JP2003174882A - 核酸の識別方法及び核酸の検査キット - Google Patents
核酸の識別方法及び核酸の検査キットInfo
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- JP2003174882A JP2003174882A JP22816399A JP22816399A JP2003174882A JP 2003174882 A JP2003174882 A JP 2003174882A JP 22816399 A JP22816399 A JP 22816399A JP 22816399 A JP22816399 A JP 22816399A JP 2003174882 A JP2003174882 A JP 2003174882A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 目的核酸を含む第１の核酸１と、前記目
的核酸中の特定領域と相補な塩基配列を有する第２の核
酸２とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行い、両核酸間で相補鎖の置換が生じた程度を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との同一性
を識別する方法において、上記第１核酸１及び第２核酸
２の一方又は双方に互いにエネルギー転位可能な少なく
とも２種の標識を導入して、上記相補鎖の置換に伴う上
記標識間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合
を測定することにより、相補鎖の置換が生じた程度を測
定することを特徴とする核酸の識別方法及び該識別方法
を実施するための検査キット。 【効果】 検体中の微量な遺伝子の変異又は多型を有す
る核酸の有無及びその割合を煩雑な固液の分離作業を必
要としない均一系において、簡易な操作で多数の検体に
ついての多数の遺伝子の変異又は多型を正確かつ迅速に
検出、定量し得るものである。
的核酸中の特定領域と相補な塩基配列を有する第２の核
酸２とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行い、両核酸間で相補鎖の置換が生じた程度を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との同一性
を識別する方法において、上記第１核酸１及び第２核酸
２の一方又は双方に互いにエネルギー転位可能な少なく
とも２種の標識を導入して、上記相補鎖の置換に伴う上
記標識間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合
を測定することにより、相補鎖の置換が生じた程度を測
定することを特徴とする核酸の識別方法及び該識別方法
を実施するための検査キット。 【効果】 検体中の微量な遺伝子の変異又は多型を有す
る核酸の有無及びその割合を煩雑な固液の分離作業を必
要としない均一系において、簡易な操作で多数の検体に
ついての多数の遺伝子の変異又は多型を正確かつ迅速に
検出、定量し得るものである。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、核酸の識別方法、
及び検査キットに関し、更に詳述すると、遺伝子の変異
又は多型を有する核酸の有無及びその割合を検体から、
固液の分離作業を必要としない簡易な操作により、直接
短時間で検出、定量することができる核酸の識別方法及
び該識別方法を実施するための検査キットに関する。
及び検査キットに関し、更に詳述すると、遺伝子の変異
又は多型を有する核酸の有無及びその割合を検体から、
固液の分離作業を必要としない簡易な操作により、直接
短時間で検出、定量することができる核酸の識別方法及
び該識別方法を実施するための検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】最近の
分子生物学の進歩は著しく、ヒト遺伝子の全塩基配列の
解読も現実のものとなってきている。また、遺伝子の多
型と疾患との関係に関するデータも日々刻々と蓄積され
てきており、ヒト遺伝子全領域の多型解析も進展しつつ
ある。このような状況下、数多くの遺伝子領域での数多
くの遺伝子変異又は多型を正確に（換言すれば一塩基の
変異も正確に）、かつ短時間で検出することは、今後の
医療現場における極めて重要な課題である。
分子生物学の進歩は著しく、ヒト遺伝子の全塩基配列の
解読も現実のものとなってきている。また、遺伝子の多
型と疾患との関係に関するデータも日々刻々と蓄積され
てきており、ヒト遺伝子全領域の多型解析も進展しつつ
ある。このような状況下、数多くの遺伝子領域での数多
くの遺伝子変異又は多型を正確に（換言すれば一塩基の
変異も正確に）、かつ短時間で検出することは、今後の
医療現場における極めて重要な課題である。
【０００３】このような遺伝子の変異を検出する方法と
しては、オリゴヌクレオチドプローブを用いる検出方法
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２７
８，（１９８３））、制限酵素切断片長多型解析法（Ｒ
ＦＬＰ法）を利用する方法（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，６９，２０１（１９８０））、リボヌクレアー
ゼを利用してＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド中の１塩
基のミスマッチを切断する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
０，１２４３（１９８５））、或いは遺伝子増幅法を利
用する変異検出方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．８８，１８９（１９９１），Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１８６，６４−６８（１９９０））などが報
告されている。
しては、オリゴヌクレオチドプローブを用いる検出方法
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２７
８，（１９８３））、制限酵素切断片長多型解析法（Ｒ
ＦＬＰ法）を利用する方法（Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎ
ｅｔ．，６９，２０１（１９８０））、リボヌクレアー
ゼを利用してＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド中の１塩
基のミスマッチを切断する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
０，１２４３（１９８５））、或いは遺伝子増幅法を利
用する変異検出方法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．８８，１８９（１９９１），Ａｎａｌ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．１８６，６４−６８（１９９０））などが報
告されている。
【０００４】しかしながら、いずれの方法も塩基配列が
知られている特定変異の検出に限られると共に、操作も
煩雑であるため、医療現場における遺伝子変異の測定に
適した方法とは言えないものである。
知られている特定変異の検出に限られると共に、操作も
煩雑であるため、医療現場における遺伝子変異の測定に
適した方法とは言えないものである。
【０００５】一方、検体中の目的核酸のある領域の不特
定変異（位置、塩基）を検出する方法としてはＳＳＣＰ
（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、単鎖コンフォメーショ
ン多型性）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８６，２７６６（１９８９））、ＤＧＧＥ法（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２３２，
（１９８９））、ｄｄＦ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３，
４４１（１９９２））などが報告されている。
定変異（位置、塩基）を検出する方法としてはＳＳＣＰ
（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ、単鎖コンフォメーショ
ン多型性）法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．８６，２７６６（１９８９））、ＤＧＧＥ法（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２３２，
（１９８９））、ｄｄＦ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １３，
４４１（１９９２））などが報告されている。
【０００６】しかしながら、上記いずれの方法も再現性
が低く、しかも検出に電気泳動法を使用するため、迅速
性に欠け、実用性が低いという問題があった。また、自
動シークエンサーにより目的核酸の塩基配列を決定し、
変異を検出する方法も考えられるが、検体が混合物であ
ったり、変異核酸の割合が少ない場合には検出すること
が不可能であった。
が低く、しかも検出に電気泳動法を使用するため、迅速
性に欠け、実用性が低いという問題があった。また、自
動シークエンサーにより目的核酸の塩基配列を決定し、
変異を検出する方法も考えられるが、検体が混合物であ
ったり、変異核酸の割合が少ない場合には検出すること
が不可能であった。
【０００７】近年、極微量のピペティング技術を利用し
たマイクロチップ型測定技術が開発され、新薬の研究や
遺伝子の多型解析などへの応用が期待されている。この
方法は微小な担体表面に数万種類のＤＮＡプローブを固
相化し、標識した検体とハイブリダイゼーションするこ
とにより変異核酸を検出する方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，４９７５−４９８２（１９９
８））であり、一度に大量の検体が処理できるため、大
幅な省力化が図れるが、再現性が低く、しかも特殊な装
置を用いるためコスト高となるという問題がある。
たマイクロチップ型測定技術が開発され、新薬の研究や
遺伝子の多型解析などへの応用が期待されている。この
方法は微小な担体表面に数万種類のＤＮＡプローブを固
相化し、標識した検体とハイブリダイゼーションするこ
とにより変異核酸を検出する方法（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，４９７５−４９８２（１９９
８））であり、一度に大量の検体が処理できるため、大
幅な省力化が図れるが、再現性が低く、しかも特殊な装
置を用いるためコスト高となるという問題がある。
【０００８】そこで、本出願人は、特定領域の不特定変
異などの迅速な識別方法として、標識した試料ＤＮＡに
非標識の標準ＤＮＡを過剰量加え、コンペティティブハ
イブリダイゼーションを行うことにより、核酸の種類に
関係なく遺伝子の変異又は多型の有無を検出でき、その
存在比も容易に算出できる方法を開発し、既に提案して
いる（以下、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法と略記する。国際公開
ＷＯ９５／０２０６８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．２２，１５４１（１９９４））。
異などの迅速な識別方法として、標識した試料ＤＮＡに
非標識の標準ＤＮＡを過剰量加え、コンペティティブハ
イブリダイゼーションを行うことにより、核酸の種類に
関係なく遺伝子の変異又は多型の有無を検出でき、その
存在比も容易に算出できる方法を開発し、既に提案して
いる（以下、ＰＣＲ−ＰＨＦＡ法と略記する。国際公開
ＷＯ９５／０２０６８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅ
ｓ．２２，１５４１（１９９４））。
【０００９】このＰＣＲ−ＰＨＦＡ法によれば、正常遺
伝子中に微量にしか存在しない変異又は多型遺伝子や変
異又は多型の種類が不特定の場合であっても確実に検出
又は定量することができ、実際、遺伝病に関連する遺伝
子又は癌関連遺伝子等の遺伝子変異や多型を有する核酸
の検出において大いに威力を発揮している（Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９５，１９８−２０
３）。
伝子中に微量にしか存在しない変異又は多型遺伝子や変
異又は多型の種類が不特定の場合であっても確実に検出
又は定量することができ、実際、遺伝病に関連する遺伝
子又は癌関連遺伝子等の遺伝子変異や多型を有する核酸
の検出において大いに威力を発揮している（Ｂｒｉｔｉ
ｓｈ Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ９５，１９８−２０
３）。
【００１０】しかしながら、このＰＣＲ−ＰＨＦＡ法
は、コンペティティブハイブリダイゼーション後の操作
に、煩雑な固液の分離作業を必要とし、最前線の医療現
場において簡易な操作で遺伝子の変異又は多型を有する
核酸を迅速に検出するという要望には十分に対応し得て
いない。
は、コンペティティブハイブリダイゼーション後の操作
に、煩雑な固液の分離作業を必要とし、最前線の医療現
場において簡易な操作で遺伝子の変異又は多型を有する
核酸を迅速に検出するという要望には十分に対応し得て
いない。
【００１１】更に、遺伝子変異と疾患との関連は非常に
複雑多岐にわたっており、当初発見された単一の遺伝子
変異により病気を発症するようなケースは比較的稀であ
り、予想以上に数多くの遺伝子変異が病気の発症に関わ
っていることが明らかになってきており、ある病気の原
因となる遺伝子変異を調べるには複数遺伝子について多
数の変異を漏れなく調べることが必要であり、このた
め、更なる簡易かつ迅速に大量の検体を自動的に処理す
ることができる核酸の検出方法の開発が望まれている。
複雑多岐にわたっており、当初発見された単一の遺伝子
変異により病気を発症するようなケースは比較的稀であ
り、予想以上に数多くの遺伝子変異が病気の発症に関わ
っていることが明らかになってきており、ある病気の原
因となる遺伝子変異を調べるには複数遺伝子について多
数の変異を漏れなく調べることが必要であり、このた
め、更なる簡易かつ迅速に大量の検体を自動的に処理す
ることができる核酸の検出方法の開発が望まれている。
【００１２】最近、Ｇｅｌｆａｎｄらは、図４に示した
ように、一対の１３塩基対のオリゴヌクレオチドのそれ
ぞれの５’末端を蛍光物質Ａ，Ｄで標識し、２本鎖を形
成した場合には蛍光エネルギー転位が起こること、一
方、競合するオリゴヌクレオチドを加えた場合、元の２
本鎖との組換えが起きれば蛍光エネルギー転位の程度が
変化することを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，６１１３-６１１８（１
９９９））。即ち、エネルギー転位を利用すれば元の２
本鎖ＤＮＡと組換えが起きて形成された２本鎖ＤＮＡの
安定性の違いを測定できることを示している。
ように、一対の１３塩基対のオリゴヌクレオチドのそれ
ぞれの５’末端を蛍光物質Ａ，Ｄで標識し、２本鎖を形
成した場合には蛍光エネルギー転位が起こること、一
方、競合するオリゴヌクレオチドを加えた場合、元の２
本鎖との組換えが起きれば蛍光エネルギー転位の程度が
変化することを報告している（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，６１１３-６１１８（１
９９９））。即ち、エネルギー転位を利用すれば元の２
本鎖ＤＮＡと組換えが起きて形成された２本鎖ＤＮＡの
安定性の違いを測定できることを示している。
【００１３】しかしながら、この方法では、オリゴヌク
レオチドのそれぞれの鎖の５’末端に蛍光エネルギー転
位可能な標識があるため、オリゴヌクレオチド鎖が長く
なれば、両標識間の距離が長くなり、それに伴ってＤＮ
Ａ組換えによるエネルギー転位の変化の程度も小さくな
り、検出が困難となる場合がある。特に、遺伝子の変異
や多型を確実に感度良く検出するには、通常、ある程度
の鎖長が必要になるため、十分な成果を挙げられないと
いう問題がある。
レオチドのそれぞれの鎖の５’末端に蛍光エネルギー転
位可能な標識があるため、オリゴヌクレオチド鎖が長く
なれば、両標識間の距離が長くなり、それに伴ってＤＮ
Ａ組換えによるエネルギー転位の変化の程度も小さくな
り、検出が困難となる場合がある。特に、遺伝子の変異
や多型を確実に感度良く検出するには、通常、ある程度
の鎖長が必要になるため、十分な成果を挙げられないと
いう問題がある。
【００１４】本発明は、上記事情に鑑みなされたもの
で、遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無及びその
割合を検体から固液の分離作業を必要としない簡易な操
作により、直接短時間で正確に検出、定量することがで
き、更には自動化も可能な核酸の識別方法及びこの識別
方法を実施するための検査キットを提供することを目的
とする。
で、遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無及びその
割合を検体から固液の分離作業を必要としない簡易な操
作により、直接短時間で正確に検出、定量することがで
き、更には自動化も可能な核酸の識別方法及びこの識別
方法を実施するための検査キットを提供することを目的
とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明は、上記目的を達成するため、第１の核酸と第２の
核酸とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行い、両核酸間で相補鎖の置換が生じた程度を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との同一性
を識別する方法において、（１）２本鎖核酸である上記
第１核酸の一方の鎖の３’端部に互いにエネルギー転位
可能な少なくとも２種の標識の一方を導入すると共に、
該第１核酸の他方の鎖の５’端部に他方の標識を導入し
て第１核酸を標識し、この標識第１核酸と１本鎖又は２
本鎖核酸である非標識の上記第２核酸とを混合してコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識
間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定
することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じ
た相補鎖の置換の程度を測定すること、又は（２）互い
にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識の一方を
上記第１核酸に導入して調製した標識第１核酸と、他方
の標識を上記第２核酸に導入して調製した標識第２核酸
とを、下記（イ）〜（ハ）の組み合わせで混合してコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識
間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定
することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じ
た相補鎖の置換の程度を測定すること（イ）上記第１核
酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸であり、一方の鎖
の３’端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、該
標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリダイズすべき側の
鎖の５’端部に他方の標識を導入した標識第２核酸との
組み合わせ、（ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一
方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標識第１核酸
と、１本鎖核酸である上記第２核酸の５’端部に他方の
標識を導入した標識第２核酸との組み合わせ、（ハ）２
本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’端部に一
方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核酸である
上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入した標識第
２核酸との組み合わせ、を提供する。
発明は、上記目的を達成するため、第１の核酸と第２の
核酸とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行い、両核酸間で相補鎖の置換が生じた程度を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との同一性
を識別する方法において、（１）２本鎖核酸である上記
第１核酸の一方の鎖の３’端部に互いにエネルギー転位
可能な少なくとも２種の標識の一方を導入すると共に、
該第１核酸の他方の鎖の５’端部に他方の標識を導入し
て第１核酸を標識し、この標識第１核酸と１本鎖又は２
本鎖核酸である非標識の上記第２核酸とを混合してコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識
間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定
することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じ
た相補鎖の置換の程度を測定すること、又は（２）互い
にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識の一方を
上記第１核酸に導入して調製した標識第１核酸と、他方
の標識を上記第２核酸に導入して調製した標識第２核酸
とを、下記（イ）〜（ハ）の組み合わせで混合してコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識
間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定
することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じ
た相補鎖の置換の程度を測定すること（イ）上記第１核
酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸であり、一方の鎖
の３’端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、該
標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリダイズすべき側の
鎖の５’端部に他方の標識を導入した標識第２核酸との
組み合わせ、（ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一
方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標識第１核酸
と、１本鎖核酸である上記第２核酸の５’端部に他方の
標識を導入した標識第２核酸との組み合わせ、（ハ）２
本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’端部に一
方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核酸である
上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入した標識第
２核酸との組み合わせ、を提供する。
【００１６】即ち、本出願人が、先に提案したＰＣＲ−
ＰＨＦＡ法は、検体中の目的核酸の特定領域を増幅し
て、２本鎖の試料核酸を調製し、一方の鎖に固相担体と
結合可能な部位を有し、かつ他方の鎖に検出可能な標識
を有する２本鎖核酸からなる標識標準核酸に、上記試料
核酸を過剰量加えてコンペティティブハイブリダイゼー
ションを行い、その結果、再構成された上記標識標準核
酸を上記検出可能な標識物と固相担体に結合可能な部位
を有する標識物とを利用して検出することによって、上
記試料核酸と上記標識標準核酸との間で相補鎖の置換が
生じた程度を測定することにより、遺伝子の変異又は多
型を有する核酸を検出するものであるが、上述のよう
に、この方法では検出に検出可能な標識物と固相担体に
結合可能な部位を有する標識物とを用いているため、面
倒な固液分離作業が必要となり、簡易な操作でしかも迅
速かつ正確な検出が要求される医療現場においては幅広
く採用されるには至っていなかった。
ＰＨＦＡ法は、検体中の目的核酸の特定領域を増幅し
て、２本鎖の試料核酸を調製し、一方の鎖に固相担体と
結合可能な部位を有し、かつ他方の鎖に検出可能な標識
を有する２本鎖核酸からなる標識標準核酸に、上記試料
核酸を過剰量加えてコンペティティブハイブリダイゼー
ションを行い、その結果、再構成された上記標識標準核
酸を上記検出可能な標識物と固相担体に結合可能な部位
を有する標識物とを利用して検出することによって、上
記試料核酸と上記標識標準核酸との間で相補鎖の置換が
生じた程度を測定することにより、遺伝子の変異又は多
型を有する核酸を検出するものであるが、上述のよう
に、この方法では検出に検出可能な標識物と固相担体に
結合可能な部位を有する標識物とを用いているため、面
倒な固液分離作業が必要となり、簡易な操作でしかも迅
速かつ正確な検出が要求される医療現場においては幅広
く採用されるには至っていなかった。
【００１７】また、上記Ｇｅｌｆａｎｄらの方法では、
図４に示したように、一対のオリゴヌクレオチドが１３
塩基対程度の短いものあれば、標識Ｄと標識Ａとが比較
的近い状態にあるので標識間のエネルギー転位が起こる
が、上述のように塩基対の長さが長くなると標識Ｄと標
識Ａとの距離が長くなり、標識間のエネルギー転位が起
こらなくなり、又は非常に少なくなって、多種多様な長
さの遺伝子断片を用い遺伝子の変異又は多型を有する核
酸の同一性を識別するのは困難である。
図４に示したように、一対のオリゴヌクレオチドが１３
塩基対程度の短いものあれば、標識Ｄと標識Ａとが比較
的近い状態にあるので標識間のエネルギー転位が起こる
が、上述のように塩基対の長さが長くなると標識Ｄと標
識Ａとの距離が長くなり、標識間のエネルギー転位が起
こらなくなり、又は非常に少なくなって、多種多様な長
さの遺伝子断片を用い遺伝子の変異又は多型を有する核
酸の同一性を識別するのは困難である。
【００１８】それに対して、上記本発明の識別方法で
は、互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識
を用い、両標識間でのエネルギー転位によるエネルギー
変化の度合を測定することにより、コンペティティブハ
イブリダイゼーションによる相補鎖の置換が生じた程度
を測定するようになっているので、固液分離作業等の煩
雑な作業を要することなく、迅速かつ簡便に第１核酸と
第２核酸との同一性を識別することができ、しかも両標
識が互いに近接する３’端部と５’端部とに導入されて
いるので、相補鎖の置換が生じた程度を正確かつ確実に
捕えることができる上、第１核酸又は第２核酸が鎖の長
い遺伝子断片であっても常に良好な感度をもって正確か
つ確実に相補鎖の置換の程度を測定し得、核酸の同一性
を正確かつ安定的に識別することができるものである。
は、互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識
を用い、両標識間でのエネルギー転位によるエネルギー
変化の度合を測定することにより、コンペティティブハ
イブリダイゼーションによる相補鎖の置換が生じた程度
を測定するようになっているので、固液分離作業等の煩
雑な作業を要することなく、迅速かつ簡便に第１核酸と
第２核酸との同一性を識別することができ、しかも両標
識が互いに近接する３’端部と５’端部とに導入されて
いるので、相補鎖の置換が生じた程度を正確かつ確実に
捕えることができる上、第１核酸又は第２核酸が鎖の長
い遺伝子断片であっても常に良好な感度をもって正確か
つ確実に相補鎖の置換の程度を測定し得、核酸の同一性
を正確かつ安定的に識別することができるものである。
【００１９】従って、本発明の識別方法によれば、上記
第１核酸及び第２核酸の一方を目的核酸を含む試料核酸
とし、他方をこの試料核酸との同一性を識別するための
標準核酸とすることにより、多数の検体の多数の遺伝子
の変異又は多型を有する核酸を迅速かつ正確に検出、定
量することができると共に、従来の煩雑な固液の分離作
業を必要としない簡易な方法で、自動化も可能となり、
最前線の医療現場での要望に応えることができるもので
ある。またこの場合、検体中に遺伝子の変異や多型を有
する核酸が極微量であったり、正常核酸と変異核酸（野
生型遺伝子と変異遺伝子）とがわずか１塩基異なる場合
であっても正確に簡易な操作で検出、定量することがで
きるものである。
第１核酸及び第２核酸の一方を目的核酸を含む試料核酸
とし、他方をこの試料核酸との同一性を識別するための
標準核酸とすることにより、多数の検体の多数の遺伝子
の変異又は多型を有する核酸を迅速かつ正確に検出、定
量することができると共に、従来の煩雑な固液の分離作
業を必要としない簡易な方法で、自動化も可能となり、
最前線の医療現場での要望に応えることができるもので
ある。またこの場合、検体中に遺伝子の変異や多型を有
する核酸が極微量であったり、正常核酸と変異核酸（野
生型遺伝子と変異遺伝子）とがわずか１塩基異なる場合
であっても正確に簡易な操作で検出、定量することがで
きるものである。
【００２０】なお、本発明において、５’端部及び３’
端部とは、核酸鎖の５’末端及び３’末端からそれぞれ
３０塩基以内の範囲を示すものである。この場合、５’
末端及び３’末端に近ければ近いほどエネルギー転位を
起こし易いため、好ましくはそれぞれの末端から１０塩
基以内であり、最も好ましくは５’末端及び３’末端で
ある。
端部とは、核酸鎖の５’末端及び３’末端からそれぞれ
３０塩基以内の範囲を示すものである。この場合、５’
末端及び３’末端に近ければ近いほどエネルギー転位を
起こし易いため、好ましくはそれぞれの末端から１０塩
基以内であり、最も好ましくは５’末端及び３’末端で
ある。
【００２１】また、本発明は、上記本発明の識別方法を
実施するためのキットとして、検体中の目的核酸の特定
領域を増幅して試料核酸を調製するための試料核酸増幅
用試薬と、目的核酸との同一性を識別する標準核酸を調
製するための標準核酸増幅用試薬と、互いに近接した状
態でエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を試料
核酸及び標準核酸のいずれか一方又は双方に導入するた
めの試薬とを具備したことを特徴とする核酸の検査キッ
トを提供する。
実施するためのキットとして、検体中の目的核酸の特定
領域を増幅して試料核酸を調製するための試料核酸増幅
用試薬と、目的核酸との同一性を識別する標準核酸を調
製するための標準核酸増幅用試薬と、互いに近接した状
態でエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を試料
核酸及び標準核酸のいずれか一方又は双方に導入するた
めの試薬とを具備したことを特徴とする核酸の検査キッ
トを提供する。
【００２２】この検査キットによれば、本発明の識別方
法に従って検体中の微量の変異又は多型遺伝子を有する
核酸を迅速に、簡単な操作で確実に検出することができ
ると共に、自動化も達成でき、最前線の医療現場におい
て極めて有用なものである。
法に従って検体中の微量の変異又は多型遺伝子を有する
核酸を迅速に、簡単な操作で確実に検出することができ
ると共に、自動化も達成でき、最前線の医療現場におい
て極めて有用なものである。
【００２３】以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の核酸の識別方法は、第1の核酸と、第２の核酸
とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーション
を行い、相補鎖の置換が生じた程度を測定することによ
り、上記第1核酸と、第２核酸との同一性を識別する方
法において、上記第１核酸及び第２核酸の一方又は双方
に互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を
導入して、上記相補鎖の置換に伴う上記標識間でのエネ
ルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定すること
により、相補鎖の置換が生じた程度を測定するものであ
り、従来のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法における２つの標識の代
わりに互いに近接した状態でエネルギー転位可能な少な
くとも２種の標識（例えば、励起により蛍光を発生する
ドナー標識と、その蛍光を吸収するアクセプター標識）
を第１核酸及び／又は第２核酸に導入して、コンペティ
ティブハイブリダイゼーション（相補鎖置換反応）を行
うものである。
本発明の核酸の識別方法は、第1の核酸と、第２の核酸
とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーション
を行い、相補鎖の置換が生じた程度を測定することによ
り、上記第1核酸と、第２核酸との同一性を識別する方
法において、上記第１核酸及び第２核酸の一方又は双方
に互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を
導入して、上記相補鎖の置換に伴う上記標識間でのエネ
ルギー転位によるエネルギー変化の度合を測定すること
により、相補鎖の置換が生じた程度を測定するものであ
り、従来のＰＣＲ−ＰＨＦＡ法における２つの標識の代
わりに互いに近接した状態でエネルギー転位可能な少な
くとも２種の標識（例えば、励起により蛍光を発生する
ドナー標識と、その蛍光を吸収するアクセプター標識）
を第１核酸及び／又は第２核酸に導入して、コンペティ
ティブハイブリダイゼーション（相補鎖置換反応）を行
うものである。
【００２４】本発明識別方法の第１の手法は、２種の標
識の一方を２本鎖核酸である第1核酸の一方の鎖の３’
端部に導入すると共に、該第１核酸の他方の鎖の５’端
部に他方の標識を導入して、標識第１核酸を調製すると
共に、該標識第１核酸に２本鎖又は１本鎖の非標識第２
核酸を混合してコンペティティブハイブリダイゼーショ
ンを行い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度合を
測定することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に
生じた相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２
核酸との同一性を識別するものである。
識の一方を２本鎖核酸である第1核酸の一方の鎖の３’
端部に導入すると共に、該第１核酸の他方の鎖の５’端
部に他方の標識を導入して、標識第１核酸を調製すると
共に、該標識第１核酸に２本鎖又は１本鎖の非標識第２
核酸を混合してコンペティティブハイブリダイゼーショ
ンを行い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度合を
測定することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に
生じた相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２
核酸との同一性を識別するものである。
【００２５】その原理について説明すると、図１（Ａ）
に示したように、エネルギー転位可能な２種の標識Ｄ，
Ａ（エネルギーを発生するドナー標識Ｄと該ドナー標識
からのエネルギーを吸収するアクセプター標識Ａ）を２
本鎖核酸である第１核酸の一方の鎖の３’端部と他方の
鎖の５’端部にそれぞれ１種類ずつ導入して２本鎖の標
識第１核酸１を調製する。この標識第１核酸１は２種の
標識Ｄ，Ａが近接した状態にあるのでエネルギー転位が
生じ、ドナー標識Ｄから発生したエネルギーがアクセプ
ター標識Ａに吸収されてドナー標識Ｄのエネルギーは低
下するが、エネルギーを吸収した標識Ａはエネルギーを
発生し、エネルギー転位が生じる。
に示したように、エネルギー転位可能な２種の標識Ｄ，
Ａ（エネルギーを発生するドナー標識Ｄと該ドナー標識
からのエネルギーを吸収するアクセプター標識Ａ）を２
本鎖核酸である第１核酸の一方の鎖の３’端部と他方の
鎖の５’端部にそれぞれ１種類ずつ導入して２本鎖の標
識第１核酸１を調製する。この標識第１核酸１は２種の
標識Ｄ，Ａが近接した状態にあるのでエネルギー転位が
生じ、ドナー標識Ｄから発生したエネルギーがアクセプ
ター標識Ａに吸収されてドナー標識Ｄのエネルギーは低
下するが、エネルギーを吸収した標識Ａはエネルギーを
発生し、エネルギー転位が生じる。
【００２６】次に、この標識第１核酸１と相同な非標識
の第２核酸２（図１では２本鎖核酸であるが１本鎖核酸
でもよい。）とを混合変性し、アニーリングすることに
よりコンペティティブハイブリダイゼーションを行う。
これにより相補鎖置換反応が起こり、図示したように２
種の標識Ｄ，Ａが近接した状態の核酸が希釈され、ドナ
ー標識Ｄのみ、或いはアクセプター標識Ａのみを有する
合成核酸が生じ、その結果、エネルギー転位を生じる核
酸の割合が減少する。
の第２核酸２（図１では２本鎖核酸であるが１本鎖核酸
でもよい。）とを混合変性し、アニーリングすることに
よりコンペティティブハイブリダイゼーションを行う。
これにより相補鎖置換反応が起こり、図示したように２
種の標識Ｄ，Ａが近接した状態の核酸が希釈され、ドナ
ー標識Ｄのみ、或いはアクセプター標識Ａのみを有する
合成核酸が生じ、その結果、エネルギー転位を生じる核
酸の割合が減少する。
【００２７】一方、図１（Ｂ）に示したように、同様の
２本鎖標識第１核酸１と変異Ｘを有する非標識第２核酸
２’とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行うと、相補鎖置換反応が生じないため、エネル
ギー転位を生じる核酸の割合は変化しない（元のま
ま）。
２本鎖標識第１核酸１と変異Ｘを有する非標識第２核酸
２’とを混合してコンペティティブハイブリダイゼーシ
ョンを行うと、相補鎖置換反応が生じないため、エネル
ギー転位を生じる核酸の割合は変化しない（元のま
ま）。
【００２８】従って、図１（Ａ），（Ｂ）のエネルギー
転位の程度を測定することにより、第１核酸１と第２核
酸２又は２’との間に生じた相補鎖の置換の程度を測定
することができ、これにより第１核酸１と第２核酸２又
は２’との同一性を識別することができるものである。
そして第１核酸１及び第２核酸２又は２’の一方を目的
核酸を含む試料核酸とし、他方を該試料核酸との同一性
を識別するための標準核酸とすることにより、試料核酸
中の遺伝子の変異の有無及びその割合を測定することが
できるものである。
転位の程度を測定することにより、第１核酸１と第２核
酸２又は２’との間に生じた相補鎖の置換の程度を測定
することができ、これにより第１核酸１と第２核酸２又
は２’との同一性を識別することができるものである。
そして第１核酸１及び第２核酸２又は２’の一方を目的
核酸を含む試料核酸とし、他方を該試料核酸との同一性
を識別するための標準核酸とすることにより、試料核酸
中の遺伝子の変異の有無及びその割合を測定することが
できるものである。
【００２９】なお、図１に示した例において、第１核酸
１として既知の変異を有するものを調製し、この変異を
有する第１核酸１と第２核酸２又は２’とを混合し、コ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行うことによ
っても同様に第２核酸２又は２’中の遺伝子の変異の有
無及びその割合を検出することができる。
１として既知の変異を有するものを調製し、この変異を
有する第１核酸１と第２核酸２又は２’とを混合し、コ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行うことによ
っても同様に第２核酸２又は２’中の遺伝子の変異の有
無及びその割合を検出することができる。
【００３０】また、本発明識別方法の第２の手法は、互
いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識の一方
を上記第１核酸に導入して調製した標識第１核酸と、他
方の標識を上記第２核酸に導入して調製した標識第２核
酸とを、下記（イ）〜（ハ）の組み合わせで混合してコ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標
識間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生
じた相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２核
酸との同一性を識別するものである。 （イ）上記第１核酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸
であり、一方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標
識第１核酸と、該標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリ
ダイズすべき側の鎖の５’端部に他方の標識を導入した
標識第２核酸との組み合わせ。 （ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の５’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 （ハ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。
いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識の一方
を上記第１核酸に導入して調製した標識第１核酸と、他
方の標識を上記第２核酸に導入して調製した標識第２核
酸とを、下記（イ）〜（ハ）の組み合わせで混合してコ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行い、上記標
識間のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合を測
定することにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生
じた相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２核
酸との同一性を識別するものである。 （イ）上記第１核酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸
であり、一方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標
識第１核酸と、該標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリ
ダイズすべき側の鎖の５’端部に他方の標識を導入した
標識第２核酸との組み合わせ。 （ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の５’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 （ハ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。
【００３１】その原理について上記（イ）のケースをモ
デルとして説明すると、図２（Ａ）に示したように、エ
ネルギー転位可能な２種の標識Ｄ，Ａを第１核酸３の一
方の鎖の３’端部と第２核酸４の他方の鎖の５’端部に
１種類ずつ導入し、標識第１核酸３と標識第２核酸４と
を調製する。これら標識核酸３，４は２本鎖の片方にし
か標識を有しない、即ち、いずれも１種の標識しか有さ
ないのでエネルギー転位は生じない。次に、これら標識
第１核酸３と標識第２核酸４とを混合変性し、アニーリ
ングすることによりコンペティティブハイブリダイゼー
ションを行う。これにより相補鎖置換反応が起こり、２
種の標識Ｄ，Ａが近接した状態の２本鎖核酸が生成し、
エネルギー転位が生じる。
デルとして説明すると、図２（Ａ）に示したように、エ
ネルギー転位可能な２種の標識Ｄ，Ａを第１核酸３の一
方の鎖の３’端部と第２核酸４の他方の鎖の５’端部に
１種類ずつ導入し、標識第１核酸３と標識第２核酸４と
を調製する。これら標識核酸３，４は２本鎖の片方にし
か標識を有しない、即ち、いずれも１種の標識しか有さ
ないのでエネルギー転位は生じない。次に、これら標識
第１核酸３と標識第２核酸４とを混合変性し、アニーリ
ングすることによりコンペティティブハイブリダイゼー
ションを行う。これにより相補鎖置換反応が起こり、２
種の標識Ｄ，Ａが近接した状態の２本鎖核酸が生成し、
エネルギー転位が生じる。
【００３２】一方、図２（Ｂ）に示したように、エネル
ギー転位可能な２種の標識Ｄ，Ａを第１核酸３の一方の
鎖の３’端部と変異Ｘを有する第２核酸４’の他方の鎖
の５’端部に１種類ずつ導入し、標識第１核酸３と標識
第２核酸４’とを調製する。これら標識第１核酸３と標
識第２核酸４’とを混合変性し、アニーリングすること
によりコンペティティブハイブリダイゼーションを行
う。この場合は、相補鎖置換反応が生じないため、２種
の標識Ｄ，Ａが近接した状態の核酸は生成せず、エネル
ギー転位は生じない。
ギー転位可能な２種の標識Ｄ，Ａを第１核酸３の一方の
鎖の３’端部と変異Ｘを有する第２核酸４’の他方の鎖
の５’端部に１種類ずつ導入し、標識第１核酸３と標識
第２核酸４’とを調製する。これら標識第１核酸３と標
識第２核酸４’とを混合変性し、アニーリングすること
によりコンペティティブハイブリダイゼーションを行
う。この場合は、相補鎖置換反応が生じないため、２種
の標識Ｄ，Ａが近接した状態の核酸は生成せず、エネル
ギー転位は生じない。
【００３３】従って、図２（Ａ），（Ｂ）のエネルギー
転位の程度を測定することにより、第１核酸３と第２核
酸４又は４’との間に生じた相補鎖の置換の程度を測定
することができ、これにより第１核酸３と第２核酸４又
は４’との同一性を識別することができるものである。
そして第１核酸３及び第２核酸４又は４’の一方を目的
核酸を含む試料核酸とし、他方を該試料核酸との同一性
を識別するための標準核酸とすることにより、試料核酸
中の遺伝子の変異の有無及びその割合を測定することが
できるものである。
転位の程度を測定することにより、第１核酸３と第２核
酸４又は４’との間に生じた相補鎖の置換の程度を測定
することができ、これにより第１核酸３と第２核酸４又
は４’との同一性を識別することができるものである。
そして第１核酸３及び第２核酸４又は４’の一方を目的
核酸を含む試料核酸とし、他方を該試料核酸との同一性
を識別するための標準核酸とすることにより、試料核酸
中の遺伝子の変異の有無及びその割合を測定することが
できるものである。
【００３４】なお、図２に示した例において、第１核酸
３として既知の変異を有するものを調製し、この変異を
有する第１核酸３と第２核酸４又は４’とを混合し、コ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行うことによ
っても同様に第２核酸４又は４’中の遺伝子の変異の有
無及びその割合を検出することができる。
３として既知の変異を有するものを調製し、この変異を
有する第１核酸３と第２核酸４又は４’とを混合し、コ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行うことによ
っても同様に第２核酸４又は４’中の遺伝子の変異の有
無及びその割合を検出することができる。
【００３５】この第２の手法における上記（ロ），
（ハ）の場合は、図２における第１核酸３及び第２核酸
４，４’のいずれか一方の核酸を１本鎖核酸としたもの
であり、その原理は図２に示した２本鎖核酸の場合と同
様である。
（ハ）の場合は、図２における第１核酸３及び第２核酸
４，４’のいずれか一方の核酸を１本鎖核酸としたもの
であり、その原理は図２に示した２本鎖核酸の場合と同
様である。
【００３６】このように本発明の核酸の識別方法は、エ
ネルギー転位可能な少なくとも２種の標識間のエネルギ
ー転位の変化の度合を直接測定するため、従来の面倒な
固液分離作業が必要なく、簡易な操作で、迅速かつ確実
に検体中の遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無及
びその割合を検出することができる。また、両標識が互
いに近接する３’端部と５’端部とに導入されているの
で、相補鎖の置換の程度が少ない場合でも容易に検出可
能な十分なエネルギー変化を生じ、確実かつ正確に置換
の程度を測定することができ、しかも第１又は第２核酸
が鎖の長い遺伝子断片であっても常に良好な感度をもっ
て正確かつ確実に置換の程度を測定し得るものである。
ネルギー転位可能な少なくとも２種の標識間のエネルギ
ー転位の変化の度合を直接測定するため、従来の面倒な
固液分離作業が必要なく、簡易な操作で、迅速かつ確実
に検体中の遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無及
びその割合を検出することができる。また、両標識が互
いに近接する３’端部と５’端部とに導入されているの
で、相補鎖の置換の程度が少ない場合でも容易に検出可
能な十分なエネルギー変化を生じ、確実かつ正確に置換
の程度を測定することができ、しかも第１又は第２核酸
が鎖の長い遺伝子断片であっても常に良好な感度をもっ
て正確かつ確実に置換の程度を測定し得るものである。
【００３７】本発明の核酸の識別方法は、上記第１核酸
及び第２核酸の一方を目的核酸を含む試料核酸とし、他
方をこの試料核酸との同一性を識別するための標準核酸
とし、遺伝子の変異や多型を有する核酸の有無並びにそ
の割合を検出する場合に好適に用いられるものである。
この場合、まず検体中の目的核酸の特定領域を増幅して
試料核酸を調製すると共に、この目的核酸の特定領域と
同じ領域の標準核酸を調製する。この際、検出対象であ
る目的核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する
遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスク
ファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子等が挙げられ
る。
及び第２核酸の一方を目的核酸を含む試料核酸とし、他
方をこの試料核酸との同一性を識別するための標準核酸
とし、遺伝子の変異や多型を有する核酸の有無並びにそ
の割合を検出する場合に好適に用いられるものである。
この場合、まず検体中の目的核酸の特定領域を増幅して
試料核酸を調製すると共に、この目的核酸の特定領域と
同じ領域の標準核酸を調製する。この際、検出対象であ
る目的核酸としては、癌関連遺伝子、遺伝病に関連する
遺伝子、ウィルス遺伝子、細菌遺伝子及び病気のリスク
ファクターと呼ばれる多型性を示す遺伝子等が挙げられ
る。
【００３８】ここで、目的核酸のうち、癌関連遺伝子と
しては、例えばｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、
ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、
又はＡＰＣ遺伝子などが挙げられる。遺伝病に関連する
遺伝子としては各種先天性代謝異常症などが挙げられ
る。ウィルス、細菌遺伝子としては、例えばＣ型肝炎ウ
ィルス、Ｂ型肝炎ウィルスなどが挙げられる。多型性を
示す遺伝子とは、病気等の原因とは必ずしも直接は関係
のない個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、例え
ば、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎ）や血液型に関する遺伝子、或いは高血圧、糖
尿病等の発症に関係するとされている遺伝子などがあ
る。これらの遺伝子は通常宿主の染色体上に存在する
が、ミトコンドリア遺伝子にコードされている場合もあ
る。
しては、例えばｋ−ｒａｓ遺伝子、Ｎ−ｒａｓ遺伝子、
ｐ５３遺伝子、ＢＲＣＡ１遺伝子、ＢＲＣＡ２遺伝子、
又はＡＰＣ遺伝子などが挙げられる。遺伝病に関連する
遺伝子としては各種先天性代謝異常症などが挙げられ
る。ウィルス、細菌遺伝子としては、例えばＣ型肝炎ウ
ィルス、Ｂ型肝炎ウィルスなどが挙げられる。多型性を
示す遺伝子とは、病気等の原因とは必ずしも直接は関係
のない個体によって異なる塩基配列を持つ遺伝子、例え
ば、ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔ
ｉｇｅｎ）や血液型に関する遺伝子、或いは高血圧、糖
尿病等の発症に関係するとされている遺伝子などがあ
る。これらの遺伝子は通常宿主の染色体上に存在する
が、ミトコンドリア遺伝子にコードされている場合もあ
る。
【００３９】このような目的核酸を含む検体としては、
例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離され
た血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙
げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存
在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を
検体とすることもできる。また、これらの検体は直接、
又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮
した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、
超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破
壊処理を予め施したものを使用することができる。この
場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮ
Ａを顕在化させる目的で行われるものである。なお、細
胞破壊処理の具体的な方法は、ＰＣＲプロトコルス ア
カデミック プレス インク ｐ１４、ｐ３５２（１９
９０）（ＰＣＲＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ｐ１４、ｐ３５２（１９９
０））等の文献に記載された公知の方法に従って行うこ
とができる。また、検体中のＤＮＡはトータル量で１〜
１００μｇ程度であることが好ましいが、１μｇ以下で
も充分増幅可能である。
例えば、細菌、ウィルス等の病原体、生体から分離され
た血液、唾液、組織病片等、或いは糞尿等の排泄物が挙
げられる。更に、出生前診断を行う場合は、羊水中に存
在する胎児の細胞や、試験管内での分裂卵細胞の一部を
検体とすることもできる。また、これらの検体は直接、
又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮
した後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、
超音波処理、或いはこれらの組み合わせ等による細胞破
壊処理を予め施したものを使用することができる。この
場合、上記細胞破壊処理は、目的とする組織由来のＤＮ
Ａを顕在化させる目的で行われるものである。なお、細
胞破壊処理の具体的な方法は、ＰＣＲプロトコルス ア
カデミック プレス インク ｐ１４、ｐ３５２（１９
９０）（ＰＣＲＰＲＯＴＯＣＯＬＳ Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，ｐ１４、ｐ３５２（１９９
０））等の文献に記載された公知の方法に従って行うこ
とができる。また、検体中のＤＮＡはトータル量で１〜
１００μｇ程度であることが好ましいが、１μｇ以下で
も充分増幅可能である。
【００４０】この場合、試料核酸及び標準核酸、即ち上
記第１核酸及び第２核酸は、公知のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣ
Ｒ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）法等により調製され（Ｍａｎａｋ，ＤＮ
Ａ Ｐｒｏｂｅｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐ２５５
〜２９１，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９
３））、特にＰＣＲ法が好適である。
記第１核酸及び第２核酸は、公知のＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣ
Ｒ（Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）
法、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ Ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔ
ｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ）法等により調製され（Ｍａｎａｋ，ＤＮ
Ａ Ｐｒｏｂｅｓ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ｐ２５５
〜２９１，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９
３））、特にＰＣＲ法が好適である。
【００４１】ここで、ＰＣＲ法につき更に詳しく説明す
ると、上記試料核酸及び標準核酸（第１核酸及び第２核
酸）を増幅するためのプライマーは、試料核酸及び標準
核酸が存在すれば、プライマーの伸長反応に基づく遺伝
子増幅反応が起こるものである。この場合、プライマー
の伸長反応は、４種又は５種のヌクレオチド三リン酸
（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三
リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リ
ン酸或いはデオキシウリジン三リン酸（これらの混合物
をｄＮＴＰということもある））を基質として該プライ
マーに取り込ませることにより行われる。
ると、上記試料核酸及び標準核酸（第１核酸及び第２核
酸）を増幅するためのプライマーは、試料核酸及び標準
核酸が存在すれば、プライマーの伸長反応に基づく遺伝
子増幅反応が起こるものである。この場合、プライマー
の伸長反応は、４種又は５種のヌクレオチド三リン酸
（デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三
リン酸、デオキシシチジン三リン酸、及びチミジン三リ
ン酸或いはデオキシウリジン三リン酸（これらの混合物
をｄＮＴＰということもある））を基質として該プライ
マーに取り込ませることにより行われる。
【００４２】この伸長反応を行う場合、通常核酸鎖を増
幅するために上記単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅
反応試薬が用いられ、この場合、核酸伸長酵素としては
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることがで
きるが、特にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、
これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がな
くなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能にな
り、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定するこ
とが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特
異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅
反応を行うことができる（詳細については特開平１−３
１４９６５号、同１−２５２３００号公報参照）。
幅するために上記単位核酸及び核酸伸長酵素を含む増幅
反応試薬が用いられ、この場合、核酸伸長酵素としては
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮ
ＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の任意のＤＮＡポリメラーゼを用いることがで
きるが、特にＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ等の
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、
これによりサイクル毎に新たな酵素の添加の必要性がな
くなり、自動的にサイクルを繰り返すことが可能にな
り、更にアニーリング温度を５０〜６０℃に設定するこ
とが可能なためプライマーによる標的塩基配列認識の特
異性を高めることができ、迅速かつ特異的に遺伝子増幅
反応を行うことができる（詳細については特開平１−３
１４９６５号、同１−２５２３００号公報参照）。
【００４３】また、この反応を行う際、反応溶液の水分
の蒸発を防止するためにオイルを添加することができ
る。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比
重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイ
ル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅
装置によってはこのような媒体を必要としないものもあ
り、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸
長反応を行うこともできる。
の蒸発を防止するためにオイルを添加することができ
る。この場合、オイルは水と分配可能で、かつ水より比
重の軽いものであればよく、具体的にはシリコーンオイ
ル、ミネラルオイル等が例示される。また、遺伝子増幅
装置によってはこのような媒体を必要としないものもあ
り、このような遺伝子増幅装置を用いてプライマーの伸
長反応を行うこともできる。
【００４４】このように、上記核酸増幅用プライマーを
用いて伸長反応を繰り返すことにより、検体中の目的核
酸を効率的に遺伝子増幅させることができ試料核酸を大
量に調製することができると共に、同様に目的核酸との
同一性を識別したい標準核酸を大量に調製することがで
きる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的
な方法については、実験医学、羊土社、８，Ｎｏ．９
（１９９０）、ＰＣＲテクノロジー ストックトン プ
レス（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の文献に記載された公
知の方法に従い行うことができる。
用いて伸長反応を繰り返すことにより、検体中の目的核
酸を効率的に遺伝子増幅させることができ試料核酸を大
量に調製することができると共に、同様に目的核酸との
同一性を識別したい標準核酸を大量に調製することがで
きる。なお、この遺伝子増幅反応を行う条件等の具体的
な方法については、実験医学、羊土社、８，Ｎｏ．９
（１９９０）、ＰＣＲテクノロジー ストックトン プ
レス（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ ｐｒｅｓｓ（１９８９））等の文献に記載された公
知の方法に従い行うことができる。
【００４５】また、遺伝子増幅を利用しないで天然の遺
伝子から制限酵素により酵素的に直接切り出してもよ
く、更には、正常核酸を増幅したものをプラスミドベク
ター、ファージベクター、又はプラスミドとファージの
キメラベクターから選ばれるベクターに組み込み、大腸
菌、枯草菌等の細菌或いは酵母等の増殖可能な任意の宿
主に導入して大量に調製することもできる（遺伝子クロ
ーニング）。更に、場合によっては化学合成によって調
製することも可能である。化学合成としては、トリエス
テル法、亜リン酸法等が挙げられ、これらは液相法又は
不溶性の担体を使った固相合成法などにより通常の自動
合成機（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社３９
２等）により１本鎖のＤＮＡを大量に調製し、その後ア
ニーリングを行うことにより２本鎖ＤＮＡを調製するこ
とができる。
伝子から制限酵素により酵素的に直接切り出してもよ
く、更には、正常核酸を増幅したものをプラスミドベク
ター、ファージベクター、又はプラスミドとファージの
キメラベクターから選ばれるベクターに組み込み、大腸
菌、枯草菌等の細菌或いは酵母等の増殖可能な任意の宿
主に導入して大量に調製することもできる（遺伝子クロ
ーニング）。更に、場合によっては化学合成によって調
製することも可能である。化学合成としては、トリエス
テル法、亜リン酸法等が挙げられ、これらは液相法又は
不溶性の担体を使った固相合成法などにより通常の自動
合成機（ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社３９
２等）により１本鎖のＤＮＡを大量に調製し、その後ア
ニーリングを行うことにより２本鎖ＤＮＡを調製するこ
とができる。
【００４６】このようにして大量に調製した試料核酸及
び標準核酸の一方を上記第１核酸とすると共に、他方を
第２核酸とし、これら第１及び第２核酸のいずれか一方
又は双方にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識
を導入する。
び標準核酸の一方を上記第１核酸とすると共に、他方を
第２核酸とし、これら第１及び第２核酸のいずれか一方
又は双方にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識
を導入する。
【００４７】ここで、本発明における標識間のエネルギ
ー転位とは、エネルギーを発生するドナー標識とこのド
ナー標識から発生したエネルギーを吸収するアクセプタ
ー標識との少なくとも２種の標識が、互いに近接した状
態にある場合に、ドナー標識からアクセプター標識への
エネルギーの移動をいう。例えば、２種の標識が蛍光標
識である場合、ドナー標識を励起して生じる蛍光をアク
セプター標識が吸収し、このアクセプター標識が発する
蛍光を測定するか、又はドナー標識を励起して生じる蛍
光をアクセプター標識が吸収することにより起こるドナ
ー標識の消光を測定することができる（ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４，３
５７−３６２（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９−５３（１９９８））。
なお、ドナー標識の蛍光波長とアクセプター標識の吸収
波長に重なりがなくてもエネルギー転位が起こる場合が
あるが、このようなエネルギー転位も本発明に含まれる
ものである。
ー転位とは、エネルギーを発生するドナー標識とこのド
ナー標識から発生したエネルギーを吸収するアクセプタ
ー標識との少なくとも２種の標識が、互いに近接した状
態にある場合に、ドナー標識からアクセプター標識への
エネルギーの移動をいう。例えば、２種の標識が蛍光標
識である場合、ドナー標識を励起して生じる蛍光をアク
セプター標識が吸収し、このアクセプター標識が発する
蛍光を測定するか、又はドナー標識を励起して生じる蛍
光をアクセプター標識が吸収することにより起こるドナ
ー標識の消光を測定することができる（ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４，３
５７−３６２（１９９５）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４９−５３（１９９８））。
なお、ドナー標識の蛍光波長とアクセプター標識の吸収
波長に重なりがなくてもエネルギー転位が起こる場合が
あるが、このようなエネルギー転位も本発明に含まれる
ものである。
【００４８】上記少なくとも２種の標識としては、互い
に近接した状態でエネルギー転位可能なものであれば特
に制限されないが、中でも蛍光物質、遅延蛍光物質が好
ましく、場合によっては化学発光物質、生物発光物質な
どを用いることもできる。このような標識の組み合せと
しては、フルオレセイン及びその誘導体（例えばフルオ
レセインイソチオシアネート等）とローダミン及びその
誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６−）
ヘキサノイックアシッド等）、フルオレセインとダブシ
ルなどが挙げられ、これらの中から任意の組み合わせを
選択することができる（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮ
Ａ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。
に近接した状態でエネルギー転位可能なものであれば特
に制限されないが、中でも蛍光物質、遅延蛍光物質が好
ましく、場合によっては化学発光物質、生物発光物質な
どを用いることもできる。このような標識の組み合せと
しては、フルオレセイン及びその誘導体（例えばフルオ
レセインイソチオシアネート等）とローダミン及びその
誘導体（例えばテトラメチルローダミンイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６−）
ヘキサノイックアシッド等）、フルオレセインとダブシ
ルなどが挙げられ、これらの中から任意の組み合わせを
選択することができる（Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ ＤＮ
Ａ Ｐｒｏｂｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｃａｄｅｍ
ｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９２））。
【００４９】上記２種の標識を試料核酸及び標準核酸
（第１核酸及び第２核酸）のいずれか一方又は双方へ導
入する方法としては、一般的な核酸への標識導入方法を
採用することができる。例えば、標識物を核酸に直接化
学的に導入する方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２
４，４８４−４８９（１９９８））、ＤＮＡポリメラー
ゼ反応或いはＲＮＡポリメラーゼ反応により標識モノヌ
クレオチドを導入する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，
３３６−３３４１（１９８７））、標識物を導入したプ
ライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより導入する
方法（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ２，３４−４０（１９９２））などが挙
げられる。
（第１核酸及び第２核酸）のいずれか一方又は双方へ導
入する方法としては、一般的な核酸への標識導入方法を
採用することができる。例えば、標識物を核酸に直接化
学的に導入する方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２
４，４８４−４８９（１９９８））、ＤＮＡポリメラー
ゼ反応或いはＲＮＡポリメラーゼ反応により標識モノヌ
クレオチドを導入する方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８，
３３６−３３４１（１９８７））、標識物を導入したプ
ライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより導入する
方法（ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ ２，３４−４０（１９９２））などが挙
げられる。
【００５０】この場合、試料核酸及び標準核酸（第１核
酸及び第２核酸）へ標識を導入する位置は、相補鎖置換
反応によりエネルギー転位が生じたり、消失する位置、
即ち、核酸鎖の３’端部及び／又は５’端部である必要
がある。具体的には、核酸鎖の５’末端及び３’末端か
らそれぞれ３０塩基以内の範囲を示すが、両方の標識が
近ければ近いほどエネルギー転位を起こし易いため、好
ましくはそれぞれの末端から１０塩基以内であり、最も
好ましくは５’末端及び３’末端である。ここで、標識
を相補鎖とハイブリダイズする塩基部分に多数導入する
と１塩基程度の置換が検出できなくなる可能性があるた
め、それぞれの核酸鎖の端部分のみに導入することが好
ましい。例えば、２種の標識の一方を一方の核酸鎖の
５’端部（３’端部）に導入すると共に、これと相補的
な他方の核酸鎖の３’端部（５’端部）に他方の標識を
導入すれば、ハイブリダイゼーション反応に影響を与え
ることなく、両核酸鎖は相補鎖置換反応により、エネル
ギー転位を生じたり、消失したりする。
酸及び第２核酸）へ標識を導入する位置は、相補鎖置換
反応によりエネルギー転位が生じたり、消失する位置、
即ち、核酸鎖の３’端部及び／又は５’端部である必要
がある。具体的には、核酸鎖の５’末端及び３’末端か
らそれぞれ３０塩基以内の範囲を示すが、両方の標識が
近ければ近いほどエネルギー転位を起こし易いため、好
ましくはそれぞれの末端から１０塩基以内であり、最も
好ましくは５’末端及び３’末端である。ここで、標識
を相補鎖とハイブリダイズする塩基部分に多数導入する
と１塩基程度の置換が検出できなくなる可能性があるた
め、それぞれの核酸鎖の端部分のみに導入することが好
ましい。例えば、２種の標識の一方を一方の核酸鎖の
５’端部（３’端部）に導入すると共に、これと相補的
な他方の核酸鎖の３’端部（５’端部）に他方の標識を
導入すれば、ハイブリダイゼーション反応に影響を与え
ることなく、両核酸鎖は相補鎖置換反応により、エネル
ギー転位を生じたり、消失したりする。
【００５１】具体的には、５’端部に標識を有する核酸
鎖を調製するには、５’端部に標識物が導入されたプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行う方法（ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２，３
４−４０（１９９２））或いは５’端部に標識が導入さ
れたリンカーと任意の核酸鎖をリガーゼにより結合させ
る方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，
９２２−９２３（１９９７））などが挙げられる。
鎖を調製するには、５’端部に標識物が導入されたプラ
イマーを用いてＰＣＲ反応を行う方法（ＰＣＲ Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ２，３
４−４０（１９９２））或いは５’端部に標識が導入さ
れたリンカーと任意の核酸鎖をリガーゼにより結合させ
る方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，
９２２−９２３（１９９７））などが挙げられる。
【００５２】一方、３’端部に標識を有する核酸鎖を調
製するには、上記５’端部に標識を導入する場合と同様
に３’端部に標識が導入されたリンカーと任意の核酸鎖
をリガーゼにより結合させる方法がある。なお、核酸鎖
がＤＮＡではなくＲＮＡであったり、ＤＮＡの３’端部
がＲＮＡである場合には、その末端のＲＮＡの糖（リボ
ース）部を選択的に開環させて、生じたアルデヒド基を
利用して標識することもできる。
製するには、上記５’端部に標識を導入する場合と同様
に３’端部に標識が導入されたリンカーと任意の核酸鎖
をリガーゼにより結合させる方法がある。なお、核酸鎖
がＤＮＡではなくＲＮＡであったり、ＤＮＡの３’端部
がＲＮＡである場合には、その末端のＲＮＡの糖（リボ
ース）部を選択的に開環させて、生じたアルデヒド基を
利用して標識することもできる。
【００５３】更に、標識を導入したモノヌクレオチド三
リン酸をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼの働きにより核酸鎖の３’端部に標識を導入す
ることもできる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５，
４８６−４９６（１９９３））。
リン酸をターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼの働きにより核酸鎖の３’端部に標識を導入す
ることもできる（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５，
４８６−４９６（１９９３））。
【００５４】なお、試料核酸及び標準核酸（第１核酸及
び第２核酸）が１００塩基以下の比較的短い核酸鎖であ
る場合には、直接化学合成により標識核酸を調製するこ
ともできる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
６，２６５９−２６６９（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇ．Ｃｈｅｍ．３，８５−８７（１９９２））。
び第２核酸）が１００塩基以下の比較的短い核酸鎖であ
る場合には、直接化学合成により標識核酸を調製するこ
ともできる（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１
６，２６５９−２６６９（１９８８）、Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇ．Ｃｈｅｍ．３，８５−８７（１９９２））。
【００５５】次に、上記のように標識を導入した試料核
酸及び標準核酸（第１核酸及び第２核酸）を用いてコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行う。
酸及び標準核酸（第１核酸及び第２核酸）を用いてコン
ペティティブハイブリダイゼーションを行う。
【００５６】この場合、本発明におけるコンペティティ
ブハイブリダイゼーションとは、相同な塩基配列を持つ
２本鎖核酸と１本鎖核酸との間、或いは相同な塩基配列
を持つ２本鎖核酸と２本鎖核酸との間で起こる競合的な
核酸鎖の置換反応であり、１本鎖核酸と２本鎖核酸、又
は複数の２本鎖核酸を変性し、アニーリングすることに
より行うことができる。
ブハイブリダイゼーションとは、相同な塩基配列を持つ
２本鎖核酸と１本鎖核酸との間、或いは相同な塩基配列
を持つ２本鎖核酸と２本鎖核酸との間で起こる競合的な
核酸鎖の置換反応であり、１本鎖核酸と２本鎖核酸、又
は複数の２本鎖核酸を変性し、アニーリングすることに
より行うことができる。
【００５７】まず、試料核酸及び／又は標準核酸（第１
核酸及び／又は第２核酸）が２本鎖である場合にはこれ
らを変性する必要があるが、変性方法は熱による方法或
いはアルカリによる方法が好ましい。また試料核酸と標
準核酸とを混合する時期は変性直前であってもよいし、
変性後であっても構わない。
核酸及び／又は第２核酸）が２本鎖である場合にはこれ
らを変性する必要があるが、変性方法は熱による方法或
いはアルカリによる方法が好ましい。また試料核酸と標
準核酸とを混合する時期は変性直前であってもよいし、
変性後であっても構わない。
【００５８】更に、反応溶液中の塩濃度が最適になるよ
うに調製する必要があり、それは鎖長によるところが大
きい。一般に、ハイブリダイゼーションにおいては、Ｓ
ＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍク
エン酸ナトリウム）やＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：３．
６Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）が使われており、本発明の識別方法にお
いてもこれらの溶液を好適な濃度に希釈して使用するこ
とができる。また、必要に応じてジメチルスルフォキシ
ド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）な
どの有機溶媒を添加することもできる。
うに調製する必要があり、それは鎖長によるところが大
きい。一般に、ハイブリダイゼーションにおいては、Ｓ
ＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍク
エン酸ナトリウム）やＳＳＰＥ（２０×ＳＳＰＥ：３．
６Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ）が使われており、本発明の識別方法にお
いてもこれらの溶液を好適な濃度に希釈して使用するこ
とができる。また、必要に応じてジメチルスルフォキシ
ド（ＤＭＳＯ）、ジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）な
どの有機溶媒を添加することもできる。
【００５９】コンペティティブハイブリダイゼーション
の温度条件は、ハイブリダイゼーションを行う核酸の鎖
長や塩基配列に応じて適宜設定されるが、通常９８〜５
０℃の範囲で３〜１０分間に１℃の速度、より好ましく
は９８〜７０℃の範囲で１０分間に１℃の速度で温度を
下げ、行うことができる。
の温度条件は、ハイブリダイゼーションを行う核酸の鎖
長や塩基配列に応じて適宜設定されるが、通常９８〜５
０℃の範囲で３〜１０分間に１℃の速度、より好ましく
は９８〜７０℃の範囲で１０分間に１℃の速度で温度を
下げ、行うことができる。
【００６０】本発明の核酸の識別方法は、上記のように
して少なくとも２種の標識を導入した試料核酸及び標準
核酸（第１核酸及び第２核酸）を熱変性又はアルカリ変
性した後、コンペティティブハイブリダイゼーションを
行い、温度を高温から徐々に下げることにより、アニー
リングを行い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度
合を測定することにより遺伝子の変異又は多型を有する
核酸を検出するものである。
して少なくとも２種の標識を導入した試料核酸及び標準
核酸（第１核酸及び第２核酸）を熱変性又はアルカリ変
性した後、コンペティティブハイブリダイゼーションを
行い、温度を高温から徐々に下げることにより、アニー
リングを行い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度
合を測定することにより遺伝子の変異又は多型を有する
核酸を検出するものである。
【００６１】この場合、遺伝子の変異又は多型を有する
核酸に比べて完全に相補な塩基配列を持つもの同士の方
がより優先的に２本鎖を形成し、これに伴って標識間で
のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合、即ち、
相補鎖置換反応により生じたり、消失したりするエネル
ギー転位の変化の度合を任意の検出器を用いて測定する
ことにより、遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無
及びその割合を検出することができる。例えば、検出に
蛍光エネルギー転位を利用する場合には、分光蛍光光度
計、蛍光プレートリーダーなどで特定波長の蛍光スペク
トルを測定することにより、遺伝子の変異又は多型を有
する核酸の有無を容易に検出することができる。
核酸に比べて完全に相補な塩基配列を持つもの同士の方
がより優先的に２本鎖を形成し、これに伴って標識間で
のエネルギー転位によるエネルギー変化の度合、即ち、
相補鎖置換反応により生じたり、消失したりするエネル
ギー転位の変化の度合を任意の検出器を用いて測定する
ことにより、遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無
及びその割合を検出することができる。例えば、検出に
蛍光エネルギー転位を利用する場合には、分光蛍光光度
計、蛍光プレートリーダーなどで特定波長の蛍光スペク
トルを測定することにより、遺伝子の変異又は多型を有
する核酸の有無を容易に検出することができる。
【００６２】具体的には、互いに近接した状態でエネル
ギー転位可能な少なくとも２種の標識（例えば、励起に
より蛍光を発生するドナー標識と、その蛍光を吸収する
アクセプター標識）を使用して、上記２種の標識の一方
を２本鎖核酸である第１核酸の一方の鎖の３’端部に導
入すると共に、該第１核酸の他方の鎖の５’端部に他方
の標識を導入して、標識第１核酸を調製すると共に、該
標識第１核酸に２本鎖又は１本鎖の非標識第２核酸を混
合してコンペティティブハイブリダイゼーションを行
い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度合を測定す
ることにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じた
相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２核酸と
の同一性、即ち標準核酸と試料核酸との同一性を識別
し、検体中の遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無
並びにその割合を検出することができる。
ギー転位可能な少なくとも２種の標識（例えば、励起に
より蛍光を発生するドナー標識と、その蛍光を吸収する
アクセプター標識）を使用して、上記２種の標識の一方
を２本鎖核酸である第１核酸の一方の鎖の３’端部に導
入すると共に、該第１核酸の他方の鎖の５’端部に他方
の標識を導入して、標識第１核酸を調製すると共に、該
標識第１核酸に２本鎖又は１本鎖の非標識第２核酸を混
合してコンペティティブハイブリダイゼーションを行
い、上記標識間のエネルギー転位の変化の度合を測定す
ることにより、上記第１核酸と第２核酸との間に生じた
相補鎖の置換の程度を測定して、第１核酸と第２核酸と
の同一性、即ち標準核酸と試料核酸との同一性を識別
し、検体中の遺伝子の変異又は多型を有する核酸の有無
並びにその割合を検出することができる。
【００６３】また、上記一方の標識を第１核酸に導入し
て調製した標識第１核酸と上記他方の標識を第２核酸に
導入して調製した標識第２核酸とを下記（イ）〜（ハ）
の組み合わせで混合して、コンペティティブハイブリダ
イゼーションを行い、上記標識間のエネルギー転位によ
るエネルギー変化の度合を測定することにより、上記第
１核酸と第２核酸との間に生じた相補鎖の置換の程度を
測定して、第１核酸と第２核酸との同一性、即ち標準核
酸と試料核酸との同一性を識別し、検体中の遺伝子の変
異又は多型を有する核酸の有無並びにその割合を検出す
ることができる。 （イ）上記第１核酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸
であり、一方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標
識第１核酸と、該標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリ
ダイズすべき側の鎖の５’端部に他方の標識を導入した
標識第２核酸との組み合わせ。 （ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の５’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 （ハ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。
て調製した標識第１核酸と上記他方の標識を第２核酸に
導入して調製した標識第２核酸とを下記（イ）〜（ハ）
の組み合わせで混合して、コンペティティブハイブリダ
イゼーションを行い、上記標識間のエネルギー転位によ
るエネルギー変化の度合を測定することにより、上記第
１核酸と第２核酸との間に生じた相補鎖の置換の程度を
測定して、第１核酸と第２核酸との同一性、即ち標準核
酸と試料核酸との同一性を識別し、検体中の遺伝子の変
異又は多型を有する核酸の有無並びにその割合を検出す
ることができる。 （イ）上記第１核酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸
であり、一方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標
識第１核酸と、該標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリ
ダイズすべき側の鎖の５’端部に他方の標識を導入した
標識第２核酸との組み合わせ。 （ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の５’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 （ハ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。
【００６４】なお、エネルギー転位可能な標識を２種以
上の複数種組み合せて使用することにより、一つの反応
容器内で複数の遺伝子の変異又は多型を有する核酸を同
時に検出することも可能である。
上の複数種組み合せて使用することにより、一つの反応
容器内で複数の遺伝子の変異又は多型を有する核酸を同
時に検出することも可能である。
【００６５】更に、本発明の核酸の識別方法では、検体
中の野生型遺伝子と変異遺伝子の割合に応じてエネルギ
ー転位の程度が有意に変化するため、野生型遺伝子と変
異遺伝子とのエネルギー転位の程度の関係を予め検量線
などを作成しておき確定しておけば、容易に野生型遺伝
子と変異遺伝子の割合を知ることもできる。
中の野生型遺伝子と変異遺伝子の割合に応じてエネルギ
ー転位の程度が有意に変化するため、野生型遺伝子と変
異遺伝子とのエネルギー転位の程度の関係を予め検量線
などを作成しておき確定しておけば、容易に野生型遺伝
子と変異遺伝子の割合を知ることもできる。
【００６６】次に、本発明の核酸の識別用検査キット
は、上記本発明の識別方法に従って遺伝子の変異又は多
型を有する核酸の有無及びその割合を検出するための検
査キットであって、必要により細胞破壊処理等の前処理
を施した検体の目的核酸の特定領域から試料核酸を調製
すると共に、この試料核酸と相補な塩基配列を有する標
準核酸を調製し、これら試料核酸及び標準核酸をそれぞ
れ上記第１核酸又は第２核酸とし、そのいずれか一方又
は双方にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を
導入し、該試料核酸と標準核酸とを混合してコンペティ
ティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識間のエ
ネルギー転位の変化の度合を測定することにより、相補
鎖の置換が生じた程度を測定するものである。
は、上記本発明の識別方法に従って遺伝子の変異又は多
型を有する核酸の有無及びその割合を検出するための検
査キットであって、必要により細胞破壊処理等の前処理
を施した検体の目的核酸の特定領域から試料核酸を調製
すると共に、この試料核酸と相補な塩基配列を有する標
準核酸を調製し、これら試料核酸及び標準核酸をそれぞ
れ上記第１核酸又は第２核酸とし、そのいずれか一方又
は双方にエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を
導入し、該試料核酸と標準核酸とを混合してコンペティ
ティブハイブリダイゼーションを行い、上記標識間のエ
ネルギー転位の変化の度合を測定することにより、相補
鎖の置換が生じた程度を測定するものである。
【００６７】この場合、検体中の目的核酸の特定領域を
増幅して試料核酸を調製するための試料核酸増幅用試薬
と、該試料核酸と目的核酸との同一性を識別する標準核
酸を調製するための標準核酸増幅用試薬と、エネルギー
転位可能な少なくとも２種の標識を試料核酸及び標準核
酸のいずれか一方又は双方に導入するための試薬とを組
合わせて本発明の核酸の識別、及び定量用検査キットと
することができる。
増幅して試料核酸を調製するための試料核酸増幅用試薬
と、該試料核酸と目的核酸との同一性を識別する標準核
酸を調製するための標準核酸増幅用試薬と、エネルギー
転位可能な少なくとも２種の標識を試料核酸及び標準核
酸のいずれか一方又は双方に導入するための試薬とを組
合わせて本発明の核酸の識別、及び定量用検査キットと
することができる。
【００６８】更に、上記本発明の核酸の識別方法で説明
した検体前処理用の細胞破壊試薬、増幅反応生成物を洗
浄するための洗浄液、反応溶液の水分の蒸発を防止する
ためのオイル及び２種の標識間のエネルギー転位の変化
の度合を測定するための試薬などを用いることができ、
これらと組み合わせて本発明の検査キットとすることも
できる。
した検体前処理用の細胞破壊試薬、増幅反応生成物を洗
浄するための洗浄液、反応溶液の水分の蒸発を防止する
ためのオイル及び２種の標識間のエネルギー転位の変化
の度合を測定するための試薬などを用いることができ、
これらと組み合わせて本発明の検査キットとすることも
できる。
【００６９】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものでは
ない。
説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものでは
ない。
【００７０】嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏ
ｓｉｓ）の原因遺伝子であるＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ
ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏ
ｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子の変
異のなかで最も多く見られる５０８番目のフェニルアラ
ニンの欠損（３塩基欠損；以下、Δ５０８変異型とい
う）を検出するため、下記方法により、標識、非標識オ
リゴヌクレオチドを合成した。
ｓｉｓ）の原因遺伝子であるＣＦＴＲ（ｃｙｓｔｉｃ
ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏ
ｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子の変
異のなかで最も多く見られる５０８番目のフェニルアラ
ニンの欠損（３塩基欠損；以下、Δ５０８変異型とい
う）を検出するため、下記方法により、標識、非標識オ
リゴヌクレオチドを合成した。
【００７１】まず、野生型及びΔ５０８変異型のオリゴ
ヌクレオチドをテンプレートとして、下記一対のプライ
マー（ＣＦ１０ＥＴＰ、ＣＦ１０ＥＴＭ；アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社製）を用いてポリメラーゼチェ
ーン反応（ＰＣＲ）を行った。
ヌクレオチドをテンプレートとして、下記一対のプライ
マー（ＣＦ１０ＥＴＰ、ＣＦ１０ＥＴＭ；アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社製）を用いてポリメラーゼチェ
ーン反応（ＰＣＲ）を行った。
【００７２】プライマー
ＣＦ１０ＥＴＰ：
配列表の配列番号１
５’−ccattaaaga aaatatcatc−３’
ＣＦ１０ＥＴＭ：
配列表の配列番号２
５’−atattcatca taggaaacac−３’
【００７３】ＰＣＲは常法に従って、〔変性：９４℃で
３０ｓｅｃ、アニーリング：５４℃で３０ｓｅｃ、伸
長：７２℃で６０ｓｅｃ〕のサイクルを３５回繰り返し
た。反応後、ＰＣＲ反応液を３％アガロースゲル電気泳
動で測定した。野生型のＰＣＲ反応液は４４塩基長のと
ころにバンドが検出された。また、Δ５０８変異型のＰ
ＣＲ反応液は４１塩基長のところにバンドが検出され
た。
３０ｓｅｃ、アニーリング：５４℃で３０ｓｅｃ、伸
長：７２℃で６０ｓｅｃ〕のサイクルを３５回繰り返し
た。反応後、ＰＣＲ反応液を３％アガロースゲル電気泳
動で測定した。野生型のＰＣＲ反応液は４４塩基長のと
ころにバンドが検出された。また、Δ５０８変異型のＰ
ＣＲ反応液は４１塩基長のところにバンドが検出され
た。
【００７４】標識、非標識オリゴヌクレオチドの調製
標識オリゴヌクレオチドの５’末端についてはＴＦＡ−
アミノリンク ＣＥフォスフォアミダイト（パーキンエ
ルマージャパン社製）を用いてアミノ基を導入し、ＴＡ
ＭＲＡ−ＮＨＳ（パーキンエルマージャパン社製）を用
いて５’末端にＴＡＭＲＡ基（テトラメチルローダミン
−５−（ａｎｄ−６−）ヘキサノイックアシッド）を蛍
光標識した。
アミノリンク ＣＥフォスフォアミダイト（パーキンエ
ルマージャパン社製）を用いてアミノ基を導入し、ＴＡ
ＭＲＡ−ＮＨＳ（パーキンエルマージャパン社製）を用
いて５’末端にＴＡＭＲＡ基（テトラメチルローダミン
−５−（ａｎｄ−６−）ヘキサノイックアシッド）を蛍
光標識した。
【００７５】一方、野生型及びΔ５０８変異型のオリゴ
ヌクレオチドの３’末端に３’−アミノ修飾Ｃ７ ＣＰ
Ｇ５００（グレンリサーチ社製）を用いてアミノ基を導
入し、次いで、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ；同仁化学研究所製）を３’末端に蛍光標識し
た。
ヌクレオチドの３’末端に３’−アミノ修飾Ｃ７ ＣＰ
Ｇ５００（グレンリサーチ社製）を用いてアミノ基を導
入し、次いで、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ；同仁化学研究所製）を３’末端に蛍光標識し
た。
【００７６】これら蛍光標識（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ）
を導入したオリゴヌクレオチドは高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、標識オリゴヌクレ
オチドとして使用した。一方、アミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて精製し、非標識オリゴヌクレオチドとして使用し
た。標識、非標識オリゴヌクレオチドを下記の通り命名
し、その塩基配列とともに示す。
を導入したオリゴヌクレオチドは高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製し、標識オリゴヌクレ
オチドとして使用した。一方、アミノ基を導入したオリ
ゴヌクレオチドはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて精製し、非標識オリゴヌクレオチドとして使用し
た。標識、非標識オリゴヌクレオチドを下記の通り命名
し、その塩基配列とともに示す。
【００７７】ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ2（野生型の非標
識コーディング鎖）： 配列表の配列番号３ ５’−Ｈ2Ｎ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt ccta
tgatga atat−３’
識コーディング鎖）： 配列表の配列番号３ ５’−Ｈ2Ｎ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt ccta
tgatga atat−３’
【００７８】ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＴＡＭＲＡ（野生型の
標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号３ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’
標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号３ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’
【００７９】ＣＦ１０ＷＳＮ２−ＮＨ2（野生型の非標
識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号５ ５’−atattcatca taggaaacac caaagatgat attttcttta
atgg−ＮＨ2−３’
識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号５ ５’−atattcatca taggaaacac caaagatgat attttcttta
atgg−ＮＨ2−３’
【００８０】ＣＦ１０ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ（野生型の標
識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号５ ５’−atattcatca taggaaacac caaagatgat attttcttta
atgg−ＦＩＴＣ−３’
識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号５ ５’−atattcatca taggaaacac caaagatgat attttcttta
atgg−ＦＩＴＣ−３’
【００８１】ＣＦ１０ＭＳＮ１−ＮＨ2（Δ５０８変異
型の非標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号４ ５’−Ｈ2Ｎ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct atga
tgaata t−３’
型の非標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号４ ５’−Ｈ2Ｎ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct atga
tgaata t−３’
【００８２】ＣＦ１０ＭＳＮ１−ＴＡＭＲＡ（Δ５０８
変異型の標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号４ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’
変異型の標識コーディング鎖）： 配列表の配列番号４ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’
【００８３】ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＮＨ2（Δ５０８変異
型の非標識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号６ ５’−atattcatca taggaaacac cgatgatatt ttctttaatg
g−ＮＨ2−３’
型の非標識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号６ ５’−atattcatca taggaaacac cgatgatatt ttctttaatg
g−ＮＨ2−３’
【００８４】ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＦＩＴＣ（Δ５０８変
異型の標識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号６ ５’−atattcatca taggaaacac cgatgatatt ttctttaatg
g−ＦＩＴＣ−３’
異型の標識コーディング鎖の相補鎖）： 配列表の配列番号６ ５’−atattcatca taggaaacac cgatgatatt ttctttaatg
g−ＦＩＴＣ−３’
【００８５】〔実施例１〕二標識間におけるエネルギー
転位の様子を蛍光スペクトルを測定することにより調べ
た。まず、下記方法により、上記標識、非標識オリゴヌ
クレオチドを用いて２本鎖ＤＮＡを調製した。
転位の様子を蛍光スペクトルを測定することにより調べ
た。まず、下記方法により、上記標識、非標識オリゴヌ
クレオチドを用いて２本鎖ＤＮＡを調製した。
【００８６】２本鎖ＤＮＡの調製
野生型標識オリゴヌクレオチドＣＦ１０ＷＳＮ１−ＴＡ
ＭＲＡ（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ
（３０ｎｍｏｌ）とを溶解液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉｎｇ ＤＮＡ）１０
０μｌに溶解し、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００
（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社
製）を用いて９８℃〜６０℃まで連続的に４時間かけて
温度を下げ、アリーリングを行い、下記（Ａ）の野生型
標識２本鎖ＤＮＡを調製した。
ＭＲＡ（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ
（３０ｎｍｏｌ）とを溶解液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉｎｇ ＤＮＡ）１０
０μｌに溶解し、ジーンアンプＰＣＲシステム９６００
（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社
製）を用いて９８℃〜６０℃まで連続的に４時間かけて
温度を下げ、アリーリングを行い、下記（Ａ）の野生型
標識２本鎖ＤＮＡを調製した。
【００８７】野生型標識２本鎖ＤＮＡ
（Ａ）：ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＷＳ
Ｎ２−ＦＩＴＣ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag aaaccacaaa
ggatactact tata−５’
Ｎ２−ＦＩＴＣ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag aaaccacaaa
ggatactact tata−５’
【００８８】また、同様に上記標識オリゴヌクレオチ
ド、非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて下記
（Ｂ）〜（Ｄ）の２本鎖ＤＮＡを調製した。これら
（Ｂ）〜（Ｄ）の２本鎖ＤＮＡの塩基配列を下記に示
す。
ド、非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて下記
（Ｂ）〜（Ｄ）の２本鎖ＤＮＡを調製した。これら
（Ｂ）〜（Ｄ）の２本鎖ＤＮＡの塩基配列を下記に示
す。
【００８９】Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡ
（Ｂ）：ＣＦ１０ＭＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＭＳ
Ｎ２−ＦＩＴＣ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag ccacaaagga
tactacttat a−５’
Ｎ２−ＦＩＴＣ ５’−ＴＡＭＲＡ−ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag ccacaaagga
tactacttat a−５’
【００９０】野生型標識非標識２本鎖ＤＮＡ
（Ｃ）：ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ2＝ＣＦ１０ＷＳＮ２
−ＦＩＴＣ ５’−ＮＨ2 −ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag aaaccacaaa
ggatactact tata−５’
−ＦＩＴＣ ５’−ＮＨ2 −ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt
cctatgatga atat−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag aaaccacaaa
ggatactact tata−５’
【００９１】Δ５０８変異型標識非標識２本鎖ＤＮＡ
（Ｄ）：ＣＦ１０ＭＳＮ１−ＮＨ2＝ＣＦ１０ＭＳＮ２
−ＦＩＴＣ ５’−ＮＨ2 −ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag ccacaaagga
tactacttat a−５’
−ＦＩＴＣ ５’−ＮＨ2 −ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct
atgatgaata t−３’ ３’−ＦＩＴＣ −ggtaatttct tttatagtag ccacaaagga
tactacttat a−５’
【００９２】蛍光スペクトル測定
上記（Ａ）〜（Ｄ）の各２本鎖ＤＮＡ溶液７μｌに溶解
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈ
ｅｒｒｉｎｇ ＤＮＡ）４１３μｌを加え、分光蛍光光
度計（島津製作所 ＲＦ−５０００）を用いて励起波長
４９４ｎｍでの蛍光スペクトルを測定した。結果を図３
に示す。
液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈ
ｅｒｒｉｎｇ ＤＮＡ）４１３μｌを加え、分光蛍光光
度計（島津製作所 ＲＦ−５０００）を用いて励起波長
４９４ｎｍでの蛍光スペクトルを測定した。結果を図３
に示す。
【００９３】図３の結果から、（Ａ）及び（Ｂ）はエネ
ルギー転位可能な二種の蛍光標識ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡ
とが近接した状態にあるのでエネルギー転位が生じ、蛍
光標識がＦＩＴＣ一種である（Ｃ）及び（Ｄ）に比べて
ＦＩＴＣによる蛍光強度が明らかに低下していることが
認められた。この場合、（Ａ）及び（Ｂ）のエネルギー
転位によるＴＡＭＲＡの蛍光は僅かに認められただけで
あった。
ルギー転位可能な二種の蛍光標識ＦＩＴＣとＴＡＭＲＡ
とが近接した状態にあるのでエネルギー転位が生じ、蛍
光標識がＦＩＴＣ一種である（Ｃ）及び（Ｄ）に比べて
ＦＩＴＣによる蛍光強度が明らかに低下していることが
認められた。この場合、（Ａ）及び（Ｂ）のエネルギー
転位によるＴＡＭＲＡの蛍光は僅かに認められただけで
あった。
【００９４】〔実施例２〕次に、非標識オリゴヌクレオ
チドを用いてΔ５０８変異型の検出を行った。まず、Ｎ
ｏ．１として、実施例１で調製した（Ａ）野生型標識２
本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０
ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎｍｏｌに野生型非標識ＤＮＡ
〔ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１
０ＷＳＮ２−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）〕と２×ＰＨＦＡ
溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒ
ｉｎｇ ＤＮＡ）５０μｌを加え、最後に、滅菌水を加
えて全体を１００μｌとした。この溶液をジーンアンプ
ＰＣＲシステム９６００（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製）を用いて、９８℃で１０分間
加熱し、ＤＮＡを熱変性した後、９８℃〜６８℃までを
１℃／ｍｉｎの速度で温度を低下させて相補鎖置換反応
（コンペティティブハイブリダイゼーション）を行っ
た。
チドを用いてΔ５０８変異型の検出を行った。まず、Ｎ
ｏ．１として、実施例１で調製した（Ａ）野生型標識２
本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０
ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎｍｏｌに野生型非標識ＤＮＡ
〔ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１
０ＷＳＮ２−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）〕と２×ＰＨＦＡ
溶液（６×ＳＳＣ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒ
ｉｎｇ ＤＮＡ）５０μｌを加え、最後に、滅菌水を加
えて全体を１００μｌとした。この溶液をジーンアンプ
ＰＣＲシステム９６００（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋ
ｉｎ Ｅｌｍｅｒ）社製）を用いて、９８℃で１０分間
加熱し、ＤＮＡを熱変性した後、９８℃〜６８℃までを
１℃／ｍｉｎの速度で温度を低下させて相補鎖置換反応
（コンペティティブハイブリダイゼーション）を行っ
た。
【００９５】得られた反応溶液７０μｌに溶解液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に示す。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に示す。
【００９６】また、Ｎｏ．２として、実施例１で調製し
た（Ａ）野生型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＷＳＮ１−
ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎｍｏｌ
とΔ５０８変異型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＭＳＮ１−Ｎ
Ｈ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＭＳＮ２−ＮＨ2（３０
ｎｍｏｌ）〕とを用いた以外はＮｏ．１と同様にして相
補鎖置換反応（コンペティティブハイブリダイゼーショ
ン）を行った。
た（Ａ）野生型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＷＳＮ１−
ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＷＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎｍｏｌ
とΔ５０８変異型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＭＳＮ１−Ｎ
Ｈ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＭＳＮ２−ＮＨ2（３０
ｎｍｏｌ）〕とを用いた以外はＮｏ．１と同様にして相
補鎖置換反応（コンペティティブハイブリダイゼーショ
ン）を行った。
【００９７】得られた反応溶液７０μｌに溶解液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に示す。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に示す。
【００９８】Ｎｏ．３として、実施例１で調製した
（Ｂ）Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＭＳ
Ｎ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎ
ｍｏｌに野生型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ
2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＷＳＮ２−ＮＨ2（３０ｎ
ｍｏｌ）〕を加えた以外はＮｏ．１と同様にして、相補
鎖置換反応（コンペティティブハイブリダイゼーショ
ン）を行った。
（Ｂ）Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０ＭＳ
Ｎ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＦＩＴＣ）３ｎ
ｍｏｌに野生型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＷＳＮ１−ＮＨ
2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＷＳＮ２−ＮＨ2（３０ｎ
ｍｏｌ）〕を加えた以外はＮｏ．１と同様にして、相補
鎖置換反応（コンペティティブハイブリダイゼーショ
ン）を行った。
【００９９】得られた反応溶液７０μｌに溶解液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に併記する。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に併記する。
【０１００】また、Ｎｏ．４として、実施例１で調製し
た（Ｂ）Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０Ｍ
ＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＦＩＴＣ）３
ｎｍｏｌにΔ５０８変異型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＭＳ
Ｎ１−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＭＳＮ２−Ｎ
Ｈ2（３０ｎｍｏｌ）〕を加えた以外はＮｏ．１と同様
にして、相補鎖置換反応（コンペティティブハイブリダ
イゼーション）を行った。
た（Ｂ）Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡ（ＣＦ１０Ｍ
ＳＮ１−ＴＡＭＲＡ＝ＣＦ１０ＭＳＮ２−ＦＩＴＣ）３
ｎｍｏｌにΔ５０８変異型非標識ＤＮＡ〔ＣＦ１０ＭＳ
Ｎ１−ＮＨ2（３０ｎｍｏｌ）とＣＦ１０ＭＳＮ２−Ｎ
Ｈ2（３０ｎｍｏｌ）〕を加えた以外はＮｏ．１と同様
にして、相補鎖置換反応（コンペティティブハイブリダ
イゼーション）を行った。
【０１０１】得られた反応溶液７０μｌに溶解液（１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に併記する。
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｎｇ／μｌ ｈｅｒｒｉ
ｎｇＤＮＡ）３５０μｌを加え、励起波長４９４ｎｍで
の蛍光スペクトルを測定した。５１７ｎｍでの蛍光強度
を表１に併記する。
【０１０２】
【表１】
【０１０３】表１の結果から、Ｎｏ．１とＮｏ．２とを
対比すると、Ｎｏ．１は（Ａ）の野生型標識２本鎖ＤＮ
Ａのそれぞれの鎖と相補的な１０当量の野生型非標識Ｄ
ＮＡを加えて相補鎖置換反応を行った場合であり、Ｎ
ｏ．２は（Ａ）の野生型標識２本鎖ＤＮＡに１０当量の
Δ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補鎖置換反応を
行った場合である。Ｎｏ．１では標識ＤＮＡと非標識Ｄ
ＮＡの塩基配列がまったく同じであり、標識ＤＮＡと非
標識ＤＮＡの鎖同士の区別がつかないので、相補鎖置換
反応が起きる。一方、Ｎｏ．２では野生型とΔ５０８変
異型は３塩基の違いがあり、相補鎖置換反応がおきにく
い。このため、非標識ＤＮＡに変異を有するＮｏ．２の
方が変異を有しないＮｏ．１に比べて蛍光強度が低くな
ることが認められた。従って、野生型標識２本鎖ＤＮＡ
に野生型及びΔ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補
鎖置換反応を行うことにより、野生型非標識ＤＮＡとΔ
５０８変異型非標識ＤＮＡとを区別できることが確認で
きた。
対比すると、Ｎｏ．１は（Ａ）の野生型標識２本鎖ＤＮ
Ａのそれぞれの鎖と相補的な１０当量の野生型非標識Ｄ
ＮＡを加えて相補鎖置換反応を行った場合であり、Ｎ
ｏ．２は（Ａ）の野生型標識２本鎖ＤＮＡに１０当量の
Δ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補鎖置換反応を
行った場合である。Ｎｏ．１では標識ＤＮＡと非標識Ｄ
ＮＡの塩基配列がまったく同じであり、標識ＤＮＡと非
標識ＤＮＡの鎖同士の区別がつかないので、相補鎖置換
反応が起きる。一方、Ｎｏ．２では野生型とΔ５０８変
異型は３塩基の違いがあり、相補鎖置換反応がおきにく
い。このため、非標識ＤＮＡに変異を有するＮｏ．２の
方が変異を有しないＮｏ．１に比べて蛍光強度が低くな
ることが認められた。従って、野生型標識２本鎖ＤＮＡ
に野生型及びΔ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補
鎖置換反応を行うことにより、野生型非標識ＤＮＡとΔ
５０８変異型非標識ＤＮＡとを区別できることが確認で
きた。
【０１０４】また、Ｎｏ．３とＮｏ．４とを対比する
と、標識２本鎖ＤＮＡ、非標識ＤＮＡのいずれもがΔ５
０８変異型であるＮｏ．４は相補鎖置換反応が生じ、標
識２本鎖ＤＮＡがΔ５０８変異型で、非標識ＤＮＡが野
生型であるＮｏ．３に比べて蛍光強度が大きいことが認
められる。従って、Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡに
野生型及びΔ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補鎖
置換反応を行うことにより、野生型非標識ＤＮＡとΔ５
０８変異型非標識ＤＮＡとを区別できることが確認でき
た。
と、標識２本鎖ＤＮＡ、非標識ＤＮＡのいずれもがΔ５
０８変異型であるＮｏ．４は相補鎖置換反応が生じ、標
識２本鎖ＤＮＡがΔ５０８変異型で、非標識ＤＮＡが野
生型であるＮｏ．３に比べて蛍光強度が大きいことが認
められる。従って、Δ５０８変異型標識２本鎖ＤＮＡに
野生型及びΔ５０８変異型非標識ＤＮＡを加えて相補鎖
置換反応を行うことにより、野生型非標識ＤＮＡとΔ５
０８変異型非標識ＤＮＡとを区別できることが確認でき
た。
【０１０５】〔実施例３〕実施例１と同様の実験を表２
に示したように標識２本鎖ＤＮＡ量及び非標識ＤＮＡ量
を１／１０等量に減らして行った。マイクロタイタープ
レート用の蛍光プレートリーダー〔フルオスター（ＢＭ
Ｇ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ），励
起フィルター：４８５ｎｍ、傾向蛍光フィルター：５３
８ｎｍ〕を用いて蛍光強度の測定を行った。なお、非標
識ＤＮＡを加えなかったものをコントロールとして測定
した。結果を表２に示す。
に示したように標識２本鎖ＤＮＡ量及び非標識ＤＮＡ量
を１／１０等量に減らして行った。マイクロタイタープ
レート用の蛍光プレートリーダー〔フルオスター（ＢＭ
Ｇ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ），励
起フィルター：４８５ｎｍ、傾向蛍光フィルター：５３
８ｎｍ〕を用いて蛍光強度の測定を行った。なお、非標
識ＤＮＡを加えなかったものをコントロールとして測定
した。結果を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
【０１０７】表２の結果から、標識２本鎖ＤＮＡと非標
識ＤＮＡとが相補なＮｏ．２及びＮｏ．６の蛍光強度は
他の場合に比べて高く、これらは相補鎖置換反応が顕著
に生じていることが認められた。これに対して標識２本
鎖ＤＮＡと非標識ＤＮＡとが３塩基相違するＮｏ．３及
びＮｏ．５は相補鎖置換反応が起こらず、蛍光強度が小
さいことが認められる。従って、相補鎖置換反応におけ
る標識２本鎖ＤＮＡ量及び非標識ＤＮＡ量を減らしても
野生型とΔ５０８変異型を区別することが可能であるこ
とが確認できた。
識ＤＮＡとが相補なＮｏ．２及びＮｏ．６の蛍光強度は
他の場合に比べて高く、これらは相補鎖置換反応が顕著
に生じていることが認められた。これに対して標識２本
鎖ＤＮＡと非標識ＤＮＡとが３塩基相違するＮｏ．３及
びＮｏ．５は相補鎖置換反応が起こらず、蛍光強度が小
さいことが認められる。従って、相補鎖置換反応におけ
る標識２本鎖ＤＮＡ量及び非標識ＤＮＡ量を減らしても
野生型とΔ５０８変異型を区別することが可能であるこ
とが確認できた。
【０１０８】〔実施例４〕野生型のエキソン１０の塩基
配列を含むプラスミド（ｐＣＦ１０−３）及びΔ５０８
変異型のエキソン１０の塩基配列を含むプラスミド（ｐ
ＣＦ５０８−１）をテンプレートとして下記一対のプラ
イマー（ＣＦ１０ＥＴＰ、ＣＦ１０ＥＴＭ）を用いてポ
リメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を行った。
配列を含むプラスミド（ｐＣＦ１０−３）及びΔ５０８
変異型のエキソン１０の塩基配列を含むプラスミド（ｐ
ＣＦ５０８−１）をテンプレートとして下記一対のプラ
イマー（ＣＦ１０ＥＴＰ、ＣＦ１０ＥＴＭ）を用いてポ
リメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を行った。
【０１０９】プライマー
ＣＦ１０ＥＴＰ：
配列表の配列番号１
５’−ccattaaaga aaatatcatc−３’
ＣＦ１０ＥＴＭ：
配列表の配列番号２
５’−atattcatca taggaaacac−３’
【０１１０】ＰＣＲは常法に従って、〔変性：９４℃で
３０ｓｅｃ、アニーリング：５４℃で３０ｓｅｃ、伸
長：７２℃で６０ｓｅｃ〕のサイクルを３５回繰り返し
た。反応後、ＰＣＲ反応液を３％アガロースゲル電気泳
動で測定した。野生型のエキソン１０の塩基配列を含む
プラスミドからの反応液は４４塩基長のところにバンド
が検出された。また、Δ５０８変異型のエキソン１０の
塩基配列を含むプラスミドからの反応液は４１塩基長の
ところにバンドが検出された。
３０ｓｅｃ、アニーリング：５４℃で３０ｓｅｃ、伸
長：７２℃で６０ｓｅｃ〕のサイクルを３５回繰り返し
た。反応後、ＰＣＲ反応液を３％アガロースゲル電気泳
動で測定した。野生型のエキソン１０の塩基配列を含む
プラスミドからの反応液は４４塩基長のところにバンド
が検出された。また、Δ５０８変異型のエキソン１０の
塩基配列を含むプラスミドからの反応液は４１塩基長の
ところにバンドが検出された。
【０１１１】上記調製したＰＣＲ反応液と実施例１で調
製した標識２本鎖ＤＮＡ（Ａ），（Ｂ）との間で相補鎖
置換反応を行い、実施例３と同様にして蛍光プレートリ
ーダー〔フルオスター（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ），励起フィルター：４８５ｎ
ｍ、傾向蛍光フィルター：５３８ｎｍ〕を用いて蛍光強
度の測定を行った。結果を表３に示す。
製した標識２本鎖ＤＮＡ（Ａ），（Ｂ）との間で相補鎖
置換反応を行い、実施例３と同様にして蛍光プレートリ
ーダー〔フルオスター（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ），励起フィルター：４８５ｎ
ｍ、傾向蛍光フィルター：５３８ｎｍ〕を用いて蛍光強
度の測定を行った。結果を表３に示す。
【０１１２】
【表３】
【０１１３】表３の結果から、Ｎｏ．２とＮｏ．３とを
対比すると、野生型ＰＣＲ反応液と相補な野生型標識２
本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．２は相補鎖置換反応が生じ、
Δ５０８変異型ＰＣＲ反応液と３塩基相違する野生型標
識２本鎖ＤＮＡとを用いたＮｏ．３に比べて蛍光強度が
高くなっていることが認められる。
対比すると、野生型ＰＣＲ反応液と相補な野生型標識２
本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．２は相補鎖置換反応が生じ、
Δ５０８変異型ＰＣＲ反応液と３塩基相違する野生型標
識２本鎖ＤＮＡとを用いたＮｏ．３に比べて蛍光強度が
高くなっていることが認められる。
【０１１４】また、Ｎｏ．５とＮｏ．６とを対比する
と、Δ５０８変異型ＰＣＲ反応液と相補なΔ５０８変異
型標識２本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．６は相補鎖置換反応
が生じ、野生型ＰＣＲ反応液と３塩基相違するΔ５０８
変異型２本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．５に比べて蛍光強度
が高くなっていることが認められる。従って、ＰＣＲ反
応液中に含まれるＤＮＡが野生型であるか、Δ５０８変
異型であるかを判定できることが確認できた。
と、Δ５０８変異型ＰＣＲ反応液と相補なΔ５０８変異
型標識２本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．６は相補鎖置換反応
が生じ、野生型ＰＣＲ反応液と３塩基相違するΔ５０８
変異型２本鎖ＤＮＡを用いたＮｏ．５に比べて蛍光強度
が高くなっていることが認められる。従って、ＰＣＲ反
応液中に含まれるＤＮＡが野生型であるか、Δ５０８変
異型であるかを判定できることが確認できた。
【０１１５】
【発明の効果】本発明の核酸の識別方法によれば、検体
中の微量な遺伝子の変異又は多型を有する核酸を煩雑な
固液の分離作業を必要としない均一系において、簡易な
操作で多数の検体についての多数の変異又は多型を有す
る核酸を同時に直接短時間で検出、定量し得るものであ
る。
中の微量な遺伝子の変異又は多型を有する核酸を煩雑な
固液の分離作業を必要としない均一系において、簡易な
操作で多数の検体についての多数の変異又は多型を有す
る核酸を同時に直接短時間で検出、定量し得るものであ
る。
【０１１６】また、本発明の検査キットによれば、本発
明の識別方法に従って検体中の微量遺伝子の変異又は多
型を有する核酸を迅速に、簡単な操作で確実に検出する
ことができると共に、自動化も可能となり、医療現場に
おいて極めて有用なものである。
明の識別方法に従って検体中の微量遺伝子の変異又は多
型を有する核酸を迅速に、簡単な操作で確実に検出する
ことができると共に、自動化も可能となり、医療現場に
おいて極めて有用なものである。
【０１１７】従って、本発明によれば、検体中に含まれ
る微量な遺伝子の変異又は多型を確実に検出することが
できる上、変異又は多型を示す遺伝子の定量も可能とな
るため、医療現場における癌や特定のウィルス・細菌感
染症の早期発見、診断・治療、及び骨髄移植の成否、拒
絶反応の有無・程度等の判定などに極めて有用なもので
ある。
る微量な遺伝子の変異又は多型を確実に検出することが
できる上、変異又は多型を示す遺伝子の定量も可能とな
るため、医療現場における癌や特定のウィルス・細菌感
染症の早期発見、診断・治療、及び骨髄移植の成否、拒
絶反応の有無・程度等の判定などに極めて有用なもので
ある。
【０１１８】
【配列表】
ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＬＩＳＴＩＮＧ
<１１０>ＷＡＫＵＮＡＧＡ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ
<１２０>ＭＥＴＨＯＤ ＯＦ ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＮＧ ＯＦ
ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＡＮＤ ＥＸＡＭＩＮＡＴＩＯＮ ＫＩＴＳ
<１３０>１１３２２
<１６０>６
<２１０>１
<２１１>２０
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>１
ccattaaaga aaatatcatc 20
<２１０>２
<２１１>２０
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>２
atattcatca taggaaacac 20
<２１０>３
<２１１>４４
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>３
ccattaaaga aaatatcatc tttggtgttt cctatgatga atat 44
<２１０>４
<２１１>４１
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>４
ccattaaaga aaatatcatc ggtgtttcct atgatgaata t 41
<２１０>５
<２１１>４４
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>５
atattcatca taggaaacac caaagatgat attttcttta atgg 44
<２１０>６
<２１１>４１
<２１２>ＤＮＡ
<２１３>Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
<４００>６
atattcatca taggaaacac cgatgatatt ttctttaatg g 41
【図１】第１発明に係る核酸の識別方法を実施した場合
を示した模式図であり、（Ａ）は正常な核酸、（Ｂ）は
変異を有する核酸を示す。
を示した模式図であり、（Ａ）は正常な核酸、（Ｂ）は
変異を有する核酸を示す。
【図２】第２発明に係る核酸の識別方法を実施した場合
を示した模式図であり、（Ａ）は正常な核酸、（Ｂ）は
変異を有する核酸を示す。
を示した模式図であり、（Ａ）は正常な核酸、（Ｂ）は
変異を有する核酸を示す。
【図３】実施例１の２種の標識間におけるエネルギー転
位の様子を示した蛍光スペクトルである。
位の様子を示した蛍光スペクトルである。
【図４】従来のＧｅｌｆａｎｄらの方法を示した説明図
である。
である。
【符号の説明】
１、３ 第１の核酸
２、４ 第２の核酸
フロントページの続き
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 CA01 CA11 CA20 EA04
HA14
4B063 QA01 QA12 QA17 QA19 QQ03
QQ06 QQ08 QQ10 QQ42 QQ52
QR32 QR33 QR41 QR62 QR66
QS03 QS25 QS34 QX02
Claims (6)
- 【請求項１】 第１の核酸と第２の核酸とを混合してコ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行い、両核酸
間で相補鎖の置換が生じた程度を測定することにより、
上記第１核酸と第２核酸との同一性を識別する方法にお
いて、２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標
識の一方を導入すると共に、該第１核酸の他方の鎖の
５’端部に他方の標識を導入して第１核酸を標識し、こ
の標識第１核酸と１本鎖又は２本鎖核酸である非標識の
上記第２核酸とを混合してコンペティティブハイブリダ
イゼーションを行い、上記標識間のエネルギー転位によ
るエネルギー変化の度合を測定することにより、上記第
１核酸と第２核酸との間に生じた相補鎖の置換の程度を
測定することを特徴とする核酸の識別方法。 - 【請求項２】 第１の核酸と第２の核酸とを混合してコ
ンペティティブハイブリダイゼーションを行い、両核酸
間で相補鎖の置換が生じた程度を測定することにより、
上記第１核酸と第２核酸との同一性を識別する方法にお
いて、互いにエネルギー転位可能な少なくとも２種の標
識の一方を上記第１核酸に導入して調製した標識第１核
酸と、他方の標識を上記第２核酸に導入して調製した標
識第２核酸とを、下記（イ）〜（ハ）の組み合わせで混
合してコンペティティブハイブリダイゼーションを行
い、上記標識間のエネルギー転位によるエネルギー変化
の度合を測定することにより、上記第１核酸と第２核酸
との間に生じた相補鎖の置換の程度を測定することを特
徴とする核酸の識別方法。 （イ）上記第１核酸及び第２核酸がいずれも２本鎖核酸
であり、一方の鎖の３’端部に一方の標識を導入した標
識第１核酸と、該標識第１核酸の標識導入鎖とハイブリ
ダイズすべき側の鎖の５’端部に他方の標識を導入した
標識第２核酸との組み合わせ。 （ロ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の３’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の５’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 （ハ）２本鎖核酸である上記第１核酸の一方の鎖の５’
端部に一方の標識を導入した標識第１核酸と、１本鎖核
酸である上記第２核酸の３’端部に他方の標識を導入し
た標識第２核酸との組み合わせ。 - 【請求項３】 上記少なくとも２種の標識が、互いに近
接した状態でエネルギー転位可能な蛍光物質である請求
項１又は２記載の核酸の識別方法。 - 【請求項４】 第１核酸及び第２核酸がポリメラーゼチ
ェーン反応（ＰＣＲ）により調製されたものである請求
項１乃至３のいずれか１項記載の核酸の識別方法。 - 【請求項５】 上記第１核酸及び第２核酸のいずれか一
方が目的核酸を含む試料核酸であり、他方がこの試料核
酸との同一性を識別するための標準核酸である請求項１
乃至４のいずれか１項記載の核酸の識別方法。 - 【請求項６】 請求項５記載の方法により核酸を識別す
るための検査キットであって、検体中の目的核酸の特定
領域を増幅して試料核酸を調製するための試料核酸増幅
用試薬と、目的核酸との同一性を識別する標準核酸を調
製するための標準核酸増幅用試薬と、互いに近接した状
態でエネルギー転位可能な少なくとも２種の標識を試料
核酸及び標準核酸のいずれか一方又は双方に導入するた
めの試薬とを具備したことを特徴とする核酸の検査キッ
ト。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22816399A JP2003174882A (ja) | 1999-08-12 | 1999-08-12 | 核酸の識別方法及び核酸の検査キット |
| AU63204/00A AU6320400A (en) | 1999-08-12 | 2000-08-07 | Method of distinguishing nucleic acids and kits for nucleic acid test |
| PCT/JP2000/005286 WO2001012849A1 (fr) | 1999-08-12 | 2000-08-07 | Procede de distinction d'acides nucleiques et kits pour l'analyse d'acides nucleiques |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22816399A JP2003174882A (ja) | 1999-08-12 | 1999-08-12 | 核酸の識別方法及び核酸の検査キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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