JP3240151B2 - Ｑベータレプリカーゼを使用する選択的増幅系 - Google Patents
Ｑベータレプリカーゼを使用する選択的増幅系Info
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- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Description
【０００１】Ｑベータ（Ｑβ）レプリカーゼは、バクテ
リオファージＱβから誘導された鋳型特異的ＲＮＡ特異
的ＲＮＡポリメラーゼである。生体内で、Ｑβレプリカ
ーゼの正常の機能はＱβバクテリオファージのＲＮＡゲ
ノムを複製して子孫のファージゲノムを産生することで
ある。各感染性Ｑβヴィリオンは分子量１．５×１０6
の一本鎖のＲＮＡの１分子を含有し、これはウイルスの
プラス（＋）鎖と呼ばれる。これはウイルスのタンパク
質の合成を指令するｍＲＮＡとして利用される鎖であ
る。（＋）鎖を鋳型として使用して、Ｑβレプリカーゼ
はもとの鋳型に対して相補的のＲＮＡコピーを産生す
る。これらのＲＮＡ分子はマイナス（−）鎖と呼ばれ
る。重要なことには、両者の（＋）および（−）の鎖は
酵素のための鋳型である。したがって、ＲＮＡ鋳型の複
製は幾何学的方式で進行する（すなわち、１、２、４、
８、１６、３２など）。
リオファージＱβから誘導された鋳型特異的ＲＮＡ特異
的ＲＮＡポリメラーゼである。生体内で、Ｑβレプリカ
ーゼの正常の機能はＱβバクテリオファージのＲＮＡゲ
ノムを複製して子孫のファージゲノムを産生することで
ある。各感染性Ｑβヴィリオンは分子量１．５×１０6
の一本鎖のＲＮＡの１分子を含有し、これはウイルスの
プラス（＋）鎖と呼ばれる。これはウイルスのタンパク
質の合成を指令するｍＲＮＡとして利用される鎖であ
る。（＋）鎖を鋳型として使用して、Ｑβレプリカーゼ
はもとの鋳型に対して相補的のＲＮＡコピーを産生す
る。これらのＲＮＡ分子はマイナス（−）鎖と呼ばれ
る。重要なことには、両者の（＋）および（−）の鎖は
酵素のための鋳型である。したがって、ＲＮＡ鋳型の複
製は幾何学的方式で進行する（すなわち、１、２、４、
８、１６、３２など）。
【０００２】生体外において、酵素は鋳型としてＱβゲ
ノムの外に制限された数の他のＲＮＡ分子を利用するこ
とができる。比較的よく研究されている１つのこのよう
なＲＮＡ鋳型は、ミディバリアント（ｍｉｄｉｖａｒｉ
ａｎｔ）（ＭＤＶ）と呼ばれる。ＭＤＶはＱβＲＮＡゲ
ノムより有意に小さく、そしてＱβレプリカーゼ反応に
おいて天然に産出する産生物として発見された。核酸の
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅可能なリ
ポータープローブとして働くことができるＭＤＶ ＲＮ
Ａの変異型を設計することに、かなりの努力が払われ
た。
ノムの外に制限された数の他のＲＮＡ分子を利用するこ
とができる。比較的よく研究されている１つのこのよう
なＲＮＡ鋳型は、ミディバリアント（ｍｉｄｉｖａｒｉ
ａｎｔ）（ＭＤＶ）と呼ばれる。ＭＤＶはＱβＲＮＡゲ
ノムより有意に小さく、そしてＱβレプリカーゼ反応に
おいて天然に産出する産生物として発見された。核酸の
ハイブリダイゼーションアッセイにおいて増幅可能なリ
ポータープローブとして働くことができるＭＤＶ ＲＮ
Ａの変異型を設計することに、かなりの努力が払われ
た。
【０００３】一般に、リポータープローブは２つの機能
で働くであろう。それは、前以て決定した標的核酸と特
異的にハイブリダイゼーションすることができるヌクレ
オチド配列を含有し、そしてアッセイにおいてその検出
を可能とするある種類の配位子を含有するであろう。普
通の検出配位子は、放射性Ｐ−３２またはＩ−１２５、
フルオレセイン、あるいは種々の方法でプローブ配列に
結合することができるビオチンである。
で働くであろう。それは、前以て決定した標的核酸と特
異的にハイブリダイゼーションすることができるヌクレ
オチド配列を含有し、そしてアッセイにおいてその検出
を可能とするある種類の配位子を含有するであろう。普
通の検出配位子は、放射性Ｐ−３２またはＩ−１２５、
フルオレセイン、あるいは種々の方法でプローブ配列に
結合することができるビオチンである。
【０００４】ＭＤＶリポーターの場合において、プロー
ブ配列は次のような方法でＭＤＶ分子の中に構成され
る：１）ＭＤＶプローブをその意図する標的核酸に特異
的にハイブリダイゼーションさせることができ、そして
２）追加のプローブ配列にかかわらずＱβレプリカーゼ
により複製することができる状態に止まる。こうして、
ＭＤＶは増幅可能な検出配位子として働くことができ
る。十億以上の子孫分子は、ほぼ３０分で単一の出発鋳
型ＭＤＶ分子から産生されることができる。こうして、
非常に多数の検出配位子（ＭＤＶ ＲＮＡ分子）は非常
にわずかのハイブリダイゼーションしたリポータープロ
ーブから産生されることができる。これにより、極めて
感受性の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、すなわ
ち、試験試料中の非常にわずかの標的分子（または有機
体）を検出することができるアッセイ、を開発すること
ができる。
ブ配列は次のような方法でＭＤＶ分子の中に構成され
る：１）ＭＤＶプローブをその意図する標的核酸に特異
的にハイブリダイゼーションさせることができ、そして
２）追加のプローブ配列にかかわらずＱβレプリカーゼ
により複製することができる状態に止まる。こうして、
ＭＤＶは増幅可能な検出配位子として働くことができ
る。十億以上の子孫分子は、ほぼ３０分で単一の出発鋳
型ＭＤＶ分子から産生されることができる。こうして、
非常に多数の検出配位子（ＭＤＶ ＲＮＡ分子）は非常
にわずかのハイブリダイゼーションしたリポータープロ
ーブから産生されることができる。これにより、極めて
感受性の核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、すなわ
ち、試験試料中の非常にわずかの標的分子（または有機
体）を検出することができるアッセイ、を開発すること
ができる。
【０００５】種々の操作したＭＤＶプローブ分子は、米
国特許第４，７８６，６００号および米国特許出願第２
５２，２４３号および米国特許出願第３７０，２１８号
に記載されており、それらの教示をここに引用によって
加える。
国特許第４，７８６，６００号および米国特許出願第２
５２，２４３号および米国特許出願第３７０，２１８号
に記載されており、それらの教示をここに引用によって
加える。
【０００６】アッセイの感受性は所定の量の標的核酸に
ついて発生することができるシグナルの量ばかりでな
く、かつまた標的核酸の不存在下でさえ発生する「バッ
クグラウンド」のシグナルの量の関数である。Ｑβレプ
リカーゼを使用する核酸プローブ系におけるバックグラ
ウンドの１つの有意の源は、「野生型」または「内因
性」変異型ＲＮＡと呼ぶ汚染性ＲＮＡがあるＱβレプリ
カーゼ調製物中に存在することである。エオヤング（Ｅ
ｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇｕｓｔ）の手順
により調製されたＱβレプリカーゼは、典型的には、タ
ンパク質の１μｇ当たり１００〜１０，０００分子の野
生型の変異型ＲＮＡを含有する。エオヤング（Ｅｏｙａ
ｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇｕｓｔ）、Ｐｒｏｇ．
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２：８２９−８３９
（１９７２）。この野生型の変異型ＲＮＡは、外因性
（すなわち、プローブ）の鋳型ＲＮＡが反応から省略さ
れるときでさえ、複製しそしてシグナルを発生する。こ
の野生型の変異型ＲＮＡはプローブＲＮＡとＱβレプリ
カーゼについて競争し、小さい数のプローブＲＮＡを検
出可能なレベルに複製する酵素の能力をきびしく制限す
る。これは、順番に、達成可能なアッセイの感度を野生
型の変異型ＲＮＡのバックグラウンドのレベルより上の
ある値に制限する。
ついて発生することができるシグナルの量ばかりでな
く、かつまた標的核酸の不存在下でさえ発生する「バッ
クグラウンド」のシグナルの量の関数である。Ｑβレプ
リカーゼを使用する核酸プローブ系におけるバックグラ
ウンドの１つの有意の源は、「野生型」または「内因
性」変異型ＲＮＡと呼ぶ汚染性ＲＮＡがあるＱβレプリ
カーゼ調製物中に存在することである。エオヤング（Ｅ
ｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇｕｓｔ）の手順
により調製されたＱβレプリカーゼは、典型的には、タ
ンパク質の１μｇ当たり１００〜１０，０００分子の野
生型の変異型ＲＮＡを含有する。エオヤング（Ｅｏｙａ
ｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇｕｓｔ）、Ｐｒｏｇ．
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２：８２９−８３９
（１９７２）。この野生型の変異型ＲＮＡは、外因性
（すなわち、プローブ）の鋳型ＲＮＡが反応から省略さ
れるときでさえ、複製しそしてシグナルを発生する。こ
の野生型の変異型ＲＮＡはプローブＲＮＡとＱβレプリ
カーゼについて競争し、小さい数のプローブＲＮＡを検
出可能なレベルに複製する酵素の能力をきびしく制限す
る。これは、順番に、達成可能なアッセイの感度を野生
型の変異型ＲＮＡのバックグラウンドのレベルより上の
ある値に制限する。
【０００７】このバックグラウンドのシグナルを制限す
る１つの手段は、Ｑβレプリカーゼ酵素の精製を改良し
て、それが汚染性野生型の変異型ＲＮＡをより少なく含
有するか、あるいはまったく含有しないようにすること
であろう。ジフランセスコ（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ）
は、同時係属米国特許出願第０７／３６４，３０６号、
１９８９年６月９日提出、その開示をここに引用によっ
て加える、において、野生型ＭＤＶ ＲＮＡを含まない
と思われる、高度に精製された酵素を生ずる、改良され
たＱβレプリカーゼの精製のプロトコルを開示してい
る。
る１つの手段は、Ｑβレプリカーゼ酵素の精製を改良し
て、それが汚染性野生型の変異型ＲＮＡをより少なく含
有するか、あるいはまったく含有しないようにすること
であろう。ジフランセスコ（ＤｉＦｒａｎｃｅｓｃｏ）
は、同時係属米国特許出願第０７／３６４，３０６号、
１９８９年６月９日提出、その開示をここに引用によっ
て加える、において、野生型ＭＤＶ ＲＮＡを含まない
と思われる、高度に精製された酵素を生ずる、改良され
たＱβレプリカーゼの精製のプロトコルを開示してい
る。
【０００８】野生型ＭＤＶによるアッセイのバックグラ
ウンドを制限する他の手段は、野生型ＭＤＶ分子のそれ
に関してプローブの分子の複製を増大する、組み換えＭ
ＤＶプローブ分子およびアッセイの条件を案出すること
であろう。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７４）は、色
素の臭化エチジウムに対して「野生型」（内因性）ＭＤ
Ｖより感受性が低い複製をもつ、突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａを記載している。しかしながら、クレイマー（Ｋｒａ
ｍｅｒ）らはこのような突然変異ＭＤＶ分子をプローブ
として使用することを論じていない。
ウンドを制限する他の手段は、野生型ＭＤＶ分子のそれ
に関してプローブの分子の複製を増大する、組み換えＭ
ＤＶプローブ分子およびアッセイの条件を案出すること
であろう。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７４）は、色
素の臭化エチジウムに対して「野生型」（内因性）ＭＤ
Ｖより感受性が低い複製をもつ、突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａを記載している。しかしながら、クレイマー（Ｋｒａ
ｍｅｒ）らはこのような突然変異ＭＤＶ分子をプローブ
として使用することを論じていない。
【０００９】Ｑβレプリカーゼを使用するアッセイの便
利さおよび精確さの主要な考察は、増幅した産生物の検
出である。生体外において、Ｑβレプリカーゼは１つの
ＭＤＶ分子を複製することができる。しかしながら、ま
た、複製産生物の出現の時間的経過が反応の開始におい
て存在するＭＤＶ鋳型の量を反映するのは、Ｑβレプリ
カーゼの性質である。すなわち、特定の組の反応条件が
与えられると、大量の入力ＭＤＶはより低い入力レベル
より速く観測可能なレベルの産生物のＭＤＶを生ずるで
あろう。事実、入力ＭＤＶと観測可能な産生物への時間
の間の、予測可能な、数学的関係が存在する。こうし
て、実験の試料中の標的核酸のレベルについての情報が
推定することができることにおいて、Ｑβレプリカーゼ
反応の反応速度論の監視は有意の価値を有する。
利さおよび精確さの主要な考察は、増幅した産生物の検
出である。生体外において、Ｑβレプリカーゼは１つの
ＭＤＶ分子を複製することができる。しかしながら、ま
た、複製産生物の出現の時間的経過が反応の開始におい
て存在するＭＤＶ鋳型の量を反映するのは、Ｑβレプリ
カーゼの性質である。すなわち、特定の組の反応条件が
与えられると、大量の入力ＭＤＶはより低い入力レベル
より速く観測可能なレベルの産生物のＭＤＶを生ずるで
あろう。事実、入力ＭＤＶと観測可能な産生物への時間
の間の、予測可能な、数学的関係が存在する。こうし
て、実験の試料中の標的核酸のレベルについての情報が
推定することができることにおいて、Ｑβレプリカーゼ
反応の反応速度論の監視は有意の価値を有する。
【００１０】阻害性化学的因子を注意して選択すること
によって、複製（増幅）反応の間のＭＤＶの産生の便利
な、定量的、反応速度論の分析を可能とするＭＤＶプロ
ーブを設計することができる。
によって、複製（増幅）反応の間のＭＤＶの産生の便利
な、定量的、反応速度論の分析を可能とするＭＤＶプロ
ーブを設計することができる。
【００１１】本発明は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を
阻害する特定の阻害性化学的因子の存在下に複製するＭ
ＤＶプローブ、およびＱβレプリカーゼ増幅系において
ＭＤＶ ＲＮＡプローブ分子を選択的に増幅する方法に
関する。新規なＭＤＶプローブの構成体の産生および使
用を記載する。これらのプローブは、従来記載されたプ
ローブ分子を越えたある数の利点を同時にを有する、こ
れらの利点次のものを包含する： １）野生型ＭＤＶ ＲＮＡ分子の複製によるアッセイの
バックグラウンドのシグナルの減少、 ２）プローブが選択的に抵抗性である化学的因子の存在
下に、プローブのより少ない分子を検出する能力、およ
び ３）Ｑβレプリカーゼの増幅アッセイにおいて便利なか
つ定量的実時間の測定を実施する能力。
阻害する特定の阻害性化学的因子の存在下に複製するＭ
ＤＶプローブ、およびＱβレプリカーゼ増幅系において
ＭＤＶ ＲＮＡプローブ分子を選択的に増幅する方法に
関する。新規なＭＤＶプローブの構成体の産生および使
用を記載する。これらのプローブは、従来記載されたプ
ローブ分子を越えたある数の利点を同時にを有する、こ
れらの利点次のものを包含する： １）野生型ＭＤＶ ＲＮＡ分子の複製によるアッセイの
バックグラウンドのシグナルの減少、 ２）プローブが選択的に抵抗性である化学的因子の存在
下に、プローブのより少ない分子を検出する能力、およ
び ３）Ｑβレプリカーゼの増幅アッセイにおいて便利なか
つ定量的実時間の測定を実施する能力。
【００１２】本発明のプローブは、非突然変異の野生型
ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子による阻害に対し
て抵抗性である、突然変異のミディバリアントのＲＮＡ
（突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ）を、選択した核酸プローブ
配列に連鎖して、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブを産
生することによって産生される。次いで、組み換えＭＤ
Ｖ ＲＮＡプローブはＱβレプリカーゼ増幅系において
使用することができる。この方法において、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブおよび野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複
製を阻害する因子を、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ
の増幅に適当な条件下に維持された、Ｑβレプリカーゼ
増幅系に含める。野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製は阻害因
子により抑制されるが、抵抗性組み換えＭＤＶ ＲＮＡ
プローブの複製は進行する。結局、組み換えＭＤＶ Ｒ
ＮＡプローブの選択的増幅および望ましくない野生型ミ
ディバリアントの複製の減少が起こる。プローブ配列が
ＭＤＶ（または突然変異ＭＤＶ）内に挿入される位置に
依存して、プローブ配列それ自体は増幅されるか、ある
いはされないことがある。プローブ配列がＭＤＶ配列内
に挿入される場合、それはＭＤＶ配列と一緒に複製（増
幅）される。プローブ配列がＭＤＶ配列のいずれかの末
端に付加される場合、それはＭＤＶ配列と一緒に複製さ
れない。ここに記載する実施例において、ＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブは突然変異ＭＤＶ配列の３′末端に付加され
たプローブ配列を有する。したがって、突然変異ＭＤＶ
配列のみがＱβレプリカーゼ添加のときに複製される。
この方式でＭＤＶ ＲＮＡプローブを設計する利点は、
プローブ配列がＱβレプリカーゼにより複製されないの
で、それは阻害因子に対して抵抗性である必要はないと
いうことである。
ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子による阻害に対し
て抵抗性である、突然変異のミディバリアントのＲＮＡ
（突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ）を、選択した核酸プローブ
配列に連鎖して、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブを産
生することによって産生される。次いで、組み換えＭＤ
Ｖ ＲＮＡプローブはＱβレプリカーゼ増幅系において
使用することができる。この方法において、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブおよび野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複
製を阻害する因子を、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ
の増幅に適当な条件下に維持された、Ｑβレプリカーゼ
増幅系に含める。野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製は阻害因
子により抑制されるが、抵抗性組み換えＭＤＶ ＲＮＡ
プローブの複製は進行する。結局、組み換えＭＤＶ Ｒ
ＮＡプローブの選択的増幅および望ましくない野生型ミ
ディバリアントの複製の減少が起こる。プローブ配列が
ＭＤＶ（または突然変異ＭＤＶ）内に挿入される位置に
依存して、プローブ配列それ自体は増幅されるか、ある
いはされないことがある。プローブ配列がＭＤＶ配列内
に挿入される場合、それはＭＤＶ配列と一緒に複製（増
幅）される。プローブ配列がＭＤＶ配列のいずれかの末
端に付加される場合、それはＭＤＶ配列と一緒に複製さ
れない。ここに記載する実施例において、ＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブは突然変異ＭＤＶ配列の３′末端に付加され
たプローブ配列を有する。したがって、突然変異ＭＤＶ
配列のみがＱβレプリカーゼ添加のときに複製される。
この方式でＭＤＶ ＲＮＡプローブを設計する利点は、
プローブ配列がＱβレプリカーゼにより複製されないの
で、それは阻害因子に対して抵抗性である必要はないと
いうことである。
【００１３】このような組み換え突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａ標的核酸の検出のためのハイブリダイゼーションアッ
セイにおいて有用である。標的核酸に対して実質的に相
補的であるプローブ配列を含有する突然変異ＭＤＶ Ｒ
ＮＡを、標的核酸の存在について試験すべき溶液と接触
させる。この混合物を相補的核酸配列の間のハイブリダ
イゼーションに適当な条件下に維持し、これにより突然
変異ＭＤＶＲＮＡおよび標的核酸の複合体を形成する。
Ａ標的核酸の検出のためのハイブリダイゼーションアッ
セイにおいて有用である。標的核酸に対して実質的に相
補的であるプローブ配列を含有する突然変異ＭＤＶ Ｒ
ＮＡを、標的核酸の存在について試験すべき溶液と接触
させる。この混合物を相補的核酸配列の間のハイブリダ
イゼーションに適当な条件下に維持し、これにより突然
変異ＭＤＶＲＮＡおよび標的核酸の複合体を形成する。
【００１４】突然変異ＭＤＶ ＲＮＡおよび標的核酸の
複合体を分離し、そして突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅
に適当な条件下に、Ｑ−ベータレプリカーゼと接触させ
る。必要に応じて、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを増幅の前
に標的核酸から分離することができる。増幅した突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡは、試験すべき溶液中の核酸の存在の
指示として検出される。
複合体を分離し、そして突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅
に適当な条件下に、Ｑ−ベータレプリカーゼと接触させ
る。必要に応じて、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを増幅の前
に標的核酸から分離することができる。増幅した突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡは、試験すべき溶液中の核酸の存在の
指示として検出される。
【００１５】増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの検出は
種々の方法により達成することができる。例えば、増幅
した核酸は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡと結合しそして、
適当な波長の光に暴露したとき、蛍光を発生する因子と
突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを接触させることによって、検
出することができる。あるいは、前述の増幅工程は、リ
ポーター基または特異的結合対の構成員をもつ増幅した
産生物の標識づけに適当な試薬を使用して実施すること
ができる。次いで、リポーター基または特異的結合対の
構成員を、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅の指示として
検出する。
種々の方法により達成することができる。例えば、増幅
した核酸は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡと結合しそして、
適当な波長の光に暴露したとき、蛍光を発生する因子と
突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを接触させることによって、検
出することができる。あるいは、前述の増幅工程は、リ
ポーター基または特異的結合対の構成員をもつ増幅した
産生物の標識づけに適当な試薬を使用して実施すること
ができる。次いで、リポーター基または特異的結合対の
構成員を、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅の指示として
検出する。
【００１６】この出願は、また、Ｑ−ベータレプリカー
ゼの増幅により産生されたＭＤＶＲＮＡ配列を検出する
実時間（それが起こるとき）のアッセイを開示する。こ
のアッセイは、蛍光因子による複製の阻害に対して抵抗
性であるＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態に連鎖された
プローブ配列を利用する。組み換えＭＤＶＲＮＡ−プロ
ーブ種を、ヌクレオチドトリホスフェート、Ｑ−ベータ
レプリカーゼおよび蛍光因子と組み合わせる。この組み
合わせは、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の増幅
が起こるために適当な条件下に維持する。産生物を蛍光
因子の蛍光の刺激に適当な波長の光に暴露する。
ゼの増幅により産生されたＭＤＶＲＮＡ配列を検出する
実時間（それが起こるとき）のアッセイを開示する。こ
のアッセイは、蛍光因子による複製の阻害に対して抵抗
性であるＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態に連鎖された
プローブ配列を利用する。組み換えＭＤＶＲＮＡ−プロ
ーブ種を、ヌクレオチドトリホスフェート、Ｑ−ベータ
レプリカーゼおよび蛍光因子と組み合わせる。この組み
合わせは、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の増幅
が起こるために適当な条件下に維持する。産生物を蛍光
因子の蛍光の刺激に適当な波長の光に暴露する。
【００１７】また、液体試料中の標的核酸配列の初期の
濃度を決定する方法を記載する。突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａおよび野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合しそして野生型Ｍ
ＤＶＲＮＡの複製を選択的に阻害する蛍光因子の存在下
に、複製する組み換え突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブ
を使用する。組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび標
的核酸がハイブリダイゼーションして組み換えＭＤＶ
ＲＮＡプローブ標的複合体を形成するために適当な条件
下に、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブを液体試料と組
み合わせる。
濃度を決定する方法を記載する。突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａおよび野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合しそして野生型Ｍ
ＤＶＲＮＡの複製を選択的に阻害する蛍光因子の存在下
に、複製する組み換え突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブ
を使用する。組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび標
的核酸がハイブリダイゼーションして組み換えＭＤＶ
ＲＮＡプローブ標的複合体を形成するために適当な条件
下に、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブを液体試料と組
み合わせる。
【００１８】複合体を分離し、そして野生型ＭＤＶ Ｒ
ＮＡの複製を阻害する蛍光因子の存在下に、プローブの
増幅に適当な条件下に、Ｑ−ベータレプリカーゼととも
にインキュベーションする。必要に応じて、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡは増幅の前に標的核酸から分離することが
できる。産生物を蛍光因子の蛍光の刺激に適当な波長の
光に暴露し、そして蛍光を組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロ
ーブの実時間の増幅の指示として検出する。液体試料中
の標的配列の初期濃度を、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロ
ーブの蓄積の速度に基づいて計算する。
ＮＡの複製を阻害する蛍光因子の存在下に、プローブの
増幅に適当な条件下に、Ｑ−ベータレプリカーゼととも
にインキュベーションする。必要に応じて、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡは増幅の前に標的核酸から分離することが
できる。産生物を蛍光因子の蛍光の刺激に適当な波長の
光に暴露し、そして蛍光を組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロ
ーブの実時間の増幅の指示として検出する。液体試料中
の標的配列の初期濃度を、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロ
ーブの蓄積の速度に基づいて計算する。
【００１９】ＭＤＶプローブ構成体は、それらを使用す
るアッセイの感度、定量性および便利さを有意に増加す
る。本発明の方法は、Ｑβレプリカーゼの増幅系におい
て突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に増幅する
ことができると同時に、存在することがある野生型ＭＤ
Ｖ ＲＮＡの望ましくない増幅を阻害する。検出または
阻害因子は、一般に、ＭＤＶ ＲＮＡに結合し、これに
よりその蛍光を増加する色素である。こうして、突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡの産生は「実時間の」モードで蛍光分
光分析により監視することができ（すなわち、反応が進
行している間）、試料の中に本来存在した標的核酸のレ
ベルを正確に定量する手段を提供することができる。
るアッセイの感度、定量性および便利さを有意に増加す
る。本発明の方法は、Ｑβレプリカーゼの増幅系におい
て突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に増幅する
ことができると同時に、存在することがある野生型ＭＤ
Ｖ ＲＮＡの望ましくない増幅を阻害する。検出または
阻害因子は、一般に、ＭＤＶ ＲＮＡに結合し、これに
よりその蛍光を増加する色素である。こうして、突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡの産生は「実時間の」モードで蛍光分
光分析により監視することができ（すなわち、反応が進
行している間）、試料の中に本来存在した標的核酸のレ
ベルを正確に定量する手段を提供することができる。
【００２０】本発明の組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ
およびそれらを増幅する方法は、野生型の非突然変異の
ＭＤＶ ＲＮＡを阻害する因子による阻害に対して抵抗
性であるＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態を利用する。
突然変異ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列および野生
型ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列は、突然変異の形
態が非突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子に
より阻害阻害に対して抵抗性であるような方法において
異なる。用語「野生型」は、Ｑβレプリカーゼに関連す
る、天然に産出する、内因性のミディバリアントＲＮＡ
を記載するために使用するためにここで使用する。用語
「突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ」は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡ
と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なるＭＤＶ Ｒ
ＮＡを呼ぶ。臭化エチジウム抵抗性の突然変異ＲＮＡ
は、例えば、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７４）。
およびそれらを増幅する方法は、野生型の非突然変異の
ＭＤＶ ＲＮＡを阻害する因子による阻害に対して抵抗
性であるＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態を利用する。
突然変異ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列および野生
型ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列は、突然変異の形
態が非突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子に
より阻害阻害に対して抵抗性であるような方法において
異なる。用語「野生型」は、Ｑβレプリカーゼに関連す
る、天然に産出する、内因性のミディバリアントＲＮＡ
を記載するために使用するためにここで使用する。用語
「突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ」は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡ
と少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なるＭＤＶ Ｒ
ＮＡを呼ぶ。臭化エチジウム抵抗性の突然変異ＲＮＡ
は、例えば、クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７４）。
【００２１】突然変異ＭＤＶ ＲＮＡは２つの重要な特
性を有する：その複製は野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を
阻害するある種の因子により阻害されず、そしてそれは
Ｑβレプリカーゼの鋳型である。突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａは、野生型ＭＤＶ ＲＮＡを阻害因子にいわゆる「進
化」暴露において暴露することによって産生することが
できる（参照、実施例２）。野生型ＭＤＶ ＲＮＡの１
次配列における変更または突然変異はＭＤＶ ＲＮＡ中
で自発的に起こり、阻害因子の存在下に数ラウンドの複
製を通過する。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７
４）。これらの突然変異の産生物はそれらを有する鋳型
分子の鋳型をより速くし、究極的に反応における非突然
変異ＲＮＡの複製に追い付く。こうして、この「選択」
法はＭＤＶ ＲＮＡの阻害因子抵抗性の形態の複製に好
適である。
性を有する：その複製は野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を
阻害するある種の因子により阻害されず、そしてそれは
Ｑβレプリカーゼの鋳型である。突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａは、野生型ＭＤＶ ＲＮＡを阻害因子にいわゆる「進
化」暴露において暴露することによって産生することが
できる（参照、実施例２）。野生型ＭＤＶ ＲＮＡの１
次配列における変更または突然変異はＭＤＶ ＲＮＡ中
で自発的に起こり、阻害因子の存在下に数ラウンドの複
製を通過する。クレイマー（Ｋｒａｍｅｒ）ら、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．）、８９：７１９−７３６（１９７
４）。これらの突然変異の産生物はそれらを有する鋳型
分子の鋳型をより速くし、究極的に反応における非突然
変異ＲＮＡの複製に追い付く。こうして、この「選択」
法はＭＤＶ ＲＮＡの阻害因子抵抗性の形態の複製に好
適である。
【００２２】本発明の組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ
は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを、選択した核酸プローブ
配列に、例えば、クローニング、結合または化学的カッ
プリングにより連鎖して、連鎖した配列（ＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブ）を形成することによってつくられる。用語
「連鎖」は、ここで使用するとき、選択した核酸配列が
ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列の中に組み込まれる
か、あるいはその３′または５′末端に取り付けられる
ことを意味する。用語「核酸プローブ配列」は、試料中
の選択した「標的」核酸配列に対して特異性の核酸配列
を呼ぶ。核酸プローブ配列は、標的核酸に対して実質的
に相補的であり、そして標的核酸とハイブリダイゼーシ
ョンしてハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハ
イブリダイゼーション複合体を試料から分離し、ＭＤＶ
ＲＮＡプローブを複合体から標準の技術により解放
し、そしてＭＤＶ ＲＮＡプローブをＱβレプリカーゼ
により増幅することができる。
は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡを、選択した核酸プローブ
配列に、例えば、クローニング、結合または化学的カッ
プリングにより連鎖して、連鎖した配列（ＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブ）を形成することによってつくられる。用語
「連鎖」は、ここで使用するとき、選択した核酸配列が
ＭＤＶ ＲＮＡのヌクレオチド配列の中に組み込まれる
か、あるいはその３′または５′末端に取り付けられる
ことを意味する。用語「核酸プローブ配列」は、試料中
の選択した「標的」核酸配列に対して特異性の核酸配列
を呼ぶ。核酸プローブ配列は、標的核酸に対して実質的
に相補的であり、そして標的核酸とハイブリダイゼーシ
ョンしてハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハ
イブリダイゼーション複合体を試料から分離し、ＭＤＶ
ＲＮＡプローブを複合体から標準の技術により解放
し、そしてＭＤＶ ＲＮＡプローブをＱβレプリカーゼ
により増幅することができる。
【００２３】これらの組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ
は、本発明の方法においてＱβレプリカーゼの増幅に使
用される。増幅可能なプローブを使用するＱβレプリカ
ーゼ増幅系は、一般に、例えば、チュ（Ｃｈｕ）ら、核
酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、１４：４４９−６０３（１９８６）、およびリザ
ージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：１１９７−１２０２
（１９８８）に記載されている。これらの増幅系は、Ｑ
βレプリカーゼがＭＤＶ ＲＮＡを幾何学的速度でコピ
ーし、これにより約３７℃において約３０分でＭＤＶ
ＲＮＡを十億倍に増加する能力に頼る。Ｑβレプリカー
ゼの増幅は、非常に感受性の選択的診断アッセイを可能
とする。このようなアッセイは、ウイルス、バクテリ
ア、癌および他の遺伝子配列に基づく試験のための感受
性のハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適
合させることができる。本発明の方法によれば、特異的
ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に増幅し、そして同時
にｅｍｒの複製を抑制し、これにより存在することがあ
る野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製により引き起こされるバ
ックグラウンドの「ノイズ」を減少することができる。
は、本発明の方法においてＱβレプリカーゼの増幅に使
用される。増幅可能なプローブを使用するＱβレプリカ
ーゼ増幅系は、一般に、例えば、チュ（Ｃｈｕ）ら、核
酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、１４：４４９−６０３（１９８６）、およびリザ
ージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：１１９７−１２０２
（１９８８）に記載されている。これらの増幅系は、Ｑ
βレプリカーゼがＭＤＶ ＲＮＡを幾何学的速度でコピ
ーし、これにより約３７℃において約３０分でＭＤＶ
ＲＮＡを十億倍に増加する能力に頼る。Ｑβレプリカー
ゼの増幅は、非常に感受性の選択的診断アッセイを可能
とする。このようなアッセイは、ウイルス、バクテリ
ア、癌および他の遺伝子配列に基づく試験のための感受
性のハイブリダイゼーションアッセイにおける使用に適
合させることができる。本発明の方法によれば、特異的
ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に増幅し、そして同時
にｅｍｒの複製を抑制し、これにより存在することがあ
る野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製により引き起こされるバ
ックグラウンドの「ノイズ」を減少することができる。
【００２４】野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害し、そ
して突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を可能とする因子
を、本発明の方法において使用して、ＭＤＶ ＲＮＡプ
ローブを選択的に増幅することができる。これらの因子
は突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに結合するが、野生型ＭＤＶ
ＲＮＡの複製をそれらが阻害するより非常に少ない程
度に突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する。
して突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を可能とする因子
を、本発明の方法において使用して、ＭＤＶ ＲＮＡプ
ローブを選択的に増幅することができる。これらの因子
は突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに結合するが、野生型ＭＤＶ
ＲＮＡの複製をそれらが阻害するより非常に少ない程
度に突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する。
【００２５】本発明の方法において、１または２以上の
これらの因子を突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブの前に
またはそれと同時に増幅系に添加する。ミリモル量の因
子（野生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａの両者に結合するために要求されるそれより大過剰
で）を添加する。因子は野生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび、
存在する場合、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに結合するが、
野生型ＭＤＶＲＮＡの複製を優先的に阻害する。
これらの因子を突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブの前に
またはそれと同時に増幅系に添加する。ミリモル量の因
子（野生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａの両者に結合するために要求されるそれより大過剰
で）を添加する。因子は野生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび、
存在する場合、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに結合するが、
野生型ＭＤＶＲＮＡの複製を優先的に阻害する。
【００２６】野生型ＭＤＶ ＲＮＡを選択的に阻害する
因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモジマ
ー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリン、
ヘシヒト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５８（ビス−ベンズ
アミジン）、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジ
を包含する。色素、例えば、臭化エチジウム、臭化エチ
ジウムのホモジマーおよびヨウ化プロピジウムはとくに
有用な阻害因子である。これらの色素は、野生型ＲＮＡ
の複製を阻害することに加えて、蛍光性である。それら
の蛍光は核酸、例えば、ＭＤＶ ＲＮＡへの結合のとき
に増加する。こうして、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡはその
蛍光を増加する色素に結合し、こうして、蛍光分光分析
を使用して検出することができる。これらの条件下で突
然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製速度はより速いために、反
応に添加した単一の分子は突然変異ＲＮＡを産生し、こ
のとき、それはＱβレプリカーゼについて野生型ＭＤＶ
ＲＮＡと効果的に競争しそして、約１００〜約１００
０分子の汚染性野生型ＭＤＶＲＮＡが存在してさえ、Ｑ
βレプリカーゼ反応の主要な産生物である。色素の蛍光
性質は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブの産生を、そ
れが進行しているとき、を可能とする、すなわち、実時
間のアッセイは本発明の方法を使用して可能である。こ
れらの阻害色素の蛍光性質に頼らない他の標識づけ方法
（例えば、32Ｐ、ビオチニル化、スルホン化または５−
ブロモＵＴＰなど）は、また、これらのＲＮＡを検出す
る手段として使用することができる。
因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモジマ
ー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリン、
ヘシヒト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５８（ビス−ベンズ
アミジン）、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジ
を包含する。色素、例えば、臭化エチジウム、臭化エチ
ジウムのホモジマーおよびヨウ化プロピジウムはとくに
有用な阻害因子である。これらの色素は、野生型ＲＮＡ
の複製を阻害することに加えて、蛍光性である。それら
の蛍光は核酸、例えば、ＭＤＶ ＲＮＡへの結合のとき
に増加する。こうして、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡはその
蛍光を増加する色素に結合し、こうして、蛍光分光分析
を使用して検出することができる。これらの条件下で突
然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複製速度はより速いために、反
応に添加した単一の分子は突然変異ＲＮＡを産生し、こ
のとき、それはＱβレプリカーゼについて野生型ＭＤＶ
ＲＮＡと効果的に競争しそして、約１００〜約１００
０分子の汚染性野生型ＭＤＶＲＮＡが存在してさえ、Ｑ
βレプリカーゼ反応の主要な産生物である。色素の蛍光
性質は、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブの産生を、そ
れが進行しているとき、を可能とする、すなわち、実時
間のアッセイは本発明の方法を使用して可能である。こ
れらの阻害色素の蛍光性質に頼らない他の標識づけ方法
（例えば、32Ｐ、ビオチニル化、スルホン化または５−
ブロモＵＴＰなど）は、また、これらのＲＮＡを検出す
る手段として使用することができる。
【００２７】野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製の抑制のため
にバックグラウンドのノイズが減少した定量的アッセイ
は、また、本発明の主題である。このアッセイを使用し
て、増幅方法により産生する突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの
量を定量することができ、したがって、また、試料の中
に本来存在した標的核酸の初期量を定量することができ
る。このアッセイ方法において、標的核酸に対して特異
的であるか、あるいはそれに対して相補的である、増幅
可能なハイブリダイゼーションプローブ配列を、例え
ば、クローニング、結合または化学的カップリングによ
り、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに連鎖するか、あるいはそ
の中に挿入する。核酸配列は標的配列に対して１００％
相補的である必要はなく、使用するハイブリダイゼーシ
ョン条件下に標的配列に結合またはそれとハイブリダイ
ゼーションするために十分に相補的である。次いで、突
然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを試験試料とハイブリダ
イゼーション条件下に接触させ、これによりプローブ−
標的複合体を形成する。プローブ−標的複合体は、標準
の技術、例えば、可逆的標的捕捉により分離する。ハン
セイカー（Ｈｕｎｓａｋｅｒ）ら、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、１８１：３６０（１９８９）。次いで、プロー
ブをそれらの標的から解放し、そしてＱβレプリカーゼ
とのインキュベーションにより増幅する。Ｑβレプリカ
ーゼはプローブをコピーし、そしてプローブの数は幾何
学的方法で増加する。すなわち、コピーの各ラウンド
後、ＲＮＡ分子の数は倍になる。次いで、試料の中に最
初に存在した標的の量を、特定の量のＲＮＡの合成に要
求される時間の量から計算する。例えば、既知の量の標
的分子を使用して調製したアッセイの複製の反応速度論
を使用して、標準曲線をつくることができる。試料の中
に存在するもとの標的の数が小さくなればなるほど、特
定の量のＲＮＡを合成するために要する時間は長くな
る。本発明のアッセイの方法において、鋳型として突然
変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを使用することによって、
野生型ＭＤＶ ＲＮＡの汚染物質の複製を抑制し、突然
変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に複製することが
できる。本発明の方法は、バックグラウンドのノイズが
減少した、簡単な、正確な、感受性のアッセイ方法を提
供する。
にバックグラウンドのノイズが減少した定量的アッセイ
は、また、本発明の主題である。このアッセイを使用し
て、増幅方法により産生する突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの
量を定量することができ、したがって、また、試料の中
に本来存在した標的核酸の初期量を定量することができ
る。このアッセイ方法において、標的核酸に対して特異
的であるか、あるいはそれに対して相補的である、増幅
可能なハイブリダイゼーションプローブ配列を、例え
ば、クローニング、結合または化学的カップリングによ
り、突然変異ＭＤＶ ＲＮＡに連鎖するか、あるいはそ
の中に挿入する。核酸配列は標的配列に対して１００％
相補的である必要はなく、使用するハイブリダイゼーシ
ョン条件下に標的配列に結合またはそれとハイブリダイ
ゼーションするために十分に相補的である。次いで、突
然変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを試験試料とハイブリダ
イゼーション条件下に接触させ、これによりプローブ−
標的複合体を形成する。プローブ−標的複合体は、標準
の技術、例えば、可逆的標的捕捉により分離する。ハン
セイカー（Ｈｕｎｓａｋｅｒ）ら、アナリティカル・バ
イオケミストリー（Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．）、１８１：３６０（１９８９）。次いで、プロー
ブをそれらの標的から解放し、そしてＱβレプリカーゼ
とのインキュベーションにより増幅する。Ｑβレプリカ
ーゼはプローブをコピーし、そしてプローブの数は幾何
学的方法で増加する。すなわち、コピーの各ラウンド
後、ＲＮＡ分子の数は倍になる。次いで、試料の中に最
初に存在した標的の量を、特定の量のＲＮＡの合成に要
求される時間の量から計算する。例えば、既知の量の標
的分子を使用して調製したアッセイの複製の反応速度論
を使用して、標準曲線をつくることができる。試料の中
に存在するもとの標的の数が小さくなればなるほど、特
定の量のＲＮＡを合成するために要する時間は長くな
る。本発明のアッセイの方法において、鋳型として突然
変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを使用することによって、
野生型ＭＤＶ ＲＮＡの汚染物質の複製を抑制し、突然
変異ＭＤＶ ＲＮＡプローブを選択的に複製することが
できる。本発明の方法は、バックグラウンドのノイズが
減少した、簡単な、正確な、感受性のアッセイ方法を提
供する。
【００２８】本発明の方法の重要な発現は、Ｑβレプリ
カーゼ増幅系において産生物の実時間の検出を可能とす
ることである。すなわち、反応の実際の進行は、反応の
完結後、産生した産生物の量を決定するために検出可能
な標識を添加するよりむしろ、それが起こるとき、監視
することができる。実時間の検出は、反応の反応速度を
監視することを可能とし、そしてＲＮＡ産生物が複製の
幾何学的期から出る正確な加熱の決定を可能とする。こ
の後者の測定は、標的ＲＮＡの初期のレベルの最も信頼
性ある測度である。リザージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バ
イオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、
６：１１９７−１２０２（１９８８）。こうして、標的
の初期量を定量する便利な、正確なかつ再現性ある手段
が得られる。
カーゼ増幅系において産生物の実時間の検出を可能とす
ることである。すなわち、反応の実際の進行は、反応の
完結後、産生した産生物の量を決定するために検出可能
な標識を添加するよりむしろ、それが起こるとき、監視
することができる。実時間の検出は、反応の反応速度を
監視することを可能とし、そしてＲＮＡ産生物が複製の
幾何学的期から出る正確な加熱の決定を可能とする。こ
の後者の測定は、標的ＲＮＡの初期のレベルの最も信頼
性ある測度である。リザージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バ
イオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、
６：１１９７−１２０２（１９８８）。こうして、標的
の初期量を定量する便利な、正確なかつ再現性ある手段
が得られる。
【００２９】均質な蛍光速度測定と呼ぶ、本発明の方法
の１つの実施態様において、Ｑβレプリカーゼ酵素、野
生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複
製産生物と結合することができる色素を使用して、産生
物ＲＮＡの合成を連続的に監視することができる。温度
を正確にコントロールし、反応を完全に密閉した環境内
で起こさせることができ、そして反応を追跡できるフル
オロメーターを使用することができる。この方法におい
て、１または２以上の蛍光性色素を緩衝剤、ヌクレオチ
ドトリホスフェートおよびＱβレプリカーゼ酵素と一緒
に反応の開始時に添加する。Ｑβレプリカーゼは、鋳型
ＭＤＶ ＲＮＡの濃度より大きい濃度で最初に添加す
る。反応の開始における色素の濃度は、また、鋳型の最
初の濃度より有意に大きい。増幅したＲＮＡの濃度は時
間とともに幾何学的に増加する。ＲＮＡの濃度がほぼ
０．１μモルより増加するとき、それはＲＮＡが色素に
結合して蛍光の容易に測定可能な増加を生ずる点に到達
する。蛍光を時間の関数として監視し、そして蛍光の増
加が最初に検出される時間（応答時間）を決定する。応
答時間は、鋳型分子の初期濃度の対数に逆に関係する。
リザージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バイオテクノロジー
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：１１９７−１２
０２（１９８８）；ロウメル（Ｌｏｍｅｌｌ）ら、クリ
ニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、３５：１８２６−１８３１（１９８９）。
の１つの実施態様において、Ｑβレプリカーゼ酵素、野
生型ＭＤＶ ＲＮＡおよび突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの複
製産生物と結合することができる色素を使用して、産生
物ＲＮＡの合成を連続的に監視することができる。温度
を正確にコントロールし、反応を完全に密閉した環境内
で起こさせることができ、そして反応を追跡できるフル
オロメーターを使用することができる。この方法におい
て、１または２以上の蛍光性色素を緩衝剤、ヌクレオチ
ドトリホスフェートおよびＱβレプリカーゼ酵素と一緒
に反応の開始時に添加する。Ｑβレプリカーゼは、鋳型
ＭＤＶ ＲＮＡの濃度より大きい濃度で最初に添加す
る。反応の開始における色素の濃度は、また、鋳型の最
初の濃度より有意に大きい。増幅したＲＮＡの濃度は時
間とともに幾何学的に増加する。ＲＮＡの濃度がほぼ
０．１μモルより増加するとき、それはＲＮＡが色素に
結合して蛍光の容易に測定可能な増加を生ずる点に到達
する。蛍光を時間の関数として監視し、そして蛍光の増
加が最初に検出される時間（応答時間）を決定する。応
答時間は、鋳型分子の初期濃度の対数に逆に関係する。
リザージ（Ｌｉｚａｒｄｉ）ら、バイオテクノロジー
（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、６：１１９７−１２
０２（１９８８）；ロウメル（Ｌｏｍｅｌｌ）ら、クリ
ニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ）、３５：１８２６−１８３１（１９８９）。
【００３０】実施例４におけるように精製したＭＤＶプ
ローブ分子を使用して、実施例５におけるように精製し
た標的分子を使用するか、あるいは実施例６におけるよ
うに精製した標的有機体を使用して、特定の応用に最も
適するように、標準曲線を調製することができる。
ローブ分子を使用して、実施例５におけるように精製し
た標的分子を使用するか、あるいは実施例６におけるよ
うに精製した標的有機体を使用して、特定の応用に最も
適するように、標準曲線を調製することができる。
【００３１】Ｑβレプリカーゼ反応を監視する本発明の
方法は、実施が容易であり、終点測定より正確であり、
簡単な装置を必要とし、複製可能な分子の異なる型をそ
れらの応答のプロフィルに基づいて区別することがで
き、費用が少なく、そして初期のＭＤＶ ＲＮＡおよび
標的核酸の濃度の定量的評価を可能とする。
方法は、実施が容易であり、終点測定より正確であり、
簡単な装置を必要とし、複製可能な分子の異なる型をそ
れらの応答のプロフィルに基づいて区別することがで
き、費用が少なく、そして初期のＭＤＶ ＲＮＡおよび
標的核酸の濃度の定量的評価を可能とする。
【００３２】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。これらの実施例はいかなる方法おいても限定を意
図しない。
する。これらの実施例はいかなる方法おいても限定を意
図しない。
【００３３】
【実施例】実施例１：ヨウ化プロピジウムによるＭＤＶ
−１の増殖の阻害 エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇ
ｕｓｔ）の手順により調製されたＱβレプリカーゼの調
製物は、典型的には、タンパク質の１μｇ当たり１００
〜１０，０００分子のＭＤＶ−１ ＲＮＡを含有する。
エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇ
ｕｓｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２：８２９−８３９（１９７２）。この「野生
型」ＲＮＡは、外因性鋳型ＲＮＡを反応から省略したと
きでさえ、複製し、そしてシグナルを発生する。
−１の増殖の阻害 エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇ
ｕｓｔ）の手順により調製されたＱβレプリカーゼの調
製物は、典型的には、タンパク質の１μｇ当たり１００
〜１０，０００分子のＭＤＶ−１ ＲＮＡを含有する。
エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａｕｇ
ｕｓｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２：８２９−８３９（１９７２）。この「野生
型」ＲＮＡは、外因性鋳型ＲＮＡを反応から省略したと
きでさえ、複製し、そしてシグナルを発生する。
【００３４】ある数の色素、臭化エチジウム、臭化エチ
ジウムのホモジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビ
ン、キナクリン、ヘスヒト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５
８（ビス−ベンズアミジン）、臭化ジミジウムおよびア
クリジンオレンジを包含する、を、直線期（ｌｉｎｅａ
ｒ ｐｈａｓｅ）の反応、すなわち、鋳型ＲＮＡが酵素
を越えた過剰量で存在し、こうして複製したＲＮＡの量
が時間とともに直線で増加する場合、においてＭＤＶ−
１の複製を阻害するそれらの能力について試験した。上
に列挙した色素のすべては、ヘスヒト（Ｈｏｅｓｃｈ
ｔ）３３２５８を除外して、ＱβレプリカーゼによるＭ
ＤＶ−１の複製を阻害した。最も強い阻害因子の１つ、
ヨウ化プロピジウム、をそれ以上の研究のために選択し
た。複製の７０％の阻害を生成する色素の濃度、約３μ
ｇ／ｍｌ、は、色素が反応のＲＮＡ産生物に結合すると
き、生成する蛍光の増加の検出を可能とするために十分
に低い。
ジウムのホモジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビ
ン、キナクリン、ヘスヒト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３２５
８（ビス−ベンズアミジン）、臭化ジミジウムおよびア
クリジンオレンジを包含する、を、直線期（ｌｉｎｅａ
ｒ ｐｈａｓｅ）の反応、すなわち、鋳型ＲＮＡが酵素
を越えた過剰量で存在し、こうして複製したＲＮＡの量
が時間とともに直線で増加する場合、においてＭＤＶ−
１の複製を阻害するそれらの能力について試験した。上
に列挙した色素のすべては、ヘスヒト（Ｈｏｅｓｃｈ
ｔ）３３２５８を除外して、ＱβレプリカーゼによるＭ
ＤＶ−１の複製を阻害した。最も強い阻害因子の１つ、
ヨウ化プロピジウム、をそれ以上の研究のために選択し
た。複製の７０％の阻害を生成する色素の濃度、約３μ
ｇ／ｍｌ、は、色素が反応のＲＮＡ産生物に結合すると
き、生成する蛍光の増加の検出を可能とするために十分
に低い。
【００３５】ヨウ化プロピジウムを、Ｑβレプリカーゼ
の調製における野生型ＲＮＡの複製へのその作用につい
て試験した。ヨウ化プロピジウムを０、１または３μｇ
／ｍｌの量で、次の成分を含有する反応の緩衝液に添加
した：９０ｍｌのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４ミ
リモルのＭｇＣｌ2、０．４ミリモルの各ＡＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、および１０μＣｉのα−32Ｐ
−ＣＴＰ。Ｑβレプリカーゼ反応は、各実施例におい
て、エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａ
ｕｇｕｓｔ）、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２：８２９−８３９（１９７２）の方法に従い調
製したＱβレプリカーゼの１．２μｇを添加することに
よって開始した。反応混合物のアリコートを５分毎に抜
き出し、そしてＤＥ８１フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｅｌｌ Ｉｎｃ．、ニューハンプシャ
イヤー州ケーネ）上にスポッティングした。スポッティ
ングしたフィルターを０．５モルのＮａＰＯ4（ｐＨ
７．０）で反復して洗浄して、組み込まれなかったヌク
レオチドを除去した。フィルターをセレンコフ（Ｃｅｒ
ｅｎｋｏｖ）輻射について標準手順によりシンチレーシ
ョンカウンターで計数した。結果を図１に示す。ヨウ化
プロピジウムの添加は、野生型ＭＤＶ−１鋳型の複製か
ら生ずる組み込みのレベルが検出可能となる時点を遅延
した。１μｇ／ｍｌは複製した産生物の出現を約２〜５
分遅延し、これは幾何学的期の複製速度の約２０〜５０
％の阻害に相当し、そして３μｇ／ｍｌは複製した産生
物の出現を約２０分遅延し、これは複製速度のほぼ３倍
の減少に相当する。
の調製における野生型ＲＮＡの複製へのその作用につい
て試験した。ヨウ化プロピジウムを０、１または３μｇ
／ｍｌの量で、次の成分を含有する反応の緩衝液に添加
した：９０ｍｌのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１４ミ
リモルのＭｇＣｌ2、０．４ミリモルの各ＡＴＰ、ＧＴ
Ｐ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、および１０μＣｉのα−32Ｐ
−ＣＴＰ。Ｑβレプリカーゼ反応は、各実施例におい
て、エオヤング（Ｅｏｙａｎｇ）およびオウガスト（Ａ
ｕｇｕｓｔ）、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．、２：８２９−８３９（１９７２）の方法に従い調
製したＱβレプリカーゼの１．２μｇを添加することに
よって開始した。反応混合物のアリコートを５分毎に抜
き出し、そしてＤＥ８１フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｅｌｌ Ｉｎｃ．、ニューハンプシャ
イヤー州ケーネ）上にスポッティングした。スポッティ
ングしたフィルターを０．５モルのＮａＰＯ4（ｐＨ
７．０）で反復して洗浄して、組み込まれなかったヌク
レオチドを除去した。フィルターをセレンコフ（Ｃｅｒ
ｅｎｋｏｖ）輻射について標準手順によりシンチレーシ
ョンカウンターで計数した。結果を図１に示す。ヨウ化
プロピジウムの添加は、野生型ＭＤＶ−１鋳型の複製か
ら生ずる組み込みのレベルが検出可能となる時点を遅延
した。１μｇ／ｍｌは複製した産生物の出現を約２〜５
分遅延し、これは幾何学的期の複製速度の約２０〜５０
％の阻害に相当し、そして３μｇ／ｍｌは複製した産生
物の出現を約２０分遅延し、これは複製速度のほぼ３倍
の減少に相当する。
【００３６】実施例２：Ｑβレプリカーゼについてのプ
ロピジウム抵抗性ＲＮＡの発生および分析 ヨウ化プロピジウム抵抗性突然変異ＲＮＡを得るため
に、「進化」実験を非修飾ＭＤＶ−１を使用して出発し
て実施した。ＭＤＶ−１を水中で１０8倍に系統的に希
釈して、ほぼ１０4ＲＮＡ／μｌの最終濃度にした。５
μｌの希釈したＲＮＡを実施例１に記載するようにＱβ
レプリカーゼ反応に添加したが、ただしヨウ化プロピジ
ウムは１．５μｇ／ｍｌの濃度で存在した。２０分後、
ＥＤＴＡを２５ミリモルの濃度に添加することによって
反応を停止した。反応産生物を１０8倍に系統的に希釈
し、その希釈物を１．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウ
ムを含有する、第２の新鮮なＱβレプリカーゼ反応に添
加した。この方法を合計１２の系統的反応について反復
した。別々の時間の過程は、反応の最後におけるＭＤＶ
ＲＮＡが、選択方法において早期に存在するものより
ヨウ化プロピジウムの存在下に複製のより速い速度を示
すことを示した。例えば、第３の系統的反応からの１０
4分子は反応において検出可能なレベルに到達するため
に約１４分を必要としたが、第１２の系統的選択反応か
ら得られた同一量の鋳型ＲＮＡは同一レベルに到達する
ために１０分より短い時間を必要とした。
ロピジウム抵抗性ＲＮＡの発生および分析 ヨウ化プロピジウム抵抗性突然変異ＲＮＡを得るため
に、「進化」実験を非修飾ＭＤＶ−１を使用して出発し
て実施した。ＭＤＶ−１を水中で１０8倍に系統的に希
釈して、ほぼ１０4ＲＮＡ／μｌの最終濃度にした。５
μｌの希釈したＲＮＡを実施例１に記載するようにＱβ
レプリカーゼ反応に添加したが、ただしヨウ化プロピジ
ウムは１．５μｇ／ｍｌの濃度で存在した。２０分後、
ＥＤＴＡを２５ミリモルの濃度に添加することによって
反応を停止した。反応産生物を１０8倍に系統的に希釈
し、その希釈物を１．５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウ
ムを含有する、第２の新鮮なＱβレプリカーゼ反応に添
加した。この方法を合計１２の系統的反応について反復
した。別々の時間の過程は、反応の最後におけるＭＤＶ
ＲＮＡが、選択方法において早期に存在するものより
ヨウ化プロピジウムの存在下に複製のより速い速度を示
すことを示した。例えば、第３の系統的反応からの１０
4分子は反応において検出可能なレベルに到達するため
に約１４分を必要としたが、第１２の系統的選択反応か
ら得られた同一量の鋳型ＲＮＡは同一レベルに到達する
ために１０分より短い時間を必要とした。
【００３７】発生した突然変異ＭＤＶ−１ ＲＮＡの分
析のために、産生物ＲＮＡのｃＤＮＡをまず得た。複製
したＲＮＡ産生物の（＋）および（−）鎖を次の手順に
よりまず分離した：反応産生物（プラスおよびマイナス
の両者の鎖の混合物）をエタノールで沈澱させ、そして
９５％のホルムアミド中に再溶解した。この溶液を９０
℃に２分間加熱し、そして氷上で冷却して鎖を変性し、
次いでこれらを８％のポリアクリルアミドゲル（５０ミ
リモルのトリス−ボレート［ｐＨ８．３］および３ミリ
モルのＭｇＣｌ2を含有する）を通して１２．５Ｖ／ｃ
ｍおよび４℃において一夜電気泳動により分割した。分
離した（＋）および（−）鎖をオートラジオグラフィー
により可視化し、それらを含有するゲルのスライスを切
除し、そしてＲＮＡを一夜０．５モルＮＨ4ＯＡｃ、１
ミリモルのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ中で溶離した。
次いで、ＲＮＡを濃縮し、そしてエタノール沈澱により
集めた。平行に、非突然変異ＭＤＶ−１はまた対照とし
て分離した鎖であった。より速く移動するＲＮＡ種
（（−）マイナス鎖）の各の１ピコモルのアリコート
を、次の配列を有する５ピコモルのＤＮＡプライマーの
オリゴヌクレオチドに、５０μｌの０．１モルトリス
（ｐＨ８．５）および２０ミリモルのＫＣｌを含有する
溶液中で９０℃に加熱し、次いで５５℃にゆっくり冷却
することによって、別々のアニーリングした：５′−Ｃ
ＣＣＧＡＣＧＴＣＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ
ＴＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣ
ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＧ−３′。５μｌの０．
１モルのＭｇＣｌ2および１０ミリモルのジチオスレイ
トール中に２モルの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰお
よびＴＴＰを含有する混合物、および２単位の鳥筋芽細
胞症ウイルスの逆トラスクリプターゼ（生化学）をアニ
ーリングしたＲＮＡ／プライマー混合物に添加し、そし
て反応混合物を５５℃において３０分間インキュベーシ
ョンした。
析のために、産生物ＲＮＡのｃＤＮＡをまず得た。複製
したＲＮＡ産生物の（＋）および（−）鎖を次の手順に
よりまず分離した：反応産生物（プラスおよびマイナス
の両者の鎖の混合物）をエタノールで沈澱させ、そして
９５％のホルムアミド中に再溶解した。この溶液を９０
℃に２分間加熱し、そして氷上で冷却して鎖を変性し、
次いでこれらを８％のポリアクリルアミドゲル（５０ミ
リモルのトリス−ボレート［ｐＨ８．３］および３ミリ
モルのＭｇＣｌ2を含有する）を通して１２．５Ｖ／ｃ
ｍおよび４℃において一夜電気泳動により分割した。分
離した（＋）および（−）鎖をオートラジオグラフィー
により可視化し、それらを含有するゲルのスライスを切
除し、そしてＲＮＡを一夜０．５モルＮＨ4ＯＡｃ、１
ミリモルのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ中で溶離した。
次いで、ＲＮＡを濃縮し、そしてエタノール沈澱により
集めた。平行に、非突然変異ＭＤＶ−１はまた対照とし
て分離した鎖であった。より速く移動するＲＮＡ種
（（−）マイナス鎖）の各の１ピコモルのアリコート
を、次の配列を有する５ピコモルのＤＮＡプライマーの
オリゴヌクレオチドに、５０μｌの０．１モルトリス
（ｐＨ８．５）および２０ミリモルのＫＣｌを含有する
溶液中で９０℃に加熱し、次いで５５℃にゆっくり冷却
することによって、別々のアニーリングした：５′−Ｃ
ＣＣＧＡＣＧＴＣＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ
ＴＡＧＧＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＧＧＧＧＡＣＣＣＣＣＣ
ＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＡＣＧＡＧ−３′。５μｌの０．
１モルのＭｇＣｌ2および１０ミリモルのジチオスレイ
トール中に２モルの各ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰお
よびＴＴＰを含有する混合物、および２単位の鳥筋芽細
胞症ウイルスの逆トラスクリプターゼ（生化学）をアニ
ーリングしたＲＮＡ／プライマー混合物に添加し、そし
て反応混合物を５５℃において３０分間インキュベーシ
ョンした。
【００３８】二本鎖ｃＤＮＡっを上の産生物の各々から
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。この方法
において、５μｌの逆トラスクリプターゼ反応産生物を
別の１００μｌの１０ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．５、０．０５モルのＫＣｌ、１０ミリモルのＭｇＣ
ｌ2、０．０１％のゼラチン、２００μモルの各ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ、５μＣｉのα−
32Ｐ−ｄＡＴＰ、１００ピコモルの上のＤＮＡオリゴヌ
クレオチド、１００ピコモルの配列５′−ＣＴＧＴＴＴ
ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＴＴＣ
ＧＧＧＧＧＧＴＣ−３′を有するＤＮＡオリゴヌクレオ
チド、および５単位のターマス・アクアチクス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｇ）ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有
する混合物に添加した。この混合物を９４℃に２分間加
熱し、５分かけて６８℃に冷却し、６８℃において１０
分間インキュベーションし、そして９４℃に戻して第２
ラウンドを開始した。この熱サイクルを２５回反復し
た。この反応の産生物をエタノール沈澱させ、非変性６
％ポリアクリルアミドゲルで分割しそして、前述したよ
うに、ゲルから標準の溶離法により回収した。これらの
反応の産生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モーター部位を１つの末端に付加して有する突然変異ま
たは対照のＭＤＶ−１ ＲＮＡの二本鎖のｃＤＮＡであ
った。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得た。この方法
において、５μｌの逆トラスクリプターゼ反応産生物を
別の１００μｌの１０ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ
８．５、０．０５モルのＫＣｌ、１０ミリモルのＭｇＣ
ｌ2、０．０１％のゼラチン、２００μモルの各ｄＡＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ、５μＣｉのα−
32Ｐ−ｄＡＴＰ、１００ピコモルの上のＤＮＡオリゴヌ
クレオチド、１００ピコモルの配列５′−ＣＴＧＴＴＴ
ＡＡＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＣＣＣＣＣＣＴＴＣ
ＧＧＧＧＧＧＴＣ−３′を有するＤＮＡオリゴヌクレオ
チド、および５単位のターマス・アクアチクス（Ｔｈｅ
ｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｇ）ＤＮＡポリ
メラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を含有
する混合物に添加した。この混合物を９４℃に２分間加
熱し、５分かけて６８℃に冷却し、６８℃において１０
分間インキュベーションし、そして９４℃に戻して第２
ラウンドを開始した。この熱サイクルを２５回反復し
た。この反応の産生物をエタノール沈澱させ、非変性６
％ポリアクリルアミドゲルで分割しそして、前述したよ
うに、ゲルから標準の溶離法により回収した。これらの
反応の産生物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのためのプロ
モーター部位を１つの末端に付加して有する突然変異ま
たは対照のＭＤＶ−１ ＲＮＡの二本鎖のｃＤＮＡであ
った。
【００３９】各精製したＰＣＲ産生物を、０．０４モル
のトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ミリモルのＭｇＣｌ
2，５ミリモルのＤＴＴ、０．５ピコモルのＰＣＲ産生
物および７０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を含有する反応混合物中で３７℃において
１時間転写した。産生物のＲＮＡは、最初の逆トランス
クリプターゼ反応をプライミングするために使用したも
とのＭＤＶ−１または変異型ＲＮＡのプラス鎖であっ
た。さらに、各産生物ＲＮＡは、正常のＭＤＶ−１の
５′末端（配列５′−ｐｐｐＧＧＧＣＣＣＵＣＵＵＣＣ
−３′の）に付加した１２ヌクレオチドの伸長および
３′末端（５′ＧＧＡＵＣＣＵＵＵＵＡＡＡＣＡＧ−
３′）に付加した１７ヌクレオチドの伸長を有する。こ
れらのＲＮＡプラス鎖の産生物を、８．３モルの尿素を
含有する６％のポリアクリルアミドゲルで分割しそし
て、前述したように、回収した。
のトリスＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５ミリモルのＭｇＣｌ
2，５ミリモルのＤＴＴ、０．５ピコモルのＰＣＲ産生
物および７０単位のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）を含有する反応混合物中で３７℃において
１時間転写した。産生物のＲＮＡは、最初の逆トランス
クリプターゼ反応をプライミングするために使用したも
とのＭＤＶ−１または変異型ＲＮＡのプラス鎖であっ
た。さらに、各産生物ＲＮＡは、正常のＭＤＶ−１の
５′末端（配列５′−ｐｐｐＧＧＧＣＣＣＵＣＵＵＣＣ
−３′の）に付加した１２ヌクレオチドの伸長および
３′末端（５′ＧＧＡＵＣＣＵＵＵＵＡＡＡＣＡＧ−
３′）に付加した１７ヌクレオチドの伸長を有する。こ
れらのＲＮＡプラス鎖の産生物を、８．３モルの尿素を
含有する６％のポリアクリルアミドゲルで分割しそし
て、前述したように、回収した。
【００４０】ヨウ化プロピジウムに対する抵抗性を与え
る突然変異がＰＣＲプロモーターに対して相補的でない
ＲＮＡの部分内に大部分が含有されることを評価するた
めに、１０5のＰＣＲ産生物からの転写体の各々を、３
μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有しないか、ある
いは含有する反応において複製した。反応を実施例１に
記載するように監視した。結果を図２に示す。ヨウ化プ
ロピジウムの不存在下に、非修飾ＭＤＶ−１ ＲＮＡ
（「コアＲＮＡ＝ＭＤＶ−１」）から発生したＲＮＡお
よびプロピジウム抵抗性変異型（「コアＲＮＡ＝ＰＩr
ＭＤＶ−１」）から発生したＲＮＡの両者は、ほぼ同一
の複製速度を示し、各々は反応において約７〜７．５分
に現れた（組み込みにおける直線の増加が外挿により横
座標をインターセプトする点）。対照的に、ヨウ化プロ
ピジウムの存在下に（「ＭＤＶ−１＋ＰＩ」）、抵抗性
突然変異ＲＮＡは１５分で現れるが、非修飾ＭＤＶ−１
から誘導された非突然変異ＲＮＡは検出可能なレベルに
複製するのに３３〜３４分を必要とした。これらの結果
が示すように、突然変異ＲＮＡ分子中で産生した配列の
変化は「非選択的」条件下に（すなわち、ヨウ化プロピ
ジウムの不存在下に）その複製に影響を与えず、そして
変化は色素の存在下に複製する能力を増加する。
る突然変異がＰＣＲプロモーターに対して相補的でない
ＲＮＡの部分内に大部分が含有されることを評価するた
めに、１０5のＰＣＲ産生物からの転写体の各々を、３
μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含有しないか、ある
いは含有する反応において複製した。反応を実施例１に
記載するように監視した。結果を図２に示す。ヨウ化プ
ロピジウムの不存在下に、非修飾ＭＤＶ−１ ＲＮＡ
（「コアＲＮＡ＝ＭＤＶ−１」）から発生したＲＮＡお
よびプロピジウム抵抗性変異型（「コアＲＮＡ＝ＰＩr
ＭＤＶ−１」）から発生したＲＮＡの両者は、ほぼ同一
の複製速度を示し、各々は反応において約７〜７．５分
に現れた（組み込みにおける直線の増加が外挿により横
座標をインターセプトする点）。対照的に、ヨウ化プロ
ピジウムの存在下に（「ＭＤＶ−１＋ＰＩ」）、抵抗性
突然変異ＲＮＡは１５分で現れるが、非修飾ＭＤＶ−１
から誘導された非突然変異ＲＮＡは検出可能なレベルに
複製するのに３３〜３４分を必要とした。これらの結果
が示すように、突然変異ＲＮＡ分子中で産生した配列の
変化は「非選択的」条件下に（すなわち、ヨウ化プロピ
ジウムの不存在下に）その複製に影響を与えず、そして
変化は色素の存在下に複製する能力を増加する。
【００４１】上で得られたＰＣＲ産生物の各々は、「非
対称の」ＰＣＲによる一本鎖の鋳型ＤＮＡの発生により
配列決定した。インニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、ＰＮＡＳ、
８５：９４３６−４１（１９８８）。配列決定は、上で
使用したＴａｇＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの
オリゴヌクレオチドを使用することによって実施した。
「バンドの圧縮」を減少するために、反応においてｄＧ
ＴＰを７−デアザｄＧＴＰ：ｄＧＴＰの３：１混合物と
置換した。観測された配列の変化を図３に概略的に示
す。
対称の」ＰＣＲによる一本鎖の鋳型ＤＮＡの発生により
配列決定した。インニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、ＰＮＡＳ、
８５：９４３６−４１（１９８８）。配列決定は、上で
使用したＴａｇＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーの
オリゴヌクレオチドを使用することによって実施した。
「バンドの圧縮」を減少するために、反応においてｄＧ
ＴＰを７−デアザｄＧＴＰ：ｄＧＴＰの３：１混合物と
置換した。観測された配列の変化を図３に概略的に示
す。
【００４２】実施例３：ヨウ化プロピジウムの存在下の
突然変異プロピジウム抵抗性ＲＮＡの検出可能性 実施例２において得られた突然変異ＲＮＡを検査して、
Ｑβレプリカーゼ反応において検出可能な量のＲＮＡを
生ずることができるプローブの最低のレベルへのヨウ化
プロピジウムの作用を決定した。一般に、ＭＤＶ ＲＮ
Ａの３′または５′末端のいずれかに配列の要素を付加
することによって産生されたプローブは、反応に多数の
プローブの分子を添加して、指数的増幅を得ることおよ
び究極的に蛍光または標識したヌクレオチドの組み込み
により検出可能な産生物を生ずることを必要とする。
［参照、ステファノ（Ｓｔｅｆａｎｏ）、米国特許出願
第７０，２１８号、１９８９年６月２２日提出、その教
示を引用によってここに加える］。
突然変異プロピジウム抵抗性ＲＮＡの検出可能性 実施例２において得られた突然変異ＲＮＡを検査して、
Ｑβレプリカーゼ反応において検出可能な量のＲＮＡを
生ずることができるプローブの最低のレベルへのヨウ化
プロピジウムの作用を決定した。一般に、ＭＤＶ ＲＮ
Ａの３′または５′末端のいずれかに配列の要素を付加
することによって産生されたプローブは、反応に多数の
プローブの分子を添加して、指数的増幅を得ることおよ
び究極的に蛍光または標識したヌクレオチドの組み込み
により検出可能な産生物を生ずることを必要とする。
［参照、ステファノ（Ｓｔｅｆａｎｏ）、米国特許出願
第７０，２１８号、１９８９年６月２２日提出、その教
示を引用によってここに加える］。
【００４３】実施例２において得られたＰＣＲ産生物の
転写を経て得られたＲＮＡの種々の量を使用してＱβレ
プリカーゼの増幅反応を開始することによって、Ｑβ複
製により検出可能な制限された数のプローブへのヨウ化
プロピジウムの作用を評価した。２つの反応の組を実施
した：１つはヨウ化プロピジウムを欠き、他方は２μｇ
／ｍｌの色素を含有する。反応を３０分後（色素を欠く
反応について）または６０分後（色素を含有する反応に
ついて）にＥＤＴＡの添加により停止し、そしてヨウ化
プロピジウムの濃度をすべての試料において３μｇ／ｍ
ｌの最終濃度にした。ＲＮＡへのヨウ化プロピジウムの
結合から生ずる蛍光により、複製したＲＮＡの存在を決
定し、蛍光は反応混合物をマイクロタイター皿に入れ、
そしてそれを３６５ｎｍの紫外線源の上に配置すること
によって検出した。ヨウ化プロピジウムの不存在下に、
検出可能なレベルの産生物を究極的に生ずるために、Ｒ
ＮＡの非抵抗性の種（例えば、対照）の１０2〜１０3分
子が最初に存在することが必要であった。しかしなが
ら、ヨウ化プロピジウムが複製の間に存在するとき、１
０4の分子を必要とした。ヨウ化プロピジウム抵抗性変
異型ＲＮＡ（突然変異ＲＮＡ）では、Ｑβ反応の間にヨ
ウ化プロピジウムの存在に無関係に１０3のプローブは
検出可能であった。これが示すように、突然変異ＲＮＡ
中の配列の変化はその非抵抗性の「親の」ＭＤＶ−１に
関してヨウ化プロピジウムの存在下にその複製速度を増
加し、そしてまた、色素の存在下に複製するとき、非抵
抗性ＭＤＶに関して検出可能なシグナルの産生に必要と
するプローブの数を減少した。
転写を経て得られたＲＮＡの種々の量を使用してＱβレ
プリカーゼの増幅反応を開始することによって、Ｑβ複
製により検出可能な制限された数のプローブへのヨウ化
プロピジウムの作用を評価した。２つの反応の組を実施
した：１つはヨウ化プロピジウムを欠き、他方は２μｇ
／ｍｌの色素を含有する。反応を３０分後（色素を欠く
反応について）または６０分後（色素を含有する反応に
ついて）にＥＤＴＡの添加により停止し、そしてヨウ化
プロピジウムの濃度をすべての試料において３μｇ／ｍ
ｌの最終濃度にした。ＲＮＡへのヨウ化プロピジウムの
結合から生ずる蛍光により、複製したＲＮＡの存在を決
定し、蛍光は反応混合物をマイクロタイター皿に入れ、
そしてそれを３６５ｎｍの紫外線源の上に配置すること
によって検出した。ヨウ化プロピジウムの不存在下に、
検出可能なレベルの産生物を究極的に生ずるために、Ｒ
ＮＡの非抵抗性の種（例えば、対照）の１０2〜１０3分
子が最初に存在することが必要であった。しかしなが
ら、ヨウ化プロピジウムが複製の間に存在するとき、１
０4の分子を必要とした。ヨウ化プロピジウム抵抗性変
異型ＲＮＡ（突然変異ＲＮＡ）では、Ｑβ反応の間にヨ
ウ化プロピジウムの存在に無関係に１０3のプローブは
検出可能であった。これが示すように、突然変異ＲＮＡ
中の配列の変化はその非抵抗性の「親の」ＭＤＶ−１に
関してヨウ化プロピジウムの存在下にその複製速度を増
加し、そしてまた、色素の存在下に複製するとき、非抵
抗性ＭＤＶに関して検出可能なシグナルの産生に必要と
するプローブの数を減少した。
【００４４】実施例４：クローニングによるヨウ化プロ
ピジウム抵抗性プローブの調製 ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡ分子は本来プ
ローブでない。むしろ、ＭＤＶ部分は検出配位子として
働く。上の背景の節において述べたように、ＭＤＶ検出
プローブは、また、標的核酸に対して特異的にハイブリ
ダイゼーションさせることができる配列の部分を含有し
なくてはならない。このようなプローブはＭＤＶ分子の
内部に挿入することができる［リダーディ（Ｌｉｚａｒ
ｄｉ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、６：１１９７−１２０２（１９８８）］か、
あるいはそれらはＭＤＶ分子の５′または３′末端のい
ずれかに付加することができる［チュ（Ｃｈｕ）ら、核
酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、１４：５５９−６０３（１９８６）；ステファノ
（Ｓｔｅｆａｎｏ）、米国特許出願第３７０，２１８
号、ｉｂｉｄ．］。このような色素抵抗性プローブを構
成する急速な、便利なかつ正確な手段は望ましい。
ピジウム抵抗性プローブの調製 ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡ分子は本来プ
ローブでない。むしろ、ＭＤＶ部分は検出配位子として
働く。上の背景の節において述べたように、ＭＤＶ検出
プローブは、また、標的核酸に対して特異的にハイブリ
ダイゼーションさせることができる配列の部分を含有し
なくてはならない。このようなプローブはＭＤＶ分子の
内部に挿入することができる［リダーディ（Ｌｉｚａｒ
ｄｉ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ）、６：１１９７−１２０２（１９８８）］か、
あるいはそれらはＭＤＶ分子の５′または３′末端のい
ずれかに付加することができる［チュ（Ｃｈｕ）ら、核
酸の研究（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ）、１４：５５９−６０３（１９８６）；ステファノ
（Ｓｔｅｆａｎｏ）、米国特許出願第３７０，２１８
号、ｉｂｉｄ．］。このような色素抵抗性プローブを構
成する急速な、便利なかつ正確な手段は望ましい。
【００４５】１つのこのような手段は実施例３に記載さ
れている手順から誘導することができる；すなわち、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して色素抵抗性Ｍ
ＤＶＲＮＡをコピーすると同時に、ｃＤＮＡ産生物の末
端に余分の配列を付加する。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターを５′末端に付加し、そして特異的
産生を３′末端に付加することができる。
れている手順から誘導することができる；すなわち、ポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して色素抵抗性Ｍ
ＤＶＲＮＡをコピーすると同時に、ｃＤＮＡ産生物の末
端に余分の配列を付加する。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターを５′末端に付加し、そして特異的
産生を３′末端に付加することができる。
【００４６】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写は
正しいＭＤＶプローブ構成体を生ずるであろう。
正しいＭＤＶプローブ構成体を生ずるであろう。
【００４７】あるいは、より「古典的な」クローニング
手順を、後述するように、使用することができる。
手順を、後述するように、使用することができる。
【００４８】実施例５および６に記載するヨウ化プロピ
ジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡプローブは、ＭＤＶ−ＳＹ
Ｎベクターと表示した特殊化した転写プラスミドの中に
プローブ配列をクローニングすることによって調製し
た。ＭＤＶ−ＳＹＮベクターは、標的特異的プローブ配
列の容易なクローニングおよび引き続くＭＤＶ ＲＮＡ
プローブ分子の産生を可能とするように設計された、１
系列のプラスミドであり、これらは少なくとも３．２μ
ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの存在下に複製すること
ができる。さらに、ＭＤＶ−ＳＹＮプラスミドはこれら
のヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡ分子の産生
を促進し、プローブ配列は５′末端上に添加され、３′
末端に付加され、ＲＮＡ内に挿入されるか、あるいは順
次のクローニング実験を通してこれらの３つの位置の任
意の組み合わせが可能である。
ジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡプローブは、ＭＤＶ−ＳＹ
Ｎベクターと表示した特殊化した転写プラスミドの中に
プローブ配列をクローニングすることによって調製し
た。ＭＤＶ−ＳＹＮベクターは、標的特異的プローブ配
列の容易なクローニングおよび引き続くＭＤＶ ＲＮＡ
プローブ分子の産生を可能とするように設計された、１
系列のプラスミドであり、これらは少なくとも３．２μ
ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムの存在下に複製すること
ができる。さらに、ＭＤＶ−ＳＹＮプラスミドはこれら
のヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡ分子の産生
を促進し、プローブ配列は５′末端上に添加され、３′
末端に付加され、ＲＮＡ内に挿入されるか、あるいは順
次のクローニング実験を通してこれらの３つの位置の任
意の組み合わせが可能である。
【００４９】多重クローニング部位の領域においてのみ
互いに異なるＭＤＶ−ＳＹＮベクターをつくった。３つ
のベクターが図４に概略的に示されている。ＭＤＶ Ｒ
ＮＡ解読配列後に、ＭＤＶ−ＳＹＮ１はＳｍａＩおよび
ＥｃｏＲＩ部位を含有する。ＭＤＶ−ＳＹＮ２はＳｍａ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、Ｋ
ｐｎＩおよびＳａｃＩ部位および他のＥｃｏＲＩ部位を
含有する。ＭＤＶ−ＳＹＮ３はＭＤＶ−ＳＹＮ２と同一
であるが、ただしそれはＭＤＶ ＲＮＡ配列から最も遠
いＥｃｏＲＩ部位を含有しない。
互いに異なるＭＤＶ−ＳＹＮベクターをつくった。３つ
のベクターが図４に概略的に示されている。ＭＤＶ Ｒ
ＮＡ解読配列後に、ＭＤＶ−ＳＹＮ１はＳｍａＩおよび
ＥｃｏＲＩ部位を含有する。ＭＤＶ−ＳＹＮ２はＳｍａ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、Ｋ
ｐｎＩおよびＳａｃＩ部位および他のＥｃｏＲＩ部位を
含有する。ＭＤＶ−ＳＹＮ３はＭＤＶ−ＳＹＮ２と同一
であるが、ただしそれはＭＤＶ ＲＮＡ配列から最も遠
いＥｃｏＲＩ部位を含有しない。
【００５０】ＭＤＶ−ＳＹＮベクターは２つの部分から
構成した。第１部分は、すべてのプラスミドの機能、例
えば、複製および薬物抵抗性を提供する、単にプラスミ
ドｐＵＣ１９であった。第２部分は２つのオーバーラッ
ピングする合成オリゴヌクレオチドから誘導した。使用
した２つのオリゴヌクレオチドの配列およびそれらをを
使用してＭＤＶ−ＳＹＮベクターを産生する方法は、図
５および図６示されている。ヨウ化プロピジウム抵抗性
ＭＤＶ ＲＮＡをエンコードするオリゴヌクレオチド配
列の部分を、実施例２に記載するようにヨウ化プロピジ
ウムの存在下の選択的複製の多数のラウンドを通して分
離された突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ（ＭＤＶ−ＰＩrと呼
ぶ）のヌクレオチド配列から誘導した（ＳａｌＩ部位を
つくるのを除外して１つのヌクレオチドをもつ）。ＭＤ
Ｖ−ＳＹＮＲＮＡの配列を化学的に合成し、したがっ
て、正確に定義する。ＭＤＶ−ＳＹＮＲＮＡおよびＭＤ
Ｖ−ＰＩr ＲＮＡは、ヨウ化プロピジウムの存在下に
ほぼ同一の反応速度で複製する。
構成した。第１部分は、すべてのプラスミドの機能、例
えば、複製および薬物抵抗性を提供する、単にプラスミ
ドｐＵＣ１９であった。第２部分は２つのオーバーラッ
ピングする合成オリゴヌクレオチドから誘導した。使用
した２つのオリゴヌクレオチドの配列およびそれらをを
使用してＭＤＶ−ＳＹＮベクターを産生する方法は、図
５および図６示されている。ヨウ化プロピジウム抵抗性
ＭＤＶ ＲＮＡをエンコードするオリゴヌクレオチド配
列の部分を、実施例２に記載するようにヨウ化プロピジ
ウムの存在下の選択的複製の多数のラウンドを通して分
離された突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ（ＭＤＶ−ＰＩrと呼
ぶ）のヌクレオチド配列から誘導した（ＳａｌＩ部位を
つくるのを除外して１つのヌクレオチドをもつ）。ＭＤ
Ｖ−ＳＹＮＲＮＡの配列を化学的に合成し、したがっ
て、正確に定義する。ＭＤＶ−ＳＹＮＲＮＡおよびＭＤ
Ｖ−ＰＩr ＲＮＡは、ヨウ化プロピジウムの存在下に
ほぼ同一の反応速度で複製する。
【００５１】ＳｍａＩ制限されたＭＤＶ−ＳＹＮプラス
ミドのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写により産
生されたＭＤＶ ＲＮＡ分子の配列を、図１１に概略的
に示す。ヨウ化プロピジウムに対する抵抗性を付与する
原因となるものとしてＭＤＶ−ＰＩr中で同定された５
つのヌクレオチド（実施例２）は、図７におけるＭＤＶ
−ＳＹＮ ＲＮＡ配列中で円形である。これらはＵ６
３、Ｕ６４、Ｕ１１７、Ｕ１３６およびＡ１３７であ
る。下線をした残基Ｇ７２はある天然に産出するＭＤＶ
−１ ＲＮＡ変異型の中に存在するが、すべての中には
存在しない。ＤＮＡ配列中のＧ７２残基は、制限酵素Ｎ
ｈｅＩについて認識配列Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃの最初
のヌクレオチドを形成する。ＮｈｅＩ制限部位はＭＤＶ
−ＳＹＮベクターにおいて独特である（すなわち、１回
だけ現れる）。箱形のＧヌクレオチドＧ５１はすべての
他のＭＤＶ−１ ＲＮＡと異なり（それらはＵ５１を含
有し）そしてＭＤＶ−ＳＹＮベクターの中に導入して、
独特ＳａｌＩ部位をつくった、Ｇ（５１）−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｃ。独特ＳａｌＩおよびＮｈｅＩ部位は、複製へ
の影響が最小である追加の配列を受け入れることが知ら
れているＭＤＶの領域をフランキングし、したがって、
ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡの本体内にプローブ配列を挿入
するために有用な部位である。
ミドのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用する転写により産
生されたＭＤＶ ＲＮＡ分子の配列を、図１１に概略的
に示す。ヨウ化プロピジウムに対する抵抗性を付与する
原因となるものとしてＭＤＶ−ＰＩr中で同定された５
つのヌクレオチド（実施例２）は、図７におけるＭＤＶ
−ＳＹＮ ＲＮＡ配列中で円形である。これらはＵ６
３、Ｕ６４、Ｕ１１７、Ｕ１３６およびＡ１３７であ
る。下線をした残基Ｇ７２はある天然に産出するＭＤＶ
−１ ＲＮＡ変異型の中に存在するが、すべての中には
存在しない。ＤＮＡ配列中のＧ７２残基は、制限酵素Ｎ
ｈｅＩについて認識配列Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｃの最初
のヌクレオチドを形成する。ＮｈｅＩ制限部位はＭＤＶ
−ＳＹＮベクターにおいて独特である（すなわち、１回
だけ現れる）。箱形のＧヌクレオチドＧ５１はすべての
他のＭＤＶ−１ ＲＮＡと異なり（それらはＵ５１を含
有し）そしてＭＤＶ−ＳＹＮベクターの中に導入して、
独特ＳａｌＩ部位をつくった、Ｇ（５１）−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ａ−Ｃ。独特ＳａｌＩおよびＮｈｅＩ部位は、複製へ
の影響が最小である追加の配列を受け入れることが知ら
れているＭＤＶの領域をフランキングし、したがって、
ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡの本体内にプローブ配列を挿入
するために有用な部位である。
【００５２】ＭＤＶ−ＳＹＮ２を最初に構成した；ＭＤ
Ｖ−ＳＹＮ１およびＭＤＶ−ＳＹＮ３は後述するように
それから誘導した。２つのオリゴヌクレオチド（図５に
示す）を、各ヌクレオチドの３′末端において１２塩基
の相補的領域のハイブリダイゼーションを通して、互い
にアニーリングした。これは２つのヌクレオチドを一緒
に１０ミリモルのトリス（ｐＨ８．５）、５０ミリモル
のＫＣｌ、３ミリモルのＭｇＣｌ2、０．１０９ゼラチ
ンおよび１ミリモルのｄＮＴＰ中で混合し、９４℃に加
熱し、そして６０℃に冷却してハイブリダイゼーション
を促進することによって達成した。各々の３′末端をＴ
ａｇ ＤＮＡポリメラーゼで、一方のオリゴヌクレオチ
ドの３′末端を他方のオリゴヌクレオチド鋳型の相補的
配列を合成するプライマーとして使用して伸長した。１
２サイクルの加熱、冷却および伸長（ＰＣＲ）を実施し
た。全長のｄｓＤＮ産生物を前述したように５％のポリ
アクリルアミドゲルから精製し、そして末端をクレノー
ＤＮＡポリメラーゼで充填した。これらの分子を酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで制限して、４塩基の一本
鎖のオーバーハングをもつ末端をつくった。産生物を再
びゲル精製し（１．４％のアガロースゲル）次いで、ま
たＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで二重に制限して、制
限し、伸長したオリゴヌクレオチドを受け入れるための
相補的４塩基のオーバーハングをつくった、ｐＵＣ１９
の中に結合した。最後に、結合した物質をＥ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５アルファ（ＢＲＬ）の中に導入し、そして生
ずるコロニーを適切な組み換え分子についてスクリーニ
ングした。ＭＤＶ−ＳＹＮ１の２つのＥｃｏＲＩ部位の
間で小さい断片を欠失することによって、ＭＤＶ−ＳＹ
Ｎ２からＭＤＶ−ＳＹＮ１を誘導した。ＭＤＶ−ＳＹＮ
２（Ｔ７プロモーターおよびＭＤＶ ＲＮＡ解読領域を
含有する）からＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ断片を分離
し、そしてそれをＥｃｏＲＩ部位を欠くｐＵＣ１９プラ
スミド中の相補的制限部位の中に結合することによっ
て、ＭＤＶ−ＳＹＮ３を産生した。
Ｖ−ＳＹＮ１およびＭＤＶ−ＳＹＮ３は後述するように
それから誘導した。２つのオリゴヌクレオチド（図５に
示す）を、各ヌクレオチドの３′末端において１２塩基
の相補的領域のハイブリダイゼーションを通して、互い
にアニーリングした。これは２つのヌクレオチドを一緒
に１０ミリモルのトリス（ｐＨ８．５）、５０ミリモル
のＫＣｌ、３ミリモルのＭｇＣｌ2、０．１０９ゼラチ
ンおよび１ミリモルのｄＮＴＰ中で混合し、９４℃に加
熱し、そして６０℃に冷却してハイブリダイゼーション
を促進することによって達成した。各々の３′末端をＴ
ａｇ ＤＮＡポリメラーゼで、一方のオリゴヌクレオチ
ドの３′末端を他方のオリゴヌクレオチド鋳型の相補的
配列を合成するプライマーとして使用して伸長した。１
２サイクルの加熱、冷却および伸長（ＰＣＲ）を実施し
た。全長のｄｓＤＮ産生物を前述したように５％のポリ
アクリルアミドゲルから精製し、そして末端をクレノー
ＤＮＡポリメラーゼで充填した。これらの分子を酵素Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで制限して、４塩基の一本
鎖のオーバーハングをもつ末端をつくった。産生物を再
びゲル精製し（１．４％のアガロースゲル）次いで、ま
たＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩで二重に制限して、制
限し、伸長したオリゴヌクレオチドを受け入れるための
相補的４塩基のオーバーハングをつくった、ｐＵＣ１９
の中に結合した。最後に、結合した物質をＥ．ｃｏｌｉ
菌株ＤＨ５アルファ（ＢＲＬ）の中に導入し、そして生
ずるコロニーを適切な組み換え分子についてスクリーニ
ングした。ＭＤＶ−ＳＹＮ１の２つのＥｃｏＲＩ部位の
間で小さい断片を欠失することによって、ＭＤＶ−ＳＹ
Ｎ２からＭＤＶ−ＳＹＮ１を誘導した。ＭＤＶ−ＳＹＮ
２（Ｔ７プロモーターおよびＭＤＶ ＲＮＡ解読領域を
含有する）からＨｉｎｄＩＩＩ／ＫｐｎＩ断片を分離
し、そしてそれをＥｃｏＲＩ部位を欠くｐＵＣ１９プラ
スミド中の相補的制限部位の中に結合することによっ
て、ＭＤＶ−ＳＹＮ３を産生した。
【００５３】ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡの複製性質の分析
を図８に示す。この実験において、ＭＤＶ−ＳＹＮ３を
ＳｍａＩで制限し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写し、
そして生ずるＲＮＡをゲル電気泳動により精製した。次
いで、種々の量のＭＤＶ−ＳＹＮ３ ＲＮＡ（１００〜
１０，０００，０００の対数増分）を、実施例３に記載
する手順に従い、３．２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウ
ムの存在下にＱβレプリカーゼにより複製した。ヨウ化
プロピジウムの関連により発生した蛍光を通してＲＮＡ
の蓄積を測定し、産生物ＲＮＡをフルオロスカン（Ｆｌ
ｕｏｒｓｋａｎ）−ＩＩフルオロメーター（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により検出することによっ
て、複製速度を各ＲＮＡ構成について実時間で測定し
た。図７に示すように、１００分子をこのアプローチに
より容易に検出することができる。バックグラウンドよ
り上の蛍光の出現は、入力ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡ分子
の各１０倍希釈物についてほぼ１分だけ異なる。
を図８に示す。この実験において、ＭＤＶ−ＳＹＮ３を
ＳｍａＩで制限し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼで転写し、
そして生ずるＲＮＡをゲル電気泳動により精製した。次
いで、種々の量のＭＤＶ−ＳＹＮ３ ＲＮＡ（１００〜
１０，０００，０００の対数増分）を、実施例３に記載
する手順に従い、３．２μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウ
ムの存在下にＱβレプリカーゼにより複製した。ヨウ化
プロピジウムの関連により発生した蛍光を通してＲＮＡ
の蓄積を測定し、産生物ＲＮＡをフルオロスカン（Ｆｌ
ｕｏｒｓｋａｎ）−ＩＩフルオロメーター（Ｆｌｏｗ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により検出することによっ
て、複製速度を各ＲＮＡ構成について実時間で測定し
た。図７に示すように、１００分子をこのアプローチに
より容易に検出することができる。バックグラウンドよ
り上の蛍光の出現は、入力ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡ分子
の各１０倍希釈物についてほぼ１分だけ異なる。
【００５４】実施例５：ヨウ化プロピジウム抵抗性プロ
ーブのＱβ複製を使用するヒト免疫欠損ウイルスについ
ての可逆的標的捕捉アッセイの方法 実験の試料は、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、ランセッ
ト（Ｌａｎｃｅｔ）、（Ｊｕｎｅ ６）：１２８６（１
９８７）の方法により、ＨＩＶ陰性のドナーの血液から
調製したｔ−リンパ芽球様細胞であった。これらを５モ
ルのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、０．１
モルのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）および１０％のデキスト
ランサルフェートを含有する緩衝液で溶菌した。ある試
料を合成標的ＲＮＡでスパイキングした。このＲＮＡ
は、ペレグリノ（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ）ら、バイオテ
クニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、５：４５
２（１９８７）に記載されているように、ＳＰ６ポリメ
ラーゼでＨＩＶ−１プロウイルスのｐｏｌ領域のクロー
ニングした断片の転写により発生させた。
ーブのＱβ複製を使用するヒト免疫欠損ウイルスについ
ての可逆的標的捕捉アッセイの方法 実験の試料は、カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、ランセッ
ト（Ｌａｎｃｅｔ）、（Ｊｕｎｅ ６）：１２８６（１
９８７）の方法により、ＨＩＶ陰性のドナーの血液から
調製したｔ−リンパ芽球様細胞であった。これらを５モ
ルのグアニジンチオシアネート（ＧｕＳＣＮ）、０．１
モルのＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）および１０％のデキスト
ランサルフェートを含有する緩衝液で溶菌した。ある試
料を合成標的ＲＮＡでスパイキングした。このＲＮＡ
は、ペレグリノ（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ）ら、バイオテ
クニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、５：４５
２（１９８７）に記載されているように、ＳＰ６ポリメ
ラーゼでＨＩＶ−１プロウイルスのｐｏｌ領域のクロー
ニングした断片の転写により発生させた。
【００５５】捕捉プローブは、短い（４０ヌクレオチ
ド）標的特異的部分および３′末端に付加した長い（ほ
ぼ１５０ヌクレオチド）ポリアデノシン（ｄＡ）「テイ
ル」を含有する、２機能のＤＮＡ分子であった。標的特
異的部分は、標準のβシアノエチルホスホルアミダイト
化学により３８０Ａ合成装置で調製した。（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォス
ターシティー）。ｄＡテイルは標準の末端のデオキシヌ
レチジルトランスフェラーゼのプロトコルにより付加し
た。ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびブルトラグ（Ｂｒ
ｕｔｌａｇ）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８：４
１（１９７９）。４つの捕捉プローブを使用した。これ
らを１１５７、１１４９、８３９および１１９６と表示
した（図９）。
ド）標的特異的部分および３′末端に付加した長い（ほ
ぼ１５０ヌクレオチド）ポリアデノシン（ｄＡ）「テイ
ル」を含有する、２機能のＤＮＡ分子であった。標的特
異的部分は、標準のβシアノエチルホスホルアミダイト
化学により３８０Ａ合成装置で調製した。（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォス
ターシティー）。ｄＡテイルは標準の末端のデオキシヌ
レチジルトランスフェラーゼのプロトコルにより付加し
た。ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）およびブルトラグ（Ｂｒ
ｕｔｌａｇ）、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、６８：４
１（１９７９）。４つの捕捉プローブを使用した。これ
らを１１５７、１１４９、８３９および１１９６と表示
した（図９）。
【００５６】これらのアッセイに使用した検出プローブ
は、それらの３′末端にほぼ４０ヌクレオチドの伸長を
もつ、ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡの組み
換え分子であった。これらの伸長はＭＤＶプローブ分子
のプローブ部分を構成し、そして標的核酸のある領域に
対して相補的であった。ＭＤＶ ＲＮＡプローブは、次
を含有するＭＤＶ−ＳＹＮ２プラスミド転写ベクター
（参照、実施例４）の中にプローブ配列を含有するオリ
ゴヌクレオチドを挿入することによって調製した：次の
順序で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、ヨ
ウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶのコピー、およびプロー
ブのオリゴヌクレオチドの挿入のためのクローニング部
位。組み換えプラスミドを精製し、そして適当な制限エ
ンドヌクレアーゼ（この場合においてＥｃｏＲＩ）で切
断した後、正しい立体配置のＭＤＶＲＮＡプローブをＴ
７ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって産生し
た。ＲＮＡプローブをポリアクリルアミドゲルの電気泳
動により精製し、そして転写の間に放射線標識の組み込
みに従い、標準の分光光度測定法により定量した。ＨＩ
Ｖ特異的ＭＤＶ ＲＮＡプローブのヌクレオチド配列を
図９に概略的に示す。捕捉プローブ（１０μｇ／ｍｌ）
および検出プローブ（４ｎｇ／ｍｌ）を各試料に添加
し、そしてこの混合物を３７℃において３０分間インキ
ュベーションしてハイブリダイゼーションを起こした。
標的核酸、捕捉プローブおよびＭＤＶ検出プローブの間
のハイブリッド複合体は、プローブを細胞リゼイトへ添
加した後、形成した。ハイブリダイゼーション複合体を
図１１に概略的に示す。
は、それらの３′末端にほぼ４０ヌクレオチドの伸長を
もつ、ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮＡの組み
換え分子であった。これらの伸長はＭＤＶプローブ分子
のプローブ部分を構成し、そして標的核酸のある領域に
対して相補的であった。ＭＤＶ ＲＮＡプローブは、次
を含有するＭＤＶ−ＳＹＮ２プラスミド転写ベクター
（参照、実施例４）の中にプローブ配列を含有するオリ
ゴヌクレオチドを挿入することによって調製した：次の
順序で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、ヨ
ウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶのコピー、およびプロー
ブのオリゴヌクレオチドの挿入のためのクローニング部
位。組み換えプラスミドを精製し、そして適当な制限エ
ンドヌクレアーゼ（この場合においてＥｃｏＲＩ）で切
断した後、正しい立体配置のＭＤＶＲＮＡプローブをＴ
７ＲＮＡポリメラーゼで転写することによって産生し
た。ＲＮＡプローブをポリアクリルアミドゲルの電気泳
動により精製し、そして転写の間に放射線標識の組み込
みに従い、標準の分光光度測定法により定量した。ＨＩ
Ｖ特異的ＭＤＶ ＲＮＡプローブのヌクレオチド配列を
図９に概略的に示す。捕捉プローブ（１０μｇ／ｍｌ）
および検出プローブ（４ｎｇ／ｍｌ）を各試料に添加
し、そしてこの混合物を３７℃において３０分間インキ
ュベーションしてハイブリダイゼーションを起こした。
標的核酸、捕捉プローブおよびＭＤＶ検出プローブの間
のハイブリッド複合体は、プローブを細胞リゼイトへ添
加した後、形成した。ハイブリダイゼーション複合体を
図１１に概略的に示す。
【００５７】ハイブリッド複合体を、磁気粒子を使用し
て、可逆的標的捕捉（ＲＴＣ）手順により溶液の中から
外に捕捉した。簡単に述べると、それらの表面に短い長
さのポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）を有する、サブ
ミクロンの大きさの磁気粒子をハイブリダイゼーション
溶液に添加しそしてインキュベーションして、捕捉プロ
ーブのポリｄＡ部分を磁気粒子上のオリゴｄＴへアニー
リングさせた。これは、順次に、ハイブリッド複合体
を、図１１に概略的に示すように、磁気粒子の表面上に
ハイブリッド複合体を「捕捉」する。
て、可逆的標的捕捉（ＲＴＣ）手順により溶液の中から
外に捕捉した。簡単に述べると、それらの表面に短い長
さのポリデオキシチミジン（ポリｄＴ）を有する、サブ
ミクロンの大きさの磁気粒子をハイブリダイゼーション
溶液に添加しそしてインキュベーションして、捕捉プロ
ーブのポリｄＡ部分を磁気粒子上のオリゴｄＴへアニー
リングさせた。これは、順次に、ハイブリッド複合体
を、図１１に概略的に示すように、磁気粒子の表面上に
ハイブリッド複合体を「捕捉」する。
【００５８】磁気粒子を洗浄して、それらの表面に非特
異的に吸収されたＭＤＶプローブを除去した。洗浄緩衝
液（１．５モルのＧｕＳＣＮ、１００ミリモルのトリ
ス、１０ミリモルのＥＤＴＡ、０．５％のサルコシル、
０．５％のＢＳＡ、０．０１％のアンチフォーム、ｐＨ
７．９）を粒子の懸濁液に添加した。粒子を渦形成して
よく混合し、次いで磁気分離ｄｖｃ（ＧＥＮＥ−ＴＲＡ
Ｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して管の壁に引き寄せた。
使用した洗浄緩衝液を吸引により除去しそして廃棄し
た。粒子を新鮮な洗浄緩衝液の中に再懸濁し、そして上
の手順（渦形成、磁気分離、吸引）により洗浄した。最
後に、ハイブリッドの複合体を磁気粒子から粒子を解放
緩衝液（３．２５モルのＧｕＳＣＮ、１００ミリモルの
トリス、６５ミリモルのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、
０．５％のサルコシル、ｐＨ７．８）の中に再懸濁する
ことによって解放し、前記解放緩衝液は捕捉プローブお
よび磁気粒子のポリｄＡ−オリゴｄＴの相互作用を崩壊
する。磁気粒子を、再び、磁気セパレーターを使用して
管の側面に引き寄せた。このとき、解放されたハイブリ
ッド複合体を含有する緩衝液相を、新鮮なアリコートの
ｄＴコーテッド磁気粒子を含有する清浄な管に移した。
前述の広範な洗浄後でさえ、なお残留ＭＤＶプローブを
それらの表面に非特異的に吸収して有する、第１組の粒
子は、廃棄した。溶離したハイブリッド複合体のＧｕＳ
ＣＮ濃度を、解放結合の中に含有される３．２５モルか
ら希釈により１．５モルに減少した。これにより、捕捉
プローブと粒子との間のポリｄＡ−オリゴｄＴ結合が再
形成し、これにより新しい組の粒子上にハイブリッド複
合体は再捕捉される。次いで、前述の３回の洗浄サイク
ルをこの組の粒子について反復し、次いでハイブリッド
複合体を粒子から解放し、そして第３組の粒子上に再捕
捉した。３回の洗浄サイクルをこの組の粒子に反復し
た。使用した粒子から清浄な粒子のハイブリッド複合体
の「通過」および広範な洗浄のこの方法の後、標的核酸
に特異的に結合しなかった、極めて低いレベルのＭＤＶ
ＲＮＡプローブのみがこのアッセイにおいて残る。サ
イクリングの各ラウンド（すなわち、新鮮な組の粒子へ
の各通過）は非特異的に結合したＭＤＶプローブの量を
約１０００倍減少する。
異的に吸収されたＭＤＶプローブを除去した。洗浄緩衝
液（１．５モルのＧｕＳＣＮ、１００ミリモルのトリ
ス、１０ミリモルのＥＤＴＡ、０．５％のサルコシル、
０．５％のＢＳＡ、０．０１％のアンチフォーム、ｐＨ
７．９）を粒子の懸濁液に添加した。粒子を渦形成して
よく混合し、次いで磁気分離ｄｖｃ（ＧＥＮＥ−ＴＲＡ
Ｋ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して管の壁に引き寄せた。
使用した洗浄緩衝液を吸引により除去しそして廃棄し
た。粒子を新鮮な洗浄緩衝液の中に再懸濁し、そして上
の手順（渦形成、磁気分離、吸引）により洗浄した。最
後に、ハイブリッドの複合体を磁気粒子から粒子を解放
緩衝液（３．２５モルのＧｕＳＣＮ、１００ミリモルの
トリス、６５ミリモルのＥＤＴＡ、０．５％のＢＳＡ、
０．５％のサルコシル、ｐＨ７．８）の中に再懸濁する
ことによって解放し、前記解放緩衝液は捕捉プローブお
よび磁気粒子のポリｄＡ−オリゴｄＴの相互作用を崩壊
する。磁気粒子を、再び、磁気セパレーターを使用して
管の側面に引き寄せた。このとき、解放されたハイブリ
ッド複合体を含有する緩衝液相を、新鮮なアリコートの
ｄＴコーテッド磁気粒子を含有する清浄な管に移した。
前述の広範な洗浄後でさえ、なお残留ＭＤＶプローブを
それらの表面に非特異的に吸収して有する、第１組の粒
子は、廃棄した。溶離したハイブリッド複合体のＧｕＳ
ＣＮ濃度を、解放結合の中に含有される３．２５モルか
ら希釈により１．５モルに減少した。これにより、捕捉
プローブと粒子との間のポリｄＡ−オリゴｄＴ結合が再
形成し、これにより新しい組の粒子上にハイブリッド複
合体は再捕捉される。次いで、前述の３回の洗浄サイク
ルをこの組の粒子について反復し、次いでハイブリッド
複合体を粒子から解放し、そして第３組の粒子上に再捕
捉した。３回の洗浄サイクルをこの組の粒子に反復し
た。使用した粒子から清浄な粒子のハイブリッド複合体
の「通過」および広範な洗浄のこの方法の後、標的核酸
に特異的に結合しなかった、極めて低いレベルのＭＤＶ
ＲＮＡプローブのみがこのアッセイにおいて残る。サ
イクリングの各ラウンド（すなわち、新鮮な組の粒子へ
の各通過）は非特異的に結合したＭＤＶプローブの量を
約１０００倍減少する。
【００５９】最後に、Ｑβ増幅のための調製において、
ハイブリッド複合体（まだ最後の組の粒子上に存在す
る）を、５０ミリモルのトリス、１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、３００ミリモルのＫＣｌおよび０．１％のＮＰ４０
を含有する緩衝液で３回洗浄して、Ｑβレプリカーゼを
阻害する微量のＧｕＳＣＮを除去し、次いでＫＣｌを欠
く上の緩衝液中でインキュベーションすることによって
粒子から解放した。ハイブリッド複合体（ＭＤＶプロー
ブはまだ標的核酸に結合している）を含有する溶離液の
アリコートを使用して、実施例１に記載する手順に従い
Ｑβレプリカーゼ増幅反応を開始した（すなわち、３μ
ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、９０ミリモルのトリ
ス、１４ミリモルのＭｇＣｌ2、０．４ミリモルの各Ａ
ＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、および０１．２μ
ｇのＱβレプリカーゼ）。
ハイブリッド複合体（まだ最後の組の粒子上に存在す
る）を、５０ミリモルのトリス、１ミリモルのＥＤＴ
Ａ、３００ミリモルのＫＣｌおよび０．１％のＮＰ４０
を含有する緩衝液で３回洗浄して、Ｑβレプリカーゼを
阻害する微量のＧｕＳＣＮを除去し、次いでＫＣｌを欠
く上の緩衝液中でインキュベーションすることによって
粒子から解放した。ハイブリッド複合体（ＭＤＶプロー
ブはまだ標的核酸に結合している）を含有する溶離液の
アリコートを使用して、実施例１に記載する手順に従い
Ｑβレプリカーゼ増幅反応を開始した（すなわち、３μ
ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、９０ミリモルのトリ
ス、１４ミリモルのＭｇＣｌ2、０．４ミリモルの各Ａ
ＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよびＣＴＰ、および０１．２μ
ｇのＱβレプリカーゼ）。
【００６０】この反応を３７℃においてフルオロメータ
ー中でインキュベーションし、ここでこのフルオロメー
ターは反応が進行するにつれて蛍光の増加を連続的に測
定した。Ｑβレプリカーゼ反応の過程の間に、よりおお
くのＭＤＶ ＲＮＡがつくられるので、蛍光の容易に測
定できる増加は新しく合成されるＭＤＶ分子と色素の会
合のために起こった。この増加は、反応の時間経過にわ
たってフルオロメーターにより検出および測定された
（図１２）。
ー中でインキュベーションし、ここでこのフルオロメー
ターは反応が進行するにつれて蛍光の増加を連続的に測
定した。Ｑβレプリカーゼ反応の過程の間に、よりおお
くのＭＤＶ ＲＮＡがつくられるので、蛍光の容易に測
定できる増加は新しく合成されるＭＤＶ分子と色素の会
合のために起こった。この増加は、反応の時間経過にわ
たってフルオロメーターにより検出および測定された
（図１２）。
【００６１】蛍光の量は存在するＭＤＶ ＲＮＡの量に
対して比例する。バックグラウンドのレベルより上の蛍
光の測定可能な増加の検出に要する時間の長さは、Ｑβ
レプリカーゼ反応の開始において存在するＭＤＶ ＲＮ
Ａの量に逆に変化する。これは、順次に、試料の中に本
来存在した標的核酸の標的核酸に対して比例する。なぜ
なら、ＭＤＶプローブは、標的核酸と会合するおかげ
で、ＲＴＣ手順を通してはじめて存続するからである。
ＲＴＣ手順の主要な機能は、標的核酸に特異的結合しな
いＭＤＶ ＲＮＡプローブを除去することである。した
がって、この方法により標的核酸の存在または不存在を
検出することができるばかりでなく、かつまたその存在
量の多少の測度を得ることができる。
対して比例する。バックグラウンドのレベルより上の蛍
光の測定可能な増加の検出に要する時間の長さは、Ｑβ
レプリカーゼ反応の開始において存在するＭＤＶ ＲＮ
Ａの量に逆に変化する。これは、順次に、試料の中に本
来存在した標的核酸の標的核酸に対して比例する。なぜ
なら、ＭＤＶプローブは、標的核酸と会合するおかげ
で、ＲＴＣ手順を通してはじめて存続するからである。
ＲＴＣ手順の主要な機能は、標的核酸に特異的結合しな
いＭＤＶ ＲＮＡプローブを除去することである。した
がって、この方法により標的核酸の存在または不存在を
検出することができるばかりでなく、かつまたその存在
量の多少の測度を得ることができる。
【００６２】実施例６：トラコーマクラミジア（Ｃｈｌ
ａｍｙｄｉａ Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出のため
のＱβ増幅した可逆的標的捕捉アッセイ トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃ
ｈｏｍａｔｉｓ）１６ＳｒＲＮＡに対して特異的な配列
を含有するＭＤＶ構成体を構成しそして、実施例５に記
載する方法に従う可逆的標的捕捉アッセイにおいて、検
出プローブとして使用した。クラミジア（Ｃｈｌａｍｉ
ｄｉａ）特異的ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮ
Ａ検出プローブの構成のために、実施例５におけるよう
にＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドよりむしろクラミジ
ア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ）特異的オリゴヌクレオチド配
列を、本質的に同一のクローニングおよび生体外転写プ
ロトコルを使用して、ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ
ＲＮＡの３′末端に付加した。ＲＮＡプローブは図１
０に示すＨＩＶプローブに類似するが、３′プローブ特
異的部分の交換を除外する。トラコーマクラミジア（Ｃ
ｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）３８０Ａオリゴヌクレオチド合成装置で合成し、そ
してアッセイにおける捕捉プローブとして使用するため
にｄＡテイリングした。捕捉プローブおよび検出プロー
ブは、トラコーマクラミジア（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔ
ｉｓ）１６Ｓ ｒＲＮＡ中の隣接する部位にハイブリダ
イゼーションするように設計する。
ａｍｙｄｉａ Ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出のため
のＱβ増幅した可逆的標的捕捉アッセイ トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃ
ｈｏｍａｔｉｓ）１６ＳｒＲＮＡに対して特異的な配列
を含有するＭＤＶ構成体を構成しそして、実施例５に記
載する方法に従う可逆的標的捕捉アッセイにおいて、検
出プローブとして使用した。クラミジア（Ｃｈｌａｍｉ
ｄｉａ）特異的ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ ＲＮ
Ａ検出プローブの構成のために、実施例５におけるよう
にＨＩＶ特異的オリゴヌクレオチドよりむしろクラミジ
ア（Ｃｈｌａｍｉｄｉａ）特異的オリゴヌクレオチド配
列を、本質的に同一のクローニングおよび生体外転写プ
ロトコルを使用して、ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ
ＲＮＡの３′末端に付加した。ＲＮＡプローブは図１
０に示すＨＩＶプローブに類似するが、３′プローブ特
異的部分の交換を除外する。トラコーマクラミジア（Ｃ
ｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）１６Ｓ ｒ
ＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）３８０Ａオリゴヌクレオチド合成装置で合成し、そ
してアッセイにおける捕捉プローブとして使用するため
にｄＡテイリングした。捕捉プローブおよび検出プロー
ブは、トラコーマクラミジア（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔ
ｉｓ）１６Ｓ ｒＲＮＡ中の隣接する部位にハイブリダ
イゼーションするように設計する。
【００６３】トラコーマクラミジア（Ｃ．ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ）ｓｅｒｏｖａｒ Ｋ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８
８７）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手し、そしてマクコイ細胞（ＭｃＣｏｙ ｃｅ
ｌｌｓ）中で増殖した。バクテリアの胞子様感染性形態
である要素の物体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｂｏｄｉｅ
ｓ）（ＥＢ）をマクコイ細胞から精製し、免疫蛍光によ
り定量し、そしてフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）
ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージ
ス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ）、１５６：５７５−５８１（１９８
７）に記載されている方法に従い使用するまで、−２０
℃において貯蔵した。他の形態のこの無条件的に細胞内
の寄生体、例えば、栄養網状物体は宿主（ＭｃＣｏｙ）
細胞から無傷で精製することは非常にいっそう困難であ
り、それゆえ比較的頑丈な要素の物体として定量するこ
とはほとんど不可能である。しかしながら、ここに報告
するものに類似する実験は感染したマクコイ細胞および
クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）陽性の頸スワブに
ついて実施し、同様な結果を得た。
ｍａｔｉｓ）ｓｅｒｏｖａｒ Ｋ（ＡＴＣＣ ＶＲ−８
８７）をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ンから入手し、そしてマクコイ細胞（ＭｃＣｏｙ ｃｅ
ｌｌｓ）中で増殖した。バクテリアの胞子様感染性形態
である要素の物体（ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙｂｏｄｉｅ
ｓ）（ＥＢ）をマクコイ細胞から精製し、免疫蛍光によ
り定量し、そしてフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）
ら、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージ
ス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄ
ｉｓｅａｓｅｓ）、１５６：５７５−５８１（１９８
７）に記載されている方法に従い使用するまで、−２０
℃において貯蔵した。他の形態のこの無条件的に細胞内
の寄生体、例えば、栄養網状物体は宿主（ＭｃＣｏｙ）
細胞から無傷で精製することは非常にいっそう困難であ
り、それゆえ比較的頑丈な要素の物体として定量するこ
とはほとんど不可能である。しかしながら、ここに報告
するものに類似する実験は感染したマクコイ細胞および
クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）陽性の頸スワブに
ついて実施し、同様な結果を得た。
【００６４】１×１０5〜１×１０2の範囲のＥＧの希釈
系列を調製し、そして前述のプローブを使用して核酸ハ
イブリダイゼーションによりアッセイした。ほぼ１×１
０5の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細
胞を、モック・コンペティター（ｍｏｃｋ ｃｏｍｐｅ
ｔｉｔｏｒ）の核酸源としてＥＢ試料の各々に添加し
た。捕捉プローブおよび検出プローブを除外して、この
実施例において使用した方法および材料は実施例５にお
けるＨＩＶ増幅アッセイについて記載したものと本質的
に同一であった。
系列を調製し、そして前述のプローブを使用して核酸ハ
イブリダイゼーションによりアッセイした。ほぼ１×１
０5の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細
胞を、モック・コンペティター（ｍｏｃｋ ｃｏｍｐｅ
ｔｉｔｏｒ）の核酸源としてＥＢ試料の各々に添加し
た。捕捉プローブおよび検出プローブを除外して、この
実施例において使用した方法および材料は実施例５にお
けるＨＩＶ増幅アッセイについて記載したものと本質的
に同一であった。
【００６５】ＥＢ試料からのＭＤＶ検出プローブ分子の
検出および定量は、また、実施例５に記載する手順に従
い、ＭＤＶ ＲＮＡプローブの生体外増幅により実施し
た。ほぼ１０００ＥＢ（１００ｒＲＮＡ分子／ＥＢと仮
定すると、ほぼ１０，０００ １６Ｓ ｒＲＮＡ標的に
等しい）の検出は、このアッセイにおける応答加熱対要
素の物体の数の関係を観測した後、可能であった。１０
００のＥＢ試料についての１５．３分の平均応答時間
は、約１０００のＭＤＶリポーター分子を直接添加して
標的のサイクリングを中断させないでＱβレプリカーゼ
反応をコントロールするとき、典型的な応答時間を表
す。
検出および定量は、また、実施例５に記載する手順に従
い、ＭＤＶ ＲＮＡプローブの生体外増幅により実施し
た。ほぼ１０００ＥＢ（１００ｒＲＮＡ分子／ＥＢと仮
定すると、ほぼ１０，０００ １６Ｓ ｒＲＮＡ標的に
等しい）の検出は、このアッセイにおける応答加熱対要
素の物体の数の関係を観測した後、可能であった。１０
００のＥＢ試料についての１５．３分の平均応答時間
は、約１０００のＭＤＶリポーター分子を直接添加して
標的のサイクリングを中断させないでＱβレプリカーゼ
反応をコントロールするとき、典型的な応答時間を表
す。
【００６６】日常の実験を越えない実験を使用して、当
業者は、ここに詳しく記載した本発明の特定の実施態様
と同等の実施態様を認識するか、あるいは確認すること
ができるであろう。このような同等の実施態様は特許請
求の範囲に包含されることを意図する。
業者は、ここに詳しく記載した本発明の特定の実施態様
と同等の実施態様を認識するか、あるいは確認すること
ができるであろう。このような同等の実施態様は特許請
求の範囲に包含されることを意図する。
【００６７】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【００６８】１、工程： ａ）標的核酸の一部分に対して実質的に相補的であるプ
ローブ配列を含有する、自己触媒的に複製することがで
きる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を準備し、突然変異Ｍ
ＤＶ ＲＮＡ分子は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合しか
つ野生型ＭＤＶＱ−ベータレプリカーゼによるＲＮＡの
複製を阻害する因子に対して、抵抗性であり、 ｂ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を標的核酸の存在につ
いて試験すべき溶液と、相補的核酸配列の間のハイブリ
ダイゼーションに適当な条件下に、接触させ、これによ
り突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を形成
し、 ｃ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を分離
し、 ｄ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体をＱ−
ベータレプリカーゼと、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合
し、これによりＱ−ベータレプリカーゼによる野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子の存在下に、突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅に適当な条件下に、接触させ、
そして ｅ）試験すべき溶液中で増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａ分子を標的核酸の存在の指示として検出する、からな
る、標的核酸を検出するハイブリダイゼーションアッセ
イ。
ローブ配列を含有する、自己触媒的に複製することがで
きる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を準備し、突然変異Ｍ
ＤＶ ＲＮＡ分子は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合しか
つ野生型ＭＤＶＱ−ベータレプリカーゼによるＲＮＡの
複製を阻害する因子に対して、抵抗性であり、 ｂ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を標的核酸の存在につ
いて試験すべき溶液と、相補的核酸配列の間のハイブリ
ダイゼーションに適当な条件下に、接触させ、これによ
り突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を形成
し、 ｃ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を分離
し、 ｄ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体をＱ−
ベータレプリカーゼと、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合
し、これによりＱ−ベータレプリカーゼによる野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子の存在下に、突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅に適当な条件下に、接触させ、
そして ｅ）試験すべき溶液中で増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａ分子を標的核酸の存在の指示として検出する、からな
る、標的核酸を検出するハイブリダイゼーションアッセ
イ。
【００６９】２、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合し、これ
によりＱ−ベータレプリカーゼによる複製を阻害する因
子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモジマー、
ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリン、臭化
ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成る群より選
択される、上記第１項記載のハイブリダイゼーション。
によりＱ−ベータレプリカーゼによる複製を阻害する因
子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモジマー、
ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリン、臭化
ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成る群より選
択される、上記第１項記載のハイブリダイゼーション。
【００７０】３、増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮＡは、
野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合し、これによりＱ−ベータ
レプリカーゼによる複製を阻害する因子の蛍光を刺激す
る適当な波長の光に、増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ
を暴露し、そして蛍光を増幅の指示として検出すること
によって、検出する、上記第１項記載のハイブリダイゼ
ーションアッセイ。
野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合し、これによりＱ−ベータ
レプリカーゼによる複製を阻害する因子の蛍光を刺激す
る適当な波長の光に、増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ
を暴露し、そして蛍光を増幅の指示として検出すること
によって、検出する、上記第１項記載のハイブリダイゼ
ーションアッセイ。
【００７１】４、プローブ配列を自己触媒的に複製する
ことができる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの５′または３′
末端に取り付ける、上記第３項記載の方法。
ことができる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡの５′または３′
末端に取り付ける、上記第３項記載の方法。
【００７２】５、プローブ配列は自己触媒的に複製する
ことができる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ中の中間配列の挿
入として存在する、上記第３項記載の方法。
ことができる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ中の中間配列の挿
入として存在する、上記第３項記載の方法。
【００７３】６、工程ｄ）における増幅は、リポーター
基または特異的結合対の構成員をもつ増幅した産生物の
標識づけに適当な試薬を使用して実施し、そしてリポー
ター基または特異的結合対の構成員を突然変異ＭＤＶ
ＲＮＡの増幅の指示として検出する、上記第１項記載の
ハイブリダイゼーションアッセイ。
基または特異的結合対の構成員をもつ増幅した産生物の
標識づけに適当な試薬を使用して実施し、そしてリポー
ター基または特異的結合対の構成員を突然変異ＭＤＶ
ＲＮＡの増幅の指示として検出する、上記第１項記載の
ハイブリダイゼーションアッセイ。
【００７４】７、工程： ａ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡおよび野生型ＭＤＶ ＲＮ
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子による阻害に対して抵抗性である
ＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態に連鎖した核酸プロー
ブ配列を準備して、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ
種を形成し、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種をヌクレオチ
ドトリホスフェート、Ｑβレプリカーゼ、および前記蛍
光因子と、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の増幅
に適当な条件下に、組み合わせ、 ｃ）工程ｂ）からの混合物を前記蛍光因子の蛍光の刺激
に適当な波長の光に暴露し、そして ｄ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の実時間の増
幅の指示として蛍光を検出する、からなる、Ｑβレプリ
カーゼの増幅により産生されるＭＤＶ ＲＮＡ配列の実
時間の検出の方法。
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子による阻害に対して抵抗性である
ＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態に連鎖した核酸プロー
ブ配列を準備して、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ
種を形成し、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種をヌクレオチ
ドトリホスフェート、Ｑβレプリカーゼ、および前記蛍
光因子と、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の増幅
に適当な条件下に、組み合わせ、 ｃ）工程ｂ）からの混合物を前記蛍光因子の蛍光の刺激
に適当な波長の光に暴露し、そして ｄ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の実時間の増
幅の指示として蛍光を検出する、からなる、Ｑβレプリ
カーゼの増幅により産生されるＭＤＶ ＲＮＡ配列の実
時間の検出の方法。
【００７５】８、野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害す
る蛍光因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモ
ジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリ
ン、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成る
群より選択される、上記第７項記載の方法。
る蛍光因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホモ
ジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナクリ
ン、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成る
群より選択される、上記第７項記載の方法。
【００７６】９、核酸プローブ配列は突然変異ＭＤＶ
ＲＮＡの末端に連鎖している、上記第７項記載の方法。
ＲＮＡの末端に連鎖している、上記第７項記載の方法。
【００７７】１０、構成成分： ａ）野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する蛍光因子の
存在下に、野生型ＭＤＶＲＮＡより効率よく複製する突
然変異ＲＮＡ、および ｂ）標的核酸に対して特異性の核酸プローブ配列、ＭＤ
Ｖ ＲＮＡプローブ構成体は、適当な波長の光に暴露し
たとき、蛍光因子の存在下に蛍光を示す、からなる、Ｍ
ＤＶ ＲＮＡプローブ構成体。
存在下に、野生型ＭＤＶＲＮＡより効率よく複製する突
然変異ＲＮＡ、および ｂ）標的核酸に対して特異性の核酸プローブ配列、ＭＤ
Ｖ ＲＮＡプローブ構成体は、適当な波長の光に暴露し
たとき、蛍光因子の存在下に蛍光を示す、からなる、Ｍ
ＤＶ ＲＮＡプローブ構成体。
【００７８】１１、核酸プローブ配列は突然変異ＭＤＶ
ＲＮＡの末端に連鎖している、上記第１０項記載のＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブ構成体。
ＲＮＡの末端に連鎖している、上記第１０項記載のＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブ構成体。
【００７９】１２、核酸プローブ配列は突然変異ＲＮＡ
配列内に挿入されている、上記第１０項記載のＭＤＶ
ＲＮＡプローブ構成体。
配列内に挿入されている、上記第１０項記載のＭＤＶ
ＲＮＡプローブ構成体。
【００８０】１３、蛍光因子はヨウ化プロピジウムであ
る、上記第１０項記載のＭＤＶ ＲＮＡプローブ構成
体。
る、上記第１０項記載のＭＤＶ ＲＮＡプローブ構成
体。
【００８１】１４、工程： ａ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡおよび野生型ＭＤＶ ＲＮ
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子の存在下に複製する、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブを準備し、組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブは突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ、および標的核酸
の少なくとも一部分に対して相補的であるヌクレオチド
配列から本質的に成り、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび標的核酸の
ハイブリダイゼーションが起こるために適当な条件下
に、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび液体試料を
組み合わせ、これにより組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロー
ブ−標的の複合体を形成し、 ｃ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ−標的の複合体を
分離し、 ｄ）工程ｃ）において得られたＭＤＶ ＲＮＡプローブ
−標的の複合体を、Ｑβレプリカーゼ、および野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する蛍光因子とともにインキ
ュベーションし、 ｅ）工程ｄ）の産生物をプローブの増幅に適当な条件下
に維持し、 ｆ）工程ｅ）からの混合物を蛍光因子の蛍光の刺激に適
当な波長の光に暴露し、そして ｇ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブの実時間の増幅の
指示として蛍光を検出し、そして組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブの蓄積の速度に基づいて存在する標的核酸の
初期濃度を計算する、からなる、液体試料中の標的核酸
配列の初期濃度を決定する方法。
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子の存在下に複製する、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブを準備し、組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブは突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ、および標的核酸
の少なくとも一部分に対して相補的であるヌクレオチド
配列から本質的に成り、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび標的核酸の
ハイブリダイゼーションが起こるために適当な条件下
に、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび液体試料を
組み合わせ、これにより組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロー
ブ−標的の複合体を形成し、 ｃ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ−標的の複合体を
分離し、 ｄ）工程ｃ）において得られたＭＤＶ ＲＮＡプローブ
−標的の複合体を、Ｑβレプリカーゼ、および野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する蛍光因子とともにインキ
ュベーションし、 ｅ）工程ｄ）の産生物をプローブの増幅に適当な条件下
に維持し、 ｆ）工程ｅ）からの混合物を蛍光因子の蛍光の刺激に適
当な波長の光に暴露し、そして ｇ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブの実時間の増幅の
指示として蛍光を検出し、そして組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブの蓄積の速度に基づいて存在する標的核酸の
初期濃度を計算する、からなる、液体試料中の標的核酸
配列の初期濃度を決定する方法。
【００８２】１５、野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害
する蛍光因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホ
モジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナク
リン、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成
る群より選択される、上記第１４項記載の方法。
する蛍光因子は、臭化エチジウム、臭化エチジウムのホ
モジマー、ヨウ化プロピジウム、プロフラビン、キナク
リン、臭化ジミジウムおよびアクリジンオレンジから成
る群より選択される、上記第１４項記載の方法。
【００８３】１６、工程ｈ）を産生したプローブの量を
標準曲線と比較することによって実施する、上記第１４
項記載の方法。
標準曲線と比較することによって実施する、上記第１４
項記載の方法。
【図１】野生型ＭＤＶ−１ ＲＮＡの複製速度へのヨウ
化プロピジウム（ＰＩ）の作用を例示するグラフであ
る。
化プロピジウム（ＰＩ）の作用を例示するグラフであ
る。
【図２】野生型ＭＤＶ−１ ＲＮＡおよび突然変異、
（プロピジウム抵抗性）（ＰＩr）ＭＤＶ−１ ＲＮＡ
の複製速度へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の作用を示
すグラフである。
（プロピジウム抵抗性）（ＰＩr）ＭＤＶ−１ ＲＮＡ
の複製速度へのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の作用を示
すグラフである。
【図３】突然変異、プロピジウム抵抗性（ＰＩr）ＭＤ
Ｖ ＲＮＡのヌクレオチド配列の概略的表示である。変
更した（突然変異した）ヌクレオチドはホールドフェー
スで示されており、矢印はヌクレオチドにおける変更を
示す。
Ｖ ＲＮＡのヌクレオチド配列の概略的表示である。変
更した（突然変異した）ヌクレオチドはホールドフェー
スで示されており、矢印はヌクレオチドにおける変更を
示す。
【図４】突然変異ヨウ化プロピジウム抵抗性プローブの
クローニングにおいて使用した、３つのプラスミド、Ｍ
ＤＶ−ＳＹＮ１、ＭＤＶ−ＳＹＮ２およびＭＤＶ−ＳＹ
Ｎ３の概略的表示である。
クローニングにおいて使用した、３つのプラスミド、Ｍ
ＤＶ−ＳＹＮ１、ＭＤＶ−ＳＹＮ２およびＭＤＶ−ＳＹ
Ｎ３の概略的表示である。
【図５】突然変異ヨウ化プロピジウム抵抗性ＭＤＶ Ｒ
ＮＡの調製において使用した２つのオリゴヌクレオチド
のヌクレオチド配列。
ＮＡの調製において使用した２つのオリゴヌクレオチド
のヌクレオチド配列。
【図６】クローニングした配列の制限地図の概略的表示
である。
である。
【図７】ＭＤＶ−ＳＹＮ ＲＮＡの概略的表示である。
突然変異したヌクレオチドは円形および箱形である。
突然変異したヌクレオチドは円形および箱形である。
【図８】ＭＤＶ−ＳＹＮ３ ＲＮＡのＱβレプリカーゼ
による増幅の実時間の検出の結果を示すグラフである。
による増幅の実時間の検出の結果を示すグラフである。
【図９】実施例５のＨＩＶについての可逆的標的の捕捉
において使用した、捕捉プローブおよび検出プローブの
標的部位の大体の位置を示すＨＩＶゲノムの概略的表示
である。
において使用した、捕捉プローブおよび検出プローブの
標的部位の大体の位置を示すＨＩＶゲノムの概略的表示
である。
【図１０】Ｑβレプリカーゼにより複製されることがで
きる、内部のインサートおよびＨＩＶ ＲＮＡに対して
特異性の３′伸長を含有する、ＨＩＶ特異的ＭＤＶ Ｒ
ＮＡプローブの概略的表示である。
きる、内部のインサートおよびＨＩＶ ＲＮＡに対して
特異性の３′伸長を含有する、ＨＩＶ特異的ＭＤＶ Ｒ
ＮＡプローブの概略的表示である。
【図１１】可逆的標的の捕捉アッセイ法および引き続く
ＱβレプリカーゼによるＭＤＶ検出プローブの増幅の概
略的表示である。
ＱβレプリカーゼによるＭＤＶ検出プローブの増幅の概
略的表示である。
【図１２】ＨＩＶについてのＱβレプリカーゼ増幅可逆
的標的捕捉アッセイの結果を示すグラフである。
的標的捕捉アッセイの結果を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 工程： ａ）標的核酸の一部分に対して実質的に相補的であるプ
ローブ配列を含有する、自己触媒的に複製することがで
きる突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を準備し、突然変異Ｍ
ＤＶ ＲＮＡ分子は、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合しか
つ野生型ＭＤＶＱ−ベータレプリカーゼによるＲＮＡの
複製を阻害する因子に対して、抵抗性であり、 ｂ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ分子を標的核酸の存在につ
いて試験すべき溶液と、相補的核酸配列の間のハイブリ
ダイゼーションに適当な条件下に、接触させ、これによ
り突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を形成
し、 ｃ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体を分離
し、 ｄ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ−標的核酸の複合体をＱ−
ベータレプリカーゼと、野生型ＭＤＶ ＲＮＡに結合
し、これによりＱ−ベータレプリカーゼによる野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する因子の存在下に、突然変
異ＭＤＶ ＲＮＡの増幅に適当な条件下に、接触させ、
そして ｅ）試験すべき溶液中で増幅した突然変異ＭＤＶ ＲＮ
Ａ分子を標的核酸の存在の指示として検出する、からな
る、標的核酸を検出するハイブリダイゼーションアッセ
イ。 - 【請求項２】 工程： ａ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡおよび野生型ＭＤＶ ＲＮ
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子による阻害に対して抵抗性である
ＭＤＶ ＲＮＡの突然変異の形態に連鎖した核酸プロー
ブ配列を準備して、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ
種を形成し、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種をヌクレオチ
ドトリホスフェート、Ｑβレプリカーゼ、および前記蛍
光因子と、組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の増幅
に適当な条件下に、組み合わせ、 ｃ）工程ｂ）からの混合物を前記蛍光因子の蛍光の刺激
に適当な波長の光に暴露し、そして ｄ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡ−プローブ種の実時間の増
幅の指示として蛍光を検出する、からなる、Ｑβレプリ
カーゼの増幅により産生されるＭＤＶ ＲＮＡ配列の実
時間の検出の方法。 - 【請求項３】 構成成分： ａ）野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する蛍光因子の
存在下に、野生型ＭＤＶ ＲＮＡより効率よく複製する
突然変異ＲＮＡ、および ｂ）標的核酸に対して特異的な核酸プローブ配列 からなり、適当な波長の光に暴露したとき、蛍光因子の
存在下に蛍光を示すことを特徴とするＲＮＡプローブ構
成体。 - 【請求項４】 工程： ａ）突然変異ＭＤＶ ＲＮＡおよび野生型ＭＤＶ ＲＮ
Ａに結合し、そして野生型ＭＤＶ ＲＮＡの複製を選択
的に阻害する蛍光因子の存在下に複製する、組み換えＭ
ＤＶ ＲＮＡプローブを準備し、組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブは突然変異ＭＤＶ ＲＮＡ、および標的核酸
の少なくとも一部分に対して相補的であるヌクレオチド
配列から本質的に成り、 ｂ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび標的核酸の
ハイブリダイゼーションが起こるために適当な条件下
に、組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブおよび液体試料を
組み合わせ、これにより組み換えＭＤＶ ＲＮＡプロー
ブ−標的の複合体を形成し、 ｃ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブ−標的の複合体を
分離し、 ｄ）工程ｃ）において得られたＭＤＶ ＲＮＡプローブ
−標的の複合体を、Ｑβレプリカーゼ、および野生型Ｍ
ＤＶ ＲＮＡの複製を阻害する蛍光因子とともにインキ
ュベーションし、 ｅ）工程ｄ）の産生物をプローブの増幅に適当な条件下
に維持し、 ｆ）工程ｅ）からの混合物を蛍光因子の蛍光の刺激に適
当な波長の光に暴露し、そして ｇ）組み換えＭＤＶ ＲＮＡプローブの実時間の増幅の
指示として蛍光を検出し、そして組み換えＭＤＶ ＲＮ
Ａプローブの蓄積の速度に基づいて存在する標的核酸の
初期濃度を計算する、からなる、液体試料中の標的核酸
配列の初期濃度を決定する方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| US514161 | 1990-04-25 | ||
| US514518 | 1990-04-25 |
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- 1991-04-25 DE DE69120342T patent/DE69120342T2/de not_active Expired - Fee Related
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