AT503721A1 - Alleldetektion - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen und Quantifizieren von Mikrosatelliten-Alle-len.

Durch die Entdeckung und Entwicklung von polymorphen Short-Tandem-Repeats (STRs) als genetische Marker entstanden in den letzten Jahren große Anreize für eine Weiterentwicklung der Identifizierung und Charakterisierung von durch genetische Defekte verursachten Krankheiten sowie beim forensischen DNA-Ty-ping.

Short-Tandem-Repeats (STRs), auch Mikrosatelliten genannt, sind Tandem-Wiederholungen von DNA-Einheiten, die über das menschliche Genom verteilt sind (siehe z.B. Hohoff et al. (1999) Mol. Biotech. 13:123-136). Die Wiederholungseinheiten bestehen typischerweise aus zwei bis sieben Basenpaaren. In bestimmten Fällen kann die Größe eines STR Hundert Basenpaare betragen, und zwar in Abhängigkeit von der Anzahl an Wiederholungseinheiten.

Die Anzahl an Wiederholungseinheiten variiert bei Individuen.

Die polymorphe Natur von STRs macht es möglich, dass diese in verschiedenen Verfahren einschließlich genetischen Kopplungsstudien (z.B. Vaterschaftstests) , forensischem DNA-Typing und klinischer Diagnostik Verwendung finden. Daher sind STR-Loci äußerst nützliche Marker für die menschliche Identifikation, Va-terschaftstests und Genkartierung. STR-Loci können mittels Nukleinsäure-Amplifikationstechniken wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Anwendung spezifischer Primersequenzen, die in den das Tandem-Repeat flankierenden Regionen identifiziert werden, amplifiziert werden.

Zur Minimierung des Arbeits- und Materialaufwands sowie der Analysezeit ist es wünschenswert, multiple Loci von einer oder mehr Proben durch einen Multiplex-Ansatz gleichzeitig zu analysieren. Solche "Multiplex"-Amplifikationen sind ausführlich in der Literatur beschrieben (z.B. Thiede C, et al. Bone Marrow Transplant (1999) 23: 1055-1060; Pindolia K, et al. Bone Marrow Transplant (1999) 24: 1235-1241; Nollet F, et al. Bone Marrow Transplant (2001) 28: 511-518; Sanchez JJ, et al. Electrophore-sis (2006), PMID:16586411).

Vor allem in der klinischen Diagnostik wird die Identifizierung von Allelen immer wichtiger. Insbesondere stellt die Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen von verwandten oder nicht verwandten Spendern einen zunehmend wichtiger werden-

NACHGEREICHT 2 den Ansatz zur Behandlung von verschiedenen malignen und nicht malignen Erkrankungen dar. Es besteht daher ein wachsender Bedarf an klinischen Diagnosemethodiken, die eine Überwachung von Spender- und Empfänger-abgeleiteter Hämatopoese (= Chimärismus) während der Post-Transplantationsperiode gestatten. Die derzeit verwendeten Techniken sind sehr heterogen, weshalb eine einheitliche Evaluierung und Vergleichung von Diagnoseresultaten zwischen einzelnen Labors schwierig wird. Daher ist die Entwicklung einer standardisierten Diagnosemethodik für den Nachweis und die Überwachung von Chimärismus, des Behandlungsfortschritts und der Risikoevaluierung bei Patienten, die einer allogenen Stammzellentransplantation (SCT) unterzogen werden, von vorrangiger Bedeutung. Solche Methoden sollten jedoch auch auf anderen Gebieten einsetzbar sein, wo eine Bestimmung von Allelen erforderlich ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen und Quantifizieren von in einer Gruppe von Loci vorhandenen Allelen aus mindestens einer Nukleinsäureprobe, umfassend die folgenden Schritte: a) Vorsehen der mindestens einen Probe, b) Unterziehen der Probe einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion unter gleichzeitiger Verwendung von Primer-Paaren, die spezifisch für jeden der Loci einer Gruppe von mindestens drei Loci, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D2S1360, D7S1517, D8S1132, D9S1118, D10S2325, D11S554, D12S1064, D12S391, D17S1290, D19S253, MYCL1, P450CYP19 und SE-33, sind und c) Auswerten der Länge von in Schritt b) erhaltenen Amplifikationsprodukten zur Bestimmung der an jedem der in der Gruppe innerhalb der Probe analysierten Loci vorhandenen Allele.

Gegebenenfalls kann beispielsweise in Posttransplantationsproben durch Auswerten der Menge von einzelnen amplifizierten Allelenfragmenten die relative Quantität von Patienten- und Empfänger-abgeleiteten Zellen in der Probe bestimmt werden. Die Quantifizierung der Amplifikationsprodukte gestattet die Bestimmung der relativen Menge von Zellen verschiedenen Ursprungs mit der Maßgabe, dass die Zellen verschiedene Allele umfassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren bezweckt die Auswahl eines geeigneten Sets von Loci, Primern und Amplifikationsprotokollen zur Generierung von amplifizierten Allelen aus einzelnen oder multiplen koamplifizierten Loci, die vnryngswpisp grnft^nmäßig_

NACHGEREICHT 3 einander nicht überlappen oder, noch bevorzugter, derart markiert sind, dass sie die Unterscheidung zwischen den Allelen verschiedener, einander größenmäßig überlappender Loci gestatten. Darüber hinaus bezweckt dieses Verfahren die Auswahl von Short-Tandem-Repeat-Loci, die zur Verwendung mit einem einzigen Amplifikationsprotokoll kompatibel sind. Die hierin beschriebenen spezifischen Locus-Kombinationen sind bei dieser Anwendung einzigartig. Kombinationen von Loci können aus einem der beiden obigen Gründe oder deswegen abgelehnt werden, weil ein oder mehr Loci in der Kombination keine entsprechende Produktausbeute liefern oder bei dieser Reaktion Fragmente erzeugt werden, die keine authentischen Allele repräsentieren.

Erfolgreiche Kombinationen neben den hierein offenbarten können durch empirische Locus-Kombinationen, durch Auswahl von Primerpaarsequenzen und durch Einstellung von Primerkonzentrationen generiert werden, um ein Gleichgewicht zu finden, bei dem alle enthaltenen Loci amplifiziert werden können. Sind das Verfahren und die Materialien der vorliegenden Erfindung einmal offenbart, drängen sich dem Fachmann wahrscheinlich verschiedene Methoden zur Auswahl von Loci, Primerpaaren und Amplifikationstechniken für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren und Set auf. Es ist beabsichtigt, dass alle diese Verfahren in den. Schutzbereich der vorliegenden Erfindung fallen.

Von besonderer Bedeutung bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Größenordnung von aus den einzelnen Loci erzeugten amplifizierten Allelen, die im Multiplex-Amplifikationsreaktionsschritt koamplifiziert werden. Die ampli-fizierten Fragmente der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise kleiner als 1000, noch bevorzugter kleiner als 500, insbesondere kleiner als 400, Basen.

Es kann jede aus einer Anzahl von verschiedenen Techniken zur Auswahl einer Gruppe von Loci für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung herangezogen werden. Eine bevorzugte Technik zur Entwicklung von nützlichen Sets von Loci für die Verwendung in diesem Analyseverfahren ist nachstehend beschrieben. Eine Strategie zur Auswahl einer geeigneten Kombination von Loci besteht darin, dass anfänglich zwei, vorzugsweise drei, STR-Loci ausgewählt werden. Ist einmal ein Multiplex enthaltend zwei, vorzugsweise drei, STR-Loci entwickelt, dann kann dieser als Kern zur Schaffung von mindestens drei, vorzugsweise mehr als NACHGEREICHT j ······ · ··· • · · · ··· · · · · ···· · · · ·· ·· ·· ·· ··· ···· ·· - 4 - drei, Loci enthaltenden Multiplexen verwendet werden. So können neue Kombination von mindestens drei Loci geschaffen werden, die die ersten zwei, vorzugsweise drei, Loci enthalten.

Es ist beabsichtigt, dass Kernsets von Loci zur Erzeugung anderer geeigneter Derivatsets von STR-Loci für Multiplex-Analy-sen unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden können. Unabhängig davon, welches Verfahren zur Auswahl der unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens analysierten Loci angewendet wird, sind folgende Merkmale allen für die Multiplex-Analyse selektionierten Loci gemeinsam: (1) Sie erzeugen ein für die Auswertung ausreichendes Amplifikationsprodukt; (2) sie generieren, wenn überhaupt, wenige Artefakte aufgrund der Zugabe (oder mangels Zugabe) einer Base zu den amplifizier-ten Allelen während des Multiplex-Amplifikationsschritts; (3) sie generieren, wenn überhaupt, wenige Artefakte aufgrund einer vorzeitigen Beendigung von Amplifikationsreaktionen durch eine Polymerase; und (4) sie erzeugen wenige oder keine Banden aus aufeinander folgenden Einzelbasendeletionen mit einem geringeren Molekulargewicht als ein gegebenes authentisches amplifiziertes Allel.

Erfindungsgemäß können die zu amplifizierenden Loci aus einem Set bestehend aus mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, noch bevorzugter mindestens fünf, am meisten bevorzugt mindestens 10, STR-Marker ausgewählt werden. Die für die Koam-plifikation und Analyse gemäß der Erfindung ausgewählte Gruppe von Loci kann jedoch vorzugsweise weiters mindestens einen Locus zusätzlich zu den mindestens drei STR-Loci umfassen. Daher ist es selbstverständlich möglich, mindestens drei Marker der Liste von Loci gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren mit anderen, aus dem Stand der Technik bekannten Markern zu kombinieren (siehe z.B. Acquaviva C, at al. Leukemia (2003) 17:241-246; Hancock JP, et al. Leukemia (2003) 17:247-251; Kreyenberg H, et al. Leukemia (2003) 17:237-240).

Die anvisierten Loci können im Multiplex-Amplifikations-schritt des vorliegenden Verfahrens koamplifiziert werden. Zur Amplifikation der Loci kann jedes Verfahren aus einer Anzahl von unterschiedlichen Amplifikationsverfahren einschließlich, aber nicht ausschließlich der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Saiki, R. K., et al. (1985), Science 230: 1350-1354), der Amplifikation auf Basis von Transkription (Kwoh, D. Y., and Kwoh, T. J.

NACHGEREIC! iT 5 (1990), American Biotechnology Laboratory, Oktober 1990) und der Amplifikation durch Strangverschiebung (SDA) (Walker, G. T., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A. 89: 392-396) verwendet werden. Vorzugsweise wird die Nukleinsäureprobe einer PCR-Ampli-fikation unter Verwendung von Primerpaaren unterzogen, die spezifisch für jeden Locus in der Gruppe sind.

Wie hierin verwendet, soll "Allel" eine genetische Variation bezeichnen, die mit einem DNA-Segment assoziiert ist, d.h. eine von zwei oder mehr alternativen Formen einer DNA-Sequenz, die denselben Locus einnehmen.

Der Ausdruck "Locus" (oder genetischer Locus) bezieht sich auf eine spezifische Position an einem Chromosom. Allele eines Locus befinden sich an identischen Orten auf homologen Chromosomen.

Wie hierin verwendet, bedeutet "gleichzeitiges Bestimmen", dass die Allele in der Gruppe von mindestens drei Loci unter Verwendung von mindestens drei für diese Loci spezifischen Primerpaaren in derselben Amplifikationsreaktion ("gleichzeitig") bestimmt werden. Solche Reaktionen werden auch "Multiplex"-Reak-tionen genannt (z.B. wenn die Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) "Multiplex-PCR" ist).

Detaillierte Informationen zu den Mikrosatellit-Markern, wie sie in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind auf NCBI Entrez UniSTS und anderen Websites (www.nebi.nlm.nih.qov/entrez/; www♦cstl.nist.qov/biotech/strba-se/; www.qdb.org/; www.ensembl.org/index.html; qai.nci.nih.qov/CHLC/; qenome.ucsc♦edu) verfügbar. Auf diesen Websites finden sich auch geeignete Primerpaare.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht die Gruppe von mindestens drei Loci aus D11S554, D7S1517, D8S1132, D9S1118 und MYCL1; D2S1360, D10S2325, D12S391 und P450CYP19; D11S554, D7S1517 und D8S1132; D11S554, D8S1132 und D9S1118; D11S554, D7S1517 und MYCL1; D11S554, D7S1517, D9S1118 und MYCL1; Dlls554, D8sll32 und MYCL1; Dlls554, D7sl517 und D9slll8;Dls554, MYCL1 und D9slll8; D11S554, D7S1517, D9S1118 und MYCL1; Dlls554, D8sll32, D7S1517 und MYCL1; D11S554, D8S1132,MYCL1 und D9S1118; Dlls554, D8S1132, D7sl517 und D9S1118; D10s2325, P450CYP19 und D2S1360; D10S2325, D12S391 und P450CYP19; D10S2325,D12S391 und D2S1360; D10S2325, D12S391 und D2S1360.

NACHGEREICHT ······ · ··· • · · · ··· · · · · • · · · ····· ·· ·· ·· ··· ···» ·· - 6 -

Oben sind besonders bevorzugte Kombinationen von Loci dargelegt, die im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens nachzuweisen sind. Es ist jedoch klar, dass in der Praxis jede Kombination von mindestens drei hierin offenbarten Loci kombiniert werden kann.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die mindestens eine Nukleinsäureprobe von einem Transplantatempfänger vor und nach Unterziehen des Empfängers einer Transplantation von einem Spender erhalten.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zweckmäßig zur Analyse des Erfolgs, Status und/oder Fortschritts einer Transplantation z.B. von Knochenmark von einem Spender an einen Empfänger verwendet werden. Im Verlauf der Behandlung werden Zellen (z.B. Leukozyten) des Empfängers vorzugsweise durch Zellen des Spenders ersetzt, die in manchen Behandlungsstadien zu einem Chimären Zustand beim Empfänger führen.

Die Analyse von Chimärismus ist zu einem Routineverfahren zur Dokumentation von Engraftments und auch zum Nachweis von Residualerkrankungen geworden. Es wurden häufig auf Nukleinsäureamplifikation basierende Verfahren, bei denen eine STR-Analyse verwendet wird, insbesondere Multiplex-Assays, eingesetzt. Diese Assays wurden jedoch für forensische Zwecke optimiert und erfüllen nicht unbedingt alle Anforderungen für eine Chimärismus-Ana-lyse.

Mikrosatelliten-(STR)-Marker, die aufgrund ihrer hervorragenden Leistungsfähigkeit bei der Chimärismus-Analyse ausgewählt worden sind, wurden sorgfältig ausgewertet und für quantitative Chimärismus-Tests unter standardisierten Versuchsbedingungen optimiert. Die dreizehn hierein offenbarten Marker entsprechen den speziellen Anforderungen einer quantitativen Chimärismus-Analyse auf optimale Weise. Die Fähigkeit des Markerpanels, aussagekräftige Marker zur Überwachung von Chimärismus bereitzustellen, erwies sich als den handelsüblichen Mikrosatellitenpanels für forensische Zwecke überlegen. Neben der hervorragenden Aussagefähigkeit des Markerpanels gestattet der standardisierte Chimärismus-Assay gemäß der vorliegenden Erfindung den empfindlichen Nachweis von Residualzellen jeglichen Ursprungs in einem Bereich zwischen 0,8 und 1,6 % in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle. Darüber hinaus erleichtert das erfindungsgemäße Verfahren die genaue und reproduzierbare

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Quantifizierung von hämatopoietischen Spender- und Empfängerzellen.

Die Erfordernisse für die Wählbarkeit von Mikrosatelliten-Markern zum klinischen Testen von Chimärismus sind bei weitem strenger als jene für forensische Analysen. Die Allelenkonstellationen, die für eine Anwendung bei Chimärismus-Tests in Frage kommen, erfordern nicht nur unterschiedliche Allelenmuster vom Spender und Empfänger, sondern, wie oben ausgeführt, eine Anzahl von zusätzlichen Merkmalen, die für die quantitative Analyse von Allelenverhältnissen relevant sind (siehe Lion T, Leukemia (2003) 17:252-254).

Auf dem Gebeit bekannte Multiplex-Mikrosatelliten-Sets gestatten die gleichzeitige Amplifikation von mehreren STR-Loci, doch die darin enthaltenen Marker liefern für Zwecke der Chimä-rismus-Analyse im Allgemeinen einen Grad an Aussagekraft, der geringer als beim erfindungsgemäßen Markerpanel ist. Die meisten handelsüblichen Sets, z.B. der Powerplex (Promega) des Identifi-ler (ABI), wurden für eine forensische Analyse entwickelt und stellen daher keine vergleichbare Anzahl von für Chimärisumus-Tests in Frage kommende Mikrosatelliten-Markern zur Verfügung.

Im Gegensatz dazu wurde das Markerpanel der vorliegenden Erfindung eingehend auf die Frequenzen von einzelnen Allelen getestet, und es zeigte sich, dass es mindestens zwei aussagekräftige Marker in praktisch jeder Spender-Empfänger-Konstellation liefert. Die Multiplexreaktionen des Markerpanels gestatten daher die Auswahl von mehreren Markern, die sich für eine Verlaufskontrolle von Chimärismus während der Posttransplantationsperiode bestens eignen. Bei der Identifizierung eines oder mehrerer aussagekräftiger Marker in einer gegebenen Spender/Empfänger-Kon-stellation liefert das erfindungsgemäße Markerpanel optimierte Primer und Reaktionsbedingungen für die quantitative Überwachung von Chimärismus in Singleplexreaktionen. Alternativ können Amplifikationsprimer von zwei (oder drei) selektionierten aussagekräftigen Markern in einer Duplex- (oder Triplex-) Reaktion kombiniert und die quantitative Analyse von Chimärismus durch Berechnen des Mittelwerts der Ablesungen für jeden einzelnen in der Reaktion inkludierten Marker durchgeführt werden. Die Möglichkeit der Multiplexierung einer geringen Anzahl von Markern, die auf Basis ihrer Aussagekraft in einer bestimmten Spender/Empfänger-Situation ausgewählt wurden, vereinigt die

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Vorteile der Erzielung eines erweiterten Datensets für die quantitative Analyse in einer Einzelreaktion unter Wahrung eines hohen Sensitivitätsgrads.

Bestehende handelsübliche Multiplex-Tests, die zum Testen von Chimärismus verwendet werden (Biotype, Serac), liefern keine optimierten Primer und Protokolle für Singleplex-PCR-Reaktionen, die die genaue Beurteilung von Chimärismus in Patientenproben erleichtern. Mit diesen Sets können quantitative Chimärismus-Tests nur durch Anwendung der kompletten Multiplexreaktion durchgeführt werden, was nicht denselben Grad an Sensitivität wie Singleplex- (oder beschränkte Oligoplex)-Reaktionen liefert.

Das Markerpanel wurde in einer breit angelegten Versuchsreihe erstellt und evaluiert. Die genaue Auswahl von geeigneten Loci und die optimierte PrimerZusammensetzung der Multiplex- und Singleplex-PCR-Reaktionen gemäß der vorliegenden Erfindung liefern ein einzigartiges System zur zuverlässigen und genauen Untersuchung von Chimärismus in der klinischen Routine.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird mindestens eine weitere Nukleinsäureprobe vom Spender erhalten.

Zur Bestimmung der Anwesenheit von Zellen des Spenders im Empfänger nach der Transplantation können vorzugsweise auch die Allele des Spenders analysiert werden. Dadurch können im Empfänger gefundene Allele eindeutig dem Spender oder, wenn die Transplantation nicht erfolgreich verlaufen ist und der Empfänger nach wie vor eigene Zellen erzeugt, dem Empfänger selbst zugeordnet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden dem Empfänger Spendergewebe, vorzugsweise Knochenmark oder angereicherte hämatopoetische Stammzellen, transplantiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Überwachung der Transplantation eines Spendergewebes, insbesondere von Knochenmark oder hämatopoetischen Stammzellen, in einen Empfänger.

Die ermittelte Länge der durch Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhaltenen Fragmente der mindestens einen Probe des Empfängers nach der Transplantation wird vorzugsweise mit der mindestens einen Probe des Empfängers vor der Transplantation oder mit der mindestens einen Probe des Spenders vergli-

NACHGEREICHT - 9 - - 9 - • · • · · · • • ·· • · • · ··· • • • • · • · · • • • ·· ·· ·· ··· ···· ·· chen.

Die Bestimmung der Länge der durch die Nukleinsäureamplifikation erhaltenen Fragmente ermöglicht die Erstellung eines Allelenprofils der analysierten Probe. Dieses Profil kann dann für Vergleiche mit den anderen Proben herangezogen werden.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe eine Blutprobe oder eine Knochen-markprobe.

Es ist natürlich auch möglich, andere Nukleinsäurequellen wie Gewebe oder Körperflüssigkeiten zu verwenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sperma, Vaginalzellen, Haaren, Knochen, bukkalen Proben, Fruchtwasser enthaltenden Plazentazellen oder Fötuszellen, Chorionzotten und Mischungen von irgendwelchen der oben angeführten Gewebe. Wurde der Empfänger jedoch einer Knochenmarktransplantation unterzogen, wird auf besonders bevorzugte Weise eine Blutprobe zur Verfügung gestellt, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann.

Die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Probe enthält vorzugsweise nukleierte Zellen, insbesondere Leukozyten und/oder Stammzellen.

Ist die Probe eine Blut- oder Knochenmarkprobe, besteht die bevorzugte Nukleinsäurequelle aus Leukozyten. Da Leukozyten im Knochenmark gebildet werden, eignet sich die aus Leukozyten gewonnene Nukleinsäure besonders gut zur Bestimmung von Allelen bei Empfängern von Knochenmarktransplantaten. Die zu analysierenden Leukozyten können gereinigt oder direkt in ihrer natürlichen Matrix (z.B. Blut) verwendet werden. Leukozyten können im erfindungsgemäßen Verfahren direkt ohne Isolieren ihrer Nukleinsäure (z.B. DNA) verwendet werden, oder es wird ihrer Nukleinsäure extrudiert, isoliert und analysiert. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure isoliert und gegebenenfalls mittels auf dem Gebiet bekannter Verfahren angereichert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Leukozyten Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, vorzugsweise NK-Zellen, B-Zellen oder T-Zellen, insbesondere T-Helferzellen, T-Suppressorzellen, insbesondere CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD34, CD38, CD45 und/oder CD56 exprimierende Zellen.

Die Forward- und/oder Reverse-Primer werden vorzugsweise mit

NACHGEREICHT 10 • · · · • · · · ··· ·· • · · · • · · · ·· ·· einem Fluoreszenzmarker markiert.

Zum Nachweis der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Amplifikationsprodukte können die Forward- und/oder Rever-se-Primer mit einer nachweisbaren Markierung konjugiert werden. Diese nachweisbare Markierung ist vorzugsweise eine Fluoreszenzmarkierung (Marker), es ist aber auch möglich, auf dem Gebiet bekannte alternative Markierungen zu verwenden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Fluoreszenzmarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alexa 350, Alexa 430, AMCA, FL, R6G, TMR, TRX,

Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, ROX, TAMRA, TET, Tetra-methylrhodamin und Texas Red.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird am meisten bevorzugt unter Verwendung von Fluoreszenznachweis als Detektionsschritt durchgeführt. Bei diesem bevorzugten Nachweisverfahren haben eines oder beide Primerpaar(e) , die in der Multiplex- oder Single-plex-Amplifikationsreaktion verwendet werden, eine Fluoreszenzmarkierung daran angebracht oder konjugiert, und in der Folge sind die durch die Amplifikationsreaktion erzeugten, amplifizierten Allele fluoreszenzmarkiert. In dieser am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die amplifizierten Allele anschließend abgetrennt, z.B. durch Kapillar-Elektrophorese, und die abgetrennten Allele unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikrobild-Analysators visualisiert und analysiert .

Der Einsatz verschiedener Fluoreszenzmarkierungen ist von besonderem Vorteil, wenn die erhaltenen Amplifikationsprodukte eine ähnliche Länge aufweisen, weil in einem solchen Fall verschiedene amplifizierte Loci nur durch ihre unterschiedlichen Fluoreszenzmerkmale unterschieden werden können.

Die Primerpaare haben vorzugsweise Primersequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2, wenn der zu amplifizierende Locus D2S1360 ist; SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4, wenn der zu ampli-fizierende Locus D7S1517 ist; SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 6, wenn der zu amplifizierende Locus D8S1132 ist; SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 8, wenn der zu amplifizierende Locus D9S1118 ist; SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, wenn der zu amplifizierende Locus D10S2325 ist; SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12, wenn der zu am-

NACHGEREICHT 11 11 • • · · · • • ·· • • · ··· • • • • · · • • • ·· ·· ·· ··· ···· ·· plifizierende Locus D11S554 ist; SEQ ID No. 13 und SEQ ID No. 14, wenn der zu amplifizierende Locus D12S1064 ist; SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16, wenn der zu amplifizierende Locus D12S391 ist; SEQ ID No. 17 und SEQ ID No. 18, wenn der zu amplifizierende Locus D17S1290 ist; SEQ ID No. 19 und SEQ ID No. 20, wenn der zu amplifizierende Locus D19S253 ist; SEQ ID No. 21 und SEQ ID No. 22, wenn der zu amplifizierende Locus MYCL1 ist; SEQ ID No. 23 und SEQ ID No. 24, wenn der zu amplifizierende Locus P450CYP19 ist, und SEQ ID No. 25 und SEQ ID No. 26, wenn der zu amplifizierende Locus SE-33 ist. Es ist natürlich auch möglich, auf dem Gebiet bekannte Primer allein oder in Kombination mit den erfindungsgemäßen Primern zu verwenden.

Primer und Primerpaare werden vorzugsweise zur Verwendung in Multiplexsystemen der Erfindung entwickelt und ausgewählt, indem ein reiterativer Prozess zur Selektion von Primersequenzen verwendet wird, die Primer für die Koamplifikation der selektio-nierten Loci gemischt werden, die Loci koamplifiziert werden, dann die amplifizierten Produkte abgetrennt und nachgewiesen werden. Anfänglich erzeugt dieser Prozess die amplifizierten Allele oft unausgewogen (d.h. mit einer höheren Produktausbeute für einige Loci als für andere) und kann auch Amplifikationsprodukte generieren, die nicht die Allele selbst repräsentieren. Diese Extrafragmente können auf mehrere der oben beschriebenen Ursachen zurückgehen.

Zur Entfernung solcher Extrafragmente aus den Multiplexsystemen werden einzelne Primer aus dem Gesamtset mit Primern aus denselben oder anderen Loci verwendet, um herauszufinden, welche Primer zur Amplifikation der Extrafragmente beitragen. Sobald zwei Primer, die ein oder mehr solcher Fragmente produzieren, identifiziert worden sind, werden einer oder beide der Beitragenden modifiziert und neuerlich getestet, entweder in einem Paar allein oder im Multiplexsystem (oder einem Subset des Multiplexsystems). Dieser Prozess wird wiederholt, bis eine Auswertung der Produkte aplifizierte Allele mit keinem oder einem akzeptablen Ausmaß an Extrafragmenten im Multiplexsystem ergibt.

Die Bestimmung der Primerkonzentration kann entweder vor oder nach der Selektion der endgültigen Primersequenzen vorgenommen werden, erfolgt aber vorzugsweise nach dieser Selektion. Im Allgemeinen führt eine zunehmende Primerkonzentration für einen bestimmten Locus zu einer Erhöhung der für diesen Locus

NACHGEREICHT erzeugten Produktmenge. Dies ist jedoch ebenfalls ein reiterati-ver Prozess, weil eine steigende Ausbeute für einen Locus zu einem Rückgang derselben für einen oder mehrere andere Loci führen kann. Weiters können Primer wechselwirken und so die Ausbeute der anderen Loci direkt beeinträchtigen. Lineare Erhöhungen der Primerkonzentration müssen nicht unbedingt lineare Erhöhungen der Produktausbeute für den entsprechenden Locus mit sich bringen.

Die Ausgewogenheit unter den Loci wird auch durch eine Reihe von Parametern des Amplifikationsprotokolls beeinflusst, wie die verwendete Template-Menge, die Anzahl von Amplifikationszyklen, die Annealingtemperatur des thermischen Zyklusprotokolls und der Einschluss oder Ausschluss eines Extra-Verlängerungsschritts am Ende des Zyklusprozesses. Eine absolute Ausgewogenheit quer über alle Allele und Loci ist im Allgemeinen unerreichbar.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure der Nukleinsäureprobe aus einer Nukleinsäure umfassenden Quelle isoliert.

Nukleinsäure umfassende Proben von einer Nukleinsäurequelle können zur Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung jedes Verfahrens zur Herstellung von Nukleinsäure hergestellt werden, das mit der Amplifikation von Nukleinsäuren, insbesondere von DNA, kompatibel ist. Dem Fachmann sind viele derartige Verfahren bekannt. Beispiele dafür sind unter anderem, aber nicht ausschließlich die DNA-Reinigung durch Phenolextraktion (Sambrook, J., et al. (2001) Molecular Cloning: A La-boratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) und die partielle Reinigung durch Salzfällung (Miller, S. et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:1215) oder Chelex (Walsh et al., (1991) BioTechniques 10:506-513, Comey, et al., (1994) Forensic Sei. 39:1 254) und die Freisetzung von ungereinigtem Material unter Verwendung von unbehandeltem Blut (Burckhardt, J. (1994) PCR Methods and Applications 3:239-243, McCabe, Edward R. B.,(1991) PCR Methods and Applications 1:99-106, Nordvag, Bjorn-Yngvar (1992) BioTechniques 12:4 S. 490-492). Selbstverständlich ist es jedoch auch möglich, eine Probe zu verwenden, bei der die Nukleinsäure aus der Nukleinsäure umfassenden Quelle (z.B. Blut) weder extrahiert noch (hoch) gereinigt ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Er-

NACHGEREICHT 13 findung werden die Längen der Amplifikationsprodukte mittels Elektrophorese, vorzugsweise mittels Gel- oder Kapillar-Elektrophorese, ausgewertet.

Sobald ein Set von amplifizierten Allelen im Multiplex-Am-plifikationsschrit des vorliegenden Verfahrens produziert worden ist, werden die amplifizierten Allele ausgewertet. Der Auswerteschritt dieses Verfahrens kann mit irgendeinem aus einer Anzahl von verschiedenen Mitteln bewerkstelligt werden, von denen die am meisten bevorzugten nach stehend beschrieben sind. Die Länge der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Amplifikationsprodukte kann durch irgendein auf dem Gebiet bekanntes, geeignetes Mittel erfolgen. Ein bevorzugtes Verfahren umfasst jedoch die Elektrophorese, insbesondere Gel- oder Kapillar-Elektrophorese .

Zur Trennung der Produkte der Multiplex-Amplifikations-reaktion wird vorzugsweise die Elektrophorese verwendet, noch bevorzugter die Kapillar-Elektrophorese (siehe z.B. Buel, Eric et al. (1998), Journal of Forensic Sciences; 43: 164-170) oder die denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese (siehe z.B. Sambrook, J. et al. (2001) in Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Die Arbeitsgänge zur Bereitung des Gels und der Elektrophorese sowie die für die Verwendung im Auswerteschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. Die Trennung von amplifizierten DNA-Fragmenten in einem denaturierenden Polyacrylamidgel und bei der Kapillar-Elektrophorese erfolgt in erster Linie auf Basis der Fragmentgröße.

Sobald die amplifizierten Allele abgetrennt sind, können die Allele und jegliche andere DNA im Gel oder in der Kapillare (z.B. DNA-Größenmarker oder eine Allelenleiter) sichtbar gemacht und analysiert werden. Die Sichtbarmachung der DNA im Gel kann durch Verwendung einer der Methoden des Standes der Technik einschließlich Silberfärbung oder von Reportern wie Radioisotopen, Fluoreszenzmarkierungen, Chemilumineszenzmarkierungen und Enzymen in Kombination mit nachweisbaren Substraten erfolgen. Das bevorzugte Verfahren zum Nachweis von Multiplexen, die mindestens drei Loci enthalten, ist jedoch Fluoreszenz (siehe z.B.

Schümm, J. W. et al. in Proceedings from the Eighth International Symposium on Human Identification, (veröffentl. 1998 von Promega Corporation), S. 78-84; Buel, Eric et al. (1998). su-_

NACHGEREIC! iT 14 pra.), wobei auf die Primer für jeden Locus in der Multiplexre-aktion die Detektion der markierten Produkte unter Verwendung eines Fluorometer-Detektors folgt.

Die Fragmente, die die in der Nukleinsäureprobe vorhandenen Allele repräsentieren, werden vorzugsweise durch Vergleichen mit einem Größenstandard wie einem DNA-Marker oder einer Locus-spe-zifischen Allelenleiter zur Bestimmung der an jedem Locus innerhalb der Probe vorhandenen Allele bestimmt. Der am meisten bevorzugte Größenmarker zur Auswertung einer Multiplex-Amplifi-kation enthaltend zwei oder mehr polymorphe STR-Loci besteht aus einer Kombination von Allelenleitern für jeden Locus, der ausgewertet wird. Siehe z.B. Puers, Christoph et al., (1993) Am J.

Hum Genet. 53:953-958, Puers, Christoph, et al. (1994) Genomics 23:260-264. Siehe auch die US 5,599,666; US 5,674,686; und US 5,783,406 zur Beschreibung von zur Verwendung bei der Detektion von STR-Loci geeigneten Allelenleitern und von darin offenbarten Verfahren zur Konstruktion von Leitern.

Im Anschluss an die Konstruktion von Allelenleitern für einzelne Loci können diese gemischt und für die Gel-Elektrophorese zur selben Zeit aufgeladen werden wie die amplifizierten Proben. Jede Allelenleiter komigriert mit Allelen in der Probe vom entsprechenden Locus.

Die Produkte der Multiplexreaktionen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines internen Bahnstandards, einer spezialisierten Art von Größenmarker, der so konfiguriert ist, dass er in derselben Bahn eines Polyacrylamidgels oder in derselben Kapillare läuft, ausgewertet werden. Der interne Bahnstandard besteht vorzugsweise aus einer Reihe von Fragmenten bekannter Länge. Der interne Bahnstandard ist noch bevorzugter mit einer Fluoreszenzfarbe markiert, die sich von anderen Farben in der Amplifikationsreaktion abhebt.

Im Anschluss an die Konstruktion des internen Bahnstandards kann dieser Standard auch mit amplifizierter Probe oder Allelenleitern gemischt und für die Elektrophorese zum Vergleich der Migration in verschiedenen Bahnen bei der Gel-Elektrophorese oder verschiedenen Kapillaren bei der Kapillar-Elektrophorese geladen werden. Eine Abweichung in der Migration des internen Bahnstandards deutet auf eine Abweichung der Leistungsfähigkeit des Trennmediums hin. Die Quantifizierung dieses Unterschieds und Korrelation mit den Allelenleitern gestattet eine Korrektur

NACHGEREICHT 15 bei der Größenbestimmung von Allelen in unbekannten Proben.

Es ist auch möglich, die in einer Probe vorhandenen Allele oder das Allelenprofil durch Verwendung von Mikroarrays (z.B. DNA-Mikroarrays) zu bestimmen. Die Hybridisierung der ampli-fizierten Produkte kann beispielsweise an Mikro- oder Nano-teilchen durchgeführt werden (siehe z.B. Heller MJ, Annu Rev Biomed Eng. 4 (2002):129-153).

Die Loci D11S554, D7S1517, D8S1132, D9S1118 und MYCL1 werden vorzugsweise gleichzeitig in einer ersten Amplifikationsreaktion amplifiziert, und die Loci D2S1360, D10S2325, D12S391 und P450-CYP19 werden vorzugsweise gleichzeitig in einer zweiten Amplifikationsreaktion amplifiziert.

Zur Erzielung von noch besseren Resultaten ist es möglich, mehr als eine (vorzugsweise zwei, noch bevorzugter drei, am meisten bevorzugt fünf) Amplifikationsreaktionen durchzuführen, wobei in jeder dieser Reaktionen mindestens drei Loci ausgewählt aus der Gruppe gemäß der vorliegenden Erfindung amplifiziert werden.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Bestimmung von in einer Gruppe von Loci vorhandenen Allelen aus mindestens einer Nukleinsäureprobe oder zur Bestimmung von Fragmentlängen von Allelen oder zum Nachweis von Chimärismus in einem Transplantatempfänger, umfassend Primerpaare, die jeweils spezifisch für mindestens drei Loci ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D2S1360, D7S1517, D8S1132, D9S1118, D10S2325, D11S554, D12S1064, D12S391, D17S1290, D19S253, MYCL1, P450CYP19 und SE-33 sind.

Das erfindungsgemäße Set, das Primerpaare umfasst, kann zweckmäßig bei jedem Verfahren eingesetzt werden, bei dem die Bestimmung von Allelen in einer Probe erforderlich ist. Beispielsweise kann dieses Set zum Nachweis und zur Quantifizierung von Chimärismus in einem Individuum, für Vaterschaftstests, forensische Analysen etc. verwendet werden. Das Set kann weiters Allelenleitern (siehe z.B. US 5,599,666), auf jeden der spezifizierten Loci gerichtete Allelenleitern, positive Kontrollen, Puffer etc. umfassen.

Die Forward- und/oder Reverse-Primer sind vorzugsweise markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzmarker markiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Fluoreszenzmarker ausgewählt aus der Gruppe be-

NACHGEREICHT 16 stehend aus Alexa 350, Alexa 430, FL, R6G, TMR, TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamin und Texas Red.

Die Primerpaare haben vorzugsweise Primersequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2, wenn der zu amplifizierende Locus D2S1360 ist; SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4, wenn der zu amplifi-zierende Locus D7S1517 ist; SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 6, wenn der zu amplifizierende Locus D8S1132 ist; SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 8, wenn der zu amplifizierende Locus D9S1118 ist; SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, wenn der zu amplifizierende Locus D10S2325 ist; SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12, wenn der zu amplif izierende Locus D11S554 ist; SEQ ID No. 13 und SEQ ID No. 14, wenn der zu amplifizierende Locus D12S1064 ist; SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16, wenn der zu amplifizierende Locus D12S391 ist; SEQ ID No. 17 und SEQ ID No. 18, wenn der zu amplifizierende Locus D17S1290 ist; SEQ ID No. 19 und SEQ ID No. 20, wenn der zu amplifizierende Locus D19S253 ist; SEQ ID No. 21 und SEQ ID No. 22, wenn der zu amplifizierende Locus MYCL1 ist; SEQ ID No. 23 und SEQ ID No. 24, wenn der zu amplifizierende Locus P450-CYP19 ist, und SEQ ID No. 25 und SEQ ID No. 26, wenn der zu amplif izierende Locus SE-33 ist.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Chimärismus bei einem Transplantatempfänger.

Lawler et al. (Blood 1991; 77:2504-2514) waren die ersten, die über den Einsatz von PCR zur Amplifikation von hoch polymorphen STR-Sequenzen auf dem Gebiet der Chimärismus-Analyse berichteten, und seither wurde von zahlreichen auf einer variierenden Anzahl von Tandem-Repeat-(VNTR) oder STR-Markern basierende Assays berichtet. Insbesondere wurde die Multiplex-Amplifikation von STR-Markern mit Fluoreszenznachweis beschrieben, da mit einem derartigen Ansatz die rasche Identifikation von aussagekräftigen Markern und auch die Berechnung von Mittelwerten möglich ist, wodurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Resultate verbessert werden. Die meisten bekannten Multiplex-STR-Systeme sind für forensische Zwecke konzipiert, werden jedoch häufig für Chimärismus-Analysen verwendet. Auch wenn eine forensische Analyse einen hohen Grad an Aussagekraft

NACHGEREICHT 17 und Standardisierung hinsichtlich ihres Zwecks, Individuen eindeutig zu identifizieren, erfordert, ist die Verwendung dieser Multiplex-STR-Systeme bei der Bestimmung von Chimärismus nicht unbedingt zweckmäßig. Bei forensischen Analysen besteht das Hauptziel in der Identifikation von Individuen. Es ist somit wichtig, ein STR-Profil zu erhalten, das eine unzweifelhafte Identifikation eines Verdächtigen oder einer unbekannten Person gestattet. Da die Identifikation weitgehend auf Datenbank-Recherchen beruht, wird die Auswahl von geeigneten STR-Markern durch die Tatsache beeinflusst, dass in großen forensischen Datenbanken wie dem Combined DNA Index System (CODIS) nur ausgewählte STR-Systeme vertreten sind. Die in diesen Datenbanken enthaltenen STR-Systeme wurden auf der Grundlage von internationalen Übereinkommen und Standards ausgewählt, die nicht unbedingt auf einer maximalen Aussagekraft beruhen. Bei der Chimärismus-Analyse wird im Wesentlichen von etwas ganz Anderem ausgegangen. Auch wenn die Unterscheidung von Individuen klarerweise genauso wichtig ist, sind die Anforderungen andere, da die involvierten Individuen (Spender und Empfänger) bekannt sind. Somit besteht ein bedeutendes Kriterium bei der Auswahl eines aussagekräftigen Markers nicht im Unterschied an sich, sondern in der Fähigkeit, auch geringe Mengen von Residualzellen in der Mischung zu identifizieren. Diesbezüglich liegt ein anderer kritischer Aspekt der STR-Analyse für eine Chimärismus-Analyse in der Anwesenheit von zusätzlichen Signalen (so genannten Stotter-Peaks). Man glaubt, dass diese Artefakte auf eine Fehlpaarung durch "Umklappen" des Strangs während der Amplifikation zurückzuführen sind. Die Intensität der Stottersignale liegt üblicherweise bei etwa 2-10 % des entsprechenden STR-Allels. Von einer hohen Rate an Stotter-Peaks wurde für lange, einfache Wiederholungsläufe berichtet, wohingegen die Anwesenheit von mangelhaften Repeats und die Verwendung von DNA-Polymerasen mit gesteigerter Prozessivität die Bildung solcher Peaks reduziert. Wenn Stottersignale vorhanden sind und gemeinsam mit den entsprechenden STR-Allelen des Empfängers oder Spenders eluieren, behindern sie eine exakte Quantifizierung. Das ist von besonderer Bedeutung bei geringen Gehalten an Residual-Wirtszellen und macht den Nachweis eines minimalen Residual-Chimärismus (der z.B. eine Residual-Krankheit widerspiegelt) praktisch unmöglich. Ein optimales STR-System für eine Chimärismus-Analyse muss daher

17NACHGEREICHT 18 eindeutige Signale für den Spender und den Empfänger haben, die von keinen Stottersignalen oder anderen die quantitative Analyse von Chimärismus beeinträchtigenden Merkmalen beeinflusst werden (Watzinger et al., Leukemia 2006). Insgesamt zeigen die Anforderungen auf dem Gebiet der Chimärismus-Analyse und der forensischen Diagnostik naheliegende und bedeutende Unterschiede, die bei der Optimierung von Chimärismus-Tests zu berücksichtigen sind.

Das Markerpanel der vorliegenden Erfindung wurde auch im Vergleich zu einem handelsüblichen Multiplex-Mikrosatelliten-Set für forensische Zwecke (PowerPlexl6; Promega; Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818) evaluiert. Dieses Set hat eine Markerzusammensetzung sehr ähnlich anderen handelsüblichen Produkten wie von der Firma Promega und anderen Firmen. Basierend auf den erzielten Ergebnissen erwies sich das erfindungsgemäße Markerpanel aufgrund der strengen Anforderungen für Chimärismus-Analysen hinsichtlich Aussagekraft als dem handelsüblichen Set weit überlegen (siehe Beispiele).

Ein anderer Aspekt der vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens für den Nachweis oder die quantitative Analyse von Chimärismus bei einem Transplantatempfänger unter Verwendung eines oder mehrerer Marker (d.h. durch Durchführung von Singleplex- oder Multiplex-reaktionen).

Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bewertung des Risikos einer Abstoßung oder eines Rückfalls eines Individuums, an dem eine Transplantation durchgeführt wurde.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Bewertung des Risikos einer Transplantatabstoßung oder Wiedererkrankung bei einem Empfänger eines Transplantats, insbesondere eines Knochenmarktransplantats oder einer Transplantation von hämato-poetischen Stammzellen, verwendet werden. Insbesondere gestattet das Verfahren die Überwachung der Allele der Leukozyten oder anderen nukleierten Zellen bei diesem Individuum vor und nach der Transplantation und die Überwachung des Allelenprofils des Empfängers in Bezug auf das Profil des Spenders über die Zeit. Eine Abstoßung oder ein Rückfall kann nachgewiesen werden, wenn das Allelenprofil von spezifischen Empfängerzellen nach der Trans-

NACHGEREICHT ♦ ·· ··♦♦ ·· -Implantation in das Profil vor der Transplantation zurückfällt.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Überwachung eines erfolgreichen Engraftments oder des Fortschritts der Heilung eines Individuums, an dem eine Transplantation durchgeführt wurde.

Ein Vaterschaftstest kann ebenfalls vorgenommen werden, indem das Allelenprofil eines ersten Individuums bestimmt und dieses Profil mit dem Profil eines zweiten Individuums verglichen wird, von dem man annimmt, dass es mit dem ersten Individuum verwandt ist.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens für Vaterschaftstests .

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für Vaterschaftstests.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens für genetische Fingerabdrücke.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Erstellung eines Allelenprofils (genetischen Fingerabdrucks) eines Individuums nützlich sein. Der erhaltene genetische Fingerabdruck kann für eine Vergleichsanalyse wie eine forensische Analyse oder zum Zurückverfolgen des Urspungs von menschlichen Proben unbekannter oder unsicherer Quelle herangezogen werden.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren näher erläutert, ohne dabei auf diese eingeschränkt zu sein.

Die Fig. la und lb zeigen einen Vergleich der Höhe der Aussagekraft des kompletten Sets von Chimärismus-Markern (13 Marker) gemäß der vorliegenden Erfindung (Fig. 1) bzw. eines PowerPlex-16-Sets (Fig. lb; Promega US; gestattet die gleichzeitige Amplifikation von Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vWA, Amelogenin, Penta D, CSF1P0, D16S539, D7S820, D13S317 und D5S818). Insgesamt ist zu erwarten, dass das erfindungsgemäße Markerpanel über mindestens einen entsprechenden Marker für eine quantitative Chimärismus-Analyse in >99 % und zwei oder mehr entsprechende Marker in 91% von verwandten Spender/Empfänger-Paaren verfügt. Dieses Niveau an Aussagekraft ist mit dem PowerPlex-16-Set (Fig. lb) nicht

NACHGEREICHT 20 erzielbar.

Fig. 2 zeigt die Fähigkeit des Markerpanels bei der Bestimmung von quantitativen Unterschieden in einer Serie von klinischen Proben. Es ist ersichtlich, dass die intrinsische Variabilität des Assays in der überwiegenden Zahl der Fälle nur +2% ausmacht.

Fig. 3 zeigt ein Beispiel für Empfänger- und Spender-Genoty-pisieren unter Verwendung der Multiplexgruppe 1. Die obere Bahn zeigt die Marker D9S1118, MYCL1 (Empfänger heterozygot, Spender homozygot), die mittlere Bahn D7S1517 (Empfänger homozygot, Spender heterozygot), und die untere Bahn D11S554 (Spender und Empfänger heterozygot) sowie D8S1132 (Spender und Empfänger heterozygot, teilen sich ein Allel).

Fig. 4 zeigt ein Beispiel für Empfänger- und Spender-Genoty-pisieren unter Verwendung der Multiplexgruppe 2. Die obere Bahn zeigt die Marker D10S2325 (Spender und Empfänger heterozygot), D12S391 (Spender und Empfänger heterozygot) und P450CYP19 (Empfänger heterozygot, Spender homozygot), und die untere Bahn D2S1360 (Empfänger heterozygot, Spender homozygot). BEISPIELE: BEISPIEL 1: Mikrosatelliten-Markerpanel und PCR-Amplifika-tionsbedingungen

Das Panel von Mikrosatelliten-Markern, die Sequenzen von Forward- und Reverse-Primern, die am 5'-Ende jedes Forward-Primers angebrachte Fluoreszenzmarkierung und das Spektrum von möglichen PCR-Produkten sind in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1:

NACHGEREICHT

Marker Markie rung Länge der PCR-Produkte SEQ ID Mo. D2S1360 FW CTGCATTAAAACATTCGAAACCAA JOE 233-273 1 REV GCAGCAGATTGTGGGACTTCTCA 2 D7S1517 FW AGCCTGATCATTACCAGGT JOE 164-212 3 REV GTTTCTATTGGGGCCATCTTGC 4 D8S1132 FW TCTCTCTCTCCCTCTCTCTTTCGAG TMR 347-379 5 REV GTTTGCCATCTTCTTACCTCTGTTGGTC 6 D9S1118 FW CAGGATATTATGTGATGGAATCC FL 92-128 7 REV GATCTCTTCTCTCTCTCTCTTTCTCCC 8 21 21 • · • · · · • ♦ ·· • · • · ·♦· • · · • · • · ♦ • · · ♦ · ·· t« ··· ···· ··

Marker Markie rung Länge der PCR-Produkte SEQ ID No. D10S2325 FW TATGGTGACCTTAAGCAGCCATG FL 163-213 9 REV GTGTCTTAGCTGAGAGATCACGCACTGC 10 D11S554 FW GGTAGCAGAGCAAGACTGTC TMR 166-246 11 REV GTTTCACCTTCATCCTAAGGCAGC 176-335(GEN) 12 D12S1064 FW ACTACTCCAAGGTTCCAGCC TMR 114-142 13 REV ACTGTTATCTCTCTTGTGGTAG 14 D12S391 FW ATCAACAGGATCAATGGATGCAT FL 237-269 15 REV GGGCTTTTAGACCTGGACTGAG 16 D17S1290 FW CCAACAGAGCAAGACTGTC FL 169-205 17 REV GTTTGAAACAGTTAAATGGCCAAAG 18 D19S253 FW ATAGACAGACAGACGGACTG TMR 239-274 19 REV GTTTGGGAGTGGAGATTACCCCT 20 MYCL1 FW AACCGTAGCCTGGCGAGACT FL 156-225 21 REV GTTTCCTTTTAAGCTGCAACAATTTC 22 P450CYP19 FW GTTCCACATAATGAAGCACAATC FL 314-464 23 REV GTTTAATCGCCTGAGTCCTGGGA 24 SE-33 FW AATCTGGGCGACAAGAGTGA TMR 138-300 25 REV ACATCTCCCCTACCGCTATA 26

In den Tabellen 2A und 2B ist das PCR-Reaktions-Setup dargelegt.

Tabelle 2A: Setup für 1 PCR-Reaktion (Primerkonzentrationen) STR-Marker Primerkonzentration* (pmol/nl) D2S1360 2 D7S1517 4 D8S1132 2 D9S1118 ★ D10S2325 2 D11S554 2 D12S1064 4 D12S391 4 D17S1290 2 D19S253 4 MYCL1 4 P450CYP19 6 SE33 4 * D9S1118 asymmetrische PCR: Fw-Primer 8 pmol/μΐ und Rev-Primer 2 pmol/μΐ

Tabelle 2B: Setup für 1 PCR-Reaktion (Vormischung)

NACHGEREICHT PCR-Puffer II (ohne MgCl2) 2,5 μΐ dNTP's (lOmM) 1 μΐ MgCl2 (25mM) 2 μΐ 5'-Primer (2-8 pmol/μΐ)* 1 μΐ 3'-Primer (2-6 pmol/μΐ)* 1 μΐ laq Gold (5 ϋ/μΐ) 0,2 μΐ H20 16,3 μΐ DNA (10 ng) ΐμΐ Gesamtvolumen 25 μΐ

Es wurden folgende Zyklusbedingungen beim Zyklusprozess (Ge-neAmp PCR-System 9600 Thermal Cycler) angewendet: 95°C 11 min 96°C 1 min

Rampe 100 % bis 94°C 30 s Rampe 29 % bis 60°C 30 s Rampe 23 % bis 70°C 45 s 10 Zyklen Rampe 100 % bis 90°C 30 s Rampe 29 % bis 60 °C 30 s Rampe 23 % bis 70°C 45 s 20 Zyklen 60°C 30 min 4°C Haltezeit

Beispiel 2: PCR-Produktanalyse durch Kapillar-Elektrophorese und Nachweis auf Fluoreszenzbasis 1 μΐ PCR-Produkt wurde mit 24 μΐ HiDi-Formamid (Applied Biosystems) und 1 μΐ des ILS-600-Längenstandards (Promega) gemischt. Nach der Denaturierung bei 95°C während 3 min wurde die Lösung auf das Kapillar-Elektrophoreseinstrument (z.B. ABI3100)

NACHGEREICHT ·· • · • • ·· • ♦ • • · · • ·· ·· ·» • · · · · · · • · · · · · • · · · ·#· • · · · · ·· ·· ·· · - 23 - geladen. Im Anschluss an die Installation der entsprechenden Matrix wurde die Analyse unter Verwendung von Standardbedingungen durchgeführt. Die Injektionsparameter (Spannung und Injektionszeit) wurden so eingestellt, dass Peakhöhen um etwa 5000 RFU oder darüber erzielt wurden.

Beispiel 3: Nachweisgrenze und quantitative Beurteilung von Patienten-Spender-Chimärismus

Die Empfindlichkeit von einzelnen Markern aus dem Markerpanel der vorliegenden Erfindung (siehe Beispiel 1) zum Nachweis geringer Mengen von Empfängerzellen gegen einen Hintergrund von Spenderzellen wurde getestet wie nachstehend beschrieben. Außerdem wurden die Fähigkeit von einzelnen Markern, Änderungen im Verhältnis von Empfängerzellen aufzudecken, und ihre Eignung für die quantitative Analyse von Chimärismus ausführlich untersucht.

Zur Bestimmung der Leistungsfähigkeit der Marker bei der quantitativen Überwachung von Chimärismus wurden Serienverdünnungen enthaltend unterschiedliche Anteile von Empfänger-Zellmaterial analysiert. Es wurde die Fähigkeit jedes Markersystems, Veränderungen im Spender/Empfänger-Zellverhältnis nachzuweisen, ermittelt. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit der quantitativen Analyse und die Abweichung des Tests von Labor zu Labor unter einheitlichen Versuchsbedingungen wurden bewertet. Serienverdünnungen von Empfänger- in Spender-DNA wurden zentral hergestellt und von den einzelnen Labors untersucht.

Die maximale Empfindlichkeit (d.h. Nachweisgrenze) lag meist unter 1,6 % (Tabelle 3). Die 1 und 10 ng DNA-Template enthaltenden Proben zeigten eine ähnliche Empfindlichkeit, aber die Robustheit des Assays war besser mit der höheren Template-Menge, wie anhand der Reproduzierbarkeit von einzelnen PCR-Reaktionen festgestellt wurde. Die beobachteten Nachweisgrenzen waren aus Sicht der klinischen Anwendung zufriedenstellend, und das Panel erwies sich als Lieferant eines robusten Systems für die quantitative Analyse von Chimärismus.

Tabelle 3: Chimärismus-Marker und Nachweisgrenzen

Marker Machvei sqrenze Frequenz 0. 78 1.56 3.13 6.25 Gesamt 1 11 4 1 0 16 2 11 3 0 0 14 3 11 2 3 0 16 4 4 9 2 1 16

NACHGEREICHT • · 24 • · «Μ ···♦ ·· • ·

Marker Nachweisgrenze 5 10 5 1 0 16 6 15 7 2 0 24 7 21 2 1 0 24 8 9 4 3 0 16 9 8 0 0 0 8 10 16 0 0 0 16 11 6 7 7 2 22 12 7 6 3 0 16 13 16 0 0 0 16 Total 145 49 23 3 220

Wie in Tabelle 3 gezeigt, lag die Nachweisgrenze (DL) für die dreizehn Marker des Markerpanels zwischen 0,8 und 1,6 % bei 88 % der untersuchten Proben.

Beispiel 4: Dynamischer Bereich und intrinsische Variabilität des Assays

Der dynamische Bereich des Markerpanels für die quantitative Beurteilung von Chimärismus liegt zwischen 1 und 100 %. Die Genauigkeit bei der Bestimmung der Quantität der Subdominanten Zellpopulation ist höher im Bereich von 10 bis 100 % Spenderoder Empfänger-abgeleiteten Zellen, während der Prozentanteil der Subdominanten Zellpopulation innerhalb des Bereichs von 1 bis 10 % tendenziell überschätzt wird. Die Fähigkeit des Markerpanels, quantitative Unterschiede zwischen klinischen Serienproben festzustellen, ist in Fig. 2 gezeigt, aus der ersichtlich ist, dass die intrinsische Variabilität des Assays bei der überwiegenden Mehrheit der Fälle nur +2 % beträgt.

Beispiel 5: Multiplexreaktionen

Zur Erleichterung der Patienten/Spender-Genotypisierung wurden Multiplex-Assays erstellt, mit denen eine Koamplifikation verschiedener Chimärismus-Marker in ein- und derselben PCR-Reak-tion möglich ist. Die Zusammensetzung der erstellten Multiplexreaktionen und die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung von mindestens zwei aussagekräftigen STR-Markern in einer gegebenen Patienten/Spender-Situation (in einer und in zwei Richtungen; ein oder zwei Repeat-Einheiten auseinander) sind in den Tabellen 4 und 5 gezeigt. Beispiele für Genotypisieren mit der Multiplex-Gruppe 1 und 2 sind in den Fig. 3 und 4 veranschaulicht .

Tabelle 4: STR-Markerzusammensetzung von Multiplexreaktionen

NACHGEREICHT 25 25 Multiplex 1 Multiplex 2 D11S554 P-450CYP19 D8S1132 D12S391 D9S1118 D2S1360 Mycl-1 D10S2325 D7S1517

Tabelle 5: Es sind die zum 5'-Markieren der jeweiligen Forward-Primer verwendeten Farben angegeben. Dabei ist der Bereich von Allelengrößen (in Basenpaaren) gezeigt, die bei der Population auftreten. Es gibt keine Überlappung von Allelenpositionen zwischen Markern, die mit derselben Farbe markiert sind, wodurch eine klare Zuordnung von Empfänger- und SpenderAllelen in den mit einzelnen Markern untersuchten DNA-Proben möglich ist.

Gruppe 1 FL (blau) JOE (grün) TMR (gelb) D9S1118 92-128 MYCL1 156-225 D7S1517 164-212 D11S554 166-246 D8S1132 347-379 Gruppe 2 FL (blau) JOE (grün) TMR (gelb) D10S2325 163-213 D12S391 220-269 P450CYP19 304-454 D2S1360 213-253

Beispiel 6: PCR-Reaktions-Setup der Multiplex-Assays Die PCR-Reaktionen werden vorzugsweise in einem Gesamtvolumen von 50 μΐ enthaltend 47 μΐ Vormischung (siehe Tabelle 6) , 2 μΐ Polymerase (vorzugsweise TaqGold) und 1 μΐ DNA (bevorzugte Konzentration: 10 ng/μΐ) angesetzt. Die Amplifikation erfolgt unter Verwendung desselben PCR-Profils wie für die Singleplex-Reaktionen.

Tabelle 6:

NACHGEREICHT

Vormischuna für 1 Reaktion f.GruDDe 1 enthält: Vormischuna für 1 Reaktion f.GruDDe i l enthält: 10x PCR-Puffer (ABI) 5,0 μ PE-Puffer 5,0 μ dNTP's (10mM) 4,0 μ dNTP’s (10mM) 4,0 μ MgCI2 (25mM) 4,0 μ VlgCI2 (25mM) 4,0 μ 5-D9S1118 (32 pmol/μ!) 1.0 μ 5-D10S2325 (18 pmol/μΙ) 1,0 μ 26 26 5'-D9S1118 (8 pmol/μΙ) 1,0 μ 3-D10S2325 (18 pmol/μΙ) 1,0 μ 5-MYCL1 (12 pmol/μΙ) 1,0 μ 5-D12S391 (24 pmol/μΙ) 1.0 μ 3-MYCL1 (12 pmol/μΙ) 1,0 μΙ 3-D12S391 (24 pmol/μΙ) 1,0 μΙ 5-D7S1517 (10 pmol/μΙ) 1,0 μ 5'-P450CYP19 (40 pmol/μΙ) 1,0 μ 3’-D7S1517 (10 pmol/μΙ) 1,0 μ . 3-P450CYP19 (40 pmol/μΙ) 1,0 μ 5'-D11S554 (20 pmol/μΙ) 1,0 μ 5'-D2S1360 (40 pmol/μΙ) 1,0 μ 3-D11S554 (20 pmol/μΙ) 1,0 μ 3-D2S1360 (40 pmol/μΙ) 1,0 μ 5-D8S1132 (20 pmol/μΙ) 1,0 μ 3-D8S1132 (20 pmol/μΙ) 1,0 μ H20 24,0 μ Η20 26,0 μΙ Gesamtvolumen 47,0 μ! Gesamtvolumen 47,0 μΙ

Der hohe Grad an Aussagekraft der EUC-Marker, d.h. die Fähigkeit, einen oder mehr Mikrosatelliten-Marker bereitzustellen, die für klinische Chimärismus-Tests in einer Spender-Empfänger-Konstellation in Frage kommen, da sie die vom Eurochimärismus-Konsortium (Watzinger et al., Leukemia 2006) aufgestellten strengen Kriterien erfüllen, ist in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7:

NACHGEREICHT direkt in 1 Richtun« 1 Repeal I 2 Repeats direkt n 2 Richtung 1 Repeat en 2 Repeats Multiplex 1 0,999977 0,997232 0,979695 0,999874 0,976533 0,845469 Multiplex 2 0,997202 0,967625 0,889619 0,990358 0,862584 0,575807 Multiplex 1 + 2 1,000000 0,999992 0,999631 1,000000 0,999445 0,977175 Multiplex 1 + 2 + restliche Marker 1,000000 1,000000 0,999997 1,000000 0,999994 0,998392

Claims (25)

1. 27 Patentansprüche: 1. Verfahren zum gleichzeitigen Bestimmen von in einer Gruppe von Loci vorhandenen Allelen aus mindestens einer Nukleinsäureprobe, umfassend die folgenden Schritte: a) Vorsehen der mindestens einen Probe, b) Unterziehen der Probe einer Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion unter gleichzeitiger Verwendung von Primer-Paaren, die spezifisch und optimiert für jeden der Loci einer Gruppe von mindestens drei Loci, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D2S1360, D7S1517, D8S1132, D9S1118, D10S2325, D11S554, D12S1064, D12S391, D17S1290, D19S253, MYCL1, P450CYP19 und SE-33, sind und c) Auswerten der Länge von in Schritt b) erhaltenen Amplifikationsprodukten zur Bestimmung der an jedem der in der Gruppe innerhalb der Probe analysierten Loci vorhandenen Allele.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Gruppe von mindestens drei Loci aus D11S554, D7S1517, D8S1132, D9S1118 und MYCL1; D2S13j80, D10S2325, D12S391 und P450CYP19; D11S554, D7S1517 und D&SH32; D11S554, D8S1132 und D9S1118; D11S554, D7S1517 und MYCL1; D11S554, D7S1517, D9S1118 und MYCL1; Dlls554, D8sll32 und MYCL1; Dlls554, D7sl517 und D9slll8;Dls554, MYCL1 und D9slll8; D11S554, D7S1517, D9S1118 und MYCL1; Dlls554, D8sll32, D7S1517 und MYCL1; D11S554, D8S1132,MYCL1 und D9S1118; Dlls554, D8S1132, D7sl517 und D9S1118; Dl0s2325, P450CYP19 und D2S1360; D10S2325, D12S391 und P450CYP19; D10S2325,D12S391 und D2S1360; D10S2325, D12S391 und D2S1360 besteht.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Nukleinsäureprobe von einem Transplantatempfänger vor und nach Unterziehen des Empfängers einer Transplantation von einem Spender erhalten wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eine weitere Nukleinsäureprobe vom Spender erhalten wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass dem Empfänger Spendergewebe, vorzugsweise Knochenmark oder hämatopoetische Stammzellen, transplantiert werden. NACHGEREICHT 28
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die ermittelte Länge der durch Schritt b) erhaltenen Fragmente der mindestens einen Probe des Empfängers nach der Transplantation mit der mindestens einen Probe des Empfängers vor der Transplantation oder mit der mindestens einen Probe des Spenders verglichen wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die relative Menge von Spender- und Empfänger-abgeleiteten Zellen in der Probe durch Quantifizierung der Amplifikationsprodukte bestimmt wird.
8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Blutprobe oder eine Knochenmarkprobe ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Probe nukleierte Zellen, insbesondere Leukozyten und/oder Stammzellen, enthält.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Leukozyten Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, vorzugsweise NK-Zellen, B-Zellen oder T-Zellen, insbesondere T-Helferzellen, T-Suppressorzellen, insbesondere CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD19, CD34, CD38, CD45 und/oder CD56 exprimierende Zellen, sind.
11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Forward- und/oder Reverse-Primer markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzmarker markiert, werden.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alexa 350, Alexa 430, AMCA, FL, R6G, TMR, TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamin und Texas Red.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekenn- NACHGEREICHT 29 • ·· · ♦ · ·· ♦ · · ♦ ······ · · ·· • · · · ·♦· · · · · ···· · · · ·· ·· »9 ♦· ··· ···· #9 zeichnet, dass die Primerpaare Primersequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2, wenn der zu amplifizierende Locus D2S1360 ist; SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4, wenn der zu amplifizierende Locus D7S1517 ist; SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 6, wenn der zu amplifizierende Locus D8S1132 ist; SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 8, wenn der zu amplifizierende Locus D9S1118 ist; SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, wenn der zu amplifizierende Locus D10S2325 ist; SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12, wenn der zu amplifizierende Locus D11S554 ist; SEQ ID No. 13 und SEQ ID No. 14, wenn der zu amplifizierende Locus D12S1064 ist; SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16, wenn der zu amplifizierende Locus D12S391 ist; SEQ ID No. 17 und SEQ ID No. 18, wenn der zu amplifizierende Locus D17S1290 ist; SEQ ID No. 19 und SEQ ID No. 20, wenn der zu amplifizierende Locus D19S253 ist; SEQ ID No. 21 und SEQ ID No. 22, wenn der zu amplifizierende Locus MYCL1 ist; SEQ ID No. 23 und SEQ ID No. 24, wenn der zu amplifizierende Locus P450CYP19 ist, und SEQ ID No. 25 und SEQ ID No. 26, wenn der zu amplifizierende Locus SE-33 ist, aufweisen.
14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure der Nukleinsäureprobe aus einer Nukleinsäure umfassenden Quelle isoliert wird.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Längen der Amplifikationsprodukte mittels Elektrophorese, vorzugsweise mittels Gel- oder Kapillar-Elektrophorese, ausgewertet werden.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Loci D11S554, D7S1517, D8S1132, D9S1118 und MYCL1 gleichzeitig in einer ersten Amplifikationsreaktion am-plifiziert und die Loci D2S1360, D10S2325, D12S391 und P450CYP19 gleichzeitig in einer zweiten Amplifikationsreaktion amplifi-ziert werden. Primerpaare, ausgewählt aus NACHGEREICHT -mr
17. 17. Set zur Bestimmung von in einer Gruppe von Loci vorhandenen Allelen aus mindestens einer Nukleinsäureprobe oder zur Bestimmung von Fragmentlängen von Allelen oder zum Nachweis von Chimä-rismus in einem Transplantatempfänger, umfassend die jeweils spezifisch für mindestens drei Loci • ·· ·· ···· · · · ······ · ··· • · · ···· · ·· · ···· · · · ·· Μ ·· ·· ··· ···· ·· - 30 - der Gruppe bestehend aus D2S1360, D7S1517, D8S1132, D9S1118, D10S2325, D11S554, D12S1064, D12S391, D17S1290, D19S253, MYCLl, P450CYP19 und SE-33 sind.
18. 18. Set nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Forward- und/oder Reverse-Primer markiert, vorzugsweise mit einem Fluoreszenzmarker markiert, sind.
19. 19. Set nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluoreszenzmarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alexa 350, Alexa 430, FL, R6G, TMR, TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamin und Texas Red.
20. 20. Set nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Primerpaare Primersequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2, wenn der zu amplifizierende Locus D2S1360 ist; SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4, wenn der zu amplif izierende Locus D7S1517 ist; SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 6, wenn der zu ampli-fizierende Locus D8S1132 ist; SEQ ID No. 7 und SEQ ID No. 8, wenn der zu amplifizierende Locus D9S1118 ist; SEQ ID No. 9 und SEQ ID No. 10, wenn der zu amplifizierende Locus D10S2325 ist; SEQ ID No. 11 und SEQ ID No. 12, wenn der zu amplifizierende Locus D11S554 ist; SEQ ID No. 13 und SEQ ID No. 14, wenn der zu amplifizierende Locus D12S1064 ist; SEQ ID No. 15 und SEQ ID No. 16, wenn der zu amplifizierende Locus D12S391 ist; SEQ ID No. 17 und SEQ ID No. 18, wenn der zu amplifizierende Locus D17S1290 ist; SEQ ID No. 19 und SEQ ID No. 20, wenn der zu amplifizierende Locus D19S253 ist; SEQ ID No. 21 und SEQ ID No. 22, wenn der zu amplifizierende Locus MYCLl ist; SEQ ID No. 23 und SEQ ID No. 24, wenn der zu amplifizierende Locus P450CYP19 ist, und SEQ ID No. 25 und SEQ ID No. 26, wenn der zu amplifizierende Locus SE-33 ist, aufweisen.
21. 21. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zum Nachweis oder zur quantitativen Analyse von Chimärismus bei einem Transplantatempfänger unter Verwendung eines oder mehrerer Marker. NACHGEREICHT 31 • · · · · · • · · · ··· • · · · · ·· ·· ··
22. 22. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Bewertung des Risikos einer Abstoßung oder eines Rückfalls eines Individuums, an dem eine Transplantation durchgeführt wurde.
23. 23. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 zur Überwachung eines erfolgreichen Engraftments oder des Fortschritts der Heilung eines Individuums, an dem eine Transplantation durchgeführt wurde..
24. 24. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für Vaterschaftstests.
25. 25. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 16 für genetische Fingerabdrücke. NACHGEREICHT