WO2007048469A1 - Verfahren zur relativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer biologischen probe - Google Patents

Verfahren zur relativen bestimmung der kopienzahl einer vorbestimmten sequenz in einer biologischen probe Download PDF

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WO2007048469A1
WO2007048469A1 PCT/EP2006/009028 EP2006009028W WO2007048469A1 WO 2007048469 A1 WO2007048469 A1 WO 2007048469A1 EP 2006009028 W EP2006009028 W EP 2006009028W WO 2007048469 A1 WO2007048469 A1 WO 2007048469A1
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biological sample
homologous
amplification
amplification reaction
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PCT/EP2006/009028
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Christoph Gauer
Wolfgang Mann
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Advalytix Ag
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for the relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence and possibly of homologous sequences to the predetermined sequence in a biological sample, in particular for determining the relative copy number of alleles, and a kit for relative quantitative determination of the number of Guide - Tuned sequence and possibly homologous sequences in a biological sample.
  • trisomy 18 Error's syndrome
  • trisomy 13 Panau syndrome
  • trisomy 21 Down syndrom
  • the copy number of the corresponding chromosome is 18, 13 and 21 per cell, respectively, whereas healthy individuals have only two copies of the aforementioned chromosomes per cell.
  • increasing the copy number of the chromosome in question leads to severe developmental disorders. While carriers of trisomy 21 are drastically inhibited in their development and sometimes have severe malformations, carriers of trisomy 18 and trisomy 13 usually die within the first year of life.
  • Huntington's disease a progressive neurodegenerative disease characterized by abnormal, involuntary movements with increasing decay of mental and physical abilities, is said to be the cascade of more than 37 copies of a particular subject (CAG), with the predisposition to disease education increases with the number of repetitions of this motif in the genome.
  • CAG a particular subject
  • Other examples of unstable trinucleotide sequences in humans are Kennedy syndrome and spinocerebral ataxia 1.
  • FI SH method fluorescence in situ hybridization
  • any fluorescence signal present indicates the presence of the sequence corresponding to the probe provided with the corresponding fluorescent label.
  • the intensity of the fluorescence may allow a limited inference to the number of sequence copies in the biological sample. If, however, at the wavelength of one of the fluorescence-labeled probes used no signal or only below a defined threshold signal lying obtained, it can be concluded that the sequence corresponding to the corresponding probe in the biological sample. However, the absence of a corresponding fluorescence signal may also be due to the fact that a mutation and / or microdeletion has taken place in the corresponding binding site of the sequence to be detected, for which reason the probe no longer binds to the predetermined sequence under the selected hybridization conditions.
  • Another disadvantage of this method is that a minimum amount of biological sample must be used in order to obtain an evaluable fluorescence signal at all. In addition, the sequence must not fall below a minimum length. Furthermore, for a valid result, it is necessary to analyze a plurality of cells, one of which
  • FISH analysis is not adequate for single cell diagnostics.
  • an automated evaluation by the pathologist is hardly possible.
  • Another fluorescence-based method is CGH analysis (comparative genomic hybridization).
  • CGH analysis comparative genomic hybridization
  • the nucleic acid of the sample to be analyzed is completely labeled with a dye 1.
  • the same amount of nucleic acid of a reference sample is labeled with a dye 2.
  • Both reaction mixtures are hybridized together on a sprouted metaphase chromosome set, wherein the sequences contained in both reaction mixtures compete for the binding sites on the spread chromosomes. Essentially, a ratio of dye 1 to dye 2 of 1: 1 will be established at all hybridization sites.
  • dye 1 will predominate at this hybridization site.
  • dye 2 will be detected at this hybridization site.
  • the reference measurement allows a relative statement about the frequency of sequences in the sample to be analyzed.
  • absolute fluorescence intensities must be measured, consuming and expensive.
  • this also requires the use of a certain, relatively high starting amount.
  • a special variant is the array CGH, which hybridizes not to chromosomes but to immobilized sequences whose physical address is known in the genome.
  • Another known method for quantifying nucleic acid sequences is the real-time PCR method, in which a PCR (polymerase chain reaction) is carried out with fluorescently labeled primers and the increase in the fluorescence signal is observed as a function of the number of cycles.
  • the threshold PCR cycle also Threshold-Cycle
  • the threshold PCR cycle is assigned to the reaction time. in which the fluorescence signal is significantly different from the background fluorescence and PCR product formation is exponential. This correlates with the initial copy number of the DNA sequence to be amplified. In this way, DNA samples can be relatively quantified by comparison with a DN A dilution series.
  • a disadvantage of this method is that the amount of starting material can not be reduced arbitrarily, since with a few starting molecules, for example 10 to 100 copies, as starting material, the stochastic error due to the exponential amplification is very large, which no longer quantitative statements allows. Furthermore, this method also requires expensive and expensive equipment for measuring the fluorescence intensity.
  • a more recent method for the quantitative determination of a nucleic acid sequence is the QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), in which several PCRs are carried out in parallel using fluorescently labeled primers in a PCR approach and the fluorescently labeled PCR products are subsequently subjected to an automatic DNA PCR. Scanner laserdensitometrisch be analyzed. In order to make a meaningful quantitative comparison between two side-by-side amplified PCR products, the two partial PCR reactions must proceed with equal efficiency and the fluorescence intensities of the reaction products at the time of exponential product amplification should be quantitatively analyzed. Other methods based on optically active-labeled probes, for example those using infrared-labeled probes, do not solve the problem either.
  • a method based on QF-PCR methodology for the detection of possible numerical aberrations of chromosomes 21, 18, 13, X and Y in amniotic fluid samples is described by Lucchini et al. in Scientific tions, September 2004.
  • This method is based on the in vitro PCR amplification of repetitive and polymorphic STR ⁇ short tandem repeats) sequences with fluorescently labeled primers. After completion of the PCR, the amplified PCR products are quantitated by capillary electrophoresis. If chromosome-specific STR systems are used in these methods, it is possible to draw conclusions about the copy number of the corresponding chromosome from the number of different PCR products obtained.
  • this method does not allow any statement about the presence or absence of a trisomy, since this result is obtained both in the case of a monoallelic trisomy and in the case of a monoallelic disomy.
  • a method based on this technology for the detection of trisomy 13 is also disclosed in DE 101 02 687 A1.
  • this method also has the disadvantage that fluorescently labeled primers must be used.
  • WO 2004/027089 discloses a method for amplifying genetic information from genetic material comprising a plurality of mutually definable subsets of genetic material by means of PCR and for determining the copy number of different chromosomes per cell, wherein in PCR with fluorescently labeled primers for each chromosome to be determined specific target sequences of predetermined length are amplified.
  • the fluorescence intensity of the PCR products obtained for the respective chromosomes is determined and the intensities obtained for the target sequences of each chromosome are compared with one another.
  • the object of the present invention is to provide a method for the relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample, in particular for the relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence and homologous sequences, for example the relative number of alleles in a biological sample. to provide, which is simple and inexpensive to carry out, which also and especially with a small number of existing in the biological sample to be examined predetermined sequences provides reliable results and which is feasible in particular with small amounts of starting material.
  • this object is achieved by a method for relative quantitative determination of the number of at least one predetermined sequence and optionally homologous sequences in a biological sample, in particular for determining the relative number of copies of alleles, comprising the following steps:
  • homologous sequences are understood to mean sequences which are similar to one another in terms of their nucleotide sequence of at least 70%, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90% and very particularly preferably at least 95%, whereas non-homologous sequences have are, which have a correspondingly lower sequence similarity with each other.
  • relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample in the sense of the present invention means determining whether a biological sample contains fewer, equal to or more copies of the predetermined sequence than a reference sample.
  • the absolute fluorescence intensity of PCR products is not determined and, as in the case of CGH, with the fluorescence intensity of a control or reference sample, but merely determines the number of different PCR products obtained and compares them with the number of different PCR products obtained with a reference sample.
  • fluorescence-marked primers do not have to be used in the method according to the invention.
  • the fluorescence intensity of the fluorescence-labeled PCR products obtained does not need to be determined in a complicated manner, but merely evaluated whether an optionally above a defined threshold value (for example a factor of 10 or 100) fluorescence is present at a wavelength corresponding to the fluorescent dyes used or not. Therefore, the inventive method is simple and inexpensive to perform without costly equipment for the quantitative detection of fluorescence.
  • the method according to the invention is suitable for the relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence in a biological sample, independently of the type of the predetermined sequence.
  • the predetermined sequence is a chromosome, gene or gene segment.
  • a defined amount of a biological sample is understood to mean that the biological sample is provided in a specific volume or the biological sample provided contains a certain number of cells or a specific amount of DNA.
  • the method according to the invention is also not limited with regard to the nature of the at least one amplification reaction, but rather all possible amplification reactions with which sequence variants can be detected can be used. Nevertheless, it has proved to be advantageous to carry out a PCR as at least one amplification reaction, since a PCR can be carried out simply and comparatively quickly and with little technical outlay, and any nucleic acid sequences from the biological sample can be amplified by selecting suitable primer pairs.
  • the principle of the method according to the invention is based on the comparison of the number of different amplification products obtained in the at least one amplification reaction according to step b) for the biological sample with the number of tests carried out for a reference sample with at least one under the same conditions as in step b) Amplification reaction obtained different amplification products. From the comparison of the numbers of the obtained different amplification products the statement can be made whether the the same amount of biological sample, containing more or fewer copies than the reference sample.
  • the reference sample has a known genotype with respect to the predetermined sequence.
  • the predetermined sequence for example a chromosome.
  • one or more cells of a healthy individual can be used as the reference sample.
  • the individual examined has less than two chromosomes.
  • the copy number at chromosome 21 per cell is 3 (trisomy 21) or higher.
  • the individual to be examined is healthy with respect to the copy number at chromosome 21.
  • a reference sample of a healthy individual that of a sick individual, for example a carrier of trisomy 21, can also be used.
  • a reference sample of a healthy individual that of a sick individual, for example a carrier of trisomy 21, can also be used.
  • the reference sample contains less than or more than two chromosomes 21 per cell.
  • the reference sample has a known copy number of the predetermined sequence.
  • the method according to the invention is quick and easy to carry out.
  • the inventive concept it is proposed that in the at least one amplification reaction according to step b) and in the at least one amplification reaction according to step d), which are adapted thereto, one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences derived from the In order to amplify, in each case, to use such a small amount of biological starting material, or to adjust the amplification conditions such that an "allelic dropout" occurs when carrying out the PCRs, the skilled artisan understands the loss of an allelic D NA Fragment after PCR amplification, caused by too small amounts of DNA starting material.
  • a heterogeneous DNA mixture such as a sample of chromosomal DNA
  • certain alleles are represented in varying numbers. Since the PCR amplifies exponentially, this unequal distribution can be amplified so much that the less concentrated allele is so poorly represented in relation to the higher allele that it can no longer be detected.
  • a certain starting amount of DNA material which is in the nanogram range, is always used in order to obtain reliable results, in contrast to the above such minimum amount of starting material to work.
  • a biological sample which contains less than 100 pg of DNA, for example chromosomal DNA.
  • a biological sample is used which contains less than 100 pg of DNA, for example chromosomal DNA.
  • Particularly preferred in the at least one amplification reaction less than 50 pg DNA, more preferably less than 10 pg DNA and very particular It is preferred that less than 5 pg of DNA be used as starting material, with the principle that the fewer base pairs contain the nucleic acid in the biological sample, the less DNA can and should be used.
  • Converted into cells, the aforementioned DNA amounts correspond to the use of less than 100 cells, preferably less than 10 cells, and more preferably less than 5 cells in the at least one amplification reaction. In particular, even when using a single cell as a biological starting material, for example. A polar body after the first maturation division, good results are obtained.
  • RNA as template in the at least one amplification reaction according to step b) and d).
  • first the RNA with reverse transcriptase must be converted into cDNA before the amplification reaction is carried out. Apart from that, the method is carried out as described above. With this embodiment of the present invention conclusions about differences in gene expression between a biological sample to be examined and a reference sample can be obtained which can not be detected at the DNA level alone.
  • the method according to the invention is based on a statistical approach in which it is not at all desirable for the one or each of the at least two mutually homologous or non-homologous sequences to be actually amplified in the at least one amplification reaction , Rather, precisely by setting the parameters of the amplification reaction, namely the use of a very small amount of DNA as starting material and / or by choosing a correspondingly small number of cycles and / or by the temperature control in the amplification reaction and / or by targeted contamination of the Ampltechnischsssatz with the amplification reaction interfering contaminants and / or by choosing very stringent hybridization conditions of the primer used to the Primeritatisstellen be achieved that only a certain percentage, namely 0 to 90% of at least one another homologous or non-homologous sequences, is actually amplified.
  • the DNA concentration of, for example, the reference sample is known, but not the DNA concentration of the biological sample, it is preferable to prepare a dilution series for both the reference sample and the biological sample, the dilution factors for the individual dilution steps for the reference sample and biological sample should be the same height.
  • the DNA concentration of both the biological sample and the reference sample are known, a dilution series is not absolutely necessary, since the known DNA concentration can then be selectively diluted to such an extent that under the selected PCR conditions less than 90% of the theoretically possible Number of different amplification products are obtained.
  • the known DNA concentration of both the biological sample and the reference sample is already so low that less than 90% of the theoretically possible number of different amplification products is obtained under the selected PCR conditions, dilution may be dispensed with. Nevertheless, in both of the above cases, preference is given to in order to be sure to have worked in a range in which the amplification reaction less than 90% of the theoretically possible number of different amplification products are obtained.
  • the slope of the regression line through the curve can be used to calculate relatively accurately how many cells in the original sample under the selected amplification conditions a predetermined number of the theoretically possible number of different amplification products, For example, 50% of the theoretically possible number of different amplification products is obtained.
  • step b) and / or in step d) exactly one PCR is performed with the biological sample or with the reference sample.
  • the term "a" PCR merely refers to the fact that not two or more different amplification reactions, which are adapted to amplify one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences, which are encompassed by the predetermined sequence the two or more different amplification reactions, for example, by the choice of the primer pairs used, be performed.
  • this does not exclude that the exactly one PCR performed in step b) and / or in step d) with the biological sample or reference sample on the basis of subsets (AI-quots) is carried out several times in order to ensure a multiple determination of the To obtain results.
  • This embodiment of the present invention is particularly fast and easy to perform.
  • the at least one PCR according to step b) and the at least one PCR according to step d) can be carried out in parallel. However, it is preferred to amplify the two samples offset in time with respect to one another, wherein the reference sample is particularly preferably amplified in time before the biological sample.
  • the average values for each sample are preferably used to compare the number of different amplification products obtained according to step f) of the method according to the invention with the two samples, namely the biological sample and the reference sample compared to the number of different amplification products obtained.
  • the standard deviation is also preferably determined in order to obtain information about the statistical reliability of the result obtained. For example, if the standard deviation in the averaging is small, it can be concluded from a different number of different amplification products obtained for the amplification reaction according to step b) compared with the corresponding number for the reference sample that the copy number of the predetermined sequence in the biological sequence Sample different from the reference sample.
  • the number of individual multiple determinations per amplification reaction is preferably between 2 and 1000 times, particularly preferably between 2 and 50 times, very particularly preferably between 2 and 20 times and most preferably between 5 and 10 times.
  • the method according to the invention is suitable not only for determining the relative number of a predetermined sequence, for example of a specific gene or genome, in a biological sample, but also, in particular, for the relative determination of the number of a predetermined sequence and for homologous sequences, preferably the homologous sequences are alleles.
  • the at least one amplification reaction according to step b) and the at least one amplification reaction according to step d) it is necessary in the at least one amplification reaction according to step b) and the at least one amplification reaction according to step d) to amplify an allele-specific sequence, which is understood as meaning a sequence which is highly similar between two alleles. homologous, but not identical. Since the number of different PCR products obtained for the biological sample and the reference sample are determined in steps c) and e), and thus the number of different alleles influences the result, it is possible to compare the obtained number of different PCR products for the the number of copies of the individual samples can be relatively determined, ie it is possible to say whether the biological sample has fewer, equal to or more copies of the allele per cell than the reference sample.
  • the at least one amplification reaction in steps b) and d) is preferably designed such that the one or at least two mutually homologous or non-homologous sequences are amplified from the non-coding DNA region.
  • the non-coding DNA region is considerably more polymorphic than the coding region, so that the probability of amplifying allele-specific sequences there is great.
  • the at least one amplification reaction according to steps b) and d) is adapted to amplify one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences consisting of the STR sequences, VNTR sequences , SNP sequences and any combinations thereof are selected, good results are obtained.
  • STR or short tan repeat sequences are highly polymorphic sequences which consist of only two to four bp repeating units and exhibit high variability between the individual individuals.
  • VNTR or variable number of tandem repeat sequences of about 15 to 30 bp in length constructed repetitive DNA sections whose total length determined by the number of repetitions of this basic unit.
  • VNTR sequences are usually highly polymorphic, i.
  • Single nucleotide polymorphisms are the simplest polymorphisms in which the homologous sequences differ only by one base. These are also ideal for carrying out the method according to the invention. Apart from that, however, all other highly polymorphic sequences are also suitable as markers for the method according to the invention.
  • the at least one amplification reaction is adapted to amplify one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences which only occur once in the genome of the donor per allele.
  • the at least one amplification reaction according to steps b) and d) is adapted to amplify between 2 and 100 mutually homologous or non-homologous sequences, in particular when adapted for the amplification of 2 to 20 mutually homologous or non-homologous sequences, especially preferably 3 to 15 mutually homologous or non-homologous sequences and very particularly preferably between 5 and 12 mutually homologous sequences or non-homologous, particularly good results are obtained.
  • a particular advantage of the method according to the invention is that in step c) and in step e) in the determination of the number of different PCR products per amplification approach, two pieces of information per amplification approach are taken into account, namely the presence or absence of a corresponding one
  • the second parameter or distinguishing feature of the individual PCR products preferably the length of the individual PCR products is selected, so that the determination of the number of different amplification products obtained in accordance with steps c) and e) the testing for the presence or absence of PCR products and the determination of the length of the individual PCR products wherein the number of different amplification products obtained corresponds to the number of amplification products of differing length obtained.
  • a suitable method for this is, for example, capillary electrophoresis.
  • the second distinguishing feature or the second parameter is preferably the Determination of the differing sequence, which is usually limited to one nucleotide in SNP sections.
  • the present invention relates to a method for the relative quantitative determination of the number of at least one predetermined nucleic acid sequence and homologous sequences in a biological sample, comprising the steps:
  • control sample preferably being of a known number of different Amplification products leads.
  • kits for the relative quantitative determination of the number of a predetermined sequence and optionally homologous sequences in a biological sample which is particularly suitable for carrying out the method according to the invention.
  • this kit comprises:
  • the number of the at least one amplification reaction adapted thereto will be one or at least two mutually homologous and / or non-homologous Sequences that are encompassed by the predetermined sequence to amplify, understood to obtain different amplification products.
  • the at least two primer pairs are adapted to amplify one or at least two mutually homologous and / or non-homologous sequences in the at least one PCR.
  • the at least two primer pairs are adapted to amplify from the group consisting of STR sequences, VNTR sequences, SNP sequences and any combinations thereof selected homologous and / or non-homologous sequences.
  • the at least two primer pairs and / or the protocol are adapted such that 2 to 100, particularly preferably 2 to 20, very particularly preferably 3 to 15 and most preferably 5 to 12 mutually homologous or non-homologous sequences are amplified.
  • the kit contain the result of at least one amplification reaction performed under the same conditions as prescribed in the protocol according to d), wherein the copy number of the reference sample is chosen such that the relative abundance for a positive amplification reaction of the at least one amplification reaction for which one or each of the at least two homologous sequences is between 20 and 80%, preferably between 30 and 70%, more preferably between 40 and 60% and most preferably about 50%.
  • a dilution series was set up with the reference sample, which had a DNA concentration of 1 ng / ml, the dilution factor between the individual dilution stages being 1: 1 in each case amounted to.
  • the dilution factor between the individual dilution stages being 1: 1 in each case amounted to.
  • two different PCR's each containing a primer pair adapted to amplify exactly one amplification product from the myc gene segment were performed.
  • the number of amplification products obtained in each PCR was determined to give the following result:
  • the first biological sample has the same number of copies on the myc gene segment as the reference sample.
  • the second biological sample has more copies of the myc gene segment than the reference sample.
  • sequence sections in a patient sample are present in a lower copy number than in a reference (deletion of Sequence sections) or in higher copy number than in the reference (amplification of sequence sections).
  • This question is being addressed today in CGH experiments. The scope of such experiments is very limited because the hybridization approach based on large amounts of starting material blurs the differences between sample and reference very much. Therefore, true (small) differences are not detected in most cases. Thus, a difference "doubling a sequence section" or the ratio of "chromosome 21: 2 copies” with the CGH is hardly detectable.
  • male cells having an X and a Y chromosome were used as a reference sample and cells from an unknown genotype were used as a biological sample. It should be determined whether the donor of the biological sample is male (one X and one Y chromosome) or female (two X chromosomes).
  • the biological sample has more X chromosomes than the reference sample.
  • the donor of the biological sample is female.
  • the reliability of the statistical statement of the aforementioned example can be increased by carrying out a multiple determination for the biological sample or by using a higher number of primer pairs in the PCR for the biological sample and the reference sample.
  • the presence of a monoallelic disomy can be distinguished from a diallelic disomy.
  • the result can be determined in a single experiment.
  • the reference can be processed temporally separated from the biological sample. This allows results of an amplification reaction at a reference sample, eg. a male sample, with respect to the predetermined sequence of interest, for example the X chromosome, in a kit according to claim 31.
  • the result can be made arbitrarily accurate by increasing the number of experiments or the number of primer pairs used in the PCR.
  • only minimal amounts of starting materials are needed, while the CGH requires microbiopsies.
  • microbiopsy it is always questionable whether they are indeed identical cells (which cell has actually become a tumor cell).
  • one analyzes different cells inadvertently mixed and hopes that the differences of the actual tumor cells are either large enough not to be mixed, or, without knowing, that the number of tumor cells is clearly predominant.
  • the method of the invention uses only a few cells and significantly reduces or completely eliminates this problem.
  • it opens the possibility to work out such differences in the cells because different cell populations, which are inadvertently mixed in the CGH, can be differentiated with the method.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologer Sequenzen in einer biologischen Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz, bei dem eine vorzugsweise definierte Menge einer biologischen Probe und eine definierte Menge einer Referenzprobe jeweils wenigstens einer Amplifikationsreaktion, welche daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, unterworfen werden, anschließend jeweils die Anzahl der für die biologische Probe und für die Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt und diese Anzahlen miteinander verglichen werden. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe.

Description

Verfahren zur relativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der relativen Kopienzahl von Allelen, sowie ein Kit zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbe- stimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe.
In der molekularen Diagnostik gewinnen Verfahren zum Quantifizieren von Sequenzen, insbesondere zur quantitativen Bestimmung der Kopien- zahl von Nukleinsäure Sequenzen pro Zelle, eine immer bedeutendere Rolle. Da eine Vielzahl von zum Teil schweren Erkrankungen durch Abweichungen von der normalen Kopienzahl von Nukleinsäuresequenzen im Genom verursacht werden, lassen sich durch eine Bestimmung der Kopienzahl bestimmter Chromosomen oder bestimmter Genabschnitte ent- sprechende Krankheiten schon im Frühstadium der Entwicklung zuverlässig diagnostizieren.
Beispiele für zum Teil schwere Anomalien, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, sind die Trisomie 18 (Edward' s Syndrom), Trisomie 13 (Patau- Syndrom) sowie Trisomie 21 (Down-Syndrom). Bei jeder dieser Krankheiten beträgt die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms 18, 13 bzw. 21 pro Zelle drei, wohingegen gesunde Individuen lediglich zwei Kopien der vorgenannten Chromosomen pro Zelle aufweisen. In allen drei Fällen führt die Erhöhung der Kopien- zahl des betreffenden Chromosoms zu schwersten Entwicklungsstörungen. Während Träger der Trisomie 21 in ihrer Entwicklung drastisch gehemmt sind und teilweise schwere Fehlbildungen aufweisen, versterben die Träger der Trisomie 18 und Trisomie 13 meistens innerhalb des ersten Lebensjahres.
Neben Krankheiten, welche auf eine erhöhte Kopienzahl ganzer Chromosomen zurückzuführen sind, ist auch eine Vielzahl von Erkrankungen bekannt, welche auf einer veränderte Kopienzahl von Genen oder Genabschnitten beruhen.
Ursache für die Huntington- Krankheit, einer progressiv verlaufenden neu- rodegenerativen Erkrankung gekennzeichnet durch abnormale, unwillkürliche Bewegungen bei zunehmendem Verfall der geistigen und körperlichen Fähigkeiten, soll die Hintereinanderschaltung von mehr als 37 Ko- pien eines bestimmten Motivs (CAG) sein, wobei die Prädisposition zur Krankheitsausbildung mit der Anzahl der Wiederholungen dieses Motivs im Genom zunimmt. Weitere Beispiele für instabile Trinukleotidsequenzen beim Menschen sind das Kennedy- Syndrom und die spinocerebrale Ataxie- 1.
Zudem ist bekannt, dass sich bestimmte Protoonkogene durch Genampli- fikation im Genom vervielfältigen können. Derartige Amplifikationen sind in dem Chromosomensatz oftmals als so genannte "double minutes" (D.M.) oder als " homogeneously staining regions" (HSR) zu erkennen. Aufgrund der enormen Erhöhung der Gen-Kopienzahl kann das zugehörige Protein in den Zellen in sehr großen Mengen produziert werden, was eine verstärkte Aktivierung der Zellproliferation - ohne Veränderung des Einzelgens an sich - ermöglicht. Insbesondere das myc-Protoonkogen soll von der Amplifikation besonders oft betroffen sein.
Aufgrund des Bedarfs an Verfahren zur Quantifizierung von Sequenzkopien in einer biologischen Probe wurde in der Vergangenheit eine Vielzahl entsprechender Verfahren vorgeschlagen.
Eines der grundlegenden Quantifizierungsverfahren, welches zumindest eine Aussage über die An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuresequenzen und abhängig von der Verfahrensführung auch einen bedingten Rück- schluss auf die Kopienzahl der betreffenden Nukleinsäuresequenzen pro Zelle erlaubt, ist das so genannte FI SH -Verfahren {fluorescence in situ hy- bridization). Bei diesem Verfahren wird die zu untersuchende biologische Probe nach entsprechender Vorbehandlung, d.h. Denaturierung mit For- mamid sowie Vorhybridisierung, mit einer oder mehreren verschiedenen Sonden, welche zuvor mit jeweils unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert wurden, unter Bedingungen inkubiert, welche eine Hybridisie- rung der Sonden mit dazu homologen Sequenzen in der biologischen Probe ermöglichen. Nach der Hybridisierung werden die Proben gewaschen, wobei unspezifische Hybridisierungssignale eliminiert werden. Abschließend werden die Fluoreszenzsignale des Präparats mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Jedes vorhandene Fluoreszenzsignal weist auf die Anwesenheit der der mit dem entsprechenden Fluoreszenzmarker versehenen Sonde entsprechenden Sequenz hin. Die Intensität der Fluoreszenz kann einen bedingten Rückschluss auf die Anzahl der Sequenzkopien in der biologischen Probe zulassen. Wird hingegen bei der Wellenlänge einer der eingesetzten fluoreszenzmarkierten Sonden kein Signal oder nur ein unterhalb eines definierten Schwellenwerts liegendes Signal erhalten, kann auf die Abwesenheit der zu der entsprechenden Sonde korrespondierenden Sequenz in der biologischen Probe geschlossen werden. Allerdings kann die Abwesenheit eines entsprechenden Fluoreszenzsignals auch darin begründet liegen, dass in der entsprechenden Bindungsstelle der nachzuweisenden Sequenz eine Mutation und/ oder Mikrodeletion stattgefunden hat, weswegen die Sonde unter den gewählten Hybridisie- rungsbedingungen nicht mehr an die vorbestimmte Sequenz bindet. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt darin, dass eine unerwünschte und zu falschen Ergebnissen führende Kreuzhybridisierung niemals vollständig ausgeschlossen werden kann. Zudem ist dieses Verfahren vergleichsweise teuer, zum einen weil zwingend Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden müssen, und zum anderen, weil es aufwändige Apparaturen, wie Fluoreszenzmikroskope, benötigt. Schließlich hängt die Aussagekraft dieses Verfahrens in ganz erheblichem Maße von der Quali- tat der eingesetzten Sonden ab; zuverlässige Ergebnisse werden nur erhalten, wenn die Sonden mit einer Effektivität von mehr als 90 % an die dazu korrespondierenden Bindungsstellen hybridisieren, so dass nur noch 10% der Zielsequenzen unhybridisiert vorliegen und demzufolge nicht mehr amplifiziert werden. Daraus folgt, dass eine falsche Wahl der Sonden, aber auch inadäquate Hybridisierungsbedingungen zu einem falschen Ergebnis führen. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass eine Mindestmenge an biologischer Probe eingesetzt werden muss, um überhaupt ein auswertbares Fluoreszenzsignal zu erhalten. Zudem darf die Sequenz eine minimale Länge nicht unterschreiten. Weiterhin ist es für ein valides Ergebnis notwendig, eine Vielzahl von Zellen zu analysieren, die einer
Hybridisierung zugänglich waren. Aus diesem Grund ist die FISH-Analyse für die Einzelzelldiagnostik nicht adäquat. Darüber hinaus ist eine automatisierte Auswertung durch den Pathologen kaum möglich. Ein anderes fluoreszenzbasierendes Verfahren ist die CGH-Analyse (com- parative genomic hybridization). Bei diesem Verfahren wird die Nukleinsäure der zu analysierenden Probe komplett mit einem Farbstoff 1 markiert. Die gleiche Menge an Nukleinsäuren einer Referenzprobe wird mit einem Farbstoff 2 markiert. Beide Reaktionsansätze werden gemeinsam auf einem gespreiteten Metaphasechromosomensatz hybridisiert, wobei die in beiden Reaktionsansätzen enthaltenen Sequenzen um die Bindungsstellen an den gespreiteten Chromosomen kompetieren. Im Wesentlichen wird sich an allen Hybridisierungsstellen ein Verhältnis von Farb- stoff 1 zu Farbstoff 2 von 1: 1 einstellen. Enthält die zu analysierende Probe amplifizierte Bereiche (mehr als die gewöhnliche Kopienzahl der Referenz), so wird der Farbstoff 1 an dieser Hybridisierungsstelle überwiegen. Im Falle einer Deletion in der zu untersuchenden Probe wird man nur den Farbstoff 2 an dieser Hybridisierungsstelle detektieren. Die Referenzmes- sung erlaubt eine relative Aussage über die Häufigkeit von Sequenzen in der zu analysierenden Probe. Allerdings ist auch dieses Verfahren, da absolute Fluoreszenzintensitäten gemessen werden müssen, aufwändig und teuer. Zudem erfordert auch dieses den Einsatz einer bestimmten, vergleichsweise hohen Ausgangsmenge.
Eine spezielle Variante ist die Array-CGH, in der nicht auf Chromosomen, sondern auf immobilisierte Sequenzen, deren physikalische Adresse im Genom bekannt ist, hybridisiert wird.
Ein weiteres bekanntes Verfahren zur Quantifizierung von Nukleinsäure- sequenzen ist die Real-Time-PCR-Methode, bei der eine PCR (Polymerase chain reaction bzw. Polymerasekettenreaktion) mit fluoreszenzmarkierten Primern durchgeführt wird und die Zunahme des Fluoreszenzsignals in Abhängigkeit von der Zyklenzahl beobachtet wird. Der Schwellenwert- PCR-Zyklus (auch Threshold-Cycle) wird dem Reaktionszeitpunkt zuge- ordnet, bei dem sich das Fluoreszenzsignal signifikant von der Hintergrundfluoreszenz abhebt und die PCR-Produktbildung exponentiell verläuft. Dieser korreliert mit der Anfangskopienzahl der zu vermehrenden DNA-Sequenz. Auf diese Weise lassen sich DNA- Proben anhand des Ver- gleichs mit einer DN A- Verdünnungsreihe relativ quantifizieren. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt jedoch darin, dass die Menge an Ausgangsmaterial nicht beliebig verkleinert werden kann, da mit wenigen Startmolekülen, beispielsweise 10 bis 100 Kopien, als Ausgangsmaterial der stochasti- sche Fehler aufgrund der exponentiellen Amplifikation sehr groß wird, was keine quantitative Aussagen mehr zulässt. Des weiteren erfordert auch dieses Verfahren aufwändige und teure Apparaturen zur Messung der Fluoreszenzintensität.
Ein neueres Verfahren zur quantitativen Bestimmung einer Nukleinsäure- sequenz ist die QF-PCR (quantitative fluorescence PCR), bei der in einem PCR- Ansatz parallel mehrere PCR's unter Einsatz unterschiedlich fluoreszenzmarkierter Primer durchgeführt werden und die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte anschließend mit einem automatischen DNA-Scanner laserdensitometrisch analysiert werden. Um einen aussagenkräftigen quantitativen Vergleich zwischen zwei nebeneinander amplifizierten PCR- Produkten treffen zu können, müssen die beiden PCR-Teilreaktionen mit gleicher Effizienz ablaufen und die Fluoreszenzintensitäten der Reaktionsprodukte zum Zeitpunkt der exponentiellen Produktamplifikation quantitativ analysiert werden. Auch andere auf optisch aktiv markierten Sonden basierende Verfahren, bspw. solche unter Einsatz von infrarotmarkierten Sonden, lösen das Problem nicht.
Ein auf der QF-PCR-Methodik basierendes Verfahren zur Feststellung möglicher numerischer Aberrationen der Chromosomen 21, 18, 13, X und Y in Fruchtwasserproben ist von Lucchini et al. in Wissenschaftliche In- formationen, September 2004 beschrieben worden. Dieses Verfahren basiert auf der in-vitro- PCR-Amplifikation von repetitiven und polymorphen STR {short tandem repeats)- Sequenzen mit fluoreszenzmarkierten Primern. Nach Abschluss der PCR werden die amplifizierten PCR-Produkte mittels Kapillarelektrophorese quantifiziert. Werden bei diesen Verfahren chromosomenspezifische STR-Systeme eingesetzt, so lassen sich aus der Anzahl der erhalten unterschiedlichen PCR-Produkte Rückschlüsse auf die Kopienzahl des entsprechenden Chromosoms schließen. Werden beispielsweise bei der Reaktion mit einem chromosomspezifischen STR-System bei der Kapillarelektrophorese drei Peaks erhalten, wobei die Peakhöhen untereinander 1: 1:1 betragen, so enthält das untersuchte Individuum drei verschiedene Allele des entsprechenden Chromosoms (triallelische Trisomie). Werden hingegen bei dem Verfahren zwei Peaks erhalten, wobei das Verhältnis der Peaks untereinander 2:1 beträgt, so weist das untersuchte Individuum pro Zelle zwei gleiche Allele des Chromosoms sowie ein anderes Allel des Chromosoms (diallelische Trisomie) auf. Im Falle, dass nur zwei Peaks mit identischer Peakhöhe erhalten werden, weist das Individuum zwei Allele auf, so dass keine Trisomie vorliegt (heterozygoter Fall) . Allerdings lässt dieses Verfahren in dem Fall, dass lediglich ein Peak er- halten wird, keine Aussage über die An- oder Abwesenheit einer Trisomie zu, da dieses Ergebnis sowohl im Falle einer monoallelischen Trisomie als auch im Falle einer monoallelischen Disomie erhalten wird. Ein auf dieser Technologie beruhendes Verfahren zum Nachweis von Trisomie 13 wird auch in der DE 101 02 687 Al offenbart. Um auch zwischen einer mono- allelischen Disomie und einer monoallelischen Trisomie unterscheiden zu können, wird bei diesem Verfahren vorgeschlagen, mit der PCR drei verschiedene, für das Chromosom 13 spezifische STR-DNA-Bereiche zu am- plifizieren. Allerdings weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass fluoreszenzmarkierte Primer eingesetzt werden müssen. Zudem erfordert es den Einsatz einer Mindestmenge an DNA, da andernfalls der stochasti- sehe Fehler aufgrund der exponentiεllen Arnplifikation sehr groß wird und keine quantitative Aussage für die diallelische Trisomie mehr möglich ist. Ein weiterer Nachteil des vorgenannten Verfahrens liegt schließlich darin, dass dieses nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit funktioniert, da nur in diesem Fenster die Peakhöhen proportional zum Verhältnis des Ausgangsmaterials sind. Des weiteren weist auch dieses Verfahren den Nachteil auf, dass die absolute Fluoreszenzintensität bestimmt werden muss.
In der WO 2004/027089 wird ein Verfahren zur Amplifikation genetischer Informationen aus genetischem Material umfassend mehrere voneinander abgrenzbare Teilmengen genetischen Materials mittels PCR und zur Bestimmung der Kopienzahl verschiedener Chromosomen pro Zelle offenbart, wobei in der PCR mit fluoreszenzmarkierten Primern für jedes zu be- stimmende Chromosom spezifische Zielsequenzen mit vorbestimmter Länge amplifiziert werden. Um eine Aussage über die Kopienzahl der zu detek- tierenden Chromosomen zu erhalten, wird die Fluoreszenzintensität der für die jeweiligen Chromosomen erhaltenen PCR-Produkte bestimmt und werden die für die Zielsequenzen jedes Chromosoms erhaltenen Intensita- ten miteinander verglichen. Wenn bspw. die mit den für das Chromosom 21 spezifischen PCR-Produkten erhaltene Intensität gleich oder zumindest annähernd gleich wie die mit den für das Chromosom 1 spezifischen PCR- Produkten erhaltene Intensität ist, wird die Aussage getroffen, dass die beiden vorgenannten Chromosomen in der biologischen Probe in gleicher Kopienzahl vorliegen. Auch dieses Verfahren setzt daher zwingend den
Einsatz fluoreszenzmarkierter Primer voraus und benötigt zur Auswertung die quantitative Erfassung der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen erhaltenen Amplifikationsprodukte. Auch dieses Verfahren funktioniert daher nur in einem engen PCR-Fenster mit einiger Zuverlässigkeit, da nur in diesem Fenster die Peakhδhen proportional zum Verhältnis des Ausgangsmaterials sind.
Alle vorgenannten Verfahren basieren auf dem Einsatz von fluoreszenz- markierten Primern und erfordern teure Apparaturen zur Bestimmung der Fluoreszenzintensität. Zudem erfordern diese den Einsatz einer Mindestmenge an Ausgangsmaterial um zumindest einigermaßen zuverlässige Ergebnisse zu erhalten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe, insbesondere zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und von dazu homologen Sequenzen, beispielsweise der relativen Anzahl von Allelen in einer biologischen Probe, bereitzustellen, welches einfach und kostengünstig durchführbar ist, welches auch und gerade bei einer geringen Anzahl an in der zu untersuchenden biologischen Probe vorhandenen vorbestimmten Sequenzen zuverlässige Ergebnisse liefert und welches insbesondere mit geringen Mengen an Ausgangsmaterial durchführbar ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der relativen Anzahl an Kopien von Allelen, gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellen einer vorzugsweise definierten Menge einer biologischen Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz, b) Durchführen von einer, zwei oder mehr verschiedenen Amplifϊ- kationsreaktionen, wobei die wenigstens eine Amplifikations- reaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifϊzieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifi- kationsreaktion von Schritt b), d) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit einer Referenzprobe vorzugsweise mit einer bekannten Menge an der vorbestimmten Sequenz unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifi- kation sreaktion , e) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt d) und f) Vergleichen der Anzahl der bei der wenigstens einen mit der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte von Schritt c) mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten gemäß Schritt e), wobei g) die Bedingungen der Amplifikationsreaktionen und die Menge der eingesetzten biologischen Probe sowie Referenzprobe derart eingestellt werden, dass in der wenigstens einen Amplifikati- onsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) 0 bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird. Unter homologen Sequenzen im Sinne der vorliegenden Erfindung werden Sequenzen verstanden, welche untereinander eine Ähnlichkeit bezüglich deren Nukleotidsequenz von wenigstens 70%, bevorzugt wenigstens 80%, besonders bevorzugt wenigstens 90% und ganz besonders bevorzugt we- nigstens 95% aufweisen, wohingegen nicht homologe Sequenzen solche sind, welche untereinander eine entsprechend geringere Sequenzähnlichkeit aufweisen. Zudem bedeutet relative quantitative Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe im Sinne der vorliegenden Erfindung die Bestimmung, ob eine biologische Probe weniger, gleich viel oder mehr Kopien der vorbestimmten Sequenz enthält als eine Referenzprobe.
Im Unterschied zu den Verfahren nach dem Stand der Technik wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren nicht, wie beispielsweise bei der quan- titativen PCR und QF-PCR, die absolute Fluoreszenzintensität von PCR- Produkten bestimmt sowie wie im Falle der CGH mit der Fluoreszenzintensität einer Kontroll- bzw. Referenzprobe verglichen, sondern lediglich die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte bestimmt und diese mit der mit einer Referenzprobe erhaltenen Anzahl an unterschiedli- chen PCR-Produkten verglichen. Insofern müssen in dem erfindungsgemäßen Verfahren keine fluoreszenzmarkierten Primer eingesetzt werden. Sofern diese zur Detektion der Anzahl an erhaltenen verschiedenen PCR- Produkten dennoch eingesetzt werden, muss nicht aufwendig die Fluoreszenzintensität der erhaltenen fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte be- stimmt werden, sondern lediglich evaluiert werden, ob eine ggf. über einem definierten Schwellenwert (bspw. Faktor 10 oder 100) liegende Fluoreszenz bei einer den eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffen entsprechenden Wellenlänge vorhanden ist oder nicht. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren ohne kostenaufwändige Apparaturen zur quantitativen Detekti- on von Fluoreszenz einfach und kostengünstig durchzuführen. Grundsätzlich ist das erfindungsgemäße Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer biologischen Probe unabhängig von der Art der vorbestimmten Sequenz geeig- net. Vorzugsweise ist die vorbestimmte Sequenz ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt. Unter definierter Menge einer biologischen Probe wird im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die biologische Probe in einer bestimmten Volumenmenge bereitgestellt wird oder die bereitgestellte biologische Probe eine bestimmte Zellenzahl oder eine be- stimmte Menge an DNA enthält.
Auch bezüglich der Art der wenigstens einen Amplifϊkationsreaktion ist das erfindungsgemäße Verfahren nicht limitiert, vielmehr können alle denkbaren Amplifikationsreaktionen, mit denen Sequenzvarianten nach- gewiesen werden können, eingesetzt werden. Dennoch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, als wenigstens eine Amplifϊkationsreaktion eine PCR durchzuführen, da eine PCR einfach und vergleichsweise schnell und mit geringem technischen Aufwand durchzuführen ist und durch die Auswahl geeigneter Primerpaare beliebige Nukleinsäure Sequenzen aus der biologi- sehen Probe amplifiziert werden können.
Das Prinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf dem Vergleich der in der wenigstens einen Amplifϊkationsreaktion gemäß Schritt b) für die biologische Probe erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikati- onsprodukten mit der Anzahl von für eine Referenzprobe mit wenigstens einer unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt b) durchgeführten Amplifikationsreaktion erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationspro- dukten. Aus dem Vergleich der Anzahlen der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte kann die Aussage getroffen werden, ob die zu un- tersuchendc biologische Probe gleich viel, mehr oder weniger Kopien als die Referenzprobe enthält.
Vorzugsweise weist die Referenzprobe bezüglich der vorbestimmten Se- quenz einen bekannten Genotyp auf. Darunter wird im Sinne der vorliegenden Erfindung verstanden, dass bekannt ist, ob es sich bei dem Individuum, aus dem die Referenzprobe entnommen wurde, um ein bezüglich der vorbestimmten Sequenz, bspw. einem Chromosom, um ein gesundes oder krankes Individuum handelt. Es muss jedoch bei dieser Ausfüh- rungsform der vorliegenden Erfindung nicht bekannt sein, wie hoch konkret die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in dem Individuum ist; vielmehr reicht aus, dass bekannt ist, ob die Referenzprobe bspw., wenn die vorbestimmte Sequenz das Chromosom 21 ist, 2 Kopien des Chromosoms 21 (gesundes Individuum) oder mehr oder weniger als 2 Kopien des Chromosoms 21 (krankes Individuum) aufweist. Durch Vergleich der Anzahl der mit der wenigstens einen PCR gemäß Schritt b) erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte mit der entsprechenden Anzahl von mit der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten lässt sich so zuverlässig darauf schließen, ob das Indivi- duum, aus dem die biologische Probe entnommen wurde, hinsichtlich der vorbestimmten Sequenz gesund (es werden mit der biologischen Probe gleich viele verschiedene PCR-Produkte wie für die Referenzprobe erhalten) oder krank ist. Dies sei am folgenden Beispiel erläutert:
Soll beispielsweise mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden, ob bei einem Individuum eine Chromosom 21 -Aberration vorliegt, können als Referenzprobe eine oder mehrere Zellen eines gesunden Individuums (mit 2 Kopien des Chromosoms 21) eingesetzt werden. Werden mit der zu untersuchenden biologischen Probe - bei Einsatz gleich vieler Zellen wie in der Referenzprobe - weniger sich voneinander unterschei- dende Arnplifikationsprodukte erhalten als mit der Referenzprobe, weist das untersuchte Individuum weniger als zwei Chromosomen auf. Werden hingegen mit der biologischen Probe mehr unterschiedliche Amplifikati- onsprodukte als mit der Referenzprobe erhalten, liegt die Kopienzahl an Chromosom 21 pro Zelle bei 3 (Trisomie 21) oder höher. Werden jedoch mit der biologischen Probe und der Referenzprobe jeweils die gleiche Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten, ist das zu untersuchende Individuum bezüglich der Kopienzahl an Chromosom 21 gesund.
Anstelle einer Referenzprobe eines gesunden Individuums kann auch die eines kranken Individuums, beispielsweise einem Träger der Trisomie 21 , eingesetzt werden. Bezogen auf das vorgenannte Beispiel ist in diesem Fall nicht bekannt, welche exakte Anzahl an Chromosom 21 das Individuum, aus dem die Referenzprobe entnommen wurde, aufweist, sondern nur, dass die Referenzprobe weniger oder mehr als zwei Chromosomen 21 pro Zelle enthält. In diesem Fall lässt sich, vorausgesetzt die Anzahl der in der biologischen Probe enthaltenen Zellen relativ zu der in der Referenzprobe enthaltenen Anzahl an Zellen ist bekannt, aus dem Vergleich der mit der biologischen Probe und mit der Referenzprobe jeweils erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten schließen, ob das Individuum, aus dem die biologische Probe entnommen wurde, die gleiche oder eine andere Kopienzahl an Chromosom 21 pro Zelle als der Träger der Referenzprobe aufweist.
Allerdings ist es bevorzugt, dass die Referenzprobe eine bekannte Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweist.
Da erfindungsgemäß genau eine Referenzprobe eingesetzt wird, ist das erfindungsgemäße Verfahren schnell und einfach durchzuführen. In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d), welche daran ange- passt sind, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, jeweils eine derart geringe Menge an biologischem Ausgangsmaterial einzusetzen, oder die Amplifϊkationsbedingungen derart einzustellen, dass bei der Durchführung der PCR's ein "allelic dropouf auftritt. Unter einem "allelic dropouf versteht der Fachmann den Verlust eines allelischen D NA- Fragmentes nach einer PCR-Amplifikation, verursacht durch zu geringe Mengen an DNA-Ausgangsmaterial. In einem heterogenen DNA-Gemisch, wie beispielsweise einer Probe chromosomaler DNA, sind bestimmte Allele unterschiedlich häufig vertreten. Da die PCR exponentiell amplifiziert, kann diese Ungleichverteilung so sehr verstärkt werden, dass das geringer konzentrierte Allel im Verhältnis zu dem höher konzentrierten Allel so gering vertreten ist, dass es nicht mehr detektiert werden kann. Um einen "allelic dropouf zu vermeiden, wird z.B. bei forensischen Untersuchungen immer eine gewisse, im Nanogrammbereich He- gende Ausgangsmenge an DNA-Material eingesetzt, um überhaupt zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Im Unterschied dazu ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gerade erwünscht, unterhalb einer solchen Mindestmenge an Ausgangsmaterial zu arbeiten.
Besonders gute Ergebnisse werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erhalten, wenn für die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine biologische Probe eingesetzt wird, welche weniger als 100 pg DNA, beispielsweise chromosomale DNA, enthält. Insbesondere bevorzugt werden in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA und ganz beson- ders bevorzugt weniger als 5 pg DNA als Ausgangsrnaterial eingesetzt, wobei grundsätzlich gilt, dass je weniger Basenpaare die Nukleinsäure in der biologischen Probe enthält, desto weniger DNA eingesetzt werden kann und sollte. Umgerechnet in Zellen entsprechen die vorgenannten DNA- Mengen dem Einsatz von weniger als 100 Zellen, bevorzugt weniger als 10 Zellen und besonders bevorzugt weniger als 5 Zellen in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion. Insbesondere auch bei Einsatz einer einzelnen Zelle als biologisches Ausgangsmaterial, bspw. einem Polkörper nach der ersten Reifeteilung, werden gute Ergebnisse erhalten.
Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und d) RNA als Vorlage einzusetzen. Bei dieser Ausführungsform muss zunächst die RNA mit reverser Transkriptase in cDNA überführt werden, bevor die Amplifi- kationsreaktion durchgeführt wird. Abgesehen davon wird das Verfahren wie zuvor beschrieben ausgeführt. Mit dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Rückschlüsse auf Unterschiede in der Genexpression zwischen einer zu untersuchenden biologischen Probe und einer Referenzprobe erhalten werden, die auf DNA-Ebene allein nicht er- fasst werden können.
Im Unterschied zu den beispielsweise in der Forensik eingesetzten Verfahren basiert das erfindungsgemäße Verfahren auf einem statistischen Ansatz, bei dem es gar nicht erwünscht ist, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen tatsächlich amplifiziert werden. Vielmehr soll gerade durch die Einstellung der Parameter der Amplifikationsreaktion, nämlich den Einsatz einer sehr geringen DNA-Menge als Ausgangsmaterial und/ oder durch Wahl einer entsprechend kleinen Zyk- lenzahl und/ oder durch die Temperaturführung bei der Amplifikations- reaktion und/oder durch eine gezielte Kontamination des Amplifikation- sansatzes mit die Amplifikationsreaktion störenden Kontaminanten und/ oder durch Wahl sehr stringenter Hybridisierungsbedingungen der eingesetzten Primer zu den Primerbindungsstellen, erreicht werden, dass nur ein bestimmter Prozentsatz, nämlich 0 bis 90 % der wenigstens einen zueinander homologen oder nicht homologen Sequenzen, tatsächlich amplifiziert wird. Indem sowohl die zu untersuchende biologische Probe als auch die Referenzprobe einer Amplifikationsreaktion mit jeweils denselben Amplifikationsbedingungen unterzogen wird, werden die Ausfälle einzelner theoretisch möglicher Amplifikationsprodukte nivelliert, so dass zuverlässig auf die relative Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der zu untersuchenden biologischen Probe verglichen mit der Referenzprobe geschlossen werden kann.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Bedingungen der Amplifikationsreaktionen und die Menge der eingesetzten biologischen Probe sowie der Referenzprobe derart einzustellen, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) 20 bis 80%, bevor- zugt 30 bis 70%, besonders bevorzugt 40 bis 60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird.
Um die vorgenannten Werte zu erreichen ist es insbesondere in dem Fall, dass die DNA-Konzentration der biologischen Probe und /oder der Referenzprobe nicht bekannt ist, vorteilhaft, in Schritt a) eine Verdünnungsreihe der biologischen Probe bereitzustellen und mit jeder Verdünnungsstufe der Verdünnungsreihe in Schritt b) wenigstens eine, besonders bevorzugt genau eine, PCR durchzuführen und /oder in Schritt d) eine Ver- dünnungsreihe der Referenzprobe bereitzustellen und mit jeder Verdün- nungsstufe der Verdünnungsreihe wenigstens eine, besonders bevorzugt genau eine, PCR durchzuführen. So kann durch Bestimmung der Anzahl an für jede Verdünnungsstufe erhaltenen unterschiedlichen Amplifikati- onsprodukten sowohl für die biologische Probe als auch die Referenzprobe eindeutig festgestellt werden, ab welcher Verdünnungsstufe bei der Ampli- fikationsreaktion gemäß Schritt b) bzw. Schritt d) weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsproduk- ten erhalten werden. Bei der anschließenden Auswertung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte für die biologische Probe und/ oder für die Referenzprobe gemäß Schritt f) werden dann vorzugsweise nur diejenigen Verdünnungsstufen berücksichtigt, bei denen 0 bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifi- kationsprodukten erhalten wurden. Auch wenn die DNA-Konzentration bspw. der Referenzprobe bekannt ist, nicht aber die DNA-Konzentration der biologischen Probe werden vorzugsweise sowohl für die Referenzprobe als auch die biologische Probe jeweils eine Verdünnungsreihe erstellt, wobei die Verdünnungsfaktoren für die einzelnen Verdünnungsstufen für die Referenzprobe und die biologische Probe gleich hoch gewählt werden.
Wenn die DNA-Konzentration sowohl der biologischen Probe als auch der Referenzprobe bekannt sind, ist eine Verdünnungsreihe nicht zwingend erforderlich, da die bekannte DNA-Konzentration dann gezielt soweit verdünnt werden kann, dass unter den gewählten PCR-Bedingungen weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukten erhalten werden. Wenn die bekannte DNA-Konzentration sowohl der biologischen Probe als auch der Referenzprobe hingegen bereits so gering ist, dass unter den gewählten PCR-Bedingungen weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukten erhalten werden, kann auf eine Verdünnung verzichtet werden. Dennoch ist es in beiden vorgenannten Fällen bevorzugt eine Ver- dünnungsreihe durchzuführen, um sicher sein zu können, in einem Bereich gearbeitet zu haben, in dem bei der Amplifikationsreaktion weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukten erhalten werden.
Dies sei an einem Gedankenbeispiel erläutert: Es liegt eine Referenzprobe mit bekannten Genotyp vor, wobei die Referenzprobe 96 Zellen umfasst. Es ist nicht sicher bekannt, ob mit dieser Zellzahl bei der durchgeführten PCR weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedli- chen Amplifikationsprodukten erhalten werden oder nicht. Daher wird eine Verdünnungsreihe erstellt, wobei der Verdünnungsfaktor zwischen den einzelnen Verdünnungsstufen 2 beträgt, mithin die einzelnen Verdünnungsstufen 96 Zellen (Verdünnungsstufe 0), 48 Zellen (Verdünnungsstufe 1), 24 Zellen (Verdünnungsstufe 2), 12 Zellen (Verdünnungsstufe 3), 6 Zellen (Verdünnungsstufe 4), 3 Zellen (Verdünnungsstufe 5) und 1,5 Zellen (Verdünnungsstufe 6) enthalten. Mit jeder Verdünnungsstufe wird nunmehr wenigstens eine PCR, bevorzugt mit mindestens 10 Primerpaaren, unter jeweils exakt den gleichen Amplifikationsbedingungen durchgeführt und anschließend die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte bestimmt, wobei das in der Fig. 1 wiedergegebene Ergebnis erhalten wurde.
Aus dem in der Fig. 1 gezeigten Ergebnis ist ersichtlich, dass unter den gewählten PCR-Bedingungen bei Einsatz von 20 Zellen oder weniger in der PCR weniger als 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden. Zudem kann durch die Steigung der durch die Kurve gelegten Regressionsgerade relativ genau berechnet werden, bei wie vielen Zellen in der Ausgangsprobe unter den gewählten Amplifikationsbedingungen eine vorbestimmte Anzahl der theo- retisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, bspw. 50% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Ampli- fϊkationsprodukten, erhalten wird.
Vorzugsweise wird in Schritt b) und/ oder in Schritt d) mit der biologi- sehen Probe bzw. mit der Referenzprobe genau eine PCR durchgeführt. Dabei bezieht sich die Angabe "eine" PCR lediglich darauf, dass nicht zwei oder mehr verschiedene Amplifikationsreaktionen, welche dazu angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, wobei sich die zwei oder mehr verschiedenen Amplifikationsreaktionen beispielsweise durch die Wahl der eingesetzten Primerpaare unterscheiden, durchgeführt werden. Dies schließt jedoch nicht aus, dass die in Schritt b) und /oder in Schritt d) durchgeführte genau eine PCR mit der biologischen Probe bzw. Referenzprobe anhand von Teilmengen (AIi- quots) mehrmals durchgeführt wird, um im Rahmen einer Mehrfachbestimmung eine Absicherung des Ergebnisses zu erhalten. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist besonders schnell und einfach durchzuführen.
Es hat sich im Rahmen der vorliegenden Erfindung als vorteilhaft erwiesen, sowohl für die PCR in Schritt b) als auch die PCR in Schritt d) eine Mehrfachbestimmung durchzuführen. Durch die Mehrfachbestimmung der wenigstens einen PCR in Schritt d) für die Referenzprobe wird im Prinzip eine Häufigkeitsverteilung erhalten, welche die Wahrscheinlichkeit für den Erhalt jeder zwischen 0 und der theoretisch möglichen Maximalzahl liegenden Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten angibt. Gleiches gilt für die Mehrfachbestimmung der PCR mit der biologischen Probe. So kann durch den Vergleich der Anzahl der bei der wenigstens einen mit der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion erhaltenen un- terschiedlichen Amplifikationsprodukten mit der Anzahl an mit der Refe- renzprobe erhaltenen unterschiedlichen Arnplifikationsprodukten eine besonders zuverlässige Aussage getroffen werden, ob die biologische Probe gleich viel, mehr oder weniger Kopien der vorbestimmten Sequenz enthält als die Referenzprobe.
Unabhängig davon, ob in Schritt b) und/ oder in Schritt d) eine oder zwei oder mehr verschiedene PCR's durchgeführt werden, können die wenigstens eine PCR gemäß Schritt b) sowie die wenigstens eine PCR gemäß Schritt d) parallel zueinander durchgeführt. Allerdings ist es bevorzugt, die beiden Proben zeitlich zueinander versetzt zu amplifizieren, wobei besonders bevorzugt die Referenzprobe zeitlich vor der biologischen Probe amplifiziert wird.
Sofern bei den einzelnen PCR's eine Mehrfachbestimmung durchgeführt wird, werden vorzugsweise für den Vergleich der Anzahl der mit den beiden Proben, nämlich der biologischen Probe und der Referenzprobe, erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten gemäß Schritt f) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Mittelwerte der für jede Probe bei der Mehrfachbestimmung erhaltenen Anzahl an unterschiedli- chen Amplifikationsprodukten miteinander verglichen. Bevorzugt wird hierbei auch die Standardabweichung bestimmt, um eine Aussage über die statistische Sicherheit des getroffenen Ergebnisses zu erhalten. Ist beispielsweise die Standardabweichung bei der Mittelwertbildung gering, so kann aus einer verschiedenen Anzahl an für die Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukten verglichen mit der entsprechenden Anzahl für die Referenzprobe besonders zuverlässig darauf geschlossen werden, dass sich die Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz in der biologischen Probe von der der Referenzprobe unterscheidet. Alternativ zu der vorgenannten Ausführungsform ist es selbstverständlich auch möglich, nur eine der Amplifikationsreaktionen gemäß den Schritten b) und d) einer Mehrfachbe Stimmung zu unterziehen, wohingegen die andere der Amplifikationsreaktionen nur einer einfachen Bestimmung unter- zogen wird. Beispielsweise werden auch gute Ergebnisse erhalten, wenn nur die für die Referenzprobe durchgeführte PCR mehrfach bestimmt wird, während die zu untersuchende biologische Probe einer einfachen Bestimmung unterzogen wird. Allerdings ist es auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren derart durchzuführen, dass sowohl für die Ampli- fikationsreaktion der Referenzprobe als auch die entsprechende Reaktion der biologischen Probe jeweils nur eine Einfachbestimmung durchgeführt wird.
Wenn wenigstens für eine der Amplifikationsreaktionen mit der biologi- sehen Probe und/ oder der Referenzprobe eine Mehrfachbestimmung durchgeführt wird, liegt die Anzahl der einzelnen Mehrfachbestimmungen pro Amplifikationsreaktion vorzugsweise zwischen 2 und 1.000 mal, besonders bevorzugt zwischen 2 und 50 mal, ganz besonders bevorzugt zwischen 2 und 20 mal und höchst bevorzugt zwischen 5 und 10 mal. Je hö- her die Anzahl der für die Referenzprobe und/ oder biologische Probe durchgeführten Bestimmungen, desto höher die statistische Sicherheit, desto höher allerdings auch der experimentelle Aufwand.
Je nach Anzahl der einzelnen Bestimmungen pro Amplifikationsreaktion kann es notwendig sein, die biologische Probe und/oder die Referenzprobe vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zu amplifizieren, um eine ausreichende Menge an Ausgangsmaterial für die einzelnen Amplifikationsreaktionen der Mehrfachbestimmung zu haben. Vorzugsweise erfolgt in diesem Fall die Vermehrung des Ausgangsmaterials durch eine unspezifische PCR der biologischen Probe und /oder der Referenzprobe. Hervorzuheben ist, dass das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur dazu geeignet ist, die relative Anzahl einer vorbestimmten Sequenz, beispielsweise eines speziellen Gens oder Genoms, in einer biologischen Probe zu bestimmen, sondern insbesondere auch zur relativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz sowie dazu homologer Sequenzen, wobei es sich bei den homologen Sequenzen vorzugsweise um Allele handelt. Bei der letztgenannten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es notwendig, in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) eine allelspezifische Sequenz zu amplifizieren, worunter eine Sequenz verstanden wird, welche zwischen zwei Allelen zwar hochgradig ähnlich bzw. homolog, aber nicht identisch ist. Da in den Schritten c) und e) die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkte für die biologische Probe und die Referenzprobe bestimmt werden und dadurch die Anzahl der unterschiedlichen Allele das Ergebnis beeinflusst, kann durch Vergleich der erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR- Produkten für die biologische Probe mit der entsprechenden Anzahl für die Referenzprobe die Kopienzahl der einzelnen Allele relativ bestimmt werden, d.h. es ist die Aus- sage möglich, ob die biologische Probe weniger, gleich viel oder mehr Kopien des Allels pro Zelle aufweist als die Referenzprobe. Daher wird die wenigstens eine Amplifikationsreaktion in den Schritten b) und d) vorzugsweise derart ausgelegt, dass die eine oder wenigstens zwei zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen aus dem nicht-kodierenden DNA-Bereich amplifiziert werden. Bekanntermaßen ist der nicht- kodierende DNA-Bereich wesentlich polymorpher als der kodierende Bereich, so dass die Wahrscheinlichkeit, dort allelspezifische Sequenzen zu amplifizieren, groß ist. In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird zudem vorgeschlagen, die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu anzupassen, dass eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen amplifϊziert werden.
Insbesondere in den Fällen, in denen die wenigstens eine Amplifikations- reaktion gemäß den Schritten b) und d) dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP- Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, werden gute Ergebnisse erhalten. STR- bzw. short tan- dem repeαt-Sequenzen sind hochpolymorphe Sequenzen, welche aus lediglich zwei bis vier bp langen Wiederholungseinheiten bestehen und zwischen den einzelnen Individuen eine hohe Variabilität aufweisen. Im Unterschied dazu bestehen VNTR- bzw. variable number of tandem repeat- Sequenzen aus etwa 15 bis 30 bp Länge aufgebauten repetitiven DNA- Abschnitten, deren Gesamtlänge durch die Anzahl der Wiederholungen dieser Grundeinheit bestimmt sind. Auch VNTR-Sequenzen sind in der Regel hochpolymorph, d.h. die Anzahl der jeweiligen Wiederholungseinheiten unterscheidet sich zwischen den verschiedenen Individuen sehr stark. Bei SNFs (single nucleotide polymorphism) handelt es sich um die ein- fachsten Polymorphismen, bei denen sich die homologen Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden. Auch diese eignen sich hervorragend für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Abgesehen davon sind jedoch auch alle anderen hochpolymorphen Sequenzen als Marker für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.
Ferner ist es bevorzugt, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche im Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen. Vorzugsweise ist die wenigstens eine Arnplifikationsreaktion gemäß den Schritten b) und d) dazu angepasst, zwischen 2 und 100 zueinander homologe bzw. nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, wobei insbesondere bei Anpassung zur Amplifikation von 2 bis 20 zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen, besonders bevorzugt 3 bis 15 zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander homologen Sequenzen bzw. nicht homologen, besonders gute Ergebnisse erhalten werden.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, die Anzahl der Kopien der vorbestimmten Sequenz in der Referenzprobe und/oder der biologischen Probe zwischen 20 und 1.000 zu wählen.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass in Schritt c) und in Schritt e) bei der Bestimmung der Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten pro Amplifikationsansatz jeweils zwei Informationen pro Amplifikationsansatz berücksichtigt werden, nämlich zum einen die An- bzw. Abwesenheit eines entsprechenden PCR- Produktes sowie zum anderen die Information über einen zweiten, die ein- zelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden Parameter, beispielsweise die Länge oder Sequenz der PCR-Produkte, weswegen selbst bei einer Einfachbestimmung der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) als auch der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) zuverlässige Ergebnisse über die relative Anzahl an Se- quenzkopien in der biologischen Probe mit Bezug zu der Referenzprobe möglich sind. Zur Bestimmung der An- bzw. Abwesenheit von Amplifikati- onsprodukten können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren eingesetzt werde, wobei lediglich beispielsweise Gelelektrophorese, gängige Hybridisierungstechniken, beispielsweise auf einem DNA- Array, genannt seien. Dabei kann es in Abhängigkeit von dem eingesetzten Dete ϊik-tionsvεrfahren zweckmäßig sein, Schwellenwerte zu definieren, oberhalb derer die Anwesenheit eines PCR-Produktes und unterhalb derer die Abwesenheit eines PCR-Produktes angenommen wird. Die Art des zweiten, die einzelnen PCR-Produkte voneinander unterscheidenden Pa- rameters ist im Wesentlichen von der Art der einen bzw. wenigstens zwei zu amplifizierenden, zueinander homologen bzw. nicht homologen Sequenzen abhängig. Werden beispielsweise die PCR-Primer in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion so gewählt, dass STR-Abschnitte und /oder VNTR- Abschnitte als zueinander homologe und/ oder nicht ho- mologe Sequenzen amplifiziert werden, wird als zweiter Parameter bzw. Unterscheidungsmerkmal der einzelnen PCR-Produkte vorzugsweise die Länge der einzelnen PCR-Produkte gewählt, so dass die Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte gemäß den Schritten c) und e) die Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von PCR- Produkten sowie die Bestimmung der Länge der einzelnen PCR-Produkte umfasst, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht. Ein geeignetes Verfahren hierfür ist beispielsweise die Kapillarelektrophorese.
Werden hingegen bei der wenigstens einen Amplifikationsreaktion PCR- Primer eingesetzt, welche daran angepasst sind, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe SNP-Sequenzen zu ampli- fizieren, so ist das zweite Unterscheidungsmerkmal bzw. der zweite Para- meter vorzugsweise die Bestimmung der sich unterscheidenden Sequenz, die bei SNP-Abschnitten üblicherweise auf ein Nukleotid beschränkt ist. Auch hierzu können alle dem Fachmann zu diesem Zweck bekannten Verfahren herangezogen werden, wobei lediglich beispielsweise DNA- Sequenzierung oder bekannte Hybridisierungsverfahren genannt seien. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsfoπn betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer biologischen Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/ oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst, b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR- Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen hier- von bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, d) Durchführen wenigstens einer PCR mit einer Referenzprobe vorzugsweise mit einer bekannten Menge an der vorbestimmten Se- quenz unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, e) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten und f) Vergleichen der Anzahl der bei der mit der biologischen Probe durchgeführten wenigstens einen PCR erhaltenen unterschiedlichen
PCR-Produkte von Schritt c) mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten gemäß Schritt e), wobei g) die Bedingungen der PCR's und die Menge der eingesetzten biologi- sehen Probe sowie der Referenzprobe derart eingestellt werden, dass in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) O bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden.
Es hat sich bei der Durchführung des erfmdungsgemäßen Verfahrens als zweckmäßig erwiesen, parallel zu der wenigstens einen Amplifikations- reaktion gemäß Schritt b) bzw. d) eine Amplifikationsreaktion unter den gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchzuführen, wobei die Kontrollprobe vorzugsweise zu einer bekannten Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten führt. So kann auf einfache Weise festgestellt werden, ob die wenigstens eine Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und/ oder Schritt d) ordnungsgemäß abgelaufen ist, oder möglicherweise durch einen Defekt an dem Thermocycler gar nicht oder nur unzurei- chend stattgefunden hat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und gegebenenfalls dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Pro- be, welches insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet ist. Erfindungsgemäß umfasst dieses Kit:
a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, b) eine Referenzprobe mit einer bezüglich der vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl und/ oder das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorge- schrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion, wobei die Ko- piεnzahl so gewählt war, dass das Ampliflkationsprodukt mit einer Wahrscheinlichkeit von weniger als 90% entstand, c) ggf. PCR-Puffer und d) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR mit der biologischen Probe und ggf. einer Referenzprobe.
Unter Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion für eine Referenzprobe werden die Anzahl der mit der wenigstens einen Amplifika- tionsreaktion, welche daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte verstanden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Kits gemäß der vorliegenden Erfindung sind die wenigstens zwei Primerpaare daran angepasst, in der wenigstens einen PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren. Insbesondere wenn die zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen hoch- gradig polymorph sind, werden gute Ergebnisse erhalten. Besonders bevorzugt sind die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst, aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählte zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
In Weiterbildung des Erfindungsgedankens wird vorgeschlagen, dass die wenigstens zwei Primerpaare und /oder das Protokoll derart angepasst sind, dass in der PCR 2 bis 100, besonders bevorzugt 2 bis 20, ganz besonders bevorzugt 3 bis 15 und höchst bevorzugt 5 bis 12 zueinander homologe bzw. nicht homologe Sequenzen amplifiziert werden. rr udεrn hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die wenigstens zwei Priπier- paare gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß d) daran anzupassen, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen PCR für jede der einen oder wenigstens zwei zueinander homo- logen bzw. nicht homologen Sequenzen zwischen 0 und 90%, bevorzugt zwischen 20 und 80%, besonders bevorzugt zwischen 30 und 70%, ganz besonders bevorzugt zwischen 40 und 60% und höchst bevorzugt etwa 50% beträgt.
Desweiteren ist es bevorzugt, dass das Kit das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion enthält, wobei die Kopienzahl der Referenzprobe so gewählt ist, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen Amplifikationsreaktion für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen Sequenzen zwischen 20 und 80%, bevorzugt zwischen 30 und 70%, besonders bevorzugt zwischen 40 und 60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% beträgt.
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von diese erläuternden, diese aber nicht einschränkenden Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Es soll bestimmt werden, ob eine biologische Probe mehr, gleich viel oder weniger Kopien von myc-Genabschnitten enthält als eine Referenzprobe.
Zunächst wurde mit der Referenzprobe, welche eine DNA- Konzentration von 1 ng/ml aufwies, eine Verdünnungsreihe angesetzt, wobei der Ver- dünnungsfaktor zwischen den einzelnen Verdünnungsstufen jeweils 1 : 1 betrug. Anschließend wurden mit jeder Verdünnungsstufe räumlich getrennt voneinander zwei verschiedene PCR's jeweils enthaltend ein Primerpaar, welches dazu angepasst war, genau ein Amplifϊkationsprodukt aus dem myc-Genabschnitt zu amplifizieren, durchgeführt. Abschließend wurde die Anzahl der bei jeder PCR erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt, wobei folgendes Ergebnis erhalten wurde:
Figure imgf000033_0001
Aus den Ergebnissen ist ersichtlich, dass ab einer Verdünnung von 1:4 allelic dropouts zu beobachten sind. Aus der bekannten Ausgangskonzentration ergibt sich somit ein Einsetzen der allelic dropouts bei einer DNA- Konzentration von 0,25 ng/ml.
Anschließend wurde mit einer ersten biologischen Probe gleicher Konzentration wie der Referenzprobe dieselbe Verdünnungsreihe pipettiert, mit jeder Verdünnungsstufe jeweils die beiden vorgenannten PCR-Reaktionen durchgeführt und die Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt. Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Figure imgf000033_0002
Aus dem Vergleich der mit der Referenzprobe und der ersten biologischen Probe erhaltenen Ergebnisse folgt, dass die erste biologische Probe gleich viele Kopien an dem myc-Genabschnitt aufweist wie die Referenzprobe.
Daraufhin wurde mit einer zweiten biologischen Probe gleicher Konzentration wie der Referenzprobe, wobei die zweite biologische Probe von der ersten biologischen Probe verschieden war, dieselbe Verdünnungsreihe wie zuvor beschrieben pipettiert, mit jeder Verdünnungs stufe jeweils die beiden vorgenannten PCR-Reaktionen durchgeführt und die Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt. Dabei wurde folgendes Ergebnis erhalten:
Figure imgf000034_0001
Aus dem Vergleich der mit der Referenzprobe und der zweiten biologi- sehen Probe erhaltenen Ergebnisse folgt, dass die zweite biologische Probe mehr Kopien an dem myc-Genabschnitt aufweist wie die Referenzprobe.
Wie der Fachmann erkennt hätte, wenn die absolute Kopienzahl in der Referenzprobe bekannt gewesen wäre, in diesem Beispiel auch die absolute Anzahl der Kopien in der ersten und zweiten biologischen Probe bestimmt werden können.
Beispiel 2
Es soll festgestellt werden, ob in einer Patientenprobe Sequenzabschnitte in einer geringeren Kopienzahl als in einer Referenz vorliegen (Deletion von Sεquenzabschnitten) oder in höherer Kopienzahl als in der Referenz (Amplifikation von Sequenzabschnitten). Diese Fragestellung wird heute in CGH-Experimenten bearbeitet. Der Aussagebereich solcher Experimente ist sehr eingeschränkt, weil der Hybridisierungsansatz basierend auf großen Mengen an Ausgangsmaterial die Unterschiede zwischen Probe und Referenz sehr stark verwischt. Wahre (kleine) Unterschiede werden deshalb in den meisten Fällen nicht entdeckt. So ist ein Unterschied "Verdopplung eines Sequenzabschnittes" oder das Verhältnis von "Chromosom 21:2 Kopien" mit der CGH kaum feststellbar.
In diesem Beispiel wurden männliche Zellen, welche ein X- und ein Y- Chromosom aufwiesen, als Referenzprobe eingesetzt und Zellen aus einem Individuum unbekannten Genotyps als biologische Probe eingesetzt. Es sollte bestimmt werden, ob der Spender der biologischen Probe männlich (ein X- und ein Y-Chromosom) oder weiblich (zwei X-Chromosomen) ist.
Zunächst wurde für die Referenz eine Verdünnungsreihe pipettiert und für jede Verdünnungs stufe eine PCR mit 10 Primerpaaren durchgeführt, um zu bestimmen, ab welcher Verdünnungsstufe allelic dropouts einsetzen. Mit der PCR konnten maximal 10 unterschiedliche Amplifikationsproduk- te erhalten werden. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:
Figure imgf000035_0001
Allelic dropouts treten somit für die Referenzprobe bei dem Einsatz von weniger gleich 6 Zellen auf. Es wurde nunmehr für die biologische Probe die gleiche Verdünnungsreihe pipettiert und mit jeder Verdünnungsstufe die gleiche PCR wie für die Referenzprobe durchgeführt, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden:
Figure imgf000036_0001
Für die biologische Probe konnten demnach bei Einsatz von 6 Zellen noch keine allelic dropouts festgestellt werden, wobei für bei Einsatz derselben Anzahl an Zellen für die Referenzprobe allelic dropouts resultierten.
Daraus ergibt sich, dass die biologische Probe mehr X-Chromosomen aufweist als die Referenzprobe. Mithin ist der Spender der biologischen Probe weiblich.
Die Sicherheit der statistischen Aussage des vorgenannten Beispiels kann dadurch erhöht werden, dass für die biologische Probe eine Mehrfachbestimmung durchgeführt wird oder dadurch, dass in der PCR für die biologische Probe und die Referenzprobe eine höhere Zahl an Primerpaaren eingesetzt wird.
Gegenüber dem CGH- Verfahren ergeben sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren folgende Vorteile:
Zum einen kann das Vorliegen einer monoallelischen Disomie von einer diallelischen Disomie unterschieden werden. Zudem kann das Ergebnis in einem Einzelexperiment festgestellt werden. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die Referenz zeitlich getrennt von der biologischen Probe bearbeitet werden kann. Damit können Ergebnisse einer Amplifikationsreaktion an einer Referenzprobe, bspw . einer männlichen Probe, bezüglich der interessierenden vorbestimmten Sequenz, bspw. dem X-Chromosom, in einem Kit gemäß Patentanspruch 31 integriert werden.
Ferner kann das Ergebnis beliebig genau gemacht werden, indem die Zahl der Experimente oder die Zahl der eingesetzten Primerpaare in der PCR erhöht wird. Zudem werden nur geringste Mengen an Ausgangsmaterialien benötigt, während die CGH-Mikrobiopsien erfordert. Bei Mikrobiop- sien ist es jedoch immer fraglich, ob es sich tatsächlich um identische ZeI- len handelt (welche Zelle ist wirklich zur Tumorzelle geworden). Typischerweise analysiert man unterschiedliche Zellen ungewollt gemischt und hofft, dass die Unterschiede der eigentlichen Tumorzellen entweder groß genug sind, um nicht vermischt zu werden, oder, ohne es zu wissen, dass die Zahl der Tumorzellen deutlich überwiegt. Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt nur wenige Zellen und vermindert dieses Problem erheblich oder umgeht es vollständig. Darüber hinaus eröffnet es die Möglichkeit, solche Unterschiede in den Zellen erst herauszuarbeiten, weil unterschiedliche Zellpopulationen, die in der CGH ungewollt gemischt werden, mit der Methode differenzierbar sind.
Allgemein lässt sich aus den vorgenannten Beispielen erkennen, dass aus der Kenntnis der Kopienzahl der Referenzprobe und dem Übergang in den allelic dropout eine bevorzugte Zahl von Zellen der biologischen Probe für das Experiment abgeleitet werden kann. Diese Zahl von Zellen soll so ge- wählt werden, dass die biologische Probe gerade in den Bereich der vollständigen Profile ist, wenn die Referenzprobe im allelic drqpout-Bereich ist oder umgekehrt. Aus dem Vergleich der Zahl der Zellen in der Referenzprobe kann dann auf die Kopienzahl in den Zellen zurück geschlossen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl we- nigstens einer vor bestimmten Sequenz und ggf. von zu der vorbestimmten Sequenz homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Bestimmung der relativen Kopienzahl von Allelen in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer vorzugsweise definierten Menge einer biologischen Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz, b) Durchführen von einer, zwei oder mehr verschiedenen Amplifϊkati- onsreaktionen, wobei die wenigstens eine Amplifikationsreaktion daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt b), d) Durchführen wenigstens einer Amplifikationsreaktion mit einer Referenzprobe vorzugsweise mit einer bekannten Menge der vorbestimmten Sequenz unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen Amplifikationsreaktion, e) Bestimmen der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifika- tionsprodukte für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion von Schritt d) und f) Vergleichen der Anzahl der bei der wenigstens einen mit der biologischen Probe durchgeführten Amplifikationsreaktion erhaltenen un- terschiedlichen Amplifikationsprodukte von Schritt c) mit der An- zahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen Ampli- fikationsprodukten gemäß Schritt e), wobei g) die Bedingungen der Amplifikationsreaktionen und die Menge der eingesetzten biologischen Probe sowie Referenzprobe derart einge- stellt werden, dass in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen Amplifikationsreaktion gemäß Schritt d) 0 bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vorbestimmte Sequenz eine Nukleinsäuresequenz, bevorzugt ein Chromosom, ein Gen oder ein Genabschnitt, ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion eine PCR ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzprobe bezüglich der vorbestimmten Sequenz einen bekannten Genotyp aufweist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzprobe eine bekannte Kopienzahl der vorbestimmten Sequenz aufweist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) und in Schritt d) eine bei der Durchführung einer PCR zu einem "allelic dropouf führende Menge an biologischer Probe und Referenzprobe bereitgestellt/ eingesetzt wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspräche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte biologische Probe und die in Schritt d) eingesetzte Referenzprobe weniger als 100 pg DNA, bevorzugt weniger als 50 pg DNA, besonders bevorzugt weniger als 10 pg DNA und ganz besonders bevorzugt weniger als 5 pg DNA umfassen.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in Schritt a) bereitgestellte biologische Probe und die in Schritt d) eingesetzte Referenzprobe weniger als 100 Zellen, be- vorzugt weniger als 10 Zellen, besonders bevorzugt weniger als 5 Zellen und ganz besonders bevorzugt 1 Zelle umfassen.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bedingungen der Amplifikationsreaktionen und die Menge der eingesetzten biologischen Probe sowie der Referenzprobe derart gewählt werden, dass in der wenigstens einen Amplifikati- onsreaktion gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen Amplifikations- reaktion gemäß Schritt d) 20 bis 80%, bevorzugt 30 bis 70%, besonders bevorzugt 40 bis 60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% der theore- tisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) und/oder in Schritt d) jeweils genau eine Amplifikationsreaktion durchgeführt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine PCR gemäß Schritt b) und die wenigstens eine PCR gemäß Schritt d) zeitlich zueinander versetzt durchgeführt werden, wobei die wenigstens eine PCR gernäß Schritt d) vorzugsweise vor der wenigstens einen PCR gemäß Schritt b) durchgeführt wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge- kennzeichnet, dass in Schritt b) und/ oder in Schritt d) für jede der wenigstens einen Amplifikationsreaktion eine Mehrfachbestimmung durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) eine Verdünnungsreihe der biologischen Probe bereitgestellt und mit jeder Verdünnungs stufe in Schritt b) wenigstens eine PCR durchgeführt wird und /oder in Schritt d) eine Verdünnungsreihe der Referenzprobe erstellt und mit jeder Verdünnungsstufe wenigstens eine PCR durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen mit der biologischen Probe und /oder der Referenzprobe in Schritt c) und/ oder Schritt e) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten der Mittelwert gebildet wird und ggf. die Standardabweichung bestimmt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion in Schritt b) und/oder in Schritt d) 2 bis 1.000 mal, bevorzugt 2 bis 50 mal, besonders bevorzugt 2 bis 20 mal und ganz besonders bevorzugt 5 bis 10 mal durchgeführt wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe vor Durchführung des Ver- fahrensschritts a) und/oder die Referenzprobe vor Durchführung des Verfahrensschritts d) mit einer unspezifischen PCR amplifiziert wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich zu amplifizieren.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und /oder nicht homologe hochpolymorphe Sequenzen zu amplifizieren.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche aus der aus STR- Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinati- onen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren, welche im Genom des Spenders jeweils pro Allel nur einmal vorkommen.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens eine Amplifikationsreaktion dazu angepasst ist, zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, be- sonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe und/ oder die Referenzprobe 20 bis 1.000 Kopien an der vorbestimmten Sequenz aufweist.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die An- bzw. Abwesenheit von Amplifϊkationspro- dukte mittels Gelelektrophorese, mittels einer Hybridisierungstechnik auf einem DNA-Array, einem Bead-System oder einer anderen optischen, elektrischen oder elektrochemischen Messung erfolgt.
24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte nach der Amplifikationsreaktion die An- bzw. Abwesenheit der einen oder wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologen Sequenzen sowie von den erhaltenen Amplifikationsprodukten ein zweiter physikalisch und/ oder chemisch messbarer Parameter bestimmt wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homolo- gen Sequenzen STR- Abschnitte und/ oder VNTR- Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Länge der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Länge entspricht.
26= Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet* dass die
Länge der Amplifikationsprodukte mit Kapillarelektrophorese bestimmt wird.
27. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die eine oder wenigstens zwei zueinander homologen und/ oder nicht homologe Sequenzen SNP-Abschnitte sind und als zweiter Parameter die Sequenz der erhaltenen Amplifikationsprodukte bestimmt wird, wobei die Anzahl der erhaltenen unterschiedlichen Amplifikationsprodukte der Anzahl der erhaltenen Amplifikationsprodukte mit sich unterscheidender Sequenz entspricht.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die
Sequenz der Amplifikationsprodukte durch DNA-Sequenzierung oder ein Hybridisierungsverfahren bestimmt wird.
29. Verfahren zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl wenigstens einer vorbestimmten Nukleinsäuresequenz und dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen einer biologischen Probe mit zu bestimmender Kopienzahl an der wenigstens einen vorbestimmten Sequenz, wobei die biologische Probe zwischen 1 und 100 Zellen und/oder zwischen 1 pg und 100 pg chromosomale DNA umfasst, b) Durchführen wenigstens einer PCR, wobei die wenigstens eine PCR daran angepasst ist, eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst und aus der aus STR-Abschnitten, VNTR- Abschnitten, SNP-Abschnitten und beliebigen Kombinationen hier- von bestehenden Gruppe ausgewählt sind, zu amplifizieren, c) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten, d) Durchführen wenigstens einer PCR mit einer Referenzprobe vorzugsweise mit einer bekannten Menge der vorbestimmten Sequenz unter denselben Reaktionsbedingungen wie der in Schritt b) eingesetzten wenigstens einen PCR, e) Bestimmen der in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) erhaltenen Anzahl an unterschiedlichen PCR-Produkten und f) Vergleichen der Anzahl der bei der mit der biologischen Probe durchgeführten wenigstens einen PCR erhaltenen unterschiedlichen
PCR-Produkte von Schritt c) mit der Anzahl an mit der Referenzprobe erhaltenen unterschiedlichen PCR-Produkten gemäß Schritt e), wobei g) die Bedingungen der PCR und die Menge der eingesetzten biologi- sehen Probe sowie der Referenzprobe derart eingestellt werden, dass in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt b) und in der wenigstens einen PCR gemäß Schritt d) 0 bis 90% der theoretisch möglichen Anzahl an unterschiedlichen Amplifikationsprodukten erhalten werden.
30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass parallel zu der wenigstens einen Amplifikations- reaktion gemäß Schritt b) und/ oder Schritt d) eine Amplifikationsreaktion unter gleichen Bedingungen mit einer Kontrollprobe durchgeführt wird.
31. Kit zur relativen quantitativen Bestimmung der Anzahl einer vorbestimmten Sequenz und ggf. dazu homologer Sequenzen in einer biologischen Probe, insbesondere zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 30, umfassend: a) wenigstens zwei Primerpaare, welche dazu angepasst sind, in wenigstens einer PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen, die von der vorbestimmten Sequenz umfasst sind, zu amplifizieren, b) eine Referenzprobe mit einer bezüglich der vorbestimmten Sequenz bekannten Kopienzahl und/ oder das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion, wobei die Kopienzahl so gewählt war, dass das Amplifikationsprodukt mit ei- ner Wahrscheinlichkeit von weniger als 90% entstand, c) ggf. PCR-Puffer und d) ein Protokoll für die Durchführung der wenigstens einen PCR mit der biologischen Probe und ggf. der Referenzprobe.
32. Kit nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare dazu angepasst sind, in der wenigstens einen PCR eine oder wenigstens zwei zueinander homologe und/ oder nicht homologe Sequenzen aus dem nicht kodierenden DNA-Bereich, bevorzugt hochpo- lymorphe zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen, wel- che besonders bevorzugt aus der aus STR-Sequenzen, VNTR-Sequenzen, SNP-Sequenzen und beliebigen Kombinationen hiervon bestehenden Gruppe ausgewählt sind, 2x1 amplifizieren.
33. Kit nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß d) daran angepasst ist, in der wenigstens einen PCR zwischen 2 und 100, vorzugsweise zwischen 2 und 20, besonders bevorzugt zwischen 3 und 15 und ganz besonders bevorzugt zwischen 5 und 12 zueinander homologe und /oder nicht homologe Sequenzen zu amplifizieren.
34. Kit na.ch einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Primerpaare gemäß a) und/ oder das Protokoll gemäß d) daran angepasst ist, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens einen PCR für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen Sequenzen zwischen 0 und 90%, bevorzugt zwischen 20 und 80%, besonders bevorzugt zwischen 30 und 70%, ganz besonders bevorzugt zwischen 40 und 60% und höchst bevorzugt etwa 50% beträgt.
35. Kit nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die dieses das Ergebnis wenigstens einer, unter den gleichen wie in dem Protokoll gemäß d) vorgeschrieben, durchgeführten Amplifikationsreaktion enthält, wobei die Kopienzahl so gewählt war, dass die relative Häufigkeit für eine positive Amplifikationsreaktion der wenigstens ei- nen Amplifikationsreaktion für die eine oder jede der wenigstens zwei zueinander homologen Sequenzen zwischen 20 und 80%, bevorzugt zwischen 30 und 70%, besonders bevorzugt zwischen 40 und 60% und ganz besonders bevorzugt etwa 50% betrug.
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