NL1021160C2

NL1021160C2 - Werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucleotidevolgorde.

Info

Publication number: NL1021160C2
Application number: NL1021160A
Authority: NL
Inventors: Andrea Cossarizza
Original assignee: Multigen Internat B V
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2004-01-27
Also published as: AU2003253515A1; AU2003253515A8; ATE351925T1; DK1521848T3; ES2280812T3; EP1521848A1; US7604964B2; DE60311263T2; US20060105334A1; WO2004011678A1; EP1521848B1; DE60311263D1

Description

Werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucle-otidevolgorde

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucle-otidevolgorde I in een monster onder gebruikmaking van een amplificatietechniek, waarbij de genoemde werkwijze de stap-5 pen omvat van 1) het toevoegen van nucleotiden, primers, polymerase en eventuele verdere reagentia nodig voor de voor het monster gebruikte amplificatietechniek, 2) het uitvoeren van één of meer amplificatiecycli voor het 10 amplificeren van de nucleotide-volgorde waarvan het kopie aantal moet worden bepaald.

De meeste eukaryote diploïde cellen bevatten twee kopieën van een enkel gen; één op elk chromosoom van een chromosomenpaar. De chromosomen van een chromosomenpaar zijn 15 afkomstig van elke ouder, de genen kunnen verschillend zijn en bijvoorbeeld één ervan kan resulteren in een abnormaal eiwit. Derhalve is het aantal functionele genen niet noodzakelijkerwijs 2 in een eukaryoot. Ofschoon genen vaak aanwezig zijn met één kopie per chromosoom van een bepaald chromoso-20 menpaar, zijn sommige genen aanwezig met verscheidene kopieën, bijvoorbeeld in tandem repeat volgorden. Een andere uitzondering op de algemene regel van 2 per cel is mitochondri-aal DNA. Een cel bevat veel mitochondriën, waarbij het aantal afhankelijk is van het type cel. Maar zelfs voor een bepaald 25 celtype kan het aantal mitochondriën variëren. Kenmerkende aantallen zijn tussen 100 en 1000 mitochondriën per cel, en elk mitochondrion bevat verscheidene kopieën mitochondriaal DNA. Het kopieaantal is niet noodzakelijkerwijs gelijk aan of groter dan 2 per cel. Sommige nucleotidevolgorden zijn zeer 30 zeldzaam onder cellen (ondanks het feit dat ze van één en hetzelfde individu, zoals een mens, afkomstig zijn). Dit is bijvoorbeeld het geval na gen herrangschikking. Dit is bijvoorbeeld het geval voor antilichaam-producerende cellen (B-lymfocyten) of receptordragende T-lymfocyten. Van een groot 35 aantal lymfocyten zullen slechts enkele een bepaalde nucleo- 10211601 2 3-volgorde bevatten die het variabele gebied definieert een bepaald antilichaam (of van de T-cel receptor) die in at is om een bepaald antigeen te herkennen. In het vak beat er een behoefte om op betrouwbare wijze het kopieaantal een nucleotide-volgorde, welke de nucleotide-volgorde van gen kan omvatten of een deel daarvan, te bepalen. Een <wijze volgens de aanhef is in het vak bekend. In het bij-ier beschrijven Douek et al. (Nature, 396, blz. 690-695 38)) een werkwijze voor het detecteren van de producten de herrangschikkingen van T-cel receptoren (TREC) onder ruikmaking van een semi-kwantitatieve assay. Voor het bean van de hoeveelheid TREC in een gegeven monster wordt bekende hoeveelheid van een DNA competitor bereid. Verlens wordt een hoeveelheid monster DNA dat de te bepalen Leotide-volgorde bevat aan de buis toegevoegd. Een PCR-Lificatie reactie wordt uitgevoerd in aanwezigheid van ra-actief gelabeld desoxynucleotide. Vervolgens worden de re-:erende amplificatieproducten op een gel gebracht om het ster DNA PCR product van het competitor DNA product te aiden. Na autoradiografie wordt de hoeveelheid van de te alen nucleotide-volgorde berekend onder gebruikmaking van aitometrische analyse van de verhouding· tussen een band een competitor en een band van het monster DNA. Het re-:aat wordt uitgedrukt als het aantal kopieën TREC per mi-jram totaal DNA. Om een aanvaardbare nauwkeurigheid te be-cen worden 4 buizen die scalaire hoeveelheden competitor bevatten gebruikt, waaraan vaste hoeveelheden monster DNA ien toegevoegd.

Het nadeel van deze werkwijze is dat wanneer DNA uit Len wordt geëxtraheerd, er moet worden aangenomen dat dit iet in de cellen aanwezige DNA is. Dat wil zeggen, er it aangenomen dat geen enkele cel aan lysis is ontsnapt en iet in de cellen aanwezige DNA werd geëxtraheerd en geïso-:d. Dit is niet noodzakelijkerwijs het geval. Een ander iel van deze werkwijze is dat deze gevoelig is voor ver-Lllen in amplificatie-efficiëntie.

Het doel van de onderhavige uitvinding is om een cwijze te verschaffen waarmee op betrouwbare wijze het ko- 6 0* 3 pieaantal van een nucleotide-volgorde kan worden bepaald zelfs indien deze aanwezig is in extreme hoeveelheden, zoals vele kopieën per cel of slechts enkele kopieën per veel cellen. Daarenboven is een doel van de onderhavige uitvinding om 5 een werkwijze te verschaffen die een verminderde gevoeligheid heeft voor de efficiëntie waarmee DNA uit de cellen die een nucleotide-volgorde I waarvan het kopieaantal moet worden bepaald bevatten wordt geëxtraheerd.

Hiertoe wordt de werkwijze volgens de onderhavige 10 uitvinding gekenmerkt doordat het monster een chromosomale tweede nucleotide-volgorde II bevat, en - de eerste nucleotide-volgorden I wordt geamplificeerd, - de tweede nucleotide-volgorden II wordt geamplificeerd, - een derde nucleotide-volgorde I' corresponderend met de 15 eerste nucleotide-volgorde I met verschillende verdunningen wordt geamplificeerd, en - een vierde nucleotide-volgorde II' corresponderend met de tweede nucleotide-volgorde II wordt geamplificeerd bij uiteenlopende verdunningen, 20 waarbij de verhouding van de concentraties nucleotide- volgorde I' en II' bekend is; de amplificaties van de derde en vierde nucleotide-volgorden I' en II' bij verschillende verdunningen het mogelijk maakt standaard krommen SCi te maken waarbij i I of II is, waarbij de concentraties van I en II 25 worden bepaald onder gebruikmaking van de respectievelijke standaard kromme SCi, en de relatieve concentraties het mogelijk maken het relatieve kopieaantal CN van volgorde I (versus nucleotide-volgorde II) te bepalen onder gebruikmaking van de formule 30 [I] sci' CN = -- [II] scii' 35 waarbij CN het relatieve kopieaantal I ten opzichte van II in het monster is; [I]sci' de concentratie I is bepaald onder gebruikmaking van standaard kromme SCI'; en 10211 eOtf 4 sen' de concentratie I is bepaald onder gebruikmaking van idaard kromme SCII'.

De nucleotide-volgorde concentraties kunnen worden laid onder gebruikmaking van elke in het vak bekende ge-.kte werkwijze. Een dergelijke werkwijze kan radioactieve iwijzen omvatten, het gebruik van elektroforetische schei-fen en kwantificering onder gebruikmaking van, bijvoor-.d, densitometrie enz. Ofschoon specifiek wordt verwezen : standaardkrommen spreekt voor zich dat dit kan geschie-onder gebruikmaking van rekenkundige werkwijzen zonder daadwerkelijk een grafiek wordt gemaakt. Dit valt volle-binnen het kader van de onderhavige uitvinding. In het smeen zullen alle amplificaties afzonderlijk worden uitge-:d (d.w.z. in een individuele amplificatiehouder zoals een e van een microtiterplaat), en bij voorkeur in hoofdzaak slijk. De werkwijze volgens de uitvinding is niet alleen : nauwkeurig, maar ook zeer doelmatig indien uitgevoerd : verscheidene monsters.

Het aantal amplificatiecycli is niet noodzakelijker-; hetzelfde voor I en II, maar ze zijn hetzelfde voor a) I ; en voor II en II' .

Volgens een voorkeursuitvoering wordt het absolute .eaantal bepaald door het vermenigvuldigen van het kopie-:al CN met het absolute kopieaantal van volgorde II per

Voor verscheidene nucleotide-volgorden II is het :al kopieën per cel bekend. Een voorbeeld is, bijvoor-.d, het gen dat codeert voor heat shock protein 70, of Fas md (CD178), waarvan bekend is dat deze aanwezig zijn met s kopieën per cel (d.w.z. het absolute kopieaantal van hsp : 2). Veel nucleotide-volgorden van genen zijn zeer ge-.kt omdat zij in het algemeen aanwezig zijn met een bekend :al kopieën in elke cel van de soort waaruit het DNA wordt :regen. De doelmatigheid waarmee DNA materiaal uit de cel-wordt geëxtraheerd is niet belangrijk (ofschoon in het il dat nucleotide-volgorde I op een andere molecuul aanwe-is dan nucleotide-volgorde II, het belangrijk is dat zij dezelfde efficiëntie worden geëxtraheerd). Bijgevolg I 60* 5 maakt deze uitvoeringsvorm de bepaling mogelijk van het absolute kopieaantal van nucleotide-volgorde I per cel.

Volgens een voorkeursuitvoeringsvorm bevindt ten minste één van de derde nucleotide-volgorde I' en vierde nu-5 cleotide-volgorde II' zich op een vector.

Indien aanwezig op een vector is het gemakkelijk om de betreffende nucleotide-volgorde in de gewenste hoeveelheden te verkrijgen. Het is ook zeer gemakkelijk om de DNA-concentratie te bepalen en bijgevolg het kopieaantal van de 10 nucleotide-volgorde per volume. De vector kan elke in het vak bekende vector zijn, zoals een plasmide, een cosmide, een virus enz. Indien de derde nucleotide-volgorde I' zich op een eerste vector bevindt en de vierde nucleotide-volgorde II' zich op een tweede vector bevindt, kunnen de vectoren in elke 15 gewenste verhouding worden gebruikt (of gemengd) om tegemoet te komen aan de verwachte verschillen in kopieaantal in het monster.

Een vector die de derde nucleotide-volgorde I' draagt bevat bij voorkeur ten minste twee verschillende derde 20 nucleotide-volgorden I' voor het meten van twee verschillende eerste nucleotiden I.

Met andere woorden, een enkele vector, waarvan de concentratie slechts één keer hoeft te worden bepaald, kan verscheidene derde nucleotide-volgorden I' dragen, hetgeen 25 het bijvoorbeeld mogelijk maakt dat de kopieaantallen van veel verschillende genen worden bepaald.

Het geniet sterk de voorkeur dat de derde nucleotide-volgorde I' en vierde nucleotide-volgorde II' zich op dezelfde vector bevinden.

30 Aldus is de verhouding constant en precies bekend (bijvoorbeeld 1:1). Dit maakt de meest nauwkeurig mogelijke metingen mogelijk.

Bij voorkeur is de eerste nucleotide-volgorde I hetzelfde als de derde nucleotide-volgorde I'.

35 Dit vermindert de fouten tengevolge van verschillen in amplificatie-efficiënties tussen I en I' sterk. Desalniettemin zijn kleine verschillen in nucleotide-volgorde in het algemeen toegestaan, ofschoon veranderingen bij plaatsen waar 102116 0** 6 robe gebruikt voor het detecteren van de concentratie van ucleotide-volgorde beter kunnen worden vermeden.

Evenzo geniet het de voorkeur dat de tweede nucleo--volgorde II hetzelfde is als de vierde nucleotide-orde II'.

Volgens een voorkeursuitvoering bevat de vector ten te twee verschillende nucleotide-volgorden I'.

Volgens een uitvoeringsvorm die zeer de voorkeur gewordt de amplificatiereactie gevolgd, bij voorkeur spec-otometrisch.

Een dergelijke spectrofotometrische werkwijze is in vak bekend. Meer in het bijzonder kunnen interne probes en gebruikt die real time metingen mogelijk maken, bij-beeld real time PCR. Interne probes zijn in het vak be-, en zijn bijvoorbeeld beschreven door Winer et al.

1. Biochem 270, blz. 41-49 (1999)). Metingen kunnen het-continu of na het beëindigen van een amplificatiecyclus en uitgevoerd.

Ofschoon de onderhavige uitvinding is beschreven on-verwijzing naar DNA, heeft de onderhavige uitvinding ook ekking op de bepaling van het aantal RNA-volgorden dat in cel aanwezig is. Er kan gebruik worden- gemaakt van in het bekende werkwijzen voor het multipliceren van RNA, bij-beeld door bereiding van cDNA. Deze aanvrage beoogt niet einteresseerde leek op te leiden tot een terzake kundige, elke reden de leek wordt verwezen naar algemene leerboe-en in het bijzonder naar een goede universiteit om de iste technieken te leren waarvan een terzake kundige weet die deze kan toepassen om de onderhavige uitvinding uit oeren.

1160«

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucleotide-volgorde I in een monster onder gebruikmaking van een amplificatietechniek, waarbij de genoemde werkwijze de stappen omvat van 1. het toevoegen van nucleotiden, primers, polymerase en even tuele verdere reagentia nodig voor de voor het monster gebruikte amplificatietechniek, 2. het uitvoeren van één of meer amplificatiecycli voor het amplificeren van de nucleotide-volgorde waarvan het kopie-10 aantal moet worden bepaald; gekenmerkt doordat het monster een chromosomale tweede nucleotide-volgorde II bevat, en - de eerste nucleotide-volgorden I wordt geamplificeerd, - de tweede nucleotide-volgorden II wordt geamplificeerd, 15. een derde nucleotide-volgorde I' corresponderend met de eerste nucleotide-volgorde I met verschillende verdunningen wordt geamplificeerd, en - een vierde nucleotide-volgorde II' corresponderend met de tweede nucleotide-volgorde II wordt geamplificeerd bij uit- 20 eenlopende verdunningen, waarbij de verhouding van de concentraties nucleotide-volgorde I' en II' bekend is; de amplificaties van de derde en vierde nucleotide-volgorden I' en II' bij verschillende verdunningen het mogelijk maakt standaard krommen SCi te maken 25 waarbij i I of II is, waarbij de concentraties van I en II worden bepaald onder gebruikmaking van de respectievelijke standaard kromme SCi, en de relatieve concentraties het mogelijk maken het relatieve kopieaantal CN van volgorde I (versus nucleotide-volgorde II) te bepalen onder gebruikmaking 30 van de formule [ I ] sci' CN = - [ II ] scii' 35 waarbij 1021160* et relatieve kopieaantal I ten opzichte van II in het ter is; [IJscr de concentratie I is bepaald onder gebruik-ng van standaard kromme SCI'; en sen' de concentratie I is bepaald onder gebruikmaking van daard kromme SCII'.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, het absolute kopieaantal wordt bepaald door het vermenig-igen van het kopieaantal CN met het absolute kopieaantal volgorde II per cel.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het ken-, dat ten minste één van de derde nucleotide-volgorde I' ierde nucleotide-volgorde II' zich op een vector bevindt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, de vector die de derde nucleotide-volgorde I' draagt bij keur ten minste twee verschillende derde nucleotide-orden I' voor het meten van twee verschillende eerste nu-tiden I bevat.

5. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het ken- , dat de derde nucleotide-volgorde I' en vierde nucleoti-olgorde II' zich op dezelfde vector bevinden.

6. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, het kenmerk, dat de eerste nucleotide-volgorde I hetzelf-s als de derde nucleotide-volgorde I' .

7. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, het kenmerk, dat de tweede nucleotide-volgorde II het-de is als de vierde nucleotide-volgorde II' .

8. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, het kenmerk, dat de amplificatiereactie wordt gevolgd, voorkeur spectrofotometrisch. 60·