JP2006304611A - Ｐｃｒ法、プライマー及びｐｎａ。 - Google Patents

Ｐｃｒ法、プライマー及びｐｎａ。 Download PDF

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Abstract

【課題】検出目的ではない遺伝子が高濃度で存在する試料のなかでも、ＰＮＡプローブが対象遺伝子に対して十分に反応し、対象遺伝子ＤＮＡの変異が正確に検出される。
【解決手段】正常なｋ−ｒａｓの対象遺伝子にＰＮＡが結合し、このｋ−ｒａｓの塩基配列を一部に含むプライマーセットと、含まないプライマーセットとで増幅を行う；ｋ−ｒａｓ遺伝子が変異していれば、ＰＮＡは結合できず、この変異した遺伝子がＰＣＲによって増幅される；ｋ−ｒａｓ遺伝子が変異せず正常であれば、ＰＮＡは結合できるので、ｋ−ｒａｓ遺伝子と一部重複するプライマーは逆に結合することができず、対象遺伝子はＰＣＲによっても増幅されない；ｋ−ｒａｓの塩基配列を含まないプライマーセットによる増幅によって、検出目的ではない遺伝子が高濃度で存在する試料のなかでもＰＮＡプローブが十分に反応し誤判定が防止される。
【選択図】図３

Description

本発明は、ＰＣＲ法等に関し、特に対象遺伝子ＤＮＡの変異を検出する方法に関する。
従来、遺伝子（ＤＮＡ）を識別、例えば視覚的方法によって識別するためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が行われてきている。このようなＰＣＲ法では、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ複製酵素）として例えばタックポリメラーゼ（Taq polymerase）が使われて、２つのプライマーに挟まれたＤＮＡ部分が短時間で大量に複製されて増やされ、これが分別例えば電気泳動等されて蛍光色素で染められて光のバンドとして肉眼でも見えるようにされる。
特許第３０１６３９９号公報
本件発明は、上述のＰＣＲ法をさらに発展させて、糞便のような高濃度の試料をはじめ種々の濃度の試料のなかでも良い条件下でも、ＰＮＡプローブが十分に反応して、対象遺伝子ＤＮＡの変異を確実に検出できるようにすることにある。このような高濃度の試料は、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高いものである。
上記目的を達成するため、本発明のＰＣＲ法は、遺伝子ＤＮＡと、 この遺伝子ＤＮＡ内の変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列と相補配列を有して、当該対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列に結合するＰＮＡであって、 この変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡは、「５′−ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ−３′」（以下「第１対象遺伝子ＤＮＡ」という）及びこの「第１対象遺伝子ＤＮＡ」と相補的な「３′−ＣＴＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡ−５′」（以下「第２対象遺伝子ＤＮＡ」という）の何れか一方を少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分であり、 上記第１または第２対象遺伝子ＤＮＡの一部を含み、上記対象遺伝子ＤＮＡから離れた塩基配列と相補配列を有して、当該塩基配列に結合するプライマーとを使用するＰＣＲ法であって、当該プライマーは、 ５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′及び ５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′のセット、または、これらと相補的配列をなす、 ５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′及び ５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′のセット（…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）とした。
このような手法によれば、後述する実験の結果、糞便のような高濃度で、上記正常細胞や細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い試料のなかでもＰＮＡプローブが十分に反応して、対象遺伝子ＤＮＡの変異をより正確に検出することができる。
高濃度の試料やその他の悪条件下のなかでは、ＰＮＡが遺伝子ＤＮＡに十分に結合（クランピング／ｃｌａｍｐｉｎｇ）しない場合や、プライマー（後述のｋ−ｒａｓプライマー）が遺伝子ＤＮＡに十分に結合せず、誤判定（誤診）や偽陽性となってしまう。糞便につき正確に遺伝子変異を正確に検査できれば、大腸癌、潰瘍性大腸炎などの大腸関係または消化器関係の異常の早期発見または発病／発症の前段階での発見ともなる。
本発明ではこのような誤判定や偽陽性を防ぐことにある。本発明のＰＮＡはＰＮＡプローブとすることもできるし、本発明のＰＣＲ法はＰＣＲクランピング法とすることもできる。なお、対象遺伝子ＤＮＡの変異は、遺伝子ＤＮＡの相補的な二本鎖の同じ箇所の両側で起きるため、本件ＰＣＲ法は、対象遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡ、プライマーのセットは、相補的にそっくり置き換えることが可能であり、各請求項にはこの相補的な両方が示されている。
以下に示す実施例では、ｋ−ｒａｓ遺伝子の変異についてのものである。ｋ−ｒａｓ遺伝子はヴォゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔａｉｎ）らの提唱するアデノーマーカルチノーマシーケンス（ａｄｅｎｏｍａ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の多段階発癌モデルが提示されて以降、発癌遺伝子として癌化に重要な役割を果たしていることが明らかになっている。
またｋ−ｒａｓ遺伝子は大腸癌のみならず、脾臓癌、肺癌でも高頻度に検出されるため、その臨床的意義は高い。ｋ−ｒａｓ遺伝子の特徴のひとつとして比較的初期の段階で変異が出現するため、スクリーニング目的のマーカーとしてもその有用性は高いものといえる。
本件発明のＰＣＲ法は、特殊かつ高価な機器が必要なく、市販されている一般のサーマルサイクラーと簡易なサブマリン電気泳動装置を保持する施設であれば実施可能であり、非常に汎用性の高い方法といえる。
本件発明のＰＣＲ法は、便中の癌関連遺伝子を検出する主目的で開発された測定方法であり、試料中のヒト由来細胞以外に多くの細菌や食物残渣など、ＰＣＲの阻害物質が含まれることを想定した測定系として構築されている。糞便のみならず、体液、分泌物や喀痰など臨床検査で用いられる広範な試料への適応可能であり、様々な試料に対応できる。
本件発明のＰＣＲ法は、細胞が多数含まれる試料などにおいても、ＰＮＡを使用する既報の方法のみならず、ＰＮＡを使用しない方法と比較しても感度・特異性は優れており、特異性・感度に優れているといえる。
（１）本発明の原理のＰＣＲ法
図１及び図２は本発明の原理のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を示す。まず、変異を検出しようとする対象遺伝子ＤＮＡの二本鎖を９０度ほどに加熱して熱変性させて分離させる。
次いで、この分離された対象遺伝子ＤＮＡの正常な一部の配列に対してＰＮＡを結合（クランピング）させる。ここで、対象遺伝子ＤＮＡが変異しておらず正常であれば、ＰＮＡは結合し、対象遺伝子ＤＮＡが変異しており異常であれば、ＰＮＡは結合できない。
次いで、反応液中に含まれるプライマーと、鎖の材料になるヌクレオド（Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｔを含む化合物）とを加えて６０度ぐらいに加熱し、この対象遺伝子ＤＮＡを挟む遺伝子ＤＮＡの二本鎖の「３′」側及び「５′」側との塩基配列部分にプライマーを結合させ、両プライマーで挟まれた二本鎖の塩基配列部分を複製・増幅（増殖）（アニーリング／ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させて、対象遺伝子ＤＮＡの塩基配列部分のみのサンプル数を増やす。この複製・増幅（増殖）（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）された対象遺伝子ＤＮＡがアガロース電気泳動されて蛍光色素で染められて光のバンドとして肉眼でも見えるようにされる。
ここで、図３及び図４に示すように、ＰＮＡ（ペプチド核酸／peptide nucleic acid）が結合／クランピング（ｃｌａｍｐｉｎｇ）する対象遺伝子ＤＮＡと一部重複するようにプライマーの塩基配列を決定すれば以下のような変化が生じる。
（ａ）対象遺伝子ＤＮＡが変異（ミュータントタイプ／ミューテーションタイプ／変異型／mutation type）していれば、このＤＮＡはＰＮＡと相補的にならないので、正常時のみ結合するＰＮＡは結合でき、この変異した対象遺伝子ＤＮＡがＰＣＲによって複製・増幅されることになる。
（ｂ）対象遺伝子ＤＮＡが変異せず正常(ワイルドタイプ／野生型／wild type)であれば、このＤＮＡはＰＮＡと相補的になるので、正常時のみ結合するＰＮＡは結合でき、対象遺伝子ＤＮＡと一部重複するプライマーは逆に対象遺伝子ＤＮＡに結合することができず、対象遺伝子ＤＮＡはＰＣＲによっても複製・増幅されないことになる。
対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のためには、上記プライマー（ｐｒｉｍｅｒ）は２つ１組のセットでよいのであるが、検出をより正確にするために、プライマーは３つ２組のセットとする。２つ目のプライマーセットは、対象遺伝子ＤＮＡの塩基配列を含まず、このようなプライマーセットによる複製・増幅によって、糞便のような高濃度で正常細胞や細菌などのＤＮＡが多く含まれる試料のなかでもＰＮＡが十分に反応し誤判定／偽陽性が防止される。
また、このＰＣＲの実行の前に、これらのプライマーが結合する遺伝子ＤＮＡのさらに外側の「３′」側及び「５′」側との塩基配列部分に別のプライマーを結合させ、両別プライマーで挟まれた塩基配列部分を事前に複製・増幅させて、対象遺伝子ＤＮＡ付近の塩基配列部分のサンプル数を事前に増やしておくこともできる。
遺伝子ＤＮＡにおいて、「アッパー」（フォーワード／センス）側とは、図１及び図２の遺伝子ＤＮＡの二本の鎖の上側をいい、「ロワー」（リバース／アンチセンス）側とは、図１及び図２の遺伝子ＤＮＡの二本の鎖の下側をいう。この上側の鎖は、左から右に向かって「５′−…−３′」の配列となっており、下側の鎖は、左から右に向かって「３′−…−５′」の配列となっている。
通常、プライマーは糖３′にリン酸を経由して糖５′が付くというかたちで、糖の５′から糖３′の方向に伸びていく。しかし、糖５′から少し離れた箇所で糖５′から糖３′の方向に伸び、さらにここから少し離れた箇所でまた糖５′から糖３′の方向に伸びていくというかたち、つまり後ずさりするようにして、糖の３′から糖５′の方向に伸びていくことも可能である。このような後ずさりによって後述する相補的なプライマーでも対象遺伝子ＤＮＡを複製・増幅することは可能である。
したがって、本件ＰＣＲ法は、対象遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡ、プライマーのセットは、相補的にそっくり置き換えることが可能であり、これらの対象遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡ、プライマーはこの相補的な両方が示されている。また、ＰＮＡは対象遺伝子ＤＮＡが正常な時に結合する塩基配列を有するが、対象遺伝子ＤＮＡが異常な時に結合する塩基配列を有していてもよい。
「相補（的）」というのは、遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡ、プライマーなどの各塩基の「Ａ」（アデニン）と「Ｔ」（チミン）、「Ｃ」（シトシン）と「Ｇ」（グアニン）とを入れ換えた状態を指す。「逆」というのは、遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡ、プライマーなどの塩基配列の向きを逆にして、「−３′」側と、「５′−」側と入れ換える、または塩基配列部分の両端の「５′−」と「−３′」と入れ換えて「３′−」と「−５′」との形にすることをいう。「逆相補（的）」は、これらの両方をともに行うことをいう。
（２）対象遺伝子ＤＮＡ
図３は本発明のＰＣＲ法のＰＮＡとプライマーとを示し、図４は変異を検出しようとする対象遺伝子ＤＮＡとその前後の遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。この塩基配列は米国ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）のAccession No. AC087239より引用したものである。この対象遺伝子ＤＮＡは人の遺伝子の一部の配列であって、ヒト遺伝子の１５８２９７番目から１５８３０９番目までの１３（ｍｅｒ）の塩基からなる次に示すＤＮＡ配列である。
（Ａ−１）（５′−）ＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴ（−３′）
この対象遺伝子ＤＮＡは便宜上「ｋ−ｒａｓ」と呼び、図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所には「ＰＮＡ−ｋｒａｓ」と示してある。
この対象となる遺伝子ＤＮＡは、この１３（ｍｅｒ）の塩基配列からなる（Ａ−１）の遺伝子ＤＮＡを少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分でもよく、これを「第１対象遺伝子ＤＮＡ」という。言い換えると、（Ａ−１）の遺伝子ＤＮＡに対して、（Ａ−１）の塩基配列の「−５′」側に最高１１（ｍｅｒ）までの塩基が含まれてもよいし、逆に、（Ａ−１）の遺伝子ＤＮＡに対して、（Ａ−１）の塩基配列の「−３′」側に最高１１（ｍｅｒ）までの塩基が含まれてもよい。
具体的には以下の通りである。
（Ａ−２）ＴＧＴＧＧ ＴＡＧＴＴＧＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ
（Ａ−１） ＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴ
（Ａ−３） ＧＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ ＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
これら（Ａ−１）を挟んで（Ａ−２）から（Ａ−３）までの間の塩基配列のいずれでもよいことになる。
実験の結果では、以下の１５（ｍｅｒ）の塩基配列が最も良い結果を得られた。
（Ａ−４）ＧＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ
さらに、以下の１４（ｍｅｒ）の塩基配列でも、良い結果を得られた。
（Ａ−５）ＧＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴ
（Ａ−６） ＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴＡ
またさらに、以下の１３（ｍｅｒ）の塩基配列でも、だいたい良い結果を得られた。
（Ａ−１） ＧＡＧＣ ＴＧＧＴＧＧＣＧＴ
上記塩基配列部分のうち、変異を起こすのは、コドン１２（遺伝暗号１２）の「ＧＧＴ」とコドン１３（遺伝暗号１３）の「ＧＧＣ」の２つである。この２つのうち何れか一方または両方が変異すれば、ＰＮＡは結合しない。したがって、対象遺伝子ＤＮＡを「ＧＧＴＧＧＣ」とすることも可能であるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性が高まるので、検査時間／実験時間と変異検出の誤差／不正確さから上記の塩基配列の長さが望ましい。対象遺伝子ＤＮＡの塩基数（ｍｅｒ）は上記（Ａ−２）〜（Ａ−３）の範囲で通常２５乃至１３、望ましくは２２至１４、より望ましくは１９乃至１５となる。
これら（Ａ−１）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）などの各対象遺伝子ＤＮＡの部分配列は、正確な変異検出に必要な最低限の配列長であり、塩基数をこれより少なくすると、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性は高くなるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は高まり、変異の検出の誤差／不正確さが大きくなる可能性は高くなる。
また、これら（Ａ−１）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）などの各対象遺伝子ＤＮＡの部分配列の塩基の数を増やすと、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が長くなる可能性は高くなるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は低くなり、変異の検出の精度／正確さが大きくなる可能性は高くなる。
なお、対象遺伝子ＤＮＡは、上記（Ａ−１）（Ａ−２）（Ａ−３）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）に代えて、これらの遺伝子ＤＮＡと相補的な他方の鎖の同じ箇所の以下の（ａ−１）（ａ−２）（ａ−３）（ａ−４）（ａ−５）（ａ−６）の塩基配列部分にそっくり置き換えることも可能である。
（ａ−１）（３′−）ＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡ（−５′）
（ａ−２）ＡＣＡＣＣ ＡＴＣＡＡＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴ
（ａ−３） ＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴ ＣＣＧＴＴＣＴＣＡＣ
（ａ−４）ＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴ
（ａ−５）ＣＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡ
（ａ−６） ＣＴＣＧ ＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴ
これらの対象遺伝子ＤＮＡは、この１３（ｍｅｒ）の塩基配列からなる（ａ−１）の遺伝子ＤＮＡを少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分でよく、これを「第２対象遺伝子ＤＮＡ」という。
（３）ＰＮＡ（ペプチド核酸）（ＰＮＡプローブ）
上記（Ａ−１）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）、（Ａ−２）〜（Ａ−３）などの対象遺伝子ＤＮＡの正常な一部の配列と逆相補配列を有して、当該対象遺伝子ＤＮＡの正常な一部の配列に結合するＰＮＡは以下の構造を有する。
（Ｂ−１）ＮＨ2− ＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣ −ＣＯＮＨ2
（Ｂ−４）ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2
（Ｂ−５）ＮＨ2− ＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2
（Ｂ−６）ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣ −ＣＯＮＨ2
ＰＮＡ（ペプチド核酸）とは、ＤＮＡ／ＲＮＡ類似の構造をもつが、リン酸結合ではなく、ペプチド結合で骨格を形成しており、ＤＮＡ／ＲＮＡ鎖の相補的配列を有する塩基配列部分に特異的に強く結合（クランピング）し、低いイオン強度に置いても結合でき、塩基配列の選択性が高い、ヌクレアーゼやプロテアーゼなどに耐性を有するなどの特徴を有している。
ＰＮＡの化学式は、次述「化１」に示す通りであり、４種の各塩基が結合しており、ＰＮＡモノマーのオリゴマー又はポリマーからなり、ＰＮＡモノマーは次述「化１」の中の「ｎ」が振られたかっこ部分が相当していて、塩基とＮ−（２−アミノアチル）−グリシンの二つの部分からなっている。このＰＮＡモノマーが１つのユニットとして繰り返されて、ＰＮＡとなる。ＰＮＡの端の「ＮＨ2−」は結合する遺伝子ＤＮＡの「３′−」側に、もう一つの端の「−ＣＯＮＨ2」は結合する遺伝子ＤＮＡの「−５′」側に結合することになる。
Figure 2006304611
次述する「化２」はＰＮＡの別の例を示す。このＰＮＡのＰＮＡモノマーは塩基とＮ−（２−アミノアチル）−グリシンの二つの部分からなっている。このＰＮＡモノマーは上記塩基に応じて以下の４種類があり、このＰＮＡモノマーが１つのユニットとして繰り返されて、ＰＮＡとなる。
Figure 2006304611
これら（Ｂ−１）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）のＰＮＡプローブは、それぞれ上記（Ａ−１）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）の対象遺伝子ＤＮＡの塩基配列部分に対して逆相補的すなわち逆向き相補的であって、当該対象遺伝子ＤＮＡに結合する。この場合、上記（Ｂ−１）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）に示すＰＮＡプローブの塩基配列の向きと、（Ａ−１）（Ａ−４）（Ａ−５）（Ａ−６）に示す対象遺伝子ＤＮＡの塩基配列の向きとは、互いに逆向きとなっていて、塩基Ａには塩基Ｔが結合し、塩基Ｃには塩基Ｇが相補的に結合する。
上記対象遺伝子ＤＮＡに対応して、１３（ｍｅｒ）の塩基配列からなる（Ｂ−１）のＰＮＡを少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分でもよい。言い換えると、（Ｂ−１）の遺伝子ＤＮＡに対して、（Ｂ−１）の塩基配列の「５′」側に最高１１（ｍｅｒ）までの塩基が含まれてもよいし、逆に、（Ｂ−１）の塩基配列の「３′」側に最高１１（ｍｅｒ）までの塩基が含まれてもよい。
具体的には以下の通りである。
（Ｂ−２）ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡ ＣＣＡＣＡ−ＣＯＮＨ2
（Ｂ−１）ＮＨ2− ＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣ−ＣＯＮＨ2
（Ｂ−３）ＮＨ2−ＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣ ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2
これら（Ａ−１）を挟んで（Ａ−２）から（Ａ−３）までの間の塩基配列のいずれでもよいことになる。
実験の結果では、上記１５（ｍｅｒ）の塩基配列が最も良い結果を得られた。
（Ｂ−４）ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2
さらに、以下の１４（ｍｅｒ）の塩基配列でも、良い結果を得られた。
（Ｂ−５）ＮＨ2− ＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2
（Ｂ−６）ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣ −ＣＯＮＨ2
またさらに、以下の１３（ｍｅｒ）の塩基配列でも、だいたい良い結果を得られた。
（Ｂ−１）ＮＨ2− ＡＣＧＣＣＡＣＣＡ ＧＣＴＣ −ＣＯＮＨ2
このＰＮＡは、上記変異を起こすコドン１２及びコドン１３の逆相補的配列の一方または両方を必ず含む。ＰＮＡの塩基数は上記（Ｂ−２）〜（Ｂ−３）の範囲で通常２５乃至１３、望ましくは２２至１４、より望ましくは１９乃至１５となる。または変異を起こす塩基のみの逆相補的配列の１つまたは複数を含む。しかし、ＰＮＡの塩基配列を短くすると、次述するように遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は高まり、変異の検出の誤差／不正確さが大きくなる可能性は高くなる。
これら（Ｂ−１）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）などの各ＰＮＡの部分配列は、正確な変異検出に必要な最低限の配列長であり、塩基数をこれより少なくすると、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性は高くなるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は高まり、変異の検出の誤差／不正確さが大きくなる可能性は高くなる。
また、これら（Ｂ−１）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）などの各ＰＮＡの部分配列の塩基の数を増やすと、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が長くなる可能性は高くなるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は低くなり、変異の検出の精度／正確さが大きくなる可能性は高くなる。
なお、ＰＮＡは、上記（Ｂ−１）（Ｂ−２）（Ｂ−３）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）に代えて、これらのＰＮＡと相補的な塩基配列を有する以下の（ｂ−１）（ｂ−２）（ｂ−３）（ｂ−４）（ｂ−５）（ｂ−６）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｂ−１）ＮＨ2− ＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧ−ＣＯＮＨ2
（ｂ−２）ＮＨ2−ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧＧＴＴＧＡＴ ＧＧＴＧＴ−ＣＯＮＨ2
（ｂ−３）ＮＨ2−ＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧ ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧＧ−ＣＯＮＨ2
（ｂ−４）ＮＨ2−ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧＧ−ＣＯＮＨ2
（ｂ−５）ＮＨ2− ＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧＧ−ＣＯＮＨ2
（ｂ−６）ＮＨ2−ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴ ＣＧＡＧ −ＣＯＮＨ2
これらのＰＮＡは、この１３（ｍｅｒ）の塩基配列からなる（ａ−１）の遺伝子ＤＮＡを少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分でよく、これを「第２対象遺伝子ＤＮＡ」という。この場合、図１及び図２では、（Ｂ−１）（Ｂ−２）（Ｂ−３）（Ｂ−４）（Ｂ−５）（Ｂ−６）のＰＮＡは上側のＤＮＡ鎖に結合するが、（ｂ−１）（ｂ−２）（ｂ−３）（ｂ−４）（ｂ−５）（ｂ−６）のＰＮＡは下側のＤＮＡ鎖に結合する。このような相補的なＰＮＡ（ｂ−１）…の他の内容は、上述の（Ｂ−１）…のＰＮＡと同じである。
（４）プライマー（１組のセット）
このＰＣＲ法で、上記使用されるプライマーの１つの組（セット）の片方は以下の通りである。
（Ｃ−ｎ）５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′
…はこれらの塩基配列部分に繋がる図４の上記ヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。この…の部分の具体的な塩基配列は図４の「ｋ−ｒａｓ１」の両側に示される。
望ましい塩基配列は以下の通りである。
（Ｃ−１）５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′
（Ｃ−２）５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′
（Ｃ−３）５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′
（Ｃ−４）５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′
通常は、これらの４つのうち何れかが選択されるが、これより「３′」側または「５′」側にさらに塩基配列が多くてもよい。このｋ−ｒａｓ１プライマーの塩基数は上記（Ｃ−ｎ）の形で通常４０乃至１５、望ましくは３０乃至１７、より望ましくは２５乃至１８となる。
このプライマーは便宜上「ｋ−ｒａｓ１」プライマーと呼び、図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所にも「ｋ−ｒａｓ１」と示してある。（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）の配列は、（Ｃ−１）の配列の両端のいずれかまたは両方の塩基が除外されており、この場合でも若干の誤差／不正確さが生じる可能性は高くなるが、本件ＰＣＲ法の後述する変異を検出することが可能である。
このプライマーと組みになる他のプライマーは以下の通りである。
（Ｄ−ｎ）５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′
…はこれらの塩基配列部分に繋がる図４の上記ヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。
この…の部分の具体的な塩基配列は、図４の「ｋ−ｒａｓ２」の両側における塩基Ｇ→Ｃ、Ｃ→Ｇ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａと相補的に置き換え、かつ逆向きにして、逆相補的にすれば得られる。
望ましい塩基配列は以下の通りである。
（Ｄ−１）５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′
（Ｄ−２）５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′
（Ｄ−３）５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′
（Ｄ−４）５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′
通常は、これらの４つのうち何れかが選択されるが、これより「３′」側または「５′」側にさらに塩基配列が多くてもよい。このｋ−ｒａｓ２プライマーの塩基数は上記（Ｄ−ｎ）の形で通常４０乃至１５、望ましくは３０乃至１７、より望ましくは２５乃至１８となる。
このプライマーは便宜上「ｋ−ｒａｓ２」プライマーと呼び、図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所にも「ｋ−ｒａｓ２」と示してある。（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の配列は、（Ｄ−１）の配列の両端のいずれかまたは両方の塩基が除外されており、この場合でも若干の誤差／不正確さが生じる可能性は高くなるが、本件ＰＣＲ法の後述する変異を検出することが可能である。
（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの結合箇所／塩基配列部分と、上記ＰＮＡの結合箇所／塩基配列部分とは、少なくとも１つの塩基、望ましくは３つの塩基が重複する。図４の例ではＧＴＡの３つの塩基配列部分が重複している。上記ＰＮＡの塩基配列または「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの塩基配列が長くなれば、重複塩基配列部分は長くなり、４つ以上の塩基配列部分が重複する。
上述のＰＮＡの塩基配列または「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの塩基配列の長さの変化に応じて、この重複塩基配列部分は以下の様に変化する。
（Ｊ−１） Ｔ
（Ｊ−２）ＧＴＡ
（Ｊ−３）ＧＴＡ ＧＧＣＡＡＧＡＧＴＧ
しかし、上述のＰＮＡの塩基配列及び「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの塩基配列は、上述の塩基配列を少なくとも含むのであるから、この重複塩基配列部分は、（Ｊ−３）からさらに「３′」側及び「５′」側に延びることになる。
このようなＰＮＡと「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーとの重複塩基配列部分が存在することによって、ＰＮＡの結合と「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの結合とが二者択一的となる。
この結果、対象遺伝子ＤＮＡが正常なときには、ＰＮＡの方が結合し、プライマー「ｋ−ｒａｓ１」及び「ｋ−ｒａｓ２」による対象遺伝子ＤＮＡの複製・増幅が不可能となる。対象遺伝子ＤＮＡが変異しているときには、ＰＮＡが結合せず、プライマー「ｋ−ｒａｓ１」及び「ｋ−ｒａｓ２」による変異した対象遺伝子ＤＮＡの複製・増幅が可能となる。
（Ｃ−１）（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）の「ｋ−ｒａｓ１」のプライマーの塩基配列は、図４のｋ−ｒａｓ１の箇所の塩基配列部分と同じになっている。図４のヒト遺伝子ＤＮＡの一本鎖と相補的な検討後をなす対の一本鎖の方の「ｋ−ｒａｓ１」の対応箇所にこのプライマーが結合するからである。
（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーの塩基配列は、図４のｋ−ｒａｓ２の箇所の塩基配列部分と逆相補的すなわち逆向きの相補的になっていて、塩基Ａには塩基Ｔが結合し、塩基Ｃには塩基Ｇが相補的に結合する。図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの「ｋ−ｒａｓ２」の箇所にこのプライマーが結合するからである。
これら（Ｃ−１）（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）の１つの選択と、（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の１つの選択とはいずれも任意であり、任意の組み合わせが可能であり、４×４＝１６通りの組み合わせが可能である。
これら（Ｃ−１）（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）の「ｋ−ｒａｓ１」、（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の「ｋ−ｒａｓ２」の塩基配列の両端の塩基をさらに除外してもよいのであるが、対象とする塩基部分配列を、これ以上短くすると、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は高くなり、遺伝子ＤＮＡの変異の検出に誤差／不正確さを生じる可能性が出てくる。
これら（Ｃ−１）（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）の「ｋ−ｒａｓ１」、（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）の「ｋ−ｒａｓ２」の各対象遺伝子ＤＮＡの部分配列は、正確な変異検出に必要な最低限の配列長であり、これらの各対象遺伝子ＤＮＡの両側の塩基または相補的塩基をさらに含む事は可能である。この場合、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間は長くなることもあるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は低くなって、変異の検出の誤差／不正確さが少なくなり、変異検出／変異検査がより正確になる。
なお、上記ｋ−ｒａｓ１プライマーは、上記（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）（Ｃ−２）（Ｃ−３）（Ｃ−４）に代えて、これらのプライマーと相補的な塩基配列を有する以下の（ｃ−ｎ）（ｃ−１）（ｃ−２）（ｃ−３）（ｃ−４）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｃ−ｎ）５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′
（ｃ−１）５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′
（ｃ−２）５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′
（ｃ−３）５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′
（ｃ−４）５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′
また、上記ｋ−ｒａｓ２プライマーは、上記（Ｄ−ｎ）（Ｄ−１）（Ｄ−２）（Ｄ−３）（Ｄ−４）に代えて、これらのプライマーと相補的な塩基配列を有する以下の（ｄ−ｎ）（ｄ−１）（ｄ−２）（ｄ−３）（ｄ−４）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｄ−ｎ）５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′
（ｄ−１）５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′
（ｄ−２）５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′
（ｄ−３）５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′
（ｄ−４）５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′
この場合、図１及び図２では、ｋ−ｒａｓ１プライマーは上側のＤＮＡ鎖に結合し、ｋ−ｒａｓ２プライマーは下側のＤＮＡ鎖に結合する。この（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…のｋ−ｒａｓ１プライマーと（ｄ−ｎ）（ｄ−１）…のｋ−ｒａｓ２プライマーとセットをなし、これらのプライマー間の遺伝子ＤＮＡが複製・増幅される。
この場合、上記ＰＮＡは上記相補的な（ｂ−１）（ｂ−２）（ｂ−３）（ｂ−４）（ｂ−５）（ｂ−６）が使用される。このような相補的なプライマー（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…（ｄ−ｎ）（ｄ−１）…の他の内容は、上述の（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）…（Ｄ−ｎ）（Ｄ−１）…のプライマーと同じである。
そして、この場合の上記ＰＮＡとｋ−ｒａｓ２プライマーとの重複塩基配列部分は以下の様に変化する。
（ｊ−１） Ａ
（ｊ−２）ＣＡＴ
（ｊ−３）ＣＡＴ ＣＣＧＴＴＣＴＣＡＣ
（５）プライマー（３つ目）
このＰＣＲ法では、上記使用されるプライマーの１組（セット）に、さらに以下のプライマーが加えられる。
（Ｅ−ｎ）５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′
…はこれらの塩基配列部分に繋がる図４の上記ヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。
この…の部分の具体的な塩基配列は、図４の「ｋ−ｒａｓ３」の両側における塩基Ｇ→Ｃ、Ｃ→Ｇ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａと相補的に置き換え、かつ逆向きにして、逆相補的にすれば得られる。
望ましい塩基配列は以下の通りである。
（Ｅ−１）５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′
（Ｅ−２）５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′
（Ｅ−３）５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′
（Ｅ−４）５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′
通常は、これらの４つのうち何れかが選択されるが、これより「３′」側及び「５′」側にさらに塩基配列が多くてもよい。このｋ−ｒａｓ３プライマーの塩基数は上記（Ｅ−ｎ）の形で通常４０乃至１５、望ましくは３０乃至１７、より望ましくは２５乃至１８となる。
このプライマーは便宜上「ｋ−ｒａｓ３」プライマーと呼び、図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所にも「ｋ−ｒａｓ３」と示してある。（Ｅ−２）（Ｅ−３）（Ｅ−４）の配列は、（Ｅ−１）の配列の両端のいずれかまたは両方の塩基が除外されており、この場合でも若干の誤差／不正確さが生じる可能性あるが、本件ＰＣＲ法の後述する変異を検出することが可能である。
この（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）（Ｅ−２）（Ｅ−３）（Ｅ−４）の「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーの塩基配列は、図４のｋ−ｒａｓ３の箇所の塩基配列部分と逆相補になっている。この図４のｋ−ｒａｓ３の遺伝子ＤＮＡの塩基配列部分に結合するからである。この（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）…のｋ−ｒａｓ３のプライマーは、上記（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）…のｋ−ｒａｓ１のプライマーとセットをなし、これらの両プライマーの間の遺伝子ＤＮＡ部分が複製・増幅される。
このような３つ目の「ｋ−ｒａｓ３」プライマーを加えると、反応中における遺伝子ＤＮＡの濃度が一定以上になった場合、上記ＰＮＡの結合が十分に起こらなくなることがあり、このようなＰＮＡの結合が不十分な場合にも、ｋ−ｒａｓ２プライマーが結合されることで、正常な対象遺伝子ＤＮＡの複製・増幅を押さえることができる。なお、上記不都合がなければ、この３つの目の「ｋ−ｒａｓ３」プライマーは省略可能である。
なお、プライマーの両端の「５′−」と「−３′」とは、糖の炭素原子（位置）を示し、遺伝子ＤＮＡの鎖は「５′−」からはじまり、「−３′」の位置に、リン酸を経由して、次の糖の「５′−」が付くという形で伸びる。遺伝子ＤＮＡの複製も、遺伝子ＤＮＡの情報をｍＲＮＡに写しとる転写も、すべて「５′−」から「−３′」の方向に進む。
また、上記ｋ−ｒａｓ３プライマーは、上記（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）（Ｅ−２）（Ｅ−３）（Ｅ−４）に代えて、これらのプライマーと相補的な塩基配列を有する以下の（ｅ−ｎ）（ｅ−１）（ｅ−２）（ｅ−３）（ｅ−４）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｅ−ｎ）５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′
（ｅ−１）５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′
（ｅ−２）５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′
（ｅ−３）５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′
（ｅ−４）５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′
この（ｅ−ｎ）（ｅ−１）…のｋ−ｒａｓ３のプライマーは、上記（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…のｋ−ｒａｓ１のプライマーとセットをなし、これらの両プライマーの間の遺伝子ＤＮＡ部分が複製・増幅される。この場合、図１及び図２では、ｋ−ｒａｓ１プライマーは上側のＤＮＡ鎖に結合し、ｋ−ｒａｓ３プライマーは下側のＤＮＡ鎖に結合する。このような相補的なプライマー（ｅ−ｎ）（ｅ−１）…の他の内容は、上述の（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）…のプライマーと同じである。
この場合、上記ＰＮＡは（Ｂ−１）…が使用され、ｋ−ｒａｓ２プライマーは、（Ｄ−ｎ）（Ｄ−１）…が使用されてもよいし、また上記ＰＮＡは相補的な（ｂ−１）…が使用され、ｋ−ｒａｓ２プライマーは相補的な（ｄ−ｎ）（ｄ−１）…が使用されてもよい。そして、ｋ−ｒａｓ１プライマーは（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）…と相補的な（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…の両方が使用されることがある。
このような追加されるプライマーセットの一方のｋ−ｒａｓ３のプライマーは、上記ｋ−ｒａｓ２のプライマーより上位側／−３′側に結合／アニーリングし、しかもこの追加されるｋ−ｒａｓ３とｋ−ｒａｓ３とのプライマーセットは、間に対象遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡのクランピング位置を挟み、上記ｋ−ｒａｓ１及びｋ−ｒａｓ２のプライマーの結合位置を含むまたは挟む。
このようなｋ−ｒａｓ１とｋ−ｒａｓ２、ｋ−ｒａｓ１とｋ−ｒａｓ３とのプライマーセットの選択は、それぞれの結合位置がある程度離れていることが望ましい。複製・増幅された遺伝子ＤＮＡ部分の電気泳動で差が生じないからである。この差（ｍｅｒ）は５０乃至３００（ｂｐ）、望ましくは７０乃至２５０（ｂｐ）である。ｂｐ（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）は塩基対を意味する。図４の本件例では、両プライマーセットの差は７１（ｂｐ）となっている。このような差は次述するｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆとｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒのプライマーセットでも同様である。
（６）プライマー（別の組み）
このＰＣＲ法では、上記２つまたは３つのプライマーを加える前に、場合によって以下のプライマーによりＰＣＲ法によって予め複製・増幅したサンプルが用いられることがある。
（Ｆ−ｎ）５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′
…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記ヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。この…の部分の具体的な塩基配列は、図４の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」の両側に示される。
望ましい塩基配列は以下の通りである。
（Ｆ−１）５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′
（Ｆ−２）５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′
（Ｆ−３）５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′
（Ｆ−４）５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′
通常は、これらの４つのうち何れかが選択されるが、これより「３′」側及び「５′」側にさらに塩基配列が多くてもよい。このｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆプライマーの塩基数は上記（Ｆ−ｎ）の形で通常３７乃至１２、望ましくは２７乃至１４、より望ましくは２２乃至１６となる。
このプライマーは便宜上「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」と呼び、図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所にも「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」と示してある。（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）の配列は、（Ｆ−１）の配列の両端のいずれかまたは両方の塩基が除外されており、この場合でも若干の誤差／不正確さを生じる可能性はあるが、本件ＰＣＲ法の後述する変異を検出することが可能である。
このプライマーと組みになる他のプライマーは以下の通りである。
（Ｇ−ｎ）５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′
…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記ヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列である。
この…の部分の具体的な塩基配列は、図４の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」の両側における塩基Ｇ→Ｃ、Ｃ→Ｇ、Ａ→Ｔ、Ｔ→Ａと相補的に置き換え、かつ逆向きにして、逆相補的にすれば得られる。
望ましい塩基配列は以下の通りである。
（Ｇ−１）５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′
（Ｇ−２）５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′
（Ｇ−３）５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′
（Ｇ−４）５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′
通常は、これらの４つのうち何れかが選択されるが、これより「３′」側及び「５′」側にさらに塩基配列が多くてもよい。このｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒプライマーの塩基数は上記（Ｆ−ｎ）の形で通常４０乃至１４、望ましくは３０乃至１６、より望ましくは２５乃至１８となる。
このプライマーは便宜上「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」と呼び、図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの結合箇所にも「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」と示してある。（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）の配列は、（Ｇ−１）の配列の両端のいずれかまたは両方の塩基が除外されており、この場合でも若干の誤差／不正確さを生じる可能性があるが、本件ＰＣＲ法の後述する変異を検出することが可能である。
（Ｆ−１）（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」のプライマーの塩基配列は、図４のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆの箇所の塩基配列部分と同じになっている。図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの一本鎖と相補的な検討後をなす対の一本鎖の方の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」の対応箇所にこのプライマーが結合するからである。
（Ｇ−１）（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」のプライマーの塩基配列は、図４のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒの箇所の塩基配列部分と逆相補的すなわち逆向きの相補的になっていて、塩基Ａには塩基Ｔが結合し、塩基Ｃには塩基Ｇが相補的に結合する。図３及び図４のヒト遺伝子ＤＮＡの「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」の箇所にこのプライマーが結合するからである。
これら（Ｆ−１）（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）の１つの選択と、（Ｇ−１）（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）の１つの選択とはいずれも任意であり、任意の組み合わせが可能であり、４×４＝１６通りの組み合わせが可能である。
これら（Ｆ−１）（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」、（Ｇ−１）（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」の塩基配列の両端の塩基をさらに除外してもよいのであるが、対象とする塩基部分配列を、これ以上短くすると、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は高くなり、遺伝子ＤＮＡの変異の検出に誤差／不正確さが生じる可能性がある。
これら（Ｆ−１）（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」、（Ｇ−１）（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）の「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」の各対象遺伝子ＤＮＡの部分配列は、正確な変異検出に必要な最低限の配列長であり、これらの各対象遺伝子ＤＮＡの両側の塩基または相補的塩基をさらに含む事は可能である。この場合、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間は長くなる可能性があるが、遺伝子ＤＮＡの他の塩基配列箇所に同じ塩基配列箇所が現れる可能性は低くなり、変異の検出の誤差／不正確さが少なくなり、変異検出／変異検査がより正確になる。
このような「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」及び「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」のプライマーは、上記対象遺伝子ＤＮＡ、上記ＰＮＡ、「ｋ−ｒａｓ１」、「ｋ−ｒａｓ２」、「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーが結合する遺伝子ＤＮＡを包含する／挟む塩基配列位置に結合する。
したがって、対象遺伝子ＤＮＡの変異の検査／検出にあたって、対象遺伝子ＤＮＡ及びＰＮＡ、「ｋ−ｒａｓ１」、「ｋ−ｒａｓ２」、「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーが結合する塩基配列部分を十分に複製・増幅しておくことができる。
このような対象遺伝子ＤＮＡ付近の事前複製・増幅を行えば、上記対象遺伝子ＤＮＡが糞便、尿、喀痰、体液（膵液、胸水、腹水、胃液など）などのＤＮＡが高濃度で存在する試料の中に存在し、例えば正常細胞または細菌が多数混入している場合や反応阻害物質が大量に混入している場合にも有効であり、検査・検出をより正確に行うことができる。
また、対象遺伝子ＤＮＡの量が極めて少ないときに有効であり、検査・検出をより正確に行うことができる。なお、このような不都合がなければ、この「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」及び「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」のプライマーを加えることは省略可能である。
なお、上記「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」プライマーは、上記（Ｆ−ｎ）（Ｆ−１）（Ｆ−２）（Ｆ−３）（Ｆ−４）に代えて、これらのプライマーと相補的な塩基配列を有する以下の（ｆ−ｎ）（ｆ−１）（ｆ−２）（ｆ−３）（ｆ−４）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｆ−ｎ）５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′
（ｆ−１）５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′
（ｆ−２）５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′
（ｆ−３）５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′
（ｆ−４）５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′
また、上記「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」プライマーは、上記（Ｇ−ｎ）（Ｇ−１）（Ｇ−２）（Ｇ−３）（Ｇ−４）に代えて、これらのプライマーと相補的な塩基配列を有する以下の（ｇ−ｎ）（ｇ−１）（ｇ−２）（ｇ−３）（ｇ−４）にそっくり置き換えることも可能である。
（ｇ−ｎ）５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′
（ｇ−１）５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′
（ｇ−２）５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′
（ｇ−３）５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′
（ｇ−４）５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′
この（ｆ−ｎ）（ｆ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆのプライマーは、上記（ｇ−ｎ）（ｇ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒのプライマーとセットをなし、これらの両プライマーの間の遺伝子ＤＮＡ部分が複製・増幅される。このような相補的なプライマー（ｆ−ｎ）（ｆ−１）…（ｇ−ｎ）（ｇ−１）…の他の内容は、上述の（Ｆ−ｎ）（Ｆ−１）…（Ｇ−ｎ）（Ｇ−１）…のプライマーと同じである。
この場合、図１及び図２では、（ｆ−ｎ）（ｆ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆプライマーは上側のＤＮＡ鎖に結合し、（ｇ−ｎ）（ｇ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒプライマーは下側のＤＮＡ鎖に結合する。なお、図１及び図２では、上記（Ｆ−ｎ）（Ｆ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆプライマーは下側のＤＮＡ鎖に結合し、上記（Ｇ−ｎ）（Ｇ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒプライマーは上側のＤＮＡ鎖に結合する。
この場合、上記ＰＮＡは（Ｂ−１）…が使用され、ｋ−ｒａｓ１、ｋ−ｒａｓ２、ｋ−ｒａｓ３プライマーは、（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）…（Ｄ−ｎ）（Ｄ−１）…（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）…が使用されてもよいし、また上記ＰＮＡは相補的な（ｂ−１）…が使用され、ｋ−ｒａｓ１、ｋ−ｒａｓ２、ｋ−ｒａｓ３プライマーは相補的な（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…（ｄ−ｎ）（ｄ−１）…（ｅ−ｎ）（ｅ−１）…が使用されてもよい。
（７）実験結果
図５〜図１０は、本件ＰＣＲ法による実験結果を示す。これらの図は、対象遺伝子ＤＮＡ部分の蛍光バンド図であり、同じ対象遺伝子ＤＮＡ部分を複製・増幅させて電気泳動させて、蛍光色素で染めて光のバンドとして示したものである。このうち図５及び図６の蛍光バンド図の縦軸は、複製・増幅させた対象遺伝子ＤＮＡの分子量つまり電気泳動量に応じており、横軸は、実験したサンプルの種類に応じている。ＰＮＡの使用／不使用は＋／−で示される。
実験では、上記「ｋ−ｒａｓ」の対象遺伝子ＤＮＡに異常を生じているもの（以下「異常サンプル」という。）と、「正常」な健常人の末梢血（以下「正常サンプル」という。）と、Ｈ2（以下「無サンプル」という。）とを用いた。これらのＤＮＡサンプル５０ナノグラム（ng）を含む１．０Ｕ、イクスパンドハイフェデリティープラスエンザイムブレンド(Expand High Fidelity PLUS Enzyme Blend/Roche Diagnostics)４マイクロリットル(μｌ)、イクスパンドハイフェデリティーリアクションバッファー［５×］ウイズ７．５ミリモル塩化マグネシウム(Expand High Fidelity PLUS Reaction Buffer［５×］with ７．５ mM MgCl2/Roche Diagnostics)０．２ミリモル（ｍＭ）、ＰＣＲヌクレオチドミックス（PCR Nucleotide Mix/R
oche Diagnostics）、ｋ−ｒａｓ１のプライマー０．５マイクロモル(μM)、ｋ−ｒａｓ２のプライマー０．５マイクロモル(μM) ｋ−ｒａｓ３のプライマー０．２５マイクロモル(μM)、ＰＮＡ２．０マイクロモル(μM)を加え合計２０マイクロリットル（μｌ）とした。
ＰＣＲシステム／ＰＣＲ装置を用い、これを９０乃至１００℃例えば９４℃で５分加熱して遺伝子ＤＮＡの二本鎖を分離し、９０乃至１００℃例えば９４℃の１分加熱でデナチュレイション（Denaturation）し、次いで放熱して４０乃至７０℃例えば５８℃の１分加熱で上記ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒのプライマーのアニーリング、そして加熱して６０乃至８０℃例えば７２℃の１分加熱でエクステンション（Extension）を行い、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒのプライマー間の遺伝子ＤＮＡを予め複製・増幅した。
次いで、これを９０乃至１００℃例えば９４℃で５分加熱して遺伝子ＤＮＡの二本鎖を分離し、９０乃至１００℃例えば９４℃の１分加熱でデナチュレイション（Denaturation）し、次いで放熱して６０乃至８０℃例えば６５℃の１分加熱でＰＮＡのアニーリング（Annealing）を行い、さらに放熱して４０乃至７０℃例えば５８℃の１分加熱で上記ｋ−ｒａｓ１、ｋ−ｒａｓ２、ｋ−ｒａｓ３のプライマーのアニーリング、そして加熱して６０乃至８０℃例えば７２℃の１分加熱でエクステンション（Extension）を行い、対象遺伝子ＤＮＡの複製・増幅を３０サイクル行った。この後、３％アガロースゲルで電気泳動またはポリアクリルアミドゲルで電気泳動させ、エティディアムブロマイド（Etidium Bromide）で染色し、紫外線イルミネータで図４乃至図７に示すように撮影した。
図５は、上記「異常サンプル」（ＳＷ４８０）と「正常サンプル」と「無サンプル」（Ｈ2Ｏ（水））とにつき、ＰＮＡを加えて結合させた場合（ＰＮＡａｄｄ ＋）と、ＰＮＡを加えないで結合させない場合（ＰＮＡａｄｄ −）の蛍光バンドを示す。この「異常サンプル」（ＳＷ４８０）は、ヒト結腸腺癌由来細胞（ATCC No. CCL-228）であり、コドン１２に変異をきたしている細胞である。
ＰＮＡ未添加では、「異常サンプル」と「正常サンプル」ともに、２５６ｂｐと１５７ｂｐとに蛍光バンドが確認できる。この１５７ｂｐの蛍光バンドは「ｋ−ｒａｓ１」と「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーセットによって複製・増幅された遺伝子ＤＮＡによって形成され、２５６ｂｐの蛍光バンドは「ｋ−ｒａｓ１」と「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーセットによって複製・増幅された遺伝子ＤＮＡによって形成されたものである。
これに対して、ＰＮＡを加えると、「異常サンプル」（ＳＷ４８０）には、２５６ｂｐと１５７ｂｐとの２つの蛍光バンドが確認できるが、「正常サンプル」には、２５６ｂｐの蛍光バンドが出現するが１５７ｂｐの蛍光バンドは出現しない。このことから、１５７ｂｐの蛍光バンドの有無によって異常と正常とを識別できる。
「正常サンプル」に１５７ｂｐの蛍光バンドが出現しないのは、ＰＮＡが対象遺伝子ＤＮＡの「ｋ−ｒａｓ」遺伝子の正常な塩基配列部分に結合して「ｋ−ｒａｓ２」プライマーが結合せず、「ｋ−ｒａｓ１」と「ｋ−ｒａｓ２」のプライマーセットによる１５７ｂｐの分子量のＤＮＡサンプルが複製・増幅されないからである。
「無サンプル」（Ｈ2Ｏ（水））では、２５６ｂｐと１５７ｂｐとのいずれの蛍光バンドも出現しない。これはＨ2Ｏ（水）の「無サンプル」では、複製・増幅可能な遺伝子ＤＮＡがもともと存在しないからである。この「無サンプル」（Ｈ2Ｏ（水））は、陰性のサンプルとして参照対比される。
図６も、上記図４と同様に、ＰＮＡを加えて結合させた場合（ＰＮＡａｄｄ ＋）と、ＰＮＡを加えないで結合させない場合（ＰＮＡａｄｄ −）の蛍光バンドを示す。
サンプルは、「ｋ−ｒａｓ」遺伝子が変異している「ＳＷ４８０」のほか、糞便から抽出した遺伝子ＤＮＡの４つの「サンプルＡ〜Ｄ」、健常人の末梢血（ＮｏｒＰ．Ｂ．）、「無サンプル」（Ｈ2Ｏ（水）である。
糞便から抽出した遺伝子ＤＮＡの４つの「サンプルＡ〜Ｄ」のうち、「サンプルＡ」及び「サンプルＤ」は、大腸癌を発症している人の糞便から抽出したものであり、「サンプルＢ」及び「サンプルＣ」は、大腸癌を発症していない健常人の糞便から抽出したものである。この大腸癌は、ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２に変異を起こしているものである。
「ｋ−ｒａｓ」遺伝子ＤＮＡが変異していたり、ｋ−ｒａｓ遺伝子のコドン１２またはコドン１３に変異を起こしている大腸癌を発症していたり場合には、２５６ｂｐと１５７ｂｐとの２つの蛍光バンドが確認できるが、そうでない正常な場合には、２５６ｂｐの蛍光バンドが出現するが１５７ｂｐの蛍光バンドは出現しない。このことから、１５７ｂｐの蛍光バンドの有無によって大腸癌の発症の有無を識別できる。
しかも、糞便のように、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い試料のなかでも、ＰＮＡプローブが十分に反応して、対象遺伝子ＤＮＡの変異をより正確に検出することができることがわかる。なお、「無サンプル」（Ｈ2Ｏ（水））では、２５６ｂｐと１５７ｂｐとのいずれの蛍光バンドも出現せず陰性サンプルとなる。
図７乃至図１０は、本件発明のＰＣＲ法と公知ではない他のＰＣＲ法との比較を示す。比較した他のＰＣＲ法では、上述の本発明のＰＣＲ法に比べて「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーのみを加えないもので、種々の濃度の試料で実験を行った。
この図７乃至図１０の蛍光バンド図の縦軸は、複製・増幅させた対象遺伝子ＤＮＡの分子量つまり電気泳動量に応じており、横軸の１０1〜１０10は、コピー数つまり複製量・増幅量に応じている。
図７の健常人の末梢血（正常サンプル）を用いた実験において、図７の上段の本件発明のＰＣＲ法では、１０2のコピー数以降、２４６ｂｐの蛍光バンドのみが現れてくる。これは、上記図５及び図６の正常サンプルと同じ結果である。
これに対して、図８の「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーを用いない他のＰＣＲ法では、１０5のコピー数以降、１５７ｂｐの蛍光バンドのみが現れてくる。これは、上記図５及び図６の正常サンプルとは全く異なり、誤判定／偽陽性となってしまっていることを示す。
図９の「ｋ−ｒａｓ」遺伝子が変異している「ＳＷ４８０」を用いた実験において、図９の上段の本件発明のＰＣＲ法では、１０2のコピー数以降、２４６ｂｐ及び１５７ｂｐの２つの蛍光バンドのみが現れてくる。これは、上記図５及び図６の異常サンプルと同じ結果である。
これに対して、図１０の「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーを用いない他のＰＣＲ法では、１０2のコピー数以降、１５７ｂｐの蛍光バンドのみが現れてくる。これは、上記図５及び図６の異常サンプルとは全く異なり、誤判定／偽陽性となってしまっていることを示す。
以上のことから、本発明のＰＣＲ法では、「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーを用いることで、糞便のような正常遺伝子ＤＮＡサンプルが大量に存在し、しかも高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
なお、プライマーを設計するにあたり一般的な留意事項として、その配列は対象となるＤＮＡの塩基配列から特異性の高い箇所を選択する必要がある。プライマーの配列と相補的/同じかまたはこれと類似の箇所が遺伝子ＤＮＡの別の箇所にあると、ＰＣＲの結果、目的の反応産物以外に複数の産物が形成されてしまうからである。
また、プライマーの設計においてＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の含有割合が高すぎる場合、プライマー同士が結合してしまうか、またはプライマー自体が立体構造を作ってしまうと、十分な反応が得られないため、ＧとＣの含有割合の低いプライマー、望ましくはＧとＣの含有率が４０乃至６０％のプライマーが選ばれる。
本発明のＰＣＲ法では、上述の正常細胞および大腸癌由来の細胞からの核酸を使用した実験より、上述の問題点はなく、かつ、従来の方法と比較・検討し優れた結果が得られた。そして、アガロース電気泳動写真における反応態度も客観的かつ容易に判断できた。このことより、上記プライマーを設計するにあたり一般的な留意事項において、本発明のプライマーは問題ないといえる。
アガロース電気泳動写真上で判別するには大きさの異なるものを作る設計が必要となるが、本発明のＰＣＲ法により、上述のように２種類または複数種類の産物が作られ、本発明のＰＣＲ法のプライマーはこの条件も満たしているといえる。
また、本件発明のＰＣＲ法では、アガロース電気泳動による目視の確認だけでなく、リアルタイムＰＣＲ法などを用いた蛍光色素による反応系への適応も可能である。この場合のプライマー設計においてＰＣＲ産物の大きさは３００ｂｐ程度までがベストとされていますが、本件発明のプライマーはこの条件も満たしている。
本件発明のプライマーおよび反応条件は多くの実験を経た上で最適化されている。上述の実験で検証していない別発明の配列のプライマーを用いて、本件発明のＰＣＲ法と同等あるいはそれ以上の結果が得られるという可能性を完全に否定できるものではないが、対象とする試料、前提となる遺伝子変異箇所周辺の配列状況および通常より多い本数のプライマーを加えるという測定条件からすると、本件発明のＰＣＲ法及びプライマーは極めて完成度が高いといえる。
（８）他の実施の形態
本発明は、上記実施例に限定されず、種々変更可能である。例えば、上記（Ｂ−１）…及び（ｂ−１）…のＰＮＡは、変異していない正常な上記第１対象遺伝子ＤＮＡ及び第２対象遺伝子ＤＮＡに結合したが、上記コドン１２またはコドン１３が変異した第１対象遺伝子ＤＮＡまたは第２対象遺伝子ＤＮＡに結合するＰＮＡとしてもよい。
この場合、対象遺伝子ＤＮＡの塩基の変異に応じて、この変異箇所に対応する上記（Ｂ−１）…及び（ｂ−１）…のＰＮＡの塩基も、この変異した塩基に結合する相補的な塩基に置き換えられる。この場合、対象遺伝子ＤＮＡの塩基の変異が複数パターン／複数段階ある時は、これに応じて複数種類のＰＮＡが用意され加えられ使用される。
そして、図１の対象遺伝子ＤＮＡが正常なときにＰＮＡは結合せず、代わりにｋ−ｒａｓ２のプライマーが結合する。また、図２の対象遺伝子ＤＮＡが変異して異常なときにＰＮＡは結合し、代わりにｋ−ｒａｓ２のプライマーが結合しない。
また、上記（Ｃ−ｎ）（Ｃ−１）…（ｃ−ｎ）（ｃ−１）…のｋ−ｒａｓ１のプライマーの代わりに（Ｆ−ｎ）（Ｆ−１）…（ｆ−ｎ）（ｆ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆが使用されてもよいし、上記（Ｅ−ｎ）（Ｅ−１）…（ｅ−ｎ）（ｅ−１）…のｋ−ｒａｓ３のプライマーの代わりに（Ｇ−ｎ）（Ｇ−１）…（ｇ−ｎ）（ｇ−１）…のｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒが使用されてもよい。
この場合、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆとｋ−ｒａｓ２とがプライマーセットをなし、ｋ−ｒａｓ１とｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒとがプライマーセットをなし、対象遺伝子ＤＮＡの２段階の複製・増幅は行われない。ＰＣＲ法の電気泳動のためには各プライマー間の複製・増幅部分の塩基数に差が必要である。
この場合でも、使用されるプライマーセットは、ｋ−ｒａｓ２とｋ−ｒａｓ１またはｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆのセットに対して、ｋ−らｓ１とｋ−ｒａｓ３、ｋ−ｒａｓ１とｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆとｋ−ｒａｓ３、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆとｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒなどとなる。後者のプライマーセット群は、いずれも、間に対象遺伝子ＤＮＡ、ＰＮＡのクランピング位置を挟み、上記ｋ−ｒａｓ２とセットをなすｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆまたはｋ−ｒａｓ１のプライマーの結合位置を含むかまたは挟む。
上記相補的なＰＮＡ、ｋ−ｒａｓ１、ｋ−ｒａｓ２、ｋ−ｒａｓ３、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ、ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒのプライマーは相補的な両方が加えられ使用されてもよい。これにより、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間は短くなる可能性がある。
また、「ｋ−ｒａｓ１」及び「ｋ−ｒａｓ３」のプライマーセット、及び／または「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｆ」及び「ｋ−ｒａｓ ｏｕｔ Ｒ」のプライマーセットは、これらのプライマーの塩基配列と逆相補的なものとしてもよい。これでも同様に、対象遺伝子ＤＮＡの事前複製・事前増幅を行うことができる。
本発明のＰＣＲ法は、正常細胞が大量に混入している場合や、対象遺伝子ＤＮＡの量が極めて少ない場合に有効であるが、正常細胞があまり混入していない場合や、対象遺伝子ＤＮＡの量が多い場合でも有効である。
ＰＮＡのアニーリングのＴｍ値は６０乃至８０℃例えば６５℃、ｋ−ｒａｓ１などのプライマーのアニーリングのＴｍ値は４０乃至７０℃例えば５８℃であり、前者は後者より高い。これは、ＰＮＡをプライマーより先にアニーリングさせるためである。しかし、これが逆であってもよい。この場合、いったん試料の温度をＰＮＡのアニーリングのＴｍ値まで下げた後、ＰＮＡを加え、ｋ−ｒａｓ１などのプライマーのアニーリングのＴｍ値まで加熱し、プライマーを加えることになる。
本発明のＰＣＲ法によって検出される遺伝子ＤＮＡの変異は、塩基の欠損、挿入、置換、ＳＮＰ（一塩基多型）など、遺伝子ＤＮＡの異常と正常との違いまたは正常であっても個人差による違いであってもよい。
また、本発明のＰＣＲ法によって検出される遺伝子ＤＮＡはヒトのものであるが、家畜その他の動物・植物・菌・微生物におけるものであってもよい。さらに、本発明のＰＣＲ法によって検出される遺伝子ＤＮＡは、遺伝子ＤＮＡの情報が写し取られたｍＲＮＡでもよいし、ＲＮＡであってもよい。
上記実施例で検査したのは、ｋ−ｒａｓと呼ばれる遺伝子であり、このｋ−ｒａｓ遺伝子は大腸癌、膵臓癌、肺癌で高頻度に変異が検出される。特に最近はこのｋ−ｒａｓ遺伝子は、発癌遺伝子として癌化に重要な役割を果たしているとされている。
（９）他の発明の効果
［１］遺伝子ＤＮＡと、 この遺伝子ＤＮＡ内の変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列と相補配列を有して、当該対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列に結合するＰＮＡであって、 この変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡは、「５′−ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ−３′」（以下「第１対象遺伝子ＤＮＡ」という）及びこの「第１対象遺伝子ＤＮＡ」と相補的な「３′−ＣＴＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡ−５′」（以下「第２対象遺伝子ＤＮＡ」という）の何れか一方を少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分であり、 上記第１または第２対象遺伝子ＤＮＡの一部を含み、上記対象遺伝子ＤＮＡから離れた塩基配列と相補配列を有して、当該塩基配列に結合するプライマーとを使用するＰＣＲ法であって、当該プライマーは、 ５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′及び ５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′のセット、または、これらと相補的配列をなす、 ５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′及び ５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′のセット（…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）であることを特徴とするＰＣＲ法。
これにより、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い、糞便のような高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
［２］上記プライマー５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′は、 ５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′、 ５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′、 ５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′または ５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′は、 ５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′、 ５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′、 ５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′または ５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′は、 ５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′、 ５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′、 ５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′または ５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′は、 ５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′、 ５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′、 ５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′または ５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法。
これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高まる。
［３］上記ＰＣＲ法は、さらに、上記プライマー５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′とセットをなす ５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′または、これらと相補的配列をなし、上記プライマー５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′とセットをなす ５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′（…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）のプライマーセットが使用され、 これらのプライマーセットの結合位置の間に、上記対象遺伝子ＤＮＡ、上記ＰＮＡの結合位置を挟み、請求項１のプライマーの結合位置を含むまたは挟むことを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法。
これにより、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い、糞便のような高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
［４］上記プライマー５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′は、 ５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′、 ５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′、 ５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′または ５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′であり、上記プライマー５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′は、 ５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′、 ５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′、 ５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′または ５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項３記載のＰＣＲ法。
これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高まる。
［５］上記ＰＣＲ法は、さらに、 ５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′及び ５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′のセット、並びに、これらと相補的配列をなす、 ５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′及び ５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′のセット（…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）のプライマーセットが使用されることを特徴とする請求項１、２、３または４記載のＰＣＲ法。
これにより、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い、糞便のような高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
［６］上記請求項１のプライマー ５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′または ５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′の代わりに、上記請求項５のプライマー ５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′または ５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′が使用され、若しくは、 上記請求項３のプライマー ５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′または ５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′の代わりに、上記請求項５のプライマー ５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′または ５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′が使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載のＰＣＲ法。
これでも同様に、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い、糞便のような高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
［７］上記プライマー５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′は、 ５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′、 ５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′、 ５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′または ５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′は、 ５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′、 ５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′、 ５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′または ５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′は、 ５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′、 ５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′、 ５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′または ５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′であり、 上記プライマー５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′は、 ５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′、 ５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′、 ５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′または ５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項５または６記載のＰＣＲ法。
これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高まる。
［８］請求項５または７のプライマーは、請求項１、２、３または４記載のプライマーに先んじて加えられることを特徴とする請求項５、６、７または８記載のＰＣＲ法。 これにより、対象遺伝子ＤＮＡの周辺だけを他の遺伝子ＤＮＡ部分に比べて十分に複製・増幅しておき、遺伝子ＤＮＡの正常／異常を正確に識別することができる。
［９］上記対象遺伝子ＤＮＡは糞便などのＤＮＡが高濃度で存在する試料の中に存在するものであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のＰＣＲ法。 これにより、正常細胞などの検出の目的となる変異遺伝子を伴わない細胞（ＤＮＡ）、腸内細菌などの細菌（ＤＮＡ）などのＤＮＡが多く含まれるまたはその可能性の高い、糞便のような高濃度の試料のなかでも、正常遺伝子ＤＮＡと変異した異常遺伝子ＤＮＡとを明確に区別して識別することができる。
［１０］上記ＰＮＡは、 …ＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣ…の塩基配列を含み、 ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡ−ＣＯＮＨ2から ＮＨ2−ＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2までの１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分を有する、または、 …ＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧ…の塩基配列を含み、 ＮＨ2−ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴ−ＣＯＮＨ2から ＮＨ2−ＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧ−ＣＯＮＨ2までの１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載のＰＣＲ法。これにより、対象遺伝子ＤＮＡをＰＮＡで予めアニーリングしておくことができる。
［１１］上記請求項１のＰＣＲ法で使用される請求項１記載のプライマー。これにより、対象遺伝子ＤＮＡの変異の検出の誤差がなくなり検出がより正確になる可能性が高くなる。
［１２］上記請求項２のＰＣＲ法で使用される請求項２記載のプライマー。これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高くなる。１
［１３］上記請求項３のＰＣＲ法で使用される請求項３記載のプライマー。これにより、対象遺伝子ＤＮＡの変異の検出の誤差がなくなり検出がより正確になる可能性が高くなる。
［１４］上記請求項４のＰＣＲ法で使用される請求項４記載のプライマー。これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高くなる。
［１５］上記請求項５のＰＣＲ法で使用される請求項５記載のプライマー。これにより、対象遺伝子ＤＮＡの変異の検出の誤差がなくなり検出がより正確になる可能性が高くなる。
［１６］上記請求項６のＰＣＲ法で使用される請求項６記載のプライマー。これにより、プライマーの塩基配列が短くなるので、対象遺伝子ＤＮＡの変異検出のための検査時間／実験時間／反応時間が短くなる可能性が高くなる。
［１７］上記請求項９のＰＣＲ法で使用される請求項９記載のＰＮＡ。これにより、対象遺伝子ＤＮＡをＰＮＡで予めアニーリングしておくことができる。
本発明は、検出目的ではない遺伝子が高濃度で存在する試料のなかでも、ＰＮＡプローブが対象遺伝子に対して十分に反応し、対象遺伝子ＤＮＡの変異が正確に検出される。正常なｋ−ｒａｓの対象遺伝子にＰＮＡが結合し、このｋ−ｒａｓの塩基配列を一部に含むプライマーセットと、含まないプライマーセットとで複製・増幅を行う。
ｋ−ｒａｓ遺伝子が変異していれば、ＰＮＡは結合できず、この変異した遺伝子がＰＣＲによって複製・増幅される。ｋ−ｒａｓ遺伝子が変異せず正常であれば、ＰＮＡは結合できるので、ｋ−ｒａｓ遺伝子と一部重複するプライマーは逆に結合することができず、対象遺伝子はＰＣＲによっても複製・増幅されない。ｋ−ｒａｓの塩基配列を含まないプライマーセットによる複製・増幅によって、検出目的ではない遺伝子が高濃度で存在する試料のなかでもＰＮＡプローブが十分に反応し誤判定が防止される。
本発明のＰＣＲ法の原理を示す。 本発明のＰＣＲ法の原理を示す。 本発明のＰＣＲ法のＰＮＡとプライマーとを示す。 本発明のＰＣＲ法の対象遺伝子ＤＮＡ付近のヒト遺伝子ＤＮＡの塩基配列を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。 本発明のＰＣＲ法の実験結果を示す。

Claims (18)

  1. 遺伝子ＤＮＡと、
    この遺伝子ＤＮＡ内の変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列と相補配列を有して、当該対象遺伝子ＤＮＡの一部の配列に結合するＰＮＡであって、
    この変異を検出する対象遺伝子ＤＮＡは、「５′−ＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＴ−３′」（以下「第１対象遺伝子ＤＮＡ」という）及びこの「第１対象遺伝子ＤＮＡ」と相補的な「３′−ＣＴＣＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡ−５′」（以下「第２対象遺伝子ＤＮＡ」という）の何れか一方を少なくとも含む１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分であり、
    上記第１または第２対象遺伝子ＤＮＡの一部を含み、上記対象遺伝子ＤＮＡから離れた塩基配列と相補配列を有して、当該塩基配列に結合するプライマーとを使用するＰＣＲ法であって、
    当該プライマーは、
    ５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′及び
    ５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′のセット、
    または、これらと相補的配列をなし、
    ５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′及び
    ５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′のセット
    （…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）
    であることを特徴とするＰＣＲ法。
  2. 上記プライマー５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′は、
    ５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′、
    ５′−ＴＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′、
    ５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴＡ−３′または
    ５′− ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ…−３′は、
    ５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′、
    ５′−ＧＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′、
    ５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣ−３′または
    ５′− ＴＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′は、
    ５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′、
    ５′−ＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′、
    ５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡＴ−３′または
    ５′− ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ…−３′は、
    ５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′、
    ５′−ＣＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′、
    ５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧ−３′または
    ５′− ＡＧＴＴＣＣＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴ −３′
    であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法。
  3. 上記ＰＣＲ法は、さらに、
    上記プライマー５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′とセットをなす
    ５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′
    または、これらと相補的配列をなし、
    上記プライマー５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′とセットをなす
    ５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′
    （…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）
    のプライマーセットが使用され、
    これらのプライマーセットの結合位置の間に、上記対象遺伝子ＤＮＡ、上記ＰＮＡの結合位置を挟み、請求項１のプライマーの結合位置を含むまたは挟むことを特徴とする請求項１記載のＰＣＲ法。
  4. 上記プライマー５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′は、
    ５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′、
    ５′−ＧＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′、
    ５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴＧ−３′または
    ５′− ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′は、
    ５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′、
    ５′−ＣＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′、
    ５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡＣ−３′または
    ５′− ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ −３′
    であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項３記載のＰＣＲ法。
  5. 上記ＰＣＲ法は、さらに、
    ５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′及び
    ５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′のセット、
    並びに、これらと相補的配列をなす、
    ５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′及び
    ５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′のセット
    （…はこれらの塩基配列部分に繋がる上記遺伝子ＤＮＡの塩基配列）
    のプライマーセットが使用されることを特徴とする請求項１、２、３または４記載のＰＣＲ法。
  6. 上記請求項１のプライマー
    ５′−…ＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＡＴＴＴＧＡＴ…−３′または
    ５′−…ＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＡＴＡＡＡＣＴＡ…−３′
    の代わりに、上記請求項５のプライマー
    ５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′または
    ５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′が使用され、若しくは、
    上記請求項３のプライマー
    ５′−…ＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＧＴＡＡＴＡＴ…−３′または
    ５′−…ＣＡＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＴＴＡＴＡ…−３′
    の代わりに、上記請求項５のプライマー
    ５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′または
    ５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′が使用されることを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載のＰＣＲ法。
  7. 上記プライマー５′−…ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ…−３′は、
    ５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′、
    ５′−ＧＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′、
    ５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＴ−３′または
    ５′− ＴＣＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ…−３′は、
    ５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′、
    ５′−ＣＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′、
    ５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧＡ−３′または
    ５′− ＣＣＴＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＣＡＡＧＧ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ…−３′は、
    ５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′、
    ５′−ＣＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′、
    ５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡ−３′または
    ５′− ＡＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣ −３′であり、
    上記プライマー５′−…ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ…−３′は、
    ５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′、
    ５′−ＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′、
    ５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣＴ−３′または
    ５′− ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＧＧＴＴＣＣ −３′
    であって、これらのプライマー群は互いに相補配列を有していることを特徴とする請求項５または６記載のＰＣＲ法。
  8. 請求項５または７のプライマーは、請求項１、２、３または４記載のプライマーに先んじて加えられることを特徴とする請求項５、６、７または８記載のＰＣＲ法。
  9. 上記対象遺伝子ＤＮＡは糞便などのＤＮＡが高濃度で存在する試料の中に存在するものであることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７または８記載のＰＣＲ法。
  10. 上記ＰＮＡは、
    …ＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣ…の塩基配列を含み、
    ＮＨ2−ＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＴＡＣＣＡＣＡ−ＣＯＮＨ2から
    ＮＨ2−ＣＡＣＴＣＴＴＧＣＣＴＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣ−ＣＯＮＨ2までの１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分を有する、または、
    …ＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧ…の塩基配列を含み、
    ＮＨ2−ＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＧＴＧＴ−ＣＯＮＨ2から
    ＮＨ2−ＧＴＧＡＧＡＡＣＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＡＧＧ−ＣＯＮＨ2までの１３乃至２５（ｍｅｒ）の塩基配列部分を有することを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９記載のＰＣＲ法。
  11. 上記請求項１のＰＣＲ法で使用される請求項１記載のプライマー。
  12. 上記請求項２のＰＣＲ法で使用される請求項２記載のプライマー。
  13. 上記請求項３のＰＣＲ法で使用される請求項３記載のプライマー。
  14. 上記請求項４のＰＣＲ法で使用される請求項４記載のプライマー。
  15. 上記請求項５のＰＣＲ法で使用される請求項５記載のプライマー。
  16. 上記請求項６のＰＣＲ法で使用される請求項６記載のプライマー。
  17. 上記請求項７のＰＣＲ法で使用される請求項６記載のプライマー。
  18. 上記請求項１０のＰＣＲ法で使用される請求項１０記載のＰＮＡ。
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