WO2003023055A2 - Methode zum nachweis von mutationen, insertionen, deletionen und polymorphismen auf der dna und ihre verwendung - Google Patents

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WO2003023055A2 PCT/DE2002/003367 DE0203367W WO03023055A2 WO 2003023055 A2 WO2003023055 A2 WO 2003023055A2 DE 0203367 W DE0203367 W DE 0203367W WO 03023055 A2 WO03023055 A2 WO 03023055A2
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Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to a new method for the detection of mutations, insertions, preferably up to 10 bases, deletions, preferably up to 10 bases, and polymorphisms on the DNA.
  • the invention furthermore relates to the use of the method for diagnosing genetic diseases, in particular familial hypercholesterolemia.
  • the invention also covers the use of the method for the detection of known and unknown single nucleotide polymorphisms (SNPs) and microsatellite markers.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • Fields of application of the invention are molecular biology, medicine and in particular diagnostics.
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the SNPs are individual base differences in the genome that occur approximately every 1000 bases and can be responsible for diseases as point mutations in genes or gene regulatory areas. Public and commercial organizations have identified more than 1.6 million SNPs (Eric Lai, 2001, Genome Research, 11: 927-929).
  • the SNPs can serve as a tool with the help of which one will be able to treat multifactorial polygenic diseases such as B. Hypertension, diabetes or other diseases, better to study, understand and ultimately diagnose.
  • Pharmacokinetic studies with the help of SNPs are becoming increasingly important in drug development.
  • SNPs SNPs that are used, for example, as DNA markers (so-called microsatellite markers) to map disease-associated genes on chromosomes through coupling studies.
  • DNA markers are short, defined sections on the DNA whose length and position on the chromosome (or genome) are known. The number of base repetitions of the microsatellites often differs between individual individuals and also between the individual alleles.
  • polymorphic microsatellite markers are used with the help of PCR for coupling and segregation studies.
  • Deviations in the DNA of individuals are already used to predict disease predispositions.
  • polymorphisms in positions 145 (A-> G), 175 (G-> T) and 1165 (G-> C) in human ⁇ 1-adrenoreceptor genes are suitable for determining a disposition for cardiomyopathies (PCT / DE00 / 02648).
  • Familial hypercholesterolemia also a genetic disease, is characterized by elevated serum cholesterol levels, tendon xanthomas and premature coronary heart disease. It follows an autosomal dominant inheritance. People with familial hypercholesterolemia cannot break down excess cholesterol in their liver (Brown, MS & Goldstein, JL (1986) Science 232, 34-47.). The reason is that the cholesterol that is bound to LDL (low density lipoprotein) in the blood cannot be absorbed by the LDL receptor. Apolipoprotein B, which is required for binding to the LDL receptor, is located on the surface of the LDL particles.
  • LDL-C low-density lipoprotein cholesterol
  • the low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) plays a central role in the development of arteriosclerosis and is one of the main risk factors for myocardial infarction (Garcia, CK et al. (2001) Genome Res 11, 1043-1052).
  • the individual risk can be determined even before severe vascular damage occurs (Umans-Eckenhausen, MA, et al. (2001) Lancet 357, 165-168).
  • the large number of known (approx. 600 mutations have been described so far) and the high probability of the existence of further previously unknown mutations place extreme demands on a genetic test for FH.
  • Affected people can be treated with cholesterol-lowering drugs in a targeted and preventive manner through timely diagnosis (Herz, J. (2001) Nat Struct Biol 8, 476-478).
  • LDL receptor e.g. by sequencing all coding exons of the LDL receptor gene.
  • a mutation can only be identified by sequencing all exons.
  • Sequencing as a method for finding polymorphisms, e.g. SNPs, and mutations, e.g. in the LDL receptor, is cost-intensive and time-consuming, so that it is undoubtedly not suitable as a routine application.
  • the invention has for its object to find a simple and inexpensive method for the detection of mutations, insertions, deletions and polymorphisms on the DNA and thereby to be able to quickly and reliably detect known and unknown mutations and polymorphisms.
  • the task also includes the use of the method for the diagnosis of genetically caused diseases, in particular familial hypercholesterolaemia by the detection of mutations, and polymorphisms on the DNA in the LDL receptor.
  • DNA molecules which are obtained from suitable materials such as cell cultures, tissue samples, blood, etc. using known methods, serve as the starting material for the method according to the invention.
  • a specific polymerase chain reaction is carried out on the DNA obtained using a forward and backward primer (oligonucleotide) which, for example, flank a polymorphic site in the genome ( Figures 1, 2 and 3).
  • the forward and backward primers are both extended with different, universal oligonucleotide sequences (Table 1) and thus serve as a "template” (basis) for the next step.
  • the universal oligonucleotide sequences do not occur in the material to be examined, so that they do not contain the specific PCR
  • two different universal oligonucleotides are added to the PCR product which are complementary to the extended ends of the forward and backward primers (Table 2).
  • Both universal oligonucleotides are each at their 5 'end with a different fluorescent dye marked, preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX or TAMRA
  • a different fluorescent dye marked preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX or TAMRA
  • two genomic DNA double strands (allele 1 and allele 2) are available as copies, each single strand with a different
  • the fluorescent dye is marked marked PCR products are denatured and cooled quickly. The rapid cooling ensures that the complementary single strands do not reassemble to form double strands.
  • PCR products are separated, which is preferably carried out with the aid of electrophoresis under non-denaturing conditions, a single difference in the base sequence is sufficient for different folding structures to form in the two strands.
  • Each DNA single strand adopts a conformation corresponding to its sequence. This leads to different running properties of the strands. Since the strands are each marked with two different fluorescent dyes, the treadmill of both strands can be evaluated separately as a "peak" signal.
  • One advantage of working with several fluorescent dyes is that the number of samples to be examined is halved with the doubling of the fluorescent dyes This multiplexing ability can be of newly developed fluorescent dyes, which makes the future viability of the method even more attractive.
  • the method described above it is possible to quickly and inexpensively detect mutations in a short time.
  • the method is very environmentally friendly and health-friendly.
  • the reaction products can be stored for a long time without losing their fluorescence intensity.
  • the multiplexing ability of the method reduces material consumption and time, which leads to a considerable reduction in costs.
  • DNA molecules which are obtained from suitable materials such as cell cultures, tissue samples, blood, etc. using known methods, serve as the starting material.
  • a specific polymerase chain reaction is carried out on the DNA obtained using a forward and backward primer (oligonucleotide) which flank an exon in the LDL receptor (Table 3).
  • the forward and backward primers are both extended with different, universal oligonucleotide sequences (Table 1) and thus serve as a "template” (basis) for the next step.
  • the universal oligonucleotide sequences do not occur in the material to be examined, so that they do not contain the specific PCR
  • the two-step PCR is followed by adding two different universal oligonucleotides (Table 2) to the PCR product that are complementary to the extended ends of the forward and reverse primers.
  • Both universal oligonucleotides are at their 5 ' - Each end marked with a different fluorescent dye, preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX and TAMRA.
  • a different fluorescent dye preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX and TAMRA.
  • two genomic DNA double strands (allele 1 and allele 2) are thus available as copies, where each single strand is labeled with a different fluorescent dye
  • all four ohgonucleotides are combined in a reaction in which the specific and the universal PCR run in succession as one reaction step ( Figures 2 and 3).
  • the fluorescent-labeled PCR products at the 5 'end are denatured and quickly cooled.
  • Polymorphic markers or sequence repetitions can be used for coupling and segregation studies with a forward and backward primer (oligonucleotide). flank a polymorphic site in the genome, can be detected by the described method ( Figure 3).
  • the forward and reverse primers are both extended with different universal oligonucleotide sequences (Table 1) and thus serve as a "template” (basis) for the next step.
  • the universal oligonucleotide sequences do not occur in the material to be examined, so that they do not contain the specific PCR but are only co-amplified, and there are also two different universal oligonucleotides in the PCR (Table 2) that are complementary to the are elongated ends of the forward and reverse primers.
  • a universal oligonucleotide is labeled at its 5 'end with a different fluorescent dye, preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX and TAMRA; The other universal oligonucleotide is unlabeled.
  • a different fluorescent dye preferably with: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX and TAMRA;
  • the other universal oligonucleotide is unlabeled.
  • all four ohgonucleotides are added in one reaction.
  • a biotin label instead of a fluorescent label can be used for single-strand generation of PCR products.
  • a specific polymerase chain reaction (PCR) is carried out by using forward and backward primers (oligonucleotide) which flank a site to be examined in the genome.
  • the forward and backward primers are both extended with different, universal oligonucleotide sequences (Table 1) and thus serve as a "template” (basis) for the next step.
  • the universal oligonucleotide sequences do not occur in the material to be examined, so that they do not contain the specific PCR
  • two different additional universal oligonucleotides (Table 2) are added, which are complementary to the elongated ends of the forward and reverse primers, and a universal oligonucleotide is labeled with a biotin at its 5 'end.
  • the other universal oligonucleotide is unlabeled.
  • all four ohgonucleotides are added in one reaction.
  • the biotin-labeled PCR products can be used by streptavidin and or NaOH for single-strand generation. For example, on the biotin-labeled forward or reverse strand an Ec time sequencing can be performed.
  • fluorescence-labeled oligonucleotide sequence II complementary to 4.
  • additional fluorescence-labeled oligonucleotide sequences at the 5 'end which are complementary to 3 and 4 and are used, for example, for multiplex runs.
  • fluorescence-labeled oligonucleotide sequence II complementary to 4.
  • additional fluorescence-labeled oligonucleotide sequences which are complementary to 3 and 4 at the 5' end and are used, for example, for multiplex runs.
  • Table 1 Sequence composition of the forward (1) and backward primers (2).
  • the specific portion that represents a flanking polymorphic site in the genome is marked with an X.
  • the forward and backward primers are both extended with different, universal oligonucleotide sequences (underlined) and thus serve as a “template” (basis) for the next step.
  • the universal forward (5) and backward primers (6) can also be used without marking z.
  • Table 3 Oligonucleotide sequences for the LDL receptor. The underlined area within the sequence represents the universal sequence for forward primer and reverse primer. Exon 4 is split into two reactions; 4A and 4B.

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Abstract

Die erfindungsgemässe Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA ist dadurch gekennzeichnet, dass: eine erste spezifische PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem Primerpaar, dass die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5'-Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist; eine zweite universelle PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem markierten Primerpaar, dass komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist.

Description

Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymorphismen auf der DNA und ihre Verwendung
Die Erfindung betrifft eine neue Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, vorzugsweise bis zu 10 Basen, Deletionen, vorzugsweise bis zu 10 Basen, und Polymoφhismen auf der DNA. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen, insbesondere der Familiären Hypercholesterinämie. Auch die Verwendung der Methode zur Detektion von bekannten und unbekannten single nucleotide polymorphismen (SNPs) und Mikrosatellitenmarker wird von der Erfindung gedeckt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Molekularbiologie, die Medizin und insbesondere die Diagnostik.
Die Analyse von genetischen Varianten wie z. B. single nucleotide polymorphismen (SNPs) auf DNA Ebene gewinnt immer mehr an Bedeutung. Die SNPs sind einzelne Basenunterschiede im Genom, die etwa alle 1000 Basen auftreten und als Punktmutationen in Genen oder genregulatorischen Bereichen für Krankheiten verantwortlich sein können. Durch öffentliche und kommerzielle Einrichtungen sind bereits mehr als 1,6 Millionen SNPs identifiziert worden (Eric Lai, 2001, Genome Research, 11:927-929). Die SNPs können als Werkzeug dienen, mit deren Hilfe man in der Lage sein wird, multifaktoriell polygene Erkrankungen, wie z. B. Hypertonie, Diabetes oder auch andere Krankheiten, besser zu studieren, zu verstehen und letztendlich zu diagnostizieren. Pharmakokinetische Untersuchungen, unter Zuhilfenahme von SNPs, gewinnen in der Medikamentenentwicklung immer mehr an Bedeutung. Die Analyse von SNPs spielt somit schon heute nicht nur in der Grundlagenforschung, sondern auch in der Routinediagnostik eine zunehmende Rolle und ist in zunehmendem Maße Gegenstand der molekularbiologischen Forschung. Das Auffinden neuer SNPs erfolgt vor allem durch die Sequenzierung von mehreren Dutzend verschiedener DNA Proben. Erst durch den Vergleich der Sequenzen (dem sogenannten „allignen ") läßt sich ein SNP identifizieren, der anschließend für Studien mit speziellen Nachweisverfahren in großen Patienten-Populationen nachgewiesen bzw. untersucht werden kann. Neben den SNPs sind für die medizinische Forschung und Diagnostik besonders die in der kodierenden und nicht kodierenden Bereichen der DNA vorkommenden kurzen Sequenzwiederholungen von zwei bis vier Basen, die sogenannten Mikrosatelliten, interessant. Mikrosatelliten werden z.B. als DNA-Marker (sog. Mikrosatellitenmarker) eingesetzt, um durch Kopplungsstudien krankheitsassoziierte Gene auf Chromosomen zu kartieren. DNA-Marker sind kurze definierte Abschnitte auf der DNA, deren Länge und Lage auf dem Chromosom (bzw. dem Genom) bekannt sind. Die Anzahl der Basenwiederholungen der Mikrosatelliten unterscheidet sich oft zwischen einzelnen Individuen und auch zwischen den einzelnen Allelen. Man spricht dann von polymoφhen Mikrosatellitenmarkern. Diese polymoφhen Marker werden mit Hilfe der PCR für Kopplungs- und Segregationsuntersuchungen eingesetzt.
Abweichungen in der DNA von Individuen werden bereits zur Vorhersage von Krankheitsdispositionen herangezogen. Beispielsweise sind Polymoφhismen in den Positionen 145 (A->G), 175 (G->T) und 1165 (G->C) im menschlichen ßl- Adrenorezeptorgen geeignet, um eine Disposition für Cardiomyopathien festzustellen (PCT/DE00/02648).
Es ist ferner beschrieben worden, daß ein Zusammenhang zwischen dem Apolipoprotein-E (epsilon 4 allel) und der Alzheimer Krankheit besteht. (Isbir T, 2001, Am J Alzheimers Dis Other Demen, Jul;16(4):205-210).
Die Familiäre Hypercholesterinämie (FH), eine ebenfalls genetisch bedingte Erkrankung, ist charakterisiert durch erhöhte Serumcholesterinwerte, Sehnenxanthome und vorzeitige koronare Herzerkrankung. Sie folgt einem autosomal dominanten Erbgang. Die Menschen, die an einer Familiären Hypercholesterinämie erkrankt sind, können überschüssiges Cholesterin nicht in ihrer Leber abbauen (Brown, M.S. & Goldstein, J.L. (1986) Science 232, 34-47.). Der Grund liegt darin, daß das Cholesterin, das im Blut an LDL (low density lipoprotein) gebunden ist, nicht durch den LDL- Rezeptor aufgenommen werden kann. An der Oberfläche der LDL-Partikel ist das Apolipoprotein B lokalisiert, das zur Bindung an den LDL-Rezeptor benötigt wird. Das Low-Density-Lipoprotein Cholesterin (LDL-C) nimmt bei der Entstehung der Arteriosklerose eine zentrale Rolle ein und ist eine der Hauptrisikofaktoren für den Herzinfarkt (Garcia, C.K. et al. (2001) Genome Res 11, 1043-1052). Durch die Untersuchung von Gendefekten im LDL-Rezeptor kann bereits vor dem Auftreten schwerer Gefäßschäden das individuelle Risiko erhoben werden (Umans-Eckenhausen, M.A., et al. (2001) Lancet 357, 165-168). Die Vielzahl der bekannten (bisher sind ca. 600 Mutationen beschrieben) sowie die große Wahrscheinlichkeit der Existenz weiterer bisher unbekannter Mutationen stellen dabei extreme Anforderungen an einen Gentest für FH. Betroffene können durch eine rechtzeitige Diagnose gezielt und vorbeugend mit cholesterinsenkenden Medikamenten behandelt werden (Herz, J. (2001) Nat Struct Biol 8, 476-478).
Das Auffinden von bekannten und neuen Mutationen im LDL-Rezeptor erfolgt z.B. durch die Sequenzierung von allen kodierenden Exons des LDL-Rezeptor Gens. Erst durch die Sequenzierung aller Exons läßt sich eine Mutation identifizieren.
Die Sequenzierung als Verfahren zum Auffinden von Polymoφhismen, z.B. SNPs, und Mutationen, z.B. im LDL-Rezeptor, ist kostenintensiv und zeitaufwendig, so dass sie als Routineanwendung zweifelsohne nicht in Betracht kommt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine einfache und kostengünstige Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymoφhismen auf der DNA zu finden und dadurch schnell und sicher bekannte und unbekannte Mutationen und Polymoφhismen detektieren zu können. Zur Aufgabe gehört auch die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkankungen, insbesondere der Familiären Hypercholesterinämie durch den Nachweis von Mutationen, und Polymoφhismen auf der DNA im LDL-Rezeptor.
Die Erfindung wird gemäß den Patentansprüchen realisiert, eine schematische Darstellung ist auf den Abbildungen 1, 2 und 3 zu sehen. Als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße Methode dienen DNA-Moleküle, die aus geeigneten Materialien wie Zellkulturen, Gewebeproben, Blut usw. mit bekannten Methoden gewonnen werden.
An der gewonnenen DNA wird erfindungsgemäß mit einem Vorwärts -und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die z.B. eine polymoφhe Stelle im Genom flankieren, eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt (Abbildungen 1, 2 und 3). Die Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen verlängert (Tabelle 1) und dienen somit als „template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. Anschließend werden zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide zum PCR Produkt zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind (Tabelle 2). Beide universellen Oligonukleotide sind an ihrem 5'- Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert und zwar vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX oder TAMRA. Nach der erneuten Amplifikation liegen somit zwei genomische DNA-Doppelstränge (Allel 1 und Allel 2) als Kopie vor, wobei jeder Einzelstrang mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Die am 5'- Ende fluoreszenzmarkierten PCR Produkte werden denaturiert und schnell abgekühlt. Die schnelle Abkühlung bewirkt, dass sich die komplementären Einzelstränge nicht wieder zu Doppelsträngen zusammenlagern. Bei der Auftrennung der PCR-Produkte, die vorzugsweise mit Hilfe der Elektrophorese unter nichtdenaturierenden Bedingungen erfolgt, genügt ein einziger Unterschied in der Basensequenz, damit sich unterschiedliche Faltstrukturen in den beiden Strängen ausbilden. Dabei nimmt jeder DNA Einzelstrang eine seiner Sequenz entsprechende Konformation an. Dies führt zur unterschiedlichen Laufeigenschaften der Stränge. Da die Stränge mit jeweils zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann die Laufbande beider Stränge separat als Signal „Peak" ausgewertet werden. Ein Vorteil des Arbeitens mit mehreren Fluoreszenzfarbstoffen besteht darin, daß die zu detektierende Anzahl der zu untersuchenden Proben mit der Verdopplung der Fluoreszenzfarbstoffe halbiert wird. Diese Multiplexfähigkeit kann durch den Einsatz von neuentwickelten Fluoreszenzfarbstoffen erhöht werden, was die Zukunftsfähigkeit der Methode noch attraktiver macht.
Mit der oben beschriebenen Methode ist es möglich, einen schnellen und kostengünstigen Nachweis von Mutationen in kurzer Zeit zu realisieren. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmarkierungen anstelle von Radioaktivität ist die Methode sehr umweit- und gesundheitsfreundlich. Zudem sind die Reaktionsprodukte lange lagerfähig, ohne an Fluoreszenzintensivität zu verlieren. Durch die Multiplexfähigkeit der Methode verringert sich der Materialverbrauch und der Zeitaufwand, was zur erheblichen Reduktion der Kosten führt.
Die Verwendung der Methode zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen wird im Folgenden am Beispiel der Familiären Hypercholesterinämie erläutert.
Als Ausgangsmaterial dienen DNA-Moleküle, die aus geeigneten Materialien wie Zellkulturen, Gewebeproben, Blut usw. mit bekannten Methoden gewonnen werden.
An der gewonnenen DNA wird erfindungsgemäß mit einem Vorwärts -und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die je ein Exon im LDL-Rezeptor flankieren (Tabelle 3), eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt. Die Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als „template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. Anschließend werden für die Zwei-Schritt-PCR zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2) zum PCR Produkt zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind. Beide universellen Oligonukleotide sind an ihrem 5 '-Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA. Nach der erneuten Amplifikation liegen somit zwei genomische DNA-Doppelstränge (Allel 1 und Allel 2) als Kopie vor, wobei jeder Einzelstrang mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Alternativ werden für eine Ein-Schritt-PCR alle vier Ohgonucleotide in eine Reaktion zusammengegeben, in dem die spezifische und die universelle PCR hintereinander als ein Reaktionsschritt läuft (Abbildungen 2 und 3). Die am 5'- Ende Fluoreszenzmarkierten PCR Produkte werden denaturiert und schnell abgekühlt. Bei der kapillarelektrophoretischen Trennung unter nichtdenaturierenden Bedingungen im Polymer genügt ein einziger Unterschied in der Basensequenz, damit sich unterschiedliche Faltstrukturen in den beiden Strängen ausbilden. Dies führt zur unterschiedlichen Laufeigenschaften der Stränge. Da die Stränge mit jeweils zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, kann die Laufbande beider Stränge separat als „Peak" ausgewertet werden. Um Sequenzunterschiede im LDL-Rezeptor zu sehen, wird immer eine Wild-typ DNA-Probe mit den zu untersuchenden Proben verglichen. Ist das Peakmuster nicht gleich, so handelt es sich bei der unbekannten Probe um ein Mutationsträger. Die gefundene Mutation im jeweiligen Amplikon kann zum Bestätigen sequenziert werden. Ist die LDL-R Untersuchung als Zwei-Schritt-PCR durchgeführt worden, so kann dafür ein Aliquot des spezifischen PCR Produktes mit unmarkierten komplementären universellen Vorwärts bzw. Rückwärtsprimer sequenziert werden (Tabelle 3).
Mit der hier genannten und beschriebenen molekularbiologischen Methode ist es möglich, den LDL-Rezeptor auf Mutationen schnell, kostengünstig und einfach zu untersuchen und somit einen Routinetest anzubieten, der das schnelle und sichere Screening von Patienten-DNA erlaubt.
Polymoφhe Marker bzw. Sequenzwiederholungen (Mikrosatellitenmarker) können für Kopplungs- und Segregationsuntersuchungen mit einem Vorwärts -und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die. eine polymoφhe Stelle im Genom flankieren, durch die beschriebene Methode nachgewiesen werden (Abbildung 3). Die Vorwärts - und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als „template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. In der PCR befinden sich zusätzlich zwei unterschiedliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2), die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind. Ein universelles Oligonukleotide ist an seinem 5 '-Ende mit je einem unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoff markiert, vorzugsweise mit: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; Das andere universelle Oligonucleotid ist unmarkiert. In dieser Ein- Schritt-PCR werden alle vier Ohgonucleotide in einer Reaktion zugegeben.
Eine Biotinmarkierung anstelle einer Fluoreszenzmarkierung kann für eine Einzelstranggenerierung von PCR-Produkten eingesetzt werden. Durch den Einsatz von Vorwärts -und Rückwärtsprimer (Oligonukleotid), die eine zu untersuchende Stelle im Genom flankieren, wird eine spezifische Polymerase Ketten Reaktion (PCR) durchgeführt. Die Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (Tabelle 1) verlängert und dienen somit als „template" (Basis) für den nächsten Schritt. Die universellen Oligonukleotidsequenzen kommen nicht im zu untersuchenden Material vor, so daß sie die spezifische PCR nicht stören, sondern lediglich koamplifiziert werden. In der Reaktion sind zwei unterschiedliche zusätzliche universelle Oligonukleotide (Tabelle 2) zugegeben, die komplementär zu den verlängerten Enden der Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind. Ein universelles Oligonukleotide ist an seinem 5 '-Ende mit einem Biotin markiert. Das andere universelle Oligonucleotid ist unmarkiert. In dieser Ein-Schritt-PCR werden alle vier Ohgonucleotide in einer Reaktion zugegeben. Die Biotinmarkierten PCR-Produkte können durch Streptavidin und oder NaOH für eine Einzelstranggenerierung genutzt werden. An dem mit Biotinmarkierten Vorwärts- oder Rückwärtsstrang kann z.B eine Echtzeitsequenzierung durchgeführt werden.
Abbildungslegenden:
Abbildung 1:
1 Vorwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotid- sequenz I
2 Rückwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II
3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I
4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II 5 Am 5 '-Ende fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3.
6 Am 5 '-Ende fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4.
A Humanes Genom mit einem Polymoφhismus (schwarzer Punkt) auf einem Allel
B Durchführung einer PCR mit modifizierten Oligonukleotiden
C Durchführung einer zweiten PCR mit universellen fluoreszenzmarkierten Oligonukleotiden
D Denaturierung der PCR-Stränge
E Sequenzspezifische Konformation von fluoreszenzmarkierten Einzelsträngen
F Auftrennung und Detektion der unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Einzelstränge
Abbildung 2:
Schematische Darstellung der neu entwickelten Applikation zum Nachweis von Mutationen und Polymoφhismen der DNA.
1 Vorwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz I. 2 Rückwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II.
3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I am Vorwärtsprimer.
4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II am Rückwärtsprimer.
5 Am 5 '-Ende des Vorwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3.
6 Am 5 '-Ende des Rückwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4. 7, 8 zusätzliche am 5 '-Ende unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu 3 und 4 sind und z.B. für Multiplexläufe eingesetzt werden.
Abbildung 3:
Schematische Darstellung der erfindungsgemäßen Applikation zum Nachweis von Mutationen und Polymoφhismen der DNA. Als spezielle Anwendung sind der LDL- Rezeptor SSCP-Gentest, die Mikrosatelliten-Kartierung und die Biotin SNP-Analyse dargestellt. 1 Vorwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz I.
2 Rückwärtsprimer am 5 '-Ende verlängert durch eine universelle Oligonukleotidsequenz II.
3 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz I am Vorwärtsprimer. 4 Anteil der universellen Oligonukleotidsequenz II am Rückwärtsprimer.
5 Am 5 '-Ende des Vorwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz I komplementär zu 3.
6 Am 5 '-Ende des Rückwärtsprimers fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenz II komplementär zu 4. 7, 8 zusätzliche am 5 '-Ende unterschiedliche fluoreszenzmarkierte Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu 3 und 4 sind und z.B. für Multiplexläufe eingesetzt werden.
Tabelle 1: Sequenzkomposition der Vorwärts (1) -und Rückwärtsprimer (2). Der spezifische Anteil der eine flankierende polymoφhe Stelle im Genom darstellt ist mit X gekennzeichnet. Die Vorwärts -und Rückwärtsprimer sind beide mit unterschiedlichen, universellen Oligonukleotidsequenzen (unterstrichen) verlängert und dienen somit als „template" (Basis) für den nächsten Schritt.
Figure imgf000012_0001
Tabelle 2: Sequenzkomposition der komplementären universellen Vorwärts (3), (5) - und Rückwärtsprimer (4), (6) . Beide Oligonikleotide werden mit einen der folgenden Fluoreszenzfarbstoffe am 5'- Ende unterschiedlich markiert: FJ, = VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; F2 = VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA; Fl ist ungleich F2. Die universellen Vorwärts (5) -und Rückwärtsprimer (6) können auch ohne Markierung z. B. für eine Sequenzierung eingesetzt werden. Für eine Einzelstrangseparation der PCR Produkte kann eines der universellen Vorwärts (7) - und Rückwärtsprimer (8) mit Biotin markiert werden. B = Biotin.
Figure imgf000012_0002
Tabelle 3: Oligonukleotidsequenzen für den LDL-Rezeptor. Der unterstrichene Bereich innerhalb der Sequenz stellt die universelle Sequenz für Vorwärtsprimer und den Rückwärtsprimer dar. Exon 4 wird in zwei Reaktionen aufgeteilt; 4A und 4B.
Figure imgf000013_0002
Figure imgf000013_0001

Claims

Patentansprüche
1. Methode zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymoφhismen auf der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass
- eine erste spezifische PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem Primeφaar, dass die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5' -Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist;
- eine zweite universelle PCR-Reaktion durchgeführt wird mit einem markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primeφaar, dass komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist;
- die PCR-Produkte durch Erhitzung denaturiert und danach schnell wieder abgekühlt werden;
- eine Auftrennung der PCR-Produkte erfolgt; und
die Detektion der Laufeigenschaften der PCR-Produkte, wobei die Laufeigenschaften abhängig sind von der speziellen Faltung und der Konformation der DNA-Einzelstränge und die spezielle Faltung wiederum von der DNA-Sequenz.
2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung mit Hilfe der Elektrophorese, vorzugsweise kapillarelektrophoretisch, erfolgt.
3. Methode nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass als komplementäre Sequenz unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenzen eingesetzt werden.
4. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zur Fluoreszenzmarkierung die Farbstoffe: VIC, NED, 6-FAM, PET, TET, HEX und TAMRA eingesetzt werden.
5. Methode nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die fluoreszenzmarkierten PCR-Produkte vereinigt werden und / oder als Multiplex Reaktion eingesetzt werden.
6. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein
Oligonukleotid eines universellen Oligonukleotidpaares mit Biotin markiert ist und das andere nicht.
7. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die erste spezifische PCR-Reaktion und die zweite universelle PCR-Reaktion in einem
Reaktionsansatz als Ein Schritt PCR durchgeführt werden.
8. Methode nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymoφhismen auf der DNA des LDL-Rezeptors nachgewiesen werden.
9. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Zwei Schritt PCR durchgeführt wird, indem
- eine erste spezifische PCR durchgeführt wird mit Primern,
• die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
• am 5' -Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primeφaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet. - eine zweite universelle PCR durchgeführt wird mit einem markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primeφaar, dass komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen ist;
die PCR-Produkte durch Erhitzung denaturiert und danach schnell wieder abgekühlt werden;
- eine Auftrennung der PCR-Produkte, vorrangig mit Hilfe der Elektrophorese, erfolgt; und
die Detektion der Laufeigenschaften der PCR-Produkte erfolgt, wobei die Laufeigenschaften abhängig sind von der speziellen Faltung und der Konformation der DNA-Einzelstränge und die spezielle Faltung wiederum von der DNA-Sequenz.
10. Methode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Ein Schritt PCR durchgeführt wird, indem
- die spezifische PCR mit Primern,
• die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
• am 5' -Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primeφaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet und
die universelle PCR mit markierten, vorrangig fluoreszenzmarkierten oder biotinmarkierten, Primern, die komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen sind
in einem Reaktionsansatz durchgeführt werden.
11. Methode nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass für die spezifische PCR vorzugsweise Primer verwendet werden, die in der Tabelle 3 aufgeführt sind.
12. Verwendung der Methode nach Anspruch 1 bis 11 zur Diagnose genetisch bedingter Erkrankungen.
13. Verwendung der Methode nach Anspruch 1 bis 11 zur Detektion bekannter oder unbekannter Mutationen und Polymoφhismen.
14. Verwendung nach Anspruch 13 zur Detektion bekannter oder unbekannter single nucleotide polymoφhismen (SNPs).
15. Verwendung nach Anspruch 13 zur Detektion bekannter oder unbekannter Mikrosatellitenmarker.
16. Testkit zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und Polymoφhismen auf der DNA, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens beinhaltet:
ein Primeφaar, dass die zu untersuchende Stelle im Genom flankiert, wobei am 5 '-Ende jedes Primers zusätzlich eine jeweils unterschiedliche universelle Oligonukleotidsequenz hängt, die mit der zu untersuchenden DNA-Sequenz nicht komplementär ist;
ein markiertes, vorrangig fluoreszenzmarkiertes oder biotinmarkiertes, Primeφaar, dass komplementär zu den universellen Oligonukleotidsequenzen ist.
17. Testkit zum Nachweis von Mutationen, Insertionen, Deletionen und
Polymoφhismen auf der DNA des LDL-Rezeptors, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens beinhaltet: Primer
• die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren, und
• am 5' -Ende durch eine universelle Oligonukleotidsequenz verlängert sind, wobei sich die universelle Oligonukleotidsequenz des Vorwärtsprimers eines Primeφaares von der des Rückwärtsprimers unterscheidet; und
markierte, vorrangig fluoreszenzmarkierte oder biotinmarkierte, Primer, die komplementär zu den in der ersten PCR verwendeten universellen Oligonukleotidsequenzen sind.
18. Testkit nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer, die die Exons des LDL-Rezeptor-Gens flankieren vorrangig die Primer verwendet werden, die in der Tabelle 3 aufgelistet sind.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006021131A1 (fr) * 2004-08-26 2006-03-02 Capitalbio Corporation Amplification acp asymétrique, ses amorce et application spéciales
WO2006075039A3 (es) * 2005-01-13 2007-04-19 Lacer Sa Método de diagnóstico in vitro de hipercolesterolemia familiar mediante detección de reordenamientos génicos
JP2013017478A (ja) * 2011-06-13 2013-01-31 Kanazawa Univ 家族性高コレステロール血症の迅速遺伝子解析方法及び該方法に使用するプライマーセット

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011027219A1 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Progenika Biopharma, S.A. High throughput detection of small genomic deletions and insertions

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIARELLI ILARIA ET AL: "A method for point mutation analysis that links SSCP and dye primer fluorescent sequencing." MOLECULAR AND CELLULAR PROBES, Bd. 12, Nr. 3, Juni 1998 (1998-06), Seiten 125-131, XP002250190 ISSN: 0890-8508 *
GEISEL J ET AL: "Fluorescence-based single-strand conformation polymorphism analysis of the low density lipoprotein receptor gene by capillary electrophoresis" JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL APPLICATIONS, ELSEVIER SCIENCE PUBLISHERS, NL, Bd. 724, Nr. 2, 19. M{rz 1999 (1999-03-19), Seiten 239-247, XP004163106 ISSN: 0378-4347 *
INAZUKA MASAKAZU ET AL: "A streamlined mutation detection system: Multicolor Post-PCR fluorescence labeling and single-strand conformational polymorphism analysis by capillary electrophoresis." GENOME RESEARCH, Bd. 7, Nr. 11, November 1997 (1997-11), Seiten 1094-1103, XP002250191 ISSN: 1088-9051 *
MAKINO R ET AL: "F-SSCP: FLUORESCENCE-BASED POLYMERASE CHAIN REACTION-SINGLE-STRAND CONFORMATION POLYMORPHISM (PCR-SSCP) ANALYSIS" PCR METHODS AND APPLICATIONS, COLD SPRING HARBOR, NY, US, Bd. 2, Nr. 1, 1. August 1992 (1992-08-01), Seiten 10-13, XP000644666 ISSN: 1054-9803 *
PROSSER J: "DETECTING SINGLE-BASE MUTATIONS" TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, Bd. 11, 1993, Seiten 238-246, XP000440486 ISSN: 0167-7799 *
WALZ TANJA ET AL: "Fluorescence-based single-strand conformation polymorphism analysis of mutations by capillary electrophoresis." ELECTROPHORESIS., Bd. 21, Nr. 2, Januar 2000 (2000-01), Seiten 375-379, XP002250189 ISSN: 0173-0835 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006021131A1 (fr) * 2004-08-26 2006-03-02 Capitalbio Corporation Amplification acp asymétrique, ses amorce et application spéciales
US8735067B2 (en) 2004-08-26 2014-05-27 Capitalbio Corporation Asymmetric PCR amplification, its special primer and application
WO2006075039A3 (es) * 2005-01-13 2007-04-19 Lacer Sa Método de diagnóstico in vitro de hipercolesterolemia familiar mediante detección de reordenamientos génicos
JP2013017478A (ja) * 2011-06-13 2013-01-31 Kanazawa Univ 家族性高コレステロール血症の迅速遺伝子解析方法及び該方法に使用するプライマーセット

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