JPH06508517A

JPH06508517A - 核酸増幅生成物の定量的検出

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Publication number: JPH06508517A
Application number: JP4511299A
Authority: JP
Inventors: ブレア，ジェームズ・ニニアン・ローウェル; ダウンズ，マルコム・ジョン; パリー，デーヴィッド・アルン; クロス，リサ; ロビンソン，フィリップ・スティーヴン
Original assignee: アマーシャム・インターナショナル・ピーエルシー
Priority date: 1991-06-07
Filing date: 1992-06-05
Publication date: 1994-09-29
Also published as: CA2103374A1; GB9112251D0; DE69221641D1; EP0668929B1; DE69221641T2; WO1992021780A1; EP0668929A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】核酸増幅生成物の定量的検出本発明は、核酸増幅プロセス、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物の迅速な定量に関し、これは容易にオートメーション化されうる。

ポリメラーゼ連鎖反応は、特異的ＤＮＡ配列を迅速に増幅するのに用いることができる方法である（１）。ＰＣＨにおいて、増幅される配列（「標的」、典型的に１００〜５０００ｂｐ）は、典型的に２０〜３０ｂｐ長さの１対のプライマーか側面に並んでいて、それらは標的の領域に対して相補的であるが互いに非相補的である。標的を熱変性させた後に冷却することには、プライマーのアニーリングおよび引続きのＤＮＡポリメラーゼによる伸長を可能にする。変性／アニーリング／伸長の反復サイクルは、標的からの生成物ＤＮＡコピーの指数的増加を引起こす。ＰＣＲの生成物は、通常、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲル上で増幅されたＤＮＡの蛍光を可視化することによって検出され、標的配列の存在または不存在に対する定量的回答が与えられる。

定量的検出が必要とされる検定（２，３）においてＰＣＨの増大する使用に伴い、最初の標的配列コピーを定量するために多数の技術が開発されてきた。開発された技術としては１、ゲルからの放射性標識した生成物バンドの摘出（４，５）サザンブロッティングに続く　［３２Ｐコプローブノ・イブリダイセーションおよびオートラジオグラフィー（６，７）　ドツトブロッティングおよび［３２Ｐ］プローブハイプリダイセーシヨン（８）がある。リムスタッド（Ｒ４ｍｓｔａｄ）ら（９）は、一方のプライマーがビオチン標識されていて、もう一方が３２Ｐて標識されているプライマ一対を用いた。ＰＣＲに続く生成物の分離は、反応混合物を、ストレプトアビジンで被覆された後に洗浄され且つシンチレーション計数用に再懸濁されている磁気ビーズと接触させることによって達成される。ラントノく一グ（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら（１０）は、同様に、ビオチン標識されたプライマーおよびストレプトアビンン被覆磁気ビーズを用いてＰＣＲ生成物を分離し、競合的比色検定と組合わせた。これらの技術はいずれも細心の注意を要し且つ時間がかかり、定量する時間は技術に応じて３〜２４時間である。それらは全て手動に集中しており、容易に自動化されない。

本発明の方法はこれらの問題を克服し、それは定量的データを典型的に３０分以内で迅速且つ正確に作成し、更に、多数の試料についての迅速な処理量を可能にする。方法は、分離または洗浄段階を全く必要としないし、容易にオートメーション化でき、したがって、例えば、疾患状態の大規模なスクリーニングプログラムでの使用に役立つ。

したがって、本発明は、試料中の特異的核酸配列を増幅し且つ定量する方法であって、（ａ）増幅される配列の多路に対する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該配列鎖の一部分に対して相補的であるが互いに相補的でない上記プライマー、（ｂ）ヌクレオチド供給（ｃ）場合により、増幅される配列の一部分に対して相補的であるがいずれのプライマーにも相補的でないプローブであり、（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）の内の一つは放射性核種を含み、（ｄ）該放射性核種に接近した場合に蛍光を発する蛍光体を含む固体材料を用いることにより、試薬（ａ）および（ｂ）、場合により（Ｃ）をポリメラーゼ存在下で用いて、該特異的核酸配列に基づく増幅生成物を生成し、該増幅生成物の一部分を試薬（ｄ ’）に結合させ、そして試薬（ｄ）によって発せられた蛍光を該特異的核酸配列の尺度として観察することを含む上記方法を提供する。特異的核酸配列を、本明細書中において標的とも称する。

本発明を、ＰＣＲによる核酸増幅に関して具体的に例証する。これは好ましい増幅技術であるが、しかしなから、本発明は、他の核酸増幅技術に対して適用しつる。このような技術としては、例えば、ＰＣＲ技術で用いられるような核酸鎖を変性するのに熱サイクラ−を用いない、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０４０８２９５号明細書および英国特許第ＧＢ２２３５６８９号明細書に記載されたものがある。本発明の方法で用いることができる当該技術分野で知られている方法としては、核酸配列基剤増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびＱ−βレプリカーゼ増幅がある。

リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、用いることができるもう一つの増幅技術である。ＬＣＲは、増幅される核酸の核鎖に対して２個のプライマーを用いることを必要とし、これらは特異的配列の存在下において相補的鎖を生じるように連結されている。

したがって、本発明は、更に、試料中の特異的核酸配列を増幅し且つ定量する方法であって、（ａ　ｂ）増幅される配列の多路に対する１対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、プライマーの多対が互いに全配７＋１鎖に対して相補的であり、１本の鎖に必要とされる対の一方のプライマーは放射性標識によって標識され且つ対のもう一方のプライマーは捕捉標識によって標識されている上記プライマー、（ｄ）放射性ヌクレオチドに接近した場合に蛍光を発する蛍光体を含む固体材料を用いることにより、試薬（ａ　ｂ）をリガーゼ存在下で用いて、該特異的核酸配列に基づく増幅生成物を生成し、該増幅生成物の一部分を試薬（ｄ）に結合させ、そして試薬（ｄ）によって発せられた蛍光を該特異的結合剤７＋１の尺度として観察することを含む上記方法を提供する。

試薬（ｄ）は、放射性核種に接近した場合に蛍光を発する蛍光体を含む固体材料である。該材料は、種々の物理的形態をとることかでき、すなわち、微量滴定プレート若しくは他の反応容器中のウェル表面などの塊状面；またはファイバー若しくはビーズなどの粒状面である。この目的のビーズは商業的に入手可能であり且つシンチレーション近接検定（ＳＰＡ）用ビーズとして知られている。本発明において用いるのに適した検定用ビーズおよび方法は米国特許第４５６８６４９号明細書に記載されている。

固体表面に含浸するかさもなければ結合するのは、放射性壊変に応答して蛍光を発する蛍光体である。ＳＰＡ技術は放射性核種の使用を必要とし、その放射線、例えば、β粒子またはオージェ電子は表面上に固定された放射性核種だけが蛍光を生じるような短い路長を有する。水性媒質は掃去剤として作用して溶液中の放射性核種からの放射線を吸収し、それによってそれが蛍光を生じるのを妨げる。

したがって、ＳＰＡ技術は、周囲の流体媒質中の放射性核種の存在下においてさえも、固体表面上に吸収された放射性核種の定量を可能にする。

本発明による好ましい実施態様において、試薬（ｄ）はその表面上に、増幅生成物に特異的な結合剤を有する。放射性核種を含まない試薬（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の内の一つは、試薬（ｄ）の特異的結合剤に対して結合する捕捉標識を含むことができる。

捕捉標識は、特異的結合剤力１１１１用可能である何等かの検出可能な基であってよい。好ましい例は、ストレプトアビジンおよび抗原／抗体組合わせが結合しているビオチン捕捉標識である。しかしながら、捕捉標識および結合剤の他の何等かの組合わせ、例えば、ホルモン／受容体組合わせまたは酵素／基質組合わせを用いてもよい。他の適当な捕捉標識／結合剤は、当業者には明らかであろう。

通常、プライマーまたはプローブは５′末端が標識された捕捉であった。更に、試薬（ａ）、（ｂ）または（Ｃ）は結合剤で標識された捕捉でありうるし、そして次に、結合剤が結合している基が、蛍光体を含む固体材料である試薬（ｄ）に対して結合することは明らかである。

捕捉標識／結合剤供給の多数の異なる組合わせは本発明の範囲内である。これらには下記の可能性がある。

（ｉ）少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａ）が捕捉標識を含み、少な（とも一つのヌクレオチド（ｂ）が放射性核種を含み、そして任意のプローブ（Ｃ）を用いない。

（ｉ　ｉ）少な（とも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａ）か捕捉標識を含み、そしてプローブ（Ｃ）は含まれ且つ放射性核種を含む。

（ｉ　ｉ　ｉ）少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａ）が放射性核種を含み、少なくとも一つのヌクレオチド（ｂ）か捕捉標識を含み、そして任意のプローブ（Ｃ）は含まれない。

（ｉｖ）少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａ）が放射性核種を含み、そしてプローブ（Ｃ）は含まれ且つ捕捉標識を含む。

（Ｖ）少なくとも一つのヌクレオチド（ｂ）か放射性核種を含み、そしてプローブ（ｃ）は含まれ且つ捕捉標識を含む。

（ｖｉ）少なくとも一つのヌクレオチド（ｂ）が捕捉標識を含み、そしてプローブ（Ｃ）は含まれ且つ放射性核種を含む。

本発明による方法は捕捉標識／′結合剤相互作用を用いることな〈実施することができるということに注目すべきである。本発明のこの態様は、核酸配Ｊ１１の正確な定量を、固体材料である試薬（ｄ）に対する核酸増幅生成物の非特異的結合にたよる本発明によって達成することができるという驚くべき発見に起因している。

放射性核種は１種類または複数のヌクレオチド（ｂ）中に含まれることが分かる。

増幅生成物の非特異的結合は、陽電荷を有する固体材料（ｄ）およびそれに全体の陰電荷を与えるＤＮＡまたはＲＮＡのリン酸主鎖に因ると考えられる。したがって、核酸は試薬（ｄ）に結合するか、単独のヌクレオチドは結合しない。結合した特異的核酸配列またはその放射性核種を含む増幅生成物は（ｄ）中の蛍光体に蛍光を発しさせる。

５ＰＡ−ＰＣＲ検定におけるハイブリダイゼーションプローブの使用は、プライマー二量体形成の結果として偽陽性シグナルを発生する可能性をなくし、そして更に、ＰＣＲ生成物の識別のためのビルトイン法を提供し、それによって、ＰＣＲ特異性を実証する手段としてのゲル電気泳動の必要をなくする。上記の好ましい可能性（ｉｖ）を用いる場合、捕捉標識プローブ（Ｃ）を、増幅核酸ｖりに対してハイブリッド形成させる前または後に、固体材料（ｄ）に対して結合させることができる。同様のことが上記の可能性（１１）に適用さね、そこにおいて、放射性標識プローブ（ｃ）を増幅生成物にハイブリッド形成する前または後に、捕捉標識プライマーを固体材料（ｄ）に結合させることができる。

増幅の特異性を実証する別の方法は、増幅生成物中の部位を切断する制限酵素の使用である。この部位での切断は、正しい生成物が製造された場合、捕捉標識末端からの距離に比例したシグナルの損失を引起こす。この実施例において、２個のプライマーの一方のみに存在する必要がある特異的捕捉システムが必要とされ、放射性核種はヌクレオチド中に取込まれている。

好ましい放射性核種標識はトリチウム［３Ｈ］であるが、ヨウ素已２５゜もオージェ電子放出によって用いることかできる。かなりエネルギーをもったβ放射体、例えば、炭素［１４ｃ　＝、硫黄Ｃ３５Ｓ］およびリン［３３Ｐ］さえも用いることができる。放射性核種かヌクレオチド供給（ｂ）中の１種類またはそれ以上のヌクレオチド中に取込まれる場合、放射性標識ヌクレオチドは増幅の各サイクルで伸長生成物中に取込まれ、したがって、多数の放射性標識が各伸長生成物中に取込まれる。

増幅の最終サイクルが完了したら、生成物混合物の一部分と、蛍光体を含み且つシンチレーション近接検定用ビーズの形であってよい固体材料（ｄ）とを接触させる。

高エネルギー放射線放射性同位体である放射性核種、例えば、ｌル［３２Ｐ］の使用は、例えば、３２Ｐからの高エネルギーβ粒子の一層長い路長がフルオルミクロスフェアビーズからのみならず溶液中で生じたチェレンコフ放射線からも極めて高いバックグラウンドシグナルを生じるならば不十分であることがある。

未知試料の定量は、既知数の標的核酸を用いて作成された標準曲線と比較することによって実施することができる。ＰＣＲ反応において、生成物かいったんプラトー（１４）に達すると、増幅は限界水準に達し、そしてより高い量の出発標的により、この「プラトー」は低量の出発標的によるよりも少ないサイクル後に達成される。結果として、この水準を越える定量の精度を引続き低下させる。ＰＣＲサイクル実施回数を減少または増加させることにより、全体の増幅を変化させることができ、したがって、「プラトー」水準までの増幅を達成する標的コピーの最低数は、実施された検定にしたがって調整することができる。

プライマーおよびヌクレオチドの濃度の最適化についても、非特異的生成物、例えば、プライマー「二量体」の生成（偶然にも互いに且つ標的に対してではなくアニールされた場合のプライマーの増幅）を避けるように慎重に考察された。

５ＰＡ−ＰＣＲによって偽陽性として検出されるプライマー−二量体の影響を最小限にするために、プライマー濃度を標準的なＰＣＲ濃度１μＭ〜概して０゜５ μＭ未満、通常は０．　２μＭまたは０．１μＭ若しくはそれ未満に減少させることが時々必要である。各標的のサイクル数は、最初に記載された「プラトー」まで全標的コピーを増幅させないように慎重に最適化される。ＰＣＲサイクル数を変更することによって同様に、標的量の全範囲を用途に応じて包含するように検定の使用範囲を変更することは可能である。

例えば、非抽出ＤＮＡ試料を用いる試料の一致性に関する問題を克服するために、各増幅の内部対照は、既知の異なる標的を、例えば、フルオレセイン５′標識プライマーおよび抗フルオレセイン抗体で被覆されたＳＰＡビーズを用いて同時増幅することによって含まれることができる。

Ｔａｑなどの熱安定ＤＮＡポリメラーゼおよびプログラム化しうる加熱ブロックの使用により、ＰＣＲは容易にオートメーション化しうる。本発明の方法は、分離および洗浄段階が必要とされないという点で、従来報告されたＰＣＲＣ微定量法も極めて好都合である。ＰＣＲがいったん完了したら、概して、１種類の試薬だけが必要とされへ検定用ピースは反応生成物混合物に加えることができるしまたはビーズに加えられた生成物混合物および試料の一部分は引続き計数用に用意される。この工程は、現在入手可能な自動サンプリングおよびピペッティング装置によって容易に取り扱うことができる。したがって、従来の定量法で可能であるよりもはるかに短時間で結果を得ることができる。

ポリメラーゼ連鎖反応は分析方法として広範囲に応用されている（１５）。定量のための迅速で且つ信頼できる方法かいったん利用可能になると、例えば、臨床的診断でのその有用性は大きく増大する。現在、ＰＣＲによる遺伝学的およびウィルス検出を疾患の進行／軽減の理解に組合わせることができるような定量的ＰＣＲが必要とされている（１６．１７）。

ここで示された新規の５ＰＡ−ＰＣＲ法は、標的ＤＮＡの最初の量に直接的に関係することがあるＰＣＲ生成物の迅速で且つ定量的な検出を与える。多工程で時間がかかる、そして手動に集中している定量的ＰＣＲの他の方法とは対照的に、この方法は２工程を用い且つ迅速である。それは、臨床的試料の大規模なスクリーニングのためのオートメーションに容易に役立つ。更に、ヌクレオチドが放射性標識されている場合、取込まれた放射性標識の量は標識された分子の寸法に比例し、そしてプライマーー二量体標識付けによるバックグラウンド「ノイズ」は、分子当り１個の標識残基を用いる他の方法よりもはるかに有意性が少ない。

ＰＣＲに類似の他の技術、例えば、リガーゼ連鎖反応は、標的配列の指数的増幅を与える。ＬＣＲの場合、標的は、互いに隣接してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド対（ＤＮＡの標的鎖当り１対）によって包含された、概して、全部で約６０塩基対に及ぶ配列に限定される。ＬＣＲについての十分な論評は、Ｆ。

８９〜１９３頁、１９９１年１月に示されている。

ＳＰＡを用いると、ＬＣＲ反応の際に生じた生成物を定量し、そして標的配列の元のコピー数に対してそれを関連付けることが可能である。これは、後に記載した実施例の場合と同様に、隣接するオリゴヌクレオチド（放射性標識オリゴヌクレオチド）の一方の３’　ＯＨ末端を、放射性残基、例えば、３Ｈ／３５Ｓ／３３Ｐで標識されたヌクレオチドで標識し、そしてビオチンまたは抗原などの特異的捕捉標識をもう一方の隣接するオリゴヌクレオチド（捕捉オリゴヌクレオチド）の５′　Ｐ０４末端に結合させることによって達成することができる。連結反応の場合、放射性オリゴヌクレオチドは捕捉オリゴヌクレオチドに対して共有結合して、ＳＰＡビーズ上で特異的に捕捉され且つ計数される連結反応生成物を生成するようになる。連結反応は標的二重らせんＤＮＡの両方の値上で起こり、したがって、２対のオリゴヌクレオチドに対する要求およびＬＣＲの指数性を生じる。

もう一つの技術であるＮＡＳＢＡは、単一混合物中において１種類の温度で核酸を連続増幅する簡単で且つ迅速な方法である。２種類のプライマーを用い、第一はＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を組込んでおり且つ第二は第一プライマーに対する標的配列の反対側に由来する。その技術はＰＮＡＳ　（１９９０）８７．１８７４〜８に記載されている。

ＰＣＲは、標的配列の指数的増幅をもたらし、したがって、１００万倍の増幅を可能にするのに約２０サイクルを必要とする。しかしながら、ＮＡＳＢＡでは、ＲＮＡの１０〜１００コピーが各転写工程で生じるので、同等の増幅を生じるのに４〜５サイクルのみを必要とした。二本鎖核酸はＮＡＳＢＡ並びに−氷核ＲＮＡと一緒に用いることができるが、二本鎖鋳型は、最初に一本鎖鋳型に変換して、その処理に適合するようにする必要かある。どちらかの（または両方の）プライマーは、捕捉および引続きのＳＰＡによる検出のためにビオチニル化することができる。放射性標識ヌクレオチドは、核酸合成反応において用いることができる。

ＳＤＡは制限酵素／ＤＮＡポリメラーゼシステムを用いるＤＮＡの増幅の等温変法である。この技術はＰＮＡＳ　（１９９２）８９，３９２〜３９６に詳細に記載されている。

二本鎖および一本鎖双方の標的ＤＮＡフラグメントはこの技術と一緒に用いることかでき、そしてＰＣＲの場合と同様に高水準の標的増幅を達成することができる。５Ｆ）Ａ定量検定との関係において、ビオチニル化プライマーを用いる標準的な方法を常に用いることはできない。標識がＤＮＡ生成物中に組込まれたシステムを用いる必要がある。これは、放射性標識ヌクレオチドおよび捕捉ハイブリダイモーション法、または放射性標識および捕捉標識ヌクレオチド、或いは放射性標識ヌクレオチドと全ＤＮＡ捕捉との使用を必要とすることがある。

Ｑ−βレプリカーゼ増幅は組換えＲＮＡ分子を指数的に増幅させる酵素Ｑ−βレプリカーゼの能力に依る。この技術は、ＰＣＲの場合と同様に、標的配列よりもむしろプローブ配列を指数的に増幅する。

Ｑ−βレプリカーゼの研究により、極めて特異的な一本鎖ＲＮＡは相補的−氷核生成物の合成のための鋳型として役立つことが分かっている。鎖合成に続いて、鋳型および生成物が複製複合体から遊離した後、双方の鎖は次の複製過程に利用可能であり、したがって、ＲＮＡ鎖の数は指数的に増大しつる。その技術は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９８６）、１４　（１４）。

５５９１〜５６０３に詳細に記載されている。Ｑ−βレプリカーゼ増幅のＳＰＡ定量化において、プライマーは増幅生成物中に取込まれない。したがって、プライマーは放射性核種も捕捉標識も含まない。

本発明を以下の実施例で更に例証する。

実施例１嚢胞性繊維症遺伝子に隣接するマーカー領域の標的コピーの定量。

３８６ｂｐ領域を、プライマー（１３）１．５′ビオチンＡＡＴ　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＣＡＣＣＣＡ　ＡＴｒ　ＧＣＴ　ＣＡ　３’２、　５’　ＧＧＴ　ＴＡＧ　ＧＴＣＡＧＡ　ＧＡＡ　ＣＡＡ　ＡＧＣＡＡＡ　Ｔｒ　３’を用いて増幅させた。

プライマーは、メトプローブ（Ｍｅｄｐｒｏｂｅ）、オス口、ノルウェイから入手した。ビオチニル化プライマーはメトプローブによってＨＰＬＣ精製された。

ＰＣＲを、以下の最適化試薬濃度、１０ｍＭ）リスＨＣＩ、ｐＨ９，０，５０、領　１ＨＭプライマーおよびＴａｑ１５０μｌミックス２単位を用いて実施した。

試薬は、シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍａ）　、プーμ、英国からであり、３ＨＴＴＰおよびＴａｑはアマ−ジャム（Ａｍｅ　ｒ　ｓ　ｈ　ａｍ）　、英国からであった。上記を２゜５ｍｌ製造して（「マスター混合物Ｊ）ＰＣＲ混合物を標準化した。ヒトゲノムＤＮＡを０〜２０ｎｇ／μｌ含有する溶液５μｌを５００μｌのエツペンドルフ試験管中にいワへマスター混合物４５μｌを加えた。次に、溶液に軽質鉱油（シグマ）２滴を」し、そしてバイオメトラ・トリオ・サーモブロック（Ｂｉｏｍｅｔｒａ　Ｔｒｉｏ　丁ｈｅｒｍｏｂｌｏｃｋ）　（バイオメトラ、メートストン、ケント州、英国）を用いて熱サイクルを実施した。

最初の変性は９５℃で３０秒間の後に、５５℃で２分間、７２℃で３分間、続いて９５℃で３０秒間を４０サイクル行なった。５５℃で２分間に続いて７２℃で１０分間の最終の伸長は最後のサイクル後に実施された。

増幅後、反応混合物２５μｌを取出し、そして５０　ｍ　Ｍ　Ｎ　ａ　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　ＡｐＨ７の５００μｌ中の最適化されたストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（０，２５ｍｇ）２５μｍに対して加えた。混合物を、それ以上インキュベーションすることなく、０〜９９９の窓付きのＬＫＢラックベータ（Ｒａｃｋｂｅｔａ）１２０９シンチレーシヨンカウンターで１５秒間計数した。

結果を図１に示す。

実施例２遺伝子の２６８ｂｐ領域の増幅によるヒトβ−グロビン遺伝子の定量。

β−グロビン遺伝子の２６８ｂｐ標的を、プライマーＰＣＯ４およびＧＨ２０（ンータス・コーポレーション（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐ、）、エメリービル、カリフォルニア、米国）と、５′末端がビオチニル化されたＰＣＯ４プライマーとを一緒に用いて増幅させた。

ＰＣ０４５′ビオチンＣＡＡ　ＣＴＴ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＣＧＴ　ＴＣＡ　ＣＣ３’ＧＨ２０５’Ｇ＾＾ＧＡＧ　ＣＣＡ　ＡＧＧ　ＡＣＡ　ＧＧＴ　ＡＣ３’プライマーは、アプライド・バイオシステムズ・ＰＣＲメイト・オリゴヌクレオチド・シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＰＣＲ−Ｍａｔｅ　Ｏｌｊｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）を用いて合成された。５′　ビオチンを、ビオチンホスホルアミダイト（アマーシャ幻を用いて導入した。

ＰＣＲおよび分析のための条件は、３５サイクルの増幅を０．０５μＭ濃度のプライマーを用いて実施すること以外は実施例１の場合と同様である。

結果を図２に示す。

β−グロビンの標的コピーの定量は、５ＰＡ−ＰＣＲを用いて再度達成しつる。

精度は実施例１で見出されたのと同様である。実施例２で測定された放射能は、実施例１の場合と比較して〈５０％であり、それは（ｉ）標的配列が一層短く、したがって、一層少ない”ＨＴＴＰが生成物分子ごとに取込まれるし、（ｉ　ｉ）ビオチニル化プライマーが精製されていないので、若干の非ビオチニル化プライマーが存在してＰＣＲを開始させるがＳＰＡビーズに対して引続き結合することはないためである。

実施例３ＨＩＶＩ　ｐ２４遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭＥＸからのｐ２４遺伝子の定量。

ＤＮＡの連続希釈１７５００コピー１５μｌ〜１．７５コピー１５μｌを調製し、ＰＣＲ混合物４５μｍを加えた。ＰＣＲは、プライマー濃度０．　２μＭおよび２単位のＴＡＱを用いる４０サイクルＰＣＲであること以外は実施例１と同様に実施した。用いられたプライマーは、ＨＩＶ−１のｐ２４遺伝子の３００ｂｐ領域を増幅する５′　ビオチニル化Ｓ　Ｋ　３９　、　ＴＩＴ　ＧＧＴ　ＣＣＴ　ＴＧＴ　ＣＴｒ　ＡＴＧ　ＴＣＣＡＧＡ　ＡＴＧおよびＳ　Ｋ　１４５　、　ＡＧＴ　ＧＧＧ　ＧＧＧ　ＡＣＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣＡＧＣＣＡＴ　ＧＣＡ　ＡＡＴてあった。

結果を図３に示す。

各点は三重反復試験試料の平均＋／−３ＥＭを示す。標的コピーと３Ｈ計数との関係を、示した線によって表わす。最も適合した線のｒ値は０．９９８である。

実施例４プラスミドの５００ｂｐ領域の増幅およびビオチニル化ハイブリダイゼーションプローブとのハイブリダイゼーションによるプラスミドＰＡＴ１５３のコピーのズ辷−■【イヒ。

５００ｂｐ標的を、以下に与えたプライマーを用いて増幅した。

１、　５’　ＧＣＧ　ＣＴＣＡＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＣＧＧ　３’２、　５’　ＧＡＧ　ＧＣＣＧＴｒ　ＧＡＧ　ＣＡＣＣＧＣＣＧ　３’プライマーは、アプライド・バイオシステムズ・ＰＣＲメイト・オリゴヌクレオチド・シンセサイザーを用いて合成し、そしてオリゴヌクレオチド・ピュアリフィケーション・カートリッジ（ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）（アプライド・バイオシステムズ）を用いて製造者のプロトコルにしたがって精製した。

ＰＣＲを実施例１の場合と同様に実施した。

増幅後、ＰＣＲ生成物のアリコート２５μｍを取出し、変性させ、そしてハイブリッド形成させて、５′末端がビオチニル化された第三のオリゴヌクレオチドプローブにした。試料を１μＭオリゴ（３）の存在下において９５℃で５分間加熱し、そして室温まで冷却させた。この２５マー生成物の配列は５ｏｏｂｐ標的領域中にあるが、それはプライマー配列と重ならない。配７１１を以下に与える。

３．５′　ビオチンＴＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＡＣＡＧＧ　ＡＣＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　Ｇ　３’プローブは、プライマー（１）および（２）の場合と同様に合成し且つ精製した。ビオチンホスホルアミダイト（アマ−ジャム）を用いてビオチン基を５′末端上に導入した。

ハイブリダイモーション後、１００　ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２中のストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ（最終濃度２ｍｇ／ｍ１）５００μ ｌを加え、そして０〜９９９窓付きラックベータ１２０９シンチレーションカウンターで試料を２０秒間計数した。

結果を図４に示す。

定量化は広範囲のコピーに関して、すなわち、２．６ｘｌＯ３〜最大２．６Ｘ１０７コピーまで達成された。第三のオリゴアプローチを用いて得られた計数は、前の二つの実施例の場合よりも低い。おそら（、これは、ＰＣＲ生成物の半分だけがこの方法を用いて計数されているという事実による。これは、ＰＣＲ生成物の第二鎖に対して相補的であるが第一プローブに対して相補的でない第二のハイブリダイモーションプローブの使用によって訂正することができた。

上記に概説したハイブリッド形成法の変法は、ビオチニル化プライマーを用いてＰＣＲ生成物を生じさせ、そして増幅させた後に、変性ＰＣＲ生成物の一部分に対して放射性標識オリゴヌクレオチドプローブをハイブリッド形成させた。

実施例５特異的ＲＮＡの標的コピーの定量。合成ジエネアンブリマー（ＧｅｎｅＡｍｐ　ｌ　ｉｍｅ　ｒ）ｐＡＷ１０９　ＲＮＡ　（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ −Ｅｌｍｅｒ）Ｎ８０８−００３７）を、下記のプライマ一対を用いて増幅させた。

ＤＭ１５１（上流）５−ビオチンＧＴＣＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＣＣＴＴ　ＣＴＡ　ＴＣ−３’Ｄ〜１１５２　（下流）５−ビオチ：／　ＣＡＴ　ＧＴＣＡＡＡ　ＴｒＴ　ＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣ −３’このプライマ一対は、Ｉ）ＡＷ１０９　ＲＮＡのＲＮＡ−ＰＣＲ増幅後に３０８塩基対の生成物を生じる。

プライマーは、ＡＢＩ　ＰＣＲメイトオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて自家合成した。５′　ビオチンを、ビオチンホスホルアミダイト（アマ−ジャム）を用いて導入した。

プライマーをＡＢＩ　ＯＰＣカートリッジで製造者のプロトコルにしたがって精製した。精製されたオリゴヌクレオチドを滅菌蒸留水中に最終濃度５０μＭで再懸濁させた。−２０℃で貯蔵した。

ＲＮＡ−ＰＣＲを、ｐＡＷ１０９鋳型のアリコート２μｌに対して加えられた下記の試薬、すなわち、１０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ９，０，５０ｍＭ　ＫＣＩ。

写酵素（アマージャムＲＡＶ−２バッチ（Ｂａｔｃｈ）３００１）１０単位を用いて実施した。最終容量を発熱物質不含水で２０μｌに調整し、そして混合物を４２℃で３０分間インキュベートした後氷上に置いた。次に、下記の試薬、すなわち、１０ｍＭ）リスＨＣＬ　ｐＨ９，０１５０ｍＭ　ＫＣＬ　１．５ｍＭＭ１５１およびＴａｑポリメラーゼ（アマ−ジャム）２単位を加えることによって容量を１００μｌに調整し、そして混合物を、滅菌蒸留水を加えることによって最終容量１００μｌに調整した。現在は、ＰＣＲに必要な完全な試薬セットがあった。試薬は全てシグマ、プーμ、英国からであり、３ＨＴＴＰはアマ−ジャム（ＴＲＫ５７６）によって供給された。

反応混合物に、軽質鉱油２滴を上層し、続いて、実施例１の場合と同一の増幅パラメーターを用いて５０サイクルを越えるＰＣＲを行なった。

増幅後、反応混合物５０μｍを取出し、そして５０ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　ｐＨ７，０中０．５ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ５００μＩに対して加えた。この検定用混合物を、それ以上インキュベーションすることなく、０〜９９９窓付きＬＫＢラックベータ１２０９シンチレーションカウンターで２０秒間計数した。更に、１９種類の各試料からの残余５０ μｌを取出し、そして臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌで染色された１％アガロースゲル上で分析した。

結果を図５に示す。

したがって、ＲＮＡ標的コピー数の定量は５ＰＡ−ＰＣＲを用いて達成するこＰＣＲ生成物の捕捉のための抗原−抗体法を用いる、嚢胞性繊維症遺伝子に隣接するマーカー領域の標的コピーの定量。

３８６ｂｐ領域を、実施例１で与えられたプライマーを用いて増幅させた。プライマーはビオチニル化されなかったし、そしてアプライド・バイオシステムズ・ＰＣＲメイトオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて合成され且つピュアリフィケーション・カートリッジ（アプライド・バイオシステムズ）を用いて製ジャム、英国；ＩＣｉ／ミリモル）および１０μＭフルオレセインｄＵＴＰを用いること以外は実施例１の場合と同様に実施した。

増幅後、ＰＤＲ生成物のアリコート３０μｌを各試験管から取出した。試料を、１ｘリン酸緩衝溶液（フロー・ラボラトリーズ（）”ｌｏｗＬａｂｏｔａｔｏｒｉｅｓ）、アービング、スコツトランド）１７０μｌおよびＰＢＳ中で１　：　２５００に希釈されたヒツジ抗フルオレセイン抗体（アマ−ジャム）１００μｍと一緒に室温で２時間インキュベートした。シンチレーション近接検定用抗ヒツジ試薬（アマ−ジャム）はＰＢ８５０ｍｌを用いて再構成され、音波処理済みニシン精子ＤＮＡを加えて最終濃度５０μｇＤＮＡ／１００μｌのバックグラウンドを減少させるためのビーズ懸濁液を生成した。ピース溶液１００μｌを各試料に対して加えた。試料をオービタルシェーカー上において室温で３時間混合した後、０〜９９９の窓開放ＬＫＢ１２０９シンチレーションカウンターでそれぞれ２０秒間計数した。

結果を図６に示す。

したがって、標的コピーの定量は、捕捉標識が抗原であり且つ結合剤がその抗原に対する抗体である５ＰＡ−ＰＣＲ検定を用いて達成しつる。この実施例において、定量は１２５〜５０００コピーの範囲で達成された。

実施例７ＬＣＲを用いる野生型β−グロビン遺伝子（錐状赤血球アレレ）の定量。

領域を下記の組のオリゴヌクレオチドを用いて増幅させた。

１．５゛−ビオチンＧＴＣＡＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣＣＴＧ　ＡＣＴ　ＣＣＴ　ＧＡ　−３’２、５’−１：’、ｔチ：／　ＣＴＧＣＡＧＴ　ＡＡＣＧＧＣＡＧＡ　ＣＴＴ　ＣＴＣＣＴ　−３’３、　５’　Ｇ　ＧＡＧ　ＡＡＧ　ＴＣＴ　ＧＣＣＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣＣ−３’４、　５’−ＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＴＧＧＴ−３’オリゴヌクレオチド数が、１、野生型である場合、アンチセンス鎖捕捉オリゴヌクレオチド。

２、野生型である場合、センス鎖捕捉オリゴヌクレオチド。

３、野生型である場合、アンチセンス鎖放射性標識オリゴヌクレオチド。

４、野生型である場合、センス鎖放射性標識オリゴヌクレオチド。

オリゴヌクレオチドは全て、ＡＢＩ　ＰＣＲメイトオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて自家合成した。オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、５０μＭで再懸濁させ、そして−２０℃で貯蔵した。

３ＨＴＴＰ　（ＴＲＫ５７６、アマ−ジャム）１ｍＣｉパックを窒素下で乾燥さ也そして滅菌蒸留水１００μｌ中に再懸濁させた。これを以下に概説した反応混合物中で用いた。

２種類の放射性標識オリゴヌクレオチド（３および４）の精製後標識付は反応は以下の通りであった。各オリゴヌクレオチド（１２５０ピコモルの３’　ＯＨ末端に対応する）２５μｌを、３ＨＴＴＰ溶液（−５０００ピコモル、−０，５ｍＣ１３Ｈ）５０μｌ、５ｍＭ　ｄｄＴＴＰ　（−１２５０ピコモル、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））１．２５μｌ、５倍ターミナルトランスフェラーゼ酵素（アマ−ジャム）２０μｌおよびターミナルトランスフェラーゼ酵素（アマーシャ幻　（１０単位）５μｌに対して加えた。最終容量は滅菌蒸留水を用いて１００μｌに調整した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートした。取込み効率は約２５％であって、比活性は放射性標識オリゴヌクレオチド３０Ｃｉ／ミリモルであった。放射性標識オリゴヌクレオチドの最終濃度は１２．５μＭであった。

ＬＣＲ検定ごとに以下の試薬条件、すなわち、０．１μＭオリゴヌクレオチド１／２／３／４．２０ｍＭトリスＨＣＬＳｐＨ７，６，２５ｍＭ酢酸カリウム、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭジチオトレイトール、０．６ｍＭ　ＮＡＤおよび０．１％トリトン（Ｔｒ　ｉ　ｔｏｎ）Ｘ−１００、Ｔａｑリガーゼ酵素（アンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）、カンビオ（Ｃａｍｂ　ｔｏ））１０単位並びに正常の非鎌状赤血球個体からの希釈血液ＤＮＡ５μｌを用いた。最終容量は５０μｌであった。反応混合物に軽質鉱油２滴を上層し、試験管をバイオメトラ・トリオ熱サイクラー上に装填した。サイクリングパラメーターは以下、すなわち、９５℃で１分間、６５℃で４分間であった。これを２０サイクルまたは３５サイクル繰り返した。

サイクリングの後、各試料のアリコート２５μｌを取出し、そして５０ｍＭＮ　ａ　２　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよび２００ｍＭ　ＮａＯＨの存在下において４ｍｇ／ｍｌのポリビニルトルエンストレプトアビジン被覆Ｓ　Ｐ　Ａビーズ５００μｌに対して加えた。この混合物を、それ以上インキュベーションすることなく、０〜９９９窓付きＬＫＢラックベータ１２０９シンチレーションカウンターで２０秒間計数した。

結果を図７および８に示す。検定されたＤＮＡ希釈の範囲を越えるＬＣＲが生じており、ＳＰＡ計数は再現性があり且つ定量的である。この試験システムにおいて、３５サイクルでは明白な「プラトー」効果が引起こされ（図７）、更に低いサイクル数では、標的の最初のコピー数に応して、はぼ直線的なシグナル増加が見込まれる（図８）。これは、ＰＣＲ反応の際に観察された「プラトー」と同様であり、それ以上に定量の精度を減少させる。

実施例８ＳＰＡビーズによって示されたＤＮＡ結合性を用いる、嚢胞性繊維症遺伝子に隣接するマーカー領域の標的コピーの定量。

ＰＣＲは、プライマーをビオチニル化しなかったこと以外は実施例１の場合と同様に実施した。

増幅後、ＰＣＲ生成物のアリコート３０μｌを各試験管から取出した。シンチレーショ／近接検定用試薬（ｌｘＰＢｓ中のケイ酸イットリウムフルオミクロスフェア（アマ−ジャム、英国））５００μｌをケイ酸イットリウムフルオミクロスフェア１ｍｇ１５００μｌ　（緩衝液）濃度で各試料に対して加えた。試料をオービタルシェーカー上において室温で３時間インキュベートした後、０〜９９９の窓開放ＬＫＢ１２０９／ンチレーンヨンカウンターでそれぞれ２０秒間計数した。

結果を図９に示す。

参考文献：１、　サイキ（Ｓａｉｋｉ）、Ｒ，、シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ）Ｓ、　、ファルーナ（Ｆａｌｏｏｎａ）、Ｆ、　、？リス（Ｍｕｌｌｉｓ）、に６、ホーン（Ｈｏｒｎ）、Ｇ、　、エーリッヒ（Ｅｒ　１１ｃｈ）、Ｈ，、アーンハイム２、ジェネス力（Ｇｅｎｅｓｃａ）、Ｊ、　、：ｙ−アン・ツー・ワン（Ｙｕａｎ−Ｈｕ　Ｗａｎｇ）、Ｒ，、アルタ−（Ａｌ　ｔ　ｅ　ｒ）　ＨｌＪ、およびワイ・り第３、ディックオーバー（Ｄｉｃｋｏｖｅｒ）、Ｒ，、トノパン（Ｄｏｎｏｖａｎ）、Ｒ，、ボルドスタイン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ）、Ｅ、　、ダンプカー（Ｄａｎｄｅｋａｒ）、Ｓ、　、ブツシュ（Ｂｕｓｈ）、Ｃ，およびカールソン（Ｃａｒｌｓｏｎ）、Ｊ、　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　ｙ５、　シリランド（Ｇｉ　１１１１ａｎｄ）、Ｇ、　、ペリジ（Ｐｅｒｒｉｎ）。

Ｓｌ、ブランチヤード（Ｂｌ　ａｎｃｈａｒｄ）、Ｋ、およびブン（Ｂｕｎｎ）。

６、　カップ（Ｋａｔｚ）、Ｊ、　、ボーディン（Ｂｏｄｉｎ）、Ｅ、およびツーエン（Ｃｏｅｎ）、Ｄ、　、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏ　Ｖ　（１９９０）、６４．９．４２８８〜４２９５゜７、　ペジ（Ｂｅ　ｊ）　、　Ａ、　、ステファン（Ｓｔｅｆｆａｎ）、Ｒ，、ディ・シーザー（Ｄｉ　Ｃｅ５ａｒｅ）、Ｊ、　、ハフ（Ｈａ　ｆ　ｆ）　、Ｌ、およびアトラス（Ａｔ　１ａｓ）、　Ｒ，、Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（１９９０）、５６．２．３０７〜３１４゜８、ケロッグ（Ｋｅ　ｌ　ｌｏｇｇ）　、Ｄ、Ｅ、　、スニンスキー（Ｓｎｉｎｓｋｙ）、Ｊ、　、クラオフ（Ｋｗｏｋ）、Ｓ、　、Ａｎａ　ｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　（１９９０）、１８９．２０２〜２０８゜９、リムスタッド（Ｒｉｍｓｔａｄ）、Ｅ、　、ホーンズ（Ｈｏｒｎｅｓ）。

Ｅｌ、オルスビク（Ｏｌｓｖｉｋ）、Ｏ，およびヒルセス（Ｈｙｌｌｓｅｔｈ）。

Ｂ、、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　（１９９０）、２８，１０．２２７５〜２２７８゜１０、ランドバーブ（Ｌｕｎｄｅｂｅｒｇ）、Ｊ、　、ワールバーブ（Ｗａｈｌｂｅｒｇ）、Ｊ、およびウーレン（Ｕｈ　１　ｅｎ）　、　Ｍ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　（１９９１）、１０．１．６８〜７５゜１１．７リス、に１、ファルー九　Ｆｌ、シャー７、Ｓｏ、サイキ、Ｒ１ホーン、Ｇ、およびエーリッヒ、Ｈ，、Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　ＨａｒｂｏｒＳ　ｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、（１９８６）、５１，２６３〜２７３゜１２、ボスワニス（Ｂｏ　ｓｗｏ　ｒ　ｔ　ｈ）　、　Ｎ、およびタワーズ（Ｔｏｗｅｒｓ）、Ｐ、　、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８９）、３４１．１６７〜１６８゜１３．７−ス（Ｈｕｔｈ）　、　Ａ、　、ｓ−スティビル（Ｅｓｔｉｖｉｌｌ）、Ｘ、、グレード（Ｇｒａｄｅ）、に、　、ピルウィッツ（Ｂｉ　ｌ　Ｉｗｉ　ｔｚ）、Ｈ，、スピーア（Ｓｐｅｅｒ）、Ａ、　、ｏ−ゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）、Ａ、、ウィリアムソン（Ｗｉ　ｌ　ｌ　ｉ　ａｍｓ　ｏｎ）　、Ｒ，、ラムセイ（Ｒａｍｓａｙ）。

Ｍ、およびクーテレ（Ｃｏｕｔｅｌｌｅ）、Ｃ，、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、（１９８９）、１７，１７，７１１８゜１４、カップ、Ｅ、およびハフ、Ｌ、　、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９８９）、３．８〜９゜１５、ライト（Ｗｒ　ｉ　ｇｈ　ｔ）　、Ｐ、　およびウィンフォードφトーマス（Ｗｙｎｆｏｒｄ　Ｔｈｏｍａｓ）、Ｄ、　、Ｊ、　ａｔｈｏｌｏｇｙ　（１９９０）、１６２．９９〜１１７゜１６、アイゼンスタイン（Ｅｉｓｅｎｓｔｅｉｎ）、Ｂ、、Ｎｅｗ　Ｅｎ　ｌ。

Ｊ、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（１９９０）、３２２．３，１７８〜１８３゜１７、ブレコツト（Ｂｒｅｃｈｏｔ）、Ｃ，、Ｊ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　（１９９０）、１１．１２４〜１２９゜ＣＦ　ＳＰＡ　ＰＣ，Ｆ？、、　０．１八間つ′今イマー　、τＮ２　ユｉ仇２．０　２．５　３．０　３．５　４．０　４゜５ＬＯＧ、。　９１５色つ断り専天省ｔてヤし７つ七・−１丈ｐＡＷ１０９　ＲＮＡ　つピ〉（（・［９栓つタ　つヒ′−歓１弔１・も５？ハーレ０ぺ、シを寂啓（ｉ（１乳１（１鈎　つビ０−２匁（ｔｌ＋・ｓ　’；ＦＡ−ＬＣＲ，４４，を勝’：＃、、ｙ勺４φ（欠し飲働１う（・−遭（国際調査報牛フロントページの続き（７２）発明者　ダウンズ、マルコム・ジョンイギリス国カーディフ　シーエフ５・４ニスジー、セント・ファガンズ、デニソン・ウェイ　４１（７２）発明者　バリー、デーヴイッド・アルンイギリス国カーディフ　シーエフト３イーエフ、キャセイズ、コラム・ロード６１、フラット　２（７２）発明者　クロス、リサイギリス国カーデイフ　シーエフ４・３ピーキユー、ヒース、アレンズバンク・ロード　１１９（７２）発明者　口ビンソン、フィリップ・ステイーヴンイギリス国パツキンガムシャー　エイチピ−２２・４キユーピー、アイルスバリー、ウィングレイプ、ウィンズロウ・ロード　９８

Claims

【特許請求の範囲】

１．試料中の特異的核酸配列を増幅し且つ定量する方法であって、（ａ）増幅される配列の各鎖に対する少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマーであって、該配列鎖の一部分に対して相補的であるが互いに相補的でない上記プライマー（ｂ）ヌクレオチド供給（ｃ）場合により、増幅される配列の一部分に対して相補的であるが、いずれのプライマーに対しても相補的でないプローブであり、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の内の一つは放射性核種を含み、（ｄ）該放射性核種に接近した場合に蛍光を発する蛍光体を含む固体材料を用いることにより、試薬（ａ）および（ｂ）、場合により（ｃ）をポリメラーゼ存在下において用いて、該特異的核酸配列に基づく増幅生成物を生成し、該増幅生成物の一部分を試薬（ｄ）に対して結合させ、そして試薬（ｄ）によって発せられた蛍光を該特異的核酸配列の尺度として観察することを含む上記方法。
２．特異的核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応技術によって増幅させる請求項１に記載の方法。
３．試薬（ｄ）がその表面上に、増幅生成物に特異的な結合剤を有する請求項１または請求項２に記載の方法。
４．放射性核種を含まない試薬（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の内の一つが、試薬（ｄ）に特異的な結合剤に対して結合する捕捉標識を含む請求項３に記載の方法。
５．少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプライマー（ａ）が捕捉標識を含み、少なくとも一つのヌクレオチド（ｂ）が放射性核種を含み、そして任意のプローブ（ｃ）を用いない請求項４に記載の方法。
６．プローブ（ｃ）が捕捉標識を含む請求項４に記載の方法。
７．捕捉標識がビオチンであり且つ結合剤がストレプトアビジンである請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．捕捉標識が抗原であり且つ結合剤がその抗原に対する抗体である請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
９．増幅生成物が試薬（ｄ）に対して非特異的方法で結合する請求項１または請求項２に記載の方法。
１０．放射性核種が、トリチウム［３Ｈ］、ヨウ素［１２５Ｉ］、炭素［１４Ｃ］、硫黄［３５Ｓ］およびリン［３３Ｐ］から選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
１１．試料中の特異的核酸配列を増幅し且つ定量する方法であって、（ａｂ）増幅される配列の各鎖に対する１対のオリゴヌクレオチドプライマーであって、プライマーの各対が互いに、増幅される全配列鎖に対して相補的であり、１本の鎖に必要とされる対の一方のプライマーは放射性標識で標識され且つ対のもう一方のプライマーは捕捉標識で標識されている上記プライマー、（ｄ）放射性ヌクレオチドに接近した場合に蛍光を発する蛍光体を含む固体材料を用いることにより、試薬（ａｂ）をリガーゼ存在下において用いて、該特異的核酸配列に基づく増幅生成物を生成し、該増幅生成物の一部分を試薬（ｄ）に結合させ、そして試薬（ｄ）によって発せられた蛍光を該特異的核酸配列の尺度として観察することを含む上記方法。
１２．最初に存在する特異的核酸配列のコピー数を、既知のコピー数の特異的配列を含む試料を用いて作成された標準曲線との関係によって推定する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
１３．増幅の程度を、増幅生成物濃度がプラトー領域より下の標準曲線の領域の範囲内にあるように調整する請求項１２に記載の方法。
１４．固体材料（ｄ）がシンチレーション近接検定用ビーズの形である請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。