KR20150102455A - 초고감도 돌연변이 증폭 방법 및 이를 위한 시발체 - Google Patents

초고감도 돌연변이 증폭 방법 및 이를 위한 시발체 Download PDF

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KR20150102455A
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최은경
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서영아
천성민
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Abstract

본 발명은 초고감도 돌연변이 증폭용 시발체, 및 이를 포함하는 돌연변이 증폭용 조성물, 돌연변이 증폭용 키트에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 시발체를 이용한 초고감도 돌연변이 증폭 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체 및 이를 이용한 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭 방법은 상기한 바와 같이, 한번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시킬 수 있으므로, 극도로 낮은 농도로 존재하는 돌연변이 유전자 또는 단일염기 다형성을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이에 본 발명자들은 이 방법을 초고감도 돌연변이 증폭법 (Ultra High Sensitive (UHS) method for amplification of mutant DNA) 로 명명하였다. 이러한 UHS 방법을 이용할 경우, 극도로 낮은 농도로 존재하는 특정 염기서열을 확인할 수 있기 때문에, 항암 치료중인 암환자의 암세포 잔존여부나, 혈액 내 극히 낮은 농도로 존재하는 암세포 유래 cell free DNA 진단 등에 활용될 수 있으며, 환자치료 성적 향상은 물론이고 높은 경제적 이익까지 창출할 수 있다. 또한, 일반적인 nested PCR 의 경우 필연적으로 발생하게 되는, 실험 소요 시간의 연장이나 실험 방법의 복잡함, 그리고 물리적으로 나뉘어진 1st PCR과 2nd PCR으로 인한 샘플간의 교차 오염 (cross contamination)과 캐리-오버 오염 (carry-over contamination)등의 위험성을, UHS 방법을 사용하면 원천적으로 차단할 수 있다. 또한 추가 증폭되는 돌연변이 DNA와 함께 정상 DNA도 증폭되기 때문에, 실험오류로 인해 발생할 수 있는 위음성 위험성 역시 배제할 수 있다.

Description

초고감도 돌연변이 증폭 방법 및 이를 위한 시발체 {Ultra High Sensitive Method for Amplification of mutant DNA and primer thereof}
본 발명은 초고감도 돌연변이 증폭용 시발체, 및 이를 포함하는 돌연변이 증폭용 조성물, 돌연변이 증폭용 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 시발체를 이용한 초고감도 돌연변이 증폭 방법에 관한 것이다.
돌연변이란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다.
돌연변이는 여러 질병과 관련이 깊다. 예를 들어, 종양의 경우, 여러 고형 종양에 있어서 TP53 유전자 혹은 KRAS 유전자 돌연변이, 갑상선암 및 대장암 등에 있어서 BRAF 유전자 돌연변이, 폐암 및 대장암에서 EGFR 유전자 돌연변이, 만성골수증식성질환에서 JAK2 유전자 돌연변이, 급성골수 구성백혈병에서 NPM1 유전자 돌연변이 등이 있다. 이러한 돌연변이의 상당수는 유전자내 특정 위치에 호발하는 특성을 가지고 있다. 이에는 TP53 Arg175His/Arg248Gln/Arg273His, KRAS 코돈 12 및 13 돌연변이, BRAF Val600Glu 돌연변이, EGFR Leu858Arg/Thr790Met 돌연변이, JAK2 Val617Phe 돌연변이, NPM1 엑손 12 돌연변이 등이 있다.
이러한 질병 특이적 돌연변이를 검출하는 것은 질병의 진단과 치료방침 결정 및 치료 후 질병의 예후 판단에 아주 유용하다. 이에 따라 질병 특이적인 돌연변이를 유전학적 방법으로 검출하는 검사법들이 개발되고 이용되어 오고 있으며, 대표적인 방법으로 직접염기서열분석법 (direct sequencing), 대립유전자특이증폭법(allele-specific PCR), 제한효소절편길이다형성 (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), Taqman 소식자(probe)법, ARMS(amplification refractory mutation system)-PCR, 변성(denaturing) HPLC (dHPLC), 및 real-time PCR fall short 등이 있다.
질병 특이적인 돌연변이 검출검사에서 중요하게 요구되는 사항으로는 (1) 정상 DNA 속에서 낮은 비율로 존재하는 돌연변이 DNA를 검출할 수 있는 민감도 (sensitivity)와 (2) 정상 DNA를 돌연변이 DNA로 잘못 판정하는 위양성(false positive) 비율을 최대한 낮출수 있는 특이도(specificity)를 갖추는 것이다.
그러나, 기존에 사용되었던 방법들은 민감도와 특이도에 있어서 만족할 만한 결과를 보여주지 못하였다. 직접염기서열분석법은 가장 특이도가 높아 위양성의 비율이 낮은 반면 20~30% 이상의 돌연변이 DNA가 존재할 경우에만 검출이 가능한 단점이 있다. 반면 대립유전자특이증폭법이나 제한효소절편길이다형성, Taqman 소식자법 등은 민감도는 높으나 특이도가 낮아 위양성의 문제점을 항상 가지고 있다.
따라서, 여전히 민감도와 특이도가 높은 검사법에 대한 수요가 높은 실정이다.
이에, 본 발명자들은, 돌연변이와 상보적인 염기 서열, 및 이에 인접한 위치에 주형의 DNA와 미스매치되는 서열을 포함하는 시발체 (MSP, mutation specific primer)를 돌연변이 서열 증폭시 적용하는 경우, 돌연변이 DNA를 매우 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였으며, 이 방법을 초고감도 돌연변이 증폭법 (UHS, Ultra High Sensitive method)으로 명명하였다.
본 발명의 일 양상은 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체 및 이를 포함하는 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 조성물, 및 증폭 키트를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 다른 양상은 상기 프로브를 이용하여 돌연변이 또는 단일염기다형성을 증폭하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은
(1) 3' 말단에 돌연변이 또는 단일염기다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism)에 상보적인 염기서열을 포함하고;
(2) 상기 (1)의 염기서열로부터 5' 말단 방향으로, 주형 염기 서열과 미스매치된 염기 서열을 포함하는,
돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체 (primer)를 제공한다.
본 발명에 있어서, 돌연변이란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 상기 돌연변이는 바람직하게는 유전자 단위의 돌연변이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된 점돌연변이 (point mutation) 또는 다중 돌연변이 (multiple mutation)일 수 있다. 또한 상기 돌연변이는 침묵 돌연변이, 중성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프래임 시프트 돌연변이 등 일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명에 있어서 단일염기다형성이 (SNP, single nucleotide polymorphism)란 개체 또는 질병군, 또는 지역군등에서 단일부분에 여러가지 DNA 염기들이 다양하게 나타나는 현상이다. 본 발명의 상기 시발체는 돌연변이뿐만 아니라 개체 또는 질병, 지역군 등에서 나타날수 있는 단일 염기 다형성의 증폭 역시 가능하다.
본 발명에서 용어, "시발체 (primer)"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형 (template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 시발체는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 시발체는 5개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 또는 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
상기 시발체에서, (2) 주형 염기서열과 미스매치된 염기서열은 (1) 돌연변이 또는 SNP와 상보적인 염기서열로부터 5' 말단 방향으로 1 내지 10 bp 거리에 위치할 수 있으며, 가장 바람직하게는 2bp에 위치할 수 있다. 또한, (2)의 주형 염기서열과 미스매치되는 염기서열은 1 내지 30 bp의 길이 일 수 있다.
본 발명에 있어서 주형 염기서열은 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 또는 SNP가 존재하는 표적 유전자 (전장 유전자), 또는 상기 표적 유전자 내의 유전자 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 일부분을 포함하는 것으로, 상기 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 일부분은 약 5 내지 1,000,000 bp, 바람직하게는 약 5 내지 100,000 bp, 더욱 바람직하게는 약 50 내지 500 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은, 상기 시발체를 포함하는 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 돌연변이 또는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 "포워드 프라이머 (forward primer) 및 리버스 프라이머(reverse primer)"로 구성될 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 또는 SNP 를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 시발체를 의미한다. 이러한 프라이머 세트 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 또는 SNP, 및 상기 돌연변이를 포함하는 유전자에 따라서 용이하게 결정할 수 있는 사항이다. 상기 포워드 프라이머 또는 리버스 프라이머의 길이는 연속하는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp 부위와 상보적인 염기서열을 갖는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp로서 설계될 수 있다.
상기 프라이머 또는 시발체는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로, 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태 일 수 있다. 본 발명의 프라이머 또는 시발체는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기와 같은 돌연변이 또는 단일염기다형성 검출용 조성물은 유전자를 증폭하기 위한 다양한 방법에 적용될 수 있다.
본 발명에서 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제 (self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭 (strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭 (loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트 (hotstart) PCR, 네스티드 (nested) PCR 및 부스터 (booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간 (real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR (differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNAends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응 (inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트 (vectorette) PCR, TAIL-PCR (thermal asymmetric interlaced PCR) 및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다.
상기 본 발명의 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 상기의 시발체를 포함하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 키트를 제공한다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 일 양상은 (1) 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 시발체 및; 돌연변이 또는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 이용하여 유전자 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭 방법을 제공한다.
상기 시발체 및 프라이머 세트는 증폭하고자 하는 표적 돌연변이 또는 SNP를 포함할 것으로 예상되는 주형 뉴클레오티드를 포함하는 시료에 대하여 유전자 증폭을 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어, "시료"는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 말한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 (예컨대, 병원성 박테리아 및/또는 바이러스)일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류 (예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다. 예컨대, 유전자 돌연변이 검출을 통한 종양 진단을 위한 경우, 상기 유전자 시료는 진단 대상 환자의 세포로부터 추출된 것일 수 있고, 종양 치료 후 잔존 종양 검사를 위한 경우, 상기 유전자 시료는 종양 치료를 받은 환자의 암세포로부터 추출된 것일 수 있으며, 약제 내성 변이 균주 검출을 위한 경우에는 박테리아 또는 바이러스 등의 균주로부터 추출된 것일 수 있다.
또한, 상기 증폭방법은 (2) 상기 (1) 단계의 유전자 증폭 산물에 대하여 잔존 dNTP를 제거하는 단계; 및 (3) 상기 (2) 단계의 증폭산물에 대하여 단일 염기 확장 (SBE, single base extension)를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명 상기 돌연변이 또는 SNP 증폭 방법의 일 양태에서는 하기의 방법에 의하여 예시적으로 수행될 수 있다.
제 1단계: 프라이머 설계 및 합성
확인하고자 하는 특정 유전자의 염기서열을 확인하고, 센스 프라이머와 안티센스 프라이머, 그리고 특정염기 특이적 시발체를 상기에서 기술한 것처럼 설계한다. 즉, 확인하고자 하는 염기서열을 포함하는 증폭산물 합성을 위해, 해당 염기서열을 중심으로 왼쪽으로 약 50bp 떨어진 염기서열에 상보 결합할 수 있는 센스 프라이머와, 오른쪽으로 약 50bp 떨어진 염기서열에 상보 결합할 수 있는 안티센스 프라이머, 그리고, 특정염기 (돌연변이 염기서열)만 선택적으로 결합할 수 있도록 돌연변이 특이적 시발체를 설계한다.
각각의 프라이머는 바람직하게는 약 60℃ 정도의 Tm 온도와, 40~60 % 정도의 GC 비율이 포함되는 18~25 mer 크기의 올리고뉴클레오타이드가 될수 있다. 돌연변이 특이적 프라이머는 센스 또는 안티센스 어느 쪽이던 상관없으며, 합성 시에는 3' 말단이 돌연변이 염기서열과 결합할 수 있도록 되도록 해야 하며, 3'말단에서 5'쪽으로 2~3bp 떨어진 곳의 염기서열 하나가 정상적인 염기서열과 상보적이지 않은 염기가 되도록 미스 매치 (mismatch)를 부여할 수 있도록 설계한다.
중합효소연쇄반응으로 증폭되는 산물의 크기는 제한되어 있지는 않으나, 대략 90~120 bp 정도가 되도록 함이 오래 보관되어 단편화된 시료를 이용한 증폭에 바람직하다.
제 2단계: 프라이머를 이용한 중합효소연쇄증폭반응
특정 염기서열 존재 여부를 확인하고자 하는 시료 DNA와 3 종류의 프라이머 (센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 돌연변이 특이적 시발체)를 혼합하고, 핫 스타트 중합효소를 이용하여 변성, 어닐링, 확장의 3단계를 45번 반복 수행하는 중합효소반응을 통해 동일한 길이의 정상 유전자와 돌연변이 유전자 산물, 그리고 돌연변이 특이적 프라이머에 의해 추가 증폭된 길이가 짧은 돌연변이 증폭산물을 동시에 증폭시킨다. 이 때, 어닐링 단계의 온도는 56 ℃와 62 ℃의 두 조건에서 수행하며, 56 ℃에서 25번, 62 ℃에서 20번 반응시켰을 경우 대부분의 유전자에서 성공적인 돌연변이 유전자 특이적 추가 증폭이 성공적으로 수행될 수 있으며, 여러 차례의 반복 증폭반응을 통해 조건의 최적화가 가능하다.
이렇게 증폭된 증폭산물 반응의 결과물은 돌연변이 유전자 여부를 확인하고자 하는 샘플시료의 돌연변이 유전자 존재 유무에 따라, 정상 유전자 증폭산물, 정상 유전자 증폭산물과 동일한 크기의 돌연변이 유전자 증폭산물, 그리고 보다 짧은 길이의 돌연변이 유전자만 추가 증폭된 산물의 3 가지가 합성될 수 있다.
제 3단계: iPLEX 반응을 이용한 돌연변이 유전자 확인
UHS 반응을 통해 합성한 각 샘플시료의 증폭산물 5 ㎕에, SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase)혼합물 2㎕를 추가하고 37 ℃에서 40분 반응시켜, 증폭산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP (deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시킨 후, 85 ℃에서 10분 가열반응 시켜 SAP 효소를 비활성화시킨다. 이 후, 확인하고자 하는 돌연변이 염기서열 직전까지 상보 결합하는 올리고뉴클레오타이드 (Unextended primer: UEP 프라이머) 를 Sequenom사에서 판매하는 iPLEX-Pro kit 혼합물과 섞어서 2 ㎕ 추가한 후, 변성, 어닐링, 확장의 3단계를 40번 반복 수행하여, UEP 프라이머의 3' 말단 방향으로 단일염기 확장되도록 한다. 반응이 완료된 후, 15 ㎕ 의 증류수와 resin을 첨가하고 20분간 반응시켜 염 제거 반응을 수행하여 반응을 완료한다. 이 후, SpectroChip II에 대략 10 nl 정도를 집적한 후, MALDI-ToF를 이용하여 분자량 차이를 확인하여, 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인한다.
본 발명의 원리를 도면을 바탕으로 이하 상세히 설명한다.
도 1은 초고감도 돌연변이 증폭법에 대한 개괄적인 도식도이다. 확인하고자 하는 특정 염기서열 (돌연변이 유전자 염기서열)과 해당 위치에서의 정상 염기서열을 A와 C로 각각 표시하였다. 이 부위를 포함하는 증폭산물 합성을 위한 중합효소증폭반응을 위한 센스와 안티센스 프라이머를 각각 forward primer와 reverse primer로 나타내었으며, 상기 설명한 공통 linker 염기서열을 나타내기 위해 주형 DNA와 결합하지 않는 꺾어진 부위를 표시하였다. 확인하고자 하는 특정 돌연변이 염기서열에 특이적인 시발체 (MSP)의 3' 말단은, 해당 돌연변이 염기서열인 A와 정확히 일치하고, 약 2~3bp 앞쪽으로 인위적인 1bp 미스매치가 있도록 설계함을 나타내고 있다. 확인하고자 하는 특정 돌연변이 염기서열이 많을 경우 다중증폭반응이 가능하며, 각 돌연변이 염기서열에 대한 각각의 센스, 안티센스, MSP 시발체를 혼합하여 증폭반응을 수행할 수 있다. 합성된 증폭산물은, 확인하고자 하는 돌연변이 염기서열이 해당 시료에 존재하는지 여부에 따라, 3가지 형태로 합성될 수 있다. 센스와 안티센스 프라이머에 의해 합성된 길이가 같은 정상유전자 증폭산물과 돌연변이 증폭산물, 그리고 돌연변이 특이적 센스 시발체와 안티센스 프라이머에 의해 합성된 짧은 길이의 돌연변이 특이적 추가 증폭산물이 이에 해당한다.
상기 설명한 바와 같이, 돌연변이 특이적 프라이머는 센스와 안티센스 어느 방향으로던 설계 가능하며, 도 1에서는 이해를 돕기 위하여 센스 방향으로 설계되었다고 가정하여 표기하였다.
도 2는 일반적인 PCR 증폭법과 초고감도 돌연변이 증폭법을 사용할 경우 얻을 수 있는 결과를 비교 설명하여 보여주는 그림이다. 돌연변이 유전자가 집중적으로 증폭된 UHS 증폭산물과는 달리, 일반적인 중합효소증폭법으로는 대부분의 증폭산물이 정상유전자임을 보여 주고 있다. 이 후, 증폭산물을 확인하는 iPLEX 반응은 동일하기 때문에, 증폭된 합성산물의 결과에 의해 돌연변이 유전자의 진단 민감도가 결정됨을 알 수 있다.
본 발명에 따른 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체 및 이를 이용한 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭 방법은 상기한 바와 같이, 한번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시킬 수 있으므로, 극도로 낮은 농도로 존재하는 돌연변이 유전자 또는 단일염기 다형성을 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 이에 본 발명자들은 이 방법을 초고감도 돌연변이 증폭법 (Ultra High Sensitive (UHS) method for amplification of mutant DNA) 로 명명하였다. 이러한 UHS 방법을 이용할 경우, 극도로 낮은 농도로 존재하는 특정 염기서열을 확인할 수 있기 때문에, 항암 치료중인 암환자의 암세포 잔존여부나, 혈액 내 극히 낮은 농도로 존재하는 암세포 유래 cell free DNA 진단 등에 활용될 수 있으며, 환자치료 성적 향상은 물론이고 높은 경제적 이익까지 창출할 수 있다. 또한, 일반적인 nested PCR 의 경우 필연적으로 발생하게 되는, 실험 소요 시간의 연장이나 실험 방법의 복잡함, 그리고 물리적으로 나뉘어진 1st PCR과 2nd PCR으로 인한 샘플간의 교차 오염 (cross contamination)과 캐리-오버 오염 (carry-over contamination)등의 위험성을, UHS 방법을 사용하면 원천적으로 차단할 수 있다. 또한 추가 증폭되는 돌연변이 DNA와 함께 정상 DNA도 증폭되기 때문에, 실험오류로 인해 발생할 수 있는 위음성 위험성 역시 배제할 수 있다.
도 1은 초고감도 돌연변이 증폭법에 대한 설명을 나타내는 그림이다.
도 2는 일반적인 PCR 증폭법과 초고감도 돌연변이 증폭법을 비교 설명한 그림이다.
도 3은 일반적인 PCR 증폭법과 초고감도 돌연변이 증폭법을 이용하여 생성한 증폭산물을, iPLEX 반응 수행하여 진단할 경우의 KRAS_Q61H 돌연변이 진단 민감도를 비교한 그림이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. UHS 방법을 이용한 KRAS _ Q61H 돌연변이 진단
UHS방법의 민감도 확인에 필요한 표준 양성 대조군 시료를 준비하기 위해, KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이를 지니는 폐암 세포주인 H460에서 순수 분리한 DNA를, 해당 유전자에 대해 정상 염기서열을 지니는 세포주인 Beas2B에서 순수 분리한 DNA로 점차적으로 희석하여, H460 DNA의 농도가 100%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 그리고 0%가 되도록 준비하였다.
이렇게 준비된 표준 양성 DNA 농도별 희석 시료를 얼마나 낮은 농도에서까지 돌연변이 DNA를 확인할 수 있는지를 확인하였다. 이 때, 센스와 안티센스 프라이머만 포함하는 일반적인 중합효소 증폭반응으로 합성된 산물을 이용한 iPLEX 반응을 함께 수행하여, UHS 반응을 통해 합성한 증폭산물을 이용할 경우의 돌연변이 DNA 진단 민감도를 비교하였다.
실시예 1-1. KRAS _ Q61H 프라이머 제작
본 실시예에 이용된 프라이머 및 시발체의 염기 정보는 하기와 같다.
KRAS _ Q61H 프라이머
KRAS_Q61 센스 프라이머:
5'-ACGTTGGATGCATGTACTGGTCCCTCATTG-3'(서열번호 1)
KRAS_Q61 안티센스 프라이머:
5'-ACGTTGGATGTGGAGAAACCTGTCTCTTGG-3'(서열번호 2)
KRAS_Q61H 특이적 센스 시발체:
5'-ATTCTCGACACAGCAGGTGAY-3'(서열번호 3)
KRAS_Q61H UEP 프라이머:
5'-ATTGCACTGTACTCCTC-3'(서열번호 3)
실시예 1-2. UHS 방법을 이용한 KRAS _ Q61H 돌연변이 증폭
KRAS 유전자의 Codon 61번 부위를 포함하는 증폭산물을 합성하기위한 중합효소증폭반응을 수행하기 위해, 다음과 같은 조건으로 각 시약을 혼합하였다.
먼저, KRAS_Q61H유전자에 대한 센스 프라이머, 안티센스 프라이머, 돌연변이 특이적 프라이머를 각각 0.5 μΜ이 되도록 혼합한 프라이머 믹스 1.2 ㎕를, 10X 중합효소연쇄반응 완충용액 (Qiagen) 0.5 ㎕, 25 mM MgC2 0.7 ㎕, 25 mM dNTP 혼합물0.1 ㎕, HotStarTaq 중합효소 (Qiagen) 0.5 unit과 3차 증류수를 섞어서 총 3㎕로 맞춰준 후, 준비된 표준 양성 DNA 농도별 희석 시료 2㎕를 첨가하여 다음의 조건대로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 94℃ 에서 15분간 둔 후, 94℃ 에서 20초, 56℃ 에서 30초, 72℃에서 60초 반응시키는 조건으로 25 사이클 수행한 후, 다시 94℃ 에서 20초, 62℃ 에서 30초, 72℃에서 60초 반응시키는 조건으로 20 사이클을 더 수행하고, 마지막으로 72℃에서 3분간 더 반응시켰다.
실시예 1-3: iPLEX 반응을 이용한 KRAS _ Q61H 증폭산물 진단
UHS 반응을 통해 증폭한 각 샘플시료의 증폭산물 5 ㎕에, SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물 (Sequenom) 2㎕ 를 추가하고 37?에서 40분 반응시켜, 증폭산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP (deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시킨 후, 85 ℃에서 10분 가열반응 시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 이 후, 7 uM 농도의 KRAS_Q61H UEP 프라이머 1.2 ㎕ 를 Sequenom사에서 판매하는 iPLEX-Pro kit 혼합물 (0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 μl Thermosequenase)과 섞어서 2 ㎕ 추가한 후, 다음의 조건대로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 9 4℃ 에서 30초 둔 후, 94℃ 에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초, 52 ℃ 에서 30초, 80 ℃에서 5초 반응시키는 조건으로 40 사이클 수행한 후, 마지막으로 72 ℃에서 3분간 더 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 15㎕ 의 증류수와 resin을 첨가하고 20분간 반응시켜 염 제거 반응을 수행하여 반응을 완료시켰다. 이 후, SpectroChip II에 대략 10 nl 정도를 집적한 후, MALDI-ToF를 이용하여 분자량 차이를 확인하여, 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 KRAS 유전자의 61번째 코돈의 돌연변이 진단 민감도의 우수성을 일반 증폭법과 비교하여 결과를 보여준 그림이다. 도 3에서는 시료에 KRAS_Q61H 돌연변이 유전자가 포함되어 있는지를 확인할 수 있으며, 얼마나 낮은 농도까지 돌연변이가 확인되는지를 일반 증폭산물과 UHS 증폭산물과 비교해 본 결과를 나타낸다. 도 3에 나타난 바와 같이, 일반 증폭산물의 경우, 전체 시료에서 KRAS_Q61H 돌연변이 염기서열을 지니는 H460 세포주의 gDNA가 5% 이상 존재하는 경우에서만 해당 돌연변이를 확인할 수 있었지만, UHS 증폭산물의 경우에는 0.5% 까지도 정확하게 확인이 되고 있음을 알 수 있다. 두 증폭산물 모두, Beas2B DNA 100%인 경우에는 정상유전자만 확인이 되고 있으며, 주형 DNA를 넣지 않은 water only의 경우에는 KRAS 유전자의 증폭산물이 합성되지 않아, 정상/돌연변이 모두 나타나지 않고 있음을 알 수 있다.
<110> THE ASAN FOUNDATION <120> Ultra High Sensitive Method for Amplification of mutant DNA and primer thereof <130> 1-79p <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61 sense primer <400> 1 acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61 antisense primer <400> 2 acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H specific sense primer <400> 3 attctcgaca cagcaggtga y 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H UEP primer <400> 4 attgcactgt actcctc 17

Claims (9)

  1. (1) 3' 말단에 돌연변이 또는 단일염기다형성 (SNP, single nucleotide polymorphism)에 상보적인 염기서열을 포함하고;
    (2) 상기 (1)의 염기서열로부터 5' 말단 방향으로, 주형 염기 서열과 미스매치된 염기 서열을 포함하는,
    돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체.
  2. 청구항 1에 있어서, (2)의 염기서열은 (1)의 염기서열로부터 5' 말단 방향으로 1 내지 10 bp 거리에 위치하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체.
  3. 청구항 1에 있어서, (2)의 염기서열은 1 내지 30 bp 길이인 것을 특징으로 하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 돌연변이는 치환, 삽입 및 결실로 이루어진 군으로부터 선택된 점돌연변이 (point mutation) 또는 다중 돌연변이 (multiple mutation)인 것을 특징으로 하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 시발체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 시발체를 포함하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 조성물.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 조성물은 돌연변이 또는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 조성물.
  7. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 시발체를 포함하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭용 키트.
  8. (1) 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 시발체 및; 돌연변이 또는 단일염기다형성을 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 이용하여 유전자 증폭을 수행하는 단계;를 포함하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    (2) 상기 (1) 단계의 유전자 증폭 산물에 대하여 잔존 dNTP를 제거하는 단계; 및
    (3) 상기 (2) 단계의 증폭산물에 대하여 단일 염기 확장 (SBE, single base extension)를 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 돌연변이 또는 단일염기다형성 증폭 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2022119423A1 (ko) * 2020-12-04 2022-06-09 주식회사 제노픽스 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물
WO2022131803A1 (ko) * 2020-12-15 2022-06-23 주식회사 제노픽스 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물

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