ES2337207T3 - Procedimiento para determinar el numero de copias. - Google Patents
Procedimiento para determinar el numero de copias. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2337207T3 ES2337207T3 ES07732383T ES07732383T ES2337207T3 ES 2337207 T3 ES2337207 T3 ES 2337207T3 ES 07732383 T ES07732383 T ES 07732383T ES 07732383 T ES07732383 T ES 07732383T ES 2337207 T3 ES2337207 T3 ES 2337207T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- copies
- nucleic acid
- amplification
- sample
- acid sequences
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Hardware Redundancy (AREA)
- Supplying Of Containers To The Packaging Station (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Abstract
Procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende las etapas siguientes: (a) proporcionar una diversidad de alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) subdividir uno o más de los productos empleados en alícuotas de la réplica y llevar a cabo una segunda reacción de amplificación para una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s), en la que cada una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; (d) calcular el número de copias por comparación en cada una de las alícuotas de la réplica del número de productos amplificados obtenido en el marcador de prueba con el número de productos amplificados obtenidos para el marcador de referencia.
Description
Procedimiento para determinar el número de
copias.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de cambios en el número de copias de
secuencias de ácido nucleico (tales como el ADN genómico) y varias
aplicaciones de este procedimiento. A título de ejemplo, el
procedimiento puede utilizarse para la detección de alteraciones
genómicas y el diagnóstico de enfermedades, tal como el cáncer.
Además, se describe asimismo una transposición no recíproca
t(3;5) identificada por el procedimiento de la presente
invención.
Las alteraciones cromosómicas (por ejemplo
anomalías) están asociadas con frecuencia a trastornos genéticos,
enfermedades degenerativas y cáncer. La deleción o multiplicación de
copias de cromosomas completos y la deleción o las amplificaciones
de segmentos cromosómicos o de zonas específicas son sucesos
frecuentes en la enfermedad, tal como el cáncer (Breast Cancer
Res. Treat. 18: Supl. 1:5-14; Biochim.
Biophys. Acta. 1072:33-50). De hecho, las
amplificaciones y deleciones de la secuencia de ADN pueden ser causa
de enfermedad. Por ejemplo, los protooncogenes y los genes
supresores del tumor, respectivamente, son con frecuencia
característicos de la tumorigénesis (Cancer Genet.
Cytogenet. 49:203-217). Evidentemente, la
identificación y clonación de zonas genómicas específicas asociadas
a la enfermedad es crucial tanto para el estudio de la enfermedad
como para el desarrollo de mejores medios de diagnóstico y
pronóstico.
Los procedimientos para determinar el estado de
los genomas individuales se requieren después del periodo de
secuenciado del genoma para llevar a cabo los objetivos de la
medicina personalizada, preventiva y de diagnóstico. Los genomas
afectados (por ejemplo de cáncer) presentan muchas anomalías aunque
las anomalías cromosómicas hereditarias están asociadas a muchos
síndromes complejos y predisposiciones a enfermedades. Realmente, el
secuenciado propuesto de una gama de genomas completos de cáncer
debe enfocarse mejor en aquellas regiones en las que están situadas
las aberraciones, utilizando procedimientos de exploración de
genomas para dichos cambios. Los neoplasmas con frecuencia
presentan aberraciones citogenéticas complejas que incluyen
deleciones, amplificaciones y transposiciones. Aunque las leucemias
y los sarcomas por lo general presentan transposiciones
cromosómicas recíprocas (2), los tumores epiteliales (que comprenden
más del 90% de los cánceres humanos) son mucho más heterogéneos
(1). Los episodios principales en los tumores epiteliales son la
ganancia o pérdida de cromosomas y las transposiciones
desequilibradas. Además de esto, existen pequeñas anomalías
citogenéticamente invisibles en tumores, por ejemplo las
encontrados a veces en asociación con transposiciones cromosómicas
(3). Particularmente bien caracterizadas, las transposiciones
cromosómicas no recíprocas son las der3 t(3;5)
desequilibradas en el adenocarcinoma renal (4,5). Estas anomalías se
asocian específicamente al adenocarcinoma renal no papilar, en el
que se produce a una frecuencia de por lo menos el 15% (6). La
aclaración de los puntos de inflexión
der(3)t(3;5) de estas transposiciones ha sido
obstaculizada porque no son recíprocas.
Un enfoque a este problema podría estar basado
en el hecho de que las transposiciones no recíprocas producen un
cambio en el número de copias de las secuencias genómicas. Están
disponibles numerosas técnicas basadas en la hibridación para
explorar el número de copias en los genomas. Estos procedimientos
utilizan ADN genómico (7) como sonda para las matrices de BACS o
PACS (8, 9) u oligonucleótidos (10, 11) que representan la secuencia
de referencia humana o utilizan sondas genómicas de representación
(ROMA) (12-14) o matrices de SNP (15). Los
procedimientos basados en la matriz, sin embargo, carecen de
flexibilidad ya que debe crearse una nueva matriz para cada
conjunto de dianas que van a examinarse. Además, estos
procedimientos no son siempre cuantitativos ya que la señal de
hibridación refleja el número de copias de la zona específica del
genoma que corresponde a la sonda. Otros enfoques basados en la RCP
cuantitativa requieren la optimización para cada locus evaluado.
El documento DE102004036285 da a conocer un
procedimiento para determinar el número de copias de un cromosoma
proporcionando una muestra que corresponde a una célula, es decir
una copia del genoma. Varios segmentos del genoma se amplían
utilizando una serie de cebadores, y se amplían en una segunda
reacción de amplificación que amplía distintos fragmentos (véase
los párrafos 35 y 40-41) cuya presencia se determina
(en el ejemplo de DE102004036285 los fragmentos se originan a
partir del cromosoma 2). El número de fragmentos amplificados se
compara con el número de fragmentos amplificados en una muestra de
referencia.
La presente invención se refiere a las mejoras
en la detección de un cambio en el número de copias de una o más
secuencias de ácido nucleico.
El procedimiento descrito en la presente memoria
(al que se hace referencia como Recuento molecular del número de
copias o MCC) mide la frecuencia de número de copias analizando la
frecuencia con que se produce la amplificación de una secuencia de
ácidos nucleicos (tal como un marcador genómico) al limitar la
dilución de ADN.
\newpage
\global\parskip0.930000\baselineskip
Los procedimientos han sido validados explorando
el número de copias que acortan la rama del cromosoma 3 humano en el
adenocarcinoma renal para situar el punto de inflexión de una
transposición no recíproca en 300 pb, permitiendo que se clone. Esta
es la primera vez que se ha clonado el punto de inflexión de una
transposición no recíproca de novo en el adenocarcinoma
renal.
En un primer aspecto se proporciona un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes: (a) proporcionar una diversidad de
alícuota(s) de la muestra, en el que cada alícuota comprende
ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por
alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en cada
alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c)
subdividir uno o más de los productos utilizados en las alícuotas
de la réplica y llevar a cabo una segunda reacción de amplificación
para una o más secuencias de ácido nucleico en cada
alícuota(s), en la que cada una de las secuencias de ácido
nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las
secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; (d)
calcular el número de copias por comparación en cada una de las
alícuotas de la réplica del número de productos amplificados
obtenido en el marcador de prueba con el número de productos
amplificados obtenidos para el marcador de referencia.
En un segundo aspecto se proporciona un
procedimiento de identificación de una o más alteraciones en una
muestra de ácido nucleico, que comprende las etapas siguientes: (a)
medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de
ácido nucleico en una primera muestra y una segunda muestra según el
procedimiento del primer aspecto de la presente invención; (b)
opcionalmente repetir iterativamente el procedimiento a resoluciones
progresivamente mayores para cada una de las muestras; y (c)
identificar una o más diferencias en la frecuencia del número de
copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la primera y
segunda muestras.
En un tercer aspecto se proporciona un
procedimiento para diagnosticar una enfermedad en un paciente, que
comprende las etapas siguientes: (a) medir la frecuencia del número
de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra
según el procedimiento del primer aspecto de la presente invención;
y (b) comparar el número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico con el número de copias normales de una o más secuencias
de ácido nucleico; en la que una diferencia entre los números de
copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra y el
número normal de copias de una o más secuencias de ácido nucleico es
indicativo de que el paciente está padeciendo la enfermedad.
En un cuarto aspecto se proporciona un
procedimiento para clonar una o más alteraciones en una muestra de
ácido nucleico que comprende las etapas siguientes: (a) identificar
una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico según el
segundo aspecto de la presente invención; y (b) clonar una o más
alteraciones.
Un quinto aspecto se refiere a un ácido nucleico
aislado que codifica una transposición no recíproca t(3;5),
en la que el cromosoma 5q21.3 para la coordenada 105386443 p.b. se
fusiona con al cromosoma 3p13 procedente de la coordenada 74111893
p.b. y en el que el resto de adenina en la unión es de uno de los
dos cromosomas.
Un sexto aspecto se refiere a un procedimiento
para diagnosticar el cáncer en un paciente que comprende la etapa de
determinación de la presencia de la transposición t(3;5) no
recíproca según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en el
que la presencia de la transposición es indicadora de que el
paciente padece cáncer.
Preferentemente, cada alícuota en la primera
reacción de amplificación comprende aproximadamente 01, a 0,9
genomas de ADN por reacción de amplificación.
Preferentemente el número de copias del marcador
de la prueba se calcula realizando el recuento manual del número de
productos de la amplificación para el marcador de prueba y el
marcador de referencia.
Preferentemente, el número de copias del
marcador de prueba se calcula utilizando la ecuación:
Np=N(1-e^{-Z})
en la que N es el número de
alícuotas; Z es el número promedio de productos amplificados por
alícuota; y Np es el número de alícuotas que cabe esperar que
contengan por lo menos una molécula del ácido nucleico según la
distribución de
Poisson.
Preferentemente, el número de copias del
marcador de prueba se calcula utilizando la ecuación:
Z=-
ln(1-Np/N)
en la que N es el número de
alícuotas del ácido nucleico sometido a prueba para una secuencia
dada; Np es el número de alícuotas que puntúan positivo para el
ácido
nucleico.
\global\parskip0.890000\baselineskip
Preferentemente, las reacciones de amplificación
se llevan a cabo utilizando la RCP.
Preferentemente, la primera reacción de
amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores directo e
inverso.
Preferentemente, la segunda reacción de
amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores
directo-interno e inverso.
Preferentemente, la muestra procede o es
procedente de un grupo constituido por el cromosoma 1, cromosoma 2,
cromosoma 3, cromosoma 4, cromosoma 5, cromosoma 6, cromosoma 7,
cromosoma 8, cromosoma 9, cromosoma 10, cromosoma 11, cromosoma 12,
cromosoma 13, cromosoma 14, cromosoma 15, cromosoma 16, cromosoma
17, cromosoma 18, cromosoma 19, cromosoma 20, cromosoma 21,
cromosoma 22, cromosoma X y cromosoma Y.
Preferentemente, la concentración de ácido
nucleico en la muestra antes de la división en alícuotas se
determina por espectrofotometría UV.
Preferentemente, la concentración de ácido
nucleico en la muestra antes de la división en alícuotas se
determina por amplificación de uno o más ácidos nucleicos que se
cree que están presentes en sólo una copia por genoma haploide en
dos o más divisiones diferentes, en la que la proporción de muestras
en cada dilución hallada positiva para uno o más ácidos nucleicos
se utiliza para mejorar la concentración estimada de ADN y por
consiguiente determinar la dilución requerida para el análisis
posterior.
Preferentemente, se amplían 4 ácidos nucleicos y
se preparan 6 diluciones.
Preferentemente, las muestras son o proceden de
pacientes enfermos y sanos.
Preferentemente, se explora inicialmente un
cromosoma completo antes de enfocar en un área para posterior
estudio.
Preferentemente, el procedimiento se lleva a
cabo inicialmente a una resolución de aproximadamente 2 Mb
disminuyendo progresivamente hasta aproximadamente 100 pares de
bases o menos.
Preferentemente, la alteración es una
transposición, una amplificación; una duplicación o una
deleción.
Preferentemente, si el número de copias de una o
más secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico del
paciente es mayor que el número de copias normales es indicativo de
una transposición, una amplificación o una duplicación.
Preferentemente, si el número de copias de una o
más secuencias de ácido nucleico en la muestra de ácido nucleico del
paciente es menor que el número de copias normales es indicativo de
una deleción.
Preferentemente, la enfermedad es el cáncer.
Preferentemente, el cáncer es cáncer de
riñón.
Preferentemente, el paciente se selecciona de
entre el grupo constituido por: (i) un paciente que está padeciendo
o se sospecha que padece la enfermedad; (ii) un paciente que se sabe
que está predispuesto a la enfermedad; (iii) un paciente que ha
estado expuesto a uno o más agentes o enfermedades que se conoce o
se sospecha que producen la enfermedad; (iv) un paciente que está
en proceso de desarrollar la enfermedad o se sospecha que desarrolla
la enfermedad.
Preferentemente, la alteración se clona
utilizando RCP inversa.
Preferentemente, el cromosoma 5q21.3 comprende
la secuencia TATACATACATACGGATATATGTATAAAATC.
Preferentemente, el cromosoma 3p13 comprende la
secuencia TAGGGAGTGAAGTAGTGGCCAAGAAAACAT
GCCAG.
GCCAG.
Preferentemente, la transposición t(3;5)
no recíproca comprende la secuencia
TATACATACATACGGATATATG
TATAAAATCATAGGGAGTGAAGTAGTGGCCAAGAAAACATGCCAG.
TATAAAATCATAGGGAGTGAAGTAGTGGCCAAGAAAACATGCCAG.
Preferentemente, el cáncer es el adenocarcinoma
renal.
La presente invención presenta numerosas
ventajas. Estas ventajas se pondrán de manifiesto en la descripción
siguiente.
A título de ejemplo la presente invención
presenta ventajas ya que el procedimiento proporciona la resolución
realmente ilimitada ya que las secuencias pueden examinarse a
intervalos por debajo de unos pocos centenares de pares de bases y
sería igualmente aplicable a la caracterización de las zonas
amplificadas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
A título de ejemplo adicional, la presente
invención presenta ventajas ya que solamente necesita una base de
datos genómica para su operación y los bancos de cebadores de RCP
permiten la rápida exploración de zonas cromosómicas o de genomas
completos.
A título de ejemplo adicional, la presente
invención presenta ventajas debido a que puede conseguirse cualquier
nivel de resolución dependiendo de la densidad de marcadores
seleccionada. Por consiguiente, el área de estudio está fácilmente
bajo control.
A título de ejemplo adicional, la presente
invención presenta ventajas porque a diferencia de otras tecnologías
de recuento de ADN, los procedimientos descritos en la presente
memoria no requieren la amplificación del genoma total o cualquier
etapa de hibridación. Esto obvia algunos problemas que puedan dar
lugar a la amplificación del genoma específico de la zona, la
supresión incompleta de las secuencias de repetición en la sonda y
elimina cualquier riesgo de hibridación cruzada, como puede ocurrir
en las oligomatrices cortas o en la amplificación del ADN de E.
coli que contamina las BAC/PAC para la matriz CGH (9).
A título de ejemplo, la presente invención
presenta ventajas porque los procedimientos son esencialmente
digitales (recuento del número de copias molecular) que simplifica
la interpretación de resultados mientras que las estrategias de
micromatriz pueden requerir calcular por ordenador los algoritmos
para su interpretación (23).
A título de ejemplo, la presente invención
presenta ventajas porque los procedimientos se prestan a
automatización, y son adecuados para alto rendimiento, aunque es
también fácilmente aplicable a la operación y por lo tanto no tienen
requisitos obligados para el sistema, tales como matriciales.
A título de ejemplo adicional, la presente
invención presenta ventajas porque el procedimiento requiere
cantidades minúsculas de ADN genómico, que son aplicables al ADN
desde tan poco como decenas de centenares de células y el ADN no ha
de ser de alto peso molecular. Los procedimientos permitirán
estudios impracticables hasta ahora, tales como el análisis
detallado del material de biopsia preneoplástica procedente de
pacientes, el análisis retrospectivo de muestras de tumorales de
archivo o la exploración de la variabilidad genómica a través de
diferentes pequeñas regiones de un tumor.
A título de ejemplo adicional, la presente
invención presenta ventajas porque los procedimientos descritos en
la presente memoria deberían también simplificar el análisis de
anomalías cromosómicas hereditarias que afectan al número de
copias, si están asociadas a la enfermedad o forman parte de un
espectro normal de variación humana.
Figura
1
El recuento molecular del número de copias (MCC)
se basa en la frecuencia de los productos de amplificación por RCP
del ADN genómico, correspondiente a los marcadores cromosómicos a lo
largo de un segmento de un cromosoma. El MCC es un procedimiento en
dos etapas. En esta figura, (A) las células llevan una transposición
no recíproca y por consiguiente una secuencia marcadora
(representada en verde) está presente en dos veces tantas copias
como un segundo marcador (representado en rojo) que une el
telomérico del punto de inflexión de la transposición. (B) El ADN
se prepara a partir de las células diana y se diluye a menos de un
genoma por alícuota. (C) Estas alícuotas se suministran a los
pocillos de una placa de 96 pocillos; por simplicidad, solamente se
ilustran los marcadores rojo y verde, que muestran el número
limitado de pocillos que recibe el ADN genómico del marcador rojo y
verde. (D) Una amplificación por RCP múltiple inicial se lleva a
cabo para ampliar todos los marcadores mediante una cantidad
modesta y se ilustran los supuestos pocillos en los que se amplían
los marcadores rojo y verde. (E, F) Los productos de reacción
múltiple se cortan y empalman en placas de réplica y se lleva a
cabo una ronda adicional de RCP realizada con los cebadores
semianidados para cada marcador (E: presenta la distribución
hipotética del producto del marcador rojo y F presenta la
distribución hipotética del producto del marcador verde). (G, H)
Los productos de la RCP de la etapa semianidada se analizan por
electroforesis en gel. En esta ilustración, el marcador rojo se
encuentra en 24 de los pocillos y el marcador verde en 46 de los
pocillos, correspondientes a un aumento del doble del número de
copias.
Figura
2
La presencia de una transposición cromosómica no
recíproca t(3;5) típica del adenocarcinoma renal no papilar
se descubrió en las células SK-RC-9
(línea incompletamente tetraploide) utilizando la fotografía del
cromosoma 3 y 5 (Figura 1 complementaria en línea). La posición
regional de la t(3;5) se determinó utilizando FISH con los
clones BAC del cromosoma 3. Los clones BAC definen una zona de
aproximadamente 1 Mb de la rama corta del cromosoma 3 (clon
RP11-24E1 situado en
7325.358-73419679 pb, panel A y clon
RP11-781E19 situado en
74210885-74236089 pb, panel B) eran verdes marcados
con fluorescencia para el análisis FISH de extensiones de la
metafase de los cromosomas SK-RC-9
en combinación con las fotografías del cromosoma 5 completo
(fluorescencia roja). El clon RP11-24E1 por BAC se
hibrida con los brazos cortos de dos cromosomas 3 normales (panel A,
rodeado en verde), pero no el cromosoma hibrido transpuesto
t(3;5) panel A, (en círculo blanco) lo que indica que BAC es
telomérico del punto de inflexión de la transposición t(3;5).
El clon RP11-781E19 de BAC se hibrida tanto con los
cromosomas 3 normales (panel B, rodeado en verde) así como con los
cromosomas híbridos t(3;5) (panel B, rodeados en blanco).
Por lo tanto, este BAC cartografía el centrómero del punto de
inflexión de t(3;5). Estos datos demuestran que el punto de
inflexión de la transposición se produce entre o dentro de la zona
del cromosoma definida por estos dos clones de BAC.
C. Representación esquemática de los cromosomas
3 normales y t(3;5) híbrido en
SK-RC-9 que presenta la zona del
cromosoma 3 que contiene el supuesto punto de inflexión de la
transposición t(3;5) determinado por FISH. Los cromosomas 3
se representan en verde y los cromosomas 5 en rojo. La zona que
contiene el punto de inflexión está representada en blanco y se
expande a continuación, comprendiendo aproximadamente la zona del
cromosoma 3p13-p12.3
Figura
3
Cada gráfico presenta el número de copias
relativo (ejes verticales) de las secuencias que comprenden el
cromosoma 3p (ejes horizontales; orientación
telomérica-centromérica es de izquierda a
derecha).
Ronda 1: Se seleccionaron secuencias a
intervalos de aproximadamente 200 a 500 kb que comprenden \sim 3,7
Mb, comprendidas por 3p13-p12.3 (la posición
cromosómica exacta y las distancias junto con las secuencias del
cebador se proporcionan en la Tabla 1). Las series de cebador, a
saber las series 5 y 7 no pudieron proporcionar producto (indicadas
por líneas de puntos). La inspección visual indicó que un
desplazamiento del doble en el número de copias entre los
marcadores 8 y 9 (mostrados por la casilla blanca). En las
anteriores rondas 2, 3 y 4, se seleccionaron nuevas secuencias con
distancias progresivamente más cortas en entre los marcadores. La
ronda 4 utilizó marcadores de \sim 300 p.b. (50 a 300 pb) aparte y
presentaban un desplazamiento del número de copias que representa
el punto de inflexión de la transposición t(3;5) no recíproca
(indicada por la casilla en blanco) y una segunda anomalía que
representa una deleción corta de aproximadamente 700 p.b. en la zona
del cromosoma 3 (indicada por la casilla punteada) centromérica de
la unión de la transposición.
Figura
4
A-C. ADN genómico de
SK-RC-9 o
SK-RC-12 (carcinoma renal de un
der(3;5) proximal al de en
SK-RC-9) se digirió con las enzimas
de restricción indicadas, se fraccionó y se transfirió a los filtros
para la hibridación a las sondas clonadas de RCP de uno de ambos
cromosomas 3p (3pA o 3pB) o 5q. Las sondas de cromosoma 3p se
localizaron en los datos de MCC en la Figura 3 y se identificó una
secuencia genómica sin repetición de esta zona utilizando la base
de datos de la secuencia del genoma humano. Asimismo se determinó
una sonda procedente del cromosoma 5q en la base de datos de la
secuencia del genoma humano después de la clonación y del
secuenciado de la unión t(3;5).
D. Cartografías de restricción parcial de las
zonas adecuadas de los cromosomas 5q, t(3;5) y 3p que
muestran la posición de las sondas de hibridación en una de las dos
caras del punto de inflexión de t(3;5) (existían dos sondas
para el cromosoma 3p, denominadas 3pA y 3pB). La longitud de la
inserción, asociada a la pequeña deleción, no es segura y está
indicada por la pequeña zona sombreada en gris que incluye una
secuencia de la enzima de restricción BgIII como se muestra mediante
las hibridaciones en filtro mostradas en B.
B=BgIII; H=HindIII; N=NcoI; RV=EcoRV;
S=SpeI.
C= AND genómico de referencia procedente de
SK-RC-12; R9= AND genómico de
SK-RC-9.
Figura
5
La posición de la unión de la transposición
t(3;5) en el genoma de
SK-RC-9 se situó en 300 p.b. por el
procedimiento MCC. La base de datos de la secuencia del genoma
humano permitió la identificación de las secuencias de restricción
en torno a esta supuesta posición y la RCP inversa se utilizó para
clonar la unión. Se digirió el ADN de
SK-RC-9 con XbaI, autoligadas a
alta dilución para obtener círculos intramoleculares y un producto
de RCP obtenido por amplificación con los cebadores F y R (panel A)
(véanse los procedimientos para las secuencias del cebador). La
secuencia de los productos de la RCP confirmó que la unión de la
transposición no recíproca t(3;5) se había clonado y la
unión comprendía las secuencias contiguas 5q (panel B, secuencia
encasillada en rojo) y 3p (panel B, secuencia encasillada en
verde). Debe apreciarse que el residuo A adicional individual en la
unión de la secuencia fusionada (posición representada por la
flecha) puede haber procedido de uno de los dos cromosomas. La
posición de los puntos de inflexión de la transposición se determinó
en los cromosomas 5q y 3p utilizando la base de datos Ensembl
humana (NCBI liberación 35) y se indica en los paneles C (5q) y D
(3p). En cada uno de estos paneles, la línea superior indica las
bandas de cromosomas relevantes y las distancias a Mb y debajo se
muestran varios genes conocidos o supuestos. La posición de los
genes Ensembl se presenta tanto para el cromosoma 5 (C) como para
el cromosoma 3 (D). Se muestra una transcripción prevista Genscan
(AN038241) a 106,58 Mb en el cromosoma 5 y dos ARNm situados en el
cromosoma 3, BC040672 (ADNc de Riken) y HSP90 en 74,10 y 74,2
respectivamente. La transposición t(3;5) de
SK-RC-9 no corta ni empalma los
genes en el cromosoma 3 ni en el cromosoma 5.
Figura
6
A. Para la cartografía de la ronda 1 de MCC, se
utilizó un panel de 35 marcadores para identificar una zona
genómica de \sim9 Mb) con intervalos de marcador alrededor de 0,25
Mb aparte. Se detectó un desplazamiento del número de copias entre
los marcadores 22 y 23. Los resultados se presentan para el panel
del marcador en el eje y el número del marcador en el eje x. Las
distancias entre los marcadores no reflejan distancias genómicas
sino que son numéricas. Las zonas encasilladas representan los
desplazamientos de la copia baja y de la copia alta. Basándose en
los datos de la ronda 1, se diseñaron una segunda serie de cebadores
espaciados a un promedio de 30 kb aparte, demostrando que la
variación del número de copias se cartografió entre los marcadores 9
y 13. Posteriormente, se realizaron dos rondas más de MCC
utilizando los marcadores a aproximadamente 3 kb (ronda 3) y 400
p.b. aparte (ronda 4). Un desplazamiento del número de copias
aparece entre los marcadores 6 y 7 en la ronda 4 definiendo una
posición del desplazamiento en 800 p.b. de cromosoma 3.
B. La zona genómica del ADN con
SK-RC-12 con este desplazamiento del
número de copias se clonó después de la RCP inversa y se puso de
manifiesto una deleción crítica del cromosoma 3 en las células
SK-RC-12. La secuencia superior
(caso superior) se extiende desde el extremo telomérico de la
deleción del cromosoma 3p y la secuencia inferior (caso inferior)
se extiende desde el extremo centromérico de la deleción del
cromosoma 3p mientras que la secuencia media es la fusión hallada
en la unión de la deleción en el ADN de
SK-RC-12 situado a 81,64 y 81,94
mb.
Figura
7
Las imágenes fundidas se presentan en señales de
hibridación con el cromosoma 3 (rojo) o 5 (verde) y la tinción con
DAPI de la metafase en los cultivos de
SK-RC-9 (esta estirpe es
incompletamente tetraploide), mostrando la presencia de la
transposición cromosómica t(3;5) no recíproca típica del
adenocarcinoma renal no papilar. Los cuadros del cromosoma se
obtuvieron a partir de Vysis.
Figura
8
Se obtuvieron datos por MCC de la ronda 4 de la
RCP (como en la Fig. 3 del texto principal) utilizando
SK-RC-9 en experimentos por
duplicación o SK-RC-12 como
referencia. La transposición y las zonas de microdeleción presentan
desplazamientos del número de copias reproducibles, mientras que el
ADN de SK-RC-12 de referencia
presenta una curva horizontal sin desplazamiento del número de
copias en esta zona.
Figura
9
Se llevó a cabo la ronda uno por análisis de MCC
con ADN de SK-RC-12 utilizando los
marcadores que comprenden una zona que comprende aproximadamente
0,25 mb del cromosoma 3p (véase la Fig. 6A, ronda 1) que presenta un
desplazamiento del número de copias entre los marcadores 22 y 23.
Se presentan los geles analíticos para los productos de la RCP
semianidados de los marcadores 21, 22, 24 y 25.
Figura
10
La MCC del ADN del cromosoma 3p de
SK-RC-12 identificó un
desplazamiento del número de copias en una zona de 400 p.b. (véase
la Fig. 6A, ronda 4) indicativo de una alteración genómica. Esto se
confirmó por hibridación en el filtro del ADN genómico de
SK-RC-12 en comparación con el ADN
preparado a partir de una estirpe celular linfoblastoide (LCL) de
referencia. Una sonda de 237 p.b. se amplió en el cromosoma 3 y se
hibridó a los digestos de restricción indicados. Se observó un
fragmento cambiado de posición en cada caso con el ADN de
SK-RC-12 en comparación con el de
LCL.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "alteración" se refiere a un cambio (tal como un cambio
conocido u oculto) que implica la pérdida o ganancia de material
genético.
Convenientemente, la alteración es una
alteración del número de copias (tal como una alteración del número
de copias en estado diploide) que puede determinarse haciendo el
recuento de la frecuencia de reiteración del ADN utilizando los
procedimientos descritos en la presente memoria.
En una forma de realización, la alteración es
una anomalía, tal como una anomalía cromosómica.
En una forma de realización, la alteración se
selecciona de entre el grupo constituido por una transposición (por
ejemplo una transposición desequilibrada o una transposición no
recíproca), una amplificación; o una duplicación o una deleción.
En una forma de realización particularmente
preferida, la alteración es una transposición no recíproca, tal como
una transposición no recíproca que se detecta en el ácido nucleico
de una célula de cáncer o tumor o derivada de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "número de copias" significa
el número de copias de una secuencia específica de ácido nucleico
(por ejemplo locus) en el genoma de un organismo específico, tal
como un ser humano.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "marcador de prueba" se refiere a una secuencia de
ácido nucleico, cuyo número de copias debe someterse a prueba según
los procedimientos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "marcador de referencia" se refiere a una secuencia
de ácido nucleico, cuyo número de copias ya se conoce o se determina
para calcular el número de copias del marcador de prueba. Como se
describe en la presente memoria, el número de copias del marcador de
prueba se calcula comparando el número de productos amplificados
para el marcador de prueba con las del marcador de referencia.
El número de copias del marcador de referencia
puede determinarse utilizando los procedimientos descritos en la
presente memoria o cualquier otro procedimiento que puede utilizarse
para determinar el número de copias de un ácido nucleico, tal como
la hibridación del genoma comparativa o la hibridación del genoma
comparativa de la matriz y similares. Desde luego, el número de
copias del marcador de referencia puede incluso determinarse por
referencia a la bibliografía ya que su número de copias puede haber
sido descrito anteriormente.
En una forma de realización de la presente
invención, se amplían el marcador de prueba y/o el marcador de
referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
El término "muestra" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a una muestra que comprende o está
constituida por ácido nucleico por lo general ADN (preferentemente
ADN genómico) en una forma adecuada para la detección por
amplificación tal como se describe en la presente memoria. Las
muestras utilizadas en los presentes procedimientos pueden proceder
esencialmente de cualquier organismo, tal como un organismo
eucariótico, incluyendo, pero sin limitarse a, seres humanos,
ratones, ratas, hámsteres, caballos y vacas.
Preferentemente, la muestra es de un ser humano
o procede del mismo.
La muestra puede proceder esencialmente de
cualquier fuente asociada a un organismo tal como una muestra de
tejido y/o fluido extraída de un individuo o de un grupo de
individuos. Los ejemplos ilustrativos incluyen piel, plasma, suero,
sangre, orina, lágrimas, órganos, fluido espinal, fluido de linfa y
tumores. La muestra puede incluso proceder de cultivos de células
in vitro, incluyendo el medio de crecimiento, células
recombinantes y componentes celulares.
Cuando las muestras se extraen para diagnóstico
o el estudio de un tumor, la muestra por lo general se extrae de un
tejido tumoral o de un tejido que se sospecha que presenta el inicio
de la formación del tumor. En las técnicas de enriquecimiento, la
muestra necesaria para la evaluación de la presencia del tumor
pueden obtenerse, por ejemplo, enriqueciendo células tumorales o el
ADN del plasma.
Por lo tanto, en muchos casos, la muestra será
una muestra de tejido o células en las que el ácido nucleico está
aislado y/o clonado y/o amplificado. Puede ser, por ejemplo, ADN
genómico procedente de un cromosoma específico, o las secuencias
seleccionadas (por ejemplo activadores, genes, fragmentos de
amplificación o restricción específicos) con alteraciones
específicas, tales como amplicones o deleciones.
Los procedimientos para aislar muestras de
células y tejidos son bien conocidos por los expertos en la materia
e incluyen, pero no se limitan a, aspirados, secciones de tejidos,
biopsias con aguja y similares. Frecuentemente la muestra será una
"muestra clínica" que es una muestra procedente de un paciente,
que incluye secciones o tejidos tales como secciones congeladas o
secciones en parafina extraídas con fines histológicos. La muestra
puede proceder también de sobrenadantes (de células) o de las
propias células de cultivos celulares, células de cultivo tisular y
de otros medios en los que puede ser deseable detectar anomalías
cromosómicas y/o determinar el número de copias.
Los procedimientos habituales conocidos en la
técnica pueden utilizarse para aislar el ácido nucleico requerido
procedente de la muestra.
Una aplicación específica de los procedimientos
descritos en la presente memoria es para analizar las secuencias de
ADN procedentes de la(s) presente(s) célula(s)
o de la población o poblaciones celulares, por ejemplo, procedentes
de muestras clínicas incluyendo tejidos tumorales y fetales.
Sin embargo, si el ácido nucleico, por ejemplo,
el ADN, debe extraerse de un pequeño número de células (por ejemplo
de una subzona tumoral específica) o de una sola célula, a veces
puede ser necesario ampliar el ácido nucleico, por un procedimiento
de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) o por un procedimiento
de reacción en cadena sin polimerasa (no-RCP). La
RCP y los procedimientos de RCP preferidos se describen en la
presente memoria. Los procedimientos de no-RCP
ilustrativos incluyen la reacción en cadena de la ligasa (RCL) y la
amplificación lineal mediante la utilización de cebadores apropiados
y su amplificación (cebado aleatorio) tal como se describe en la
presente memoria.
Ventajosamente, los ácidos nucleicos de muestras
de tejido archivadas, por ejemplo, muestras de patología empapadas
en parafina o fijadas en formalina, pueden analizarse por los
procedimientos descritos en la presente memoria. El ácido nucleico
de dichas muestras puede extraerse por técnicas conocidas tales como
las descritas en Anatomic Pathology 95(2);
117-124 (1191) y Cancer Res. 46:
2964-2969 (1986), y si es necesario, amplificadas
para análisis. Dicho ácido nucleico puede ampliarse utilizando un
procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en la
que por ejemplo, el ADN procedente de los tejidos empapados en
parafina se amplía por RCP.
Un valor específico de analizar dicho ácido
nucleico archivado es que dichas muestras están normalmente
asociadas a los registros médicos de pacientes de los que se
extraen las muestras. Por consiguiente, pueden hacerse asociaciones
de diagnóstico/pronóstico valiosas entre el estado puesto de
manifiesto del material del ácido nucleico del paciente y los
antecedentes médicos del tratamiento y los resultados para estos
pacientes. Por ejemplo, la información reunida por los
procedimientos descritos en la presente memoria puede utilizarse
para predecir la agresividad de un tumor basado en su modelo de
amplificación y/o deleción correspondiente a las asociaciones
realizadas con patrones similares de los pacientes cuyos resultados
se conocen.
Asimismo, otro ácido nucleico que se fija por
otros procedimientos - tal como el material arqueológico conservado
mediante procedimientos de fijación natural - puede estudiarse
también. Las diferencias del número de copias entre las especies
proporcionan información del grado de similitud y divergencia de las
especies estudiadas. Las conexiones y discrepancias importantes
desde el punto de vista de la evolución entre las especies que
existen o se han extinguido pueden hacerse por consiguiente
utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria.
Tal como se describe en la presente memoria, una
vez se ha preparado la muestra, puede dividirse en una o más
alícuotas (por ejemplo varias alícuotas). En el contexto del número
de alícuotas, el término "varias" significan 2 o más,
preferentemente 10 o más, preferentemente 20 o más, preferentemente
30 o más, preferentemente 40 o más, preferentemente 60 o más,
preferentemente 80 o más, preferentemente 90 o más, o incluso
preferentemente, 100, 200, 300, 400, 600, 800 o incluso 1000 o
más.
En una forma de realización particularmente
preferida, los procedimientos de la presente invención se realizan
en una o más placas que contienen varios pocillos. Preferentemente
la plaza contiene 96 pocillos o 384 pocillos. Pueden utilizarse
también placas de otros tamaños adecuados. Por consiguiente, el
número de alícuotas de las muestras que por lo general se
correlacionan con el número de pocillos en la placa. Sin embargo,
cuando se utilizan dichas placas, la muestra no está necesariamente
en alícuotas en cada uno y en todos los pocillos ya que pueden
utilizarse uno o más pocillos como referencias. A título de ejemplo,
si se realiza un experimento en una o más placas de 96 pocillos,
entonces aproximadamente 8 pocillos más o menos de cada placa pueden
utilizarse como referencias negativas, que no se ponen en contacto
con las alícuotas de la muestra. Así, las referencias negativas
carecen de ácido nucleico - tal como ADN genómico - que es o procede
de la muestra.
\newpage
Cada alícuota de la muestra utilizada según la
presente invención comprende menos de un genoma para la reacción de
amplificación tal como se define para la cartografía HAPPY (22).
Preferentemente cada alícuota de la muestra utilizada según la
presente invención comprende aproximadamente 0,9, 0,8, 0,7, 0,6,
0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ó 0,1 genomas o menos por reacción de
amplificación. Más preferentemente, cada alícuota de la muestra
utilizada según la presente invención comprende un intervalo que
consiste en cualquier punto de partida o final adecuado del número
de genomas por reacción de amplificación, tal como aproximadamente
0,1 a 0,9 genomas por reacción de amplificación o como
aproximadamente 0,3 a 0,5 genomas por reacción de amplificación. Más
preferentemente, cada alícuota de la muestra utilizada según la
presente invención comprende aproximadamente 0,3 genomas por
reacción de amplificación.
Para determinar la concentración exacta de ADN
en la muestra antes de la preparación de alícuotas, pueden
realizarse ensayos iniciales utilizando un intervalo de diluciones
de ADN que cabe esperar (basándose en la concentración de ADN
determinada por espectrometría de UV) que proporcionen entre 0,25 y
8 genomas de ADN por muestra. Pueden analizarse aproximadamente 4
secuencias de ácido nucleico por muestra de ácido nucleico a
diferente diluciones (tal como 6 diluciones) para diferentes
secuencias de ácido nucleico que se cree que están presentes
solamente en una copia por genoma haploide. La proporción de
muestras de cada dilución hallada positiva para estos marcadores se
utiliza para refinar la concentración estimada de ácido nucleico y
por consiguiente determinar la dilución requerida para el análisis
posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"amplificación" se refiere a cualquier procedimiento para
multiplicar las cadenas de ácido nucleico (tal como el ADN genómico)
in vitro.
Preferentemente, el procedimiento es enzimático
y es lineal o de carácter exponencial.
Las técnicas de amplificación incluyen, pero no
se limitan a, los procedimientos ampliamente clasificados como
procedimientos de amplificación de ciclación térmica y los
procedimientos de amplificación isotérmicos. Los procedimientos de
ciclación térmica adecuados incluyen, por ejemplo, la reacción en
cadena de la ligasa (Genomics 4:560, (1989); y
Science 241: 1077 (1988)). La reacción en cadena de la ligasa
utiliza la ADN ligasa y cuatro oligonucleótidos, 2 por cadena
diana. Los oligonucleótidos se hibridan con las secuencias
adyacentes en el ácido nucleico que debe ampliarse y se unen
mediante la ligasa. La reacción se desnaturaliza térmicamente y se
repite el ciclo. Los procedimientos de amplificación isotérmicos
útiles en la presente invención incluyen, por ejemplo, la
amplificación con desplazamiento de cadena (SDA) (Proc. Nat.
Acad. Sci. EE.UU. 89:392-396 (1992)),
Q-beta-replicasa
(Bio/Technology 6:1197-1202 (1988));
amplificación de la secuencia de ácido nucleico (NASBA)
(Bio/Technology 13:563-565 (1995)); y la
replicación de la secuencia automantenida (Proc. Nat. Acad.
Sci. EE.UU. 87:1874-1'878 (1990)).
Un procedimiento de amplificación
particularmente preferido es la RCP. Como es bien conocido por los
expertos en la materia, este es un procedimiento en el que
prácticamente toda la secuencia de ácido nucleico puede ampliarse
selectivamente. El procedimiento implica utilizar series emparejadas
de oligonucleótidos de la secuencia predeterminada que se hibridan
con las cadenas opuestas de ADN y definen los límites de la
secuencia que debe ampliarse. Los oligonucleótidos ceban rondas
múltiples sucesivas de síntesis de ADN catalizadas por una ADN
polimerasa termoestable. Cada ronda de síntesis es separada por lo
general por una etapa de fusión y rehibridación, permitiendo que se
amplíe una secuencia de ADN dada varias cientos de veces en menos de
una hora (Science 239:487, 1988). Como se describe en la presente
memoria, más de un ácido nucleico puede ampliarse simultáneamente
por RCP múltiple en la que se emplean múltiples cebadores
emparejos.
El ácido nucleico puede marcarse en uno o más
nucleótidos durante o después de la amplificación.
Tal como se describe en la presente memoria, los
procedimientos se realizan utilizando una reacción de amplificación
en dos fases.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera reacción de amplificación es por lo
general una etapa de amplificación con cebadores externos
multiplexados con objeto de ampliar una o más, preferentemente dos
o más (por ejemplo varias) secuencias de ácido nucleico. Cuando se
analizan genes y directos grandes o genes indefinidos, se requieren
con frecuencia muchas reacciones de amplificación individuales para
identificar las alteraciones. Por lo tanto, para racionalizar el
análisis de grandes genes complejos, pueden utilizarse cebadores
múltiples para la amplificación simultánea de diferentes secuencias
de ácido nucleico en una sola reacción de amplificación. Los
procedimientos para la preparación de cebadores múltiples son
conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo en la patente
US nº 6.207.372.
En una forma de realización, se amplían uno o
más marcadores (por ejemplo un marcador de prueba y/o un marcador de
referencia).
En otra forma de realización, se amplían dos o
más marcadores (por ejemplo un marcador de prueba y/o un marcador de
referencia).
En otra forma de realización, se amplían todos
los marcadores.
En otra forma de realización, se amplían todas
las copias de una o más secuencias o marcadores.
En otra forma de realización, se amplían uno o
más marcadores, dos o más marcadores o todos los marcadores en una
zona cromosómica o genómica o locus de interés.
Para la primera reacción, se prepara ácido
nucleico y se diluye a menos de aproximadamente un genoma por
alícuota. Si el procedimiento de amplificación seleccionado es la
RCP entonces puede preparase una mezcla maestra que contiene los
cebadores de todas las secuencias que deben ampliarse en tampón de
RCP (tal como el tampón Gold PCR (Perkin-Elmer)),
MgCl_{2}, tal como aproximadamente MgCl_{2} 2 mM, las dNTP, tal
como aproximadamente 200 \muM de cada dNTP y Taq ADN polimerasa,
tal como aproximadamente 0,1 U/\mul de Taq Gold ADN polimerasa
(Perkin-Elmer).
De manera adecuada, el ácido nucleico se divide
en varias alícuotas.
De manera adecuada, el ácido nucleico se divide
en varias alícuotas idénticas o sustancialmente idénticas.
De manera adecuada, cada una de las alícuotas
que se prepara se suministra a un pocillo o receptáculo. Por
consiguiente, en una forma de realización de la presente invención,
las reacciones de amplificación se realizarán en paralelo
utilizando, por ejemplo, placas de 96 pocillos. De este modo, las
alícuotas de la mezcla madre se distribuirán en, por ejemplo, 8
pocillos de las placas de 96 pocillos (referencias negativas), y
posteriormente, aproximadamente 0,03 genomas/\mul del ADN
genómico añadido a la mezcla madre para análisis. Las alícuotas de
esta mezcla (conteniendo cada una aproximadamente 0,3 genomas de
ADN) se reparten en alícuotas en cada uno de los pocillos restantes
y los pocillos de referencia reciben una mezcla equivalente pero que
carece de ADN genómico (referencias negativas). Todas las muestras
se cubren con aceite mineral (aproximadamente 20 \mul).
Una reacción de amplificación inicial puede
realizarse para ampliar uno o más marcadores en cada una de las
alícuotas. Preferentemente, se amplían todos los marcadores en cada
una de las alícuotas.
El ciclo térmico se realiza por lo general con
inicio en caliente a aproximadamente 93ºC durante aproximadamente 9
minutos, seguido de aproximadamente 25 ciclos de aproximadamente 20
segundos a aproximadamente 94ºC, aproximadamente 30 segundos y
aproximadamente 52ºC y aproximadamente 1 minuto a aproximadamente
72ºC. El experto en la materia apreciará que pueden introducirse
variaciones de esta reacción de ciclo térmico.
Cada uno de los productos amplificados se
diluyen hasta una cantidad que es suficiente para la segunda
reacción de amplificación para ampliar el ácido nucleico contenido
en la misma.
En una forma de realización de la presente
invención resulta preferido que la primera reacción de amplificación
esté automatizada.
\vskip1.000000\baselineskip
Adecuadamente, uno o más (por ejemplo cada uno)
de los productos amplificados de la primera reacción de
amplificación se subdividen o se cortan y empalman en una o más
muestras de réplica o alícuotas de la réplica.
Adecuadamente, uno o más (por ejemplo cada uno)
de los productos amplificados de la primera reacción de
amplificación se subdivide, se cortan y empalma o se suministra en
uno o más pocillos de réplica o receptáculos de réplica.
Por consiguiente, antes de la segunda reacción
de amplificación se preparan uno o más conjuntos de la réplica de
los productos amplificados procedentes de la primera reacción de
amplificación. Adecuadamente, la serie de productos amplificados de
la réplica comprende 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% ó 100% de cada uno de los productos amplificados para la
primera reacción de amplificación. Preferentemente, la serie de la
réplica de los productos amplificados comprende 90%, 95%, 96%, 97%,
98%, 99% o 100% de cada uno de los productos amplificados
procedentes de la primera reacción de amplificación.
Por lo general, una o más (por ejemplo cada una
de las) alícuotas procedentes de la primera reacción de
amplificación se subdivide o se suministra a un número de muestras
de la réplica, alícuotas, pocillos o receptáculos que se
correlacionan con el número de marcadores que se amplían. De manera
adecuada, un marcador se amplía en cada una de las muestras de la
réplica, alícuotas, pocillos o receptáculos. Por lo tanto, a título
de ejemplo, si se amplían cuatro marcadores entonces cada alícuota
de la primera reacción de amplificación se subdivide, corta o
empalma o se suministra en cuatro muestras de la réplica, alícuotas,
pocillos o receptáculos. Un primer marcador se ampliará en una
primera de las muestras de la réplica, alícuotas, pocillos o
receptáculos, un segundo marcador se ampliará en una segunda de las
muestras de la réplica, alícuotas, pocillos o receptáculos y así
sucesivamente.
\newpage
En una forma de realización de la presente
invención, se amplía uno o más de los productos de amplificación
obtenidos o que pueden obtenerse a partir de la primera reacción de
amplificación.
Por lo general, la segunda reacción de
amplificación se lleva a cabo utilizando una reacción de
amplificación semianidada en la que se utiliza el mismo cebador
complementario tal como se utiliza en la primera reacción de
amplificación en combinación con un cebador directo interno para
cada marcador que va a ampliarse.
Si la segunda amplificación se lleva a cabo
utilizando la RCP entonces por lo general, la RCP semianidada
utiliza MgCl_{2}, tal como aproximadamente MgCl_{2} 1,5 mM y
aproximadamente 1 \muM de los cebadores directo interno y
complementario apropiados. Las otras concentraciones son
aproximadamente las mismas que las utilizadas para la primera
reacción de amplificación como anteriormente.
En una forma de realización, el ciclo térmico se
lleva a cabo a aproximadamente 93ºC durante aproximadamente 9
minutos, seguido de aproximadamente 33 ciclos de aproximadamente 20
segundos a aproximadamente 94ºC, aproximadamente 30 segundos a
aproximadamente 52ºC y aproximadamente 1 minuto a aproximadamente
72ºC). El experto en la materia apreciará que pueden introducirse
variaciones de esta reacción de ciclo térmico.
Ventajosamente, las reacciones de amplificación
de la segunda fase se organizan mediante robots en placas de
microvaloración múltiples de 384 pocillos de modo que cada una de
las primeras 96 reacciones de amplificación pueden identificarse
para cada uno de los diferentes marcadores. Por lo tanto, a título
de ejemplo, si se identifican cuatro secuencias de ácido nucleico
en la segunda amplificación, entonces puede utilizarse una placa de
384 pocillos proporcionando de este modo 96 pocillos para cada una
de las cuatro secuencias de ácido nucleico. Alternativamente, la
segunda etapa de amplificación semianidada puede llevarse a cabo en
una segunda placa de 96 pocillos si se utiliza una pipeta
multicanal para las transferencias, en lugar de un sistema
robótico.
En una forma de realización de la presente
invención resulta preferido que la segunda reacción de amplificación
esté automatizada.
En una forma de realización de la presente
invención resulta preferido que la primera y la segunda reacciones
de amplificación estén automatizadas.
Ventajosamente, los procedimientos descritos en
la presente memoria pueden utilizarse en combinación con otras
reacciones de amplificación. A título de ejemplo, los procedimientos
descritos en la presente memoria pueden utilizarse en combinación
con una o más reacciones RCP que detectan anomalías genéticas, tales
como las transposiciones recíprocas.
En un aspecto adicional, se suministra un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- suministrar una variedad de alícuotas de la muestra, en las que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a la de un genoma por alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico de cada una de varias alícuotas en una primera reacción de amplificación; (c) ampliar en una segunda reacción de amplificación una o más secuencias de ácido nucleico de cada una de varias alícuotas preparadas según la etapa (b) en la que por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba; y (d) calcular el número de copias del marcador de prueba comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba con los de un marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se suministra un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (b)
- suministrar una variedad de alícuotas de la muestra, en las que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a la de un genoma por alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico de cada una de varias alícuotas en una primera reacción de amplificación; (c) ampliar en una segunda reacción de amplificación una o más secuencias de ácido nucleico de cada una de varias alícuotas preparadas según la etapa (b) en la que por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; y (d) calcular el número de copias del marcador de prueba comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba con los de un marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se suministra un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- suministrar una o más (por ejemplo una variedad de) alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a la de un genoma por alícuota; (b) ampliar uno o más (preferentemente todos) los marcadores de cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) distribuir cada uno de los productos de amplificación procedentes de la primera reacción de amplificación en la muestras de réplica; (d) ampliar en una segunda reacción de amplificación uno o más marcadores de cada alícuta(s) en las muestras de réplica preparadas según la etapa (c), en la que por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba; y (e) calcular el número de copias del marcador de prueba comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba con los de un marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se suministra un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- suministrar una o más (por ejemplo una variedad de) alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a la de un genoma por alícuota; ampliar uno o más (preferentemente, todos) los marcadores de cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) distribuir cada uno de los productos de amplificación procedentes de la primera reacción de amplificación en la muestras de réplica; (d) ampliar en una segunda reacción de amplificación dos o más marcadores de cada alícuta(s) en las muestras de réplica preparadas según la etapa (c), en la que por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; y (e) calcular el número de copias del marcador de prueba comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba con los del marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores utilizados en la amplificación se
seleccionan de manera que puedan hibridarse con secuencias en las
zonas adyacentes de la secuencia de ácido nucleico (por ejemplo
locus) que se está ampliando. Los cebadores se seleccionan para que
tengan por lo menos complementariedad sustancial con las diferentes
cadenas de ácido nucleico que se está ampliando.
El cebador debe tener suficiente longitud de
modo que pueda cebar la síntesis de los productos de amplificación
en presencia de un agente para la polimerización. La longitud y
composición del cebador depende de muchos parámetros, incluyendo,
por ejemplo la temperatura a la que se lleva a cabo la reacción de
hibridación, la concentración del cebador y la composición
específica del ácido nucleico del cebador. Por lo general el cebador
incluye de 15 a 30 nucleótidos, preferentemente, de 18 a 20 pb.
Para algunas formas de realización de la presente invención,
resulta preferido que los cebadores tengan una Tm comprendida entre
aproximadamente 52 y 60ºC (basado en el cálculo
Tm=2x(A+T)+4x(G+C)). Preferentemente el diseño incluye
por lo menos dos bases G o C en el extremo 3' y por lo menos una en
el extremo 5'. En general, no se utilizan los cebadores que poseen
series de cualquier base individual mayores de 4 bases. La longitud
del amplímero interno se diseña para que esté comprendida entre
aproximadamente 80 y 150 p.b. y la posición del cebador externo no
más de aproximadamente 150 p.b. corriente arriba del cebador directo
interno.
La longitud del cebador puede depender más o
menos de la complejidad de la zona de unión del cebador y de los
factores enumerados a continuación además de los que son conocidos
por los expertos en la materia.
Por lo general, los cebadores se hibridan
específicamente a una secuencia nucleotídica específica. La
expresión "se hibridan específicamente" tal como se utiliza en
la presente memoria se refiere a la unión, duplicación o
hibridación de un ácido nucleico preferentemente a una secuencia
específica en condiciones severas. La expresión "condiciones
severas" se refiere a las condiciones bajo las cuales un cebador
se hibridará preferentemente con su subsecuencia diana, y en menor
medida con, o no completamente con, otras secuencias.
Los cebadores pueden sintetizarse según los
procedimientos que son bien conocidos en la técnica.
La selección del cebador puede realizarse
utilizando varios procedimientos que son conocidos en la técnica
(por ejemplo similares al diseño para utilizaciones convencionales
de la RCP) incluyendo, por ejemplo, el diseñador de cebador
universal después de enmascarar los elementos repetitivos de la
secuencia genómica (Assembly NCBl 35, http://www.ensembl.org)
utilizando Repeatmasker (http://www.repeatmasker.org).
En la primera reacción de amplificación descrita
anteriormente, se utilizan cebadores por lo general que comprenden
un cebador directo e inverso para cada secuencia de ácido nucleico
que se amplía. Los pares de cebadores múltiples pueden combinarse
en una sola reacción múltiple de modo que en la primera reacción de
amplificación, se amplían múltiples secuencias de ácido nucleico
(tales como todos los marcadores).
En la segunda reacción de amplificación tal como
se describió también anteriormente, unas reacciones de amplificación
semianidadas se realizan típicamente para cada secuencia de ácido
nucleico específica que debe ampliarse. Los cebadores utilizados
son de manera adecuada un cebador complementario tal como se utiliza
en la primera reacción de amplificación en combinación con un
cebador directo interno. Para algunas formas de realización de la
presente invención resulta preferido que los cebadores utilizados
sean iguales o sustancialmente iguales a los utilizados en la
primera reacción de amplificación. Por lo general se utilizarán
aproximadamente 0,15 \muM de cada cebador en la primera reacción
de amplificación. Por lo general se utilizará aproximadamente 1
\muM de los cebadores directo interno y complementario adecuados
para la segunda reacción de amplificación.
En una forma de realización de la presente
invención, se utilizan varios pares de cebadores cada uno para una
reestructuración cromosómica específica en una sola reacción. Cada
par de cebadores da como resultado un producto de amplificación que
es de diferente longitud y así los productos de la amplificación
pueden diferenciarse.
En otra forma de realización de la presente
invención, se utilizan cebadores marcados en los que cada par
cebador está marcado con una etiqueta diferente y de este modo los
productos de la amplificación pueden así diferenciarse.
Ventajosamente, pueden analizarse por
consiguiente múltiples cambios de posición cromosómicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la segunda reacción de amplificación
pueden analizarse los productos de amplificación de varias maneras
para determinar el número de copias de las secuencias
amplificadas.
A título de ejemplo, los productos de la
amplificación pueden analizarse separando los productos amplificados
utilizando la electroforesis con objeto de puntuar la presencia o
ausencia del o de los productos de amplificación en cada alícuota de
la muestra.
A título de ejemplo adicional, los resultados
pueden puntuarse mediante análisis de la curva de fusión.
Los resultados pueden ser evaluados mediante
evaluación visual del número de pocillos positivos. A título de
ejemplo, si dos marcadores de ácido nucleico (A y B) se puntúan en
la misma serie de 88 alícuotas, y si las cifras de alícuotas que
puntúan positivo para cada marcador fueran 34 y 56 respectivamente,
entonces las concentraciones medias de las dos secuencias pueden
calcularse como 0,49 y 1,0 copias por alícuota, respectivamente.
Por consiguiente, si la secuencia A se sabe que está presente en N
copias por genoma, puede deducirse que la secuencia B está presente
en 2N copias por genoma.
Si las moléculas de ácido nucleico se
distribuyen al azar entre N alícuotas para dar una media de Z
moléculas por alícuota entonces, según la distribución de Poisson,
el número de alícuotas Np que cabe esperar que contengan por lo
menos una molécula de ácido nucleico viene dado por la ecuación:
(i)Np=N(1-e^{-z})
Por el contrario, si en un panel de N alícuotas
subgenómicas de ácido nucleico se determina la presencia de una
secuencia dada, y si Np de estas puntuaciones de alícuotas positivas
para la secuencia (es decir contiene por lo menos una copia de la
secuencia), entonces el número medio de moléculas de la secuencia
por alícuota puede calcularse de la manera siguiente:
(ii)Z=-ln(1-Np/N)
Por lo tanto, a partir del número de alícuotas
que puntúan positivo para cualquier secuencia dada, puede
determinarse la concentración de esta secuencia (expresada en
copias por alícuotas). Si se analizan dos o más secuencias de esta
manera en la misma serie (o series similares) de alícuotas de ácido
nucleico, entonces pueden calcularse sus concentraciones relativas y
por consiguiente su abundancia relativa.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona un procedimiento de identificación de una o más
alteraciones en una muestra de ácido nucleico, que comprende las
etapas siguientes: (a) determinar el número de copias de una o más
secuencias de ácido nucleico en una muestra de ácido nucleico según
el procedimiento del primer aspecto de la presente invención; y (b)
repetir de manera iterativa el procedimiento en resoluciones cada
vez mayores.
Por consiguiente, el procedimiento del primer
aspecto de la presente invención se repite de manera iterativa
ampliando las secuencias de ácido nucleico que están espaciadas a
intervalos cada vez más pequeños. Por lo general, puede obtenerse
una fotografía en bruto de una alteración genómica utilizando los
procedimientos ya conocidos en la técnica, tal como la hibridación
fluorescente in situ (FISH). Dichos procedimientos pueden
ser útiles para proporcionar una estimación del número de copias de
las secuencias en un cromosoma específico en la proximidad de una
alteración genómica, tal como, por ejemplo, un punto de inflexión.
Sin embargo, para definir con mayor detalle la alteración genómica
de interés puede utilizarse ventajosamente el procedimiento de la
presente invención repitiéndolo de manera iterativa a resoluciones
cada vez mayores. De este modo, por ejemplo, en una primera ronda,
pueden utilizarse marcadores espaciados a intervalos de
aproximadamente 0,2 a 0,5 Mb sobre aproximadamente 3,8 Mb en la
zona del cromosoma en la que se ha encontrado anteriormente que se
produce la alteración genética. Puede llevarse a cabo una ronda
posterior utilizando marcadores a intervalos de aproximadamente 50
kb para mejorar más la supuesta alteración genómica hasta en
aproximadamente 40 kb. Pueden realizarse todavía más rondas para
localizar más la alteración genómica a aproximadamente 1 a 4 kb y a
continuación a menos de 500 p.b. A dicha resolución fina, pueden
utilizarse incluso procedimientos para identificar otras
alteraciones genómicas, tales como deleciones en el lado
centromérico de una transposición.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han identificado muchas zonas cromosómicas o
genes específicos que están presentes en un número de copias
alterado en las células enfermas. El número de copias de cualquier
secuencia de ácido nucleico específica es por lo general de 2 en un
individuo diploide, lo que refleja la presencia de una copia de una
secuencia de ácido nucleico en cada cromosoma. Está ampliamente
aceptado que los cambios del número de copias ocasionan cantidades
anormales, o actividad, de las proteínas codificadas por estas zonas
y por último el fenotipo de la enfermedad opcional.
En un aspecto, se proporciona un procedimiento
de identificación de una o más alteraciones en una muestra de ácido
nucleico, que comprende las etapas siguientes: (a) medir la
frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico en una primera muestra y una segunda muestra según el
procedimiento del primer aspecto de la presente invención; (b)
repetir iterativamente el procedimiento a resoluciones cada vez
mayores para cada una de las muestras; y (c) identificar una o más
diferencias en la frecuencia del número de copias de una o más
secuencias de ácido nucleico en la primera y segunda muestras.
En una forma de realización preferida las
muestras son o proceden de pacientes enfermos y sanos. En una forma
de realización particularmente preferida, el ácido nucleico de la
enfermedad es o procede de un paciente que padece cáncer. Por
consiguiente, el procedimiento puede utilizarse para identificar una
o más alteraciones entre un genoma de cáncer y un genoma normal.
La invención proporciona también un
procedimiento de diagnóstico de una enfermedad en un paciente que
padece o se sospecha que padece la enfermedad basado en la
detección de los cambios en el número de las copias de un ácido
nucleico. El paciente que está siendo examinado puede presentar
síntomas de la enfermedad o síntomas que pueden estar asociados a
la enfermedad. El paciente puede no presentar síntomas en absoluto
pero puede en su lugar sospecharse que es sensible o está
predispuesto a la enfermedad por antecedentes familiares o por el
ensayos genéticos (p. ej. huellas dactilares genéticas), por
ejemplo, como se describe en la presente memoria a continuación. El
paciente puede ser un paciente que ha estado expuesto a uno o más
agentes o condiciones que se sabe o que se sospecha que produce la
enfermedad. El paciente puede incluso ser un paciente que está en
proceso de desarrollar una enfermedad o sea sospechoso de
desarrollarla. En un aspecto se proporciona un procedimiento de
diagnóstico de una enfermedad en un paciente que padece o se
sospecha que padece la enfermedad, que comprende las etapas
siguientes: (a) medir la frecuencia del número de copias de una o
más secuencias de ácido nucleico en una muestra según el
procedimiento del primer aspecto de la presente invención; y (b)
comparar el número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico con el número de copias normal (p. ej., sin enfermedad) de
una o más secuencias de ácido nucleico; en la que la diferencia
entre el número de copias es indicativo de que el paciente padece la
enfermedad.
Por lo general, el número de copias normal se
determinará analizando las muestras de un paciente o de varios
pacientes que no padecen la enfermedad que está siendo
analizada.
Una diferencia entre el número de copias de una
o más secuencias de ácido nucleico en el paciente que está siendo
analizado y el número de copias normal es indicativo de que está
presente una alteración y de que el paciente padece la
enfermedad.
Puede utilizarse incluso una muestra de
numerosos individuos diferentes que se sabe que padecen una
enfermedad común. Pueden llevarse a cabo ensayos de identificación
para determinar la frecuencia del número de copias en numerosas
secuencias de ácido nucleico diferentes para cada uno de los
individuos enfermos con objeto de identificar las secuencias de
ácido nucleico que tienen un número de copias alterado. Por ejemplo,
para los individuos que presentan un tumor, puede extraerse una
muestra de la zona tumoral de cada individuo y realizar
identificaciones para identificar las zonas del genoma con un número
de copias alterado. Con dicha información, pueden realizarse
correlaciones entre las secuencias de ácido nucleico que presentan
un número de copias alterado y las enfermedades específicas. Por
consiguiente, los procedimientos de la presente pueden utilizarse
para identificar la alteración de las secuencias de ácido nucleico,
que están asociadas a enfermedades específicas.
Por lo tanto, en un aspecto adicional se
proporciona también un procedimiento de diagnóstico de una
enfermedad en un paciente que padece o se sospecha que padece la
enfermedad se sabe que está predispuesto a la enfermedad (por
ejemplo por antecedentes familiares o por el ensayos genéticos, tal
como por huellas dactilares genéticas), ha estado expuesto a uno o
más agentes o condiciones que se sabe o que se sospecha que produce
la enfermedad o está en proceso o se sospecha que está en proceso
de desarrollar la enfermedad que comprende las etapas siguientes:
(a) medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias
de ácido nucleico en una muestra que se sabe que es la causa de la
enfermedad o está asociada a ésta; y (b) comparar el número de
copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la muestra con
la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico en la muestra con la frecuencia del número de copias de una
o más secuencias de ácido nucleico en la muestra que se sabe que es
la causa de la enfermedad o está asociada a ésta; en el que una
correlación entre el número de copias es indicativo de que el
paciente padece la enfermedad.
En una forma de realización, la enfermedad puede
ser cáncer, tal como cáncer de riñón.
La presente invención proporciona además un
procedimiento para detectar una o más alteraciones, tales como
amplificaciones y/o deleciones, una o más muestras, tales como las
muestras que son o proceden de células tumorales. Los resultados
que se obtienen pueden utilizarse para determinar el comportamiento
ulterior de la muestra. La determinación puede realizarse asociando
los modelos de alteraciones en la muestra con el comportamiento de
la muestra. Dichas asociaciones pueden realizarse analizando, por
ejemplo, el ADN de las muestras archivadas relacionado con
registros médicos, o cuando se analizan muestras recientes por los
procedimientos descritos en la presente memoria y los pacientes a
los que se hace el seguimiento.
Otro aspecto de la presente invención consiste
en proporcionar un procedimiento de análisis de células procedentes
de una célula o tejido anormal sospechoso, en una etapa preliminar
del desarrollo. Una ventaja de los procedimientos descritos en la
presente memoria es que solamente se requiere para el análisis una
pequeña cantidad de ácido nucleico genómico. La detección precoz de
las alteraciones, tal como las amplificaciones y/o deleciones, en
dichas células o tejidos permite la intervención terapéutica precoz
que puede adaptarse a las reestructuraciones genéticas. Además,
dicha detección precoz proporciona medios para asociar la evolución
de las células o tejidos a las reestructuraciones genéticas
detectadas por los procedimientos de la presente invención.
Utilizando estos procedimientos pueden llevarse
a cabo identificaciones rápidamente y con poco coste. Por
consiguiente, los procedimientos pueden ser muy aconsejables para el
desarrollo de perfiles de patología molecular que permite a los
doctores hacer pronósticos más informados del paciente y predecir
mejor la respuesta del paciente a diferentes terapias, mejorando de
este modo los resultados clínicos.
Para los pacientes que presentan síntomas de una
enfermedad, el procedimiento descrito en la presente memoria puede
utilizarse también para determinar si el paciente tiene alteraciones
del número de copias que son conocidas porque están relacionadas
con enfermedades que están asociadas a los síntomas que presenta el
paciente. Por ejemplo, para un paciente que tiene un tumor, un
doctor obtendría una muestra del tumor. La identificación de la
muestra del tumor para identificar si existe una alteración del
número de copias en las secuencias de ácido nucleico conocidas por
estar asociadas al tipo de tumor específico puede llevarse a cabo
rápidamente utilizando los procedimientos descritos en la presente
memoria. Con la información específica con respecto a las
alteraciones del número de copias y el conocimiento de las
correlaciones entre los resultados de la enfermedad y la eficacia
de diferentes estrategias de tratamiento para la o las alteraciones
específicas, el doctor puede tomar una decisión documentada con
relación al pronóstico del paciente y la opción más eficaz de
tratamiento. Por ejemplo, si los procedimientos demuestran que se
amplían unas secuencias específicas de ácido nucleico y que la
amplificación de este locus está asociada a la escasa recuperación,
el doctor puede aconsejar al cliente con respecto a la probable
eficacia las opciones de tratamiento agresivo y la opción de llevar
a cabo simplemente dichos tratamientos, especialmente si la
enfermedad está muy avanzada. Por otra parte, si el número de
copias está alterado en un locus que está asociado a la buena
recuperación, el doctor puede describir un intervalo de opciones de
tratamiento que varía desde simplemente controlar la enfermedad
para ver si la enfermedad empeora o medidas más agresivas para
asegurar que la enfermedad es atacada antes de que empeore.
De este modo, en un aspecto adicional, se
proporciona un procedimiento para determinar si un paciente presenta
una o más alteraciones del número de copias que es conocido porque
está relacionado con una enfermedad, que comprende la etapa de
identificar si existe una alteración del número de copias utilizando
el procedimiento según el primer aspecto de la invención en una o
más secuencias de ácido nucleico que se sabe que están asociadas a
la enfermedad que se sospecha que está padeciendo el paciente, en la
que una correlación entre la alteración del número de copias en el
paciente y la alteración del número de copias en la enfermedad
indica que el paciente está padeciendo la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Los términos "tumor" o "cáncer" se
refieren a la presencia de células que poseen características
típicas de células productoras de cáncer, tales como la
proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastásico,
rápido crecimiento y velocidad de proliferación, y determinadas
propiedades morfológicas características.
Con frecuencia, las células cancerosas estarán
en forma de tumor, pero dichas células pueden existir solas en un
animal, o pueden ser células cancerosas no tumorígenas, tales como
las células de leucemia.
Los cánceres incluyen, pero no se limitan a
melanomas, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de bronquios,
cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer
de estómago, cáncer de ovario, cáncer de vejiga urinaria, cáncer
cerebral o del sistema nervioso central, cáncer del sistema nervioso
periférico, cáncer de esófago, cáncer cervical, cáncer de útero o
de endometrio, cáncer de cavidad oral o de faringe, cáncer de
hígado, cáncer de riñón, cáncer de testículo, cáncer del conducto
biliar, cáncer del intestino delgado o de apéndice, cáncer de las
glándulas salivales, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de las
glándulas suprarrenales, osteosarcoma, condriosarcoma y
similares.
\newpage
Los tumores pueden ser de cariotipos
heterogéneos que contienen varias poblaciones de células cada con
diferentes tipos de reestructuraciones genéticas. Las células
tumorales son difíciles de cultivar, y no está claro que las
células cultivadas sean representativas de la población original de
células tumorales. La presente invención proporciona unos medios
para evitar el obstáculo del cultivo ya que solamente se requieren
bajas cantidades de ácido nucleico y por consiguiente permite la
caracterización genética de células tumorales y de este modo, de la
heterogeneidad de los tumores.
La extracción de la mayor parte del ácido
nucleico de muchas células de un tumor puede utilizarse también para
determinar las alteraciones consistentes en un tumor.
En un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona un procedimiento para detectar,
diagnosticar o determinar la sensibilidad de un sujeto al cáncer
que comprende la etapa de determinar la presencia de la
transposición t(3;5) no recíproca como se describe en la
presente memoria en un paciente, en el que la presencia de la
transposición es indicativa de que el paciente tiene, es probable
que tenga o está predispuesto a desarrollar cáncer. Preferentemente,
el cáncer es el adenocarcinoma renal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en la presente
memoria proporcionan ventajosamente una manera rápida, precisa y
económica de determinar la frecuencia del número de copias de una o
más secuencias de ácido nucleico. Esto convierte en ideales a los
procedimientos de análisis molecular de numerosas enfermedades, así
como la evaluación de desequilibrios cromosómicos asociados, por
ejemplo, a síndromes que amenazan la salud.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en la presente
memoria pueden utilizarse para desarrollar correlaciones entre
determinados fenotipos de enfermedades y pronósticos para los
pacientes. Por ejemplo, pueden utilizarse procedimientos para
identificar numerosos ácidos nucleicos en una variedad de diferentes
pacientes que tienen los mismos síntomas aparentes de enfermedad
para identificar estos ácidos nucleicos que tienen un número de
copias anómalas. En este caso, se obtendrían muestras a partir del
tejido enfermo. Puede mantenerse un historial sanitario para cada
individuo de la prueba para hacer una correlación entre los ácidos
nucleicos con número de copias alteradas y las respuestas de la
enfermedad.
De esta manera, pueden hacerse correlaciones entre los cambios de número de copias y el pronóstico del paciente.
De esta manera, pueden hacerse correlaciones entre los cambios de número de copias y el pronóstico del paciente.
Por lo tanto, en otro aspecto se proporciona
también un procedimiento para determinar el pronóstico del paciente
que comprende las etapas siguientes: (a) determinar la frecuencia
del número de copias de uno o más ácidos nucleicos procedentes de
uno o más pacientes que presentan los mismos síntomas de enfermedad
aparentes que el paciente que utiliza el procedimiento según el
primer aspecto de la presente invención; (b) identificar aquellos
ácidos nucleicos que tienen un número de copias anómalo; (c)
correlacionar los ácidos nucleicos que tienen un número de copias
alterado con la respuesta de la enfermedad; y (d) preveer la
respuesta de la enfermedad en el paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en la presente
memoria puede aplicarse de manera rutinaria antes de administrar un
fármaco a un paciente por primera vez. Si el paciente se observa que
pierde ambas copias de un gen que expresa una enzima requerida para
la desintoxicación de un fármaco específico, generalmente no debería
administrarse el fármaco al paciente o, debería administrarse el
fármaco en dosis más pequeñas en comparación con los pacientes que
presentan concentraciones normales de la enzima. El curso posterior
puede ser necesario si no hay ningún tratamiento alternativo
disponible. Si se observa que el paciente pierde ambas copias de un
gen que expresa una enzima requerida para la activación de un
fármaco específico, el fármaco no tendrá ningún efecto beneficioso
en el paciente y no debería administrarse. A los pacientes con una
copia natural de un gen y una copia mutante de un gen, y a quienes
están en situación de riesgo de tener menores niveles de una enzima,
se les debe administrar fármacos metabolizados por esta enzima
únicamente con el mismo cuidado, dependiendo de nuevo de si existen
alternativas disponibles. Si el fármaco está desintoxicado por la
enzima en cuestión, debería administrarse al paciente en general
una dosis menor del fármaco. Si el fármaco es activado por la
enzima, debería administrarse al paciente heterocigótico una dosis
mayor del fármaco. Lo contrario aplica a pacientes con copias
adicionales de un gen de biotransformación específica, quienes
están en situación de riesgo de tener concentraciones elevadas de
una enzima. La selección más racional de agentes terapéuticos que
pueden prepararse con la utilidad de resultados de identificación
con menos efectos secundarios y mayor eficacia del fármaco en
pacientes con poca metabolización.
Los procedimientos pueden ser útiles también
para identificar poblaciones de pacientes quienes van a ser
sometidos a una prueba clínica de un nuevo fármaco. El examen
identifica un grupo de pacientes, cada uno de los cuales presenta
concentraciones naturales del complemento completo de enzimas de
biotransformación. El grupo de pacientes a continuación se somete a
la determinación de la seguridad y la eficacia de los fármacos. Los
fármacos que demuestran ser eficaces mediante dichas pruebas son
formulados para su utilización terapéutica con un vehículo
farmacéutico tal como agua destilada estéril, solución salina
fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de
Hank.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en la presente
memoria pueden utilizarse también para identificar individuos que
se sabe que son sensibles a una enfermedad. En este escenario, por
ejemplo, el individuo conocería los resultados de la prueba o los
antecedentes familiares que presentan la presencia de un marcador de
la enfermedad que era sensible a una enfermedad específica. Se
extraería una muestra de tejido, que está asociado a la enfermedad
a la que un paciente es sensible. A título de ejemplo solamente, si
el paciente procede de una familia con antecedentes de cáncer de
piel, un doctor realizaría una biopsia de la piel para obtener la
muestra. Puede determinarse entonces un valor de la frecuencia del
número de copias del locus o de los loci asociados a la enfermedad
específica a la que el paciente es sensible utilizando los
procedimientos descritos en la presente memoria. Si la
determinación presenta un número anormal de copias, el paciente
puede entonces ser aconsejado con respecto a la probabilidad de que
el paciente comience a padecer la enfermedad y los pros y contras
con respecto a diferentes tratamientos alternativos. En este caso
en el que el paciente todavía no está presentando síntomas de la
enfermedad, la acción más apropiada puede ser simplemente controlar
estrechamente al paciente. Sin embargo, el paciente, tras el
consejo apropiado, puede elegir tomar la acción agresiva preventiva
para evitar problemas en una fecha posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Los procedimientos descritos en la presente
memoria también pueden ser útiles para identificar individuos, que
no presentan síntomas de enfermedad ni sensibilidades conocidas, a
la enfermedad. Un individuo en esta categoría generalmente no
presentaría síntomas de enfermedad, no tendría antecedentes
familiares de la enfermedad y no tendría conocimiento de que
transporta un marcador asociado a una enfermedad. En tales casos,
pueden utilizarse procedimientos como una herramienta de
identificación preventiva. En este aspecto, un número de locus
seleccionados conocidos por estar asociados con determinadas
enfermedades puede examinarse para identificar locus con un número
de copias atípico. En este caso, se obtendrían muestras de
diferentes tejidos o fluidos que están afectados por la(s)
enfermedad(es) que se está(n) examinando. Si se identifica
que un o unos locus presentaban un número de copias alterado,
entonces se aconsejaría al paciente respecto a la probabilidad de
que la enfermedad se manifieste y el intervalo de opciones de
tratamiento disponibles.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra utilización de los procedimientos descritos
se sitúa en el área de los diagnósticos prenatales, en particular,
como un modo de identificar anomalías del número de copias en un
embrión o feto. Una tendencia general en aumento es para las
mujeres que esperan hasta más tarde en la vida para tener niños.
Asociado a este retraso, está el riesgo creciente de que el niño
nazca con un defecto congénito de nacimiento.
Los procedimientos para obtener ácido nucleico
de células embrionarias (es decir, el recién nacido en desarrollo
desde la concepción hasta 8 semanas de desarrollo) o fetales (es
decir, el recién nacido en desarrollo desde nueve semanas de
desarrollo hasta el nacimiento) son bien conocidas en la técnica.
Los ejemplos incluyen pero no se limitan a la biopsia materna (por
ejemplo, muestreo cervical, muestreo de amniocentesis, muestreo de
sangre), biopsia fetal (por ejemplo, biopsia hepática) y muestreo de
la vellosidad coriónica (patente US nº 6.331.395).
El aislamiento del ácido nucleico fetal
procedente de la sangre materna se utiliza preferentemente según
este aspecto de la presente invención ya que es un procedimiento no
agresivo que hace que no plantee ningún riesgo para el recién
nacido en desarrollo (Am, J. Hum. Genet. (1998) 62(4):
768-75). Las células exentas de ácido nucleico
fetal pueden recogerse de la circulación materna y analizarse tal
como se describió anteriormente (Am. J. Obstet. Gynecol.
(2002) 186:117-20). Las técnicas de la RCP se
utilizan por lo general junto con estos procedimientos con objeto
de aumentar la cantidad relativa de ácido nucleico fetal y permitir
de este modo el análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
La expresión "ácido nucleico" tal como se
utiliza en la presente memoria se refiere a un desoxirribonucleótido
o ribonucleótido en forma mono- o bicatenaria.
La expresión comprende los ácidos nucleico, es
decir, oligonucleótidos, que contienen análogos conocidos de
nucleótidos naturales que presentan propiedades de fijación
similares o mejoradas. La expresión comprende también estructuras
similares al ácido nucleico con ejes centrales sintéticos. Los
análogos con eje central de ADN incluyen fosfodiéster,
fosforotioato, fosforoditioato, metilfosfonato, fosforamidato,
fosfotriéster de alquilo, sulfamato, 3'-tioacetal,
metilen(metilimino),
3'-N-carbamato, carbamato de
morfolino, y ácidos nucleicos peptídicos (ANP); véase
Oligonucleotides and Analogues, a Practical Approach, editado por F.
Eckstein, IRL Press en Oxford University Press (1991); Antisense
Strategies, Annals of the New York Academy of Sciences, Volumen
600, Eds. Baserga y Denhardt (NYAS 1992); Milligan (1993) J. Med.
Chem. 36:1923-1937; Antisense Research and
Applications (1993, CRC Press). Los ANP contienen ejes centrales no
iónicos, tales como las unidades de
N-(2-aminoetil)glicina. Los enlaces
fosforotioato se describen en los documentos WO 97/03211; WO
96/39154; Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol.
144:189-197. Otros ejes centrales sintéticos
comprendidos en el término incluyen los enlaces metilfosfonato o
los enlaces alternativos metilfosfonato y fosfodiéster
(Strauss-Soukup (1997) Biochemistry 36:
8692-8698), y los enlaces bencilfosfonato (Samstag
(1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev
6:153-156).
El ácido nucleico puede ser ADN o ARN de origen
genómico, sintético o recombinante por ejemplo ADNc. El ácido
nucleico puede ser bicatenario o monocatenario si representa la
cadena transcrita complementaria o combinaciones de la misma.
Preferentemente, el ácido nucleico es ADN, más
preferentemente ADN genómico.
El ácido nucleico puede prepararse mediante la
utilización de técnicas de ADN recombinante (por ejemplo ADN
recombinante).
En un aspecto de la presente invención se
proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un transposición
t(3;5) no recíproca, en la que el cromosoma 5q21.3 para la
coordenada 105386443 p.b. se fusiona al cromosoma 3p13 de coordenada
74111893 p.b. y en el que el resto de adenina en la unión es de uno
de los dos cromosomas.
Preferentemente, el cromosoma 5q21.3 comprende
la secuencia TATACATACATACGGATATATGTATAAAATC o una variante,
desviación homóloga o fragmento de la misma.
Preferentemente, el cromosoma 3p13 comprende la
secuencia TAGGGAGTGAAGTAGTGGCCAAGAAAACAT GCCAG o una variante,
desviación homóloga o fragmento de la misma.
Preferentemente, la transposición t(3;5)
no recíproca comprende la secuencia TATACATACATACGGATATATG
TATAAAATCATAGGGAGTGAAGTAGTGGCCAAGAAAACATGCCAG o una variante,
desviación homóloga o fragmento de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico correspondiente a la
alteración identificada por los procedimientos de la presente
invención puede clonarse y ligarse en un montaje.
El término "montaje" (que es sinónimo a los
términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido") incluye una secuencia nucleotídica unida directa o
indirectamente a un activador.
El montaje puede contener o expresar un
marcador, que permite la selección del montaje de la secuencia
nucleotídica de una célula, tal como una célula bacteriana, vegetal
o de mamífero. Existen varios marcadores que pueden utilizarse, por
ejemplo los que codifican la
manosa-6-fosfato isomerasa
(especialmente para plantas) o los marcadores que proporcionan
resistencia a antibióticos, por ejemplo resistencia a G418,
higromicina, bleomicina, kanamicina y gentamicina.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico correspondiente a la
alteración identificada por los procedimientos de la presente
invención puede clonarse y ligarse en un vector.
El término "vector" incluye vectores de
expresión, vectores de transformación y vectores lanzadera.
La expresión "vector de transformación"
significa un montaje capaz de ser transferido desde una entidad a
otra entidad, que puede ser de la especie o puede ser de una especie
diferente. Si el montaje es capaz de transferirse desde una especie
a otra, por ejemplo desde un plásmido de E. coli a una
bacteria, tal como del género Bacillus, entonces el vector
de transformación se denomina a veces "vector lanzadera". Puede
ser incluso un montaje capaz de transferirse desde un plásmido de
E. coli a un Agrobacterium a una planta.
Los vectores pueden transformarse en una célula
hospedadora adecuada tal como se describe a continuación para
proporcionar la expresión de un polipéptido.
Los vectores pueden ser por ejemplo vectores de
plásmido, de virus o de fago proporcionados con un origen de
replicación, opcionalmente un activador para la expresión de dicho
polinucleótido y opcionalmente un regulador del activador.
Los vectores pueden contener una o más
secuencias nucleotídicas de marcador seleccionable. Los sistemas de
selección más adecuados para microorganismos industriales son los
formados por el grupo de marcadores de selección que no necesitan
una mutación en el organismo hospedador. Los ejemplos de marcadores
de selección no micóticos son las secuencias nucleotídicas para
acetamidasa (amdS), ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), resistencia a la fleomicina y benomilo (benA).
Ejemplos de marcadores de selección no micóticos son la secuencia
nucleotídica con resistencia a G418 bacteriana (ésta puede
utilizarse también en levaduras, pero no en hongos filamentosos),
la secuencia nucleotídica con resistencia a la ampicilina (E.
coli), la secuencia nucleotídica con resistencia a la neomicina
(Bacillus), y la secuencia nucleotídica uidA de E.
coli, que codifica la \beta-glucuronidasa
(GUS).
Los vectores pueden utilizarse in vitro,
por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transfectar
o transformar una célula hospedadora.
De este modo, los polinucleótidos pueden
incorporarse en un vector recombinante (por lo general un vector
replicable), por ejemplo, un vector de clonación o expresión. El
vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una
célula hospedadora compatible.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención comprende la utilización
de variantes, homólogos, derivados y fragmentos de los mismos.
El término "variante" se utiliza para
significar un polipéptido natural o secuencias nucleotídicas que
difieren de una secuencia natural.
El término "fragmento" indica que una
secuencia polipeptídica o nucleotídica comprende una fracción de una
secuencia natural. Puede comprender una o más secciones contiguas
grandes de secuencia o muchas secciones pequeñas. La secuencia
puede también comprender otros elementos de la secuencia, por
ejemplo, puede ser una proteína de fusión con otra proteína.
Preferentemente la secuencia comprende por lo menos 50%, más
preferentemente por lo menos 65%, más preferentemente por lo menos
80%, más preferentemente por lo menos 85%, más preferentemente por
lo menos 90%, más preferentemente por lo menos 95%, más
preferentemente por lo menos 96%, más preferentemente por lo menos
97%, más preferentemente por lo menos 98%, más preferentemente por
lo menos 99% de la secuencia natural.
Preferentemente el fragmento conserva el 50%,
más preferentemente el 60%, más preferentemente el 70%, más
preferentemente el 80%, más preferentemente el 85%, más
preferentemente el 90%, más preferentemente el 95%, más
preferentemente el 96%, más preferentemente el 97%, más
preferentemente por lo menos 98% o más preferentemente el 99% de
actividad de la secuencia polipeptídica o nucleotídica natural.
El fragmento puede ser un fragmento
funcional.
Por "fragmento funcional" de una molécula
se entiende un fragmento que conserva o posee sustancialmente la
misma actividad biológica que la molécula intacta. En todos los
casos, un fragmento funcional de una molécula conserva por lo menos
el 10% y por lo menos aproximadamente el 25%, 50%, 75%, 80%, 85%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la actividad biológica de la
molécula intacta.
El termino "homólogo" significa una entidad
que tiene una determinada homología con las presentes secuencias de
aminoácido y las presentes secuencias nucleotídicas. Aquí, el
término "homología" puede equivaler a "identidad".
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia de aminoácidos, que puede
ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferentemente por lo menos
95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la presente secuencia. Aunque
homología puede considerarse también desde el punto de vista de
similitud (es decir restos de aminoácidos con propiedades/funciones
químicas similares), en el contexto de la presente invención se
prefiere expresar homología en términos de identidad de
secuencia.
En el presente contexto, una secuencia homóloga
se considera que incluye una secuencia de nucleótidos, que puede
ser por lo menos 75, 85 o 90% idéntica, preferentemente por lo menos
95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la presente secuencia. Aunque
homología puede considerarse también desde el punto de vista de
similitud (es decir restos de aminoácidos con propiedades/funciones
químicas similares), en el contexto de la presente invención se
prefiere expresar homología en términos de identidad de
secuencia.
Las comparaciones de homología pueden realizarse
visualmente, o más frecuentemente, con la ayuda de programas de
comparación de secuencias fácilmente disponibles. Estos programas
informáticos comercialmente disponibles pueden calcular el % de
homología entre dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse sobre
secuencias contiguas, es decir una secuencia está alineada con otra
secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente
con el aminoácido correspondiente en otra secuencia, un resto a la
vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos". Por lo
general, dichas alineaciones sin huecos se realizan solamente sobre
un número relativamente pequeño de restos.
Aunque este es un procedimiento muy sencillo y
consecuente, no puede tener en consideración que, por ejemplo, en
un par de secuencias de otro modo idénticas, una inserción o
deleción ocasionará que los siguientes restos de aminoácidos se
coloquen fuera de la alineación, resultando de este modo
potencialmente una gran reducción en el % de homología cuando se
lleva a cabo una alineación global. En consecuencia, la mayoría de
los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir
alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles
inserciones y deleciones sin penalizar indebidamente la puntuación
global de la homología. Esto se consigue insertando "huecos"
en la alineación de la secuencia para tratar de maximizar la
homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se produce
en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como
sea posible (reflejando mayor relatividad entre las dos secuencias
comparadas) conseguirá una puntuación mayor que la que tiene muchos
huecos. Los "costes por hueco afines" se utilizan por lo
general para cargar un coste relativamente elevado por la
existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada
resto posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de
hueco más generalmente utilizado. Altas penalizaciones por hueco
desde luego producirán alineaciones optimizadas con menores huecos.
La mayoría de los programas de alineación permiten que se
modifiquen las penalizaciones por hueco. Sin embargo, resulta
preferido utilizar los valores por defecto cuando se utiliza dicho
programa para comparaciones de secuencias. Por ejemplo, cuando se
utiliza el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalización por hueco
por defecto para secuencias de aminoácidos es -12 para un hueco y -4
para cada extensión.
El cálculo del % de homología máximo por
consiguiente requiere en primer lugar la producción de una
alineación óptima, teniendo en consideración las penalizaciones por
hueco. Un programa de ordenador adecuado para llevar a cabo dicha
alineación es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (University of
Wisconsin, EE.UU.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids
Research 12:387). Los ejemplos de otro programa que pueden realizar
comparaciones de secuencias incluyen, pero se limitan, al paquete
BLAST (véase Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo
18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol.,
403-410), el GENEWORKS continuación de herramientas
de comparación y CLUSTAL. Tanto BLAST como FASTA están disponibles
para investigación fuera de línea y en línea (véase Ausubel el
al., 1999 ibid páginas 7-58 a
7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones, es
preferible utilizar el programa Bestfit GCG. Una nueva herramienta,
denominada BLAST 2 Sequences está también disponible para comparar
secuencias de proteínas y nucleótidos (véase FEMS MIcrobio
Left 1999 174(2): 247-5; FEMS MIcrobio
Left 1999 177(1): 187-8).
Aunque el % de homología final puede medirse en
términos de identidad, el propio proceso de alineación no está
basado por lo general en una comparación de pares todo o nada. En su
lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación de
similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación en
forma de pares basada en la similitud química o la distancia en la
evolución. Un ejemplo de dicha matriz generalmente utilizada es la
matriz BLOSUM62, la matriz por defecto para la continuación de
programas BLAST. Los programas Winsconsin de GCG generalmente
utilizan valores públicos por defecto o la tabla de comparación de
símbolos habitual si se suministra (véase el manual de usuario para
más detalles). Para algunas aplicaciones, resulta preferido
utilizar los valores públicos por defecto para el paquete de GCG, o
en el caso de otro programa informático, la matriz por defecto, tal
como BLOSUM62.
Una vez el programa informático ha producido la
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa
informático por lo general forma parte de la comparación de
secuencias y genera un resultado numérico.
Deberían utilizarse penalizaciones por hueco
cuando se determina la identidad de secuencia, preferentemente
entonces se utilizan los siguientes parámetros:
Para la comparación de secuencias polipeptídicas
pueden utilizarse los escenarios siguientes: penalización por
creación de HUECO de 3,0 y penalización de 0,1 por amplificación de
HUECO. De manera adecuada, el grado de identidad con respecto a una
secuencia de aminoácidos se determina sobre por lo menos 5
aminoácidos contiguos, se determina sobre por lo menos 10
aminoácidos contiguos, sobre por lo menos 15 aminoácidos contiguos,
sobre por lo menos 20 aminoácidos contiguos, sobre por lo menos 30
aminoácidos contiguos, sobre por lo menos 40 aminoácidos contiguos,
sobre por lo menos 50 aminoácidos contiguos o sobre por lo menos 60
aminoácidos contiguos.
Las secuencias pueden tener también deleciones,
inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos, que producen
un cambio imperceptible y dan como resultado una sustancia
funcionalmente equivalente. Las sustituciones deliberadas de
aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud de
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la
naturaleza amfipática de los restos siempre que se conserve la
actividad de fijación secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los
aminoácidos cargados negativamente incluyen el ácido aspártico y el
ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen la
lisina y la arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza
polares sin carga que presentan valores de hidrofilia similares
incluyen la leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina,
asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y
tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservadores,
por ejemplo, según la tabla a continuación. Los aminoácidos en el
mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma
línea en la tercera columna pueden sustituirse unos por otros:
La presente invención comprende también la
sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento se utilizan
ambas en la presente memoria para significar el intercambio de un
resto de aminoácido existente, por un resto alternativo) puede
producirse es decir la sustitución semejante por semejante, tal como
básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La
sustitución no homóloga puede producirse también es decir en una
clase de resto a otra o alternativamente implicando la inclusión de
aminoácidos artificiales, tales como ornitina (denominada en lo
sucesivo Z), ácido diaminobutírico ornitina ((denominada en adelante
B), norleucina ornitina (denominada en lo sucesivo O),
pirilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Los reemplazamientos pueden ser realizados
también por aminoácidos artificiales e incluyen; aminoácidos alfa*
y alfa-disustituidos* N-alquil
aminoácidos*, ácido láctico*, derivados haluro de aminoácidos
naturales, tal como trifluorotirosina*,
p-Cl-fenilalanina*,
p-Br-fenilalanina*,
p-I-fenilalanina*,
L-alil-glicina*,
\beta-alanina*, ácido
L-\alpha-aminobutírico*,
L-\gamma-aminobutírico*, ácido
L-\alpha-aminoisobutírico*, ácido
L-\varepsilon-aminocaproico^{#},
ácido 7-aminoheptanoico*,
L-metionina sulfona^{#*},
L-norleucina*, L-norvalina*,
p-nitro-L-fenilalanina*,
L-hidroxipolina^{#},
L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina
(Phe), tales como 4-metil-Phe*,
pentametil-Phe*, L-Phe
(4-amino)^{#}, L-Tyr
(metil)*,
L-Phe(4-isopropil)*,
L-Tic(ácido 1, 2, 3,
4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxilo)*,
ácido L-diaminopropiónico^{#} y
L-Phe (4-bencil)*. La anotación * se
ha utilizado en aras de la exposición anterior (en relación con la
sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza
hidrófoba del derivado mientras que # se ha utilizado para indicar
la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características
amfipáticas.
Las secuencias de aminoácidos variantes pueden
incluir grupos espaciadores adecuados que pueden insertarse entre
cualquiera de dos restos de aminoácido de la secuencia incluyendo
grupos alquilo (tales como los grupos metilo, etilo o propilo)
además de espaciadores de aminoácidos, tales como los restos de
glicina o \beta-alanina. Una forma adicional de
variación conlleva la presencia de uno o más restos de aminoácidos
en forma peptoide y será bien comprendida por los expertos en la
materia. Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza
para referirse a restos variantes de aminoácidos en los que el grupo
sustituyente \alpha-carbono está en el átomo de
nitrógeno del resto en lugar de en el carbono \alpha. Los
procedimientos para preparar péptidos en forma peptoide son
conocidos en la técnica, por ejemplo Simon R.J. et al.,
PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 y
Horwell D.C., Trends Biotechnol. (1995) 13(4),
132-134.
Las secuencias nucleotídicas para su utilización
en la presente invención pueden incluir en ellas nucleótidos
sintéticos o modificados en la técnica se conocen numerosos tipos
diferentes de modificación a oligonucleótidos. Éstas incluyen los
ejes centrales de fosfonato de metilo y de fosforotioato y/o la
adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o
5' de la molécula. En aras de la presente invención, debe
sobreentenderse que las secuencias nucleotídicas pueden ser
modificadas por cualquier procedimiento disponible en la técnica.
Dichas modificaciones pueden realizarse para aumentar la actividad
in vivo de la vida útil de las secuencias nucleotídicas
útiles en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Los materiales para su utilización en los
procedimientos de la presente invención son apropiados teóricamente
para la preparación de kits.
Dicho kits puede comprender recipientes, cada
uno con uno o más de varios reactivos (por lo general en forma
concentrada) utilizados en los procedimientos de la presente
invención que están descritos en la presente memoria, incluyendo,
por ejemplo, tampones y los trifosfatos de nucleótido apropiado (por
ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), ADN
polimerasa y pueden incluirse también uno o más cebadores para su
utilización en la presente invención.
Los oligonucleótidos en recipientes pueden estar
en cualquier forma, por ejemplo, liofilizados o en solución (por
ejemplo, agua destilada o solución tamponada), etc. Los
oligonucleótidos listos para su utilización en la misma reacción de
amplificación pueden combinarse en un solo recipiente o pueden estar
en recipientes separados.
El kit opcionalmente comprende además un ácido
nucleico de referencia.
Se incluirán también por lo general una serie de
instrucciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se proporciona un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que
comprenden las etapas siguientes: (a) proporcionar una o más
alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende
ácido nucleico en una cantidad inferior a un genoma por alícuota;
(b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en la(s)
alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c)
ampliar en una segunda reacción de amplificación dos o más
secuencias de ácido nucleico procedentes de la(s)
alícuota(s) preparada(s) según la etapa (b), en la que
por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador
de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es
un marcador de referencia; y (d) calcular el número de copias del
marcador de prueba comparando el número de productos amplificados
para el marcador de prueba con los del marcador de referencia.
En un aspecto adicional, se proporciona un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar una o más alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad inferior a un genoma por alícuota; (b) ampliar un marcador de prueba en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) dividir cada uno de los productos amplificados procedentes de la primera reacción de amplificación en por lo menos dos alícuotas de la réplica; (d) ampliar en una segunda reacción de amplificación un marcador de prueba en por lo menos una alícuota o unas de las alícuotas de la réplica preparadas según la etapa (c); y (d) calcular el número de copias comparando el número de productos amplificados procedentes de la segunda reacción de amplificación para el marcador de prueba con los de un marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se proporciona un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar una o más alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad inferior a un genoma por alícuota; (b) ampliar un marcador de prueba en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación; (c) dividir cada uno de los productos amplificados procedentes de la primera reacción de amplificación en por lo menos dos alícuotas de la réplica; (d) ampliar en una segunda reacción de amplificación el marcador de prueba procedente de una primera alícuota de la réplica y el marcador de referencia procedente de una segunda alícuota de la réplica preparadas según la etapa (c); y (e) calcular el número de copias comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba y el marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional, se proporciona un
procedimiento de medición de la frecuencia del número de copias de
una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra, que comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar una o más alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por alícuota; (b) ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en un marcador de prueba en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación, en la que por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia; (c) dividir cada uno de los productos amplificados procedentes de la primera reacción de amplificación en por lo menos dos alícuotas de la réplica; (d) ampliar en una segunda reacción de amplificación el marcador de prueba procedente de una primera alícuota de la réplica y el marcador de referencia procedente de una segunda alícuota de la réplica preparadas en la etapa (c); y (e) calcular el número de copias del marcador de prueba comparando el número de productos amplificados para el marcador de prueba con las del marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención utiliza, a menos que se
indique de otra manera, técnicas convencionales de biología
molecular, microbiología y tecnología de ADN recombinante que están
comprendidas en las capacidades de cualquier experto en la materia.
Dichas técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo,
J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Segunda Edición, Books 1-3,
Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al.
(1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular
Biology, caps. 9, 13, y 16, John Wiley & Sons, Nueva York,
N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, DAN Isolation and
Sequencing; Essential Techniques, John Wiley & Sons; M. J. Gait
(Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach,
Irl Press; y, D.M.J. Lilley y J.E. Dahlberg, 1992, Methods of
Enzymology: DNA Structure Part A: Syntesis and Physical Analysis of
DNA Methods in Enzymology, Academica Press. Cada uno de estos textos
generales está incorporado en la presente memoria como
referencia.
La invención se describirá a continuación con
mayor detalle a título de ejemplo, lo que significa que sirven para
ayudar a cualquier experto en la materia a llevar a cabo la
invención y no se pretende en modo alguno limitar el alcance de la
invención. Además, cada una de las varias formas de realización y
aspectos de la presente invención tal como se definen en la presente
memoria anteriormente y como se reivindican en el apartado
reivindicaciones a continuación encuentran apoyo experimental en los
Ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las estirpes celulares
SK-RC-9 y
SK-RC-12 ^{20} en DMEM más suero
de ternero fetal al 10%. Se preparó ADN genómico procedente de las
células SK-RC-9 y
SK-RC-12 utilizando el kit DNeasy
Tissue de Qiagen (Qiagen Ltd. U.K.). El ADN se diluyó con agua
destilada hasta aproximadamente 10 genomas/\mul (aproximadamente
30 pg/\mul), y se almacenó a -70ºC en alícuotas.
A grandes rasgos, el análisis de muestras
genómicas para secuencias múltiples en MCC se lleva a cabo
utilizando una amplificación por RCP en dos fases, como se muestra
en el diagrama de la Figura 1. Tres cebadores de RCP (directo e
inverso, más un cebador directo interno anidado) se utilizan para
cada locus (es decir el marcador genómico) que debe ensayarse. En
la primera fase, los pares de cebadores múltiples de la RCP (directo
e inverso), se combinan en una sola reacción múltiple. Los
productos de esta reacción se utilizan como plantillas para las
reacciones de RCP de la segunda fase, cada una de las cuales utiliza
los cebadores directo-interno e inverso para una
sola secuencia. La selección del cebador se llevó a cabo utilizando
criterios sencillos (similares al diseño para utilizaciones
convencionales de RCP) después de enmascarar elementos repetitivos
de la secuencia genómica (Assembly NCBI 35, http://www.ensembl.org)
utilizando Repeat-masker
(http://www.repeatmasker.org). Por lo general, la longitud del
cebador es de 18 a 20 p.b., con una Tm entre 52-60ºC
(basada en el cálculo Tm=2x(A+T)+4x(G+C)). El diseño
requiere por lo menos 2 bases G o C en el extremo 3' y por lo menos
una en el extremo 5'. No se permiten series de ninguna base
individual mayor de 4 bases. La longitud del amplímero interno se
diseña para que esté comprendida entre 80 y 150 p.b. y la posición
del cebador externo no superior a 150 p.b. corriente arriba del
cebador directo interno.
La concentración de ADN es importante en el
análisis de MCC pero no necesita ser demasiado exacta ya que se
obtiene precisión con un contenido en ADN medio de
\sim02-06 genomas haploides por alícuota. La
concentración de partida de las preparaciones de ADN genómico se
determinó utilizando espectrofotometría ultravioleta y basada en
ésta, se realizó una serie de diluciones (convenientemente 6) que
cabe esperar proporcionen entre 0,25 y 8 genomas de ADN por
muestra. Dieciséis alícuotas de cada dilución se analizaron
(utilizando MCC en placas de 96 pocillos, como se describió
anteriormente) para cada uno de los cuatro marcadores,
correspondiente a los segmentos de ADN que se cree que están
presentes en una copia por genoma haploide. La producción de
alícuotas (pocillos) que puntuaron positivas (promediados en los
cuatro marcadores), se utilizó para calcular la concentración de
ADN real en cada dilución. Estos datos se utilizaron a su vez para
determinar el grado exacto de dilución requerida para análisis MCC.
Cuando se ha determinado la concentración de trabajo para MCC, la
dilución de ADN puede utilizarse para todas las etapas de MCC. Cada
nueva preparación de ADN requiere valoración independiente.
Para MCC, se preparó una mezcla madre que
contenía los cebadores de RCP directo e inverso para todas las
secuencias que han de analizarse (0,15 \muM de cada oligo), 1 x
tampón de RCP Gold (Perkin-Elmer), 2 mM MgCl_{2},
200 \muM de cada dNTP y 0,1 u/\mul de Taq Gold ADN polimerasa
(Perkin-Elmer) y aproximadamente 0,03 genomas/\mul
(0,09 pg/\mul) de ADN genómico. 10 \mul de esta mezcla se
dispensaron en cada uno de los 88 pocillos de una placa de 96
pocillos y los 8 pocillos restantes (referencias negativas)
recibieron 10 \mul de una mezcla similar pero que carece de ADN.
Todas las muestras se cubrieron con 20 \mul de aceite mineral. Los
ciclos térmicos se realizaron en caliente partiendo a 93ºC durante
9 minutos, seguido de 25 ciclos de 20 segundos a 94ºC, 30 segundos
a 52ºC, y 1 minuto a 72ºC. Cada reacción RCP se diluyó hasta 500
\mul con agua, y se utilizaron muestras de 5 \mul como
plantilla en cada segunda fase (marcador específico) de RCP
semianidada (MgCl_{2} 1,5 mM, 1 \muM de los cebadores directo
interno y complementario adecuados, otras concentraciones como
anteriormente y ciclo térmico a 93ºC durante 9 minutos, seguido de
33 ciclos de 20 segundos a 94ºC, 30 segundos a 52ºC y 1 minuto a
72ºC. Después de la RCP semianidada, se añadieron a cada pocillo 8
\mul de 2 x tampón de carga (15% p/v de Ficoll 400, 0,1 mg/ml de
azul de bromofenol, 4x Sybr Green, 1x TBE) y se analizaron los
productos de la amplificación por electroforesis durante 10 minutos
a 10 V/cm en geles de poliacrilamida al 6% en placa horizontal de
108 pocillos prefundidos (geles MIRAGE; Genetix Ltd., U.K.)
puntuando la presencia o ausencia del producto de la RCP en cada
muestra. En experimentos posteriores, los resultados se puntuaron
por el análisis de la curva de fusión utilizando un ABI 7900HT con
el programa informático SDS del fabricante.
En estos casos, la mezcla de RCP para las RCP de
segunda fase se modificó para que contenga MgCl_{2} 4 mM y 0,5 x
SyBr GreenI (Cambrex, U.K.). Todas las reacciones de RCP de la
segunda fase se realizaron con robot en placas múltiples de
microvaloración de 384 pocillos (conteniendo cada placa las 96
reacciones de cada uno de los cuatro marcadores). (Nota: la segunda
etapa de RCP semianidada no pudo realizarse en una segunda placa de
96 pocillos utilizando una pipeta multicanal para las
transferencias, en lugar de un sistema robótico).
\vskip1.000000\baselineskip
Si las moléculas de ADN se distribuyen al azar
entre una serie de alícuotas entonces, a partir del número de
alícuotas que puntúan positivo para cualquier secuencia dada, la
concentración de esta secuencia (expresada en copias por alícuotas)
puede determinarse a partir de la ecuación de Poisson (véase la
información complementaria). Si se analizan dos o más secuencias de
esta manera en la misma serie de alícuotas de ADN genómico, entonces
pueden calcularse sus concentraciones relativas, y por consiguiente
su abundancia relativa en el ADN genómico.
Por ejemplo, si dos marcadores de ADN (A y B) se
puntúan en la misma serie de 88 alícuotas, y si los números de
alícuotas que puntúan positivo para cada marcador fueran 34 y 56
respectivamente, entonces las concentraciones medias de las dos
secuencias pueden calcularse (a partir de la ecuación ii, parte A de
información complementaria en línea) como 0,49 y 1,0 copias por
alícuota, respectivamente. Por consiguiente, si la secuencia A se
sabe que está presente en n copias por genoma, puede deducirse que
la secuencia B está presente en 2n copias por genoma.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis por FISH se realizó siguiendo los
protocolos habituales con fotografías del cromosoma completo
(Vysis) o BAC ADN (clones BAC de Invitrogen Ltd.) convertido en
fluorescente mediante la traducción DIG-nick y el
kit fluorescente mejorador de anticuerpos para la detección por DIG
(ROCHE Diagnostics Ltd., U.K.) según las instrucciones del
fabricante. Los clones de BAC utilizados en este estudio de
SK-RC-9 fueron
RP11-24E1, RP11-781E19,
RP11-413E6 en la rama corto del cromosoma 3 y
CTD-2193G5, CTD-2197I11 en la rama
larga del cromosoma 5. Los clones por BAC utilizados en este
estudio de SK-RC-12 fueron
RP11-328N12, RP11-24E1,
RPH-413E6, RP11-528E14,
RP11-424C9. Las posiciones del clon BAC son a partir
del Ensembl Human Genome Server, Assembly NCBI 35.
\vskip1.000000\baselineskip
El ADN genómico se digirió hasta terminación con
encimas de restricción, se fraccionó en geles de agarosa al 0,8% y
se transfirió a membranas HybondN (Amersham). La hibridación en
filtro de Southern se realizó con los fragmentos aislados de
vectores plásmidos^{24}, radiomarcados por reacciones de cebado de
oligonucleótidos aleatorios tal como se describe ^{25}.
Las sondas genómicas para análisis de 5q y 3p en
el ADN de SK-RC-9 se ampliaron en el
ADN humano por RCP y los productos se clonaron utilizando el
sistema de clonación TOPO (Invitrogen) y se verificaron las
secuencias. Las secuencias de cebador para el cromosoma 3 sonda 3pA
fueron AAGCAGGTTAAGGGAGAAGATGAC (posición genómica desde 74112725
hasta 74.114.748 p.b.) y CTCTGAACTCTCTTATTTAAAG (posición genómica
desde 74113146 hasta 74113167 p.b.), para la sonda 3pB del
cromosoma 3 fueron CCCATTGCTCCCCAGCC (posición genómica desde
74114114 hasta 74114137 p.b.) y GCTGTTGGAGGATGAGAGG (posición
genómica desde 74114239 hasta 74114257 pb) y para la sonda del
cromosoma 5q fueron CTGTTCATTCCTTCAACTTCCTA (posición genómica desde
105386013 hasta 105386035 pb) y GCTGATTTTATACATATATCTGTATG (posición
genómica desde 105386412 hasta 105386437 pb).
La sonda del cromosoma 3 para la hibridación en
el filtro del ADN de SK-RC-12 se
realizó clonando el producto genómico de la PCR utilizando los
cebadores GAATTCAGCTATTCAACGC (posición genómica en 81938151) y
GGAAGTGCTAAACACAATGG (posición genómica en 81938388).
\vskip1.000000\baselineskip
La clonación por RCP inversa se realizó tal como
se describe ^{21}. Se digirió ADN de
SK-RC-9 (5 \mug) con 100 unidades
de XbaI (New England Biolabs) durante la noche a 37ºC. El ADN
digerido se extrajo con fenol y se recuperó con precipitación en
etanol. El ADN digerido se puso en círculo por ligadura con 3.200
unidades de T4 ADN ligasa (New England Biolabs) en un volumen de
600 \mul a 16ºC durante 16 horas. El ADN ligado se precipitó con
etanol y se disolvió en 40 \mul de Tris-HCI pH 7,4
a 25ºC, EDTA 1 mM. Se utilizaron cinco microlitros (\sim0.6
\mug de plantilla de ADN) en 50 \mul. La reacción RCP que
contenía 500 \muM de cada dNTP, cebadores directo e inverso 1
\muM, 1x tampón (Expand Long Template Buffer 2, Roche) y 3,75 u de
enzima Expand Long Template (Roche). Las condiciones de la
amplificación por PCR fueron 94ºC durante 2 min, seguidos de 35
ciclos de 94ºC durante 15 s., 60ºC durante 30 s., 68ºC durante 15
min y una etapa de amplificación final a 68ºC durante 30 min. El
producto de la RCP se separó en un gel de agarosa al 1%, se purificó
utilizando Gel Extraction Kit de Qiagen (Qiagen) y se clonó en el
vector de clonación TOPO (Invitrogen). Las secuencias de cebador
para la RCP inversa de la unión de la transposición fueron
CTTCCATACCACTTATGGTGTCTA complementaria (posición genómica en el
cromosoma 3p a 74.112.296 hasta 74.112.319 p.b.) y
AATGCAGACCCTCAAACTATACC transcrita (posición genómica en el
cromosoma 3p a 74.112.472 hasta 74.112.494 pb).
Las secuencias del cebador para la amplificación
por CPR de la zona de fusión de deleción del cromosoma 3 en
SK-RC-12 fueron
5'-AATGTCATGCAGCATATGAC (posición genómica a
81.648.380) y TGATCTTGATTACA
TAGCATT (posición genómica a 81.937.983).
TAGCATT (posición genómica a 81.937.983).
\vskip1.000000\baselineskip
Las células normales son diploides para genes
autosómicos en tanto que las células cancerosas pueden presentar
transposiciones, deleciones, amplificación o inversiones
cromosómicas. Si estos cambios conllevan alteraciones del número de
copias en el estado diploide, es posible determinar éstas mediante
recuento de la frecuencia de reiteración del ADN. El método MCC
consigue esto por análisis de la frecuencia con la que se produce la
amplificación por RCP del marcador genómico al limitar la dilución
del ADN (realmente moléculas individuales de ADN). Las reacciones
por RCP múltiples se realizan en un formato de 96 pocillos y
relativo al número de copias determinado para marcadores adyacentes
que depende del número de pocillos con un producto de RCP.
La esencia del método MCC se describe en la
Figura 1, con un ejemplar de transposición desequilibrada. Los
carcinomas renales frecuentemente llevan transposiciones no
recíprocas entre los cromosomas 3 y 5 (p;q) ^{4,5,17,18}
produciendo un desequilibrio del número de copias. Esto se ilustra
en la Figura 1C en la que la transposición da como resultado un
número de copias para la porción distal del cromosoma negro y 2n
proximal para la transposición. El ADN genómico está muy diluido
tal como se describe para la cartografía HAPPY^{19} y las
alícuotas que contienen menos de un genoma haploide de ADN se
distribuye en 88 pocillos de una placa de microvaloración de 96
pocillos, dejando 8 pocillos para las referencias negativas de la
RCP. La primera ronda de análisis de RCP es una etapa de
amplificación múltiple para cada una de las alícuotas con todos los
cebadores externos mezclados en cada pocillo de la placa de 96
pocillos (Fig. 1D), de modo que todas las copias de cualquier
secuencia diana se amplían en alguna medida. La segunda ronda de RCP
es una etapa de RCP semianidada para cada marcador individual (es
decir, no múltiple), utilizando como plantilla el producto de la RCP
transferido desde la placa múltiple en placas de réplicas recientes
(Fig. 1E, F). Estos productos de la RCP de la segunda ronda se
separan en geles de poliacrilamida (Fig. 1 G, H) y se puntúan. La
proporción de alícuotas que son positivas para cualquier marcador
específico refleja el número de copias relativo de cada marcador en
el genoma. En los experimentos expuestos en la presente memoria, el
número de reacciones positivas a la RCP se recontaron manualmente.
Se realizaron varias etapas por conveniencia empleando un sistema de
transferencia robótico para desplazar las muestras entre las placas
de microvaloración para la RCP y la RCP semianidada y en la segunda
placa de microvaloración para el gel. Esto se puede llevar a cabo
fácilmente en manual utilizando pipetas multicanal si la robótica no
está disponible.
En la Figura 1G y H se presentan ejemplos de
observación en gel de los productos de la RCP en MCC aplicados al
carcinoma real, para marcadores distales o proximales al punto de
inflexión no recíproco respectivamente. En lo anterior, 24 pocillos
presentan un producto de RCP mientras que en el último 46 pocillos
presentan un producto, lo que indica aproximadamente 2 veces el
doble de la diferencia del número de copias entre los marcadores.
(Los detalles del análisis estadístico pueden encontrarse en la
información complementaria). Cuando se lleva a cabo una exploración
inicial de una zona cromosómica, pueden utilizarse marcadores muy
espaciados y la distancia entre ellos pueden variarse según la
necesidad. Por ejemplo, si no existen datos citogenéticos
disponibles (tal como puede ser el caso con el ADN obtenido de
pequeñas muestras de biopsia), puede presentar ventajas explorar un
cromosoma completo antes de centrarse en un área para un estudio más
detallado. Aproximadamente 70 marcadores en aproximadamente un
espacio de 2 Mb proporcionarían esta información para el total del
cromosoma 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Una motivación tras el desarrollo del método MCC
fue situar con precisión los puntos de inflexión de la transposición
cromosómica no recíproca recurrente t(3;5)(p;q) en el
carcinoma renal como preludio a su clonación. Estas importantes
transposiciones cromosómicas han sido extensamente estudiadas por
citogenetistas y se han descrito tres zonas de punto de inflexión
principales en la rama corta del cromosoma 3 ^{6}. Se han creado
estirpes celulares de carcinoma renal no papilar y papilar a partir
de material de tumor primario y metastásico ^{20}. El análisis
por FISH de la estirpe de células
SK-RC-9 del carcinoma renal
metastásico, utilizando las fotografías de los cromosomas 3 y 5,
puso de manifiesto la presencia de unas transposición cromosómica
t(3;5) no recíproca (Figura 1 complementaria en línea). La
posición del punto de inflexión de la transposición cromosómica
t(3;5) fue investigada inicialmente por FISH utilizando
clones BAC de una zona de aproximadamente 3 Mb (73,2 a 75,8 Mb) del
cromosoma 3p (Fig. 2). Ya que no hay ningún cromosoma derivado
recíproco en el carcinoma renal t(3;5), no es posible
obtener la cartografía fina de ningún clon de BAC que comprenda el
punto de inflexión, ya que BACS se hibrida o no con el cromosoma
der(3;5). Por lo tanto el análisis por
BAC-FISH de las transposiciones recíprocas de este
modo se basa en localizar BACS que flanquean el punto de inflexión
(Fig. 2).
El clon BAC más próximo situado telomérico
respecto del punto de inflexión de t(3;5) fue
RP11-24E1 (en 73.256.358-73.419.679
p.b. del telómero 3p) porque este BAC se une a los cromosomas 3
normales pero no a la t(3;5) (Fig. 2A). EL clon
RP11-781E19 por BAC (en
74.210.885-74.236.089 p.b. del telómero 3p) está
situado precisamente proximal al punto de inflexión ya que se
hibrida en ambos cromosomas 3 normal y t(3;5) (Fig. 2B).
Estos datos situaban el punto de inflexión en la
SK-RC-9 en una zona de cómo máximo 1
Mb del cromosoma 3p13-p12.3 (Fig. 2C et
al.).
Los autores trataron de definir la posición del
punto de inflexión de la transposición en el cromosoma 3 utilizando
rondas múltiples de RCC a mayor resolución cada vez. Los datos de
FISH (Fig. 2) demostraron que las secuencias de la rama corta del
cromosoma 3 que ponen telomérico al punto de inflexión cabía esperar
que estuvieran presentes en dos copias por célula (debido al
carácter poliploide de las células
SK-RC-9), mientras que las
proximales al punto de inflexión, o en la rama larga, cabía esperar
que estuvieran presentes en cuatro copias (es decir comprendiendo
dos cromosomas 3 normales y dos cromosomas der 3;5). Los autores
llevaron a cabo una ronda inicial de MCC examinando el número de
copias de doce marcadores espaciados a intervalos de
0,2-0,5 Mb sobre aproximadamente 3,8 Mb en la zona
del cromosoma 3p13-p12.3. Los resultados (Fig. 3,
ronda 1) pusieron de manifiesto un doble desplazamiento en el
número de copias relativo entre los marcadores situados a 73.760.583
p.b. y 74.333.559 pb, definiendo el supuesto punto de ruptura de la
transposición en un intervalo de aproximadamente 570 kb. Se realizó
una ronda posterior de MCC utilizando 12 marcadores a intervalos de
aproximadamente 50 kb (Fig. 3, ronda 2), refinando más la zona de
punto de inflexión supuesta en aproximadamente 40 kb. Dos rondas de
MCC más (Fig. 3, ronda 3 y 4) situaron más el desplazamiento en
número de copias a aproximadamente 1-4 kb y a
continuación a 300 p.b. respectivamente. Además, la cuarta ronda de
MCC puso de manifiesto una deleción aparente en el lado centromérico
de la supuesta transposición (expuesto a continuación).
Los autores confirmaron que los datos de MCC
correspondían a alteraciones genómicas utilizando hibridaciones en
filtro. Se preparó una sonda en la zona del cromosoma 3p (Fig. 4,
sonda 3pA) correspondiente al desplazamiento del número de copias y
se hibridó para los filtros que llevan ADN genómico digerido con
restricción en las células SK-RC-9
y una estirpe de células SK-RC-12
renales diferentes cuyo punto de inflexión t(3;5) se sitúa
proximal al de SK-RC-9 (AD, GC y
THR, sin publicar). Se observaron bandas cambiadas de posición con
dos digestos de encima de restricción diferentes de
SK-RC-9 (Fig. 4A), demostrando que
el método MCC había identificado una anomalía genuina en el
cromosoma 3 en esta estirpe celular.
\vskip1.000000\baselineskip
La ronda 4 del análisis por MCC del ADN de
SK-RC-9 presentaba un desplazamiento
del número de copias que, dada su posición genómica, era candidata
para la unión de la transposición no recíproca entre los cromosomas
3 y 5. Ya que la secuencia normal de esta zona del cromosoma 3p es
conocida, los autores diseñaron un par de cebadores del cromosoma 3
para la clonación por RCP inversa del ADN correspondiente a la
anomalía. Este procedimiento para la clonación del ADN desconocido
asociado a un segmento de ADN conocido se basa en el diseño de
cebadores de RCP que pueden extenderse en direcciones opuestas
(ilustrado en la Fig. 5A) en una plantilla de ADN circular ^{21}.
Por consiguiente, el ADN de SK-RC-9
se digirió con XbaI, se hicieron círculos intramoleculares y se
llevó a cabo la RCP para producir una banda de \sim 1,5 kb. La
secuencia de este producto de RCP demostró que comprendía la unión
de la transposición t(3;5) cromosómica no recíproca (Fig. 5B)
en la que una zona del cromosoma 5q (la posición se muestra en la
Fig. 5D, coordenada 105.386.443 pb) se había fusionado con una zona
del cromosoma 3p (Fig. 5D, coordenada 74.111.893 pb). El resto de
adenina en la unión puede proceder de uno de los dos cromosomas. La
reestructuración de este segmento del cromosoma 5 en el ADN de las
células SK-RC-9 fue presentada
formalmente utilizando estudios de hibridación en filtro (Fig. 3B,
sonda 5q).
\vskip1.000000\baselineskip
Durante la definición del punto de inflexión de
la transposición mediante el análisis MCC, los autores observaron
una reducción del número de copias adicional en una zona que
comprende aproximadamente 700 p.b. prácticamente centromérico del
punto de inflexión (Fig. 3 ronda 4). Este descubrimiento se comprobó
con dos experimentos de MCC independientes (Figura 2
complementaria) comparando el ADN de
SK-RC-9 con el de otro carcinoma
renal (SK-RC-12) con una
t(3;5) situada en una zona diferente del grupo 3p.
Una posible explicación para esta anomalía en el
ADN de SK-RC podría ser una pequeña deleción en el
cromosoma t(3;5), prácticamente centromérica del punto de
inflexión de la transposición. Los autores tratan de corroborar
esto mediante la RCP genómica con los cebadores que flanquean esta
zona. Aunque podrían ampliar un fragmento del tamaño esperado (907
p.b.) procedente del cromosoma 3 normal, no existían pruebas de un
producto más pequeño que debería haber sido amplificado a través
del segmento de ADN eliminado (datos no representados). De este
modo, esta deleción corta debe ser acompañada por la inserción de
secuencias de otra posición. El análisis de hibridación en el
filtro en la Figura 4 confirma esta posibilidad. Cuando el ADN de
SK-RC-9 se digiere con BgIII, los
autores esperarían un fragmento cambiado de posición en el cromosoma
der(3;5) de aproximadamente 4,3 kb cuando se hibrida con la
sonda 5q en la transposición estaban asociados simplemente con una
pequeña deleción. En su lugar los autores observaron un fragmento
mayor de aproximadamente 5 kb (Fig. 4B). Además, los tamaños
observados de los fragmentos NcoI y SacI que utilizan la sonda 3pB
(Fig. 4C) son ambos significativamente mayores que el esperado para
una única deleción (11,5 kb o 9,5 kb observados y 4,5 kb o 4 kb
esperados respectivamente). Los datos de la hibridación de NcoI son
especialmente significativos porque la sonda 3pB no detecta la unión
de la transposición sino solamente la anomalía adicional. Estos
datos sugieren una inserción junto con la deleción y que la
inserción que acompaña la microdeleción 3p parece ser mayor de 7
kb.
\vskip1.000000\baselineskip
Una ilustración adicional de la sensibilidad de
MCC fue proporcionada por la caracterización de una deleción
críptica en la estirpe de las células
SK-RC-12 del carcinoma renal de
células transparentes que lleva una transposición t(3p;5q)
no recíproca (datos no mostrados). El análisis FISH con clones
RP11-528E14 de BAC (cromosoma 3 en
76,7-76,9 Mb) y RP11-424C9
(cromosoma 3 en 87,7-88,0 Mb) delineó la zona del
punto de inflexión de la t(3;5) para una zona grande de
aproximadamente 10 Mb. El análisis por MCC se realizó utilizando un
panel de marcadores que comprenden esta zona a intervalos de
aproximadamente 0,5 Mb (Fig. 6A, ronda 1). Se observó un
desplazamiento del número de copias entre los marcadores 22 y 23
(los geles analíticos para los productos de RCP de los marcadores
21, 22, 24 y 25 se muestran en la Fig. 3 complementaria). Las rondas
sucesivas de MCC con más marcadores poco espaciados (Fig. 6A,
rondas 2 y 3) resolvieron la región a aproximadamente 2 kb y una
ronda final de MCC localizó el desplazamiento del número de copias
en 400 p.b. (Fig. 6A, ronda 4). La presencia de una alteración
genómica se confirmó por hibridación en el filtro utilizando una
sonda de 237 p.b. del cromosoma 3 y comparando los fragmentos de
restricción en el ADN de SK-RC-12
con los de una estirpe celular linfoblastoide (LCL). Se observó un
fragmento cambiado de posición en cada caso con el ADN de
SK-RC-12 (Fig. 4
complementaria).
Se obtuvo la zona genómica correspondiente al
desplazamiento del número de copias de la ronda 4 utilizando la RCP
inversa. Para obtener esta secuencia de la zona de unión, se digirió
el ADN genómico con NcoI y se autoligó para formar las plantillas
del ADN circular, se amplió utilizando la secuencia del cromosoma 3
situada con la ronda 4 de MCC. El producto de la RCP se clonó y se
obtuvo la secuencia, poniendo de manifiesto que el cambio del
número de copias procedente de una sola deleción del cromosoma 3p de
\sim 289 kb (Fig. 6B, 81,64 y 81,94 Mb). Las secuencias de las
zonas que flanquean el punto de deleción del cromosoma 3 normal se
comparan con las del cromosoma 3 fusionado en
SK-RC-12 (Fig. 6B). Esto da a
conocer la identidad de una zona de 6 p.b. en ambos extremos del
segmento de la deleción (Fig. 6B) sugiriendo que esta microhomología
puede haber sido utilizada en la unión del extremo no homólogo para
reparar las roturas de doble cadena.
\vskip1.000000\baselineskip
Si se distribuyen al azar moléculas de ADN entre
N alícuotas para proporcionar un promedio de Z moléculas por
alícuota entonces, según la distribución de Poisson, el número de
alícuotas Np que cabe esperar contengan por lo menos una molécula de
ADN viene dado por:
(i)Np=N(1-e^{-z})
Por el contrario, si un panel de N alícuotas
subgenómicas de ADN viene determinado por la RCP para una secuencia
dada, y si Np de estas alícuotas puntúan positivo para la secuencia
(es decir contienen por lo menos una copia de la secuencia) entonces
el número medio de moléculas de esta secuencia por alícuotas puede
calcularse de la manera siguiente:
(ii)Z=-ln(1-Np/N)
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Por consiguiente, a partir del número de
alícuotas que puntúan positivo para cualquier secuencia dada, puede
determinarse la concentración de esta secuencia (expresada en copias
por alícuotas). Si se analizan dos o más secuencias de esta manera
en la misma serie (o series similares) de alícuotas de ADN genómico,
entonces pueden calcularse sus concentraciones relativas y por
consiguiente su abundancia relativa en el ADN genómico.
\vskip1.000000\baselineskip
Clones BAC utilizados para definir la posición
de la t(3;5) en células
SK-RC-9 se situaron en los
cromosomas 3 y 5 utilizando la base de datos Ensembl de genoma
humano, montaje NCBI 35 en http://www.ensembl.org/
\vskip1.000000\baselineskip
Coordenadas de BAC en 3p (donde el resto 1 está
situado en el telómero del cromosoma 3p):
RP11-24E1
73256358-73419679 bp
RP11-781E19
74210885-74236089 bp
RP11-413E6
75698634-75885406 bp
\vskip1.000000\baselineskip
Coordenadas de BAC en 5q (donde el resto 1 está
situado en el centrómero del cromosoma 5)
CTD-2193G5
102719818-102903604 bp
CTD-197111
108078031-108252168 bp
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores procedían del servidor Ensembl del
genoma humano, construcción 35 y las coordenadas dadas se refieren a
esta información de la secuencia. Como esto está bajo revisión en
curso, la posición exacta de cualquier tiempo futuro debería
determinarse utilizando una búsqueda BLAST de la base de datos del
genoma.
Los cebadores utilizaron el análisis de
SK-RC-9 se presentan en la Tabla
1.
\vskip1.000000\baselineskip
Coordenadas de BAC en 3p (donde el resto 1 está
situado en el telómero del cromosoma 3p):
RP11-328N12 cromosoma 3 at
72.5-72.7 Mb
RP11-24E1 cromosoma 3 at
73.1-73.3 Mb
RP11-413E6 cromosoma 3 at
75.5-75.7 Mb
RP11-528E14 cromosoma 3 at
76.7-76.9 Mb
RP11-424C9 cromosoma 3 at
87.7-88.0 Mb
\vskip1.000000\baselineskip
En el contexto de la presente invención se ha
demostrado que MCC puede hacer el recuento directamente de las
copias de diferentes secuencias mientras se explora una zona
cromosómica o genómica para identificar variaciones locales en el
número de copias. Las iteraciones de este procedimiento permiten
localizar rápidamente los límites exactos del segmento anómalo,
como los autores han demostrado por localización y clonación del
punto de inflexión de una transposición cromosómica no recíproca.
El punto de inflexión específico que los autores han clonado
representa el primer ejemplo de clonación de una transposición
cromosómica no recíproca por primera vez. El cáncer renal tiene un
pronóstico muy pobre^{22} y los tumores que aparecen en el túbulo
proximal (cáncer renal no papilar) con frecuencia presentan una
transposición t(3;5) cromosómica no recíproca. Los puntos de
inflexión en el grupo 3 del cromosoma para tres zonas diferentes de
la rama corta ^{6} y el uno que describen los autores en este
artículo (en las células SK-RC-9) se
localizan en el grupo más distante (en el cromosoma 3p13). El
análisis de la secuencia de ADN del punto de inflexión de uno de los
dos cromosomas 3p o 5q en SK-RC-9
demuestran que no existe ni pérdida ni ganancia de material
específicamente en la unión, lo que implica la rotura y reparación
precisas en el extremo. Además, las roturas no conllevan la escisión
en ninguno de los genes conocidos o supuestos (véase la Fig. 5). De
este modo, la transposición no proporcionaría un gen de fusión, y
sugiere además un mecanismo diferente para los principales
resultados oncogénicos de la transposición no recíproca. La
utilización de MCC para analizar y clonar los puntos de inflexión de
otras transposiciones no recíprocas del carcinoma renal no arrojan
más luz sobre esto, y la comparación de las secuencias del punto de
inflexión entre diferentes transposiciones debería ayudar a
clarificar si existe algún mecanismo de transposición específico
para la secuencia.
\vskip1.000000\baselineskip
En este estudio, se han utilizado la nueva
tecnología de MCC para determinar la posición de un punto de
inflexión de la transposición no recíproca y la existencia de dos
deleciones crípticas en el cromosoma 3. Esta eficacia de la técnica
al utilizar rondas iterativas de determinación del número de copias
con aumento de resolución ha sido aplicada para clonar y secuenciar
dos de los cambios asociados al cáncer. Existen pruebas crecientes
de que la deleción y amplificación acompaña a las transposiciones
cromosómicas, salvo si son funcionalmente significativas o no ha
sido difícil de determinar debido a la penuria de ensayos
funcionales. Como los cromosomas implicados en transposiciones
intercromosómicas son intrínsecamente inestables en el momento de la
ruptura de la doble cadena, la incidencia de cambios adicionales
puede no parecer demasiado sorprendente. Sin embargo, los
mecanismos de reparación del ADN tienen intrínsecamente gran
fidelidad, lo que añade creencia a la idea de que los cambios pueden
ser funcionalmente importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
El MCC adolece de varios inconvenientes sobre
otros procedimientos para localizar alteraciones en un número de
copias. El procedimiento ofrece efectivamente resolución ilimitada
ya que las secuencias pueden examinarse en amplios intervalos por
debajo de unos pocos centenares de pares de bases. Ya que MCC
utiliza la información de la secuencia del genoma, solamente
requiere una base de datos de genoma para su operación y una serie
de cebadores de RCP. Los bancos de cebadores de RCP, formateados
para su utilización en MCC, pueden ser creados para permitir la
rápida identificación de zonas cromosómicas o de genomas completos.
Además, el método debería ser aplicable a zonas de amplificaciones
genómicas, así como a deleciones.
A diferencia de las tecnologías basadas en la
matriz para la determinación del número de copias, MCC no requiere
la amplificación del genoma completo o de ninguna etapa de
hibridación. Esto evita algunos problemas que pueden surgir de la
amplificación sesgada, la supresión incompleta de secuencias
repetidas en la sonda o la hibridación cruzada, como puede ocurrir
cuando se utilizan matrices oligo cortas o por amplificación del ADN
de E. coli que contamina los BAC/PAC para la matriz CGH
^{9}. La cuantificación exacta del número de copias por MCC
depende de la amplificación con éxito de todas las copias de un
locus en el panel de alícuotas. La mayoría de los conjuntos de
cebadores de RCP opera bien (detectando la mayoría de las copias) o
no en absoluto (no detectando copias, o proporcionando productos de
RCP muy escasos en todos los casos). Estas últimas son obvias y
pueden descartarse del análisis, ya que fueron realizadas para los
marcadores 5 y 7 (Fig. 3, ronda 1). No obstante, un solo marcador
de aparentemente poco número de copias puede ser observado con
cuidado, ya que podría surgir solamente de un fallo para detectar
alguna de las copias de este locus. En la práctica, esto no es un
inconveniente, ya que la aparente pérdida de copias será confirmada
(o no) a medida que proceda el análisis a mayor resolución. El MCC
es esencialmente un método digital que simplifica la interpretación
de resultados mientras que los métodos de micromatriz son
cuantitativos a menudo requieren algoritmos complejos para la
interpretación ^{23}. Aunque el MCC es fácilmente aplicable a la
operación manual, se presta también bien a la automatización, y
debería ser adaptable a otras plataformas para el análisis de RCP de
alto rendimiento con ahorros potenciales de tiempo y costes.
El MCC requiere cantidades minúsculas de ADN
genómico, siendo aplicable desde pocas decenas a centenares de
células, y el ADN no tiene que ser de alto peso molecular. Los
autores sugieren por lo tanto que el MCC haya sido capaz hasta la
fecha de estudios poco prácticos, tales como el análisis detallado
del material de biopsia preneoplásico de los pacientes, el análisis
retrospectivo de muestras de tumor de archivo, o la exploración de
la variabilidad genómica a través de diferentes pequeñas zonas de un
tumor. El MCC debería también simplificar el análisis de anomalías
cromosómicas hereditarias que afectan al número de copias, si están
asociadas con la enfermedad o forman parte de un espectro normal de
variación humana. La utilización de MCC en el trabajo actual de los
autores emplea estirpes celulares en las que los desequilibrios son
constantes de célula a célula. La aplicación de MCC a las
diferencias constitucionales del número de copias (por ejemplo en
síndromes heredados), será similar ya que todo el ADN será
idéntico. Éste no será necesariamente el caso de las biopsias de
material basado en la enfermedad, donde la "igualdad" del
muestreo podría influir en la utilidad (como en otros procedimientos
basados en el número de copias). Las muestras de tumor pueden ser
un resultado específico ya que las resecciones comprenderán células
cancerosas, células de estroma (probablemente de cariotipo normal) y
células inflamatorias. No obstante, las pequeñas cantidades de
material requerido para MCC y la sensibilidad del método
posibilitarían detectar anomalías del número de copias incluso
frente a algún antecedente de ADN normal.
1. Albertson, D.G., Collins, C.,
McCormick, F. & Gray, J.W. Chromosome aberrations
in solid tumors. Nat Genet 34, 369-376
(2003).
2. Rabbitts, T.H. Chromosomal
translocations in human cancer. Nature 372,
143-149 (1994).
3. Huntly, B.J., Bench, A. &
Green, A.R. Double jeopardy from a single translocation:
deletions of the derivative chromosome 9 in chronic myeloid
leukemia. Blood 102, 1160-1168
(2003).
4. Kovacs, G., Szucs, S., De
Riese, W. & Baumgartel, H. Specific chromosome
aberration in human renal cell carcinoma. Int. J. Cancer 40,
171-178 (1987).
5. Kovacs, G. & Brusa, P.
Recurrent genomic rearrangements are not at the fragile sites on
chromosomes 3 and 5 in human renal cell carcinomas. Hum Genet
80, 99-101 (1988).
6. Kovacs, G. et al. The
Heidelberg classification of renal cell tumours. J. Pathol.
183, 131-133 (1997).
7. Pinkel, D. & Albertson,
D.G. Comparative genomic hybridization. Annu Rev Genomics Hum
Genet 6, 331-354 (2005).
8. Fiegler, H. et al. DNA
microarrays for comparative genomic hybridization based on
DOP-PCR amplification of BAC and PAC clones.
Genes Chromosomes Cancer 36, 361-374
(2003).
9. Menten, B. et al. arrayCGHbase:
an analysis platform for comparative genomic hybridization
microarrays. BMC Bioinformatics 6, 124 (2005).
10. Brennan, C. et al.
High-resolution global profiling of genomic
alterations with long oligonucleotide microarray. Cancer Res
64, 4744-4748 (2004).
11. Carvalho, B., Ouwerkerk, E.,
Meijer, G.A. & Ylstra, B. High resolution
microarray comparative genomic hybridisation analysis using spotted
oligonucleotides. J Clin Pathol 57, 644-646
(2004).
12. Lucito, R. et al.
Representational oligonucleotide microarray analysis: a
high-resolution method to detect genome copy number
variation. Genome Res 13, 2291-305
(2003).
13. Sebat, J. et al.
Large-scale copy number polymorphism in the human
genome. Science 305, 525-528
(2004).
14. Jobanputra, V. et al.
Application of ROMA (representational oligonucleotide microarray
analysis) to patients with cytogenetic rearrangements. Genet
Med 7, 111-118 (2005).
15. Zhou, W. et al. Counting
alleles reveals a connection between chromosome 18q loss and
vascular invasion. Nat Biotechnol 19, 78-81
(2001).
16. Zhao, X. et al. Homozygous
deletions and chromosome amplifications in human lung carcinomas
revealed by single nucleotide polymorphism array analysis. Cancer
Res 65, 5561-5570 (2005).
17. Heim, S. & Mitelman, F.
Cytogenetics of solid tumours. Recent Advances in
Histopathology, 37-66 (1991).
18. Hoglund, M. et al. Dissecting
karyotypic patterns in renal cell carcinoma: an analysis of the
accumulated cytogenetic data. Cancer Genet Cytogenet 153,
1-9 (2004).
19. Dear, P.H. & Cook, P.R.
Happy mapping: a proposal for linkage mapping the human genome.
Nucleic Acids Res 17, 6795-6807
(1989).
20. Ebert, T., Bander, N.H.,
Finstad, C.L., Ramsawak, R.D. & Old, L.J.
Establishment and characterisation of human renal cancer and normal
kidney cell lines. Cancer Res. 50, 5531-5536
(1990).
21. Suzuki, T. et al. New genes
involved in cancer identified by retroviral tagging. Nat
Genet 32, 166-174 (2002).
22. Cohen, H.T. & McGovern,
F.J. Renal-cell carcinoma. N Engl J Med 353,
2477-2490 (2005).
23. Daruwala, R.S. et al. A
versatile statistical analysis algorithm to detect genome copy
number variation. Proc Natl Acad Sci USA 101,
16292-16297 (2004).
24. LeFranc, M.-P., Forster, A.,
Baer, R., Stinson, M.A. & Rabbitts, T.H.
Diversity and rearrangement of the human T cell rearranging \gamma
genes: Nine germ-line variable genes belonging to
two subgroups. Cell 45, 237-246
(1986).
25. Feinberg, A.P. &
Vogelstein, B.A. A technique for radiolabelling DNA
restriction endonuclease fragments to high specific activity.
Anal. Biochem. 132, 6-13 (1983).
Varias modificaciones y variaciones de los
procedimientos y del sistema descritos de la invención serán
evidentes para los expertos en la materia. Aunque la invención ha
sido descrita en relación con formas de realización preferidas
específicas, debe sobreentenderse que la invención tal como se
reivindica no debería estar limitada indudablemente a dichas formas
de realización específicas. De hecho, varias modificaciones de los
modos descritos de llevar a cabo la invención serán obvios para los
expertos en biología molecular o los campos relacionados se
pretenden que estén comprendidos dentro del alcance de las
reivindicaciones siguientes.
Claims (19)
1. Procedimiento de medición de la frecuencia
del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en
una muestra, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- proporcionar una diversidad de alícuota(s) de la muestra, en la que cada alícuota comprende ácido nucleico en una cantidad que es inferior a un genoma por alícuota;
- (b)
- ampliar una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s) en una primera reacción de amplificación;
- (c)
- subdividir uno o más de los productos empleados en alícuotas de la réplica y llevar a cabo una segunda reacción de amplificación para una o más secuencias de ácido nucleico en cada alícuota(s), en la que cada una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de prueba y por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico es un marcador de referencia;
- (d)
- calcular el número de copias por comparación en cada una de las alícuotas de la réplica del número de productos amplificados obtenido en el marcador de prueba con el número de productos amplificados obtenidos para el marcador de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que cada alícuota en la primera reacción de amplificación
comprende aproximadamente 0,1 a 0,9 genomas de ADN por reacción de
amplificación.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que el número de copias del marcador de prueba se calcula
contando manualmente el número de productos de amplificación para el
marcador de prueba y el marcador de referencia.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el número de copias del
marcador de prueba se calcula utilizando la ecuación:
Np=N(1-e^{-z})
en la que N es el número de
alícuotas; Z es el número promedio de productos amplificados por
alícuota; y Np es el número de alícuotas que cabe esperar que
contenga por lo menos una molécula del ácido nucleico según la
distribución de
Poisson.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de copias del marcador
de prueba se calcula utilizando la ecuación:
Z=-ln(1-Np/N)
en la que N es el número de
alícuotas del ácido nucleico sometido a prueba para una secuencia
dada; Np es el número de alícuotas que puntúan positivo para el
ácido nucleico (es decir, por lo menos una copia de la secuencia del
ácido nucleico está
amplificada).
\vskip1.000000\baselineskip
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que las reacciones de
amplificación se realizan utilizando PCR.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la primera reacción de
amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores directos e
inversos.
8. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la segunda reacción de
amplificación se lleva a cabo utilizando pares cebadores
directos-internos e inversos.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de ácido
nucleico en la muestra antes de la división en alícuotas se
determina por amplificación de uno o más ácidos nucleicos que se
cree que están presentes en sólo una copia por genoma haploide en
dos o más divisiones diferentes, en la que la proporción de muestras
en cada dilución hallada positiva para uno o más ácidos nucleicos se
utiliza para refinar la estimación de la concentración de ADN y
determinar así la dilución requerida para el análisis posterior.
\newpage
10. Procedimiento de identificación de una o más
alteraciones en una muestra de ácido nucleico, que comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una primera muestra y una segunda muestra según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9;
- (b)
- opcionalmente repetir iterativamente el procedimiento a resoluciones progresivamente superiores para cada una de las muestras; y
- (c)
- identificar una o más diferencias en la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en la primera y la segunda muestras.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Procedimiento según la reivindicación 10, en
el que las muestras son o proceden de sujetos enfermos y sanos.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la enfermedad es el cáncer.
13. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el procedimiento se realiza
inicialmente a una resolución de 2 Mb disminuyendo progresivamente
hasta 100 pares de bases o menos.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la alteración es una
transposición, una amplificación, una duplicación o una
deleción.
15. Procedimiento para diagnosticar una
enfermedad en un paciente, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- medir la frecuencia del número de copias de una o más secuencias de ácido nucleico en una muestra según el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9; y
- (b)
- comparar el número de copias de dichas una o más secuencias de ácido nucleico con el número de copias normales de dichas una o más secuencias de ácido nucleico;
en el que una diferencia entre los números de
copias de dichas una o más secuencias de ácido nucleico en la
muestra y el número de copias normales de dichas una o más
secuencias de ácido nucleico es indicativo de que el paciente está
padeciendo la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
16. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que si el número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico en la muestra de ácido nucleico del paciente es superior al
número de copias normales es indicativo de una transposición, una
amplificación o una duplicación.
17. Procedimiento según la reivindicación 15, en
el que si el número de copias de una o más secuencias de ácido
nucleico en la muestra de ácido nucleico del paciente es inferior al
número de copias normales es indicativo de una deleción.
18. Procedimiento para clonar una o más
alteraciones en una muestra de ácido nucleico que comprende las
etapas siguientes:
- (a)
- identificar una o más alteraciones en una muestra de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14; y
- (b)
- clonar dichas una o más alteraciones.
\vskip1.000000\baselineskip
19. Procedimiento según la reivindicación 18, en
el que la alteración se clona utilizando clonación por RCP
inversa.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US79175406P | 2006-04-12 | 2006-04-12 | |
| US791754P | 2006-04-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2337207T3 true ES2337207T3 (es) | 2010-04-21 |
Family
ID=38510432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07732383T Active ES2337207T3 (es) | 2006-04-12 | 2007-04-12 | Procedimiento para determinar el numero de copias. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090191556A1 (es) |
| EP (1) | EP2002016B1 (es) |
| JP (1) | JP5491171B2 (es) |
| AT (1) | ATE449193T1 (es) |
| DE (1) | DE602007003331D1 (es) |
| DK (1) | DK2002016T3 (es) |
| ES (1) | ES2337207T3 (es) |
| WO (1) | WO2007129000A2 (es) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7702468B2 (en) | 2006-05-03 | 2010-04-20 | Population Diagnostics, Inc. | Evaluating genetic disorders |
| US10522240B2 (en) | 2006-05-03 | 2019-12-31 | Population Bio, Inc. | Evaluating genetic disorders |
| WO2010088288A2 (en) * | 2009-01-28 | 2010-08-05 | Fluidigm Corporation | Determination of copy number differences by amplification |
| GB201007522D0 (en) | 2010-05-05 | 2010-06-23 | Mrc Technology | Method |
| US20110275068A1 (en) * | 2010-05-10 | 2011-11-10 | Medical Research Council | Method |
| EP2601609B1 (en) * | 2010-08-02 | 2017-05-17 | Population Bio, Inc. | Compositions and methods for discovery of causative mutations in genetic disorders |
| US10221454B2 (en) | 2011-10-10 | 2019-03-05 | The Hospital For Sick Children | Methods and compositions for screening and treating developmental disorders |
| US11180807B2 (en) | 2011-11-04 | 2021-11-23 | Population Bio, Inc. | Methods for detecting a genetic variation in attractin-like 1 (ATRNL1) gene in subject with Parkinson's disease |
| RU2593708C2 (ru) * | 2012-01-20 | 2016-08-10 | БГИ Диагносис Ко., Лтд. | Способ и система выявления вариации числа копий в геноме |
| DK2812452T3 (da) | 2012-02-09 | 2020-06-29 | Population Bio Inc | Fremgangsmåder og sammensætninger til screening og behandling af udviklingsforstyrrelser |
| EP2895621B1 (en) | 2012-09-14 | 2020-10-21 | Population Bio, Inc. | Methods and compositions for diagnosing, prognosing, and treating neurological conditions |
| US10233495B2 (en) | 2012-09-27 | 2019-03-19 | The Hospital For Sick Children | Methods and compositions for screening and treating developmental disorders |
| GB2558326B (en) | 2014-09-05 | 2021-01-20 | Population Bio Inc | Methods and compositions for inhibiting and treating neurological conditions |
| JP6284137B2 (ja) * | 2015-11-18 | 2018-02-28 | 国立研究開発法人海洋研究開発機構 | 標的核酸の定量方法及びそのためのキット |
| US20190189241A1 (en) | 2016-07-20 | 2019-06-20 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Selecting Neoepitopes as Disease-Specific Targets for Therapy with Enhanced Efficacy |
| US10240205B2 (en) | 2017-02-03 | 2019-03-26 | Population Bio, Inc. | Methods for assessing risk of developing a viral disease using a genetic test |
| HRP20221504T1 (hr) | 2018-08-08 | 2023-03-31 | Pml Screening, Llc | Postupci procjene rizika od razvoja progresivne multifokalne leukoencefalopatije uzrokovane john cunningham virusom pomoću genetskog testiranja |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888740A (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-30 | Genaco Biomedical Products, Inc. | Detection of aneuploidy and gene deletion by PCR-based gene- dose co-amplification of chromosome specific sequences with synthetic sequences with synthetic internal controls |
| NL1021160C2 (nl) * | 2002-07-26 | 2004-01-27 | Multigen Internat B V | Werkwijze voor het bepalen van het kopieaantal van een nucleotidevolgorde. |
| JP4773338B2 (ja) * | 2003-03-07 | 2011-09-14 | ルビコン ゲノミクス， インコーポレイテッド | Ｄｎａ重合プロセスにより生成される全ゲノムおよび全トランスクリプトームライブラリーの増幅および分析 |
| DE102004036285A1 (de) * | 2004-07-27 | 2006-02-16 | Advalytix Ag | Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe |
| GB0426188D0 (en) * | 2004-11-30 | 2004-12-29 | Leuven K U Res & Dev | DNA repeats |
| DE102005045560B4 (de) * | 2005-09-23 | 2009-02-12 | Advalytix Ag | Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Zelle |
| DE102005059227A1 (de) * | 2005-12-12 | 2007-06-14 | Advalytix Ag | Verfahren zur Bestimmung des Genotyps aus einer biologischen Probe enthaltend Nukleinsäuren unterschiedlicher Individuen |
| ES2739483T3 (es) * | 2006-02-02 | 2020-01-31 | Univ Leland Stanford Junior | Detección genética fetal no invasiva mediante análisis digital |
-
2007
- 2007-04-12 ES ES07732383T patent/ES2337207T3/es active Active
- 2007-04-12 WO PCT/GB2007/001340 patent/WO2007129000A2/en active Application Filing
- 2007-04-12 US US12/296,749 patent/US20090191556A1/en not_active Abandoned
- 2007-04-12 JP JP2009504815A patent/JP5491171B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-04-12 DE DE602007003331T patent/DE602007003331D1/de active Active
- 2007-04-12 DK DK07732383.0T patent/DK2002016T3/da active
- 2007-04-12 AT AT07732383T patent/ATE449193T1/de not_active IP Right Cessation
- 2007-04-12 EP EP07732383A patent/EP2002016B1/en not_active Not-in-force
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007129000A2 (en) | 2007-11-15 |
| EP2002016B1 (en) | 2009-11-18 |
| JP2009533040A (ja) | 2009-09-17 |
| EP2002016A2 (en) | 2008-12-17 |
| US20090191556A1 (en) | 2009-07-30 |
| ATE449193T1 (de) | 2009-12-15 |
| DK2002016T3 (da) | 2010-03-29 |
| WO2007129000A3 (en) | 2008-03-13 |
| DE602007003331D1 (de) | 2009-12-31 |
| JP5491171B2 (ja) | 2014-05-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2337207T3 (es) | Procedimiento para determinar el numero de copias. | |
| Durmaz et al. | Evolution of genetic techniques: past, present, and beyond | |
| ES2688458T3 (es) | Recuento varietal de ácidos nucleicos para obtener información del número de copias genómicas | |
| ES2886923T3 (es) | Métodos y composición para generar sondas de ADN de secuencia única, marcaje de sondas de ADN y el uso de estas sondas | |
| US7303880B2 (en) | Microdissection-based methods for determining genomic features of single chromosomes | |
| CN108138231A (zh) | 分型和组装不连续基因组元件 | |
| US11857940B2 (en) | High-level multiplex amplification | |
| CN107849606A (zh) | 提高下一代测序灵敏度的方法 | |
| CN108463559A (zh) | 肿瘤的深度测序概况分析 | |
| Marotta et al. | A common copy-number breakpoint of ERBB2 amplification in breast cancer colocalizes with a complex block of segmental duplications | |
| CN110628891A (zh) | 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法 | |
| KR20190020133A (ko) | 염색체에 대한 인-시츄 혼성화를 위한 dna 탐침 | |
| CA2324866A1 (en) | Biallelic markers for use in constructing a high density disequilibrium map of the human genome | |
| KR20110106244A (ko) | 간세포암종의 예후 진단용 단일 염기 다형성 | |
| EP1829979B1 (en) | Method of identifying gene with variable expression | |
| CN107614704A (zh) | 采样测序 | |
| AU2010253978B2 (en) | Methods of scoring gene copy number in a biological sample using in situ hybridization | |
| JP5288387B1 (ja) | テロメア配列増幅用プライマー | |
| US20090181397A1 (en) | Predictive and diagnostic methods for cancer | |
| CN115715321A (zh) | 用于鉴定基因组dna中与蛋白质结合的区域的方法、组合物和试剂盒 | |
| US20040234961A1 (en) | Telomere length determination and applications | |
| US9139881B2 (en) | Method for assessing breast cancer susceptibility | |
| JP2006304611A (ja) | Ｐｃｒ法、プライマー及びｐｎａ。 | |
| Kowalska et al. | A new platform linking chromosomal and sequence information | |
| RU2818323C2 (ru) | Способ получения полноразмерной последовательности митохондриальной ДНК человека с использованием набора олигонуклеотидов методом мультиплексной амплификации для работы с образцами деградированной ДНК |