WO2006075039A2 - Método de diagnóstico in vitro de hipercolesterolemia familiar mediante detección de reordenamientos génicos - Google Patents

Abstract

Método de diagnóstico in vitro de hipercolesterolemia familiar mediante detección de reordenamientos génicos. El método se basa en el análisis cuantitativo de fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR multiplex que permite amplificar la totalidad de un gen, en el marcaje fluorescente de dichos fragmentos y en la comparación de las señales obtenidas con las correspondientes al gen sin reordenamientos. El método permite tanto la detección de deleciones ya conocidas en el gen del r-LDL como la identificación de deleciones en este gen desconocidas hasta ahora, que son objeto también de la invención.

Description

MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR MEDIANTE DETECCIÓN DE REORDENAMIENTOS GÉNICOS

ÁMBITO DE LA INVENCIÓN La invención se adscribe al sector técnico-industrial del diagnóstico in vitro, extracorpóreo, de muestras biológicas, mediante técnicas de ingeniería genética, para determinar la predisposición de un individuo al desarrollo de la enfermedad denominada hipercolesterolemia familiar.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La aterosclerosis se define según la Organización Mundial de la Salud (OMS) como una combinación de cambios que se produce en la íntima de las arterias a consecuencia de un acumulo focal de lípidos y componentes complejos que se acompaña con la formación de tejido fibroso y calcificación que a su vez se asocia con cambios en estructura de la media.

La aterosclerosis puede considerarse como una forma especial de arteriosclerosis con un depósito patogénico de lípidos en la pared arterial. La mayoría de formas de la arteriosclerosis implican la degeneración grasa de la pared vascular, con lo que los términos arteriosclerosis y aterosclerosis suele utilizarse de forma indistinta (Assmann G. en "Lipid Metabolism and Atherosclerosis" Schattauer Verlag GmbH, Stuttgart 1982:1).

Los lípidos son sustancias insolubles en disoluciones acuosas. Las lipoproteínas son las partículas que posibilitan el transporte de los lípidos en la sangre. Las lipoproteínas se dividen en varias categorías según su densidad dependiendo de cómo pueden separarse por ultracentrifugación, (Havel RJ y col. J Clin Invest 1955,34:1345). Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) (d=l,019-l,063 g/mL) son las que mayoritariamente transportan el colesterol en el torrente circulatorio. Estas lipoproteínas están formadas por el 75% de lípidos (principalmente colesterol libre, colesterol esterificado y fosfolípidos); alrededor del 70 % del colesterol total de la sangre es transportado por las partículas LDL.

El término hipercolesterolemia se utiliza para reflejar la elevación del colesterol del plasma por encima de los niveles considerados normales para una determinada población y es uno de los factores cruciales para el inicio y progresión de la arteriosclerosis. Más de la mitad de todas las muertes que se producen en los países desarrollados están relacionados con la enfermedad cardiovascular arteriosclerosa

(Murray CJL y López AD, Lancet 1997; 349:1269-1276).

La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad de herencia autosómica dominante causada por mutaciones que se producen en el gen del receptor de las LDL (r-LDL); este gen codifica una proteína que permite la captación y degradación intracelular de las LDL (Goldstein JL, y Brown MS Ann Rev CeIl Biol 1985; 1:1-39).

La penetrancia de la HF es cercana al 100%, lo que significa que la mitad de la descendencia de una persona afectada tendrá su colesterol plasmático muy elevado desde el momento de nacer, afectando por igual a hombres y mujeres (Goldstein JL, Brown MS. The metabolic basis of inherited disease. Editores: Scriver CR, Beaudet AL,

SIy WS, Valle D. McGraw HiIl New York 6^a edition, 1989; 1215-1250).

Los pacientes con HF presentan como síntomas característicos clínicos arco corneal, xantomas tendinosos y enfermedad coronaria prematura (Scientific Steering

Committee on behalf of the Simón Broome Register Group. Atherosclerosis 1999; 142: 105-115). La HF es una de las enfermedades monogénicas más frecuentes, con una prevalencia estimada de pacientes heterocigotos de una en cada 500 personas y de heterocigotos de una en cada 1.000.000.

Determinadas poblaciones tales como los canadienses de habla francesa

(Leitersdorf E y col. J Clin Invest 1990; 85:1014-1023), cristianos libaneses (Lehrman MA y col. J Biol Chem 1987; 262:401-410), drusos (Landsberger D y col. Am J Hum

Genet 1992; 50:427-433) finlandeses (Koivisto UM y col. J Clin Invest 1992; 90:219-

228), los "afrikaners" de Suráfrica (Kotze MJ y col. Ann Hum Genet 1991; 55:115-

121), los judíos Ashkenazi de descendencia lituana (Meiner V y col. Am J Hum Genet

1991; 49:443-449) presentan la particularidad que sólo tienen unas pocas mutaciones responsables de la HF; esto es consecuencia de un efecto fundador y, por lo tanto, la frecuencia de heterocigotos en estas poblaciones es más alta que lo estimado para otras poblaciones.

Los pacientes con HF presentan una concentración de colesterol en plasma muy elevada, por regla general superior al percentil 95. La mortalidad de los pacientes con HF, ajustada por edad y sexo, es entre cuatro y cinco veces más alta que en la población general (Scientific Steering Committee on behalf of the Simón Broome Register Group.

Atherosclerosis 1999; 142:105-115). Los pacientes que heredan dos mutaciones en el locus del gen del r-LDL se denominan HF homocigotos o HF heterocigotos compuestos, en cuyo caso prácticamente no hay receptores funcionales, lo que condiciona que la concentración de c-LDL se eleve entre seis y ocho veces en relación a la considerada normal. La mayoría de pacientes de esta categoría presentan enfermedad coronaria antes de los 20 años (Goldstein JL y col. N Engl J Med 1983; 309:288-296). Si los pacientes homocigotos o los heterocigotos fueran diagnosticados antes de que presentaran signos de enfermedad coronaria y tratados de forma preventiva, su riesgo de infarto de miocardio se vería reducido de forma sustancial.

El r-LDL es una glicoproteína ubicua de membrana de 839 aminoácidos que capta e internaliza partículas LDL por un mecanismo denominado de endocitosis (Goldstein J. y Brown M. J Biol Chem 1974; 249:5153-5162).

El gen del r-LDL se encuentra situado en el brazo corto del cromosoma 19 región pl3.1-13.3 (Yamamoto T y col. CeIl 1984; 39:27-38), tiene un tamaño de 45.000 pares de bases (pb). Este gen consta de 18 exones y 17 intrones los cuales codifican los seis dominios funcionales de la proteína: el péptido señal, el dominio de unión del ligando, el dominio homólogo al factor de crecimiento epidérmico (EGF), la zona de glicosilación, el dominio transmembrana y el citoplásmico (Sundhof T y col. Science 1985; 228:893-895).

La síntesis de r-LDL se encuentra regulada por un sofisticado mecanismo de retroalimentación que controla la transcripción del gen del r-LDL en función de las variaciones de la concentración intracelular de esteróles y la demanda celular de colesterol (Sudhof TC y col. J Biol Chem 1987; 262:10773-10779). Las secuencias del ADN necesarias para la regulación de la transcripción del gen del r-LDL están situadas en una región de 177 pb de la zona promotora (Sudhof TC y col. J Biol Chem 1987; 262:10773-10779). Esta región contiene todos los elementos en cis que permiten la expresión basal así como la regulación por esteróles y contiene tres repeticiones de 16 pb cada una. Las repeticiones 1 y 3 contienen un sitio de unión para el factor de transcripción

SpI y son esenciales para que se produzca la expresión basal del gen, pero requieren de la contribución de la repetición 2 para la expresión completa (Dawson PA y col. J Biol Chem 1988; 263;3372-3379). La repetición 2 incluye un elemento de regulación por esteróles de 10 pb, SRE-I (Smith JR y col. J Biol Chem 1990; 265:2306-2310) que posibilita la unión del factor de transcripción denominado SREBP-I, el cual aumenta la transcripción cuando la concentración de esteróles intracelulares disminuye. Hasta la fecha, se han descrito varias mutaciones situadas en los elementos reguladores de la transcripción del receptor LDL (Hobbs HH, y col. Hum Mutat 1992; 1:445-466; Koivisto UM, y col. Proc Nati Acad Sci USA, 1994; 91:10526-10530), Mozas P, y col J Lipid Res 2002; 43:13-18, http://www.ucl.ac.uk/fh; http://www.umd.necker.fr). El exón 1 codifica el péptido señal, el cual consiste en una secuencia de 21 aminoácidos que es eliminada de la proteína durante la translocación que tiene lugar en el retículo endoplásmico. Se han descrito varias mutaciones en este exón que incluyen cambios de pauta de lectura, cambios de aminoácido o codones de parada (http://www.ucl.ac.uk/fh; http://www.umd.necker.fr).

Los exones del 2 al 6 codifican el dominio de unión al ligando, el cual consta de siete repeticiones en tándem de 40 aminoácidos. La estructura de este dominio ha sido resuelta de forma parcial (Jeon H y col. Nature Struc Biol 2001; 8:499-504). En cada repetición tiene una agrupación de aminoácidos cargados negativamente Asp-X-Ser- Asp-Glu y seis restos de cisteína que forman tres enlaces disulfuro.

El segundo dominio del r-LDL consta de una secuencia de 400 aminoácidos codificada por los exones 7 al 14. Esta secuencia tiene un 33% de homología con el factor precursor del crecimiento de la epidermis (EGFP). Al igual que el dominio de unión al ligando, esta región contiene tres repeticiones de 40 aminoácidos con secuencias ricas en cisteína. Las dos primeras repeticiones, denominadas A y B, son contiguas y están separadas de la tercera repetición por una región de 280 aminoácidos que contiene cinco copias de la secuencia YWTD (Tyr-Trp-Thr-Asp). El dominio análogo al EGFP es fundamental para la disociación acida del r-LDL de las partículas recubiertas de clatrina que tiene lugar en el endosoma durante el proceso de reciclado del receptor. De todas las mutaciones descritas hasta la fecha, aproximadamente el 55% están localizadas en la región homologa EGFP y el 35% están localizadas en las repeticiones YWTD (http://www.ucl.ac.uk/fh).

El tercer dominio del r-LDL , codificado por el exón 15, es una región en la que abundan los aminoácidos treonina y serina. La función de este dominio se desconoce, pero se sabe que en esta región están ancladas las cadenas de carbohidratos. Esta zona está muy poco conservada en seis especies analizadas y se cree que desempeña una función estabilizadora del receptor. (Goldstein y col. en The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease. Editores: Sciver CR, Beaudet AL, SIy WS, Valle D. 7^th Edition. McGraw Hill, 1995: 1981-2030). El dominio transmembrana consta de 22 aminoácidos hidrofóbicos codificados por el exón 16 y el extremo 5' del exón 17. Este dominio es esencial para el anclaje del receptor a la membrana celular.

El dominio citoplásmico del r-LDL está formado por una secuencia de 50 aminoácidos codificada por la región 3' del exón 17 y la 5' del exón 18. Este dominio contiene dos secuencias señal que permiten dirigir la proteína a la superficie celular y situar al receptor en las partículas revestidas (Yokode M, y col. J CeIl Biol 1992; 117: 39-46). Este dominio es uno de los más conservados, con un porcentaje de aminoácidos conservados del 86 % entre seis especies analizadas.

Las mutaciones del r-LDL que se han encontrado en pacientes con HF se clasifican en 5 clases: alelos nulos, alelos defectuosos en el transporte, alelos defectuosos en la unión, alelos defectuosos en la internalización y alelos defectuosos en el reciclado. Por regla general cada categoría está asociada con mutaciones localizadas en una región del gen que codifica un dominio particular de la proteína. (Hobbs HH, y col. Hum Mutat 1992; 1:445-466). La heterogeneidad que presentan los pacientes con HF en cuanto a los niveles plasmáticos de colesterol ligado a LDL(c-LDL) y enfermedad coronaria se debe en parte a diferencias en cuanto al tipo de mutación (Sun XM y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13:1680-1688, Kotze y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1993; 13:1460-1468; Gudnason V y col. Arterioscler Thromb Vas Biol 1997; 17:3092-3101). Por otra parte, el descenso que se produce en la concentración del c-LDL en pacientes HF heterocigotos tras el tratamiento con inhibidores de la hidroxi-metilglutaril coenzima A (HMGCoA) reductasa depende, en parte, de la naturaleza de la mutación del gen r-LDL (Leisterdorf E y col. Circulation 1993; 87:35-44; Jeenah M y col. Atherosclerosis 1993; 98:51-58, Sijbrands EJG y col. Atherosclerosis 1998; 136:247- 254).

El principal ligando del receptor es la partícula LDL, la cual contine una sola copia de una proteína denominada la apolipoproteína B-100 (ApoB-100) (Goldstein J y Brown M J Biol Chem 1974; 249:5153-5162). Esta apolipoproteína tiene una zona en la que abundan los aminoácidos básicos y es el lugar donde se une al receptor (Borén J y col. J Clin Inves 1998; 101: 1084-1093). Se han encontrado varias mutaciones en el gen de la apoB-100 que alteran la funcionalidad de la proteína y disminuyen la capacidad de retirada de las partículas LDL, dando como resultado el acumulo de c- LDL en plasma. Hasta la fecha se han descrito cuatro mutaciones en el gen de apo B- 100 que cursan con una hipercolesterolemia que se denomina apolipoproteína B defectuosa familiar (BDF); todas estas mutaciones se encuentran localizadas en el dominio de unión de la apo-BlOO; aminoácidos 3130-3630: R3480W, R3500Q, R3500W y R3531C (Soria L y col. Proc Nati Acad Sci USA 1989; 86: 587-591; Pullinger CR, y col. J Clin Invest 1995; 95:1225-1234; Gaffney D, y col. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1995; 15:1025-1029; Boren J, y col. J Biol Chem 2001; 276:9214- 9218). Una mutación que cambia el codón de la posición 3500, CGG, por CAG, dando lugar a una sustitución de una Glutamina por Arginina (R3500Q), es la más frecuente de todas las que cursan con BDF. Los pacientes heterocigotos para la mutación apo B-3500 son por regla general hipercolesterolémicos, aunque su concentración de colesterol total plasmático varía dentro del rango observado en pacientes con HF hasta concentraciones moderadamente elevadas. (Tybjaerg-Hansen A, y col. Atherosclerosis 1990; 80:235- 242; Hansen PS, y col. Arterioscl Throm Vasc Biol 1997; 17:741-747). Dado que las características y bioquímicas de estos pacientes son muy similares, el diagnóstico diferencial entre los pacientes con BDF o HF sólo es posible a través del diagnóstico genético molecular. El diagnóstico clínico de la HF se fundamenta en los datos analíticos de lípidos y lipoproteínas del plasma, sintomatología clínica (xantomas) e historia familiar y personal de enfermedad coronaria. La OMS, a través de su programa MedPed, recomienda una serie de criterios a seguir para llevar a cabo el diagnóstico clínico de HF. Estos criterios están basados en una puntuación que depende de la historia personal y familiar de hipercolesterolemia, características clínicas y analítica del paciente. Cuando la puntuación que alcanza el paciente es igual o superior a 8 puntos el criterio clínico de diagnóstico de HF se clasifica como "seguro", entre 5 y 8 puntos de "probable" y entre 3 y 5 puntos de "posible" (Familial Hypercholesterolemia. Report of a second WHO consultation. The International MedPed FH Organization, Geneva 1998). Sin embargo, algunos pacientes no cumplen con los criterios de HF porque la historia familiar es incompleta o desconocida, o bien porque en el momento del análisis sólo presentan concentraciones moderadas de colesterol plasmático y carecen de signos de depósito de colesterol en tejidos, tales como xantomas tendinosos, arco corneal o xantelasmas. En familias cuya mutación del gen del r-LDL se conoce, se ha demostrado que, el mejor "punto de corte" para el diagnóstico, es utilizar el percentil 90 para la concentración de c-LDL (Umans-Eckenhausen MAW y col. Lancet 2001; 357:165-168. Sin embargo, el 18% de los pacientes portadores de la mutación presentan una concentración de colesterol total por debajo de este percentil; por otra parte, la proporción de falsos positivos fue también del 18%. Por lo tanto, se comete un porcentaje alto de diagnósticos equivocados si se utiliza sólo la cifra de colesterol plasmático. Se ha publicado que más del 50% de los pacientes con HF no reciben tratamiento farmacológico hipolipemiante ni consejo dietético como consecuencia de no haber sido diagnosticados correctamente como pacientes con HF (Williams RR y col. Am J Cardiol 1993; 72:18D-24D). El conocimiento de las bases moleculares de la HF ha permitido que se pueda realizar el diagnóstico inequívoco a nivel del ADN en la gran mayoría de casos: la demostración de un defecto molecular en el gen del r-LDL constituye una confirmación definitiva del diagnóstico (Familial Hypercholesterolemia. Report of a second WHO consultation. The International MedPed FH Organization, Geneva 1998). El diagnóstico preciso de la HF es posible utilizando métodos de biología molecular; sin embargo, en la actualidad su utilidad en poblaciones heterogéneas se encuentra limitada debido a la gran heterogeneidad de las mutaciones del gen del r-LDL, lo que dificulta la sistematización del estudio diagnóstico. En la solicitud PCT WO-88/03175 (Biotechnology Research Partners, Ltd.) se reivindica un método para el diagnóstico de la aterosclerosis que se basa en la detección de la presencia o ausencia de varios polimorfismos en la región génica de la apolipoproteína AI-CIII-AIV, o en los genes apoB, apoCI, apoAII, así como en el gen del receptor de LDL. Concretamente para este gen, se presenta el empleo de los polimorfismos Cfrl31 y BstEII.

Otro documento de interés es la patente japonesa JP- 10099099, que se refiere al empleo de una mutación en el triplete codificante del aminoácido 109, en concreto la inserción de una C, para el diagnóstico de anormalidades en el gen del receptor de LDL, aunque no se menciona concretamente la hipercolesterolemia familiar. Las patentes norteamericanas US-4.745.060 y US-4.966.837, ambas de la

Universidad de Texas, presentan métodos para el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar basándose en mutaciones en el gen del receptor de LDL. Sin embargo, lo que se reivindica en la primera de ellas son secuencias correspondientes al gen "normal", presentando un ejemplo puntual de una mutación que se define por el cambio del mapa de restricción con Xba I. En la segunda patente, por su parte, se reivindica el empleo de varias enzimas de restricción (Eco RI, Asp 718, Taq I, Bam HI, Xba I, Inf. I, BgI II, CIa I, Eco RV, Kpn I, Pvu II, Sph I, Sst I, Sst II, Stu I, Xho I, Nde I y Nsi I) en un método para determinar mutaciones en el gen r-LDL, que se basa en observar la alteración del modelo de restricción con estas enzimas frente al modelo correspondiente al gen normal.

Los documentos de patentes más próximo a la invención son WO02/06467 y WO01/53520, en los que se describen métodos de detección de errores en el metabolismo lipídico basado en una serie de polimorfismos y mutaciones del gen r- LDL, entre las que se encuentran algunas deleciones. Ninguna de las mutaciones descritas en dichas patentes coinciden con las reivindicadas en la presente solicitud; tampoco coinciden los métodos propuestos para la sistematización del análisis.

La solicitud de Patente ES200300206 y las Patentes de Adición a ella ES200302671 y ES200403041, desarrolladas por el mismo grupo que la presente invención, describen un dispositivo de ensayo in vitro para el diagnóstico extracorpóreo de la hipercolesterolemia familiar en el que se combina la detección de mutaciones puntuales en el gen r-LDL descritas por primera vez en las mencionadas solicitudes con la detección de mutaciones y polimorfismos ya descritos, mediante una serie de sondas oligonucleotídicas capaces de hibridar con dichas mutaciones. A pesar de su utilidad para la sistematización del diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar mediante en análisis de posibles mutaciones en el gen r-LDL, las mutaciones detectadas por este dispositivo son mutaciones que implican a un número muy pequeño de nucleótidos, no estudiándose la posible presencia de los llamados reordenamientos génicos, definiéndose como tales las deleciones o inserciones en la secuencia del gen que implican a un número extenso de nucleótidos y que pueden afectar a más de un exón.

En las bases de datos de mutaciones publicadas del gen r-LDL, http://www.ucl.ac.uk/fh y http://www.umd.necker.fr/LDLR, se han descrito deleciones e inserciones que van desde una sola base a reordenamientos génicos mayores de 20 kb. Estas deleciones o inserciones del gen r-LDL aparecen en aproximadamente un 5-10% de los pacientes con diagnóstico certero de Hipercolesterolemia Familiar (Heath K et al. J Med Genet 2000; 37:272-280; Chaves FJ et al, Eur J Clin Invest 2001; 31(4):309- 317). El diseño de un método de detección de estos reordenamientos rápido y fácil de utilizar sería de gran utilidad para permitir un diagnóstico fiable de la HF utilizando técnicas de biología molecular. Dicha técnica, además, permitiría extender el estudio de mutaciones puntuales en el gen del receptor de las LDL a aquellos pacientes que presenten un cuadro clínico de Hipercolesterolemia Familiar en los que no se haya diagnosticado ninguna mutación puntual.

Por ello, uno de los objetivos de la presente invención es el diseño de una técnica que permita el diagnóstico de la hipercolesterolemia familiar a partir de la detección de grandes y pequeños reordenamientos a lo largo de todo el gen del receptor de LDL, técnica que permita identificar de forma precisa y fiable los exones y/o promotores que estén afectados por este tipo de alteraciones de forma forma rápida y fácil de estandarizar. Este objetivo se cumple mediante el método proporcionado por la invención. Otro objetivo de la presente invención es la identificación de nuevos reordenamientos, no descritos hasta ahora, para completar el conocimiento de las mutaciones del gen r-LDL, su asociación con el desarrollo de la hipercolesterolemia familiar y posibilitar el diagnóstico de esta enfermedad mediante técnicas de biología molecular que detecten mutaciones en dicho gen del r-LDL.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona una método de detección de grandes y pequeños reordenamientos génicos basada en el análisis cuantitativo de fragmentos de ADN obtenidos por PCR multiplex y marcados fluorescentemente. El método permite el análisis de dichos reordenamientos a lo largo de todo un gen, incluyendo el promotor y la totalidad de los exones de dicho gen, pudiendo identificarse aquellos que estén afectados por este tipo de alteraciones en un paciente concreto. En particular, el método permite la detección de grandes y pequeños reordenamientos a lo largo de todo el gen r- LDL, lo que incluye el promotor y los 18 exones que constituyen la secuencia génica del gen.

Dicho método de detección de reordenamientos comprende las siguientes etapas: a) realización de una serie de PCR multiplex que permitan la amplificación de todos los exones y el promotor del gen r-LDL, utilizando al menos una pareja de cebadores capaz de amplificar al menos la parte de la secuencia donde se encuentra el reordenamiento, a los que se les ha añadido un cebador universal adicional en el extremo 5'; b) realización de una PCR secundaria sobre los fragmentos amplificados obtenidos en las PCR multiplex de la etapa a) haciendo uso de los cebadores universales previamente utilizados en dicha etapa a), en los que al menos uno se encuentra marcado con un compuesto que permita la posterior detección de los fragmentos amplificados; c) comparación entre los mareajes de los fragmentos amplificados en la PCR secundaria correspondientes a una muestra control, sin reordenamientos, y una muestra de un paciente con hipercolesterolemia familiar.

Una realización preferida de la presente invención consistiría en: a) realización de una serie de PCR multiplex que permitan la amplificación de todos los exones y el promotor del gen r-LDL, utilizando al menos una pareja de cebadores seleccionados del grupo de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 39 a los que se les ha añadido un cebador universal adicional en el extremo 5'; b) realización de una PCR secundaria sobre los fragmentos amplificados obtenidos en las PCR multiplex de la etapa a) haciendo uso de los cebadores universales previamente utilizados en dicha etapa a), en los que al menos uno se encuentra marcado con un compuesto que permita la posterior detección de los fragmentos amplificados; c) comparación entre los mareajes de los fragmentos amplificados en la PCR secundaria correspondientes a una muestra control, sin reordenamientos, y una muestra de un paciente con hipercolesterolemia familiar.

Las ventajas que presenta esta técnica frente a las utilizadas anteriormente (Southern blot, PCR larga...) son varias:

- rapidez y facilidad de estandarización del método

- mayor Habilidad en el diagnóstico

- requiere pequeñas cantidades de ADN

- un único análisis permite el estudio de todo el gen r-LDL Además, la posibilidad de detectar grandes y pequeños reordenamientos permite extender el estudio del gen del receptor de las LDL a aquellos pacientes en los que no se haya detectado ninguna mutación puntual en dicho gen pero que presenten o se sospeche que puedan presentar un cuadro clínico de hipercolesterolemia familiar.

Adicionalmente, se han detectado y caracterizado toda una serie de mutaciones nuevas que se detallan más adelante y que suponen grandes reordenamientos en el gen r-LDL. Tanto estas mutaciones detectadas por primera vez, como los restantes reordenamientos ya descritos, pueden detectarse mediante el método de la invención para analizar la probabilidad de que un individuo desarrolle hipercolesterolemia familiar. Todos los reordenamientos que en esta invención se relacionan con el desarrollo de la hipercolesterolemia familiar se producen en la secuencia génica SEQ ID NO: 1 correspondiente al gen del receptor de lipoproteínas de baja densidad (r-LDL). Es decir, todas las mutaciones se producen en el mismo gen, se emplean en el mismo dispositivo de ensayo, utilizándose la misma tecnología, para determinar, según un mismo método, extracorpóreamente e in vitro, la probabilidad de desarrollar la misma enfermedad, lo que apoya el carácter unitario de la invención.

En la Tabla I se detallan los nuevos reordenamientos detectados, así como otros reordenamientos de los que se ya había informado previamente (R0004: Hobbs et ai, 1990. Ann Rev Genet 24:133 y Hobbs et al.,1992. Hum Mut 1:445; R005: Chaves FJ et al., 2001. Eur J Clin Invest 31(4): 309-317; R006: Hobbs et al. 1992. Hum Mutat 1:445; R015: Bertolini et al., 1995. Arteriesclerosis Thromb Vasc Biol 15: 81; R016: Lelli et al, 1991. J Med Genet 24:144) que han sido detectados utilizando el método de la invención, demostrando la validez de este método para ser utilizado en el diagnóstico, extracórporeo e in vitro, de la hipercolesterolemia familiar, mediante la detección de reordenamientos en el gen del rLDL.

TABLA L-

Deleciones detectadas mediante el método de la presente invención

Más adelante se describe un ejemplo de aplicación del método de detección de grandes y pequeños reordenamientos, aportándose datos concretos de la puesta a punto del método y su validez para la detección de grandes reordenamientos mediante la aplicación a muestras en la que es conocida la presencia de deleciones o inserciones.

Posteriormente se describe la detección de mutaciones del gen r-LDL descritas por primera vez en la presente invención y se muestran ejemplos de su detección mediante el método de la presente invención, ilustrados mediante las figuras que se describen a continuación.

Breve descripción de los figuras

- La Figura IA muestra la localización a lo largo del gen r-LDL de los cinco grandes fragmentos amplificados para la detección de reordenamientos en muestras de pacientes. - La Figura IB muestra el resultado de someter a electroforesis el producto de la amplificación mediante PCR de los fragmentos indicados en la Figura IA en una muestra de ADN en la que el gen r-LDL no presentaba reordenamientos. En los extremos laterales aparecen bandas correspondientes a marcadores de tamaño (Mr). - La Figura 2 muestra la electroforesis en la que se detectó la presencia de la deleción R003.

- La Figura 3 muestra la caracterización de la deleción R003 mediante la electroforesis de los productos de la amplificación, en un control sin reordenamientos (C) y en la muestra analizada (M), de los subfragmentos cuya localización se indica en la parte inferior de dicha figura.

- La Figura 4 muestra el electroferograma de detección de la deleción R003 mediante la técnica del análisis cuantitativo de fragmentos de ADN marcados fluorescentemente (TACFAMF). Se representan los picos correspondientes a las áreas de los fragmentos de un control de ADN (línea discontinua) y de la muestra portadora de la deleción (línea continua).

- La Figura 5 muestra los electroferogramas de detección de la deleción R004 mediante la técnica del análisis cuantitativo de fragmentos de ADN marcados fluorescentemente (TACFAMF). Se representan los picos correspondientes a las áreas de los fragmentos de un control de ADN (línea discontinua) y de la muestra portadora de la deleción (línea continua).

- La Figura 6 muestra los electroferogramas de detección de la deleción R005 mediante la técnica del análisis cuantitativo de fragmentos de ADN marcados fluorescentemente (TACFAMF). Se representan los picos correspondientes a las áreas de los fragmentos de un control de ADN (línea discontinua) y de la muestra portadora de la deleción (línea continua).

- La Figura 7 muestra la electroforesis en la que se detectó la presencia de la deleción R008.

- La Figura 8 muestra la caracterización de la deleción R008 mediante la electroforesis de los productos de la amplificación, en un control sin reordenamientos y en la muestra analizada, de los subfragmentos cuya localización se indica en la parte inferior de dicha figura.

- La Figura 9 muestra los electroferogramas de detección de la deleción R008 mediante la técnica del análisis cuantitativo de fragmentos de ADN marcados fluorescentemente (TACFAMF). Se representan los picos correspondientes a las áreas de los fragmentos de un control de ADN (línea discontinua) y de la muestra portadora de la deleción (línea continua).

- La Figura 10 muestra los electroferogramas de detección de la deleción RO 13 mediante la técnica del análisis cuantitativo de fragmentos de ADN marcados fluorescentemente (TACFAMF). Se representan los picos correspondientes a las áreas de los fragmentos de un control de ADN (línea discontinua) y de la muestra portadora de la deleción (línea continua)

Ejemplo 1: Método detallado de detección de reordenamientos Como se ha comentado anteriormente, el método de detección de reordenamientos se basa en una Técnica de Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentementemente (TACFAMF) obtenidos por PCR multiplex . La aplicación del método requiere la realización de las siguientes etapas:

a) PCR multiplex

A partir de una muestra de ADN se procede a la amplificación de todos los exones y el promotor del gen rLDL. En la realización preferida de la invención, se emplean 0,8 μg de ADN y su amplificación se realiza mediante cuatro PCR multiplex: E, F, G y H. Para llevar a cabo estas cuatro amplificaciones en las PCR multiplex se utilizan los cebadores correspondientes, según se indica posteriormente en la Tabla II, a los que se les ha añadido un cebador universal (tag) en el extremo 5' para posibilitar la etapa b) siguiente de PCR secundaria específica. En la realización preferida de la invención, las condiciones de amplificación puestas a punto para estas cuatro multiplex han sido optimizadas de modo que la reacción de PCR no alcance en ningún caso su fase exponencial. El desarrollo de la PCR dentro de una escala linea es un paso importante ya que, de esta forma, el amplificado obtenido será proporcional al ADN de partida. De esta forma se establece una relación proporcional entre la cantidad de ADN de partida de la muestra y el producto de PCR que posteriormente se cuantifica.

Las agrupaciones de exones amplificados, los tamaños de los fragmentos y los cebadores utilizados en estas cuatro PCR multiplex son los que se detallan a continuación en la Tabla II: Tabla II Cebadores utilizados, exones y fragmentos amplificados en las PCR multiplex

En la realización preferida de la invención, las reacciones de amplificación de cada una de las PCR multiplex se llevan a cabo en un volumen final de 25 μl a partir de 100 ng de ADN en una mezcla 10X de tampón de PCR (Applied Biosystems), MgCl₂ 1,5 mM (Applied Biosystems), dNTPs 0,1 mM, la mezcla de cebadores correspondiente a cada una de las multiplex ajustados a diferentes concentraciones y 1,5 U de polimerasa Taq GoId (Applied Biosystems). El programa de amplificación utilizado es: 1 ciclo de 10 minutos de desnaturalización a 96°C, 16 ciclos de: 30 segundos de desnaturalización a 94°C, 1 minuto de hibridación a 62°C y elongación a 72°C durante 3 minutos y una extensión final a 72°C durante 10 minutos.

b) PCR secundaria

Los productos obtenidos en las PCR multiplex son sometidos a una PCR secundaria utilizando la pareja de cebadores universales con los que se habían marcado previamente en 5' los cebadores utilizados en la etapa a). En la realización descrita de la invención, la pareja de cebadores utilizada es la siguiente :

Tag Directo: 5' TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GA 3 ' (SEQ ID NO:40) y Tag Reverso 5'AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GA 3' (SEQ ID NO:41) de los cuales el cebador reverso, Tag Reverso, se utiliza en esta etapa marcado con un fluoróforo.

Para el mareaje de cada una de las cuatro PCR multiplex se utiliza un fluoróforo distinto, los fluoróforos utilizados son: 6-FAM, VIC, PET y NED. En la realización preferida descrita, las condiciones de esta PCR han sido ajustadas para mantener igualmente una amplificación lineal. De este modo, la intensidad de los amplificados tras la segunda amplificación no supera la escala lineal de detección del secuenciador automático ABI PRISM modelo 3100, de Applied Biosystems, en el que se analizan los fragmentos amplificados.

La reacción de amplificación de cada una de las PCR secundarias se llevó a cabo en un volumen final de 15 μl a partir de 5 μl de cada una de las PCRs multiplex (dilución previa 1:5) en una mezcla de 10X PCR buffer (Applied Biosystems), 1,5 mM MgCl₂ (Applied Biosystems), 0,1 mM dNTPs, 9 μM de cebadores universales tag cuyo reverso está marcado con un fluoróforo correspondiente a cada una de las multiplex y 1,5 U de polimerasa Taq GoId (Applied Biosystems). El programa de amplificación utilizado es: 1 ciclo de 10 minutos, de desnaturalización a 96° C, 18 ciclos de: 30 segundos de desnaturalización a 94° C, 1 minuto de hibridación a 55° C y elongación a 72° C durante 1 minuto y una extensión final de 72° C durante 10 minutos.

c) Detección diferencial de los fragmentos amplificados

En la realización descrita, el análisis de los fragmentos obtenidos en la PCR secundaria se llevó a cabo en un secuenciador automático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems. Se mezclan 2 μl de los productos de PCR secundaria correspondientes a las multiplex E y G y I μl de las multiplex F y H, 0,5 μl del marcador de tamaño GeneScan 500 LIZ y el resto hasta un volumen final de 25 μl es HiDi formamida. Las áreas de los picos obtenidos en el análisis de fragmentos son calculadas usando el software de análisis GeneScan 3.7. De esta forma, en un único análisis se mezclan 5 colores, correspondientes a las cuatro PCR multiplex y el marcador de tamaño, que nos permite obtener las áreas de los picos correspondientes a todos los exones y el promotor del gen r-LDL de una muestra.

d) Selección de controles y análisis de los datos En la realización descrita, se seleccionó como control de ADN (no presenta alteraciones en el gen r-LDL) la línea celular K562 (Promega). La puesta a punto de las condiciones de las PCR multiplex, PCR secundaria y análisis de fragmentos, descritas en los pasos a), b) y c), se llevó a cabo mediante el análisis de cuatro réplicas del ADN control hasta que se lograron resultados reproducibles interanálisis e intraanálisis para el posterior estudio de pacientes. El análisis de los datos se realiza a partir de los valores del área de los picos correspondientes a cada uno de los exones y promotor del gen r-LDL, obtenidos tras el análisis de fragmentos en el secuenciador automático. Se calculan los ratios de cada exón mediante la relación entre las áreas de los fragmentos del exón frente a las áreas de los otros cuatro exones, dentro de cada grupo multiplex. En total se llevan a cabo 4 análisis por cada exón en cada grupo multiplex, excepto en el grupo E que son en total 3 análisis (sólo se analizan 4 exones). Estos análisis se llevan a cabo en plantillas excel.

Posteriormente se calculan la media y la desviación estándar de las cuatro réplicas control a partir de los ratios de cada exón. Para que el análisis sea considerado válido, la desviación estándar respecto de la media de los ratios de intensidad (exón vs. exón) de las réplicas del control K562 debe ser < 15%. Una vez que se comprueba que la relación entre las cuatro réplicas del ADN control en todos los exones de los 4 grupos multiplex es considerada como válida, se puede proceder al análisis de muestras con reordenamientos.

e) Cálculo de los límites de normalidad

Para proceder al cálculo de los límite superiores e inferiores de normalidad, se recurre tanto a muestras positivas en las que se conoce que existen inserciones o deleciones como a muestras negativas en las que tales reordenamientos no existen. El proceso de análisis de los fragmentos de amplificación correspondientes a estas muestras es el mismo que el anteriormente descrito para las réplicas del ADN control, pero usando sólo dos réplicas por cada muestra en concreto. Posteriormente se compara la media de los ratios correspondientes a cada muestra frente a la media de los ratios del ADN control para obtener los porcentajes de variación respecto del control en cada uno de los exones de los cuatro grupos multiplex. Si estos porcentajes se encuentran en torno al 100%, se descartan posibles deleciones o inserciones.

Con los porcentajes de variación de muestras negativas se calcula la media y la desviación estándar de todos ellos y se establecen los límites superiores e inferiores de normalidad para cada análisis. De esta forma los porcentajes de variación en los análisis de pacientes deben quedar dentro de estos límites.

Empleando esta metodología se consiguió identificar grandes reordenamientos en varios controles positivos de grandes reordenamientos. Los datos obtenidos de estos controles permitieron elaborar intervalos de confianza, tanto para deleciones como para inserciones. De esta forma se han podido establecer los intervalos de confianza de normalidad y los límites superiores e inferiores de inserciones/deleciones. f) Análisis de muestras de pacientes

Como se ha descrito para el caso de las muestras en las que se conoce ya la existencia de reordenamientos, el proceso de análisis de fragmentos de amplificación de individuos en los que se desea detectar la posible existencia de un reordenamiento es el mismo que el descrito para las réplicas del ADN control, pero usando dos réplicas para cada paciente. Además, en el procedimiento de estudio de estas muestras se incluye siempre la amplificación de una muestra que actúa como control positivo por presentar un gran reordenamiento y una muestra que actúa como control negativo por no presentar ningún reordenamiento. Una vez obtenidos los datos, se compara la media de los ratios de los pacientes frente a la media de los ratios del ADN control negativo para obtener los porcentajes de variación de los pacientes respecto del control en cada uno de los exones de los cuatro grupo multiplex. Si estos porcentajes se encuentran en torno al 100%, se descartan posibles deleciones o inserciones. Finalmente en cada análisis de pacientes se incluye siempre una muestra control positivo que presente un gran reordenamiento y una muestra control negativo que no presente ningún gran reordenamiento.

Por tanto se considerará que un paciente presenta una deleción o duplicación cuando se cumplan simultáneamente las premisas siguientes: i) la media del conjunto de las réplicas de la muestra se encuentra fuera de los valores de normalidad establecidos, ii) la media del conjunto de las réplicas se encuentra por debajo o por encima de los valores superiores o inferiores establecidos en el intervalo de confianza para las deleciones o inserciones, respectivamente, iii) cada réplica de la muestra del paciente debe cumplir por separado los requisitos arriba expuestos.

En los siguientes ejemplos se muestra la identificación de nuevos reordenamientos en el gen r-LDL desconocidos hasta ahora, cuya existencia se confirma por el método de la invención, así como la demostración de la validez del método aplicándolo a muestras de ADN en las que ya se conocía la existencia de deleciones.

Ejemplos de análisis de muestras con reordenamientos

Para el estudio de los reordenamientos, se utilizó el ADN de pacientes con diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar tras analizar cinco grandes fragmentos del gen del r-LDL. Estos fragmentos se diseñaron de forma que tres de los fragmentos (1, 2 y 3) abarcan el gen completo del r-LDL, mientras que los otros dos (4 y 5) solapan con los fragmentos anteriores. La Figura IA muestra la distribución de estos fragmentos a lo largo del gen, mientras que en la Tabla III se indican los tamaños exactos de cada uno de estos fragmentos, las cotas de nucleótidos entre las que se encuentran según la numeración de la secuencia del gen r-LDL depositada en la base de datos GenBank y que tiene el número de acceso AY324609 (www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank) y los cebadores utilizados para la amplificación de cada uno de ellos.

Tabla III.- Fragmentos del gen r-LDL analizados en el estudio de reordenamientos

Los fragmentos anteriores 1, 2, 3, 4 y 5 se amplificaron de manera simultánea mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción de PCR de los 5 fragmentos se llevó a cabo utilizando el mismo programa térmico en un termociclador PE GeneAmp® 9700, utilizando los cebadores citados en la Tabla HL La reacción de amplificación se llevó a cabo en un volumen final de 20 μL con 300 ng de DNA en una mezcla de 2OmM Tris-HCl, pH 8,4, 2,75 mM MgCl2, 500 μM de cada dNTP, 300 nM de cada cebador y 1,5 unidades de Expand Long Témplate (Roche). Los ciclos de amplificación fueron: una desnaturalización inicial a 94°C durante 2 minutos, seguido por 10 ciclos con una desnaturalización a 94 ⁰C durante 20 segundos, 20 segundos de hibridación a 64,5 ⁰C y extensión a 68°C durante 15 minutos; estos ciclos se continuaron con 19 ciclos iguales a los anteriores donde el tiempo de extensión se prolongó 15 segundos por ciclo. Al final de los ciclos se realizó una extensión a 68°C durante 7 minutos. Los fragmentos amplificados se separaron por electroforesis en geles de agarosa al 0,5% y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. La Figura IB muestra el resultado la electroforesis correspondiente a una muestra de ADN en el que no existían reordenamientos en el gen r-LDL.

La aplicación de esta metodología permitió detectar variaciones en los resultados de las electroforesis correspondientes a las muestras de distintos pacientes en los que se había diagnosticado hipercolesterolemia, indicando la presencia de reordenamientos. Posteriormente se procedió a la caracterización de dichos reordenamientos amplificando subfragmentos de los fragmentos en los que se había detectado un reordenamiento y secuenciando aquellos subfragmentos que mostraran un patrón diferente al del control al ser sometidos a una nueva electroforesis. Para realizar esta caracterización se utilizó el grupo de cebadores A2F, A2R, A3F, A6F, A7R, A8R, A9F, AlOF, AlOR, AIlF, AI lR, A12R, A13F, A13R, A14F y A16R (SEQ ID NO:52 a SEQ ID NO:67), que habían sido empleados anteriormente en estudios de detección de mutaciones del gen r-LDL realizados por el grupo de los autores, cebadores que se complementaron diseñando un juego de cebadores adicionales, cuya denominación y posición en el gen r-LDL según la numeración de la secuencia depositada en la base de datos GenBank de número de acceso AY324609 se indican a continuación en la Tabla IV.

Tabla IV.- Cebadores diseñados para la caracterización de las deleciones

La existencia de los reordenamientos se confirmó también posteriormente mediante la técnica basada en el análisis cuantitativo de fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) de la invención. Ejemplo 2: Análisis de la deleción de 3129 pb que comprende el exón 16 y la zona 5' del exón 17 (Código R003)

Esta deleción de 3129 pb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 3 como una doble banda con tamaños de 14,8 kb (alelo normal) y 11,8 kb (alelo mutado) (Figura 2).

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de tres subfragmentos del fragmento 3, A13-A16, A14-F3 y A14-A16. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla V.

Tabla V

Detalles de los subfragmentos del fragmento 3 amplificados para la caracterización de R003

En la Figura 3 se muestra la posición de estos subfragmentos a largo del gen del r-LDL, así como los resultados obtenidos tras someter a electroforesis el producto de la amplificación de dichos subfragmentos en la muestra estudiada. La secuenciación del fragmento A14-A16 mostró que la deleción era de 3.129 pb. Esta deleción comprende los nucleótidos 40.946 al 44.075 (numeración según acceso al GenBank AY324609), que incluyen en exón 16 y la zona 5' del exón 17.

Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF), aplicándola al análisis de fragmentos correspondientes al grupo multiplex G del gen r-LDL, obteniéndose en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems los resultados que se muestran en la Figura 4. En dicha figura puede observarse una disminución del área de los picos correspondientes a los exones 16 y 17 de la muestra portadora de la deleción (línea continua) con respecto al control sin reordenamientos (línea discontinua).

Esta deleción se encontró en un varón de 50 años con historia familiar de hipercolesterolemia autosómica dominante. El paciente presentaba arco corneal y sus cifras máximas de colesterol total (CT) y colesterol asociado a las LDL (cLDL) alcanzaron unos niveles de 350 y 282 mg/dl respectivamente, con concentraciones de triglicéridos (TG) y colesterol asociado a las HDL (cHDL) normales. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 6 puntos. El tratamiento hipolipemiante con un inhibidor de la HMGCoA reductasa redujo su concentración de CT y cLDL a 272 y 205 mg/dl respectivamente,

Ejemplo 3: Análisis de la deleción de 7595 pb que comprende los exones 17 y 18 (R004)

Esta deleción de 7595 pb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 3 como una doble banda

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de dos subfragmentos del fragmento 3, A14-C6 y C7-C6. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla VI.

Tabla VI

Detalles de los subfragmentos del fragmento 3 amplificados para la caracterización de R004

La secuenciación del fragmento C7-C6 mostró que la deleción comprendía un total de 7.595 pb. Esta deleción comprende los nucleótidos 41.297 a 47.892 (numeración según acceso al GenBank AY324609 y extensión de la secuencia). Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) aplicada al análisis de fragmentos correspondientes a los grupos multiplex G y H del gen r-LDL, obteniéndose en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems los resultados que se muestran en la Figura 5. En dicha figura puede observarse una disminución del área de los picos correspondientes a los exones 17 y 18 de la muestra portadora de la deleción (línea continua) con respecto al control sin reordenamientos (línea discontinua).

Esta deleción se encontró en cinco individuos aparentemente sin relación familiar y con diagnóstico clínico de hipercolesterolema familiar. Uno de estos pacientes era una mujer de 48 años con xantomas en los extensores de las manos y que había sufrido un infarto de miocardio a los 36 años de edad que preciso de cirugía coronaria. Sus cifras máximas de CT y cLDL alcanzaron unos niveles de 537 y 443mg/dl respectivamente, con niveles de TG de 307 mg/dl y cHDL de 32 mg /di. Un hermano de 61 años y un hijo de 29 años presentaban hipercolesterolemia con cifras de colesterol superiores a 300 mg/dl. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 17 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Atorvastatina (40mg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 320 y 234 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 4: Análisis de la deleción de 4 kb que afecta a la zona promotora del gen y el exón 1 (Código R005)

Esta deleción de 4 kb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 1 como una doble banda. La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de dos subfragmentos del fragmento 1, C8-A2 y C8-C4. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla VII. Tabla VII

Detalles de los subfragmcntos del fragmento 1 amplificados para la caracterización de R005

La secuenciación del fragmento C8-C4 mostró que la deleción era de aproximadamente 4 kb.

Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) aplicada al análisis de fragmentos correspondientes a los grupos multiplex G y H del gen LDL, obteniéndose en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems los resultados que se muestran en la Figura 6. En dicha figura puede observarse una disminución del área de los picos correspondientes al promotor en el grupo G (electroferograma superior) y al exón 1 en el grupo E (electroferograma inferior) de la muestra portadora de la deleción (línea continua) respecto del control sin reordenamientos (línea discontinua).

Esta deleción se encontró en un hombre de 38 años con arco corneal, con antecedentes familiares de hipercolesterolemia autosómica dominante y con cifras de CT de 402 mg/dl, c-LDL 321 mg/dl, TG 217 mg/dl y c-HDL de 37 mg/dl. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 12 puntos. El tratamiento hipolipemiante con Atorvastatina (lOmg/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 340 y 260 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 5: Análisis de la deleción de 5.113 pb que implica los exones 4, 5 y 6 (Código R006) Esta deleción de 5.113 pb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 4 como una doble banda .

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de cuatro subfragmentos del fragmento 4, A2-F4, A3-A7, C2-A7 y C3-7R. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla VIII.

Tabla VIII

Detalles de los subfragmentos del fragmento 4 amplificados para la caracterización de R006

La secuenciación del fragmento C3-7R mostró que la deleción era de aproximadamente 5 kb. Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF), de forma análoga a la de los ejemplos anteriores.

Esta deleción de 5 Kb se encontró en un hombre de 50 años con xantomas en los extensores de las manos y que había sufrido un infarto de miocardio a la edad de 40 años y con cifras de CT de 476 mg/dl, c-LDL: 408 mg/dl, TG: 115mg/dl y c-HDL: 45 mg/dl. Su madre, una hermana y un hijo presentaban cifras de colesterol total de 467, 392 y 386 mg/dl respectivamente El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 19 puntos. El tratamiento hipolipemiante combinado con simvastatina (40 mg/día) y fenofibrato (200 mg/día) redujo su concentración de CT a 296 mg/dl.

Ejemplo 6: Análisis de la deleción de 9.498 pb que elimina los exones 3, 4, 5 y 6 (Código R008)

Esta deleción de 9.498 pb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 4 como una doble banda con tamaños de 15,3 kb (alelo normal) y 5,5 kb (alelo mutado) (Figura 7).

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de tres subfragmentos del fragmento 4, A2-A8, A2-F4 y A2-A7. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla IX.

Tabla IX

Detalles de los subfragmentos del fragmento 4 amplificados para la caracterización de R008

En la Figura 8 se muestra la posición de estos subfragmentos a largo del gen del r-LDL, así como los resultados obtenidos tras someter a electroforesis el producto de la amplificación de dichos subfragmentos en la muestra estudiada. La secuenciación del fragmento A2-A7 mostró que la deleción era de 9.498 pb. Esta deleción comprende los nucleótidos 13.296 al 22.794 (numeración según acceso al GenBank AY324609), implicando a los elementos AIu situados entre las coordenadas 13246-13368 y 22563- 22874.

Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) aplicada al análisis de fragmentos correspondientes a los grupos de las multiplex E, F y H del gen r-LDL, obteniéndose en el secuenciador anutomático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems los resultados que se muestran en la Figura 9. En dicha figura puede observarse una disminución del área de los picos correspondientes a los exones 3, 4, 5 y 6 de la muestra portadora de la deleción (línea continua) con respecto al control sin reordenamientos (línea discontinua). Esta deleción de 9.498 pb se encontró en un varón de 53 años con historia familiar de hipercolesterolemia, xantomas aquíleos en los extensores de las manos. Su colesterol total y c-LDL fueron de 550 y 483 mg/dl respectivamente. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 17 puntos. El tratamiento hipolipemiante combinado con simvastatina (20 mg/día) y colestiramina (16g/día) redujo su concentración de CT y cLDL a 365 y 288 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 7: Análisis de la deleción de 6,7 kb que elimina los exones 7, 8, 9 y 10 (Código R013)

Esta deleción de 6,7 kb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición del fragmento 2 como una doble banda.

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de tres subfragmentos del fragmento 2, A6-A11, A6-A10 y C5-A10. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla X.

Tabla X

Detalles de los subfragmentos del fragmento 2 amplificados para la caracterización de R013

La secuenciación de los fragmentos A6-A10 y C5-A10 mostró que la deleción era de aproximadamente 6,7 kb.

Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) aplicada al análisis de fragmentos correspondientes a los grupos de las multiplex F y H del gen r-LDL, obteniéndose en el secuenciador automático ABI PRISM 3100 de Applied Biosystems los resultados que se muestran en la Figura 10. En dicha figura puede observarse una disminución del área de los picos correspondientes a los exones 7, 9 y 10 de la muestra portadora de la deleción (línea continua) con respecto al control sin reordenamientos (línea discontinua).

Esta deleción se encontró en un varón de 30 años con historia familiar de hipercolesterolemia y arco corneal. Las concentraciones de CT y c-LDL sin tratamiento hipolipemiante fueron de 408 y 351 mg/dl respectivamente. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 13 puntos. El tratamiento hipolipemiante con un inhibidor de la hidroximetil-glutatil CoA reductasa redujo sus cifras de de CT y cLDL a 240 y 176 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 8: Análisis de la deleción de 2,8 kb que implica los exones 11 y 12 (Código R015) Esta deleción de 2,8 kb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición de los fragmentos 2 y 5 como dobles bandas.

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de dos subfragmentos, A9-A12 y Cl-Cl. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla XI.

Tabla XI Detalles de los subfragmentos amplificados para la caracterización de ROl 5

La secuenciación del fragmento Cl-Cl mostró que la deleción era de aproximadamente 2,8 kb. Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) de forma análoga a la de los ejemplos anteriores.

Esta deleción de 2,8 Kb se encontró en una mujer de 59 años con historia personal de enfermedad vascular periférica y familiar de hipercolesterolemia. Las concentraciones de CT y c-LDL fueron de 600 y 457 mg/dl respectivamente. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 10 puntos. El tratamiento hipolipemiante con colestipol y pravastatina redujo sus cifras de de CT y cLDL a 419 y 278 mg/dl respectivamente.

Ejemplo 9: Análisis de la deleción de 3,8 kb que implica la eliminación de los exones 13 y 14 (Código R016)

Esta deleción de 3,8 kb se observó tras la amplificación de los cinco fragmentos y su separación por electroforesis en un gel de agarosa según el método anteriormente descrito, debido a la aparición de los fragmentos 3 y 5 como dobles bandas.

La deleción observada se caracterizó mediante amplificación por PCR de dos subfragmentos, AlO-Al 3, AI l -Al 3. Los tamaños teóricos de cada uno de estos subfragmentos, exones en ellos comprendidos y cebadores utilizados para su amplificación se muestran a continuación en la Tabla XII.

Tabla XII Detalles de los subfragmentos amplificados para la caracterización de ROl 6

La secuenciación del fragmento Al 1 -Al 3 mostró que la deleción era de 3,8 kb.

Alternativamente, esta mutación puede detectarse por el procedimiento descrito como Técnica basada en el Análisis Cuantitativo de Fragmentos de ADN Marcados Fluorescentemente (TACFAMF) de forma análoga a la de los ejemplos anteriores.

Esta deleción se encontró en una mujer de 57 años con historia personal de claudicación intermitente y familiar de enfermedad coronaria prematura e hipercolesterolemia. Su concentracionde CT previo al tratamiento hipolipemiante fue de 525 mg/dl. El diagnóstico clínico de hipercolesterolemia familiar alcanzó una puntuación según criterios del MedPed de 11 puntos. El tratamiento hipolipemiante con atorvastatina (20 mg/dl) redujo sus cifras de de CT y cLDL a 329 y 222 mg/dl respectivamente.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Secuencia génica correspondiente a SEQ ID NO :1 que presenta al menos un reordenamiento en el gen r-LDL que comprende al menos una de las siguientes deleciones: una deleción de 3129 pb que supone la deleción parcial de los exones 16 y 17, una deleción de 9498 pb que implica a los exones 3, 4, 5 y 6 o una deleción de 6,7 kb que implica a los exones 7, 8, 9 y 10, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro de la hipercolesterolemia familiar.

2.- Secuencia génica según la reivindicación 1, que comprende además alguna de las siguientes mutaciones puntuales: C134Y, C195Y, S174N, C100Y, C304Y, W422S, S533X, 1705delG, 1706-2 A>C, 1988-2 A>T, 2266delA, 2390-2 A>G, T433N, 818del8, 1423delGC/insA, 1204insT, 451del3, G516X, 2389+4A>G, 1815dell l, 1186+5G>A, T740M, I771T, R279G, T446I, H562Q, C74Y, D686Y, G(-2)R, E579D, S205C, D200V, V766E, L(-6)P, 2544insC, C42Y, 2389+3A>C, [1587- 5del5;1587del31], (-23)A>C, 1054 dell l, 108delC, 1197del9, 1207delT, 1432delG, 191-2delAinsCT, 2184delG, 231delC, 2399del5/ins4, 313+linsT, 338dell6, 510insC, 675dell5, 684dupl2, 941-39 OT, C127R, C195R, C255G, C319Y, D157G, D630N, E291X, H635N, N59K, T41M, W515X, Y379X, Y421X, 2393del9, (-42) C/G,(-49) C/T, 1045delC, 1061-8 T>C, A378T, C358R, 1358 + 1 G/A, 1706-10 G>A, 1845 + 1 G/C, 2085dell9, 211del G, 2140 + 5 G/A, 2207insT, 2390-1G/C, 313+1 G>C, 313+1 G/A, 313+2GinsT, 518 del G, 7delC, 872delC, 884delT, 920ins4, A519T, C113W, C255X, C281Y, C297F, C347Y, C371X, C646Y, C677Y, C68W, C74G, C95R, D151N, D200G, D200Y, D280G, ElOX, E246A, E256K, F634L, G322S, G352D, G571E, N543H, N804K, Q12X, Q133X, Q357P, Q427X, Q71 E, R395Q, R574W, R612C, S156L, S205P, T413K, T7051, V502M, W(-18)X, W541X, D679E, 1359 -1 G>A, 681ins21, C122X, V408M, G528D, D412H, N619N, E80K, L534P, 621S, C356Y, R329X, G248D, C201Y, 313+5G>A, C358Y, C331R, D157N, V776M, 664L, W462X, Q328X, L584P, R395W, G314V, W469X, P678L, R612H, R236W, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro, de la hipercolesterolemia familiar.

3.- Secuencia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende además alguno de los siguientes polimorfismos: 81T>C BstUI Exón 2, 1060+10G>C Smal Exón 7, 1171G>A Stul Exón 8, 1413G>A Ddel Exón 10, 1617OT BstNI Exón 11, 1725OT SSCP Exón 12, 1771OT HincII Exón 12, 1959 T>C Avall, Exón 13, 2232G>A MspI Exón 15, de aplicación en métodos de diagnóstico extracorpóreos e in vitro, de la hipercolesterolemia familiar.

4. Secuencia génica según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que comprende además un reordenamiento que comprende alguna de las siguientes deleciones: una deleción de 7595 pb que implica los exones 17 y 18, una deleción de 4 kb que elimina la zona promotora del gen y el exón 1, una deleción de 5113 pb que implica la deleción de los exones 4, 5 y 6, una deleción de 2,8 kb que implica a los exones 11 y 12 y una deleción de 3,8 kb que implica a los exones 13 y 14.

5.- Oligonucleótidos seleccionados de los grupos de SEQ ID NO:42 a SEQ ID NO:51 y SEQ ID NO:68 a SEQ ID NO:76, capaces de actuar como cebadores para la amplificación de cualquier fragmento de ADN en el que se haya producido al menos uno de los reordenamientos descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4.

6.- Uso de cualquiera de los oligonucleótidos de la reivindicación 5 en un método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar caracterizado por la detección de al menos uno de los reordenamientos del gen r-LDL descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4.

7.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar caracterizado por la identificación de al menos uno de los reordenamientos de las reivindicaciones 1 ó 4 en el gen del r-LDL que comprende las etapas siguientes: a) amplificar fragmentos del gen del r-LDL que juntos abarcan la secuencia promotora y los 18 exones del gen mediante PCR utilizando como cebadores los oligonucleótidos del grupo de SEQ ID NO:42 a SEQ ID NO:51; b) separar los fragmentos amplificados mediante electroforesis en gel y comparar el patrón de distribución de bandas obtenidas con el correspondiente a un ADN control sin reordenamientos; c) amplificar mediante PCR subfragmentos de aquellos fragmentos en los que se haya observado diferencias en la posición de las bandas con respecto al control para acotar la zona en la que se ha producido al menos uno de los reordenamientos, utilizando cebadores seleccionados del grupo de SEQ ID NO:42 a SEQ ID NO:76; d) identificar al menos uno de dichos reordenamientos mediante secuenciación de aquellos subfragmentos obtenidos en la etapa c) que presenten diferencias en su tamaño con respecto a los correspondientes al ADN control sin reordenamientos.

8.- Oligonucleótidos seleccionados del grupo de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO:39, capaces de actuar como cebadores para la amplificación de cualquier fragmento de ADN en el que se haya producido al menos uno de los reordenamientos descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4.

9.- Uso de cualquiera de los oligonucleótidos seleccionados del grupo de SEQ ID NO:2 a SEQ ID NO:41 en un método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar caracterizado por la detección de al menos uno de los reordenamientos del gen r-LDL descritos en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 4.

10.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar, caracterizado por la identificación de al menos un reordenamiento de bases en el gen r-LDL que comprende las etapas siguientes: c) realización de una serie de PCR multiplex que permitan la amplificación de todos los exones y el promotor del gen r-LDL, utilizando al menos una pareja de cebadores capaz de amplificar al menos la parte de la secuencia donde se encuentra el reordenamiento, a los que se les ha añadido un cebador universal adicional en el extremo 5'; d) realización de una PCR secundaria sobre los fragmentos amplificados obtenidos en las PCR multiplex de la etapa a) haciendo uso de los cebadores universales previamente utilizados en dicha etapa a), en los que al menos uno se encuentra marcado con un compuesto que permita la posterior detección de los fragmentos amplificados; e) comparación entre los mareajes de los fragmentos amplificados en la PCR secundaria correspondientes a una muestra control, sin reordenamientos, y una muestra de un paciente con hipercolesterolemia familiar.

11.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar caracterizado por la identificación de alguno de los reordenamientos de las reivindicaciones 1 ó 4 en el gen del r-LDL que comprende las etapas siguientes : a) realización de una serie de PCR multiplex que permitan la amplificación de todos los exones y el promotor del gen r-LDL, utilizando al menos una pareja de cebadores seleccionados del grupo de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 39 a los que se les ha añadido un cebador universal adicional en el extremo 5'; b) realización de una PCR secundaria sobre los fragmentos amplificados obtenidos en las PCR multiplex de la etapa a) haciendo uso de los cebadores universales previamente utilizados en dicha etapa a), en los que al menos uno se encuentra marcado con un compuesto que permita la posterior detección de los fragmentos amplificados; c) comparación entre los mareajes de los fragmentos amplificados en la

PCR secundaria correspondientes a una muestra control, sin reordenamientos, y una muestra de un paciente con hipercolesterolemia familiar.

12.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado porque las condiciones de las PCR multiplex de la etapa a) son tales que cada una de las reacciones de PCR no alcanza en ningún caso su fase exponencial.

13.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el mareaje de la etapa b) consiste en un fluoróforo.

14. Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según la reivindicación 13, caracterizado porque se utiliza un fluoróforo distinto para cada una de las PCR multiplex.

15. Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según la reivindicación 14, caracterizado porque los fluoróforos utilizados son 6-FAM, VIC, PET y NED.

16. Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque los cebadores universales utilizados en las etapas a) y b) del método son los correspondientes a SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41.

17.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según la reivindicación 16, caracterizado porque el cebador universal utilizado en la etapa b) del método se corresponde con SEQ ID NO:41 y se encuentra marcado.

18.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según la reivindicación 17, caracterizado porque el cebador correspondiente a SEQ ID NO:41 se encuentra marcado con un fluoróforo.

19.- Método de diagnóstico extracorpóreo e in vitro de la hipercolesterolemia familiar según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 18, caracterizado porque el control de ADN que no presenta mutaciones en el gen del r-LDL utilizado en la etapa c) corresponde a la línea celular K562.