DE10242206A1 - Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA und ihre Verwendung - Google Patents

Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA und ihre Verwendung

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DE10242206A1
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Abstract

Die Erfindung betrifft eine neue Methode zum Nachweis von Mutationen, kleinen Isertionen (bevorzugt bis zu 10 Basen), kleinen Deletionen (bevorzugt bis zu 10 Basen), und Polymorphismen auf der DNA. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen, insbesondere der Familiären Hypercholesterinämie. Auch die Verwendung der Metehode zur Detektion von bekannten und unbekannten single nucleotide polymorphismen (SNPs) und Mikrosatellitenmarker wird von der Erfindung gedeckt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und insbesondere die Diagnostik. DOLLAR A Die erfindungsgemäße Methode zum Nachweis von Mutationen, Isertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass DOLLAR A - eine erste spezifische PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem Primärpaar, dass die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5'-Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist; DOLLAR A - eine zweite universelle PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primerpaar, dass komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist; DOLLAR A - die PCR-Prodikte durch Erhitzung denaturiert und danach schnell wieder abgekühlt werden; DOLLAR A - eine Auftrennung, vorrangig mit Hilfe einer ...

Description

  • Die Erfindung betrifft eine neue Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, vorzugsweise bis zu 10 Basen, Deletionen, vorzugsweise bis zu 10 Basen, und Polymorphismen auf der DNA. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen, insbesondere der Familiären Hypercholesterinämie. Auch die Verwendung der Methode zur Detektion von bekannten und unbekannten single nucleotide polymorphismen (SNPs) und Mikrosatellitenmarker wird von der Erfindung gedeckt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und insbesondere die Diagnostik.
  • Die Analyse von genetischen Varianten wie z. B. single nucleotide polymorphismen (SNPs) auf DNA Ebene gewinnt immer mehr an Bedeutung. Die SNPs sind einzelne Basenunterschiede im Genom, die etwa alle 1000 Basen auftreten und als Punktmutationen in Genen oder genregulatorischen Bereichen für Krankheiten verantwortlich sein können. Durch öffentliche und kommerzielle Einrichtungen sind bereits mehr als 1,6 Millionen SNPs identifiziert worden (Eric Lai, 2001, Genome Research, 11: 927-929). Die SNPs können als Werkzeug dienen, mit deren Hilfe man in der Lage sein wird, multifaktoriell polygene Erkrankungen, wie z. B. Hypertonie, Diabetes oder auch andere Krankheiten, besser zu studieren, zu verstehen und letztendlich zu diagnostizieren. Pharmakokinetische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme von SNPs, gewinnen in der Medikamentenentwicklung immer mehr an Bedeutung. Die Analyse von SNPs spielt somit schon heute nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in der Routinediagnostik eine zunehmende Rolle und ist in zunehmendem Maße Gegenstand der molekularbiologischen Forschung. Das Auffinden neuer SNPs erfolgt vor allem durch die Sequenzierung von mehreren Dutzend verschiedener DNA Proben. Erst durch den Vergleich der Sequenzen (dem sogenannten "allignen ") läßt sich ein SNP identifizieren, der anschließend für Studien mit speziellen Nachweisverfahren in großen Patienten-Populationen nachgewiesen bzw. untersucht werden kann.
  • Neben den SNPs sind für die medizinische Forschung und Diagnostik besonders die in der kodierenden und nicht kodierenden Bereichen der DNA vorkommenden kurzen Sequenzwiederholungen von zwei bis vier Basen, die sogenannten Mikrosatelliten, interessant. Mikrosatelliten werden z. B. als DNA-Marker (sog. Mikrosatellitenmarker) eingesetzt, um durch Kopplungsstudien krankheitsassoziierte Gene auf Chromosomen zu kartieren. DNA-Marker sind kurze definierte Abschnitte auf der DNA, deren Länge und Lage auf dem Chromosom (bzw. dem Genom) bekannt sind. Die Anzahl der Basenwiederholungen der Mikrosatelliten unterscheidet sich oft zwischen einzelnen Individuen und auch zwischen den einzelnen Allelen. Man spricht dann von polymorphen Mikrosatellitenmarkern. Diese polymorphen Marker werden mit Hilfe der PCR für Kopplungs- und Segregationsuntersuchungen eingesetzt.
  • Abweichungen in der DNA von Individuen werden bereits zur Vorhersage von Krankheitsdispositionen herangezogen. Beispielsweise sind Polymorphismen in den Positionen 145 (A→G), 175 (G→T) und 1165 (G→C) im menschlichen β1- Adrenorezeptorgen geeignet, um eine Disposition für Cardiomyopathien festzustellen (PCT/DE00/02648).
  • Es ist ferner beschrieben worden, daß ein Zusammenhang zwischen dem Apolipoprotein-E (epsilon 4 allel) und der Alzheimer Krankheit besteht. (Isbir T, 2001, Am J Alzheimers Dis Other Demen, Jul; 16 (4): 205-210).
  • Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH), eine ebenfalls genetisch bedingte Erkrankung, ist charakterisiert durch erhöhte Serumcholesterinwerte, Sehnenxanthome und vorzeitige koronare Herzerkrankung. Sie folgt einem autosomal dominanten Erbgang. Die Menschen, die an einer Familiären Hypercholesterinämie erkrankt sind, können überschüssiges Cholesterin nicht in ihrer Leber abbauen (Brown, M. S. & Goldstein, J. L. (1986) Science 232, 34-47.). Der Grund liegt darin, daß das Cholesterin, das im Blut an LDL (low density lipoprotein) gebunden ist, nicht durch den LDL- Rezeptor aufgenommen werden kann. An der Oberfläche der LDL-Partikel ist das Apolipoprotein B lokalisiert, das zur Bindung an den LDL-Rezeptor benötigt wird.
  • Das Low-Density-Lipoprotein Cholesterin (LDL-C) nimmt bei der Entstehung der Arteriosklerose eine zentrale Rolle ein und ist eine der Hauptrisikofaktoren für den Herzinfarkt (Garcia, C. K. et al. (2001) Genome Res 11, 1043-1052). Durch die Untersuchung von Gendefekten im LDL-Rezeptor kann bereits vor dem Auftreten schwerer Gefäßschäden das individuelle Risiko erhoben werden (Umans-Eckenhausen, M. A., et al. (2001) Lancet 357, 165-168). Die Vielzahl der bekannten (bisher sind ca. 600 Mutationen beschrieben) sowie die große Wahrscheinlichkeit der Existenz weiterer bisher unbekannter Mutationen stellen dabei extreme Anforderungen an einen Gentest für FH. Betroffene können durch eine rechtzeitige Diagnose gezielt und vorbeugend mit cholesterinsenkenden Medikamenten behandelt werden (Herz, J. (2001) Nat Struct Biol 8, 476-478).
  • Das Auffinden von bekannten und neuen Mutationen im LDL-Rezeptor erfolgt z. B. durch die Sequenzierung von allen kodierenden Exons des LDL-Rezeptor Gens. Erst durch die Sequenzierung aller Exons läßt sich eine Mutation identifizieren.
  • Die Sequenzierung als Verfahren zum Auffinden von Polymorphismen, z. B. SNPs, und Mutationen, z. B. im LDL-Rezeptor, ist kostenintensiv und zeitaufwendig, so dass sie als Routineanwendung zweifelsohne nicht in Betracht kommt.
  • Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache und kostengünstige Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA zu finden und dadurch schnell und sicher bekannte und unbekannte Mutationen und Polymorphismen detektieren zu können. Zur Aufgabe gehört auch die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen, insbesondere der Familiären Hypercholesterinämie durch den Nachweis von Mutationen, und Polymorphismen auf der DNA im LDL-Rezeptor.
  • Die Erfindung wird gemäß den Patentansprüchen realisiert, eine schematische Darstellung ist auf den Abb. 1, 2 und 3 zu sehen.
  • Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Methode dienen DNA-Moleküle, die aus geeigneten Materialien wie Zellkulturen, Gewebeproben, Blut usw. mit bekannten Methoden gewonnen werden.
  • An der gewonnenen DNA wird erfindungsgemäß mit einem Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die z. B. eine polymorphe Stelle im Genom flankieren, eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt (Abb. 1, 2 und 3). Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen verlängert (Tabelle 1) und dienen somit als "template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. Anschließend werden zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide zum PCR Produkt zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind (Tabelle 2). Beide universellen Oligonukleotide sind an ihrem 5'- Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert und zwar vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX oder TAMRA. Nach der erneuten Amplifikation liegen somit zwei genomische DNA-Doppelstränge (Allel 1 und Allel 2) als Kopie vor, wobei jeder Einzelstrang mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Die am 5'- Ende fluoreszenzmarkierten PCR Produkte werden denaturiert und schnell abgekühlt. Die schnelle Abkühlung bewirkt, dass sich die komplementären Einzelstränge nicht wieder zu Doppelsträngen zusammenlagern. Bei der Auftrennung der PCR-Produkte, die vorzugsweise mit Hilfe der Elektrophorese unter nichtdenaturierenden Bedingungen erfolgt, genügt ein einziger Unterschied in der Basensequenz, damit sich unterschiedliche Faltstrukturen in den beiden Strängen ausbilden. Dabei nimmt jeder DNA Einzelstrang eine seiner Sequenz entsprechende Konformation an. Dies führt zur unterschiedlichen Laufeigenschaften der Stränge. Da die Stränge mit jeweils zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann die Laufbande beider Stränge separat als Signal "Peak" ausgewertet werden. Ein Vorteil des Arbeitens mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen besteht darin, daß die zu detektierende Anzahl der zu untersuchenden Proben mit der Verdopplung der Fluoreszenzfarbstoffe halbiert wird. Diese Multiplexfähigkeit kann durch den Einsatz von neuentwickelten Fluoreszenzfarbstoffen erhöht werden, was die Zukunftsfähigkeit der Methode noch attraktiver macht.
  • Mit der oben beschriebenen Methode ist es möglich, einen schnellen und kostengünstigen Nachweis von Mutationen in kurzer Zeit zu realisieren. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmarkierungen anstelle von Radioaktivität ist die Methode sehr umwelt- und gesundheitsfreundlich. Zudem sind die Reaktionsprodukte lange lagerfähig, ohne an Fluoreszenzintensivität zu verlieren. Durch die Multiplexfähigkeit der Methode verringert sich der Materialverbrauch und der Zeitaufwand, was zur erheblichen Reduktion der Kosten führt.
  • Die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen wird im Folgenden am Beispiel der Familiären Hypercholesterinämie erläutert.
  • Als Ausgangsmaterial dienen DNA-Moleküle, die aus geeigneten Materialien wie Zellkulturen, Gewebeproben, Blut usw. mit bekannten Methoden gewonnen werden.
  • An der gewonnenen DNA wird erfindungsgemäß mit einem Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die je ein Exon im LDL-Rezeptor flankieren (Tabelle 3), eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als "template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. Anschließend werden für die Zwei-Schritt-PCR zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2) zum PCR Produkt zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind. Beide universellen Oligonukleotide sind an ihrem 5'-Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA. Nach der erneuten Amplifikation liegen somit zwei genomische DNA-Doppelstränge (Allel 1 und Allel 2) als Kopie vor, wobei jeder Einzelstrang mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Alternativ werden für eine Ein-Schritt-PCR alle vier Oligonucleotide in eine Reaktion zusammengegeben, in dem die spezifische und die universelle PCR hintereinander als ein Reaktionsschritt läuft (Abb. 2 und 3). Die am 5'-Ende Fluoreszenzmarkierten PCR Produkte werden denaturiert und schnell abgekühlt. Bei der kapillarelektrophoretischen Trennung unter nichtdenaturierenden Bedingungen im Polymer genügt ein einziger Unterschied in der Basensequenz, damit sich unterschiedliche Faltstrukturen in den beiden Strängen ausbilden. Dies führt zur unterschiedlichen Laufeigenschaften der Stränge. Da die Stränge mit jeweils zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann die Laufbande beider Stränge separat als "Peak" ausgewertet werden. Um Sequenzunterschiede im LDL-Rezeptor zu sehen, wird immer eine Wildtyp DNA-Probe mit den zu untersuchenden Proben verglichen. Ist das Peakmuster nicht gleich, so handelt es sich bei der unbekannten Probe um ein Mutationsträger. Die gefundene Mutation im jeweiligen Amplikon kann zum Bestätigen sequenziert werden. Ist die LDL-R Untersuchung als Zwei-Schritt-PCR durchgeführt worden, so kann dafür ein Aliquot des spezifischen PCR Produktes mit unmarkierten komplementären universellen Vorwärts bzw. Rückwärtsprimer sequenziert werden (Tabelle 3).
  • Mit der hier genannten und beschriebenen molekularbiologischen Methode ist es möglich, den LDL-Rezeptor auf Mutationen schnell, kostengünstig und einfach zu untersuchen und somit einen Routinetest anzubieten, der das schnelle und sichere Screening von Patienten-DNA erlaubt.
  • Polymorphe Marker bzw. Sequenzwiederholungen (Mikrosatellitenmarker) können für Kopplungs- und Segregationsuntersuchungen mit einem Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die eine polymorphe Stelle im Genom flankieren, durch die beschriebene Methode nachgewiesen werden (Abb. 3). Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als "template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. In der PCR befinden sich zusätzlich zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2), die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind. Ein universelles Oligonukleotide ist an seinem 5'-Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; Das andere universelle Oligonucleotid ist unmarkiert. In dieser Ein- Schritt-PCR werden alle vier Oligonucleotide in einer Reaktion zugegeben.
  • Eine Biotinmarkierung anstelle einer Fluoreszenzmarkierung kann für eine Einzelstranggenerierung von PCR-Produkten eingesetzt werden. Durch den Einsatz von Vorwärts- und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die eine zu untersuchende Stelle im Genom flankieren, wird eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als "template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. In der Reaktion sind zwei unterschiedliche zusätzliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2) zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind. Ein universelles Oligonukleotid ist an seinem 5'-Ende mit einem Biotin markiert. Das andere universelle Oligonucleotid ist unmarkiert. In dieser Ein-Schritt-PCR werden alle vier Oligonucleotide in einer Reaktion zugegeben. Die Biotinmarkierten PCR-Produkte können durch Streptavidin und oder NaOH für eine Einzelstranggenerierung genutzt werden. An dem mit Biotinmarkierten Vorwärts- oder Rückwärtsstrang kann z.B eine Echtzeitsequenzierung durchgeführt werden.
    • Abbildungslegenden Abb. 1
  • 1 Vorwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz I
    2 Rückwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II
    3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I
    4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II
    5 Am 5'-Ende fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3
    6 Am 5'-Ende fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4
    A Humanes Genom mit einem Polymorphismus (schwarzer Punkt) auf einem Allel
    B Durchführung einer PCR mit modifizierten Oligonukleotiden
    C Durchführung einer zweiten PCR mit universellen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden
    D Denaturierung der PCR-Stränge
    E Sequenzspezifische Konformation von fluoreszenzmarkierten Einzelsträngen
    F Auftrennung und Detektion der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Einzelstränge
    • Abb. 2
  • Schematische Darstellung der neu entwickelten Applikation zum Nachweis von Mutationen und Polymorphismen der DNA. 1 Vorwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz I
    2 Rückwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II
    3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I am Vorwärtsprimer
    4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II am Rückwärtsprimer
    5 Am 5'-Ende des Vorwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3
    6 Am 5'-Ende des Rückwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4
    7, 8 zusätzliche am 5'-Ende unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu 3 und 4 sind und z. B. für Multiplexläufe eingesetzt werden
    • Abb. 3
  • Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Applikation zum Nachweis von Mutationen und Polymorphismen der DNA. Als spezielle Anwendung sind der LDL- Rezeptor SSCP-Gentest, die Mikrosatelliten-Kartierung und die Biotin SNP-Analyse dargestellt. 1 Vorwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz I
    2 Rückwärtsprimer am 5'-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II
    3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I am Vorwärtsprimer
    4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II am Rückwärtsprimer
    5 Am 5'-Ende des Vorwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3
    6 Am 5'-Ende des Rückwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4
    7, 8 zusätzliche am 5'-Ende unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu 3 und 4 sind und z. B. für Multiplexläufe eingesetzt werden
    • Tabelle 1
  • Sequenzkomposition der Vorwärts- (1) und Rückwärtsprimer (2). Der spezifische Anteil der eine flankierende polymorphe Stelle im Genom darstellt ist mit X gekennzeichnet. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (unterstrichen) verlängert und dienen somit als "template" (Basis) für den nächsten Schritt.


    • Tabelle 2
  • Sequenzkomposition der komplementären universellen Vorwärts- (3), (5) und Rückwärtsprimer (4), (6). Beide Oligonikleotide werden mit einen der folgenden Fluoreszenzfarbstoffe am 5'- Ende unterschiedlich markiert: F1 = VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; F2 = VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; F1 ist ungleich F2. Die universellen Vorwärts- (5) und Rückwärtsprimer (6) können auch ohne Markierung z. B. für eine Sequenzierung eingesetzt werden. Für eine Einzelstrangseparation der PCR Produkte kann eines der universellen Vorwärts- (7) und Rückwärtsprimer (8) mit Biotin markiert werden. B = Biotin.




Claims (18)

1. Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass
eine erste spezifische PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem Primerpaar, das die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5'-Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist;
eine zweite universelle PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primerpaar, das komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist;
die PCR-Produkte durch Erhitzung denaturiert und danach schnell wieder abgekühlt werden;
eine Auftrennung der PCR-Produkte erfolgt; und
die Detektion der Laufeigenschaften der PCR-Produkte, wobei die Laufeigenschaften abhängig sind von der speziellen Faltung und der Konformation der DNA-Einzelstränge und die spezielle Faltung wiederum von der DNA-Sequenz.
2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung mit Hilfe der Elektrophorese, vorzugsweise kapillarelektrophoretisch, erfolgt.
3. Methode nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als komplementäre Sequenz unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenzen eingesetzt werden.
4. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Fluoreszenzmarkierung die Farbstoffe: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA eingesetzt werden.
5. Methode nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte vereinigt werden und/oder als Multiplex Reaktion eingesetzt werden.
6. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Oligonukleotid eines universellen Oligonukleotidpaares mit Biotin markiert ist und das andere nicht.
7. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste spezifische PCR-Reaktion und die zweite universelle PCR-Reaktion in einem Reaktionsansatz als Ein Schritt PCR durchgeführt werden.
8. Methode nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA des LDL-Rezeptors nachgewiesen werden.
9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Zwei Schritt PCR durchgeführt wird, indem
eine erste spezifische PCR durchgeführt wird mit Primern,
die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
am 5'-Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primerpaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet,
eine zweite universelle PCR durchgeführt wird mit einem markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primerpaar, das komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist;
die PCR-Produkte durch Erhitzung denaturiert und danach schnell wieder abgekühlt werden;
eine Auftrennung der PCR-Produkte, vorrangig mit Hilfe der Elektrophorese, erfolgt; und
die Detektion der Laufeigenschaften der PCR-Produkte erfolgt, wobei die Laufeigenschaften abhängig sind von der speziellen Faltung und der Konformation der DNA-Einzelstränge und die spezielle Faltung wiederum von der DNA-Sequenz.
10. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Ein Schritt PCR durchgeführt wird, indem
die spezifische PCR mit Primern,
die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
am 5'-Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primerpaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet und
die universelle PCR mit markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primern, die komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen sind
in einem Reaktionsansatz durchgeführt werden.
11. Methode nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass für die spezifische PCR vorzugsweise Primer verwendet werden, die in der Tabelle 3 aufgeführt sind.
12. Verwendung der Methode nach Anspruch 1 bis 11 zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen.
13. Verwendung der Methode nach Anspruch 1 bis 11 zur Detektion bekannter oder unbekannter Mutationen und Polymorphismen.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Detektion bekannter oder unbekannter single nucleotide polymorphismen (SNPs).
15. Verwendung nach Anspruch 13 zur Detektion bekannter oder unbekannter Mikrosatellitenmarker.
16. Testkit zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens beinhaltet:
ein Primerpaar, das die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5'-Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist;
ein markiertes, vorrangig fluoreszenzmarkiertes oder biotinmarkiertes, Primerpaar, dass komplementär zu den universellen Oligonukleotidsequenzen ist.
17. Testkit zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA des LDL-Rezeptors, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens beinhaltet:
Primer
die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
am 5'-Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primerpaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet; und
markierte, vorrangig fluoreszenzmarkierte oder biotinmarkierte, Primer, die komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen sind.
18. Testkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer, die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren vorrangig die Primer verwendet werden, die in der Tabelle 3 aufgelistet sind.
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