DE69626111T2

DE69626111T2 - Universale primersequenz zur multiplex dna amplifikation

Info

Publication number: DE69626111T2
Application number: DE69626111T
Authority: DE
Inventors: P. Shuber
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2016-06-07
Also published as: DE69626111D1; AU6163696A; US6207372B1; EP0832290B1; JPH11507226A; AU703417B2; CA2223729C; US5882856A; WO1996041012A1; CA2223729A1; ATE232242T1; EP0832290A1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft universelle Primer zur Verwendung bei der Amplifikation von DNA-Sequenzen durch Verfahren wie Polymerase-Kettenreaktion (PCR), insbesondere Primer, die die gleichzeitige Amplifikation einer Menge von DNA- Sequenzen ermöglichen.

Hintergrund der Erfindung

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, mit dem praktisch jede DNA- Sequenz selektiv amplifiziert (vervielfältigt) werden kann. Das Verfahren beinhaltet die Verwendung von Paaren von Oligonucleotiden mit vorbestimmter Sequenz, die mit entgegengesetzten DNA-Strängen hybridisieren und die Grenzen der zu amplifizierenden Sequenz definieren. Die Oligonucleotide dienen als Primer für mehrere aufeinanderfolgende Cyclen der DNA-Synthese, die durch eine thermostabile DNA-Polymerase katalysiert werden. Jeder Synthesecyclus ist typischerweise durch einen Schritt des Schmelzens und Reassoziierens abgetrennt, was es ermöglicht, eine gegebene DNA-Sequenz in weniger als einer Stunde mehrhundertfach zu vervielfältigen (Saiki et al., Science 239: 487, 1988).
Aufgrund der schnellen Fortschritte in der Säuger-Molekulargenetik wurde eine steigende Zahl von Krankheitsgenen identifiziert. Dementsprechend hat PCR eine weit verbreitete Verwendung für die Diagnose von vererbten Störungen und der Prädisposition für Krankheiten erlangt. Typischerweise wird der interessierende Bereich entweder von genomischer DNA oder von einer Quelle für spezifische cDNA, die das zugehörige Genprodukt codiert, amplifiziert. Dann werden Mutationen oder Polymorphismen identifiziert, indem man die amplifizierte DNA Analysetechniken unterwirft, wie DNA-Sequenzierung, Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonucleotiden (ASOs), Oligonucleotid-Ligasierung, Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen oder SSCP-Analyse (single-strand conformational polymorphism = Einzelstrangkonformationspolymorphismus).
Für die Analyse von kleinen Genen und Transcripten oder von Genen, von denen das mutante Allel oder der Polymorphismus gut charakterisiert sind, ist die Amplifikation eines einzigen definierten DNA-Bereichs zuweilen ausreichend. Wenn man große Gene und Transcripte oder undefinierte Gene analysiert, sind jedoch häufig mehrere individuelle PCR-Reaktionen erforderlich, um kritische Basenänderungen oder Deletionen zu identifizieren. Um die Analyse großer komplexer Gene effizienter zu machen, wird also Multiplex-PCR verwendet (d. h. die gleichzeitige Amplifikation von verschiedenen Ziel-DNA-Sequenzen in einer einzigen PCR-Reaktion).
Die mit Multiplex-PCR erhaltenen Ergebnisse werden jedoch häufig durch Artefakte des Amplifikationsverfahrens kompliziert. Dazu gehören "falsche negative" Ergebnisse aufgrund eines Versagens der Reaktion und "falsche positive" Ergebnisse, wie die Amplifikation von falschen Produkten, was durch die Assoziation der Primer an Sequenzen verursacht sein kann, die mit den wahren Erkennungssequenzen verwandt, doch von ihnen verschieden sind.
Zur Verwendung in der Multiplex-PCR sollte ein Primer so gestaltet sein, dass seine vorhergesagte Hybridisierungskinetik ähnlich ist wie die der anderen Primer, die in derselben Multiplexreaktion verwendet werden. Während die Assoziationstemperaturen und Primerkonzentrationen bis zu einem gewissen Grad berechnet werden können, müssen die Bedingungen im Allgemeinen für jede Multiplexreaktion empirisch bestimmt werden. Da die Möglichkeit einer unspezifischen Auslösung mit jedem zusätzlichen Primerpaar zunimmt, müssen die Bedingungen nach Bedarf modifiziert werden, wenn einzelne Primerpaare hinzugefügt werden. Außerdem werden Artefakte, die aus dem Wettbewerb um Ressourcen resultieren (z. B. Abreicherung von Primern), in der Multiplex-PCR verstärkt, da Unterschiede in den Ausbeuten von ungleich amplifizierten Fragmenten mit jedem Cyclus verstärkt werden.
Weighardt et al. (PCR Meth. App. 3: 77, 1993) beschreiben die Verwendung von Oligonucleotiden mit einem 5'-Schwanz für die PCR. Ein entscheidendes Merkmal dieses Amplifikationsverfahrens beinhaltet jedoch getrennte Assoziations- und Primerverlängerungsreaktionen für jeden Primer, was im Multiplex-Kontext nicht praktizierbar ist. Daher kann die vollständige Optimierung der Reaktionsbedingungen für die Multiplex-PCR arbeitsintensiv und zeitraubend werden. Da verschiedene Multiplex-PCRs jeweils einzigartige Reaktionsbedingungen haben können, kann die Entwicklung neuer diagnostischer Tests sehr kostspielig werden.
In der Technik besteht also ein Bedürfnis nach Primern, die die Gestaltung und Durchführung von Multiplex-PCR-Reaktionen ohne aufwändige Optimierungsschritte ermöglichen, unabhängig von den potentiell divergenten Eigenschaften der verschiedenen verwendeten Primer. Weiterhin besteht in der Technik ein Bedürfnis nach Primern, die Multiplex-PCR-Reaktionen ermöglichen, welche unter denselben Reaktionsbedingungen gleichzeitig äquivalente Mengen von jedem von vielen Amplifikationsprodukten erzeugen.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Primer, die die gleichzeitige Amplifikation von mehreren in einer DNA-Probe vorhandenen DNA-Zielsequenzen ermöglichen. Gemäß der Erfindung wird die DNA-Probe in einem einzigen Reaktionsgemisch mit einer Menge von gepaarten Oligonucleotidprimern mit der Struktur 5'-XY-3' in Kontakt gebracht, wobei X eine Sequenz umfasst, die nicht mit der Zielsequenz hybridisiert, die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen X und seinem Komplement in Abwesenheit anderer Sequenzen größer als etwa 60ºC ist und Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb der Zielsequenz oder ihrem Komplement enthalten ist oder diese flankiert.
Danach werden mehrere Cyclen des Schmelzens, der Reassoziation und DNA- Synthese (d. h. eine PCR-Reaktion) mit der oben genannten DNA-Probe und den Oligonucleotidprimern der Erfindung durchgeführt. Dann können amplifizierte Zielsequenzen nach einem beliebigen Verfahren nachgewiesen werden, einschließlich zum Beispiel der Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonucleotiden, Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen oder SSCP-Analyse (single-strand conformational polymorphism = Einzelstrangkonformationspolymorphismus).
Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Nachweis von mehreren definierten Ziel-DNA-Sequenzen in einer DNA-Probe. Dieses Verfahren wird durchgeführt, indem man dasselbe Verfahren durchführt, wie es oben dargelegt ist, wobei die 3'-Sequenz eines Primers jedes Paars eine Ziel-DNA-Sequenz selbst oder ihr Komplement umfasst. Das Verfahren beinhaltet einen weiteren Schritt des Nachweisens der Amplifikationsprodukte, vorzugsweise durch Gel-Elektrophorese, In dieser Ausführungsform ist die An- oder Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts diagnostisch für die An- oder Abwesenheit der Zielsequenz in der ursprünglichen DNA-Probe.
In einem anderen Aspekt umfasst die Erfindung Verfahren zum genetischen Screening mit hohem Durchsatz. Das Verfahren, das den schnellen und gleichzeitigen Nachweis von mehreren definierten Ziel-DNA-Sequenzen in DNA- Proben, die von einer Menge von Individuen erhalten wurden, ermöglicht, wird durchgeführt, indem man gleichzeitig viele verschiedene Zielsequenzen aus einer großen Zahl von Patienten-DNA-Proben amplifiziert, wobei man Oligonucleotidprimerpaare wie oben verwendet.
In noch einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einzelsträngige Oligonucleotid-DNA-Primer für die Amplifikation einer Ziel-DNA-Sequenz in einer Multiplex-Polymerase-Kettenreaktion bereit. Die Primer haben die Struktur 5'-XY-3', wobei X eine Primersequenz der Erfindung umfasst und Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb einer Zielsequenz oder ihrem Komplement enthalten ist oder diese flankiert. Typischerweise umfasst Y eine Sequenz mit einer Länge von 17 bis 25 Basen, vorzugsweise von 17 bis 20 Basen, und die Schmelztemperatur von Hybriden zwischen den Primern und ihren Komplementen beträgt wenigstens 72ºC.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auf die Diagnose von genetischen und Infektionskrankheiten, Geschlechtsbestimmung, Analyse genetischer Verknüpfung und forensische Studien angewendet werden.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Tabelle, in der ampliconspezifische Oligonucleotid-Primersequenzen aufgeführt sind.
Fig. 2 zeigt die Agarose-Gel-Analyse der Primerkonzentration und der Assoziationstemperatur für die Amplifikation des CFTR-Exons 21.
Fig. 3 zeigt die Agarose-Gel-Analyse der CFTR-15-plex-Ampliconorganisation.
Fig. 4 zeigt einen Gelvergleich von chimärischen Primern mit sequenzspezifischen Primern für die CFTR-15-plex-PCR-Amplifikation.
Fig. 5 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen mehrerer Genloci, die in einem einzigen PCR-Thermocycler unter identischen Reaktionsbedingungen und Cyclusparametern durchgeführt wurden.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse von Amplifikationen mehrerer Genloci, die in einem einzigen PCR-Thermocycler unter identischen Reaktionsbedingungen und Cyclusparametern durchgeführt wurden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die hier beschriebenen Verfahren der Erfindung stellen ein Amplifikationssystem für Multiplex-PCR bereit, das auf der Verwendung chimärischer Primer beruht, die am 5'-Ende mit einer nicht verwandten Sequenz von 20 Nucleotiden (UPS) markiert ist. Die unten angegebenen Beispiele zeigen, dass mehrere genomische Sequenzen unter identischen Reaktionsbedingungen und Cyclusparametern gemeinsam amplifiziert werden können, mit nur sehr wenig Optimierung der PCR-Bedingungen. Unter Verwendung von Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung kann eine hochspezifische und -effiziente Amplifikation von Zielsequenzen leicht und reproduzierbar durch einfache Einstellung der individuellen Primerkonzentrationen ohne zusätzliche Modifikation der Reaktionskomponenten oder der Assoziationstemperaturen erreicht werden.
Chimärische Primer der Erfindung ergaben saubere, visuell nachweisbare PCR- Profile über einen achtfachen Bereich von Matrizen-DNA-Konzentrationen (siehe Beispiele). Überdies werden durch das hohe Niveau der Konsistenz in Bezug auf die relativen Bandenintensitäten die Aussagekraft erhöht und die Interpretation der Ergebnisse vereinfacht.
Die erhöhte Spezifität und Effizienz, die durch Verwendung von chimärischen Primern der Erfindung erreicht wird, ist auf eine Standardisierung der Hybridisierungskinetik zurückzuführen. Während der frühen Cyclen der PCR werden Moleküle synthetisiert, die die markierten Primer an ihren 5'-Enden enthalten. Daher haben alle synthetisierten Amplicons in allen anschließenden Amplifikationscyclen identische 20-bp-Primersequenzen mit der vorhergesagten Hybridisierungskinetik der Markierung in Form der universellen Primersequenz (UPS). Weiterhin schreitet aufgrund des äußerst GC-reichen Bereichs am 5'-Ende der UPS- Sequenzen der Erfindung die Keimbildung unter PCR-Bedingungen, die für die UPS-Markierung optimal sind, in einer primerorientierten 5'→3'-Richtung fort. Außerdem hat jedes chimärische Primerpaar einen 3'-sequenzspezifischen Bereich mit einem internen Stabilitätsprofil (ΔG) für die Primer-Duplexierung, das niedriger ist als für die UPS-Markierung. Daher dienen chimärische Primer, die ein Gesamt-Tm haben, das erheblich größer als 72ºC ist, als hocheffiziente und doch stringente Erkennungssequenzen für die anschließenden Cyclen der PCR.
Durch die Standardisierung der Hybridisierungskinetik haben die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung die Notwendigkeit, unterschiedliche Reaktionsbedingungen und Cyclusparameter zu bewerten, weitgehend beseitigt. Daher liefert die Verwendung von UPS-markierten Primern der Erfindung ein weniger kostspieliges Verfahren bezüglich Polymerase, Arbeit und Zeit und sollte die Entwicklung von komplexen Multiplex-PCRs zur Verwendung in neuen diagnostischen Tests stark vereinfachen.

Definitionen:

1. Der hier verwendete Ausdruck "Amplifikation" von DNA bezeichnet die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Erhöhung der Konzentration einer besonderen DNA-Sequenz innerhalb eines Gemischs von DNA- Sequenzen. Ein "Amplicon" ist eine Ziel-DNA-Sequenz, die durch PCR amplifiziert wird.
2. Der hier verwendete Ausdruck "Multiplex-PCR" bezeichnet die gleichzeitige Amplifikation von mehreren Ziel-DNAs in einem einzigen Gemisch für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
3. "Hoher Durchsatz" bezeichnet die Fähigkeit, eine große Zahl von DNA-Proben (z. B. über 100 genomische DNAs) gleichzeitig schnell und ökonomisch zu verarbeiten und einem Screening zu unterziehen sowie große Zahlen von unterschiedlichen Genloci innerhalb einer einzigen DNA-Probe gleichzeitig einem Screening zu unterziehen.
4. Der hier verwendete Ausdruck "Tm" bezeichnet die Schmelztemperatur (Temperatur, bei der 50% des Oligonucleotids einen Duplex bilden) des Oligonucleotids, die unter Verwendung der nächst benachbarten (nearest-neighbor) thermodynamischen Werte von Breslauer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3746- 3750, 1986) für DNA und Freier et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9373- 9377, 1986) für RNA berechnet wird.
5. Der hier verwendete Ausdruck "ΔG" bezeichnet die freie Enthalpie für das Oligonucleotid, berechnet nach dem Nearest-Neighbor-Verfahren von Breslauer et al. (DNA) bzw. Freier et al. (RNA). Die freie Enthalpie wird berechnet durch die Formel: G = H - TS, wobei H die Enthalpie ist, S die Entropie ist und T die Temperatur ist. Die freie Enthalpie ist ein Maß für die Stabilität; je größer der negative Wert, desto stabiler ist der durch das Oligonucleotid gebildete Duplex.
Die vorliegende Erfindung umfasst Verfahren und Zusammensetzungen, die die effiziente und im Wesentlichen gleichzeitige Amplifikation von verschiedenen Ziel-DNA-Sequenzen in einer einzigen Polymerase-Kettenreaktion (d. h. Multiplex-PCR) ermöglichen. Vorzugsweise werden äquivalente Mengen jedes Amplifikationsprodukts erhalten. Das Verfahren verwendet neue chimärische Oligonucleotidprimer, die die technischen Schwierigkeiten bei der Multiplex-PCR, die zu einer ungleichen Amplifikation verschiedener Zielsequenzen in demselben Reaktionsgemisch führen, umgehen.
Bei einer Standard-PCR-Reaktion, bei der mehr als ein einziges Paar von Oligonucleotidprimern eingesetzt wird, bedeutet die obligatorische Vorgabe einer einzigen Menge von Reaktionsbedingungen zum Beispiel im Allgemeinen, dass eines der Primerpaare effizienter als Primer wirkt, was bewirkt, dass die durch dieses Primerpaar spezifizierte Zielsequenz in den frühen Cyclen der Amplifikation selektiv amplifiziert wird. Weiterhin werden die effizienteren Primer auch früher aus der Reaktion abgereichert als die weniger effizienten, was zu einer erhöhten Akkumulation von unspezifischen Amplifikationsprodukten in späteren Amplifikationscyclen führt. Diese Probleme werden natürlich größer, wenn man mehrere Primerpaare (> 3-4) in einer einzigen Reaktion verwenden möchte.
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umgehen diese Probleme durch Vorgabe eines gleichmäßig hohen Grades der Spezifität für die Assoziationsreaktionen, die zwischen verschiedenen Primern, die in dem Gemisch vorhanden sind, und ihren zugehörigen Zielsequenzen in der DNA-Matrize stattfinden. Während der frühen Cyclen der Amplifikation werden Produkte synthetisiert, die an beiden Enden die chimärischen Primer enthalten. Die chimärischen Primer dienen dann als Erekennungssequenzen hoher Stringenz für anschließende Amplifikationscyclen. Dies führt zu einer Standardisierung der Assoziationseffizienz verschiedener Primer und ihrer zugehörigen Zielsequenzen und standardisiert also auch den Amplifikationsgrad verschiedener Targets.

Primergestaltung

Multiplex-PCR gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet chimärische Oligonucleotidprimer, die zwei Domänen beinhalten. Die 5'-"Hälfte" jedes Primers kann jede Sequenz mit einer Länge zwischen 17 und 25 Basen, vorzugsweise 17 bis 20 Basen, die nicht mit der Ziel-DNA verwandt ist, umfassen und hat die Eigenschaft, Hybride mit relativ hohen Schmelztemperaturen (z. B. TmS > 60ºC in Abwesenheit anderer Sequenzen) zu bilden. Bei einigen Anwendungen, wenn die Ziel-DNA-Sequenz in eine Sequenz mit geringer Komplexität (d. h. < 108 bp) eingebettet ist, können Primer verwendet werden, die Hybride mit niedrigeren Schmelztemperaturen bilden.
In einer Ausführungsform umfasst die 5'-Sequenz
Diese Sequenz, die als "universelle Primersequenz" (UPS) bezeichnet wird, ist von dem Bakteriophagenvektor M13mp18 (Messing J., Meth. Enzymol. 101: 20, 1983) abgeleitet. Alternative Ausführungsformen der universellen Primersequenzen der Erfindung für die 5'-Sequenz umfassen die folgenden Oligonucleotide:
Die 3'-"Hälfte" jedes Primers umfasst eine zielspezifische Sequenz, d. h. eine Sequenz, die in der Ziel-DNA oder ihrem Komplement entweder vorhanden oder potentiell vorhanden ist. Diese 3'-Sequenzen können ohne Einschränkung jede solche Sequenz von 17-25 Basen und vorzugsweise 20 Basen umfassen, unabhängig von den Schmelztemperaturen der zwischen der isolierten Sequenz und ihrem Komplement gebildeten Hybride.
In einer Ausführungsform soll die 3'-Hälfte des Primers mit einer genomischen Sequenz hybridisieren, die die interessierende Zielsequenz flankiert; in diesem Fall wird der Primer verwendet, um die Zielsequenz für anschließende diagnostische Tests, wie z. B. Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonucleotiden, Spaltung mit Restriktions-Endonucleasen oder SSCP-Analyse, zu amplifizieren. Zu diesem Zweck muss die 3'-Hälfte des Primers einer Sequenz, von der bekannt ist, dass sie in allen zu testenden DNA-Proben vorhanden ist, (oder ihrem Komplement) entsprechen. Nichteinschränkende Beispiele für 3'-Primerhälften, die für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in Fig. 1 gezeigt.
In einer anderen Ausführungsform dient die Amplifikationsreaktion selbst als entscheidender Diagnoseschritt. In diesem Fall entspricht die 3'-Sequenz des Primers einer definierten Wildtypversion eines besonderen Amplicons oder seinem Komplement (oder einer Variantenversion seines Komplements), dessen An- oder Abwesenheit getestet wird. Wenn solche allelspezifischen Sequenzen in chimärische PCR-Primer gemäß der vorliegenden Erfindung eingebaut werden und die chimärischen Primer in Amplifikationsreaktionen verwendet werden, gilt die Abwesenheit eines gegebenen Amplifikationsprodukts als definitiv für die Abwesenheit des Allels in der getesteten DNA-Probe.
Zur Verwendung in einer gegebenen Multiplex-PCR-Reaktion werden die zielspezifischen Primersequenzen typischerweise als Gruppe analysiert, um das Potential für eine zufällige Dimerbildung zwischen verschiedenen Primern zu bewerten. Diese Bewertung kann durch Verwendung von kommerziell erhältlichen Computerprogrammen für die Sequenzanalyse, wie Gene Runner, Hastings Software Inc., erreicht werden. Andere Variablen, wie die bevorzugten Konzentrationen von Mg²&spplus;, dNTPs, Polymerase und Primern, werden unter Verwendung von in der Technik wohlbekannten Verfahren optimiert (Edwards et al., PCR Meth. App. 3: 565, 1994).

DNA-Matrizen

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung kann jede DNA- Probe verwendet werden, einschließlich unter anderem eukaryontische, prokaryontische und virale DNA. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Ziel- DNA eine Probe von genomischer DNA dar, die aus einem Patienten isoliert wurde. Diese DNA kann aus einer beliebigen Zellquelle oder Körperflüssigkeit erhalten werden. Nichteinschränkende Beispiele für Zellquellen, die in der klinischen Praxis verfügbar sind, sind Blutzellen, Wangenepithelzellen, Zervikovaginalzellen, Epithelzellen aus Urin, fetale Zellen oder beliebige Zellen, die in durch Biopsie erhaltenem Gewebe vorhanden sind. Zu den Körperflüssigkeiten gehören Blut, Urin, Liquor, Sperma und Gewebeexsudate an der Stelle einer Infektion oder Entzündung. DNA wird unter Verwendung irgendeines der zahlreichen Verfahren, die in der Technik Standard sind, aus der Zellquelle oder Körperflüssigkeit extrahiert. Man wird sich darüber im Klaren sein, dass das besondere Verfahren, das zum Extrahieren der DNA verwendet wird, von der Natur der Quelle abhängen wird. Die bevorzugte Menge der zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung zu extrahierenden DNA beträgt wenigstens 5 pg (entsprechend etwa 1 Zelläquivalent einer Genomgröße von 4 · 10&sup9; Basenpaaren).

Multiplex-PCR-Reaktionsbedingungen

Bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung wird eine DNA- Probe unter Bedingungen, die für eine Polymerase-Kettenreaktion geeignet sind, mit Paaren von chimärischen Oligonucleotidprimern in Kontakt gebracht. Es können Standard-PCR-Reaktionsbedingungen verwendet werden, z. B. 1,5 mM MgCl&sub2;, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 200 uM Desoxynucleotidtriphosphate (dNTPs) und 25-100 E/ml Taq-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT).
Die Konzentration jedes chimärischen Primers in dem Reaktionsgemisch kann im Bereich von etwa 0,05 bis etwa 4 uM liegen. Die optimale Konzentration für Primer wird bewertet, indem man einzelne PCR-Reaktionen durchführt, bei denen jedes Primerpaar individuell verwendet wird. In ähnlicher Weise wird jedes Primerpaar unabhängig bewertet, um zu bestätigen, dass alle in einer einzigen Multiplex-PCR-Reaktion zu verwendenden Primerpaare dieselben Amplifikationsbedingungen (d. h. Temperatur, Dauer der Assoziations- und Verlängerungsschritte) erfordern. Es hat sich gezeigt (siehe Beispiel unten), dass alle chimärischen Primer, die die von M13 abgeleitete UPS als 5'-Hälfte ihrer Sequenz enthielten, in einem breiten Bereich von Assoziationstemperaturen (d. h. 50- 60ºC) verwendet werden konnten.
Multiplex-PCR-Reaktionen werden unter Verwendung von manuellen oder automatischen Temperaturcyclen durchgeführt. Jeder kommerziell erhältliche Thermocycler kann verwendet werden, wie z. B. Perkin-Elmer 9600 Cycler.
Schließlich werden die Reaktionsprodukte analysiert, wobei man irgendeines von mehreren Verfahren, die in der Technik wohlbekannt sind, verwendet. Vorzugsweise wird Agarose-Gel-Elektrophorese verwendet, um jede der amplifizierten Sequenzen rasch abzutrennen und zu identifizieren. In einer Multiplexreaktion sind die verschiedenen amplifizierten Sequenzen vorzugsweise von unterschiedlicher Größe und können also in einem einzigen Gel getrennt werden. In einer Ausführungsform wird das Reaktionsgemisch vor der Elektrophorese mit einer oder mehreren Restriktions-Endonucleasen behandelt. Alternative Verfahren der Produktanalyse umfassen ohne Einschränkung die Dot-Blot-Hybridisierung mit allelspezifischen Oligonucleotiden und die SSCP.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter veranschaulichen, ohne ihren Umfang einzuschränken.

Beispiel 1: Primergestaltung

Sequenzspezifische Primer wurden ohne Rücksicht auf Haarnadelbildung so gewählt, dass sie ein berechnetes ΔG für die Primer-Duplexbildung von unter -10 kcal/mol hatten. Das nach dem A+T/G+C-Verfahren bestimmte Tm dieser Primer liegt im Bereich von 52 bis 68ºC. Um die potentielle Primerdimerbildung innerhalb eines Primerpaars zu bewerten, wurden Primerpaare unter Verwendung der Software Amplify 1.2 (University of Wisconsin, Department of Genetics, Madison, WI) analysiert. Die universelle Primersequenz (UPS)
stammt vom Bakteriophagen M13mp18.
Die UPS-markierten Primer enthalten die 20 Nucleotide umfassend UPS- Sequenz, die an das 5'-Ende der in Fig. 1 aufgeführten einzelnen sequenzspezifischen Primer gebunden ist.
Oligonucleotidprimer wurden von Operon Technologies (Alameda, CA) synthetisiert. Oligonucleotide wurden durch HPLC gereinigt und durch Spektrophotometrie quantifiziert.

Beispiel 2: DNA-Präparation

Vollblutproben wurden in Hochglucose-ACD-VacutainernTM (Becton Dickinson & Co., Franklin Lanes, NJ) gesammelt. Nach der Zentrifugation wurde die Leucocytenschicht aufgefangen und durch zweimaliges Waschen mit einer 10 : 1 (v/v) Lösung von 14 mM NH&sub4;Cl und 1 mM NaHCO&sub3; lysiert. Die Lymphocyten wurden durch Zentrifugation geerntet, in Lysepuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,4 M NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% SDS, 500 ug/ml Proteinase K) resuspendiert und über Nacht bei 37ºC inkubiert. Dann wurden Proben mit 1/4 Volumen gesättigtem NaCl extrahiert, und die DNA wurde durch Ethanolfällung gewonnen. Das endgültige DNA-Sediment wurde mit 70% Ethanol gewaschen, an der Luft getrocknet und in TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) gelöst.
Wangenepithelzellenproben wurden erhalten, indem man den Belag der Mundhöhle 30 Sekunden lang mit einem sterilen Cytologiepinsel (Scientific Products #S7766-1a) abpinselte. DNA wurde präpariert, indem man die Pinsel in 1,2-ml- 96-Napf-Polypropylenröhrchen (USA/Scientific Plastics, Ocala, Florida) in 600 ul 50 mM NaOH eintauchte, und mit einem Vortexmischer behandelt. Die Röhrchen, die noch die Pinsel enthielten, wurden 5 min lang auf 95ºC erhitzt, und die Pinsel wurden vorsichtig entfernt. Die Lysate wurden mit 60 ul 1 M Tris-HCl (pH 8,0) neutralisiert und mit einem Vortexmischer behandelt. Die Proben wurden bei 4ºC gelagert.

Beispiel 3: Amplifikationsreaktionen

Einzelne Amplifikationen wurden durchgeführt, wobei man 4 ul (1-2 ug) bzw. 10 ul (5-50 ng) genomische DNA verwendete, die entweder aus Blut oder aus Wangenepithelzellen präpariert wurde. 50-ul-Reaktionsgemische wurden in 1X PCR-Puffer (10 mM Tris-HOI, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl&sub2;), 200 uM dNTPs und 2,5 Einheiten Taq-Polymerase (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt.
Multiplex-PCR-Reaktionen wurden in einem Volumen von 100 ul unter denselben Bedingungen durchgeführt, außer dass 10 Einheiten Taq-Polymerase pro Reaktion verwendet wurden.
Um die Verwendung von markierten Primern in der Multiplex-PCR zu demonstrieren, wurden die in Fig. 1 vorgestellten 32 Primerpaare entweder allein oder als chimärische Primer, die am 5'-Ende eine Markierung von 20 Nucleotiden enthielten (GCGGTCCCAAAAGGGTCAGT), die der M13mp18-Universalprimersequenz (UPS) entsprach, eingesetzt. Das Tm für alle chimärischen Primer wurde zu über 72ºC berechnet.
Die Primerkonzentrationen lagen im Bereich von 0,25 bis 1,0 uM. Amplifikationen wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer 9600 Thermocycler (Perkin- Elmer, Norwalk, CT) während 28 Cyclen mit Gradient durchgeführt (Schmelzen bei 94ºC während 10 s, Assoziation bei 50ºC, 55ºC, 60ºC oder 65ºC während 10 s und Verlängerung bei 72ºC während 10 s).
Nach Beendigung der Reaktion wurden 8 ul der Reaktionsprodukte direkt auf ein mit 2% Ethidiumbromid angefärbtes Agarose-Gel geladen und 90 Minuten lang einer Elektrophorese bei 250 Volt unterzogen. Die Amplifikationsprodukte wurden mit einem UV-Durchleuchter sichtbar gemacht und mit einem Alpha Innotech IS-500 Digital Imaging System, Version 1.97 (Sun BIO Science, Inc., Branford, CT) photographiert.
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirkungen des Einbaus von Primersequenzen der Erfindung in PCR-Primer auf die Amplifikation zu demonstrieren.

Beispiel 4: Wirkung von chimärischen Primern auf die Effizienz und Spezifität der Amplifikation

Drei sequenzspezifische Primerpaare, die zum Amplifizieren des Exons 21 des CFTR-Gens (CFTR = cystic fibrosis transmembrane regulator) (Kerem et al., Science 245: 1073, 1989) verwendet wurden, sind in Fig. 2 gezeigt. Eine chimärische Version von einem der drei Primer, die die M13-UPS-Sequenz
unmittelbar 5' von den gezeigten Sequenzen enthielt, wurde synthetisiert. Die Oligonucleotide wurden unter Verwendung von herkömmlicher Chemie synthetisiert und vor der Verwendung durch HPLC (highperformance liquid chromatography) gereinigt.
Die Primer wurden einer zweifachen Verdünnungsreihe für jedes Primerpaar unterzogen (SS#1, SS#2, SS#3 und SS#3+UPS, siehe Fig. 1). Die Primerpaare SS#1, SS#2 und SS#3 sind nur sequenzspezifische Primer; SS#3+UPS ist chimärisch mit der 5'-UPS-Sequenz.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe der UPS-Markierung eine verstärkte Spezifität über einen vierfachen Bereich von Primerkonzentrationen ergibt, während die Amplifikationseffizienz bei Assoziationstemperaturen von 50 bis 65ºC beibehalten wird. Auf der Grundlage dieser und ähnlicher Analysen zusätzlicher chimärischer Primerpaare wurde eine Assoziationstemperatur von 60ºC als optimal für die PCR-Amplifikation unter Verwendung von UPS-markierten Primern bestimmt.
Die Effizienzen, mit denen die drei CFTR-Primerpaare (als SS#1, SS#2 und SS#3 bezeichnet) als Primer für eine Amplifikation wirkten, variierte mit der Primerkonzentration und der Assoziationstemperatur (Fig. 2). Die Primerkonzentrationen waren wie folgt: Spuren 1, 4, 7 und 10 (1,0 uM), Spuren 2, 5, 8 und 11 (0,5 uM) und Spuren 3, 6, 9 und 12 (0,25 uM). Die Temperaturen der Assoziation betrugen 50ºC, 55ºC, 60ºC bzw. 65ºC, wie es angegeben ist.
Die Primer SS#1 und SS#3 waren zum Beispiel bei Assoziationstemperaturen von über 60ºC merklich ineffizient. Das als SS#3-UPS bezeichnete Primerpaar, das den SS#3-Primern mit der M13-UPS-Sequenz an ihren 5-Termini entspricht, war bei allen getesteten Temperaturen als Primer hochgradig effizient; weiterhin wurden in Reaktionen, die SS#3-UPS-Primer enthielten, nur wenige falsche Amplifikationsprodukte nachgewiesen. Dagegen ergaben SS#2-Primer bei allen drei Temperaturen unterhalb von 65ºC falsche Amplifikationsprodukte.

Beispiel 5: Multiplex-Amplifikation mit chimärischen Primern

Um die Verwendung von chimärischen Primern für Multiplex-PCR zu bewerten, wurde ein System entworfen, bei dem 15 UPS-markierte Primerpaare verwendet wurden, die spezifisch für den Locus des CFTR-Gens (CFTR = cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) waren. Ein Beispiel für das Gel- Elektrophorese-Muster der Multiplex-PCR-Produkte ist in Fig. 3 gezeigt.
Wie für das Exon 21 (Fig. 2) demonstriert wurde, wurde jede chimärische Primerpaarkonzentration, die innerhalb des CFTR-15-plex verwendet wurde, bestimmt, indem man über einen Bereich von Konzentrationen unabhängige Ampliconamplifikationen durchführte. Spuren 1-3; Multiplex-Amplifikation von 3 verschiedenen genomischen DNA-Proben, die aus Blut isoliert wurden. Alle Proben wurden mit chimärischen CFTR-15-plex-Primern (siehe Fig. 1) mit den folgenden Primerpaarkonzentrationen amplifiziert: Int 19, 0,5 uM. Exon 19; 0,5 uM. Exon 21; 1,0 uM. Exon 9; 0.75 uM. Exon 13; 1,0 uM. Exon 4; 1.0 uM. Exon 17b; 0.5 uM. Exon 7; 0.5 uM. Exon 11; 1,0 uM. Exon 10; 1,0 uM. Exon 20; 0.25 uM. Exon 5; 0.5 uM. Exon 14b; 0.5 uM. Exon 12; 0.5 uM. Exon 3; 0.25 uM. Spur M; ΦX174-Hae-III-abgebaute Marker-DNA.
Unter Verwendung derselben Amplifikationsbedingungen, die ursprünglich für die einzelnen chimärischen Primerpaare definiert worden waren, ließen sich alle 15 der vorausgesagten CFTR-PCR-Produkte relativ leicht gemeinsam amplifizieren. Es sollte hervorgehoben werden, dass bei den in Fig. 3 vorgestellten CFTR- Multiplexreaktionen und allen anschließenden Reaktionen dieselben Reaktionskomponenten, Cycluszeiten und Temperaturen ohne Modifikation gegenüber den Assaybedingungen für das einzelne Amplicon eingesetzt wurden. Die einzige erforderliche Optimierung war eine Anpassung der Primerkonzentrationen für Intron 19 und Exon 19, um vergleichbare Bandenintensitäten der gemeinsam amplifizierten Produkte zu erzeugen.

Beispiel 6: Vergleich von Multiplex-PCR-Reaktionen unter Verwendung von CFTR-Primerpaaren mit und ohne M13-UPS

Um die verstärkte Spezifität und Effizienz zu demonstrieren, die sich durch die UPS-Sequenz in der Multiplex-PCR ergibt, wurden parallele Reaktionen durchgeführt, wobei man UPS-markierte CFTR-Primer und die entsprechenden unmarkierten Primer verwendete. Für beide Primerpaare wurden identische Reaktionsbedingungen, Cycluszeiten und Primerkonzentrationen verwendet. Zuvor wurden optimale Primerkonzentrationen für die einzelnen Primerpaare bestimmt. Zufälligerweise waren die in dieser Weise bestimmten optimalen Konzentrationen für die UPS-markierten und die nicht-UPS-markierten Primer identisch.
Fig. 4 zeigt die Ergebnisse eines Agarose-Gel-Vergleichs von chimärischen Primern mit sequenzspezifischen Primern für die CFTR-15-plex-PCR-Amplifikation. Spuren 1-8; genomische DNA-Proben, aus Blut isoliert. Spuren 9-16; genomische DNA-Proben, aus Wangenepithelzellen isoliert. Jede nachfolgende Probe in der Gruppe von vier Amplifikationen stellt eine zweifache serielle Verdünnung der genomischen DNA dar. Spuren 1-4 und 9-12; CFTR-15-plex- Amplifikation mit chimärischen Primern. Spuren 5-8 und 13-16; CFTR-15-plex- Amplifikation mit sequenzspezifischen Primern, Spur M; ΦX174-Hae-III-abgebaute Marker-DNA.
Wie gezeigt, erzeugte die Multiplex-Amplifikation unter Verwendung der sequenzspezifischen Standardprimerpaare kein klares Multiplex-PCR-Profil des CFTR-Locus. Insbesondere waren mehrere der erwarteten Banden deutlich unterrepräsentiert, vermutlich aufgrund einer differentiellen PCR-Amplifikation ihrer jeweiligen Produkte (Fig. 4, Spuren 5-8 und Spuren 13-16).
Dagegen wurde ein klares Multiplexprofil erhalten, wenn der CFTR-Locus mit den entsprechenden UPS-markierten Primerpaaren amplifiziert wurden. Die erwarteten Banden traten klar hervor und waren praktisch frei von kontaminierenden Produkten (Fig. 4, Spuren 1-4 und 9-12). Überdies wurden äquivalente Bandenmuster über einen achtfachen Bereich von Matrizenkonzentrationen beobachtet, wenn UPS-markierte Primerpaare eingesetzt wurden.
Umgekehrt war das unter Verwendung von sequenzspezifischen Primern erzeugte Amplifikationsprofil empfindlich gegenüber Variationen in der Matrizenkonzentration, wie anhand der Änderungen in der Intensität einzelner Banden ersichtlich ist (Fig. 4, Spuren 5-8 und 13-16).

Beispiel 7: Verwendung von Multiplex-PCR zum gleichzeitigen Amplifizieren von verschiedenen, mit Krankheiten zusammenhängenden Sequenzen unter identischen Bedingungen

Um die allgemeine Nützlichkeit der UPS-markierten Primer weiter zu demonstrieren wurden 29 verschiedene humangenomische Zielsequenzen (Fig. 1) in einem einzigen Thermocycler unter identischen Reaktionsbedingungen und Cyclusparametern amplifiziert. Ergebnisse aus diesen Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von sequenzspezifischen Primerpaaren und den zugehörigen UPS-markierten Primerpaaren sind in Fig. 5 und Fig. 6 vorgestellt.
Die Bandenmuster für die folgenden Primerpaare sind in Fig. 5 gezeigt: Banden 1-3: Amplifikation von CFTR-15-plex mit chimärischen Primern; Spuren 4-6: Amplifikation von CFTR-15-plex mit sequenzspezifischen Primern; Spuren 7-9: Multiplex-Amplifikation von α-Galactosidase-Gauchersche-Krankheit-(GCR)-3- plex (Kornreich et al., Nuc. Acids Res. 17: 3301, 1989) und Sichelzellenanämie- (SCA)-Einzeltarget (Navon et al., Science 243: 1471, 1989) mit chimärischen Primern; Spuren 10-12: Multiplex-Amplifikation von GCR-3-plex und SCA-Einzeltarget mit sequenzspezifischen Primern; Spuren 13-15: Multiplex-Amplifikation von GCR-Einzeltarget und Tay-Sachs-(TS)-Duplex (Tanaka et al., Am. J. Hum. Genet. 46: 329, 1990) mit chimärischen Prirnern; Spuren 16-18: Multiplex- Amplifikation von GCR-Einzeltarget und TS-Duplex mit sequenzspezifischen Primern; Spuren 19-21: Amplifikation von β-Thaiassämie-Einzeltarget mit chimärischen Primern; und Spuren 22-24: Amplifikation von β-Thalassämie- Einzeltarget mit sequenzspezifischen Primern, Spur M: ΦH174-Hae-III-abgebaute Marker-DNA. Alle Primerpaare wurden an 3 verschiedenen genomischen DNA-Proben getestet, die isoliert wurden aus: Spuren 1-8: genomische DNA- Proben, aus Blutzellen isoliert, während die genomische DNA-Matrize in den Spuren 9-12 aus Wangenepithelzellen stammte.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse einer unabhängigen Amplifikation von sechs Zielsequenzen innerhalb des humanen Wilms-Tumor-Gens (WT1) (Varanasi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3554, 1994). Spuren 1, 2, 5, 6, 9, 10, 13, 14, 17, 18, 21 und 22: mit chimärischen Primern durchgeführte Amplifikationen. Spuren 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15, 16, 19, 20, 23 und 24: mit sequenzspezifischen Primern durchgeführte Amplifikationen. Die Amplifikationen stellen jeweils sechs Amplicons innerhalb des WT-1-Gens dar (B, F, II, J, N und O; siehe Fig. 1). Alle Primerpaare wurden an zwei unabhängigen genomischen DNA-Proben getestet, die aus Blut isoliert wurden. Spur M: ΦX174-Hae-III-abgebaute Marker-DNA. Mit Ausnahme eines einzigen Primerpaars (Fig. 6, Spuren 5-8), das kein nachweisbares Produkt erzeugte, wenn der chimärische Primer eingesetzt wurde, verstärkte die Anwesenheit der UPS-Sequenz die Ausbeute der jeweiligen PCR- Produkte (Fig. 6, Spuren 1-4, 9-12, 13-16, 17-20, 21-24).
Ergebnisse aus den hier vorgestellten Multiplex-PCR-Reaktionen zeigen, dass sowohl für Einzelgenmultiplexe (Fig. 5, Spuren 1-3) als auch für Multiplexreaktionen mit Beteiligung von mehr als einem Gen (Fig. 5, Spuren 7-9, 13-15) die UPS-markierten Primer nur die gewünschten Banden erzeugten und die gemeinsam amplifizierten Produkte gleichmäßiger in Bezug auf die Bandenintensitäten waren als die entsprechenden Produkte, die aus den nichtmarkierten sequenzspezifischen Primern erzeugt wurden (Fig. 6, Spuren 4-6, 10-12, 16-18).

Claims

1. Menge von einzelsträngigen Oligonucleotid-DNA-Primerpaaren für die gleichzeitige Amplifikation von mehreren Ziel-DNA-Sequenzen unter einer einzigen Kombination von Reaktionsbedingungen in einer einzigen Multiplex-Polymerbase-Kettenreaktion (PCR), wobei die Primer eine 5'-X- Domäne und eine 3'-Y-Domäne aufweisen, wobei

a) jede dieser 5'-X-Domänen eine Sequenz umfasst, die nicht mit den mehreren Zielsequenzen hybridisiert;

b) die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen jedem X und seinem Komplement in Abwesenheit anderer Sequenzen größer als etwa 60ºC ist; und

c) jedes Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb einer Zielsequenz oder ihrem Komplement vorhanden ist oder diese flankiert.

2. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

3. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

4. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

5. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

6. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

7. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

8. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

9. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

10. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

11. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

12. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

13. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

14. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

15. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

16. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

17. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

18. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

19. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

20. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

21. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

22. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

23. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

24. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

25. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

26. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

27. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

28. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

29. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

30. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

31. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

32. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X die Sequenz

umfasst.

33. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X und Y jeweils 17 bis 25 Basen umfassen.

34. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei X und Y jeweils 17 bis 20 Basen umfassen.

35. Menge von Primerpaaren gemäß Anspruch 1, wobei die Schmelztemperatur eines zwischen jedem der Primer und seinem Komplement in einer Lösung von 0,5 M NaCl gebildeten Hybrids wenigstens 72ºC beträgt.

36. Oligonucleotid-DNA-Primer für die Amplifikation einer Ziel-DNA-Sequenz, wobei der Primer aus der Sequenz

besteht, wobei Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb der Zielsequenz oder ihrem Komplement vorhanden ist oder diese flankiert.

37. Verfahren zur gleichzeitigen Amplifikation von mehreren Ziel-DNA-Sequenzen, die in einer DNA-Probe vorhanden sind, umfassend:

(a) In-Kontakt-Bringen der DNA-Probe in einem einzigen Reaktionsgemisch mit einer Menge von gepaarten Oligonucleotidprimern mit der Struktur 5'-XY-3', wobei

i) X eine Sequenz umfasst, die nicht mit den mehreren Zielsequenzen hybridisiert;

ii) die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen X und seinem Komplement in Abwesenheit anderer Sequenzen größer als etwa 60ºC ist; und

iii) Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb einer Zielsequenz oder ihrem Komplement vorhanden ist oder diese flankiert; und

(b) Durchführen mehrerer Cyclen des Schmelzens, Reassoziierens und der DNA-Synthese.

38. Amplifikationsverfahren gemäß Anspruch 37, wobei X die Sequenz

umfasst.

39. Verfahren zum Nachweis mehrerer definierter Ziel-DNA-Sequenzen in einer DNA-Probe, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) In-Kontakt-Bringen der DNA-Probe in einem einzigen Reaktionsgemisch mit einer Menge von Oligonucleotidpaaren, wobei jedes dieser Paare aus einem ersten und einem zweiten Oligonucleotidprimer besteht, wobei

i) der erste Primer jedes Paares die Struktur 5'-XY-3' hat, wobei X eine Sequenz umfasst, die nicht mit den mehreren Zielsequenzen hybridisiert, die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen X und seinem Komplement in Abwesenheit anderer Sequenzen größer als etwa 60ºC ist und Y eine Sequenz umfasst, die innerhalb einer Zielsequenz oder ihrem Komplement vorhanden ist; und

ii) der zweite Primer jedes Paares die Struktur 5'-XY-3' hat, wobei X eine Sequenz umfasst, die nicht mit den mehreren Zielsequenzen hybridisiert, die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen X und seinem Komplement in Abwesenheit anderer Sequenzen größer als etwa 60ºC ist und Y eine Sequenz umfasst, die die Zielsequenz oder ihr Komplement flankiert;

(b) Durchführen mehrerer Cyclen des Schmelzens, Reassoziierens und der DNA-Synthese unter Bildung von Amplifikationsprodukten von DNA-Proben mit den Oligonucleotiden als Primern; und

(c) Nachweisen der Amplifikationsprodukte.

40. Nachweisverfahren gemäß Anspruch 39, wobei X die Sequenz

umfasst.

41. Nachweisverfahren gemäß Anspruch 39, wobei der Nachweis eines Amplifikationsprodukts die Anwesenheit einer Zielsequenz in der DNA-Probe anzeigt.

42. Nachweisverfahren gemäß Anspruch 39, wobei der Schritt des Nachweisens eine Gelelektrophorese umfasst.

43. Verfahren zum genetischen Screening mit hohem Durchsatz zum gleichzeitigen Nachweisen der Anwesenheit mehrerer definierter Ziel-DNA- Sequenzen in DNA-Proben, die von mehreren Individuen erhalten wurden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen einer DNA-Probe von jedem der Individuen;

(b) gleichzeitiges In-Kontakt-Bringen jeder der in (a) erhaltenen DNA- Proben mit einer Menge von Oligonucleotidpaaren, wobei jedes dieser Paare aus einem ersten und einem zweiten Oligonucleotidprimer besteht, wobei

(c) Durchführen mehrerer Cyclen des Schmelzens, Reassoziierens und der DNA-Synthese unter Bildung von Amplifikationsprodukten; und

(d) Nachweisen der Amplifikationsprodukte.

44. Screeningverfahren gemäß Anspruch 43, wobei X die Sequenz

umfasst.

45. Screeningverfahren gemäß Anspruch 43, wobei der Nachweis eines Amplifikationsprodukts die Anwesenheit einer Zielsequenz in der DNA-Probe anzeigt.

46. Screeningverfahren gemäß Anspruch 43, wobei der Schritt des Nachweisens eine Gelelektrophorese umfasst.