JP5843112B2 - 標的塩基配列の識別方法 - Google Patents
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Description
本願は、2010年3月29日に日本に出願された、特願2010−075297号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
このように、SNP等の生殖細胞系列変異の検出は、ほぼ定性的な検出といってよく、その方法は比較的容易で簡便な各種方法が実用化されている。
つまり、試料の大部分が正常細胞であって一部変異細胞が含まれる場合、多くの正常な遺伝子中に存在するわずかな変異遺伝子を検出しなければならず、この点が体細胞遺伝子の変異検出と生殖細胞系列における変異検出とで異なる点であり、体細胞の遺伝子変異検出をより困難にしている点である。
一方で、サンプル由来の核酸を、核酸増幅反応により、標準2本鎖核酸とまったく同じ長さとなるように増幅して調製する。得られたサンプル由来2本鎖核酸と標準2本鎖核酸を混合し、熱を加えて2本鎖を変性させた後、徐々に温度を低下させて再び2本鎖を形成させる。このとき、サンプル由来2本鎖核酸の変異部位が、すべて標準2本鎖核酸と同じアデニンであった場合、サンプル由来2本鎖核酸と標準2本鎖核酸との間では鎖の組み換え反応が生じる。理論上は、サンプル由来2本鎖核酸と標準2本鎖核酸の分子数の比が1:1であった場合、組み換わる確率は1/2であり、また元の2本鎖にもどる確率も1/2であり、蛍光共鳴エネルギー移動の程度も1/2となる。サンプル由来2本鎖核酸の変異部位が、すべて標準2本鎖核酸とは異なるグアニンであった場合、鎖組み換えは起こらず、従って蛍光共鳴エネルギー移動の程度は変化しない。これをもって、サンプル中の検出(識別)したい目的の塩基がアデニンであるかグアニンであるかを検出することが可能となる。サンプル由来2本鎖核酸と標準2本鎖核酸との比を増大させることにより、組換えの程度を大きくすることができる。たとえば、サンプル由来2本鎖核酸と標準2本鎖核酸の比が20:1である場合、組換えの割合は20/21、すなわち標準2本鎖核酸が元の2本鎖に戻る確率は1/21となり、蛍光共鳴エネルギー移動の変化が大きくなり検出が容易になる。
(1) 標的塩基配列を識別する方法であって、
試料2本鎖核酸と、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む標準2本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、
前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料2本鎖核酸と前記標準2本鎖核酸とにおいて競合ハイブリダイゼーションを行う降温工程と、
前記標準2本鎖核酸を構成していた核酸鎖と、前記試料2本鎖核酸を構成していた核酸鎖とにより形成された2本鎖核酸を測定する測定工程と、
前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、
を有し、
前記降温工程を、カチオン性くし型重合体の存在下で行い、
前記降温工程において、前記反応液の降温速度が0.2〜3℃/秒であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法、
(2) 前記カチオン性くし型重合体が、カチオン性基を含む高分子鎖である主鎖と、親水性基である側鎖とを有することを特徴とする前記(1)記載の標的塩基配列の識別方法、
(3) 前記カチオン性くし型重合体の主鎖がポリリジンであることを特徴とする前記(2)記載の標的塩基配列の識別方法、
(4) 前記カチオン性くし型重合体の側鎖がデキストランであることを特徴とする前記(2)又は(3)記載の標的塩基配列の識別方法、
(5) 前記カチオン性くし型重合体の主鎖がグアニジル基を含むことを特徴とする前記(2)〜(4)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
(6) 前記カチオン性くし型重合体の主鎖部分の分子量が5,000以上であることを特徴とする前記(2)〜(5)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
(7) 前記試料2本鎖核酸と前記標準2本鎖核酸の鎖長が同一であることを特徴とする前記(1)〜(6)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
(8) 前記標的塩基配列が、遺伝子変異の特定の遺伝子型の変異部位を含む領域と相同的な塩基配列であることを特徴とする前記(1)〜(7)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
(9) 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖が、互いに異なる種類の標識物質によりそれぞれ標識されていることを特徴とする前記(1)〜(8)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
(10) 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖を標識する標識物質と他方の鎖を標識する標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする前記(9)記載の標的塩基配列の識別方法、
(11) 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖が、いずれも蛍光物質により標識されていることを特徴とする前記(9)又は(10)記載の標的塩基配列の識別方法、
(12) 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖が蛍光物質により標識されており、他方の核酸鎖が消光物質により標識されていることを特徴とする前記(9)又は(10)記載の標的塩基配列の識別方法、
(13) 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖が、固相担体と結合可能な標識物質により標識されていることを特徴とする前記(9)〜(12)のいずれかに記載の標的塩基配列の識別方法、
を提供するものである。
なお、本発明及び本願明細書においては、互いに相補的な2つの1本鎖核酸の組み合わせにおいて、それらが2本鎖を形成している場合はもちろんのこと、1本鎖核酸に解離している状態のものも、2本鎖核酸と呼ぶことがある。なぜなら、互いに相補的な1本鎖核酸は、溶液状態で共存していると自然に2本鎖を形成することがあるからである。
反応液中に十分量の鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸が存在していた場合には、試料2本鎖核酸は標準2本鎖核酸と同一であり、標的塩基配列を有していると判断する。一方、十分量の鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸が存在していなかった場合には、試料2本鎖核酸は標準2本鎖核酸と同一ではないと判断することができる。なお、本発明において、「鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸を測定する」とは、鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸自体を検出することに加えて、標準2本鎖核酸に対する鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸の割合を測定することも含む。
その他、近接させた場合に熱エネルギーの放出が生じる組み合わせの分子であってもよい。このような標識物質の組み合わせとしては、Alexa Fluor(登録商標)488(インビトロジェン社製)、ATTO 488(ATTO-TEC GmbH社製)、Alexa Fluor(登録商標)594(インビトロジェン社製)、及びROX(Carboxy-X-rhodamine)からなる群より選択される1とBHQ(登録商標、Black hole quencher)−1又はBHQ(登録商標)−2との組み合わせ等が挙げられる。
なお、グアニンは、FAMが近接した場合にクエンチする能力があるため(Nucleic acids Research 2002,vol.30.no.9 2089-2195)、これを利用してもよい。例えば、標準2本鎖核酸の一方の鎖の3’端部をFAMで標識した場合であって、他方の鎖の5’末端の塩基がグアニンである場合には、当該他方の鎖を標識物質で標識せずともよい。
例えば、一方の核酸鎖の5’末端をフルオレッセイン等のドナー標識物質で標識し、もう一方の核酸鎖の3’末端をDABCYL等のアクセプター標識物質で標識する。この二つの標識された核酸鎖を混合して標準標識2本鎖核酸とする。標識された核酸鎖は、標識の導入も含めて化学合成を利用して調製することができる。
実際に試料中の遺伝子変異を検出するには、PCRにて増幅した反応液、標準標識2本鎖核酸、カチオン性くし型重合体を添加して反応液を調製する。この反応液を90℃程度で熱処理を行って変性し、それから、反応液の温度を、標準標識2本鎖核酸のTm値程度、例えば70℃程度まで、0.2℃/秒以上、例えば2℃/秒程度の降温速度で下げることにより、競合ハイブリダイゼーションを行い、最後に蛍光測定を行う。蛍光測定を行う温度は、70℃でもよく、室温付近でもよい。また、リアルタイム−PCR装置等を使って降温中の蛍光変化を逐次測定してもよい。得られた蛍光値から、鎖組み換えにより形成された2本鎖核酸を測定して鎖の組換えの程度を判断し、試料中の核酸の塩基配列が、標準標識2本鎖核酸と同じかどうかを判定する。蛍光測定の測定誤差等を小さくするため、熱変性処理前の反応液の蛍光値、あるいは熱変性処理時の蛍光値を利用して補正することもできる。
がん遺伝子であるKRASのコドン12の遺伝子変異を識別対象の変異部位とし、当該変異部位を含む部分領域の塩基配列を標的塩基配列として、試料2本鎖核酸の遺伝子型が、標準2本鎖核酸の遺伝子型と同一か否かを、本発明の識別方法を用いて識別した。なお、使用する標準2本鎖核酸及び試料2本鎖核酸は、常法の化学合成法により調製した。
まず、コドン12の野生型(Wild)及び変異型(G12S)の標準2本鎖核酸をそれぞれ作製した。変異型(G12S)は、コドン12の点突然変異により、グリシンがセリンに改変されている変異型である。各標準2本鎖核酸は、一方の核酸鎖の両末端をFAM標識(グレンリサーチ社製)し、他方の核酸鎖の両末端をDABCYL標識(グレンリサーチ社製)した。各遺伝子型の標準2本鎖核酸は、構成する2本の核酸鎖を1本ずつ化学合成したものをハイブリダイズさせることにより調製した。表1に、化学合成した核酸鎖の配列を、遺伝子型ごとに示す。表1中、コドン12及びコドン13は下線で示し、変異部位は小文字で表した。また、「6−FAM」はFAM標識を、「DAB」はDABCYL標識を、右欄の数字は配列表中の対応する配列番号を、それぞれ示す。
また、表1に記載の塩基配列と同じ塩基配列であって、標識のないものを合成し、互いに相補的な核酸鎖同士を混合したものを、試料2本鎖核酸とした。
図中、CP(−)はポリマーを添加しなかった場合の結果を、CP1〜CP3は各ポリマーを添加した結果を、それぞれ示す。
図2(A)は、試料2本鎖核酸と標識標準2本鎖核酸の塩基配列がいずれもG12Sであり、両者が完全に一致する場合の温度変化に対する蛍光変化である。標識標準2本鎖核酸は、過剰に存在する試料2本鎖核酸により競合され、鎖組換え反応が起こる。この場合には、FAMの蛍光はDABCYLで消光することができず、温度が降下してもFAMの蛍光は一定の値を保つ。
一方、図2(B)は、試料2本鎖核酸が野生型であり、標識標準2本鎖核酸がG12Sであり、両者が1塩基異なる場合を示したものである。この場合には、標識標準2本鎖核酸と試料2本鎖核酸の両方がそれぞれで優先的に2本鎖を形成するために、鎖の組み換えは起きにくい。従って、鎖組み換えによる2本鎖核酸の形成とともに、FAMの蛍光はDABCYLで消光され低下する。
図2(C)は、温度変化のプロフィールを示す。35℃で15分間保持し、その後、第1回目の温度降下では、95℃から65℃まで0.25℃/分の速度で比較的ゆっくり降下させた。ふたたび95℃に加熱し、第2回目の温度降下では、65℃まで1℃/分で温度を降下させた。再度95℃に加熱し、第3回目の温度降下では、96℃/分で35℃まで温度降下させたことを示す。
図3は、図2(B)の第3回目の温度降下(96℃/分)の部分を拡大して表したものである。
なお、CP3のポリマーを添加した場合に、第1回目と第2回目の温度降下で蛍光が減少しなかった。これは、CP3のポリマーを添加したことにより、標準2本鎖核酸のTm値が降下し、第1回目と第2回目の65℃までの温度降下では2本鎖が形成されなかったためと考えられる。第3回目の温度降下で35℃まで降下させることにより、2本鎖を形成されたため、効果が観察されたものである。
PCRにより調製した試料2本鎖核酸を用いて、実施例1と同様にして、KRASのコドン12の野生型(Wild)及び変異型(G12S)を、本発明の識別方法を用いて識別した。カチオン性くし型重合体として、実施例1で最も効果が高かったCP2のポリマーを用いた。
本発明の識別方法を用いて、アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ALDH2)のアルコール代謝に関与するといわれているSNPを識別して検出した。カチオン性くし型重合体として、実施例1で最も効果が高かったCP2のポリマーを用いた。
また、「6−FAM」、「DAB」、右欄の数字は、表1と同じである。
一方、INDEX値がプラスで十分大きい値の場合には、試料2本鎖核酸と標識標準2本鎖核酸の塩基配列に違いがあることを示している。
これに対して、図5(B)に示すように、カチオン性くし型重合体を添加した場合には、FAMのINDEX値が、試料2本鎖核酸がGアリルホモの場合にプラスで十分大きく、Aアリルホモの場合にゼロに近い値であり、遺伝子型Gと遺伝子型Aを明瞭に識別することができた。
これらの結果から、反応液中にカチオン性くし型重合体を添加することにより、反応液の温度を高速で降下させた場合でも、競合ハイブリダイゼーションにより1塩基の識別が可能であることが明らかになった。また、本実施例により、蛍光標識の異なる対立する遺伝子型に対応する標識標準2本鎖核酸を同時に存在させることにより、両方の遺伝子型の同時検出も可能であることが明らかとなった。
Claims (13)
- 標的塩基配列を識別する方法であって、
試料2本鎖核酸と、標的塩基配列と同一の塩基配列を含む標準2本鎖核酸とを、一の反応液内において熱変性処理する熱変性工程と、
前記熱変性工程の後、前記反応液の温度を低下させることにより、前記試料2本鎖核酸と前記標準2本鎖核酸とにおいて競合ハイブリダイゼーションを行う降温工程と、
前記標準2本鎖核酸を構成していた核酸鎖と、前記試料2本鎖核酸を構成していた核酸鎖とにより形成された2本鎖核酸を測定する測定工程と、
前記測定工程により得られた測定結果に基づき、前記標準2本鎖核酸と前記試料2本鎖核酸との同一性を識別する識別工程と、
を有し、
前記降温工程を、カチオン性くし型重合体の存在下で行い、
前記降温工程において、前記反応液の降温速度が0.2〜3℃/秒であることを特徴とする、標的塩基配列の識別方法。 - 前記カチオン性くし型重合体が、カチオン性基を含む高分子鎖である主鎖と、親水性基である側鎖とを有することを特徴とする請求項1記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記カチオン性くし型重合体の主鎖がポリリジンであることを特徴とする請求項2記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記カチオン性くし型重合体の側鎖がデキストランであることを特徴とする請求項2又は3記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記カチオン性くし型重合体の主鎖がグアニジル基を含むことを特徴とする請求項2〜4のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記カチオン性くし型重合体の主鎖部分の分子量が5,000以上であることを特徴とする請求項2〜5のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記試料2本鎖核酸と前記標準2本鎖核酸の鎖長が同一であることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標的塩基配列が、遺伝子変異の特定の遺伝子型の変異部位を含む領域と相同的な塩基配列であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖が、互いに異なる種類の標識物質によりそれぞれ標識されていることを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖を標識する標識物質と他方の鎖を標識する標識物質との間で、エネルギー移動が可能であることを特徴とする請求項9記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖が、いずれも蛍光物質により標識されていることを特徴とする請求項9又は10記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖が蛍光物質により標識されており、他方の核酸鎖が消光物質により標識されていることを特徴とする請求項9又は10記載の標的塩基配列の識別方法。
- 前記標準2本鎖核酸を構成する2本の核酸鎖のうち、一方の核酸鎖が、固相担体と結合可能な標識物質により標識されていることを特徴とする請求項9〜12のいずれか一項に記載の標的塩基配列の識別方法。
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