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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der
Kopienzahl einer Nukleotidsequenz I in einer Probe unter Verwendung
einer Amplifikationstechnik, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
- 1) Zugabe von Nukleotiden, Primern,
Polymerase und jeglichen weiteren Reagenzien, falls nötig, die für die Amplifikationstechnik,
die verwendet wird, benötigt
werden zu der Probe,
- 2) Durchführung
von ein oder mehreren Amplifikationszyklen, um die Nukleotidsequenz
I zu amplifizieren, für
die die Kopiezahl bestimmt werden soll;
wobei die Probe eine
chromosomale zweite Nukleotidsequenz II enthält,
und
a) die erste
Nukleotidsequenz I amplifiziert wird,
b) die zweite Nukleotidsequenz
II amplifiziert wird,
c) eine dritte Nukleotidsequenz I', korrespondierend
zu der ersten Nukleotidsequenz I, und die in einer Kontrollprobe
vorliegt, wird in verschiedenen Verdünnungen amplifiziert, und
d)
eine vierte Nukleotidsequenz II',
korrespondierend zu der zweiten Nukleotidsequenz II, und die in
einer Kontrollprobe vorliegt, wird in verschiedenen Verdünnungen
amplifiziert,
wobei das Verhältnis der Konzentrationen der
Nukleotidsequenzen I' und
II' bekannt ist,
wobei
die Amplifikationen der dritten und vierten Nukleotidsequenzen I' und II' bei unterschiedlichen
Verdünnungen
Standardkurven SCi ermöglichen, wobei i I oder II
ist, wobei die Konzentrationen von I und II unter Verwendung der
jeweiligen Standardkurve SCi bestimmt werden
und die relativen Konzentrationen es ermöglichen, die relative Kopiezahl
CN der Sequenz I (gegenüber
der Nukleotidsequenz II) unter Verwendung der Formel: zu bestimmen, wobei
CN
die relative Kopiezahl von I gegenüber II in der Probe ist;
[I]SCI' die
Konzentration von I ist, bestimmt unter Verwendung der Standardkurve
SCI';
und
[II]SCII' ist die Konzentration von II,
bestimmt unter Verwendung der Standardkurve SCII'.
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Die
meisten eukaryontischen diploiden Zellen enthalten zwei Kopien eines.
einzelnen Gens; eines auf jedem Chromosom eines Paars von Chromosomen.
Die Chromosomen eines Chromosomenpaars stammen von jedem Elternteil
ab, und die Gene können
daher unterschiedlich sein und beispielsweise kann eines von ihnen
zu einem abnormalen Protein führen.
So ist die Zahl der funktionalen Gene nicht notwendigerweise bei
einem Eukaryonten 2 und kann 1 oder sogar 0 sein. Während häufig Gene
in einer Kopie pro Chromosom eines bestimmten Chromosomenpaars vorliegen,
liegen einige Gene in multiplen Kopien vor, beispielsweise in Tandem-Repeat-Sequenzen.
Eine andere Ausnahme zu der allgemeinen Regel von 2 Kopien pro Zelle
ist die Mitochondrien-DNA. Eine Zelle enthält viele Mitochondrien, wobei
die Zahl von der Art der Zelle abhängt. Selbst jedoch für eine bestimmte
Zellart kann die Zahl der Mitochondrien variieren. Typische Zahlen
liegen zwischen 100 und 1.000 Mitochondrien pro Zelle und jedes
Mitochondrium enthält
etliche Kopien der Mitochondrien-DNA. Zusätzlich ist die typische Kopienzahl
nicht notwendigerweise entsprechend größer als 2 pro Zelle. Einige
Nukleotidsequenzen sind unter den Zellen sehr selten (obwohl es
sich um ein und dasselbe Subjekt handelt, wie z.B. einen Menschen).
Dies tritt z.B. nach einer Genumanordnung auf. Dies ist z.B. der
Fall bei Antikörper
erzeugenden Zellen (B-Lymphozyten) oder Rezeptor tragenden T-Lymphozyten.
Von einer großen
Anzahl von Lymphozyten werden nur einige wenige eine bestimmte Nukleotidsequenz
enthalten, die den variablen Bereich eines bestimmten Antikörpers (oder
des T-Zell-Rezeptors) definiert, der ein bestimmtes Antigen erkennen
kann. Auf dem Gebiet besteht ein Bedarf, die Kopienzahl einer Nukleotidsequenz
verlässlich
zu bestimmen, die die Nukleotidsequenz eines Gens oder Teils davon
umfassen kann. Ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff
ist auf dem Gebiet bekannt.
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Die
EP-A-0 959 140 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung einer Menge
einer Nukleinsäuresequenz
in einer Probe, umfassend die Schritte der Bildung einer Vielzahl
von Standardproben (II), die jeweils eine bekannte Startmenge einer
Nukleinsäure-Kontrollsequenz
(II') und eine bekannte
Startmenge einer Nukleinsäure-Zielsequenz
(I') darin enthalten;
Bildung einer Testprobe, die eine bekannte Startmenge der Nukleinsäure-Kontrollse quenz
und eine unbekannte Startmenge der Nukleinsäure-Zielsequenz enthält (I);
Amplifikation von Mengen der Nukleinsäure-Kontroll- und -Zielsequenzen
in jeder der Standard- und Testproben, während eines Amplifikations-Zeitintervalls;
Messung von Indizien der amplifizierten Mengen der Nukeinsäure-Kontroll- und -Zielsequenzen
in jeder der Standardproben und der Testprobe; Bestimmung eines
Amplifikationsverhältnisses
aus den gemessenen Indizien der amplifizierten Mengen der Nukleinsäure-Kontroll-
und -Zielsequenzen in den Standardproben und Bestimmung einer Größenordnung
der Startmenge der Nukleinsäure-Zielsequenz
in der Testprobe aus dem Amplifikationsverhältnis und den gemessenen Indizien
der amplifizierten Mengen der Nukleinsäure-Kontroll- und -Zielsequenzen
in der Testprobe. Die unterschiedlichen Standardsequenzen befinden
sich jedoch nicht auf demselben Sektor.
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Die
EP-A-1 138 783 offenbart ein Quantifizierungsverfahren für eine Zielnukleinsäure in einer
Probe, umfassend die folgenden Schritte: a) Bestimmung der Amplifikationseffizienz
der Zielnukleinsäure
unter definierten Amplifikationsbedingungen, b) Amplifikation der
Zielnukleinsäure,
enthalten in der Probe unter denselben definierten Reaktionsbedingungen,
c) Messung der Amplifikation in Echtzeit, d) Quantifikation der
ursprünglichen
Menge der Zielnukleinsäure
in der Probe durch Korrektur der ursprünglichen Menge, abgeleitet
von Schritt c) mit Hilfe der bestimmten Amplifikationseffizienz.
Die unterschiedlichen Standardsequenzen liegen jedoch nicht auf demselben
Vektor.
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Ein
Verfahren gemäß dem Oberbegriff
ist bekannt, und wird offenbart von Kwok et al. in
US 5,389,512 .
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Es
ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, dieses Verfahren zur
verlässlichen
Bestimmung der Kopienzahl einer Nukleotidsequenz zu verbessern,
selbst wenn diese in extremen Mengen vorliegt, wie z.B. sehr vielen
Kopien pro Zelle oder nur einigen Kopien pro viele Zellen. Zusätzlich ist
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines
Verfahrens, das eine reduzierte Empfindlichkeit zu der Effizienz
hat, mit der die DNA aus den Zellen extrahiert wurde, enthaltend
eine Nukleotidsequenz I, für
die die Kopienzahl bestimmt werden soll.
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Zu
diesem Zweck ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Paar von Amplifikationsreaktionen,
gewählt
aus i) a) und b) und ii) c) und d), in einem Einzelbehälter durchgeführt und
spektrofotometrisch während
der Amplifikation überwacht
wird, und die dritte Nukleotidsequenz I' und die vierte Nukleotidsequenz II' auf einem einzelnen
Vektor vorliegen.
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Dies
ermöglicht
eine akkuratere Messung der relativen oder absoluten Kopienzahlen
der Nukleotidsequenz I. Geeignete spektrofotometrische Verfahren
sind auf dem Gebiet bekannt. Insbesondere betreffen solche Verfahren
interne Sonden für
Echtzeitmessungen, z.B. Echtzeit-PCR. Interne Sonden sind auf dem
Gebiet bekannt und werden beispielsweise von Winer et al (Anal.
Biochem 270, Seiten 41-49 (1999)) offenbart. Die Messungen können entweder
kontinuierlich oder nach Beendigung eines Amplifikationszyklus durchgeführt werden.
Während spezifisch
auf Standardkurven Referenz genommen wird ist klar, dass die unter
Verwendung von Computerverfahren durchgeführt werden kann, ohne das ein tatsächlicher
Graph erstellt wird. In der gegenwärtigen Anwendung involviert
daher der Ausdruck "Herstellung
einer Standardkurve" ein
Verfahren unter Verwendung von mindestens zwei Referenzpunkten zur
Bestimmung einer (relativen) Konzentration. Allgemein werden alle
Amplifikationen im wesentlichen zur selben Zeit durchgeführt. Durch
Durchführung multipler
Amplifikationen in einem Behälter
wird der Raum für
einen Fehler reduziert. Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht nur
hoch akkurat sondern auch sehr effizient, wenn es für multiple
Proben durchgeführt
wird. Das heißt,
für jede
Nukleotidsequenz I, für
die eine Kopienzahl bestimmt werden soll, muss nur eine einzelne
Standardkurve SCII' hergestellt werden. Im Hinblick
auf die Bezeichnung "korrespondierend", wie in der vorliegenden
Erfindung im Zusammenhang mit Nukleotidsequenzen verwendet, soll
dies bedeuten, dass die Nukleotidsequenzen I und I' (und II und II') oder genauer gesagt, die
Nukleotidsequenz von einer und die komplementäre Sequenz der anderen unter
stringenten Bedingungen hybridisieren können. Wenn die Sequenzen I und
I' (und II und II') nicht dieselbe
Länge aufweisen, ist
die kürzeste
der beiden vorzugsweise höchstens 50
%, noch bevorzugter höchstens
30 % kürzer.
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Die
dritte Nukleotidsequenz I' und
vierte Nukleotidsequenz II',
die auf demselben Vektor vorliegen, ermöglichen, dass ihr Verhältnis konstant
und exakt bekannt ist (beispielsweise 1:1). Dies ermöglicht es,
dass besonders akkurate Messungen möglich werden. Es ist möglich, den
Vektor, der die beiden Nukleotidsequenzen I' und II' enthält, einem Verdau unter Verwendung
von ein oder mehr Restriktionsenzymen, optional gefolgt von einer
Reinigung zu unterziehen, um ein lineares Molekül zu erhalten, das die beiden
Nukleotidsequenzen I' und
II' enthält und Verwendung
dieses Moleküls
für die
Amplifikationen, die für
die Standardkurven benötigt
werden.
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In
der gegenwärtigen
Anmeldung soll ein Vektor jede Nukleotidsequenz sein, bestehend
aus oder enthaltend die zu amplifizierenden Nukleotidsequenz (Nukleotidsequenzen).
Wenn diese auf einem Vektor vorliegen, der in vitro oder in vivo
repliziert werden kann, wird es einfach, diese bestimmte Nukleotidsequenz
in gewünschten
Mengen zu erhalten. Es ist auch sehr einfach, die DNA-Konzentration
zu bestimmen und daher die Kopienzahl der Nukleotidsequenz pro Volumen.
Ein Vektor, der zur Replikation in der Lage ist oder repliziert
werden kann, kann irgendein solcher Vektor sein, der auf dem Gebiet
bekannt ist, wie z.B. ein Plasmid, ein Cosmid, ein Virus usw. Wenn
gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
die dritte Nukleotidsequenz I' auf
einem ersten Vektor und die vierte Nukleotidsequenz II' auf einem zweiten
Vektor vorliegt, können
die Vektoren in jedem gewünschten
Verhältnis
verwendet (oder gemischt) werden, um den erwarteten Unterschieden
in der Kopienzahl in der Probe zu entsprechen.
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Douek
et al. (Nature 396, Seiten 690-695 (1998)) beschreibt ein Verfahren
zum Nachweis der Produkte der Umanordnungen von T-Zell-Rezeptoren
(TREC) unter Verwendung eines semi-quantitativen Assays. Zur Bestimmung
der Menge von TREC in einer gegebenen Probe wurde eine bestimmte Menge
eines DNA-Kompetitors hergestellt. Dann wird eine Menge von Proben-DNA,
enthaltend die zu bestimmende Nukleotidsequenz, dem Röhrchen zugefügt. Eine
PCR-Amplifikationsreaktion
wird in Gegenwart von radioaktiv markiertem Deoxynukleotid durchgeführt. Darauffolgend
läßt man die
resultierenden Amplifikationsprodukte auf einem Gel laufen, um das
Proben-DNA PCR-Produkt von einem kompetitiven DNA-Produkt zu trennen.
Nach der Autoradiografie wird die Menge der zu bestimmenden Nukleotidsequenz
unter Verwendung einer densitometrischen Analyse aus dem Verhältnis zwischen
einer Bande von Kompetitor-DNA und einer Bande der Proben-DNA berechnet.
Das Ergebnis wird als Zahl von Kopien von TREC pro Mikrogramm Gesamt-DNA ausgedrückt. Um
eine annehmbare Genauigkeit zu erreichen, werden 4 Röhrchen,
enthaltend skalare Mengen von Kompetitor-DNA verwendet, wozu fixierte
Mengen Proben-DNA zugefügt
werden. Der Nachteil dieses Verfahrens ist derjenige, dass wenn
DNA aus Zellen extrahiert wird, angenommen werden muss, dass dies
die gesamte DNA ist, die in den Zellen vorliegt. Das heißt, es wird
angenommen, dass keine Zelle der Lyse entkommen ist und dass alle DNA,
die in den Zellen vorliegt, extrahiert und isoliert wurde. Dies
ist nicht notwendigerweise der Fall. Ein anderer Nachteil dieses
Verfahrens ist derjenige, dass es im Hinblick auf Unterschiede in
der Amplifikationseffizienz empfindlich ist.
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Die
europäische
Patentveröffentlichung
EP 0 959 140 offenbart ein
Verfahren und einen Apparat zur Bestimmung von Mengen von Nukleinsäuresequenzen
in Proben unter Verwendung von Standardkurven und Amplifikationsverhältnisschätzungen. Eine
Pluralität
von Standardproben, die jeweils eine bekannte Menge einer Nukleinsäurekontrollsequenz enthalten
und eine Testprobe, die eine bekannte Menge der Nukleinsäurekontrollsequenz
plus eine Nukleinsäuresequenz
in unbekannter Konzentration enthält, werden einer Amplifikationsreaktion
unterworfen. Die Konzentration der in unbekannter Konzentration
in der Testprobe vorliegenden Nukleinsäure wird bestimmt.
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Die
europäische
Patentveröffentlichung
EP 1 138 783 offenbart ein
Quantifizierungsverfahren einer Nukleinsäure in einer Testprobe durch
Bestimmung der Amplifikationseffizienz unter definierten Bedingungen
und Durchführung
der Quantifizierung der Nukleinsäure
unter denselben definierten Bedingungen, was eine Korrektur der
bestimmten Konzentration für
die Nukleinsäure
ermöglicht.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform wird
die absolute Kopienzahl durch Multiplikation der Kopienzahl CN mit
der absoluten Kopienzahl von Sequenz II pro Zelle bestimmt.
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Für etliche
Nukleotidsequenzen II ist die Zahl von Kopien pro Zelle bekannt.
Ein Beispiel ist beispielsweise das Gen, das das Hitzeschockprotein
70 kodiert oder der Fas Ligand (CD178), von denen bekannt ist, dass
sie mit zwei Kopien pro Zelle vorliegen (d.h. die absolute Kopienzahl
von hsp 70 = 2). Viele Nukleotidsequenzen von Genen sind sehr geeignet, da
sie allgemein in bekannter Anzahl von Kopien in jeder Zelle der
Art, von der die DNA abstammt, vorliegen. Die Effizienz, mit der
das DNA-Material aus den Zellen extrahiert wird, ist nicht wichtig
(obwohl es in dem Fall, dass die Nukleotidsequenz I auf einem unterschiedlichen
Molekül
vorliegt als in Nukleotidsequenz II, wichtig ist, dass sie mit derselben
Effizienz extrahiert werden). Daher ermöglicht diese Ausführungsform
die Bestimmung der absoluten Kopienzahl der Nukleotidsequenz I pro
Zelle.
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Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform liegen
mindestens zwei unterschiedliche dritte Nukleotidsequenzen I' zur Messung einer
korrespondierenden Zahl unterschiedlicher erster Nukleotidsequenzen
I auf einem einzelnen Vektor vor.
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Anders
ausgedrückt
kann ein einzelner Vektor, der es nur nötig macht, dass seine Konzentration nur
einmal bestimmt wird, multiple dritte Nukleotidsequenzen I' tragen, was beispielsweise
erlaubt, dass Kopienzahlen von vielen unterschiedlichen Genen bestimmt
werden.
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Vorzugsweise
ist die Sequenz der ersten Nukleotidsequenz I dieselbe wie diejenige
der dritten Nukleotidsequenz I'.
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Dies
reduziert deutlich die Fehler aufgrund von Unterschieden in Amplifikationseffizienten
zwischen I und I'.
Trotzdem werden kleine Unterschiede in der Nukleotidsequenz allgemein
erlaubt, obwohl Veränderungen
der Stellungen, wo die Sonde für
den Nachweis der Konzentration der Nukleotidsequenz verwendet wird,
am besten vermieden werden. Anders ausgedrückt wird es sehr bevorzugt,
wenn die Sonde ein perfektes Paar für die Sequenz ist, wo sie binden
soll.
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Ähnlich wird
es bevorzugt, dass die Sequenz der zweiten Nukleotidsequenz II dieselbe
wie diejenige der vierten Nukleotidsequenz II' ist.
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Obwohl
die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf DNA beschrieben wird,
betrifft die vorliegende Erfindung auch die Bestimmung einer Anzahl
von RNA-Sequenzen, die in einer Zelle vorliegen. Man kann sich dabei
Verfahren bedienen, die auf dem Gebiet bekannt sind, um die RNA
zu vervielfältigen,
z.B. durch Herstellung von cDNA. Diese Anmeldung versucht nicht,
einem interessierten Laien zu erklären, wie er ein Fachmann auf
dem Gebiet werden kann, aus welchem Grund der Laie auf allgemeine
Textbücher
verwiesen wird und insbesondere auf eine gute Universität, um die
benötigten
Techniken zu erlernen, von denen der Fachmann auf dem Gebiet weiß, wie er
diese Techniken anwenden soll, um die gegenwärtige Erfindung auszuführen.
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Die
vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
erklärt,
worin
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1 eine
Standardkurve für
eine mtDNA-Sequenz I' (Kreise)
repräsentiert
plus Daten für die
Nukleotidsequenz I (Quadrate);
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2 repräsentiert
eine Standardkurve für eine
Kern-DNA-Sequenz II' (Kreise)
plus Daten für die
Nukleotidsequenz II (Quadrate);
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3 repräsentiert
eine Standardkurve für eine
Kern-DNA-Sequenz I' (Kreise)
plus Daten für
die Nukleotidsequenz I (Quadrate);
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4 repräsentiert
eine Standardkurve für eine
Kern-DNA-Sequenz II' (FasL)
(Kreise) plus Daten für
die Nukleotidsequenz II (Quadrate);
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5 zeigt
die Wirkung des Alters auf die Zahl von Kopien von TREC in peripheren
Lymphozyten (Prozentsatz von Lymphozytenzellen, die TREC exprimieren).
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Das
Verfahren gemäß der Erfindung
wird unter Verwendung von zwei Beispielen illustriert. Das erste
betrifft die quantitative Analyse von Mitochondrien-DNA (mtDNA)
und demonstriert das Verfahren zur Bestimmung multipler Kopien pro
Zelle. Das zweite Beispiel demonstriert die quantitative Bestimmung
einer fraktionalen Kopienzahl einer bestimmten Nukleotidsequenz
pro Zelle.
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BEISPIEL 1
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Material und Methoden
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Primer
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Die
Nukleotidsequenz I (mtDNA) war eine Strecke mit einer Länge von
102 Nukleotiden und korrespondiert zu einem Teil des Enzyms NADH-Dehydrogenase,
wie codiert durch mtDNA. Die Amplifikation der Nukleotidsequenz
I wurde unter Verwendung eines Satzes von Primern durchgeführt, die
jeweils eine Länge
von 21 Nukleotiden aufwiesen und unter Verwendung von Standardverfahren
synthetisiert wurden. Die Sequenzen beider Primer wurden im Hinblick
auf ihre Einzigartigkeit für
menschliche mtDNA unter Verwendung der Blast-Software durch die NCBI Site bei NIH
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) überprüft.
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Die
Nukleotidsequenz II (Kern-DNA), die als Referenz diente, war eine
Strecke mit einer Länge von
104 Nukleotiden und einem Teil des FasL-Gens, das mit zwei Kopien
pro menschlicher Zelle vorliegt. Die Amplifikation der Nukleotidsequenz
II wurde unter Verwendung eines Satzes von Primern mit jeweils einer
Länge von
21 bzw. 24 Nukleotiden durchgeführt.
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Sonden
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Um
das Fortschreiten der Amplifikation zu überwachen, wurde eine Sonde
für die
Nukleotidsequenz I verwendet, wobei die Sonde eine Länge von 23
Nukleotiden aufweist, mit einer FAM (Carboxyfluoreszein) fluoreszierenden
Sonde am 5'-Ende
und einer BlackHole Quencher1TM-Gruppe am
3'-Ende. Diese Sonde
und alle anderen in dieser Anmeldung wurden kommerziell bei MWG,
Ebersberg, Deutschland, bestellt. Die Sequenz der Sonde wurde im
Hinblick auf ihre Einzigartigkeit für menschliche mtDNA unter Verwendung
der Blast-Software durch die oben erwähnte NCBI-Stelle überprüft.
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Die
für Nukleotid
II verwendete Sonde hatte eine Länge
von 22 Nukleotiden und ein TexasRed als fluoreszierende Markierung
und eine BlackHole Quencher2TM-Gruppe am
3'-Ende (MWG).
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DNA-Isolierung
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Die
DNA wurde von HL60, einer promyelozytischen Leukämiezelllinie, unter Verwendung
eines DNA-Isolationskits von Qiagen, Hilden, Deutschland, gemäß den Anweisungen
des Herstellers isoliert.
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Kontrolle
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Ein
Vektor wurde konstruiert, wobei pGEM-11Z (Promega), enthaltend die
Sequenzen I' und
II' vom Kopf zum
Schwanz, verwendet wurde, unter Verwendung von standardisierten
genetischen Manipulationsverfahren, wie sehr bekannt aus Sambrook
et al. (Molecular cloning. A lab manual. (1989)) in E. coli. Die
Nukleotidsequenzen I' und
II' waren zu ihrer
jeweiligen I- und
II-Gegenstücken
identisch und lagen auf dem Vektor in einem hoch definierten 1:1-Verhältnis vor.
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Die
absolute Konzentration der Kontrollen wurde unter Verwendung von
limitierenden Verdünnungsassays
(Sambrook) durchgeführt.
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Amplifikation
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Die
Amplifikation wurde unter Verwendung eines iCycler Thermal cycler
(BioRad, Hercules, Calif., USA) unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Die
Amplifikation wird in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt. Dieses
Instrument erlaubt die Überwachung
der Fluoreszenz in bis zu 4 unterschiedlichen Kanälen. Kurz
gefasst wurde ein Denaturierungszyklus (95°C für 6 min) durchgeführt, gefolgt
von 45 Amplifikationszyklen (94°C
für 30
s, 60°C für 60 s).
Die Amplifikation wurde in einer Mischung durchgeführt, die
aus folgendem bestand: Promega PCR-Puffer 1x (Promega, Madison,
Wis., USA), 3,0 mM MgCl2, 400 pmol Primer
für mtDNA,
0,2 mM dNTP und 2 U Taq-Polymerase (Promega). Gemäß der Erfindung
wurde die Amplifikation für
beide Nukleotidsequenzen I und II in einer einzelnen Vertiefung durchgeführt und
dasselbe gilt für
die Nukleotidsequenzen I' und
II' (für die Bestimmung
der Standardkurven). Die Daten wurden unter Verwendung der Software
des iCyclers analysiert.
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Die
Standardkurven wurden durch Einführung
einer bekannten Kopienzahl von Vektor pro Vertiefung erstellt.
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Die
Amplifikationsexperimente wurden in Triplikat durchgeführt.
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Ergebnisse
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1 zeigt
die Standardkurve für
die Nukleotidsequenz I' und 2 zeigt
die Standardkurve für die
Nukleotidsequenz II',
basierend auf FasL. Bemerke die ausgezeichneten Korrelationskoeffizienten von
0,995 bzw. 0,996, was die ausgezeichnete Genauigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens
anzeigt. Unter Verwendung dieser Kurven wurde die Konzentration
der Nukleotidsequenzen I und II (dargestellt als Quadrate in den 1 und 2)
bestimmt. Da bekannt ist, dass die Nukleotidsequenz für FasL (und
genauer gesagt für
die Sonde für
Nukleotid II/II')
mit zwei Kopien pro Zelle vorliegt, ist die Zahl der Kopien der
Nukleotidsequenz I pro Zelle zweimal so hoch, d.h. 160.
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BEISPIEL 2
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Im
wesentlichen wurde dasselbe Verfahren wie in Beispiel 1 beschrieben
verwendet, außer
dass die Nukleotidsequenz I zu einem Teil der Sequenz des delta-Locus
des T-Zell-Rezeptors korrespondiert. Das Verfahren wurde verwendet,
um die Kopienzahl von TREC pro Zelle zu bestimmen, insbesondere
von peripheren Lymphozyten im Blut in drei Altersgruppen (gesunde
Menschen mit 20, 60 oder 100 Jahren. Die Zahl der Leute war jeweils
16 (10), 17 (10) und 21 (17), wobei die Zahl der Frauen in Klammern
angegeben ist).
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Die
Standardkurven für
die Nukleotidsequenz I' und
II' sind in den 3 bzw.
4 dargestellt. Die folgenden Korrelationskoeffizienten wurden erhalten:
0,999 und 0,998.
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5 zeigt,
dass die Kopienzahl von TREC mit dem Alter abnehmen (Durchschnitt
pro Altersgruppe, dargestellt als horizontale Linie) und zwar von
ungefähr
3,2 auf 0,1 pro 100 Zellen.
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Während für das Verfahren
gemäß der vorliegenden
Erfindung spektrofotometrische Verfahren besonders günstig sind,
im Hinblick auf die Tatsache, dass diese einen simultanen Nachweis
von multiplen Markierungen ermöglichen,
ist es dennoch möglich, eine
Amplifikationsreaktion unter Verwendung irgendeines bekannten Amplifikationsverfahrens durchzuführen, wobei
die dritte Nukleotidsequenz I' und
die vierte Nukleotidsequenz II' auf
einem einzelnen Vektor vorliegen und die Amplifikation von jeweils
I' und II' werden in jeweils
getrennten Behältern durchgeführt, wie
z.B. getrennten Vertiefungen. Die Anmeldung umfasst diese Möglichkeit
ebenfalls. Solche Amplifikationstechniken umfassen, abgesehen von
den oben erwähnten,
CP (Cycling Probe Reaction), bDNA (Branched DNA amplification),
SSR (selbst-gestützte
Sequenz-Replication), SOA (Strang Displacement Amplification), QBR
(Q-Beta Replicase), Re-AMP (Formerly RAMP), NASBA (Nukleinsäuresequenz
Based Amplification), RCR (Reparatur-Kettenreaktion), LCR (Ligase-Kettenreaktion), TAS
(Transorption Based Amplification System), und HCS (vervielfältigte ribosomale
RNA).
