JP5099920B2 - 核酸試験用対照 - Google Patents
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Description
本発明は、内部対照生体分子を、試験試料、ネガティブ対照試料、ポジティブ対照試料、試薬対照試料に添加して、または内部対照生体分子を、試験試料、ネガティブ対照試料、標的生体分子を含むポジティブ対照試料に添加して標的生体分子を含む試薬対照試料を提供し、各試料中でシグナルを測定してシグナルを証明し、標的生体分子を検出することで試験試料中の標的生体分子を検出する方法に関する。本発明はまた、標的生体分子の存在を示すシグナルの測定を証明する方法に関する。本発明はさらに、試料中の標的核酸のグループの一員の存在または非存在を検出する方法および標的核酸のグループの一員の存在を示すシグナルの測定を証明する方法に関する。使用およびキットが同様に考慮される。
核酸の測定は、分析化学において、特に健康ケアにおいて重要なツールになっている。例えば、感染疾患および遺伝的状態は個体から受けた試料中の疾患または状態を示す核酸の存在または量を基にして容易に測定され得る。この理由のために、核酸、好ましくはオリゴヌクレオチドの疾患または遺伝的状態を示す標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを用いる方法が確立された。多くの標的核酸は、生物中に生物由来の試料中の直接検出が可能でないような低濃度で存在する。かかる標的は検出前に増幅されることが必要である。適切な増幅方法は例えば、LCR (U.S. 特許第5,185,243号, 第5,679,524号および第5,573,907号; EP 0 320 308; WO 90/01069; WO 89/12696; および WO 89/09835)、サイクリングプローブ技術(U.S. 特許第5,011,769号, 第5,403,711号, 第5,660,988号, および 第4,876,187号, および 公開PCT出願 WO 95/05480, WO 95/14106, および WO 95/00667)、InvaderTM 技術 (U.S.特許第5,846,717号; 第5,614, 402号; 第5,719,028号; 第5,541, 311号; および 第5,843,669号)、Q-ベータリプリカーゼ技術(U.S. 特許第4,786, 600号)、NASBA (U.S. 特許第5,409,818号; EP-0 329 822)、TMA (U.S. 特許第5,399,491号, 第5,888,779号, 第5,705,365号, 第5,710,029号), SDA (U.S. 特許第5, 455,166号および 第5,130,238号) ならびに PCR (US-A-4,683,202)である。
生体分子の検出方法を制御するための新しい概念を提供することは本発明の課題であった。
以下の工程:
a) 工程a1)または工程a2)からなる工程、
a1)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、
標的生体分子を含むポジティブ対照試料、および
標的生体分子を含む試薬対照試料
に添加する工程、
a2)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、および
標的生体分子を含むポジティブ対照試料、
に添加する工程、ならびに
標的生体分子を含む試薬対照試料を提供する工程、
b)精製された生体分子を含む試料を得るために工程a)の試料から生体分子を任意に精
製する工程、
c)内部対照生体分子および標的生体分子のシグナルの存在または非存在を工程a)また
は工程b)で得られた各試料中で測定する工程、
d)内部対照生体分子のシグナルの存在と独立して標的生体分子のシグナルの存在につい て標的生体分子を含むことが疑われる試料を調べること、または標的生体分子のシグ ナルが非存在である場合に内部対照生体分子のシグナルの存在について調べること、
内部対照生体分子のシグナルの存在および標的生体分子のシグナルの非存在について ネガティブ対照試料を調べること、
標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在についてポジティブ対照試料 を調べること、ならびに
方法の工程d)において標的生体分子のシグナルの存在について試薬対照試料を調べ ること、または標的生体分子および任意に内部対照生体分子のシグナルの存在につい て試薬対照試料を調べること、
によって標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子のシグナルの存在 または非存在を証明する工程、
e)標的生体分子の存在または非存在を検出する工程であって、工程c)で測定され、か つ工程d)で証明された標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在また は非存在が試験試料中の標的生体分子の存在または非存在を示す、工程
を含む、標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子の存在または非存在を検出する方法が提供される。
a)標的生体分子を含むことが疑われ、内部対照生体分子を含む試料、および
内部対照生体分子を含み、標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、および
標的生体分子および内部対照生体分子を含むポジティブ対照試料、
標的生体分子および任意に内部対照生体分子を含む試薬対照試料
を提供する工程、
b)内部対照生体分子および標的生体分子のシグナルを各試料中で測定する工程、
c)内部対照生体分子のシグナルの存在と独立して標的生体分子のシグナルの存在につい て標的生体分子を含むことが疑われる試料を調べること、または標的生体分子のシグ ナルが非存在である場合に内部対照生体分子のシグナルの存在について調べること、
内部対照生体分子のシグナルの存在および標的生体分子のシグナルの非存在について ネガティブ対照試料を調べること、
標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在についてポジティブ対照試料 を調べること、および
標的生体分子および任意に内部対照生体分子のシグナルの存在について試薬対照試料 を調べること
によって試験試料中の標的生体分子の存在を示す試験試料中の標的生体分子のシグナ ルの存在を証明する工程
を含む。
a)内部対照核酸を、
標的核酸のグループの一員(または標的核酸)を含むことが疑われる試料、および
標的核酸のグループの一員(または標的核酸)を含まないネガティブ対照試料、およ び
標的核酸のグループの一員(または標的核酸)を含むポジティブ対照試料
に添加する工程、
b)標的核酸のグループおよび任意に内部対照核酸を含む試薬対照試料を提供する工程、
c)精製された核酸を含む試料を得るために工程a)および/または工程b)の試料から 核酸を任意に精製する工程、
d)内部対照核酸および標的核酸のグループの一員(または標的核酸)のシグナルの存在 または非存在を、工程a)および工程b)または工程b)および工程c)で得られた 各試料中で測定する工程、
e)内部対照核酸のシグナルの存在と独立して標的核酸のグループの一員(または標的核 酸)の存在について標的核酸のグループの一員(または標的核酸)を含むことが疑わ れる試料を調べること、または標的核酸のグループの一員(または標的核酸)が非存 在である場合に内部標的核酸のシグナルの存在について調べること、
内部対照核酸のシグナルの存在および標的核酸のシグナルの非存在についてネガティ ブ対照試料を調べること、
標的核酸のグループの各一員(または標的核酸)および任意に内部対照核酸のシグナ ルの存在について試薬対照試料を調べること、ならびに
標的核酸のグループの一員(または標的核酸)および内部対照核酸のシグナルの存在 についてポジティブ対照試料を調べること、
によって標的核酸のグループの一員(または標的核酸)を含むことが疑われる試料中 の標的核酸のグループの一員(または標的核酸)のシグナルの存在または非存在を証 明する工程、または
f)標的核酸のグループの一員(または標的核酸)の存在または非存在を検出する工程で あって、工程d)で測定され、かつ工程e)で証明された標的核酸のグループの一員 (または標的核酸)および内部対照核酸のシグナルの存在および/または非存在が標的 核酸のグループの一員(または標的核酸)を含むことが疑われる試料中の標的核酸の グループの一員(または標的核酸)の存在または非存在を示す、工程、
によるものである。
a)標的核酸のグループの一員を含むことが疑われ、内部対照核酸を含む試料、
標的核酸のグループおよび任意に内部対照核酸を含む試薬対照試料、
標的核酸のグループの一員を含まず、内部対照核酸を含むネガティブ対照試料、およ び
標的核酸のグループの一員および内部対照核酸を含むポジティブ対照試料
を提供する工程、
b)内部対照核酸および標的核酸のグループの一員のシグナルを各試料中で測定する工 程、
c)内部対照核酸のシグナルの存在と独立して標的核酸の一員のシグナルの存在について 標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料を調べること、または標的核酸 のグループの一員のシグナルが非存在である場合に内部対照核酸のシグナルの存在に ついて試料を調べること、
標的核酸のグループの各一員のシグナルの存在について試薬対照試料を調べること、
標的核酸のグループの一員のシグナルの非存在および内部対照核酸のシグナルの存在 についてネガティブ対照試料を調べること、および
標的生体分子および内部対照核酸のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調 べること、
によって標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグルー プの一員のシグナルの存在を証明する工程、
を含む、標的核酸のグループの一員の存在を示すシグナルの測定を証明する方法が提供される。
a)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含む試薬対照試料、
b)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含まないネガティブ対照試料、
c)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含むポジティブ対照試料、
d)内部対照核酸、ならびに
e)標的核酸または標的核酸のグループの一員を検出する試薬
を含む標的核酸または標的核酸のグループの一員を検出するキットが提供される。
当該技術分野の技術範囲である分子生物学および核酸化学の従来の技術は文献に説明される。例えば、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, a practical approach, ed. 1984, IRL Press, Oxford, England; Hames, B.D., およびHiggins, S.J., Nucleic Acid Hybridisation, a practial approach, ed. 1985, IRL Press, Oxford, England; ならびにEnzymology, Academic Press, Inc.の一連の方法を参照、全ては参照によって本明細書に援用される。全ての特許、特許出願、および本明細書で言及される公開物、上掲および後掲の両方は、参照によって本明細書に援用される。
以下の工程:
a)工程a1)または工程a2)からなる工程、
a1)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、
標的生体分子を含むポジティブ対照試料、および
標的生体分子を含む試薬対照試料
に添加する工程、
a2)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、および
標的生体分子を含むポジティブ対照試料
に添加する工程、ならびに
標的生体分子を含む試薬対照試料を提供する工程、
b)精製された生体分子を含む試料を得るために工程a)の試料から生体分子を任意
に精製する工程、
c)内部対照生体分子および標的生体分子のシグナルの存在または非存在を工程a)
または工程b)で得られた各試料中で測定する工程、
d)内部対照生体分子のシグナルの存在と独立して標的生体分子のシグナルの存在に
ついて標的生体分子を含むことが疑われる試料を調べること、または標的生体分子の
シグナルが非存在である場合に内部対照生体分子のシグナルの存在について調べるこ
と、
内部対照生体分子のシグナルの存在および標的生体分子のシグナルの非存在について
ネガティブ対照試料を調べること、
標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在についてポジティブ対照試料
を調べること、ならびに
方法の工程d)において標的生体分子のシグナルの存在について試薬対照試料を調べ
ること、または標的生体分子および任意に内部対照生体分子のシグナルの存在につい
て試薬対照試料を調べること、
によって標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子のシグナルの存在
または非存在を証明する工程、
e)標的生体分子の存在または非存在を検出する工程であって、工程c)で測定さ
れ、かつ工程d)で証明された標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存
在または非存在が試験試料中の標的生体分子の存在または非存在を示す、工程、
を含む、標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子の存在または非存在を検出する方法が提供される。
c1)工程a)または工程b)で得られた試料に、
− 内部対照核酸および標的核酸にハイブリダイズするプライマー対、または第一のものが内部対照核酸にハイブリダイズし、第二のものが標的核酸にハイブリダイズする2つのプライマー対、
− 内部対照核酸にハイブリダイズする第一プローブ対であって、該第一プローブ対の一員が、互いに5ヌクレオチド以内の間隔で内部対照核酸にハイブリダイズし、該第一プローブ対の第一プローブは、第一ドナー蛍光標識で標識され、該第一プローブ対の第二プローブは、対応する第一アクセプター蛍光標識で標識され、内部対照核酸への第一プローブおよび第二プローブのハイブリダイゼーションが共鳴エネルギー転移関係をもたらす、第一プローブ対;
− 標的核酸にハイブリダイズする第二プローブ対であって、該第二プローブ対の一員は、互いに5ヌクレオチド以内の間隔で標的核酸にハイブリダイズし、該第二プローブ対の第一プローブは、第二ドナー蛍光標識で標識され、該第二プローブ対の第二プローブは、対応する第二アクセプター蛍光標識で標識され、標的核酸への第一プローブおよび第二プローブのハイブリダイゼーションが共鳴エネルギー転移関係をもたらす、第二プローブ対;ならびに
− 熱安定性核酸ポリメラーゼ、および内部対照核酸および標的核酸を増幅するために必要な試薬
を添加する工程、
c2)各試料中に存在する場合、内部対照核酸および標的核酸を試料中で増幅する工程、
c3) 各試料の温度の関数として内部対照核酸および標的核酸の蛍光シグナルの存在または非存在を別々に各試料中で測定する工程であって、
− 内部対照核酸に特異的な蛍光シグナルが第一プローブ対の該第一プローブの第一ドナー蛍光標識と第一プローブ対の第二プローブの第一アクセプター蛍光標識との間での蛍光共鳴エネルギー転移によって生じ、
− 標的核酸に特異的な蛍光シグナルが第二プローブ対の該第一プローブの第一ドナー蛍光標識と第二プローブ対の第二プローブの第一アクセプター蛍光標識との間での蛍光共鳴エネルギー転移によって生じる、工程
を含む。
−ハイブリダイゼーション時の増大蛍光共鳴エネルギー転移
が挙げられる。
分子ビーコンオリゴヌクレオチドは、分子の二次構造により互いに近接する蛍光化合物およびクエンチャー化合物で標識される。標的DNAに結合すると、分子内水素結合が壊れ、プローブの1つの末端に結合された蛍光化合物がプローブの反対の末端に結合されたクエンチャー化合物から分離する(Lizardi et al., 米国特許第5,118,801号)。
a)グラム陽性菌は、Proteus mirabilis、Serratia marcescens、Acinetobacter baumannii、Klebsiella pneumoniae、Klebsiella oxytoca、Enterobacter aerogenes、Enterobacter cloacae、Escherichia coli、Pseudomonas aeruginosa、もしくはStenotrophomonas maltophiliaであり、
b)グラム陰性菌は、Staphylococcus種、Enterococcus faeciumもしくはfaecalis、もしくはStreptococcus種であり、または
c)真菌は、Candida albicans、Aspergillus fumigatus、Candida krusei、Candida glabrata、Candida parapsilosis、もしくはCandida tropicalisである。
a)標的生体分子を含むことが疑われ、内部対照生体分子を含む試料、および
− 内部対照生体分子を含み、標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、および
− 標的生体分子および内部対照生体分子を含むポジティブ対照試料
− 標的生体分子および任意に内部対照生体分子を含む試薬対照試料
を提供する工程、
b)内部対照生体分子および標的生体分子のシグナルを各試料中で測定する工程、
c) −内部対照生体分子のシグナルの存在と独立して標的生体分子のシグナルの存在について標的生体分子を含むことが疑われる試料を調べること、または標的生体分子のシグナルが非存在である場合に内部対照生体分子のシグナルの存在について調べること、
− 内部対照生体分子のシグナルの存在および標的生体分子のシグナルの非存在についてネガティブ対照試料を調べること、
− 標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調べること、ならびに
− 標的生体分子および任意に内部対照生体分子のシグナルの存在について試薬対照試料を調べること
によって試験試料中の標的生体分子の存在を示す試験試料中の標的生体分子のシグナルの存在を証明する工程
を含む。
a)内部対照核酸を、
− 標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料、および
− 標的核酸のグループの一員を含まないネガティブ対照試料、および
− 標的核酸のグループの一員を含むポジティブ対照試料
に添加する工程、
b)標的核酸のグループおよび任意に内部対照核酸を含む試薬対照試料を提供する工程、
c)精製された核酸を含む試料を得るために工程a)および/または工程b)の試料から核酸を任意に精製する工程、
d)工程a)および工程b)または工程b)および工程c)で得られた各試料中で内部対照核酸のシグナルおよび標的核酸のグループの一員のシグナルの存在または非存在を測定する工程、
e) −内部対照核酸のシグナルの存在と独立して標的核酸のグループの一員のシグナルの存在について標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料を調べること、または標的核酸のグループの一員のシグナルが非存在である場合に内部対照核酸のシグナルの存在について調べること
− 内部対照核酸のシグナルの存在および標的核酸のシグナルの非存在についてネガティブ対照試料を調べること
− 標的核酸のグループの各一員および任意に内部対照核酸のシグナルの存在について試薬対照試料を調べること、ならびに
− 標的核酸のグループの一員および内部対照核酸のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調べること
によって標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグループの一員のシグナルの存在または非存在を証明する工程、
f)標的核酸のグループの一員の存在または非存在を検出する工程であって、工程d)で測定され、かつ工程e)で証明された標的核酸のグループの一員および内部対照核酸のシグナルの存在および/または非存在が標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグループの一員の存在または非存在を示す、工程
を含むまたはによって、標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグループの一員の存在または非存在を検出する方法が提供される。
d1)工程a)および工程b)または工程b)および工程c)で得られた試料に、
− 内部対照核酸および標的核酸のグループの一員にハイブリダイズするプライマー対、または内部対照核酸にハイブリダイズするプライマー対およびその各一員が標的核酸のグループの一員にハイブリダイズするプライマー対のグループ、
− 内部対照核酸にハイブリダイズする第一プローブ対であって、該第一プローブ対の一員は、互いに5ヌクレオチド以内の間隔で内部対照核酸にハイブリダイズし、該第一プローブ対の第一プローブは、第一ドナー蛍光標識で標識され、該第一プローブ対の第二プローブは、対応する第一アクセプター蛍光標識で標識され、内部対照核酸への第一プローブおよび第二プローブのハイブリダイゼーションが共鳴エネルギー転移関係をもたらす、第一プローブ対;
− 各一員が標的核酸のグループの一員にハイブリダイズするプローブ対のグループであって、プローブ対のグループの一員は、互いに5ヌクレオチド以内の間隔で標的核酸のグループの各一員にハイブリダイズし、プローブ対のグループの一員の第一プローブは、第二ドナー蛍光標識で標識され、プローブ対のグループの一員の第二プローブは、対応する第二アクセプター蛍光標識で標識され、標的核酸のグループの一員への第一プローブおよび第二プローブのハイブリダイゼーションが共鳴エネルギー転移関係をもたらす、プローブ対のグループ;ならびに
− 熱安定性核酸ポリメラーゼ、および内部対照核酸および標的核酸のグループを増幅するために必要な試薬
を添加する工程、
d2)各試料に存在する場合、内部対照核酸および標的核酸のグループを試料中で増幅する工程、
d3)各試料の温度の関数として内部対照核酸および/または標的核酸のグループの一員の蛍光シグナルの存在または非存在を別々に各試料中で測定する工程であって、
− 内部対照核酸に特異的な蛍光シグナルが第一プローブ対の該第一プローブの第一ドナー蛍光標識と第一プローブ対の第二プローブの第一アクセプター蛍光標識との間での蛍光共鳴エネルギー転移によって生じ、
− 標的核酸のグループの一員に特異的な蛍光がプローブ対のグループの一員の該第一プローブの第一ドナー蛍光標識とプローブ対のグループの一員の第二プローブの第一アクセプター蛍光標識との間での蛍光共鳴エネルギー転移によって生じる、工程
を含む。
− a)グラム陽性菌は、プロテウス ミラビリス(Proteus mirabilis)、セラチア マルセッセンス(Serratia marcescens)、アシネトバクター バウマンニ(Acinetobacter baumannii)、クレブシエラ ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、エンテロバクター アエロゲネス(Enterobacter aerogenes)、エンテロバクター クロアカ(Enterobacter cloacae)、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、もしくはステノトロフォモナス マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)であり、
b)グラム陰性菌は、スタフィロコッカス種(Staphylococcus spp.)、エンテロコッカス フェシウム(Enterococcus faecium)あるいはエンテロコッカス フェシウム(Enterococcus faecalis)もしくはストレプトコッカス種(Streptococcus spp.)であり、または
c)真菌は、カンジダ アルビカンス(Candida albicans)、アスペルギルス フミガタス(Aspergillus fumigatus)、カンジダ クルセイ(Candida krusei)、カンジダ グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ パラプシロシス(Candida parapsilosis)、もしくはカンジダ トロピカリス(Candida tropicalis)である。
a)− 標的核酸のグループの一員を含むことが疑われ、内部対照核酸を含む試料、
− 標的核酸のグループおよび任意に内部対照核酸を含む試薬対照試料、
− 標的核酸のグループの一員を含まず、内部対照核酸を含むネガティブ対照試料、ならびに
− 標的核酸のグループの一員および内部対照核酸を含むポジティブ対照試料
を提供する工程、
b)内部対照核酸および標的核酸のグループの一員のシグナルを各試料中で測定する工程、
c)− 内部対照核酸のシグナルの存在と独立して標的核酸の一員のシグナルの存在について標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料を調べること、または標的核酸のグループの一員のシグナルが非存在である場合に内部対照核酸のシグナルの存在について試料を調べること
− 標的核酸のグループの各一員のシグナルの存在について試薬対照試料を調べること
− 標的核酸のグループの一員のシグナルの非存在および内部対照核酸のシグナルの存在についてネガティブ対照試料を調べること、ならびに
− 標的生体分子および内部対照核酸のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調べること
によって標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグループの一員のシグナルの存在を証明する工程
を含む、標的核酸のグループの一員の存在を示すシグナルの測定を証明する方法が提供される。
a)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含む試薬対照試料、
b)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含まないネガティブ対照試料、
c)標的核酸または標的核酸のグループの一員を含むポジティブ対照試料、
d)内部対照核酸、および
e)標的核酸または標的核酸のグループの一員を検出する試薬
を含む、標的核酸または標的核酸のグループの一員の検出用キットが提供される。
標的核酸または標的核酸のグループの一員を検出する試薬は、
− プローブ対およびプライマー対、
− 熱安定性核酸ポリメラーゼ、ならびに
− 標的核酸または標的核酸のグループの一員を増幅する試薬
を含む。
すべての試薬は、検出される生物による汚染について調べる必要がある。該生物およびそれに由来する核酸のない試薬のみによって最適感度がもたらされ得る。
16s rRNA(リボソームリボ核酸)および23sRNA遺伝子(細菌標的)の間ならびに18s rRNAおよび28sRNA遺伝子(真菌標的)の間にITS領域(ITS:内部転写スペーサー)を含むプラスミドDNA(ほぼ104コピーのプラスミドDNA)の混合物を、RC G-、RC G+、RC FおよびIC対照試薬(RC:試薬対照、G-:グラム陰性、G+:グラム陽性、F:真菌、IC:内部対照)の調製のために使用した。
pTE-Smar-1: S.marcescens 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Abau-1: A.baumannii 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Koxy-1: K.oxytoca 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Eclo-1: E.cloacae 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Ecol-1: 大腸菌16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Pmir-1: P.mirabilis 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Paer-2 P. aeruginosa 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Smal-1: S.maltophilia 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pStaph_wt: S. aureus 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pEntero_l: E. faecalis 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pEntero_2: E. faecium 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pStrep_wt S.pneumoniae 16S/23S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pAfum-PC-PFl: A. fumigatus 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pCgla-PC-PFl: C. glabrata 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pCalb-PC-PFl: C. albicans 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pCkru-PC-PFl: C. krusei 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pCtrop-PC-PFl: C.tropicalis 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pCpara-PC-PFl: C.parapsilosis 18S/28S-rRNA-スペーサー領域を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pTE-Paer-IC/2: P. aeruginosa 16S/23S-rRNA-スペーサー領域およびIC G特異的プローブ結合部位を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pIC G+: E.faecium 16S/23S-rRNA-スペーサー領域およびIC G+特異的プローブ結合部位を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
pAfum(FP10/21)-ICv2-PFl: C. albicans 18S/28S-rRNA-スペーサー領域およびIC F特異的プローブ結合部位を含むpT3T7BMに基づくプラスミド
100μlキャピラリーローターを有するLightCyclerTM2.0機器(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を、610nm、640nm、670nmおよび705nmでのハイブリダイゼーションプローブの蛍光検出に使用した。生データの作成およびデータの分析は、LightCyclerソフトウェア4.05(Roche Diagnostics GmbH、Germany)を用いて行なった。
本明細書に述べたすべてのオリゴヌクレオチドは、化学合成によって調製した。標識を結合させるための試薬は、Roche Diagnostics GmbHから購入することができる(LightCycler Red 640 NHSエステル カタログ番号2015161;LightCycler Red 705ホスホルアミダイト カタログ番号2157594;LightCyclerフルオレセイン(以下、「F」と略記)CPGカタログ番号3113906)。該試薬の使用は、Biochemica No. 1 (2001)、p.8-13に記載されている。Cy5-NHSエステルは請求によりAmershamから得られる。LC-Red 610-NHSエステルは、610nmで最大の発光を有し、US 5,750,409に開示された蛍光色素を用いて標準的なプロトコルに従って合成した。
試料(特に臨床用試料)を試料調製に供し、このとき、試料のその他の成分から核酸を放出させ、精製した。これは、MagNA PureTM LC and MagNA PureTM LC DNA単離キットIII(細菌、真菌)(Roche Diagnostics GmbH、Germany、カタログ番号3 264 785)を用いて行なった。試料調製により、溶出バッファー中に核酸を含む被検物がもたらされた。
Claims (15)
- 以下の工程:
a) 工程a1)または工程a2)からなる工程、
a1)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、および
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、
標的生体分子を含むポジティブ対照試料、および
標的生体分子を含む第2のポジティブ対照試料
に添加する工程、
a2)内部対照生体分子を、
標的生体分子を含むことが疑われる試料、および
標的生体分子を含まないネガティブ対照試料、および
標的生体分子を含むポジティブ対照試料、
に添加する工程、ならびに
標的生体分子を含む第2のポジティブ対照試料を提供する工程、
b)精製された生体分子を含む試料を得るために工程a)の試料から生体分子を精製する工程、ここで、ポジティブ対照試料は、該精製に供されるが、第2のポジティブ対照試料は、該精製に供されない、
c)内部対照生体分子のシグナルおよび標的生体分子のシグナルの存在または非存在を工程a)または工程b)で得られた各試料中で測定する工程、
d)内部対照生体分子のシグナルの存在と独立して標的生体分子のシグナルの存在について標的生体分子を含むことが疑われる試料を調べること、または標的生体分子のシグナルが非存在である場合に内部対照生体分子のシグナルの存在について調べること、
内部対照生体分子のシグナルの存在および標的生体分子のシグナルの非存在についてネガティブ対照試料を調べること、
標的生体分子のシグナルの存在および内部対照生体分子のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調べること、ならびに
標的生体分子のシグナルの存在について第2のポジティブ対照試料を調べること、または標的生体分子のシグナルおよび任意に内部対照生体分子のシグナルの存在について第2のポジティブ対照試料を調べること
によって標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子のシグナルの存在または非存在を証明する工程、ならびに
e)標的生体分子の存在または非存在を検出する工程、ここで、工程c)で測定され、かつ工程d)で証明された標的生体分子および内部対照生体分子のシグナルの存在または非存在が、標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子の存在または非存在を示す、
を含む、標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子の存在または非存在を検出する方法。 - ポジティブ対照試料が、標的生体分子を含むウイルス、微生物または細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 標的生体分子が標的生体分子のグループである、請求項1または2記載の方法。
- 生体分子が核酸である、請求項1〜3いずれか記載の方法。
- 標的核酸および内部対照核酸が工程c)の前に増幅される、請求項4記載の方法。
- 標的核酸または内部対照核酸のシグナルが、蛍光シグナルである、請求項4または5記載の方法。
- 蛍光シグナルが、標的核酸または内部対照核酸にハイブリダイズするプローブに結合した標識によって生じる、請求項6記載の方法。
- 標的核酸の核酸配列が、微生物、細胞またはウイルスに特異的な核酸配列である、請求項4〜7いずれか記載の方法。
- a)内部対照核酸を、
標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料、および
該標的核酸のグループの該一員を含まないネガティブ対照試料、および
該標的核酸のグループの該一員を含むポジティブ対照試料
に添加する工程、
b)該標的核酸のグループおよび任意に内部対照核酸を含む第2のポジティブ対照試料を提供する工程、
c)精製された核酸を含む試料を得るために工程a)および/または工程b)の試料から核酸を精製する工程、ここで、ポジティブ対照試料は、該精製に供されるが、第2のポジティブ対照試料は、該精製に供されない、
d)工程a)および工程b)、または工程b)および工程c)で得られた各試料中で内部対照核酸のシグナルおよび該標的核酸のグループの該一員のシグナルの存在または非存在を測定する工程、
e)内部対照核酸のシグナルの存在と独立して該標的核酸のグループの該一員のシグナルの存在について該標的核酸のグループの該一員を含むことが疑われる試料を調べること、または該標的核酸のグループの該一員のシグナルが非存在である場合に内部対照核酸のシグナルの存在について調べること、
内部対照核酸のシグナルの存在および標的核酸のシグナルの非存在についてネガティブ対照試料を調べること、
該標的核酸のグループの各一員のシグナルおよび任意に内部対照核酸のシグナルの存在について第2のポジティブ対照試料を調べること、ならびに
該標的核酸のグループの該一員のシグナルの存在および内部対照核酸のシグナルの存在についてポジティブ対照試料を調べること
によって該標的核酸のグループの該一員を含むことが疑われる試料中の該標的核酸のグループの該一員のシグナルの存在または非存在を証明する工程、ならびに
f)該標的核酸のグループの該一員の存在または非存在を検出する工程、ここで、工程d)で測定され、かつ工程e)で証明された該標的核酸のグループの該一員および内部対照核酸のシグナルの存在または非存在が、該標的核酸のグループの該一員を含むことが疑われる試料中の該標的核酸のグループの該一員の存在または非存在を示す、
によって標的核酸のグループの一員を含むことが疑われる試料中の標的核酸のグループの一員の存在または非存在を検出する方法。 - 内部対照核酸が標的核酸の一部を含み、
ポジティブ対照試料が、標的核酸を含むウイルス、微生物もしくは細胞を含み、または、ポジティブ対照試料が、標的核酸もしくはその一部を含む溶液であり、または
第2のポジティブ対照試料が、標的核酸またはその一部を含む溶液である、請求項9記載の方法。 - 該標的核酸のグループの該一員および内部対照核酸が、工程d)の前に増幅される、請求項9または10記載の方法。
- 該標的核酸のグループの該一員のシグナルまたは内部対照核酸のシグナルが、蛍光シグナルである、請求項9〜11いずれか記載の方法。
- 蛍光シグナルが、該標的核酸のグループの該一員または内部対照核酸にハイブリダイズするプローブに結合した標識によって生じる、請求項12記載の方法。
- 該標的核酸のグループの該一員が、微生物、細胞またはウイルスに特異的な核酸配列を含む、請求項9〜13いずれか記載の方法。
- 標的生体分子を含むことが疑われる試料中の標的生体分子の存在もしくは非存在を検出するための、または標的生体分子の存在を示すシグナルの測定を証明するための、任意に内部対照生体分子を含む第2のポジティブ対照試料および内部対照生体分子を含むポジティブ対照試料の使用であって、両試料は標的生体分子を含み、ポジティブ対照試料は、その中に含まれる標的生体分子を得るための精製工程に供されるが、第2のポジティブ対照試料は、該精製工程に供されない、使用。
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