CN102844446A - 目标碱基序列的识别方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种伴随竞争性杂交的碱基序列的识别方法，该方法在保持识别碱基序列差异的精度的同时，可在与现有方法相比非常短的时间内识别具有目标碱基序列的核酸。本发明的目标碱基序列的识别方法，具有下述工序：热变性工序，其将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理；降温工序，其在上述热变性工序之后，通过使上述反应液的温度降低，从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交；测定工序，其对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定；和识别工序，其基于通过上述测定工序得到的测定结果，识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性。并且，上述降温工序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。

Description

目标碱基序列的识别方法

技术领域

本发明涉及一种识别试样所含的核酸是否为具有目标碱基序列的核酸的方法，更详细地说，涉及一种在竞争性杂交中可改善核酸识别性和缩短反应时间的方法。

本申请基于2010年3月29日向日本提交的日本特愿2010-075297号要求优先权，将其内容援用于此。

背景技术

通过人类基因组的解读、特别是通过制作SNP（Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性）图谱的国际人类基因组单体型图计划，有关人类基因组的信息日趋增加。而且，在全世界范围内已经大规模开展以实现下述“对应于个人遗传信息的医疗”（量身定制式医疗）作为目标的研究：通过发现所获得的基因组信息与个人体质之间的关联，掌握基因水平上的个人体质差别，可对应于个人特性进行疾病诊断、治疗、预防或施药。这里的基因差别意味着每个人的基因组碱基序列上的差别，其主要差别是一个碱基的差别（SNP）。另外，最近，已了解短碱基序列的重复次数（拷贝数）的差别（拷贝数变异（Copy Number variation：CNV））也广泛存在于全基因组中，并指出了该CNV的差别与疾病之间的关联性。

在此，为了掌握个人在基因水平上的差别，有必要调查每个人的基因型。例如，已知在某SNP中，其基因型为AA、AG、GG三种。A表示腺嘌呤、G表示鸟嘌呤碱基，该SNP是基因组位置有腺嘌呤的情形和鸟嘌呤的情形的一个例子。因此，为识别该SNP的基因型的检查，就是要确定是该三种基因型中的哪一种。即，只要发现A是0和100中的哪一个、G是0和100中的哪一个或者A和G是否为50和50即可。

如此，SNP等的生殖细胞系列突变的检测，基本可以说是定性的检测，该方法是较容易的，各种简便的方法得到实用化。

另一方面，在癌细胞中，在体细胞水平上发生突变并且该突变成为癌的诱因而与异常增殖有关。因此，在某特定种类的癌细胞中，有时会出现特定基因的突变，可以将该突变作为指标进行癌细胞的检测。但是，癌细胞富有多样性，根据一种突变来确定癌细胞未必是容易的。

另外，在最近的药物疗法中，开发了以生物体内特定的分子（蛋白质等）作为目标的药剂，且发现了副作用少、效果高的药剂。它们被称作分子靶向药物，主要在癌治疗领域中得到积极的开发。极其最近，明确了在这些分子靶向药物中，当作为靶目标的分子的信号传递的下游蛋白质中发生突变时，则该药剂的效果得不到发挥等。此时，通过调查对发生了突变的蛋白质进行编码的基因的突变，可以预测该药剂的效果，不断开拓与SNP检测不同的新型“量身定制式医疗”的领域。

在此所述的癌细胞中的特征性突变或者对分子靶向药物显示抵抗性的突变，几乎都是体细胞突变。在前述的生殖细胞系列突变时在所有细胞中均发现相同的突变，与此相对，在体细胞突变中只在引起突变的细胞中发现突变，在未引起突变的细胞（通常为正常细胞）中未发现突变。因此，通常在标本（作为检查对象的试样）中处于突变细胞和正常细胞相混合的状态，对应于这些细胞的丰度比（abundance ratio），存在有突变基因和正常基因。

即，若试样的大部分是正常细胞而含有部分突变细胞，则不得不从大量正常基因中检测出所存在的少许突变基因，而这就是体细胞的基因突变检测与生殖细胞中的突变检测的不同点，使体细胞的基因突变检测变得更加困难。

在体细胞的基因突变检测法中，大致分为两种方法。其中，一种是在检测过程的基因扩增阶段区别正常基因和突变基因的方法，具体而言，是只对突变基因进行特异性扩增的方法。

例如，作为灵敏度最好的方法，是用限制酶只对正常基因进行切割并只对未切割的突变基因进行扩增的、被称作“突变体富集PCR（mutant-enrichedPCR）”的方法（例如，参照非专利文献1）。在该方法中，通过反复进行扩增突变基因的反应，可以从正常基因10⁶分子中检测出1分子的突变基因（例如，参照非专利文献2）。该方法在这种所谓高灵敏度的方面优良，但操作非常繁杂，并不是可以适用于通常的诊断中的方法。

另外，开发了一种在PCR等的引物的延伸反应中通过区分一个碱基的差别进行扩增的方法。该方法是被称作“ARMS（amplification refractory mutationsystem，扩增抑制突变系统）”（例如，参照非专利文献3）、或“ASPCR（allele specific PCR，等位基因特性PCR）”（例如，参照非专利文献4）等的方法。该方法是一种优异的方法，灵敏度较高，不需要再进行除通常PCR扩增反应以外的操作，可以在封闭系统中进行全部反应，所以非常简便，不存在PCR遗留污染。然而，但凡有一次错误识别一个碱基而进行了正常基因的扩增时，则在此后的扩增反应中，也会与扩增突变基因同样地扩增正常基因，因此，也可以称作一种假阳性危险高的方法。当采用该方法时，需要严格控制反应条件（即，反应温度、盐浓度等），并且模板量也需要严格相同（例如，参照非专利文献5），因此对检查非特定多数的标本的临床检查或者要求高精度的诊断中并不适合采用。

另一种检测体细胞的基因突变的方法，是在检测过程中同时扩增突变基因和正常基因后通过区别突变基因和正常基因来进行检测的方法。作为通过区别所扩增的突变基因和正常基因进行检测的方法，有利用电泳的方法、利用杂交的各种方法（例如，参照非专利文献5）。然而，在大部分方法中，很难以良好的精度检测出包含在大量正常基因中的少量突变基因。例如，作为被称作突变基因检测的金标准（gold standard）的方法，有双脱氧测序法（dideoxy sequencing）。尽管双脱氧测序法能够以较高灵敏度检测突变基因，但当突变基因和正常基因混在时，突变基因的检测灵敏度为10％左右，作为实际检查所希望的灵敏度是不充分的。除此之外，已有报道，在焦磷酸测序法中，可以提高检测灵敏度至5%左右，优于双脱氧测序法（例如，参照非专利文献6）。

另外，正在开发下述方法：将含有突变的序列通过PCR进行扩增，求出其生成物的双链DNA的解链曲线，根据突变基因和正常基因的解链曲线的差别求出突变基因的比例。在该方法中，可检测正常基因中所含的突变基因达到5%左右（例如，参照非专利文献7）。

例如，报道了一种通过精确控制严格性来检测1个核苷酸的差异的方法（例如，参照非专利文献8）。该方法利用了，与低聚核苷酸探针和目标序列完全互补时（全匹配）相比，包含探针与目标序列即使一个碱基不互补的碱基对时（不匹配）的缔合体的熔解温度降低。该方法也被利用于DNA芯片等，但一个碱基的识别性受到探针的碱基序列等的较大影响，或者需要非常严格的温度控制等，向临床诊断的应用未必容易。

除此之外，作为严格区分一个碱基的差别的方法，还开发了利用具有相同碱基序列的双链之间的竞争性杂交的PCR-PHFA法。PCR-PHFA法是：若作为基因型识别对象的试样（双链核酸）和已知序列的标准双链核酸之间的碱基序列完全相同，则不能对各链进行区别，并且通过杂交而发生链的重组（链置换），但在样品和标准双链核酸之间只要一个碱基有差别，则通过竞争性杂交而在具有完全互补的碱基序列的链相互之间优先形成双链，因此，在试样与标准双链核酸之间不发生链的重组，PCR-PHFA法是利用该现象的突变检测法。已有报道：通过使用该PCR-PHFA法，能够以1%左右的高灵敏度从实际标本中检测出突变基因（例如，参照专利文献1和非专利文献9）。

还提出了几种PCR-PHFA法的改良方法。例如专利文献2中，作为PCR-PHFA法的改良方法，公开了利用荧光共振能量转移的方法。在以高灵敏度准确测定微量的突变基因的PCR-PHFA法中，有必要检测出具有相同序列的两个双链核酸之间的链的重组，但多数情况下不标记试样的双链核酸而标记用于使链发生重组的已知序列的标准核酸。在专利文献2记载的方法中，通过在标准核酸的一条链的5’末端附近结合荧光物质来进行标记，采用其它荧光物质对另一条链的3’末端附近进行标记。当未通过竞争性杂交发生链置换而标准核酸返回原来的双链状态时，能够观察到两种不同荧光物质之间的荧光共振能量转移。与此相对，若试样的双链核酸之间发生链置换反应，则观察不到荧光共振能量转移。因此，通过测定该荧光共振能量转移的程度，可以测定链的重组程度。

具体地说，例如，在对某核酸序列的某位置（设定为识别对象的突变位点）为腺嘌呤的情形和为鸟嘌呤的情形进行区别的情况下，准备包含该位置且该位置的碱基为腺嘌呤（互补链中为胸腺嘧啶）的标准双链核酸。进而，将该标准双链核酸中的一条链用荧光物质X标记，将另一条链用可与荧光物质X相互能量转移的荧光物质Y标记。即，标准双链核酸中，两种荧光物质邻近，所以直接处于产生荧光共振能量转移的状态。

另一方面，通过核酸扩增反应，将来源于样品的核酸扩增，制备成与标准双链核酸完全相同的长度。将所得到的来源于样品的双链核酸和标准双链核酸混合，施加热能使双链变性后，慢慢地降低温度，再次形成双链。此时，当来源于样品的双链核酸的突变位点全都与标准双链核酸相同为腺嘌呤时，在来源于样品的双链核酸与标准双链核酸之间产生链的重组反应。理论上，当来源于样品的双链核酸与标准双链核酸的分子数之比为1:1时，重组概率为1/2，另外，返回原来的双链的概率也为1/2，荧光共振能量转移的程度也为1/2。当来源于样品的双链核酸的突变位点为鸟嘌呤而全都与标准双链核酸不同时，不引起链重组，因此荧光共振能量转移的程度没有变化。由此，可检测样品中希望检测（识别）的目标碱基为腺嘌呤还是为鸟嘌呤。通过使来源于样品的双链核酸与标准双链核酸之比增大，可以增大重组的程度。例如，来源于样品的双链核酸与标准双链核酸之比为20:1时，重组比例为20/21、即标准双链核酸返回原来的双链的概率为1/21，荧光共振能量转移的变化增大，变得容易检测。

如此，PCR-PHFA法是检测灵敏度高、再现性优异的方法，但存在需要较长时间的问题。例如，在专利文献1和非专利文献9记载的方法中，为了在PCR-PHFA法中精度良好地进行竞争性杂交，需要在DNA的变性温度至70℃或完成杂交的温度以下的温度施加非常缓慢的温度调节（0.1℃/分钟），进行杂交。其原因是，荧光PHFA为非酶反应，所以标准双链核酸与试样双链核酸的链交换效率受热力学的支配，认为极端的温度变化使识别的精度变差（例如，参照非专利文献10）。即，在以充分的精度识别核酸的情况下，PHFA需要数小时的时间，在将通过本法进行的变异检查实用化上是个大课题。

另一方面，为了促进双链核酸与单链核酸之间的链置换反应的反应速度，公开了一种使用阳离子性高分子的方法（例如，参照专利文献3）。进而，还公开了一种方法，其中，应用这样的由阳离子性高分子产生的对链置换反应的反应促进效果，通过在等温环境下利用作为试样的单链核酸与作为标准（基准）的双链核酸之间的链置换反应、或作为试样的双链核酸与作为标准的部分双链核酸之间的链置换反应，来检测一个核苷酸的差异（例如，参照专利文献4和5）。这些方法利用了在试样核酸的碱基序列与标准核酸的碱基序列完全互补时（全匹配）与含有即使一个碱基不互补的碱基对时（错配）相比，两核酸间的链置换反应的反应速度快的原理。这些方法虽然识别碱基差别的能力优异，但由于检测的是反应速度的差，所以存在需要充分的反应时间以确保在一个碱基差异的检测上所希望的精度的问题。另外，专利文献4记载的方法中，要求试样核酸为单链，专利文献5记载的方法中，在成为试样的双链核酸中，识别碱基的部分需要位于双链核酸的末端部分，在实用的观点上准备这样的试样双链核酸有困难。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第2982304号公报

专利文献2：日本特开2003-174882号公报

专利文献3：日本特开2001-78769号公报

专利文献4：日本专利第4178194号公报

专利文献5：日本特开2008-278779号公报

非专利文献

非专利文献1：Chen等（另外1人）、Analytical biochemistry（分析生物化学）、1991年、第195卷、第51～56页。

非专利文献2：Jacobson等（另外1人）、Oncogene（致癌基因）、1994年、第9卷、第553～563页。

非专利文献3：Newton等（另外7人）、Nucleic acids research（核酸研究）、1989年、第17卷、第2503～2516页。

非专利文献4：Wu等（另外3人）、Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America（美国国家科学院学报）、1989年、第86卷、第2757～2760页。

非专利文献5：Nollau等（另外1人）、Clinical Chemistry（临床化学）、1997年、第43卷、第1114～1128页。

非专利文献6：Ogino等（另外9人）、The Journal of Molecular Diagnostics（分子诊断学杂志）、2005年、第7卷、第413～421页。

非专利文献7：Krypuy等（另外4人）、BMC Cancer（BMC癌症）、2006年、第6卷、第295页。

非专利文献8：Wallace等（另外5人）、Proceedings of the National Academyof Sciences of the United States of America（美国国家科学院学报）、1983年、第80卷、第278～282页。

非专利文献9：Tada等（另外7人）、Clinica Chimica Acta（临床化学学报）、2002年、第324卷、第105页。

非专利文献10：Oka等（另外5人）、Nucleic acids research（核酸研究）、1994年、第22卷、第9号、第1541～1547页。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的在于，在这种状况下，提供一种PCR-PHFA法等的伴随竞争性杂交的碱基序列的识别方法，该方法在保持识别碱基序列差异的精度的同时可在与现有方法相比非常短的时间内识别试样所含的核酸是否为具有目标碱基序列的核酸。

解决课题的方法

本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，在PCR-PHFA法等竞争性杂交法中，通过在反应液中添加阳离子性梳型聚合物，从而即使以超过试样核酸与标准核酸之间的竞争性杂交的平衡速度的速度使温度降低，也可以不损害识别精度地识别碱基序列，从而完成了本发明。

即，本发明提供下述技术方案。

（1）一种目标碱基序列的识别方法，其识别目标碱基序列法，其特征在于，具有下述工序：

热变性工序，该热变性工序将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理；

降温工序，该降温工序上述热变性工序之后，通过使上述反应液的温度降低，从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交；

测定工序，该测定工序对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定；和

识别工序，该识别工序基于通过上述测定工序得到的测定结果，识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性，

并且，上述降温工序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。

（2）如上述（1）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物具有作为含有阳离子性基团的高分子链的主链和作为亲水性基团的侧链。

（3）如上述（2）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链为聚赖氨酸。

（4）如上述（2）或（3）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的侧链为葡聚糖。

（5）如上述（2）～（4）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链含有胍基。

（6）如上述（2）～（5）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链部分的分子量为5000以上。

（7）如上述（1）～（6）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，在所述降温工序中，所述反应液的降温速度为0.2～3℃/秒。

（8）如上述（1）～（7）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述试样双链核酸与所述标准双链核酸的链长相同。

（9）如上述（1）～（8）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述目标碱基序列是与含有基因突变的特定基因型的突变位点的区域相同的碱基序列。

（10）如上述（1）～（9）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链分别被种类相互不同的标记物质标记。

（11）如上述（10）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，标记构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中的一条核酸链的标记物质与标记另一条链的标记物质之间可进行能量转移。

（12）如上述（10）或（11）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链均被荧光物质标记。

（13）如上述（10）或（11）所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中，一条核酸链被荧光物质标记，另一条核酸链被消光物质标记。

（14）如上述（10）～（13）中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中，一条核酸链被可与固相载体结合的标记物质标记。

（15）一种目标碱基序列识别用试剂盒，其用于识别目标碱基序列的方法中，其特征在于，含有包含与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸、和阳离子性梳型聚合物。

（16）如上述（15）所述的目标碱基序列识别用试剂盒，其特征在于，所述目标碱基序列是与含有基因突变的特定基因型的突变位点的区域相同的碱基序列。

发明效果

通过本发明的目标碱基序列的识别方法，可以在不损害识别精度的条件下与现有方法相比极大缩短竞争性杂交所需要的时间。

附图说明

图1是示意性表示本发明的识别方法和现有方法中的、标准双链核酸和具有与标准双链核酸不同的碱基序列的试样双链核酸的竞争性杂交的一个实例的图。

图2是表示在实施例1中对各温度下的反应液的荧光强度进行实时测定的结果的图。

图3是将图2（B）的第3次温度降低（96℃/分钟）的部分进行扩大来表示的图。

图4是表示在实施例2中对使用野生型的标记标准双链核酸时的各温度下的反应液的荧光强度进行实时测定的结果的图。

图5是将实施例3中急速（2.5℃/秒）进行温度降低时的结果用指数值（INDEX值）的柱形图来表示的图。

具体实施方式

在本发明和本申请说明书中，所谓“识别目标碱基序列”意指识别试样所含的核酸是否为具有目标碱基序列的核酸。

在本发明和本申请说明书中，所谓“试样双链核酸”意指由成为检测是否具有目标碱基序列的对象的试样制备的核酸，并且是由两条彼此互补的核酸链（单链核酸）构成的双链核酸。另外，所谓“标准双链核酸”意指由含有与目标碱基序列相同的碱基序列的核酸链和具有与该核酸链互补碱基序列的核酸链构成的双链核酸。

此外，在本发明和本申请说明书中，两条彼此互补的单链核酸的组合中当然包括它们形成双链的情况，而且解离成单链核酸的状态的情况也称为双链核酸。这是因为，彼此互补的单链核酸以溶液状态共存时，自然会形成双链。

本发明的目标碱基序列的识别方法（以下有时称为“本发明的识别方法”）是识别试样双链核酸的碱基序列是否包含目标碱基序列的方法，其特征在于，将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸混合，使其热变性后，在使温度降低进行竞争性杂交时，在阳离子性梳型聚合物存在下进行竞争性杂交。通过添加阳离子性梳型聚合物，即使加快降温速度时，也可以以高精度识别碱基序列。

图1是示意性表示本发明的识别方法和现有方法中的、标准双链核酸和具有与标准双链核酸不同的碱基序列的试样双链核酸的竞争性杂交的一个实例的图。图1（A）表示在温度缓慢降低条件下进行现有方法的竞争性杂交的情况，图1（B）表示在温度急剧降低条件下进行现有方法的竞争性杂交的情况，图1（C）表示在温度急剧降低条件下进行本发明的识别方法的竞争性杂交的情况。

作为竞争性杂交法的一个实例，有PCR-PHFA法。对于PCR-PHFA法，一般，一边从双链核酸的热变性温度开始使温度降低一边进行杂交反应，重要的是温度缓慢降低（0.1℃/分钟）。只要竞争性杂交反应时的降温速度缓慢，完全互补的核酸链之间的双链形成（同源双链）就比碱基序列不同的核酸链之间的双链形成（异源双链）优先发生｛图1（A）｝。另一方面，当加快降温速度时，由于杂交反应在达到各温度下的平衡之前温度发生变化，所以碱基序列的识别精度不充分，不仅引起同源双链的形成，而且引起异源双链的形成｛图1（B）｝。特别是在标准双链核酸与试样双链核酸之间的碱基序列的差别仅为一个碱基的情况下，易于产生异源双链，对变异的识别出现错误。因此，现有的PCR-PHFA法中，存在无法容易地缩短反应时间的问题。

与此相对，对于本发明的识别方法，由于在反应液中添加了阳离子性梳型聚合物，所以即使急剧降低反应液的温度时，同源双链也优先产生，因而可以高精度地检测试样双链核酸是否具有与目标碱基序列相同的碱基序列。通过在阳离子性梳型聚合物存在下进行竞争性杂交反应可获得这种效果的理由虽然不明确，但是推测或许是由于，通过阳离子性梳型聚合物，大幅度加快了杂交反应的反应速度，结果可以快速达到平衡状态。

通过本发明的识别方法，即使在不存在阳离子性梳型聚合物时因温度变化急速而无法在不同的碱基序列间进行区别的情况下，也可识别碱基序列。实际上，在后述实施例1中，在反应液中添加阳离子性梳型聚合物的情况下，即使在比通常的条件将降温速度加快100倍的条件下进行竞争性杂交时，也保持了仅一个碱基有差异的碱基序列的识别性。另一方面，在不添加阳离子性梳型聚合物的情况下，当标准双链核酸与试样双链核酸的碱基序列仅一个碱基不同时，形成许多错误的杂交、即异源双链，无法区别标准双链核酸与试样双链核酸的碱基序列相同的情况（匹配）和不同的情况（错配）。对于不添加阳离子性梳型聚合物的情况，从热力学平衡的观点出发，该结果是理所当然的。

反应液中存在具有相似碱基序列的核酸链时，在阳离子性梳型聚合物存在下，尽管温度高速变化，具有完全互补的碱基序列的核酸链之间也优先形成互补链，这是由本发明人等首次发现的，该认识涵盖了现有的核酸化学、热力学的许多常识。通过该认识，显示了在PCR-PHFA法等的竞争性杂交反应中，不需要进行以往必须进行的高精度的温度控制，测定时间也可缩短至1分钟以内。

本发明中所用的阳离子性梳型聚合物，只要为相对于主链以梳子形状导入了侧链且含有阳离子性基团的聚合物，就没有特别限定，然而优选在以含有阳离子性基团的高分子链（聚阳离子）为主链的聚合物上以梳子形状导入了作为侧链的亲水性基团的聚合物，更优选在主链的聚阳离子上以梳子形状导入了含有亲水性基团的高分子的共聚物（以下称为“阳离子性梳型共聚物”）。

对于作为阳离子性梳型共聚物的主链的聚阳离子，可以举出将赖氨酸、精氨酸、组氨酸、鸟氨酸等氨基酸、葡糖胺等糖、烯丙基胺、吖丙啶等阳离子性单体之中的一种或多种聚合得到的聚合物、或它们的衍生物。在本发明中，优选使用以聚赖氨酸、聚精氨酸、赖氨酸与精氨酸的共聚物、或它们的衍生物为主链的阳离子性梳型共聚物。

作为阳离子性单体的聚合物的衍生物，例如，可以举出在构成聚合物的一部分或全部单体上附加了官能团的聚合物等。作为这样的官能团，只要不损害聚合物所具有的阳离子性，就没有特别限定，例如，可以举出胍基等。

对于作为阳离子性梳型共聚物的侧链的含有亲水性基团的高分子，可以举出葡聚糖、直链淀粉、纤维素等多糖类、聚乙二醇等聚醚以及它们的衍生物等。在本发明中，优选使用以葡聚糖、聚乙二醇或它们的衍生物为侧链的阳离子性梳型共聚物。

作为用作侧链的含有亲水性基团的高分子的衍生物，只要不损害亲水性，就没有特别限定，例如，可以举出羧甲基衍生物、氨基酸衍生物、醛衍生物等。

作为在本发明中所用的阳离子性梳型聚合物，优选主链为聚赖氨酸或聚精氨酸或它们的衍生物、侧链为葡聚糖的阳离子性梳型共聚物，更优选主链为聚赖氨酸或聚精氨酸或它们的胍衍生物（含有胍基的衍生物）、侧链为葡聚糖的阳离子性梳型共聚物，进一步优选在聚赖氨酸或胍基化聚赖氨酸上接枝聚合葡聚糖而得到的阳离子性梳型共聚物。

本发明中所用的阳离子性梳型聚合物的大小根据用于竞争性杂交的试样双链核酸和标准双链核酸的链长选择适当的大小即可。在本发明中，主链部分的分子量优选为2,000以上，更优选为5,000以上。例如，使用在聚赖氨酸或胍基化聚赖氨酸上接枝聚合葡聚糖而得到的阳离子性梳型共聚物时，优选主链部分的分子量为2,000～20,000，更优选为5,000～15,000。此外，通过调整主链的聚阳离子的聚合度，可以得到具有所期望大小的主链部分的阳离子性梳型聚合物。

此外，已知如专利文献3～5的记载所述，阳离子性梳型聚合物具有在链置换反应中促进链交换的效果。然而，在专利文献3～5中，对于单链核酸之间的双链形成或竞争性杂交中的作用效果，没有任何提示。通过在阳离子性梳型聚合物存在下进行竞争性杂交，可以在不损害碱基序列的识别精度的条件下提高反应液的降温速度使反应所需时间大幅缩短，这是由本发明人等首次得到的认识。

在此，所谓链置换反应是指，具有与双链核酸的一条核酸链类似或完全相同的碱基序列的单链核酸同实际上形成了双链的双链核酸之中的一条核酸链进行置换的反应。与此相对，杂交反应是指，具有互补的碱基序列的两条单链核酸之间形成双链核酸的反应。进而，竞争性杂交反应是相对于一条单链核酸，两条以上的单链核酸竞争性杂交，由此形成双链核酸的反应。当以最佳的反应条件进行竞争性杂交反应时，由于参与竞争的单链核酸中形成更稳定的双链核酸的单链核酸优先杂交，因而作为结果，形成最稳定的双链核酸。

本发明中所用的试样双链核酸，例如可以利用核酸扩增反应来制备。作为核酸扩增反应，没有特别限定，可以适宜使用选自PCR法、LCR（连接酶链反应：Ligase chain Reaction）法、3SR（自主序列复制：Self-sustained SequenceReplication）法、SDA（链替代扩增反应：Strand Displacement Amplification）法等中的公知的核酸扩增反应（Manak（纳克）著，DNA Probes（DNA探针技术）第二版p255～291，Stockton Press（斯托克顿出版社）（1993））。由于扩增后的核酸片段可以作为双链核酸获得，所以在本发明中特别优选PCR法。此外，在核酸扩增物不为双链核酸时，需要利用引物延伸反应等来进行双链核酸制备的工序。

本发明中所用的标准双链核酸也与试样双链核酸同样地，可以利用核酸扩增反应来制备，但优选通过公知的化学合成来制备。这是因为，化学合成法时，标记物质的导入位置等的自由度高。作为化学合成法，可以举出三酯法、亚磷酸法等。例如，使用通常的利用液相法或固相合成法（其应用了不溶性载体）等的自动合成机（APPLIED BIOSYSTEMS公司的392等），大量制备单链的DNA，其后进行退火，由此可以制备双链DNA。

在本发明的识别方法中，试样双链核酸与标准双链核酸的链长可以有差异，然而优选两者链长相同。这是因为，可以抑制由链长的差别导致的对杂交效率的影响，从而可以以更高精度识别一个碱基的差异。

具体地说，本发明的识别方法的特征在于，具有下述工序：热变性工序，其将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理；降温工序，其在上述热变性工序之后，通过使上述反应液的温度降低，从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交；测定工序，其对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定；和识别工序，其基于通过上述测定工序得到的测定结果，识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性，并且，上述降温工序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。

热变性工序是将试样双链核酸和标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理的工序。具体地说，在适当组成的反应液中分别添加试样双链核酸和标准双链核酸后，通过加热该反应液，从而进行热变性处理。例如，通过将该反应液在90～100℃、优选95～100℃加热一定时间，可以使该反应液中所含有的试样双链核酸和标准双链核酸变性。此外，试样双链核酸或标准双链核酸也可以作为含有各核酸的溶液添加在反应液中。

阳离子性梳型聚合物可以在热变性处理后降温工序开始前添加在反应液中，然而优选在热变性工序前添加在反应液中。添加在反应液中的阳离子性梳型聚合物的量可以基于反应液中阳离子性梳型聚合物与核酸的荷电比（[阳离子性梳型聚合物的电荷]/[核酸的电荷]）来决定，在荷电比为0.01～10,000的范围内选择适当的值。此外，“核酸的电荷”是反应液中存在的全部核酸的电荷的总和。

另外，在反应液中除此以外可以添加调整反应液pH的缓冲剂、双链形成所必需的1价或2价阳离子、影响双链核酸稳定性的有机溶剂等。作为缓冲剂，例如，可以举出Tris-HCl等。作为阳离子，例如，可以举出钠离子、镁离子等。作为有机溶剂，例如，可以举出二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）等。

接下来，作为降温工序，通过使热变性工序后的反应液的温度降低，在阳离子性梳型聚合物的存在下，在上述试样双链核酸与上述标准双链核酸中进行竞争性杂交。在降温工序中，从变性温度降低至标准双链核酸Tm值以下的温度即可，反应终止时刻的反应液温度可以根据标准双链核酸和试样双链核酸的链长、碱基序列适宜设定。

在本发明的识别方法中，由于在阳离子性梳型聚合物存在下进行降温，因而可以以高速、例如0.2℃/秒以上的速度从变性温度降低至标准双链核酸Tm值以下的温度进行竞争性杂交。予以说明的是，也可以以比0.2℃/秒平稳的降温速度实施。这样的高速的温度变化可以使用可调节温度的专用的装置或实时-PCR装置等进行。

在本发明中，反应液的降温速度优选为0.2～3℃/秒，更优选为0.5～3℃/秒，还优选为0.5～2℃/秒。如此，通过高速降温，可以大幅缩短降温工序所需的时间。因此，通过本发明的识别方法，可以在30秒左右、时间长的话为60秒左右进行竞争性杂交。

接下来，作为测定工序，对由构成标准双链核酸的核酸链和构成试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定，作为识别工序，基于所得的测定结果，识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性。此后，将“由构成标准双链核酸的核酸链和构成试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸”也称为“通过链重组形成的双链核酸”。

当反应液中存在足够量的通过链重组形成的双链核酸时，判断为试样双链核酸与标准双链核酸相同，具有目标碱基序列。另一方面，当不存在足够量的通过链重组形成的双链核酸时，可以判断为试样双链核酸与标准双链核酸不同。此外，在本发明中，所谓“对通过链重组形成的双链核酸进行测定”除检测通过链重组形成的双链核酸本身以外，也包括测定通过链重组形成的双链核酸相对于标准双链核酸的比例。

此外，对通过链重组形成的双链核酸的测定，可以在降温工序终止时、即竞争性杂交后（终点）进行，也可以在降温工序开始时和终止时进行测定，通过比较两测定值，识别试样双链核酸是否与标准双链核酸相同。另外，测定工序中的测定也可以在降温工序中经时性地（实时）进行。

通过预先将标准双链核酸和试样双链核酸的任一种利用标记物质标记，可以以该标记物质为指标，测定通过链重组形成的双链核酸。由于一般可以预先准备，所以标记标准双链核酸是方便的。其中，优选构成标准双链核酸的两条核酸链分别利用种类不相同的标记物质进行标记。在如此预先进行了标记的情况下，通过链重组形成的双链核酸仅由一种标记物质标记，可以与被两种标记物质标记的标准双链核酸区别而将其检测出来。

作为标记物质，可以使用非放射性、放射性物质中任一种类，但优选使用非放射性物质。对非放射性的标记物质而言，作为可直接标记的，可举出：荧光物质[例如，荧光素衍生物（异硫氰酸荧光素等）、罗丹明及其衍生物（四甲基异硫氰酸罗丹明等）]、化学发光物质（例如，吖啶等）等。另外，通过利用与标记物质特异性结合的物质，可以间接检测标记物质。作为这种标记物质，可以举出：生物素、配体、特定的核酸或蛋白质半抗原等。而且，作为与标记物质进行特异性结合的物质，若是生物素则可利用与其进行特异性结合的亲和素（avidin）或链霉亲和素，若是半抗原则可利用与其进行特异性结合的抗体，若是配体则可利用受体，若是特定的核酸或蛋白质，则可利用与其特异性结合的核酸、核酸结合蛋白质或与特定蛋白质有亲和性的蛋白质等。作为上述半抗原可使用具有2,4-二硝基苯基的化合物或地高辛（Digoxigenin），并且生物素或荧光物质等也可以作为半抗原使用。这些标记物质均能够以单独一种或者在必要时以多种组合的方式通过公知的方法（参照日本特开昭59-93099号公报、日本特开昭59-148798号公报、日本特开昭59-204200号公报）导入。

另外，当将两种标记物质之中的任一种标记物质设定为可在固相载体上结合的物质时，通过进行惯用的固液分离操作，可以测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链重组的发生程度。例如，用标记物质A标记标准双链核酸的一条链而用可在固相载体上结合的标记物质B标记另一条链，使竞争性杂交后的反应液接触可与标记物质B结合的固相载体。然后，测定在该固相载体上结合的双链核酸中的标记物质A。当发生链重组时，由在该固相载体上结合的双链核酸中的标记物质A所标记的双链核酸的比例减少。此外，在经标记的双链核酸的一条链与未标记的链发生了置换时，新生成的双链核酸可结合在固相载体上，但由于不存在用于检测的标记，因而无法检测。

特别是，在本发明中，优选：通过使用可相互能量转移的两种标记物质（例如，通过激发而产生荧光的供体标记物质以及吸收所述荧光的受体标记物质），以由这些标记物质间的能量转移所产生的能量变化程度作为指标，测定通过链重组形成的双链核酸。

标记物质间的能量转移是指：当产生能量的供体标记物质和吸收该供体标记物质所产生能量的受体标记物质的至少两种标记物质在处于相互邻近的状态时，能量由供体标记物质向受体标记物质转移。例如，当两种标记物质为荧光物质时，受体标记物质吸收了通过激发供体标记物质所产生的荧光，并测定该受体标记物质发出的荧光，或者，可以测定由受体标记物质吸收通过激发供体标记物质而产生的荧光并由此引起的供体标记物质的消光（《PCRMethods and applications（PCR方法与应用）》4，357-362（1995），《NatureBiotechnology（自然生物技术）》16，49-53（1998））。此外，即使供体标记物质的荧光波长和受体标记物质的吸收波长不重叠，有时也引起能量转移，本发明中也包括这种能量转移。另外，受体标记物质也可以为消光物质。作为这样的淬灭剂，例如可以举出DABCYL、黑洞（Black Hole）等。

作为可进行相互能量转移的两种标记物质，只要在相互邻近的状态可进行能量转移即可，没有特别限制，然而优选荧光物质、延迟荧光物质，根据不同情况，也可以使用化学发光物质、生物发光物质等。作为这种标记物质的组合，可以举出：荧光素及其衍生物（例如异硫氰酸荧光素等）与罗丹明及其衍生物（例如四甲基异硫氰酸罗丹明、四甲基罗丹明-5-（6）己酸等）的组合；荧光素与DABCYL的组合等，可以从它们中选择任意组合（NonisotopicDNA Probe Techniques（非同位素DNA探针技术）,Academic Press（美国学术出版社）（1992））。

除此以外，还可以是在邻近时发生热能量释放的组合的分子。作为这种标记物质的组合，可以举出：选自由Alexa Fluor（注册商标）488（Invitrogen（英杰）社制造）、ATTO 488（ATTO-TEC GmbH社制造）、Alexa Fluor（注册商标）594（Invitrogen社制造）和ROX（羧基-X-罗丹明：Carboxy-X-rhodamine）组成的组中的一种与BHQ（注册商标、Black holequencher（黑洞淬灭剂））-1或BHQ（注册商标）-2的组合等。

此外，鸟嘌呤在FAM邻近的情况下具有淬灭的能力（Nucleic acidsResearch（核酸研究）2002,vol.30.no.92089-2195），因而可以对其进行利用。例如，当标准双链核酸的一条链的3’端部用FAM标记时，另一条链的5’末端的碱基为鸟嘌呤的情况下，也可以不用标记物质标记该另一条链。

作为向标准双链核酸或试样双链核酸中导入标记物质的方法，可以采用通常向核酸中导入标记的方法。例如，可以举出：将标记物质直接通过化学方式导入核酸的方法（Biotechniques（生物技术）24,484-489（1998））；通过DNA聚合酶反应或RNA聚合酶反应导入标记物质结合单核苷酸的方法（Science（科学）238,336-3341（1987））；通过使用导入了标记物质的引物进行PCR反应来导入的方法（PCR Methods and Applications（方法与应用）2,34-40（1992））等。

在标准双链核酸或试样双链核酸中导入标记物质的位置必须是通过链置换反应发生能量转移或消失的位置、即核酸链的3’端部和/或5’端部。具体而言，在本发明中，5’端部和3’端部是表示分别从核酸链的5’末端和3’末端出发的30个碱基以内的范围，双方标记物质越近就越容易发生能量转移，因此，优选从各末端出发为10个碱基以内，最优选为5’末端和3’末端。在此，若将标记物质大量导入与互补链杂交的碱基部分时，有可能无法检测一个碱基程度的置换，因此优选只在各核酸链的端部分导入。例如，通过在一条核酸链的5’端部（3’端部）导入两种标记物质中的一种，而且在与其互补的另一条核酸链的3’端部（5’端部）导入另一种标记物质，由此，在并不影响杂交反应的情况下，两核酸链通过链置换反应发生能量转移或者消失。

本发明的识别方法可以很好地用于基因突变的识别。具体地说，以含有基因突变的突变位点的区域的碱基序列作为目标碱基序列。此外，在本发明中所谓基因突变意指在同一生物种的个体间存在的基因的碱基序列的差异，所谓突变位点意指碱基序列中的有差异的部位。具体地说，通过碱基序列中的1个或多个碱基被取代、缺失、插入，产生碱基序列差异。作为这样的基因突变，例如，可以举出SNP、CNV多型等。另外，在本发明中所谓基因突变除SNP等基因多型那样的先天变异以外，也包含在同一个体中的细胞间存在的基因的碱基序列差异、即体细胞变异等后天变异。

在本发明的识别方法中，作为成为目标的基因突变，是被称作癌相关基因、遗传病相关基因、药剂的代谢或效力相关基因、病毒基因和细菌基因中的变异。作为癌相关基因，例如可以举出KRAS基因、BRAF基因、PTEN基因、PIK3CA基因、ALK熔合基因、EGFR基因、NRAS基因、p53基因、BRCA1基因、BRCA2基因或APC基因等。作为遗传病相关基因，可以举出报道与各种先天性代谢异常病等相关的基因等。有关药剂的代谢，可以举出关系到药剂代谢的酶、即细胞色素P450或转运体等基因。作为病毒基因、细菌基因，例如可以举出C型肝炎病毒、B型肝炎病毒等基因。进而，与疾病等的原因未必有直接关系的人白细胞抗原基因HLA等也与移植的适宜性、药物副作用等相关，是重要的基因。而且，提示受到线粒体编码的基因突变也与疾病相关，这些基因的变异也可成为目标。

本发明的识别方法由于其高识别精度和迅速性，所以也可有效用于临床检查等。在考虑医疗现场的基因检查的实用性的情况下，测定时间的短缩是非常重要的。通过本发明的识别方法，可以以高精度且超短时间识别SNP等生殖细胞变异以及体细胞变异。

例如，KRAS为信号传递系统的蛋白质，是原癌基因。据报道，许多癌细胞中在KRAS基因上产生变异。特别是在KRAS基因的密码子12、13上明显可见伴随氨基酸置换的变异，已知存在13种变异图谱。最近，逐渐弄清楚在KRAS基因上存在变异的患者中，作为抗癌剂的EGFR抗体药（西妥昔单抗、帕尼单抗）等无法发挥效力。这种抗癌剂治疗不仅有副作用，而且需要高额的费用。因此，作为量身定制式医疗的一环，提出治疗前进行KRAS基因突变的检查，仅选择见效的患者进行治疗。

另外，EGFR抗体药西妥昔单抗被用作大肠癌治疗药。大肠癌的一年的患病人数近10万，2005年（日本平成17年）的死亡人数为四万八百人。饮食生活的欧美化导致有继续增加的倾向，据EGFR抗体药的制造商的估算，4年后40,000人的大肠癌患者将成为EGFR抗体药治疗的对象。如果该估算正确，则KRAS基因的检查市场仅日本国内预想在4年后超过4亿日元。

然而，现有的识别方法存在以充分的精度迅速识别体细胞变异有困难、假阳性多的问题。本发明的识别方法对于体细胞变异也可精度非常好地迅速识别，因而不仅改善了临床检查的精度，而且可以期待有助于缩减医疗费。

本发明的识别方法可以如下所示应用于PCR-PHFA法。首先，设计用于扩增欲检测的变异部分（目标碱基序列）的引物，以试样核酸为模板，得到含有变异部分的扩增产物。另一方面，准备包含与含有变异部分的扩增产物相同的区域、且由分别被可进行能量转移的两种标记物质标记的核酸链形成的标准标记双链核酸。

例如，将一条核酸链的5’末端用荧光素等供体标记物质标记，将另一条核酸链的3’末端用DABCYL等受体标记物质标记。将这两条经标记的核酸链混合，形成标准标记双链核酸。包括标记的导入在内，标记的核酸链可以利用化学合成来制备。

为了实际上检测试样中的基因突变，添加PCR中扩增的反应液、标准标记双链核酸、阳离子性梳型聚合物来制备反应液。在90℃左右对该反应液进行热处理，将其变性，然后，通过以0.2℃/秒以上、例如2℃/秒左右的降温速度将反应液的温度降低至标准标记双链核酸Tm值左右、例如70℃左右，从而进行竞争性杂交，最后进行荧光测定。进行荧光测定的温度可以为70℃，也可以为室温附近。另外，也可以使用实时-PCR装置等依次测定降温中的荧光变化。由所得的荧光值，测定通过链重组形成的双链核酸，判定链的重组程度，并判定试样中的核酸的碱基序列是否与标准标记双链核酸相同。为了减小荧光测定的测定误差等，也可以利用热变性处理前的反应液的荧光值或热变性处理时的荧光值进行校正。

本发明的目标碱基序列识别用试剂盒是在识别目标碱基序列的方法中使用的试剂盒，其特征在于，含有包含与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸、和阳离子性梳型聚合物。除此以外，目标碱基序列识别用试剂盒中也可以组合缓冲剂、阳离子、有机溶剂等添加在竞争性杂交反应液中的试剂、用于检测标记物质的标记的试剂等。如此，通过使本发明的识别方法所必需的试剂等试剂盒化，可以更简便且在短时间内识别目标碱基序列。

本发明的目标碱基序列识别用试剂盒特别优选用于以与含有基因突变的特定基因型的突变位点的区域相同的碱基序列作为目标碱基序列，检测基因突变。

实施例

下面，给出实施例，具体说明本发明，但本发明并不局限于下述实施例。

[实施例1]

将癌基因KRAS的密码子12的基因突变作为识别对象的突变位点，将含有该突变位点的部分区域的碱基序列作为目标碱基序列，利用本发明的识别方法识别试样双链核酸的基因型是否与标准双链核酸的基因型相同。此外，使用的标准双链核酸和试样双链核酸通过常规方法的化学合成法来制备。

首先，分别制造密码子12的野生型（Wild）和变异型（G12S）的标准双链核酸。变异型（G12S）是通过密码子12的点突然变异而使甘氨酸变为丝氨酸的变异型。各标准双链核酸在其一条核酸链的两末端施以FAM标记（Glen Research社制造），在另一条核酸链的两末端施以DABCYL标记（GlenResearch社制造）。各基因型的标准双链核酸通过使一条一条化学合成的构成双链核酸的两条核酸链杂交来制备。表1中连同基因型一起给出化学合成的核酸链的序列。表1中，密码子12和密码子13用下划线示出，突变位点用小写字母表示。另外，“6-FAM”表示FAM标记，“DAB”表示DABCYL标记，右栏的数字表示在序列表中相对应的序列号。

另外，合成碱基序列与表1中记载的碱基序列相同但没有进行标记的核酸链，将彼此互补的核酸链混合，制成试样双链核酸。

[表1]

将500nM wild-FAM（野生型的标准双链核酸之中的经FAM标记的单链核酸）（1μL）、500nM wild-DAB（野生型的标准双链核酸之中的经DABCYL标记的单链核酸）（1μL）、2M NaCl（1μL）、ROX（0.6μL）、0.5M EDTA（2μL）、阳离子性梳型聚合物（1μL）、1×PCR缓冲液（12.4μL）和5μM试样双链核酸（2μL）混合，制成荧光PHFA反应液。作为对照，代替阳离子性梳型共聚物混合纯水（1μL）。ROX溶液使用Invitrogen社制造的产品。

此外，作为阳离子性梳型聚合物，使用3种以聚赖氨酸为主链在侧链聚合葡聚糖而得到的阳离子聚合物（CP1～CP3）。CP1是在分子量为5,000的聚赖氨酸主链上附加88wt%的葡聚糖而得的阳离子聚合物，CP2是在分子量15,000的聚赖氨酸主链上附加88wt%的葡聚糖而得的阳离子聚合物，CP3是在分子量15,000的胍基化聚赖氨酸主链上附加88wt%的葡聚糖而得的阳离子聚合物。由反应液全体中存在的核酸的磷酸残基浓度计算出总阴离子量，以阳离子聚合物量成为该阴离子量约8倍量的方式在反应液中添加阳离子聚合物。

将所述制备的荧光PHFA反应液放置于实时PCR装置（ABI-7900）中，在35℃保持15分钟，其后，关于95℃至35℃的温度区域，在3种降温速度的条件下连续测定FAM的荧光。此外，ROX是作为内标物质添加的，将FAM的荧光值除以ROX的荧光值而得的值作为FAM的相对荧光值。

将对各温度下的反应液荧光强度进行实时测定的结果示于图2和图3。

图中，CP（-）表示没有添加聚合物时的结果，CP1～CP3表示添加了各聚合物的结果。

图2（A）是试样双链核酸和标记标准双链核酸的碱基序列均为G12S且两者完全一致时的与温度变化对应的荧光变化。标记标准双链核酸受到过剩存在的试样双链核酸的竞争，引起链重组反应。该情况下，FAM的荧光无法用DABCYL淬灭，即使温度降低，FAM的荧光也保持恒定值。

另一方面，图2（B）表示试样双链核酸为野生型、标记标准双链核酸为G12S、两者存在一个碱基差异的情况。该情况下，由于标记标准双链核酸和试样双链核酸各自都优先形成双链，所以难以引起链的重组。因此，在基于链重组的双链核酸的形成的同时，FAM的荧光通过DABCYL淬灭而降低。

图2（C）表示温度变化的轮廓。在35℃保持15分钟，其后，在第1次温度降低中，以0.25℃/分钟的速度较缓慢地从95℃降低至65℃。再次加热为95℃，在第2次温度降低中以1℃/分钟使温度降低至65℃。再次加热为95℃，在第3次温度降低中，以96℃/分钟使温度降低至35℃。

图3是将图2（B）的第3次温度降低（96℃/分钟）的部分进行扩大来表示的图。

其结果，图2（A）中，添加任一聚合物时，所有的温度变化速度下荧光都不降低，未观察到荧光共振能量转移（FRET）。可认为这是因为，在所有的反应中标记标准双链核酸与过剩的试样双链核酸之间发生链重组，FAM的荧光无法用DABCYL淬灭。

另一方面，图2（B）中，在第1次温度降低（0.25℃/分钟）中，除添加CP3聚合物时以外，通过温度降低，荧光减少。这表示，添加CP1和CP2聚合物的反应中，标记标准双链核酸返回原来的状态，引起荧光共振能量转移（FRET），FAM的荧光被DABCYL淬灭。在第2次温度降低（1℃/分钟）中，表现出与第1次温度降低大致相同的行迹，该温度降低速度下，除CP3以外的全部反应中，完全互补的核酸链之间优先形成双链。如图3所示，在第3次温度降低（96℃/分钟）中，添加所有的聚合物的反应中，通过温度降低，荧光减少，可以识别一个碱基差异。

此外，在添加CP3聚合物的情况下，在第1次和第2次温度降低下荧光不减少。认为这是因为，通过添加CP3聚合物，标准双链核酸的Tm值降低，在第1次和第2次的降低至65℃的温度降低中没有形成双链。通过在第3次温度降低中降低至35℃，可形成双链，因而观察到效果。

[实施例2]

使用通过PCR制备的试样双链核酸，与实施例1同样地利用本发明的识别方法识别KRAS的密码子12的野生型（Wild）和变异型（G12S）。作为阳离子性梳型聚合物，使用实施例1中效果最高的CP2聚合物。

将PCR反应液的组成设定为250nM KF引物、250nM KR引物、250μMdNTP、1×PCR缓冲液、2.5单位Taq DNA聚合酶（Takara Taq Hot StartVersion：Takara公司的热启动Taq），将反应液总量设定为47.5μL。在该PCR反应液中添加10ng/μL的模板DNA 2.5μL，使总反应容量为50μL。PCR的反应条件是，在95℃进行3分钟的处理后，95℃（20秒）→57℃（30秒）→72℃（30秒）的变性、退火、延伸反应进行40个循环。将使用的KF引物和KR引物的碱基序列示于表2。表中右栏的数字表示在序列表中相对应的序列号。此外，模板DNA使用来源于癌细胞的DNA（DLD-1和A549）。DLD-1的KRAS的基因型为G13D（异源），A549的KRAS的基因型为G12S的变异型（同源）。对于它们的序列通过直接测序法确认序列。

[表2]

	碱基序列
			KF引物	5′-TATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCT	5
KR引物	5′-TATCGTCAAGGCACTCTTGCC	6

将所得的PCR反应液（12.4μL）、500nM wild-FAM（野生型标准双链核酸之中的经FAM标记的单链核酸）（1μL）、500nM wild-DAB（野生型的标准双链核酸之中的经DABCYL标记的单链核酸）（1μL）、2M NaCl（1μL）、ROX（0.6μL）、0.5M EDTA（2μL）和CP3聚合物（1μL）混合，制成荧光PHFA反应液。由反应液全体中存在的核酸的磷酸残基浓度计算出总阴离子量，以阳离子聚合物量成为该阴离子量约8倍量的方式在反应液中添加阳离子聚合物。PCR反应液分别使用以来源于DLD-1的基因组（具有野生型和G13D的变异型两种基因的基因组）为模板的反应液（DLD-1）和以来源于A549的基因组（仅具有G12S的变异基因的基因组）为模板的反应液这两种反应液。与实施例1同样地使用实时PCR装置测定了所制备的荧光PHFA反应液的与温度变化对应的荧光变化。

将使用野生型的标记标准双链核酸时的对各温度下的反应液荧光强度进行实时测定的结果示于图4。图4（A）表示未添加阳离子聚合物时的荧光行迹，图4（B）表示添加了阳离子聚合物时的荧光行迹。图4（C）表示温度变化的轮廓。与实施例1相同，进行3种降温速度下的实验。图4（A）和（B）中，“wt”表示以来源于DLD-1的基因组为模板的PCR反应液的结果，“G12S”表示以来源于A549的基因组为模板的PCR反应液的结果，“仅标记DNA”表示在没有基因组作为模板的条件下进行的PCR反应液的结果。

其结果如图4（A）所示，在使用由作为试样双链核酸具有野生型碱基序列的基因组（DLD-1）制备的PCR反应液的情况下，任一降温速度下都未见FAM的荧光的减少，可以识别其为与标记标准双链核酸相同的碱基序列。另一方面，在使用由作为试样双链核酸具有G12S的变异型碱基序列的基因组（A549）制备的PCR反应液的情况下，在第1次和第2次温度降低中，与不添加试样双链核酸仅添加标记标准双链核酸的反应液相同，在低温下FAM的荧光降低。由该结果可以识别试样双链核酸不是与标记标准双链核酸相同的碱基序列。然而，在第3次温度降低时（96℃/分钟），使用野生型和G12S的任一试样双链核酸的情况下，FAM的荧光在低温都不减少，无法识别两者的差异。这是因为，温度降低速度快，在野生型与G12S之间没有产生区别，形成异源双链。

另一方面，添加了阳离子性梳型聚合物的图4（B）中，即使第3次温度降低中，使用G12S的试样双链核酸的情况下通过温度降低，FAM的荧光也降低，野生型的标记标准双链核酸和G12S的试样双链核酸各自优先形成双链，抑制了异源双链的形成。由这些结果可知，在将PCR产物作为试样双链核酸时，添加阳离子性梳型聚合物的反应体系中，即使在急速的温度降低中也保持了一个碱基的识别性。

[实施例3]

利用本发明的识别方法，对认为参与编码醇脱氢酶的基因（ALDH2）的醇代谢的SNP进行识别检测。作为阳离子性梳型聚合物，使用实施例1中效果最高的CP2聚合物。

SNP部位为A和G等位基因的基因型的标准双链核酸分别通过常规方法的化学合成法制备。A基因型检测用的标准双链核酸在一条核酸链的5’末端施以FAM标记（Glen Research社制造），在另一条核酸链的3’末端施以DABCYL标记（Glen Research社制造）。另一方面，G基因型的标准双链核酸在一条核酸链的5’末端施以Alexa594标记（Glen Research社制造），在另一条核酸链的3’末端施以DABCYL标记（Glen Research社制造）。各标准双链核酸通过使一条一条化学合成的构成双链核酸的两条核酸链杂交来制备。在表3中连同基因型一起给出化学合成的核酸链的序列。表3中，“AL（A）”表示A基因型，“AL（G）”表示G基因型，“Ale594”表示Alexa594标记。

另外，“6-FAM”、“DAB”、右栏的数字的含义与表1相同。

[表3]

另一方面，通过PCR制备试样双链核酸。PCR反应液的组成设定为250nM引物F、250nM引物R、250μM dNTP、1×PCR缓冲液、2.5单位Taq DNA聚合酶（Takara Taq HotStart Version：Takara公司的热启动Taq），将反应液总量设定为47.5μL。在该PCR反应液中添加10ng/μL的模板DNA（东洋纺）2.5μL，使总反应容量为50μL。PCR的反应条件是，在95℃进行3分钟的处理后，95℃（20秒）→57℃（30秒）→72℃（30秒）的变性、退火、延伸反应进行40个循环。将使用的对照DNA、引物F和引物R的碱基序列示于表4。表中的右栏的数字表示在序列表中相对应的序列号。此外，作为基因型为A等位同源或G等位同源的试样双链核酸，作为模板DNA分别使用A基因型或G基因型。另外，作为基因型为异源的试样双链核酸，将两方的模板等量混合而得的核酸作为模板DNA。所添加的DNA总量相同。

[表4]

分别使用这样制备的标准双链核酸和试样双链核酸，与实施例2同样地制备荧光PHFA反应液。利用MX3000P（Stratagene社制造）测定所制备的荧光PHFA反应液的与温度变化对应的荧光变化。温度降低的条件是，在95℃变性30秒后，使温度降低至90℃。其后以2.5℃/秒的速度将温度降低至35℃。对FAM和Alexa594分别测定90℃和35℃下的荧光强度。90℃与35℃间的荧光值的差别用以下所示的指数值表示。在此，“ΔF”为从FAM或Alexa594的90℃的荧光值中减去35℃的荧光值而得到的值。另外，“对照反应液”意指没有添加试样双链核酸的反应液（仅添加了标记标准双链核酸和阳离子性梳型聚合物的反应液）。

指数（%）=ΔF[反应液]/ΔF[对照反应液]×100

通过反应液的ΔF除以对照反应液的ΔF，将连同标记的荧光变化的差别进行标准化。荧光值具有温度依赖性，低温下荧光值具有变高的倾向。因此，在试样双链核酸和标准标记双链核酸的碱基序列相同的情况下，35℃的荧光值有时比90℃的荧光值高，此时指数值变为负值。指数值为负或接近零时，试样双链核酸与标记标准双链核酸间发生链的重组，表示它们的碱基序列相同。

另一方面，指数值为正值且足够大时，表示试样双链核酸和标记标准双链核酸的碱基序列存在差别。

图5是将急速（2.5℃/秒）进行温度降低时的结果用指数值的柱形图来表示的图。图5（A）是未添加阳离子性梳型聚合物的情况，图5（B）是添加了阳离子性梳型聚合物的情况。图5中，“A同源”是使用基因型为A等位同源的试样双链核酸的结果，“A/G异源”是使用基因型为异源的试样双链核酸的结果，“G同源”是使用基因型为G等位同源的试样双链核酸的结果。另外，图中，左柱表示FAM的指数值（经FAM修饰的A等位基因检测用的标记双链核酸的指数值），右柱表示Alexa594的指数值（经Alexa594修饰的G等位基因检测用的标记双链核酸的指数值）。

如图5（A）所示，在未添加阳离子性梳型聚合物的情况下，Alexa594的指数值在试样双链核酸为A等位同源时为正且足够大，在试样双链核酸为G等位同源时为负值，可以从基因型A中识别检测出基因型G。然而，FAM的指数值在试样双链核酸为G等位同源时也与试样双链核酸为A等位同源时同样地高，无法从基因型G中识别检测出基因型A。

与此相对，如图5（B）所示，在添加了阳离子性梳型聚合物的情况下，FAM的指数值在试样双链核酸为G等位同源时为正且足够大，在试样双链核酸为A等位同源时接近零，可以明确地识别基因型G和基因型A。

由这些结果可知，通过在反应液中添加阳离子性梳型聚合物，即使高速降低反应液温度时，也可通过竞争性杂交进行一个碱基上的识别。另外，通过本实施例可知，通过使与荧光标记不同的对立的基因型对应的标记标准双链核酸同时存在，可进行两基因型的同时检测。

工业实用性

本发明的目标碱基序列的识别方法可以高精度且迅速（例如，仅数分钟）识别基因型等的仅一个碱基或数个碱基程度的差异的碱基序列，因而可利用于临床检查等领域、特别是体细胞变异的检查等领域中。

Claims (16)

1.一种目标碱基序列的识别方法，其识别目标碱基序列法，其特征在于，具有下述工序：

热变性工序，该热变性工序将试样双链核酸和含有与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸在单反应液内进行热变性处理；

降温工序，该降温工序上述热变性工序之后，通过使上述反应液的温度降低，从而在上述试样双链核酸和上述标准双链核酸中进行竞争性杂交；

测定工序，该测定工序对由构成上述标准双链核酸的核酸链和构成上述试样双链核酸的核酸链形成的双链核酸进行测定；和

识别工序，该识别工序基于通过上述测定工序得到的测定结果，识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性，

并且，上述降温工序在阳离子性梳型聚合物的存在下进行。

2.如权利要求1所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物具有作为含有阳离子性基团的高分子链的主链和作为亲水性基团的侧链。

3.如权利要求2所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链为聚赖氨酸。

4.如权利要求2或3所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的侧链为葡聚糖。

5.如权利要求2～4中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链含有胍基。

6.如权利要求2～5中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述阳离子性梳型聚合物的主链部分的分子量为5000以上。

7.如权利要求1～6中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，在所述降温工序中，所述反应液的降温速度为0.2～3℃/秒。

8.如权利要求1～7中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述试样双链核酸与所述标准双链核酸的链长相同。

9.如权利要求1～8中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，所述目标碱基序列是与含有基因突变的特定基因型的突变位点的区域相同的碱基序列。

10.如权利要求1～9中任一项所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链分别被种类相互不同的标记物质标记。

11.如权利要求10所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，标记构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中的一条核酸链的标记物质与标记另一条链的标记物质之间可进行能量转移。

12.如权利要求10或11所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链均被荧光物质标记。

13.如权利要求10或11所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中，一条核酸链被荧光物质标记，另一条核酸链被消光物质标记。

14.如权利要求10所述的目标碱基序列的识别方法，其特征在于，构成所述标准双链核酸的两条核酸链之中，一条核酸链被可与固相载体结合的标记物质标记。

15.一种目标碱基序列识别用试剂盒，其用于识别目标碱基序列的方法中，其特征在于，含有包含与目标碱基序列相同的碱基序列的标准双链核酸、和阳离子性梳型聚合物。

16.如权利要求15所述的目标碱基序列识别用试剂盒，其特征在于，所述目标碱基序列是与含有基因突变的特定基因型的突变位点的区域相同的碱基序列。

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