でプローブを標識する方法を教示する。オ
リゴヌクレオチドを標識する一つの公知の方法によれ
ば、標識−ホスホルアミダイト試薬を調製し、オリゴヌ
クレオチドへその合成の間に標識を加えために使用す
る。例えば、Thuong,N.T.ら、Tet.Letters,29（46）:59
05−5908（1988）又はCohen,J.S.ら、発行された米国特
許出願第07/246,688号（NTIS ORDER No.PAT−APPL−７
−246,688）（1989）を参照せよ。 こうして、典型的な連結されたオリゴヌクレオチドは
一端にカルバゾールを有し、他端にアダマンタンを有
し、それにより微粒子酵素免疫アッセイ（MEIA）技術を
使用してIMx 装置（Abbott Laboratories,Abbott Par
k,IL）により検出できる。アッセイ手順は市販のアルフ
ァフェトプロテインアッセイで使用されるものと同様で
あるが、以下のとおりである。（１）抗アルファフェト
プロテイン抗体で被覆された微粒子を抗カルバゾール抗
体で被覆された微粒子で置き換えること、（２）抗アル
ファフェトプロテイン抗体：アルカリ性ホスファターゼ
結合体を抗３−フェニル−１−アダマンタン酢酸抗体：
アルカリ性ホスファターゼ結合体で置き換えること。 アボットIMx 装置で実行されるような微粒子酵素免
疫アッセイ（MEIA）の手順は更に、欧州特許出願公開第
439,182号、欧州特許出願公開第288,793号、Fiore,M.ら
のClin.Chem.,34/9:1726−1732（1988）に記述されてい
る。典型的な手順は次のとおりである。LCRで増幅した
サンプルの100μＬをサンプルウェルにピペットで入れ
る。それから、このサンプルの30−50μＬをインキュベ
ーションウェルにピペットで入れ、抗カルバゾール抗体
で被覆された微粒子をそのウェルに加える。続いて抗カ
ルバゾール抗体とカルバゾール末端を有する核酸配列の
複合体が形成される適切な時間インキュベーションを行
う。インキュベーションの後、IMx 反応セルのガラス
ファイバー捕捉マトリックス上に該混合物をピペットで
注ぎ、アルカリ性ホスファターゼと結合した抗アダマン
タン抗体を加える。これにより、ガラスファイバー捕捉
マトリックスに捕捉される微粒子−オリゴヌクレオチド
−酵素複合体が形成される。洗浄段階で過剰の試薬を除
去した後（この手順では、ガラスファイバー捕捉マトリ
ックスの下の吸取紙が試薬溶液を吸収し、さもなければ
ガラスファイバー捕捉マトリックス上で溢れてしま
う）、ガラスファイバー捕捉マトリックスを４−メチル
ウムベリフェリルホスフェート（MUP）で処理する。表
面に結合した酵素により、蛍光を発生しないMUPがその
蛍光を測定できる４−メチルウムベリフェロン（MU）に
転換する。後述の実施例で与えるIMx速度値は、カウン
ト／秒／秒（c/s/s）で表される蛍光産物の形成速度を
示す。連結プローブの量は直接的にこの速度に関連す
る。IMx は典型的に２−12c/s/sの範囲で「機械」ノイ
ズ又はバックグラウンドを生じることを注意すべきであ
る。 後述する実施例では、フルオレセインハプテン及びビ
オチンハプテン又はカルバゾールハプテン及びアダマン
タン酢酸（アダンマンタン）ハプテンでプローブ対を標
識する。実質的にはいずれのハプテンのいずれの組合わ
せも可能であるけれども、典型的には上記に従い、フル
オレセイン及びビオチンを一緒に使用し、アダマンタン
及びカルバゾールを一緒に使用する。好ましくはプロー
ブ対の各メンバーは異なる標識をもったほうがよい。 本発明の実施に於いて有用な他の等しく適切な検出方
法には、ELISA、EIA、免疫クロマトグラフィー、及びサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、溶
液ハイブリダイゼーション、他の当業界公知の他の方法
などの核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。 ポリメラーゼの量は以下のように定義された単位で表
わされる。酵素の１単位は、70℃で30分間で酸不溶性物
質に10ナノモルの全ヌクレオチドを取り込むのに必要と
される酵素量に等しい。リガーゼ酵素の単位は本明細書
で次のように定義する。95％精製Thermus thermophilus
DNAリガーゼの1mgは約１×108単位の比活性を持つ。こ
の定義は正確に標準化されておらず20％は変わりうる
が、最適化は当業者により容易に達成される。 本発明の目的のために標的配列を一本鎖として記述し
てある。しかし、これは、標的が実際に二重鎖でありプ
ローブとのハイブリダイゼーションの前にその相補鎖か
ら簡単に解離される場合を含むことが理解されるべきで
ある。二重鎖標的の場合、第３及び第４プローブ（２次
プローブ）であるＡ′およびＢ′はそれぞれ標的の相補
鎖とのハイブリダイゼーションによる最初の段階に参加
するであろう。一本鎖標的の場合では、それらは最初の
ハイブリダイゼーション段階に参加せず、次のハイブリ
ダイゼーション段階に参加し、第１及び第２プローブを
連結することにより産生される１次融合配列と結合す
る。標的配列にはデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核
酸（RNA）が含まれる。しかし、本明細書で示し、請求
の範囲に記載した標的はDNAである。本発明の目的のた
めにまた、デオキシヌクレオチド三リン酸にはデオキシ
アデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオ
キシグアノシン三リン酸及びデオキシシトシン三リン酸
が含まれる。しかし、これは、類似の方法で水素結合を
形成できるならば上記４種のアナログである修飾された
塩基又は伝統的でない塩基を除外することを意味しな
い。 本発明を実施例で更に記述するが、実施例は本発明の
例であり、いずれにせよ本発明を限定するつもりはな
い。例えば、特異的である長さを有する配列をリストす
る。同一のマップの位置をカバーするが僅かに少ない又
は多い塩基数を有する配列は、リストした配列と標的上
の同一の位置にハイブリダイゼーションするのならば、
これらの配列と等価であり本発明の範囲内であると認め
られることを理解すべきである。標的配列と約80％以上
の相同性を有する配列もまた本発明の範囲内であること
も理解される。好ましくは、本発明のLCR配列のいかな
る塩基の置換も、ギャップ又は凹所から３つ以上離れて
いるべきである。 Chlamydiaは真正細胞内寄生虫であるので、正確に対
照希釈を数量化するのは困難である。一つの基本体（E
B）（elementary body）及び一つの封入体形成単位（IF
U）は理論的に一個の生物に等価であるが、この等価性
はめったに実際には起こらない。死生物が同一のEB又は
IFUに存在しているとき、実際の生物数は不正確であ
る。EB又はIFUを評価するために、培養したストック溶
液に対し作成された標準曲線を使用して、IMx速度によ
って対照溶液IFUを評価する。 実施例1:プローブセット１（配列番号２−５）を使用し
たChlamydia trachomatisの検出 Chlamydia trachomatisのMOMP遺伝子のヌクレオチド4
35−482（配列番号１）に対応する標的配列を検出する
ためにオリゴヌクレオチドプローブを選択した（図
１）。多数のChlamydia trachomatis serovars（血清学
的変異株）からなる一連の生物からの標的DNAを検出で
きるかどうかを判定するために、これらの生物に対しプ
ローブセット１（配列番号２−５）を試験した。LCR反
応混合物は、LCR緩衝液（50mM EPPS、30mM MgCl2、20
mM K+（KOH及びKClから）、10μＭ NAD）、1.7μＭの
dATP、1.7μＭのdCTP（ギャップ充填ヌクレオチド）、
上述したカルバゾール及びアダマンタンで標識した各オ
リゴヌクレオチドプローブ８×1011個の分子、５μg/ml
のアセチル化したウシ血清アルブミン（BSA）,0.5mMのE
DTA,0.02重量％アジ化ナトリウム、２単位のThermus種
のDNAポリメラーゼ（Molecular Biology Resources,Mil
waukee,WI）、18,000単位のThermus thermophilusDNAリ
ガーゼ（Abbott Laboratories）及び標的DNA（Chlamydi
a trachomatisの10個の基本体に相当）を全容量200μＬ
に含んでいた。Perkin−Elmer Model 480サーモサイク
ラーで、97℃で１秒、55℃で１秒、62℃で50秒、の設定
で合計40サイクルのサイクルを行った。 標的DNAは、多数の当業界公知の方法で調製できる。
本実施例では、標的DNAを、5mM EPPS、60mM MgCl2か
らなる緩衝液中で85−95℃で10分間、該生物（McCoy細
胞中で生育した）を熱処理することで標的DNAを調製し
た。 増幅後、連結産物を、上述したAbbott自動化IMx 分
析機を使用したサンドイッチ免疫アッセイを使用して検
出した。表１はカウント／秒／秒（C/S/S）として表現
したアッセイの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット１（配列番号２−
５）がChlamydia trachomatisの15種の異なる血清学的
変異株からの標的DNAを検出できることを示す。 実施例2:プローブセット１（配列番号２−５）を使用し
た微生物源からの標的DNAの検出 プローブセット１（配列番号２−５）（図１）を、幾
つかの微生物源からの一連の標的DNAに対してLCRアッセ
イで使用した。標的DNAを微生物源から抽出し、標的DNA
が１反応当たり約105コピー存在するということを除い
て、実施例１で記述したようにLCRを行った。プローブ
を、上述したように図１で示すようにカルバゾール及び
アダマンタンで標識し、20μＬ反応中７×1011分子供給
した。IMx 装置の複数のランを分析し、陽性対照（P
C）及び陰性対照（NC）の数値を各ランごとに求めた。
各ランに於ける陽性対照はChlamydiaの5.0 IFUである
と推定した。陰性対照はサケ精子DNA330ngであった。 表２はアッセイの結果を示す。 結果は、Chlamydia trachomatisからのDNAで生じた信
号と比較して、LCRを使用して多数の微生物源からの標
的DNAで試験したとき、プローブセット１はほとんど検
出できない信号しか与えないことを示す。幾つかの細菌
種からの信号はバックグラウンドより大きかったけれど
も、いずれもChlamydia陽性対照からの信号の1/6もなか
った。 実施例3:プローブセット４（配列番号17−20）によるCh
lamydia trachomatisの検出 プローブセット４（配列番号17、18、19及び20）（図
２）を使用して、上述のChlamydia trachomatisの潜在
プラスミドのオリゴヌクレオチド6917−6964（配列番号
16）に対応する標的DNAを検出した（図２）。ギャップ
充填のヌクレオチドがdCTP及びdTTPであり、1.2単位のT
hermus種のDNAポリメラーゼと10,800単位のThermus the
rmophilusのDNAリガーゼを使用したことを除いて実施例
１で述べたように反応を行った。プローブは200μＬ反
応液中6.2×1011分子であり、97℃で１秒、55℃で１
秒、及び62℃で50秒で、合計40サイクルのサイクルを行
った。連結産物を実施例１で述べたように自動化IMx
分析機で分析した。結果を表３に示す。 これらの結果は、プローブセット４（配列番号17−2
0）は試験したChlamydia trachomatis血清学的変異株の
15株全部からの標的DNAを検出できることを示した。 実施例4:プローブセット４（配列番号17−20）を使用し
た完全な微生物からの標的DNAの検出 プローブセット４（配列番号17−20）（図２）の特異
性を評価するために、種々の細菌、カビ、ウイルス及び
Chlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaciの株を含む
多数の完全な（intact）微生物を使用して、LCRを行っ
た。２単位のThermus種のDNAポリメラーゼ及び18,000単
位のThermus thermophilusのDNAリガーゼを使用したこ
とを除いて、実施例３で述べたようにLCRを行った。IMx
装置の複数のランで分析を行った。各ランのプローブ
濃度及び陽性対照（PC）と陰性対照（NC）の値を後述の
表５に示す。結果を表４（微生物）と4A（Chlamydia
種）に示す。 実施例４の各ランでのプローブ濃度及び結果の陽性対
照（PC）と陰性対照（NC）の値を表５に示す。各ラン
で、陽性対照はChlamydia trachomatisの5.0 IFUであ
ると推定され、また陰性対照は330ngサケ精子DNAであっ
た。 これらの結果は、プローブセット４（配列番号17、1
8、19及び20）はChlamydia trachomatisがLCR反応混合
液に存在するときのみ連結産物を産生し、近縁のChlamy
dia pneumoniae、Chlamydia psittaciの株を含めて多数
の他の微生物が存在するときには、そうではないことを
示す。 実施例5:プローブセット５（配列番号22−25）によるCh
lamydia trachomatisの検出 プローブセット５（配列番号22−25）（図２）を使用
して上述のChlamydia trachomatisの潜在プラスミドの
ヌクレオチド6107−6160（配列番号21）（図２）に対応
する標的DNAを検出した（図２）。ギャップ充填のヌク
レオチドdATP及びdCTPを使用し、アセチル化BSAを使用
せずに、実施例１で述べたように反応を行った。97℃で
１秒、58℃で１秒、及び65℃で20秒で合計37サイクルの
サイクルを行った。上述したように、プローブをビオチ
ンとフルオレセインで標識し、200μＬ反応中２×1012
分子のプローブを用いた。図２で示し、上述したよう
に、IMx 分析機で連結産物を分析した。結果を表６に
示す。 これらの結果は、プローブセット５（配列番号22−2
5）はChlamydia trachomatisの15の異なる血清学的変異
株を検出できることを示す。 実施例6:プローブセット５（配列番号22−25）を使用し
た微生物起源からの標的DNAの検出 一連の非クラミジア微生物からの標的DNAを使用し
て、プローブセット５の特異性を評価した。標的DNAが
約105ゲノム／反応で存在することを除いて、４つのラ
ンで実施例５で述べたようにLCRを行った。各ランで、
陽性対照（PC）は5.0 IFUであると推定され、陰性対照
（NC）は330ngのヒト胎盤DNAであった。各ランのPC値及
びNC値を表７に示す。IMx 分析を上述したように行っ
た。表７はまたこれらの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット５（配列番号22−2
5）は多数の非クラミジア微生物又はChlamydia psittic
iからの標的DNAと交差反応性を示さないことを示す。 実施例7:プローブセット２（配列番号７−10）を使用し
たChlamydia trachomatisの標的DNAの検出 プローブセット２（配列番号７−10）を使用してChla
mydia trachomatisのMOMP遺伝子のヌクレオチド788−83
5（配列番号６）に対応する標的DNAを検出した（図
１）。図１に示すように及び上述したようにプローブを
合成し標識した。プローブは200μＬ反応液中２×1012
分子を用いた。ギャップ充填ヌクレオチドとしてdATP及
びdCTPを用いて、実施例１で記述したようにLCRアッセ
イを行った。表８はアッセイの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット２は試験した大部分
の血清学的変異株で比較的低いIMx 速度を与えること
を示す。最良の結果は、血清学的変異株Ｄ、Ｆ、L1及び
L2で得られた。 実施例8:プローブセット２（配列番号７−10）を使用し
た非クラミジアの標的DNAの検出 多数の非クラミジア微生物からの標的DNAを使用し
て、LCRアッセイで200μＬ反応液中２×1012分子でプロ
ーブセット２を用いた。標的DNAが反応中約108ゲノムで
存在することを除いて、実施例７で述べたようにLCRを
行った。各ランで、陽性対照（PC）は5.0 IFUであると
推定され、陰性対照（NC）は330ngのヒト胎盤DNAであっ
た。これらのアッセイの結果を表９に示す。 これらの結果は、標的DNAとして多数の非クラミジア
細菌からのDNAを使用するとき、プローブセット２は検
出できる連結産物を産生しなかったことを示す。 実施例9:プローブセット３（配列番号12−15）を使用し
たChlamydia trachomatisの検出 多数のChlamydia trachomatisの血清学的変異株のMOM
P遺伝子のヌクレオチド1501−1506に対応する標的DNAを
検出できる能力について、プローブセット３（配列番号
12−15）を評価した（図１）。97℃で１秒、58℃で１
秒、65℃で10秒、合計37サイクルのサイクルを行ったこ
とを除いて、実施例１で述べたように（充填ヌクレオチ
ドとしてdATP及びdCTPを使用）、LCRを行った。200μＬ
反応液中２×1012分子のプローブを使用した。結果を表
10に示す。 結果は、プローブセット３（配列番号12−15）はChla
mydia trachomatis血清学的変異株B,Ba,D,E,F,G,H,J,L
1,L2及びL3からの標的DNAを検出できるが、血清学的変
異株A,C,I及びＫからの標的DNAはほとんど信号を与えな
いことを示す。 前述の実施例を例示として示したが、添付の請求の範
囲で示した本発明の範囲を制限することを意図していな
い。例えば、特定の長さの配列をリストしてある。同一
のマップ位置をカバーするが、より少ない又はより多く
のヌクレオチド数を有する配列は、リストした配列と標
的上で同一の位置にハイブリダイズするならば、上記の
配列の等価物にあり、本発明の範囲内であると理解すべ
きである。
虫である。それは宿主細胞で生育増殖し、細胞の細胞質
に封入体（inclusion）を形成し宿主の臨床的症状の原
因となる。 クラミジア属は３つの異なる種からなる。即ち、Chla
mydia psittaci,Chlamydia trachomatis,Chlamydia pne
umoniaeである。これらの種のうち、Chlamydia trachom
atis及びChlamydia pneumoniaeは結膜炎、トラコーマ生
殖器感染、肺炎などの病気の原因となるヒトに一般的な
病原菌である。 Chlamydia trachomatisを検出するために、臨床標本
を真核細胞培養単層の上に接種し、48時間以上インキュ
ベートし、その後ヨウ素又はギムザで染色する。Chlamy
dia trachomatis抗原を検出するために、及びクラミジ
ア感染に反応して産生される抗体を検出するために、種
々の免疫蛍光アッセイも使用される。クラミジア抗原の
検出のための免疫蛍光の使用には、クラミジアを含む疑
いのある臨床標本を、クラミジア抗原に対するフルオレ
セインイソチオシアネート（FITC）で標識したモノクロ
ーナル抗体に接触させることが含まれる。 抗クラミジア抗体の検出のための免疫蛍光技術にはミ
クロ免疫蛍光（MIF）及び間接免疫蛍光が含まれる。MIF
アッセイは、顕微鏡のスライドに精製した微生物を固定
することにより行う。MIF及び間接免疫蛍光の両者は、
患者の標本中の生物に対する抗体の検出のための試薬と
してクラミジアを利用する。MIFはガラススライドに固
定した精製クラミジアを利用し、一方間接免疫蛍光は感
染細胞の核の周囲の細胞質内封入体として組織培養細胞
中で生育しているクラミジアを利用する。クラミジア種
の検出のために酵素免疫アッセイも使用される。これら
の方法のすべてが労力と時間を要する。 Chlamydia trachomatisを含む種々の病原菌を検出す
るための有用である可能性のある方法として、ドットブ
ロット、スロットブロット、サザンブロット、溶液ハイ
ブリダイゼーション、in situハイブリダイゼーション
などの核酸ハイブリダイゼーション技術が提案されてき
た。Mullisらの米国特許第4,683,195号明細書に述べら
れているようなポリメラーゼ連鎖反応（PCR）方法をま
た種々の病原菌の検出のために使用することが提案され
てきた。 HoganらによるPCT出願の国際公開第88/03957号明細書
（1988年６月25日公開）は核酸ハイブリダイゼーション
技術を使用する非ウイルス生物の検出を提出している。
この方法は、識別することが求められている特定の非ウ
イルス生物に独特であるとして選択したリボソームRNA
の一領域に相補的であるオリゴヌクレオチドを構築する
ことを含む。Hoganの出願は、Chlamydia trachomatisの
検出に有用であり得て、E.coli rRNAの塩基60−105、1
75−210、600−635、830−870の配列にそれぞれ対応
し、及びE.coli 23SRNAの塩基275−320、330−365、11
60−1190、1450−1490、1510−1545、1710−1750の配列
にそれぞれ対応する16S及び23SリボソームRNAに対する
配列を含むオリゴヌクレオチド配列を提出している。該
出願はまた、多数の他の非ウイルス生物に対するプロー
ブを提出している。 リガーゼ連鎖反応（LCR）として知られる核酸増幅の
ための別の方法は、本発明の背景として更なる関心が持
たれる。LCRでは、２つの１次（primary）プローブ（第
１プローブ及び第２プローブ）及び２つの２次（second
ary）プローブ（第３プローブ及び第４プローブ）を含
むプローブ対を、いずれも標的に対しモル過剰で使用す
る。第１プローブは標的鎖の第１のセグメントにハイブ
リダイズし、第２プローブは標的鎖の第２のセグメント
にハイブリダイズし、１次プローブが５′リン酸基−
３′水酸基の関係で互いに隣接し、リガーゼが２つのプ
ローブを共有結合的に融合産物に融合又は連結できるよ
うに第１セグメント及び第２セグメントが隣接する。更
に、同様の隣接様式で第３プローブ（２次プローブ）は
第１プローブの一部にハイブリダイズでき、第４プロー
ブ（２次プローブ）が第２プローブの一部にハイブリダ
イズできる。勿論、標的が初めから２本鎖ならば、２次
プローブもまず第１に標的の相補鎖にハイブリダイズす
るであろう。１次プローブの連結鎖が標的鎖から離れる
と、１次プローブの連結鎖は第３プローブ及び第４プロ
ーブにハイブリダイズする。第３プローブ及び第４プロ
ーブは連結し相補的な２次連結産物を形成する。連結産
物が標的又は標的の相補鎖のどちらか一方に機能的に等
価であることを理解することは重要である。ハイブリダ
イゼーション及び連結のサイクルを繰り返すと、標的配
列が増幅される。この技術は、1989年６月16日公開のK.
Backmanの欧州特許出願公開第320308号明細書及び1991
年７月31日公開のK.Backmanらの欧州特許出願公開第439
182号明細書により完全に述べられている。両明細書は
引用により本明細書に含まれるものとする。 現在利用できる技術にもかかわらず、Chlamydia trac
homatisを検出するために感度が良く、迅速で、特異的
で、再現性のある技術が必要である。 発明の概要 本発明は、Chlamydia trachomatisからの標的DNAの特
異的検出に有用なオリゴヌクレオチドプローブに関す
る。このようなオリゴヌクレオチドプローブは、長さが
10ないし約50ヌクレオチドで、配列番号１、６、11、16
又は21記載の配列に対し、本明細書記載のハイブリダイ
ゼーション条件下でこのような配列又はその相補鎖にハ
イブリダイズするために十分な相補性又は相同性を有す
る。十分な相補性又は相同性のためには一般的に約80％
ないし100％の相補性又は相同性が必要とされる。典型
的にはより短いプローブには高いパーセンテージが必要
とされ、より長いプローブには低いパーセンテージでも
有用である。長さが15ないし40、通常は約20−25ヌクレ
オチドの範囲のプローブが好ましい。このようなオリゴ
ヌクレオチドプローブは少なくとも２種のChlamydia tr
achomatisの血清学的変異株、好ましくは３種以上、理
想的には10種以上を検出するが、クラミジア属の他の生
物を含む他の関連生物とは実質的に交差反応を起こさな
い。本発明のこのようなオリゴヌクレオチドプローブの
好ましい例は配列番号２−５、７−10、12−15、17−20
及び22−25のプローブである。 本発明はまた、本明細書記載のプローブセット１（配
列番号２−５）、プローブセット２（配列番号７−1
0）、プローブセット３（配列番号12−15）、プローブ
セット４（配列番号17−20）及びプローブセット５（配
列番号22−25）、並びにそのコンビネーション、サブコ
ンビネーションを含むChlamydia trachomatisからの標
的DNAを検出する２種以上、好ましくは４種のオリゴヌ
クレオチドプローブの組成物に関する。 本発明のもう一つの特徴は、Chlamydia trachomatis
からの標的DNAの検出方法に関するが、該方法は、Chlam
ydia trachomatisからの標的DNAを含む疑いのあるサン
プルを供給する段階と、本明細書記載の配列番号１、
６、11、16又は21の配列の一つとハイブリダイズさせる
ために上記のオリゴヌクレオチドプローブとサンプルDN
Aをハイブリダイズさせる段階（ここでオリゴヌクレオ
チドプローブは好ましくは直接的に又は間接的に信号を
発生できるレポーター基で標識されるものとする）と、
更にハイブリッドを検出することにより、通常はレポー
ターにより産生される信号を検出することにより標的DN
Aの存在を測定する段階を含む方法である。 本発明の更に別の特徴は、上記の標識したオリゴヌク
レオチドプローブによりリガーゼ連鎖反応（LCR）を使
用してChlamydia trachomatisからの標的DNAを増幅し検
出する方法を提供することである。該方法は一般的に、
標的DNAを含む疑いのあるサンプル及び本発明の４種の
プローブセットの１つ以上を供給する段階（ここで好ま
しくはプローブセットの少なくとも１つのプローブが検
出することができるレポーター基で標識されるものとす
る）、更にリガーゼ連鎖反応を行い、レポーター基を検
出する段階を含む方法である。LCRの特に好ましい変法
では、標的依存性補正段階に先立ってプローブが互いに
連結できないように修飾された形でプローブを準備す
る。好ましい一つの方法として、修飾されたプローブセ
ットが連結する前に充填されなければならない少なくと
も一つのギャップを含むという方法がある。標的依存性
様式でのギャップの充填は、適当なデオキシヌクレオチ
ド三リン酸（１種又は複数）を供給し、更にポリメラー
ゼ試薬を供給することで達成されるが、デオキシヌクレ
オチド三リン酸は４種全部よりは少ないものとする。 その後、少なくとも一度、以下の段階を行う。プロー
ブセットを標的DNAを含む疑いのあるサンプルと混合す
ること、ハイブリダイズした標的とハイブリダイズした
プローブを変性させること、変性させたプローブを変性
させた標的DNAにハイブリダイズさせること、もしプロ
ーブ修飾が存在すれば、それを鋳型依存性様式で補正
し、それにより隣接したプローブを産生させること、リ
ガーゼを使用して隣接プローブを連結し再構成プローブ
を形成させること、再構成プローブ中の標識を検出する
こと。本明細書で使用する「補正（correction）」とい
う用語は、欧州特許第439,182号明細書と同じ意味で使
用する。 本発明の更に別の特徴は、Chlamydia trachomatisの
検出に有用なキットを含むというものである。該キット
は、本発明のプローブセットを１種以上、リガーゼ試
薬、ポリメラーゼ試薬、１種以上であるが４種全部では
ないデオキシヌクレオチド三リン酸を含む１種以上の適
当な容器を含む。典型的には、プローブセットからの少
なくとも一つのプローブは標識又はレポーター基を有す
るが、これが無くとも検出は可能である。 図面の簡単な説明 図１はChlamydia trachomatis MOMP特異的な標的DNA
とそれぞれの標的に並列されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブを示す。 図２はChlamydia trachomatisの潜在プラスミド特異
的な標的DNAとそれぞれの標的に並列されたオリゴヌク
レオチドプローブを示す。 図のプローブセット１−４で、CZはカルバゾール由来
ハプテンを表し、ADはアダマンタン由来ハプテンを表
す。プローブセット５で、Ｂはビオチン残基を表し、Ｆ
はフルオレセイン残基を表す。これらの標識を本明細書
で更に述べる。 図と配列表の配列はプローブの正確な配列を示すが、
同様の特徴（例えば、C.trachomatisDNAの検出）を有す
るプローブが得られるそれらの配列の修飾又は変異も本
発明の範囲内と精神内であると認められることを理解す
べきである。 発明の詳細な説明 本発明のオリゴヌクレオチド配列（配列番号１−15）
（図１）は、Baehr,W.ら、Proc.Nat′l.Acad.Sci.（US
A）,85,4000−4004（1988）により報告されたChlamydia
trachomatisの主要外膜蛋白質（MOMP）をコードする遺
伝子由来である。該遺伝子は少なくとも1120ヌクレオチ
ドの長さであり、典型的には生物あたり１コピー存在し
ている。本発明の配列番号16−25、図２に対応する他の
オリゴヌクレオチドは、Chlamydia trachomatisに見出
だされた潜在プラスミド由来である（Hatt,C,ら、Nucl.
Acids Res.16（９）:4053−4067）。潜在プラスミドは
典型的には生物あたり７−10コピー存在し、7498塩基対
の長さであり、幾つかの読取り枠を含んでいる。 本発明で使用されるリガーゼ連鎖反応（LCR）の変法
は、本明細書でA,B（１次プローブ）、Ａ′,B′（２次
プローブ）と命名した２対のプローブを使用する。Ａ′
はＡに実質的に相補的であり、Ｂ′はＢに実質的に相補
的である。DNAの逆平行の性質の故に、プローブＡとプ
ローブＢ′は本明細書で「上流」プローブと命名し、そ
れぞれのパートナーB,A′に近接した３′末端を有し、
プローブＢとプローブＡ′は「下流」である。プローブ
対の一つの少なくとも一つのプローブは初めは、ハイブ
リダイズしたプローブを「非平滑末端」にし、及び／又
は２種のプローブ二重鎖のリガーゼに触媒される融合の
ための適切な基質ではないものにする「修飾」末端を含
む。「修飾末端」は、その相補的プローブに関してより
も連結点に関して定められる。他の「修飾末端」は公知
であり、本発明の範囲内であるが、本明細書で述べる全
部の「修飾末端」は、塩基を欠失しプローブ対が標的配
列にアニールされるとき、上流のプローブと下流のプロ
ーブの間に「ギャップ」を生じる。これらの修飾末端の
存在は、標的の無いときに相補的プローブ二重鎖の相互
の平滑末端連結によって生じる偽陽性信号を減少させ
る。 次に修飾の「補正」を行い、プローブを連結可能なも
のとする。本明細書で使用する「補正」という用語は、
標的依存性様式で２種の１次プローブ又は２種の２次プ
ローブをそれぞれのパートナーに連結可能なものとする
方法を指す。標的、標的の相補鎖、それらから産生され
るポリヌクレオチド配列にハイブリダイズするプローブ
だけが「補正」される。「補正」は使用される修飾末端
の型により幾つかの方法で達成される。ギャップ充填に
よる補正を本明細書で例示する。この方法は鋳型依存性
ポリメラーゼと必要なデオキシヌクレオチド三リン酸
（dNTP）を使用し、上流プローブを伸展させ、その末端
を下流プローブに隣接させる。必要なdNTPは標的配列に
基づいて決定される。 本明細書で使用される「連結点」又は「連結予定点」
は、鋳型依存性様式で連結される２種のプローブパート
ナー間の特異的な位置を指す。それは，「補正」された
プローブが３′水酸基−５′リン酸基の関係でそのパー
トナーに隣接して存在する部位である。４種のLCRプロ
ーブの各セットの場合、２種の「連結点」がある。即
ち、１次プローブパートナーのための点と２次プローブ
パートナーのための点である。慣用のLCRでは、２つの
連結点は互いに向き合い、プローブ対が互いにハイブリ
ダイズするとき平滑末端二重鎖を形成する。本発明の実
施態様で使用されるLCR法では、連結点は互いに向き合
うものではなく、ギャップのために１以上の塩基により
互いに離れている。連結の正確な点は、選択される配列
により異なるものであり、それ故各実施態様の中で更に
記述する。 各プローブは、慣用のヌクレオチドホスホルアミダイ
ト化学及びApplied Biosystems,Inc.,（Foster City,C
A）;DuPont,（Wilmington,DE）；又はMilligen,（Bedfo
rd,MA）から入手できる装置を使用して慣用的に合成で
きるデオキシリボ核酸（DNA）を含む。リガーゼによる
連結に必要な、適当なプローブの５′末端のリン酸化は
当業界公知であるキナーゼ又は市販の合成試薬によって
達成できる。プローブにおいて１つ以上のリボヌクレオ
チド残基を使用することがまた望ましい。 一般的に、本発明を実行するにあたり有用なLCR法は
変性とその後の以下の繰り返しの段階を含む。即ち
（ａ）修飾されたプローブを標的にハイブリダイズさせ
ること（及び標的相補鎖が存在する二重鎖ならば、標的
の相補鎖にハイブリダイズさせること）、（ｂ）プロー
ブを連結可能にするために標的依存性様式で修飾を補正
すること、（ｃ）補正されたプローブをそのパートナー
に連結し融合産物又は連結産物を形成させること、
（ｄ）標的から連結産物を解離させ、ハイブリダイゼー
ション、補正、連結の各段階を繰り返し、所望の標的配
列を増幅することである。（ａ）（ｃ）（ｄ）の段階は
全ての実施態様で基本的に同じであり、一緒に論じるこ
とができる。（ｂ）段階は使用する修飾の型によって異
なり、ギャップ充填だけを本明細書で論じる。 プローブの標的（必要により標的の相補鎖）へのハイ
ブリダイゼーションは当業界で広く公知であり、欧州特
許出願公開第320308号明細書で説明されている。プロー
ブの長さ、プローブの濃度、実験条件の厳格さは全てハ
イブリダイゼーションが起こる程度及び速度に影響を与
える。好ましくは、プローブは所望の特異性をもたらす
ために十分な長さである。即ち、サンプルにおいて非標
的配列にハイブリダイズ可能なことを避けるために十分
な長さである。典型的には、15ないし100塩基のオーダ
ーのプローブがこの目的に合う。現在、約15ないし約40
の長さのプローブが好ましい。 プローブは化学量論的に反応することが予期されるの
で、ほとんど等モル濃度で加えられる。一般的に各プロ
ーブは約5nMないし約90nMの範囲の濃度で存在する。好
ましくは約10nMないし約35nMである。典型的な反応容量
である200μＬでは、これは各プローブを約1.2×1012な
いし約４×1012分子加えることに等しい。200μＬ当た
り約２×1012分子が良好な出発点であったが、反応容量
は変更できる。各反応のために使用するプローブの最適
量も、行う必要のあるサイクル数と反応容量で変わる。
所定のサイクル数で最適の信号を与えるためのプローブ
濃度は当業者によって容易に決定される。 「ハイブリダイゼーション」条件又は「ハイブリダイ
ジング」条件は一般的に核形成（uncleation）及びアニ
ーリングを促進する条件として定められる。しかし、こ
のようなアニーリングはかなり予測できる様式で温度、
イオン強度、プローブの長さ、プローブのG:C含量など
の幾つかの原因に依存することは当業界公知である。例
えば、反応温度を下げるとアニーリングを促進する。プ
ローブのいかなるセットにとっても融解温度即ちTmは幾
つかの公知の方法のいずれによっても決定できる。典型
的には、診断への適用では融解温度よりわずかに引きハ
イブリダイゼーション温度を使用する。イオン強度即ち
「塩」濃度はまた融解温度に大きな影響を与える。なぜ
なら、小カチオンはホスホジエステル骨格上の負電荷を
打ち消して二重鎖の形成を安定化する傾向があるからで
ある。典型的な塩濃度はカチオンの種類と価数に依存す
るが、当業者に容易に理解される。同様に、高G:C含量
と長いプローブの長さはまた二重鎖形成を安定化するこ
とが知られている。なぜなら、A:Tペアが２つの水素結
合をもつのに対しG:Cペアは３つの水素結合をもつから
であり、より長いプローブはプローブを保持する、より
多くの水素結合をもつからである。このように高G:C含
量とより長いプローブの長さは融解温度を上昇させて
「ハイブリダイゼーション条件」に大きな影響を与え
る。 ある診断への適用のためにプローブを選択すると、G:
C含量及び長さを知り説明することができ、「ハイブリ
ダイゼーション条件」を正確に決定できる。イオン強度
は典型的に酵素活性のために最適化されるので、変わり
得る唯一の要因は温度である。特異性を改善するため
に、ハイブリダイゼーション温度をプローブのTmより僅
かに低い温度に選択する。典型的にはTmより２−10℃低
い温度に選択する。このようにある特定のプローブセッ
トとシステムのための適切な「ハイブリダイゼーション
条件」を得ることは当業者の通常の技術の範囲内であ
る。 プローブの提供の後、本発明で使用されるLCR法の次
の段階は「隣接した」プローブを産生する特異的な補正
段階である。この段階の次に一つのプローブを隣接パー
トナーに連結する。このようにして、各補正１次プロー
ブをその関連した１次プローブに連結し、各補正２次プ
ローブをその関連した２次プローブに連結する。DNAポ
リメラーゼを使用して補正を成し得る。各サイクル毎に
追加のポリメラーゼを加える必要性を無くする熱安定性
DNAポリメラーゼが最も好ましい。「隣接したプロー
ブ」の連結は「再構成されたプローブ」を産生する。酵
素による連結は２つの隣接したプローブを共有結合で結
合させる好ましい方法なので、「連結（ligation）」と
いう用語を本明細書で使用する。しかし、「連結」は一
般的用語であり、２つのプローブを共有結合で結合させ
るいかなる方法を含むと理解すべきである。酵素連結の
一つの代替法は、欧州特許出願公開第324616号明細書に
記載の光連結である。 好ましい酵素連結段階を可能なものとする条件及び試
薬は一般的に当業者に公知である。本発明で有用な連結
試薬には、T4リガーゼ、並びに欧州特許第320308号明細
書と欧州特許第373962号明細書で教示のE.coliDNAリガ
ーゼ及びThermus thermophilusDNAリガーゼ（例えばATC
C27634）などの原核生物リガーゼが含まれる。後者のリ
ガーゼは、LCRの熱サイクルの間で活性を保持する能力
を有するので現在では好ましい。熱安定性のリガーゼが
無ければ、サイクルを繰り返す毎にリガーゼを加えなけ
ればならない。Rabinら、J.Biol.Chem.261:10637−1647
（1986）によって報告されているDrosophilaのDNAリガ
ーゼなどの真核生物のリガーゼもまた有用である。 連結後、連結（再構成）鎖を標的から解離し（例え
ば、融解）、LCRの慣用法のように工程を数回繰り返
す。繰り返しサイクル数は１ないし約100回の間であり
得る。現在、約15ないし約70回が好ましい。 相補的（２次）プローブにハイブリダイズするとき
に、連結予定点から離れた末端が他の望ましくない連結
反応に加わらないようにプローブを設計することが望ま
しい。このため、粘着末端又は平滑末端は避けるべきで
ある。このような末端を使用しなければならないとき
は、５′末端リン酸基を避け、除去し、又はブロックす
べきである。オリゴヌクレオチドプローブを合成する
（これらは通常５′末端リン酸基を有しない）かホスフ
ァターゼ酵素を使用して末端リン酸基を（例えば、DNA
の制限消化により産生されたオリゴヌクレオチドから）
除去することにより以上のことを達成できる。あるい
は、プローブの「間違った」外部末端の連結を、「ホッ
ク（hook）」残基又はマーカー残基でプローブの少なく
とも一つのプローブの末端をブロックして防止できる。
このことは以下に詳細に述べる。 上述したように、４種のプローブを使用すると、連結
したプローブ又は再構成プローブはそれ自体、更なるサ
イクルで標的と等価の鋳型として働き、指数関数的増幅
をするので、最大の増幅が可能となる。米国特許第5,18
5,243号明細書に述べられているように、検出手段とし
て一本鎖上で伸展し連結した２種のプローブを使用する
ことも可能となる。こうした繰り返し段階で（相補的プ
ローブの存在しないとき）線形増幅が生ずる。当業者な
らば連結対のためのプローブセットから適切なプローブ
対（例えば、プローブＡ及びB;又はプローブＢ′及び
Ａ′）を容易に選択できる。 増幅後、増幅した配列を当業界公知の多数の方法で検
出できる。非標識プローブは、重量又は長さに基づくゲ
ル上での分離と当業界公知の適切な色素による染色の
後、検出できる。より典型的には、検出は、標識した連
結産物から連結していない標識したプローブを分離させ
た後、分画フラクションの一つにおいて標識量を測定し
て行える。分離は電気泳動、免疫クロマトグラフィーな
どのクロマトグラフィー、濾過、下記の好ましい特異的
リガンド捕捉法、又はこれらの方法の組合わせによって
行える。標識プローブには直接又は間接的に検出可能な
レポーター基又は標識が含まれる。直接標識には色原
体、酵素のような触媒、蛍光化合物、発光化合物、化学
発光化合物、及び32P又は3Hなどの放射性元素が含まれ
る。間接標識には、下記のような特異的結合リガンドが
含まれる。 特に好ましい態様では、ハプテンすなわち「ホック」
は、少なくとも２種のプローブの利用できる外側の末端
（融合産物の反対側末端）にレポーター基として結合す
る。「ホック」は結合パートナーに親和性を有するリガ
ンド又は部分である。典型的にはホックには、融合産物
の一端（例えば、第１上流プローブＡの５′末端及び第
２下流プローブＡ′の３′末端）で、固相上にコートし
た抗体又はアビジンなどの特異的結合試薬によって固定
化されうる抗原又はハプテンが含まれる。他端（例え
ば、第１下流プローブＢの３′末端及び第２上流プロー
ブＢ′の５′末端）でホックは抗体−酵素結合体などの
標識又は標識システムによって認識されうる別の抗原又
はハプテンを含む。 ホックとしては、特に限定されないがハプテン（下記
のような）、相補的ポリヌクレオチド「テール」領域、
レクチン／炭水化物対、酵素及び補酵素、及び当業界公
知の他のものが例示される。 多数の異なるハプテンが当業界公知である。ハイブリ
ダイゼーション又は連結を妨害しないならば、実質的に
いかなるハプテンをも本発明で使用できる。幾つかの代
表的ハプテンには、多数の薬剤（例えば、ジゴキシン、
テオフィリン、フェンサイクリジン（PCP）、サリチル
酸塩等）、T3、ビオチン、フルオレセイン（FITC）、ダ
ンシル,2,4−ジニトロフェノール（DNP），ブロモウラ
シルなどの修飾ヌクレオチド、Ｎ−アセチル−７−ヨー
ド−２−フルオレニルアミノ（AIF）基を加えて修飾し
た塩基、及び多数の他のものが含まれる。本明細書で述
べるハプテンのあるものは、本出願人の係属中の1991年
12月17日出願の米国特許出願第07/808,508号（アダマン
タン酢酸）及び米国特許出願第07/808,839号（カルバゾ
ール及びジベンゾフラン）、本出願人の係属中の1992年
３月27日出願の米国特許出願第07/858,929号（アクリジ
ン）及び米国特許出願第07/858,820号（キノリン）に開
示されている。上記したハプテンに関する各出願の開示
内容はすべて引用により本明細書に取り込まれるものと
する。 ハプテンをプローブに加える方法は多数文献で公知で
ある。Enzo Biochemical（New York）及びClontech（Pa
lo Alto）の両者はプローブ標識技術を述べ、市販化し
ている。例えば、第１級アミンは、３′−アミン−ON
CPGTM（Clontech,Palo Alto,CA）を使用して３′オリゴ
末端に結合させることができる。同様に、第１級アミン
は、Aminomodifier II （Clontech）を使用して５′オ
リゴ末端に結合させることができる。アミンは、慣用の
活性化及び結合化学を使用して種々のハプテンと反応で
きる。更に、共に係属中の1990年12月11日出願の米国特
許出願第625,566号及び1990年12月20日出願の米国特許
出願第630,908号はそれぞれ５′及び３′末端でプロー
ブを標識する方法を教示している。上記の共に係属中の
出願は引用により本明細書に取り込まれるものとする。 1992年６月25日公開の国際公開第92/10505号及び1992
年７月９日公開の国際公開第92/11388号はそれぞれ５′
及び３′末端でプローブを標識する方法を教示する。オ
リゴヌクレオチドを標識する一つの公知の方法によれ
ば、標識−ホスホルアミダイト試薬を調製し、オリゴヌ
クレオチドへその合成の間に標識を加えために使用す
る。例えば、Thuong,N.T.ら、Tet.Letters,29（46）:59
05−5908（1988）又はCohen,J.S.ら、発行された米国特
許出願第07/246,688号（NTIS ORDER No.PAT−APPL−７
−246,688）（1989）を参照せよ。 こうして、典型的な連結されたオリゴヌクレオチドは
一端にカルバゾールを有し、他端にアダマンタンを有
し、それにより微粒子酵素免疫アッセイ（MEIA）技術を
使用してIMx 装置（Abbott Laboratories,Abbott Par
k,IL）により検出できる。アッセイ手順は市販のアルフ
ァフェトプロテインアッセイで使用されるものと同様で
あるが、以下のとおりである。（１）抗アルファフェト
プロテイン抗体で被覆された微粒子を抗カルバゾール抗
体で被覆された微粒子で置き換えること、（２）抗アル
ファフェトプロテイン抗体：アルカリ性ホスファターゼ
結合体を抗３−フェニル−１−アダマンタン酢酸抗体：
アルカリ性ホスファターゼ結合体で置き換えること。 アボットIMx 装置で実行されるような微粒子酵素免
疫アッセイ（MEIA）の手順は更に、欧州特許出願公開第
439,182号、欧州特許出願公開第288,793号、Fiore,M.ら
のClin.Chem.,34/9:1726−1732（1988）に記述されてい
る。典型的な手順は次のとおりである。LCRで増幅した
サンプルの100μＬをサンプルウェルにピペットで入れ
る。それから、このサンプルの30−50μＬをインキュベ
ーションウェルにピペットで入れ、抗カルバゾール抗体
で被覆された微粒子をそのウェルに加える。続いて抗カ
ルバゾール抗体とカルバゾール末端を有する核酸配列の
複合体が形成される適切な時間インキュベーションを行
う。インキュベーションの後、IMx 反応セルのガラス
ファイバー捕捉マトリックス上に該混合物をピペットで
注ぎ、アルカリ性ホスファターゼと結合した抗アダマン
タン抗体を加える。これにより、ガラスファイバー捕捉
マトリックスに捕捉される微粒子−オリゴヌクレオチド
−酵素複合体が形成される。洗浄段階で過剰の試薬を除
去した後（この手順では、ガラスファイバー捕捉マトリ
ックスの下の吸取紙が試薬溶液を吸収し、さもなければ
ガラスファイバー捕捉マトリックス上で溢れてしま
う）、ガラスファイバー捕捉マトリックスを４−メチル
ウムベリフェリルホスフェート（MUP）で処理する。表
面に結合した酵素により、蛍光を発生しないMUPがその
蛍光を測定できる４−メチルウムベリフェロン（MU）に
転換する。後述の実施例で与えるIMx速度値は、カウン
ト／秒／秒（c/s/s）で表される蛍光産物の形成速度を
示す。連結プローブの量は直接的にこの速度に関連す
る。IMx は典型的に２−12c/s/sの範囲で「機械」ノイ
ズ又はバックグラウンドを生じることを注意すべきであ
る。 後述する実施例では、フルオレセインハプテン及びビ
オチンハプテン又はカルバゾールハプテン及びアダマン
タン酢酸（アダンマンタン）ハプテンでプローブ対を標
識する。実質的にはいずれのハプテンのいずれの組合わ
せも可能であるけれども、典型的には上記に従い、フル
オレセイン及びビオチンを一緒に使用し、アダマンタン
及びカルバゾールを一緒に使用する。好ましくはプロー
ブ対の各メンバーは異なる標識をもったほうがよい。 本発明の実施に於いて有用な他の等しく適切な検出方
法には、ELISA、EIA、免疫クロマトグラフィー、及びサ
ザンブロット、ドットブロット、スロットブロット、溶
液ハイブリダイゼーション、他の当業界公知の他の方法
などの核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。 ポリメラーゼの量は以下のように定義された単位で表
わされる。酵素の１単位は、70℃で30分間で酸不溶性物
質に10ナノモルの全ヌクレオチドを取り込むのに必要と
される酵素量に等しい。リガーゼ酵素の単位は本明細書
で次のように定義する。95％精製Thermus thermophilus
DNAリガーゼの1mgは約１×108単位の比活性を持つ。こ
の定義は正確に標準化されておらず20％は変わりうる
が、最適化は当業者により容易に達成される。 本発明の目的のために標的配列を一本鎖として記述し
てある。しかし、これは、標的が実際に二重鎖でありプ
ローブとのハイブリダイゼーションの前にその相補鎖か
ら簡単に解離される場合を含むことが理解されるべきで
ある。二重鎖標的の場合、第３及び第４プローブ（２次
プローブ）であるＡ′およびＢ′はそれぞれ標的の相補
鎖とのハイブリダイゼーションによる最初の段階に参加
するであろう。一本鎖標的の場合では、それらは最初の
ハイブリダイゼーション段階に参加せず、次のハイブリ
ダイゼーション段階に参加し、第１及び第２プローブを
連結することにより産生される１次融合配列と結合す
る。標的配列にはデオキシリボ核酸（DNA）又はリボ核
酸（RNA）が含まれる。しかし、本明細書で示し、請求
の範囲に記載した標的はDNAである。本発明の目的のた
めにまた、デオキシヌクレオチド三リン酸にはデオキシ
アデノシン三リン酸、デオキシチミジン三リン酸、デオ
キシグアノシン三リン酸及びデオキシシトシン三リン酸
が含まれる。しかし、これは、類似の方法で水素結合を
形成できるならば上記４種のアナログである修飾された
塩基又は伝統的でない塩基を除外することを意味しな
い。 本発明を実施例で更に記述するが、実施例は本発明の
例であり、いずれにせよ本発明を限定するつもりはな
い。例えば、特異的である長さを有する配列をリストす
る。同一のマップの位置をカバーするが僅かに少ない又
は多い塩基数を有する配列は、リストした配列と標的上
の同一の位置にハイブリダイゼーションするのならば、
これらの配列と等価であり本発明の範囲内であると認め
られることを理解すべきである。標的配列と約80％以上
の相同性を有する配列もまた本発明の範囲内であること
も理解される。好ましくは、本発明のLCR配列のいかな
る塩基の置換も、ギャップ又は凹所から３つ以上離れて
いるべきである。 Chlamydiaは真正細胞内寄生虫であるので、正確に対
照希釈を数量化するのは困難である。一つの基本体（E
B）（elementary body）及び一つの封入体形成単位（IF
U）は理論的に一個の生物に等価であるが、この等価性
はめったに実際には起こらない。死生物が同一のEB又は
IFUに存在しているとき、実際の生物数は不正確であ
る。EB又はIFUを評価するために、培養したストック溶
液に対し作成された標準曲線を使用して、IMx速度によ
って対照溶液IFUを評価する。 実施例1:プローブセット１（配列番号２−５）を使用し
たChlamydia trachomatisの検出 Chlamydia trachomatisのMOMP遺伝子のヌクレオチド4
35−482（配列番号１）に対応する標的配列を検出する
ためにオリゴヌクレオチドプローブを選択した（図
１）。多数のChlamydia trachomatis serovars（血清学
的変異株）からなる一連の生物からの標的DNAを検出で
きるかどうかを判定するために、これらの生物に対しプ
ローブセット１（配列番号２−５）を試験した。LCR反
応混合物は、LCR緩衝液（50mM EPPS、30mM MgCl2、20
mM K+（KOH及びKClから）、10μＭ NAD）、1.7μＭの
dATP、1.7μＭのdCTP（ギャップ充填ヌクレオチド）、
上述したカルバゾール及びアダマンタンで標識した各オ
リゴヌクレオチドプローブ８×1011個の分子、５μg/ml
のアセチル化したウシ血清アルブミン（BSA）,0.5mMのE
DTA,0.02重量％アジ化ナトリウム、２単位のThermus種
のDNAポリメラーゼ（Molecular Biology Resources,Mil
waukee,WI）、18,000単位のThermus thermophilusDNAリ
ガーゼ（Abbott Laboratories）及び標的DNA（Chlamydi
a trachomatisの10個の基本体に相当）を全容量200μＬ
に含んでいた。Perkin−Elmer Model 480サーモサイク
ラーで、97℃で１秒、55℃で１秒、62℃で50秒、の設定
で合計40サイクルのサイクルを行った。 標的DNAは、多数の当業界公知の方法で調製できる。
本実施例では、標的DNAを、5mM EPPS、60mM MgCl2か
らなる緩衝液中で85−95℃で10分間、該生物（McCoy細
胞中で生育した）を熱処理することで標的DNAを調製し
た。 増幅後、連結産物を、上述したAbbott自動化IMx 分
析機を使用したサンドイッチ免疫アッセイを使用して検
出した。表１はカウント／秒／秒（C/S/S）として表現
したアッセイの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット１（配列番号２−
５）がChlamydia trachomatisの15種の異なる血清学的
変異株からの標的DNAを検出できることを示す。 実施例2:プローブセット１（配列番号２−５）を使用し
た微生物源からの標的DNAの検出 プローブセット１（配列番号２−５）（図１）を、幾
つかの微生物源からの一連の標的DNAに対してLCRアッセ
イで使用した。標的DNAを微生物源から抽出し、標的DNA
が１反応当たり約105コピー存在するということを除い
て、実施例１で記述したようにLCRを行った。プローブ
を、上述したように図１で示すようにカルバゾール及び
アダマンタンで標識し、20μＬ反応中７×1011分子供給
した。IMx 装置の複数のランを分析し、陽性対照（P
C）及び陰性対照（NC）の数値を各ランごとに求めた。
各ランに於ける陽性対照はChlamydiaの5.0 IFUである
と推定した。陰性対照はサケ精子DNA330ngであった。 表２はアッセイの結果を示す。 結果は、Chlamydia trachomatisからのDNAで生じた信
号と比較して、LCRを使用して多数の微生物源からの標
的DNAで試験したとき、プローブセット１はほとんど検
出できない信号しか与えないことを示す。幾つかの細菌
種からの信号はバックグラウンドより大きかったけれど
も、いずれもChlamydia陽性対照からの信号の1/6もなか
った。 実施例3:プローブセット４（配列番号17−20）によるCh
lamydia trachomatisの検出 プローブセット４（配列番号17、18、19及び20）（図
２）を使用して、上述のChlamydia trachomatisの潜在
プラスミドのオリゴヌクレオチド6917−6964（配列番号
16）に対応する標的DNAを検出した（図２）。ギャップ
充填のヌクレオチドがdCTP及びdTTPであり、1.2単位のT
hermus種のDNAポリメラーゼと10,800単位のThermus the
rmophilusのDNAリガーゼを使用したことを除いて実施例
１で述べたように反応を行った。プローブは200μＬ反
応液中6.2×1011分子であり、97℃で１秒、55℃で１
秒、及び62℃で50秒で、合計40サイクルのサイクルを行
った。連結産物を実施例１で述べたように自動化IMx
分析機で分析した。結果を表３に示す。 これらの結果は、プローブセット４（配列番号17−2
0）は試験したChlamydia trachomatis血清学的変異株の
15株全部からの標的DNAを検出できることを示した。 実施例4:プローブセット４（配列番号17−20）を使用し
た完全な微生物からの標的DNAの検出 プローブセット４（配列番号17−20）（図２）の特異
性を評価するために、種々の細菌、カビ、ウイルス及び
Chlamydia pneumoniae、Chlamydia psittaciの株を含む
多数の完全な（intact）微生物を使用して、LCRを行っ
た。２単位のThermus種のDNAポリメラーゼ及び18,000単
位のThermus thermophilusのDNAリガーゼを使用したこ
とを除いて、実施例３で述べたようにLCRを行った。IMx
装置の複数のランで分析を行った。各ランのプローブ
濃度及び陽性対照（PC）と陰性対照（NC）の値を後述の
表５に示す。結果を表４（微生物）と4A（Chlamydia
種）に示す。 実施例４の各ランでのプローブ濃度及び結果の陽性対
照（PC）と陰性対照（NC）の値を表５に示す。各ラン
で、陽性対照はChlamydia trachomatisの5.0 IFUであ
ると推定され、また陰性対照は330ngサケ精子DNAであっ
た。 これらの結果は、プローブセット４（配列番号17、1
8、19及び20）はChlamydia trachomatisがLCR反応混合
液に存在するときのみ連結産物を産生し、近縁のChlamy
dia pneumoniae、Chlamydia psittaciの株を含めて多数
の他の微生物が存在するときには、そうではないことを
示す。 実施例5:プローブセット５（配列番号22−25）によるCh
lamydia trachomatisの検出 プローブセット５（配列番号22−25）（図２）を使用
して上述のChlamydia trachomatisの潜在プラスミドの
ヌクレオチド6107−6160（配列番号21）（図２）に対応
する標的DNAを検出した（図２）。ギャップ充填のヌク
レオチドdATP及びdCTPを使用し、アセチル化BSAを使用
せずに、実施例１で述べたように反応を行った。97℃で
１秒、58℃で１秒、及び65℃で20秒で合計37サイクルの
サイクルを行った。上述したように、プローブをビオチ
ンとフルオレセインで標識し、200μＬ反応中２×1012
分子のプローブを用いた。図２で示し、上述したよう
に、IMx 分析機で連結産物を分析した。結果を表６に
示す。 これらの結果は、プローブセット５（配列番号22−2
5）はChlamydia trachomatisの15の異なる血清学的変異
株を検出できることを示す。 実施例6:プローブセット５（配列番号22−25）を使用し
た微生物起源からの標的DNAの検出 一連の非クラミジア微生物からの標的DNAを使用し
て、プローブセット５の特異性を評価した。標的DNAが
約105ゲノム／反応で存在することを除いて、４つのラ
ンで実施例５で述べたようにLCRを行った。各ランで、
陽性対照（PC）は5.0 IFUであると推定され、陰性対照
（NC）は330ngのヒト胎盤DNAであった。各ランのPC値及
びNC値を表７に示す。IMx 分析を上述したように行っ
た。表７はまたこれらの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット５（配列番号22−2
5）は多数の非クラミジア微生物又はChlamydia psittic
iからの標的DNAと交差反応性を示さないことを示す。 実施例7:プローブセット２（配列番号７−10）を使用し
たChlamydia trachomatisの標的DNAの検出 プローブセット２（配列番号７−10）を使用してChla
mydia trachomatisのMOMP遺伝子のヌクレオチド788−83
5（配列番号６）に対応する標的DNAを検出した（図
１）。図１に示すように及び上述したようにプローブを
合成し標識した。プローブは200μＬ反応液中２×1012
分子を用いた。ギャップ充填ヌクレオチドとしてdATP及
びdCTPを用いて、実施例１で記述したようにLCRアッセ
イを行った。表８はアッセイの結果を示す。 これらの結果は、プローブセット２は試験した大部分
の血清学的変異株で比較的低いIMx 速度を与えること
を示す。最良の結果は、血清学的変異株Ｄ、Ｆ、L1及び
L2で得られた。 実施例8:プローブセット２（配列番号７−10）を使用し
た非クラミジアの標的DNAの検出 多数の非クラミジア微生物からの標的DNAを使用し
て、LCRアッセイで200μＬ反応液中２×1012分子でプロ
ーブセット２を用いた。標的DNAが反応中約108ゲノムで
存在することを除いて、実施例７で述べたようにLCRを
行った。各ランで、陽性対照（PC）は5.0 IFUであると
推定され、陰性対照（NC）は330ngのヒト胎盤DNAであっ
た。これらのアッセイの結果を表９に示す。 これらの結果は、標的DNAとして多数の非クラミジア
細菌からのDNAを使用するとき、プローブセット２は検
出できる連結産物を産生しなかったことを示す。 実施例9:プローブセット３（配列番号12−15）を使用し
たChlamydia trachomatisの検出 多数のChlamydia trachomatisの血清学的変異株のMOM
P遺伝子のヌクレオチド1501−1506に対応する標的DNAを
検出できる能力について、プローブセット３（配列番号
12−15）を評価した（図１）。97℃で１秒、58℃で１
秒、65℃で10秒、合計37サイクルのサイクルを行ったこ
とを除いて、実施例１で述べたように（充填ヌクレオチ
ドとしてdATP及びdCTPを使用）、LCRを行った。200μＬ
反応液中２×1012分子のプローブを使用した。結果を表
10に示す。 結果は、プローブセット３（配列番号12−15）はChla
mydia trachomatis血清学的変異株B,Ba,D,E,F,G,H,J,L
1,L2及びL3からの標的DNAを検出できるが、血清学的変
異株A,C,I及びＫからの標的DNAはほとんど信号を与えな
いことを示す。 前述の実施例を例示として示したが、添付の請求の範
囲で示した本発明の範囲を制限することを意図していな
い。例えば、特定の長さの配列をリストしてある。同一
のマップ位置をカバーするが、より少ない又はより多く
のヌクレオチド数を有する配列は、リストした配列と標
的上で同一の位置にハイブリダイズするならば、上記の
配列の等価物にあり、本発明の範囲内であると理解すべ
きである。
配列番号:1
配列の長さ:48
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
起源
生物名:Chlamydia trachomatis
配列
配列番号:2
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:3
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:4
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:5
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:6
配列の長さ:48
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
起源
生物名:Chlamydia trachomatis
配列
配列番号:7
配列の長さ:25
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:8
配列の長さ:22
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:9
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:10
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:11
配列の長さ:46
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（genomic）
起源
生物名:Chlamydia trachomatis
配列
配列番号:12
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:13
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:14
配列の長さ:20
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:15
配列の長さ:23
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:16
配列の長さ:48
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（extrachromosomal）
起源
生物名:Chlamydia trachomatis
配列
配列番号:17
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:18
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:19
配列の長さ:21
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:20
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:21
配列の長さ:54
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（extrachromosomal）
起源
生物名:Chlamydia trachomatis
配列
配列番号:22
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:23
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:24
配列の長さ:24
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：環状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
配列番号:25
配列の長さ:27
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（synthetic）
配列
フロントページの続き
(72)発明者 カリーノ，ジヨン・ジェイ
アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガ
ーニー、フエズント・メドウ・コート・
215
(72)発明者 サリチユーロ，ジヨン・エイ
アメリカ合衆国、ウイスコンシン・
53143、ケノーシヤ、トウエンテイ・サ
ード・アベニユー・8341
(72)発明者 パビツク，エドワード・ケイ
アメリカ合衆国、イリノイ・60639、シ
カゴ、ノース・マクビツカー・2450
(72)発明者 クロノウスキー，ポール・エイ
アメリカ合衆国、イリノイ・60097、ワ
ンダー・レイク、ヒルトツプ・ドライ
ブ・3105
(72)発明者 マンラブ，マシユー・テイー
アメリカ合衆国、イリノイ・60061、バ
ーモン・ヒルズ、エコー・コート・11、
アパートメント・５
(72)発明者 マーシヤル，ロナルド・エル
アメリカ合衆国、イリノイ・60099、ザ
イオン、ウインスロツプ・コート・900
(56)参考文献 欧州特許出願公開336412（ＥＰ，Ａ
１)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/00 - 1/70
G01N 33/53
C07H 21/00 - 21/04
ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ
ｅｎｅＳｅｑ
ＣＡ（ＳＴＮ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (7)
- 【請求項１】クラミジア トラコーマ（Chlamydia trac
homatis）からの標的DNAを検出するための組成物であっ
て、該組成物が配列番号２及び４、配列番号３及び５、
配列番号７及び９、配列番号８及び10、配列番号12及び
14、配列番号13及び15、配列番号17及び19、配列番号18
及び20、配列番号22及び24、並びに配列番号23及び25か
らなる群から選択されるオリゴヌクレオチドプローブ対
を含むことを特徴とする組成物。 - 【請求項２】検体中のクラミジア トラコーマからの標
的DNAの存在の検出方法であって、該方法は、 ａ）標的DNAを含む疑いのある検体と請求項１記載の少
なくとも１つのプローブ対を混合し、 ｂ）１種又は複数の、しかし４種全部よりは少ないデオ
キシヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼ及びリガーゼ
を供給し、 ｃ）検体とプローブセットの混合物を変性させ、二本鎖
DNAを解離させ、 ｄ）変性したDNAに該プローブセットをハイブリダイズ
させ、各プローブ対の各プローブの間にギャップを有す
るハイブリダイズしたプローブを作成し、 ｅ）鋳型依存性様式でハイブリダイズしたプローブを補
正し、隣接し連結可能なプローブを作成し、 ｆ）隣接したプローブを連結し、再構成したプローブを
形成させ、 ｇ）クラミジア トラコーマからの標的DNAの存在の尺
度として再構成されたプローブの形成の程度を測定する
こと の各段階を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項３】プローブセット１（配列番号２−５）、プ
ローブセット２（配列番号７−10）、プローブセット３
（配列番号12−15）、プローブセット４（配列番号17−
20）及びプローブセット５（配列番号22−25）からなる
群から選択される４本のオリゴヌクレオチドプローブセ
ットを含む組成物となるように、一組の追加オリゴヌク
レオチド対を含む請求項１に記載の組成物。 - 【請求項４】セットの少なくとも１つのプローブがレポ
ーター基を有することを特徴とする請求項３記載の組成
物。 - 【請求項５】検体中のクラミジア トラコーマからの標
的DNAの存在の検出方法であって、該方法は、 ａ）標的DNAを含む疑いのある検体と請求項３に記載の
少なくとも１つのプローブセットを混合し、 ｂ）１種又は複数の、しかし４種全部よりは少ないデオ
キシヌクレオチド三リン酸、ポリメラーゼ及びリガーゼ
を供給し、 ｃ）検体とプローブセットの混合物を変性させ、二本鎖
DNAを解離させ、 ｄ）変性したDNAに該プローブセットをハイブリダイズ
させ、各プローブ対の各プローブの間にギャップを有す
るハイブリダイズしたプローブを作成し、 ｅ）鋳型依存性様式でハイブリダイズしたプローブを補
正し、隣接し連結可能なプローブを作成し、 ｆ）隣接したプローブを連結し、再構成したプローブを
形成させ、 ｇ）段階ｂ）ないしｆ）を少なくとも一度繰り返し、及
び ｈ）クラミジア トラコーマからの標的DNAの存在の尺
度として再構成されたプローブの形成の程度を測定する
こと の各段階を含むリガーゼ連鎖反応を利用することを特徴
とする方法。 - 【請求項６】プローブセットの少なくとも１つのプロー
ブがハプテンで標識され、該方法が更に、免疫アッセイ
様式を使用して該標識を検出することを含むことを特徴
とする請求項５記載の方法。 - 【請求項７】クラミジア トラコーマからの標的DNAを
検出するために有用なキットであって、該キットが、 ａ）少なくとも１つの請求項３に記載のプローブセッ
ト、 ｂ）ポリメラーゼ試薬、 ｃ）１種又は複数であるが、４種全部よりは少ないデオ
キシヌクレオチド三リン酸、及び ｄ）リガーゼ試薬 を含有する１つ又は複数の適切な容器を含むキット。 発明の分野 本発明は、例えばリガーゼ連鎖反応（LCR）法による
トラコーマ・クラミジア（Chlamydia trachomatis）を
検出するために有用なオリゴヌクレオチドに関する。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/116,389 | 1993-09-03 | ||
| US08/116,389 US5601978A (en) | 1993-09-03 | 1993-09-03 | Oligonucleotides and methods for the detection of chlamydia trachomatis |
| PCT/US1994/013895 WO1995006756A2 (en) | 1993-09-03 | 1994-08-18 | OLIGONUCLEOTIDES AND METHODS FOR THE DETECTION OF $i(CHLAMYDIA TRACHOMATIS) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09503910A JPH09503910A (ja) | 1997-04-22 |
| JP3418401B2 true JP3418401B2 (ja) | 2003-06-23 |
Family
ID=22366891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50833395A Expired - Fee Related JP3418401B2 (ja) | 1993-09-03 | 1994-08-18 | トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5601978A (ja) |
| EP (1) | EP0716714B1 (ja) |
| JP (1) | JP3418401B2 (ja) |
| AT (1) | ATE211769T1 (ja) |
| AU (1) | AU1334495A (ja) |
| CA (1) | CA2170870C (ja) |
| DE (1) | DE69429626T2 (ja) |
| ES (1) | ES2171529T3 (ja) |
| WO (1) | WO1995006756A2 (ja) |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6230501B1 (en) | 1994-04-14 | 2001-05-15 | Promxd Technology, Inc. | Ergonomic systems and methods providing intelligent adaptive surfaces and temperature control |
| US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US20070269799A9 (en) * | 1994-06-22 | 2007-11-22 | Zhang David Y | Nucleic acid amplification methods |
| CA2203398A1 (en) * | 1994-10-26 | 1996-05-09 | Thomas Sandal | An enzyme with lipolytic activity |
| JPH11506605A (ja) * | 1995-06-07 | 1999-06-15 | アボツト・ラボラトリーズ | 増幅反応におけるバックグラウンドを減少させるためにプローブをマスキングする方法 |
| US5888736A (en) * | 1995-12-22 | 1999-03-30 | Visible Genetics, Inc. | Method, compositions and kit for detection and identification of microorganisms |
| US6852487B1 (en) | 1996-02-09 | 2005-02-08 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using the ligase detection reaction with addressable arrays |
| US6413718B1 (en) | 1996-05-01 | 2002-07-02 | Visible Genetics Inc. | Method for sequencing of nucleic acid polymers |
| EP1736554B1 (en) | 1996-05-29 | 2013-10-09 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
| US5814490A (en) * | 1996-06-11 | 1998-09-29 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acids |
| US20060156517A1 (en) | 1997-08-22 | 2006-07-20 | Hammerslag Gary R | Reel based closure system |
| US6096501A (en) * | 1997-11-04 | 2000-08-01 | Becton Dickinson And Company | Assay for Chlamydia trachomatis by amplification and detection of Chlamydia trachomatis crytpic plasmid |
| US5837469A (en) * | 1997-11-04 | 1998-11-17 | Becton Dickinson And Company | Assay for chlamydia trachomatis by amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acid |
| US6261769B1 (en) | 1998-03-31 | 2001-07-17 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Intergenic spacer target sequence for detecting and distinguishing Chlamydial species or strains |
| US6225443B1 (en) * | 1999-05-19 | 2001-05-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Cytotoxic T lymphocyte epitopes of the major outer membrane protein of chlamydia trachomatis |
| US20050214825A1 (en) * | 2000-02-07 | 2005-09-29 | John Stuelpnagel | Multiplex sample analysis on universal arrays |
| US7582420B2 (en) | 2001-07-12 | 2009-09-01 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US8076063B2 (en) * | 2000-02-07 | 2011-12-13 | Illumina, Inc. | Multiplexed methylation detection methods |
| US7955794B2 (en) | 2000-09-21 | 2011-06-07 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| US6682889B1 (en) | 2000-11-08 | 2004-01-27 | Becton, Dickinson And Company | Amplification and detection of organisms of the Chlamydiaceae family |
| AU2002366101A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-06-10 | Activbiotics, Inc. | Hybrid oligonucleotide primers for amplification of dna and uses thereof |
| AU2003269908A1 (en) * | 2002-07-15 | 2004-02-02 | Illumina, Inc. | Multiplex nucleic acid reactions |
| KR100532664B1 (ko) * | 2002-09-09 | 2005-12-02 | 주식회사 바이오메드랩 | 클라미디아 트라코마티스 탐지용 프로브, 이를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 탐지용 키트, 및 이를 이용한 클라미디아 트라코마티스의 탐지방법 |
| JP4874986B2 (ja) | 2004-10-29 | 2012-02-15 | ボア テクノロジイ インコーポレイテッド | ケーブル締め付け機構およびその付勢方法 |
| US20070065837A1 (en) * | 2005-09-21 | 2007-03-22 | Qiagen Diagnostics Gmbh | Methods and compositions for the detection of Chlamydia trachomatis |
| US8468657B2 (en) | 2008-11-21 | 2013-06-25 | Boa Technology, Inc. | Reel based lacing system |
| CN102821635B (zh) | 2010-01-21 | 2015-10-14 | 博技术有限公司 | 用于系带系统的引导装置 |
| KR101942227B1 (ko) | 2010-04-30 | 2019-01-24 | 보아 테크놀러지, 인크. | 릴 기반 끈 조임 시스템 |
| US9375053B2 (en) | 2012-03-15 | 2016-06-28 | Boa Technology, Inc. | Tightening mechanisms and applications including the same |
| US10070695B2 (en) | 2010-04-30 | 2018-09-11 | Boa Technology Inc. | Tightening mechanisms and applications including the same |
| DE102011078342A1 (de) * | 2011-06-29 | 2013-01-03 | Aj Innuscreen Gmbh | Rehybridisierendes Sondensystem zur qualitativen und quantitativen Messung von spezifischen Nukleinsäuren in Echtzeit |
| US9101181B2 (en) | 2011-10-13 | 2015-08-11 | Boa Technology Inc. | Reel-based lacing system |
| EP3871548B1 (en) | 2012-08-31 | 2024-04-03 | NIKE Innovate C.V. | Motorized tensioning system |
| US9516923B2 (en) | 2012-11-02 | 2016-12-13 | Boa Technology Inc. | Coupling members for closure devices and systems |
| WO2014074645A2 (en) | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Boa Technology Inc. | Devices and methods for adjusting the fit of footwear |
| US9439477B2 (en) | 2013-01-28 | 2016-09-13 | Boa Technology Inc. | Lace fixation assembly and system |
| US10702409B2 (en) | 2013-02-05 | 2020-07-07 | Boa Technology Inc. | Closure devices for medical devices and methods |
| US10251451B2 (en) | 2013-03-05 | 2019-04-09 | Boa Technology Inc. | Closure devices including incremental release mechanisms and methods therefor |
| US9610185B2 (en) | 2013-03-05 | 2017-04-04 | Boa Technology Inc. | Systems, methods, and devices for automatic closure of medical devices |
| US9706814B2 (en) | 2013-07-10 | 2017-07-18 | Boa Technology Inc. | Closure devices including incremental release mechanisms and methods therefor |
| WO2014165541A2 (en) | 2013-04-01 | 2014-10-09 | Boa Technology Inc. | Methods and devices for retrofitting footwear to include a reel based closure system |
| US10076160B2 (en) | 2013-06-05 | 2018-09-18 | Boa Technology Inc. | Integrated closure device components and methods |
| JP6778103B2 (ja) | 2013-06-05 | 2020-10-28 | ボア テクノロジー，インコーポレイテッド | 一体化されたクロージャー装置部品および方法 |
| DE112014003135B4 (de) | 2013-07-02 | 2020-12-24 | Boa Technology Inc. | Rolle zur verwendung mit einem verschnürungssystem zum festziehen eines gegenstandes sowie vorrichtungen hierzu und verfahren zum zusammenbauen einer vorrichtung zum festziehen eines gegenstandes |
| WO2015035257A2 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-12 | Boa Technology Inc. | Alternative lacing guides for tightening mechanisms and methods therefor |
| US9681705B2 (en) | 2013-09-13 | 2017-06-20 | Boa Technology Inc. | Failure compensating lace tension devices and methods |
| KR101895140B1 (ko) | 2013-11-18 | 2018-09-04 | 보아 테크놀러지, 인크. | 보철 및 장구의 자동 폐쇄를 제공하기 위한 방법 및 장치 |
| USD835976S1 (en) | 2014-01-16 | 2018-12-18 | Boa Technology Inc. | Coupling member |
| USD751281S1 (en) | 2014-08-12 | 2016-03-15 | Boa Technology, Inc. | Footwear tightening reels |
| USD767269S1 (en) | 2014-08-26 | 2016-09-27 | Boa Technology Inc. | Footwear tightening reel |
| US20160058127A1 (en) | 2014-08-28 | 2016-03-03 | Boa Technology Inc. | Devices and methods for enhancing the fit of boots and other footwear |
| USD758061S1 (en) | 2014-09-08 | 2016-06-07 | Boa Technology, Inc. | Lace tightening device |
| WO2016054317A1 (en) | 2014-10-01 | 2016-04-07 | Ossur Hf | Support for articles and methods for using the same |
| WO2016057697A1 (en) | 2014-10-07 | 2016-04-14 | Boa Technology Inc. | A tension adjustment mechanism and a method for adjusting the fit of a shoe |
| USD776421S1 (en) | 2015-01-16 | 2017-01-17 | Boa Technology, Inc. | In-footwear lace tightening reel |
| USD835898S1 (en) | 2015-01-16 | 2018-12-18 | Boa Technology Inc. | Footwear lace tightening reel stabilizer |
| US10004297B2 (en) | 2015-10-15 | 2018-06-26 | Boa Technology Inc. | Lacing configurations for footwear |
| KR102391910B1 (ko) | 2016-08-02 | 2022-04-28 | 보아 테크놀러지, 인크. | 신발끈 결속 시스템의 인장 부재 가이드 |
| WO2018107050A1 (en) | 2016-12-09 | 2018-06-14 | Boa Technology Inc. | Reel based closure system |
| US10543630B2 (en) | 2017-02-27 | 2020-01-28 | Boa Technology Inc. | Reel based closure system employing a friction based tension mechanism |
| US11357279B2 (en) | 2017-05-09 | 2022-06-14 | Boa Technology Inc. | Closure components for a helmet layer and methods for installing same |
| US10772384B2 (en) | 2017-07-18 | 2020-09-15 | Boa Technology Inc. | System and methods for minimizing dynamic lace movement |
| US11492228B2 (en) | 2019-05-01 | 2022-11-08 | Boa Technology Inc. | Reel based closure system |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US5011769A (en) * | 1985-12-05 | 1991-04-30 | Meiogenics U.S. Limited Partnership | Methods for detecting nucleic acid sequences |
| JP3116353B2 (ja) * | 1986-11-24 | 2000-12-11 | ジエン‐プローブ・インコーポレイテツド | 非ウイルス微生物の検出及び／又は定量用核酸プローブ |
| CA1323293C (en) * | 1987-12-11 | 1993-10-19 | Keith C. Backman | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
| IT1224253B (it) * | 1988-04-08 | 1990-09-26 | Sclavo Spa | Oligonucleotidi sintetici utili per la determinazione di chlamydia trachomatis in un campione biologico |
| US5232829A (en) * | 1989-09-29 | 1993-08-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Detection of chlamydia trachomatis by polymerase chain reaction using biotin labelled lina primers and capture probes |
| CA2035010C (en) * | 1990-01-26 | 1996-12-10 | Keith C. Backman | Method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
| FR2663040B1 (fr) * | 1990-06-11 | 1995-09-15 | Bio Merieux | Procede de detection d'une sequence nucleotidique selon la technique d'hybridation sandwich. |
| GB9019512D0 (en) * | 1990-09-06 | 1990-10-24 | Ici Plc | Assay method |
| AU2844792A (en) * | 1991-12-11 | 1993-06-17 | Becton Dickinson & Company | Probes to chlamydia trachomatis |
| CA2124795A1 (en) * | 1991-12-23 | 1993-07-08 | Ray Sanchez-Pescador | Chlamydiae probes for use in solution phase sandwich hybridization assays |
| JPH07504087A (ja) * | 1992-02-12 | 1995-05-11 | クロマジェン インク | 蛍光性ｎ−ヌクレオシド及び蛍光性ｎ−ヌクレオシド構造類似体の応用 |
-
1993
- 1993-09-03 US US08/116,389 patent/US5601978A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-08-18 EP EP95904799A patent/EP0716714B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-18 WO PCT/US1994/013895 patent/WO1995006756A2/en active IP Right Grant
- 1994-08-18 AU AU13344/95A patent/AU1334495A/en not_active Abandoned
- 1994-08-18 AT AT95904799T patent/ATE211769T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-08-18 DE DE69429626T patent/DE69429626T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-18 JP JP50833395A patent/JP3418401B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-08-18 ES ES95904799T patent/ES2171529T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-08-18 CA CA002170870A patent/CA2170870C/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-09-05 US US08/708,431 patent/US5756298A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-06-23 US US08/880,830 patent/US5846785A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5601978A (en) | 1997-02-11 |
| AU1334495A (en) | 1995-03-22 |
| WO1995006756A2 (en) | 1995-03-09 |
| WO1995006756A3 (en) | 1995-05-04 |
| EP0716714B1 (en) | 2002-01-09 |
| US5756298A (en) | 1998-05-26 |
| DE69429626D1 (de) | 2002-02-14 |
| EP0716714A1 (en) | 1996-06-19 |
| CA2170870C (en) | 2005-12-27 |
| CA2170870A1 (en) | 1995-03-09 |
| ATE211769T1 (de) | 2002-01-15 |
| ES2171529T3 (es) | 2002-09-16 |
| DE69429626T2 (de) | 2002-09-12 |
| JPH09503910A (ja) | 1997-04-22 |
| US5846785A (en) | 1998-12-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3418401B2 (ja) | トラコーマ・クラミジア検出のためのオリゴヌクレオチド及び方法 | |
| CN111549176B (zh) | 用于检测SARS-CoV-2的LAMP引物组及试剂盒 | |
| EP0571911A2 (en) | Mycobacteria probes | |
| JP5986043B2 (ja) | クラミジア・トラコマチスを検出するためのプライマー及びプローブ配列 | |
| US9458513B2 (en) | Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same | |
| EP0892856A1 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
| AU675080B2 (en) | Probes to mycobacterium avium mycobacterium intracellulare and mycobacterium paratuberculosis | |
| JPH11502124A (ja) | オールインワン核酸増幅アッセイ | |
| US20030082563A1 (en) | Detection of bacillus anthracis | |
| JP4387479B2 (ja) | トラコーマクラミジア潜在プラスミドの増幅および検出による、トラコーマクラミジアの検定 | |
| JP4744878B2 (ja) | トラコーマクラミジア及び淋菌の増幅及び検出のためのポリヌクレオチド | |
| US5968739A (en) | Nucleic acid primers and probes for detecting Legionella pneumophila | |
| JP2000511777A (ja) | クラミジア・ニューモニエ検出用核酸プライマーおよびプローブ | |
| AU5359690A (en) | Polymerase chain reaction products incorporating reporter moieties and affinity seperation | |
| JP3127135B2 (ja) | トラコーマクラミジア核酸の増幅および検出 | |
| JPH10500567A (ja) | マイコバクテリアの検出用材料及び検出方法 | |
| Rossau et al. | DNA probes for Bordetella species and a colorimetric reverse hybridization assay for the detection of Bordetella pertussis | |
| EP1541697B1 (en) | Detection of group B streptococcus | |
| KR20110052794A (ko) | Ａ형 간염 바이러스에 대한 역전사 중합효소 연쇄반응 효소면역 측정법 | |
| JPH0588A (ja) | 新規核酸断片およびこれらを用いたマイコプラズマの検出法 | |
| US6010857A (en) | Detection of cervical chlamydia trachomatis infection | |
| JP2000342261A (ja) | ブルクホルデリア・セパシアの検出法及び検出用キット |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |