KR101569127B1

KR101569127B1 - 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 평가 방법, 질환 예측 방법 및 다형 검출용 시약 키트

Info

Publication number: KR101569127B1
Application number: KR1020120044370A
Authority: KR
Inventors: 아키 이구치; 가오루 구로세
Original assignee: 아크레이 가부시키가이샤
Priority date: 2011-05-02
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2015-11-13
Also published as: JP5757908B2; US8624017B2; CN102766681B; EP2520664A1; KR20120124028A; CN102766681A; US20120282607A1; EP2520664B1; JP2012244990A

Abstract

[과제] ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브를 제공한다.
[해결수단] ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브를, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 301번째∼311번째의 염기를 포함하는 염기길이 11∼50의 염기 서열에 상보적이며 또한 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고 311번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드 등을 포함하여 구성한다.

Description

다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 평가 방법, 질환 예측 방법 및 다형 검출용 시약 키트{PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY, DISEASE PREDICTION METHOD AND REAGENT KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM}

본 발명은, 다형 검출용 프로브, 다형 검출 방법, 약효 평가 방법, 질환 예측 방법 및 다형 검출용 시약 키트에 관한 것이다.

종래, 고(高)요산 혈증의 치료 표적 분자로서는, 요산의 재흡수 트랜스포터인 Urate 트랜스포터(URAT1/SLC22A12)나, 글루코스 트랜스포터9(GLIT9/SLC22A12)가 알려져 있었다.

근래, BCRP(breast cancer resistance protein)라고도 불리고 있는 ABCG2(ATP-binding cassette sub-family G member2) 유전자가, 고용량성의 배뇨 트랜스포터를 코드하고 있는 것이 밝혀졌다.

또한, ABCG2 유전자의 다형의 존재가, 통풍의 발증 리스크의 증가에 관련하는 것이 시사되어, ABCG2 유전자는 통풍의 주요한 병인 유전자인 것이 밝혀졌다(예를 들면, 실험 의학 2010년, 제28권, 제8호, p.1285-1289 참조).

또한, ABCG2 유전자의 다형의 존재가, 태반에 있어서의 단백 발현 이상과 관련이 있는 것도 시사되고 있어(예를 들면, Drug. Metab. Dispos., 2005년, 제33권, 제1호, p.94-101 참조), ABCG2 유전자의 다형을 단시간에 저비용으로 간편하게 측정하는 방법이 요망되고 있다.

유전자의 다형을 측정하는 방법으로서는, 측정하고자 하는 염기를 포함하는 부분을 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 행하고, 당해 특정 염기에 있어서의 변이의 유무로 절단의 유무가 나눠지는 제한 효소로 절단하고, 그 후 전기 영동으로 절단됐는가 아닌가를 검출하는 방법(PCR-RFLP법)이 알려져 있다(예를 들면, Genet. Mol. Res., 2010년, 제9권, 제1호, p.34-40 참조).

또한, 변이를 포함하는 영역을 PCR법으로 증폭한 후, 형광 색소로 표지된 핵산 프로브를 사용하여 융해 곡선 분석을 행하고, 융해 곡선 분석의 결과에 의거하여 염기 서열의 변이를 해석하는 방법도 알려져 있다(예를 들면, 일본 특개2002-119291호 공보 참조).

그러나, PCR-RFLP법에서는, PCR 반응 후에 증폭 산물을 취출(取出)하여 제한 효소 처리를 행할 필요가 있다. 그 때문에 증폭 산물이 다음 반응계에 혼입할 우려가 있어, 이에 기인하여 위(僞)양성, 위음성의 결과를 얻게 되버릴 경우가 있다. 또한, PCR 종료 후, 제한 효소로 처리를 행하고, 그 후 전기 영동을 행하기 때문에, 검출까지 필요한 시간도 매우 길어져 버릴 경우가 있다. 또한, 조작이 복잡하기 때문에, 자동화가 곤란하다.

그 때문에, ABCG2 유전자 다형 검출을 위한 새로운 기술 개발이 요망되고 있었다.

본 발명은, ABCG2 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이를 사용하는 다형 검출 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은, 당해 검출 방법을 사용한 약효 평가 방법이나 질환 예측 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 또한 본 발명은, 당해 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 구체적 수단은 이하와 같다.

<1> 하기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브.

(P1) 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 301번째∼311번째의 염기를 포함하는 염기길이 11∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 311번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호1에 상보적인 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 311번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P1') 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 301번째∼311번째의 염기를 포함하는 염기길이 11∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 311번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 311번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P2) 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 234번째∼251번째의 염기를 포함하는 염기길이 18∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호2에 상보적인 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P2') 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 234번째∼251번째의 염기를 포함하는 염기길이 18∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호2와 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,

(P3) 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 152번째∼161번째의 염기를 포함하는 염기길이 10∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호3에 상보적인 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖고, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및

(P3') 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 152번째∼161번째의 염기를 포함하는 염기길이 10∼50의 염기 서열에 상보적인 서열이며, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호3과 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.

<2> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 311번째의 염기가, 5' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나에 위치하고, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 251번째의 염기가, 5' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나에 위치하고, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 152번째의 염기가, 3' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나에 위치하는 <1>기재의 다형 검출용 프로브.

<3> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 311번째의 염기가, 5' 말단에 위치하고, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 251번째의 염기가 5' 말단에 위치하고, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 형광 색소로 표지된 152번째의 염기가 3' 말단에 위치하는 <1> 또는 <2>에 기재의 ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브.

<4> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소 또는 증가하는, <1>∼<3> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<5> 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는, <1>∼<4> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<6> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 11∼40이며, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18∼40이며, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 10∼40인, <1>∼<5> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<7> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 11∼28이며, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 20∼30이며, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 15∼30인, <1>∼<6> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<8> 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 14∼18이며, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 22∼26이며, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가 18∼22인, <1>∼<7> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<9> 융해 곡선 분석용의 프로브인, <1>∼<8> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브.

<10> <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 ABCG2 유전자의 다형 검출 방법.

<11> <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 상기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 다형 검출용 프로브를 사용하는 <10>기재의 다형 검출 방법.

<12> (Ⅰ) <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과, (Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 근거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과, 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과, (Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ABCG2 유전자에 있어서의 다형의 존재를 검출하는 것을 포함하는, <10> 또는 <11>기재의 다형 검출 방법.

<13> 상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻기 전 또는 상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, <12>기재의 다형 검출 방법.

<14> <10>∼<13> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCG2 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것과, 검출된 다형의 유무에 의거하여, 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함하는, 약제의 약효 판정 방법.

<15> <10>∼<13> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCG2 유전자의 다형을 검출하는 것과, 검출된 다형의 유무에 의거하여, 질환의 이환(罹患) 리스크를 예측하는 질환 예측 방법.

<16> <1>∼<9> 중 어느 하나에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, 다형 검출용 시약 키트.

<17> 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트, 또는 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트의 어느 하나에 프라이머 세트의 적어도 하나를 더 포함하는, <16>기재의 다형 검출용 시약 키트.

본 발명에 의하면, ABCG2 유전자의 다형을, 높은 감도로, 간편하게 검출하는 것을 가능하게 하는 다형 검출용 프로브, 이를 사용하는 다형 검출 방법을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 의하면, 당해 검출 방법을 사용한 약효 평가 방법이나 질환 예측 방법을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 당해 검출용 프로브를 사용한 다형 검출용 시약 키트를 제공할 수 있다.

[도 1] (A) 핵산 혼합물의 융해 곡선, 및 (B) 미분 융해 곡선의 일례를 나타낸 도.
[도 2] (A) 및 (B)는, 본 발명의 실시예1-1에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 3] 본 발명의 실시예1-2에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 4] (A)∼(H)는, 본 발명의 실시예2에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 5] (A)∼(C)는, 본 발명의 실시예3에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 6] (A)∼(C)는, 본 발명의 실시예4에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 7] (A)∼(C)는, 본 발명의 실시예4에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 8] (A) 및 (B)는, 본 발명의 비교예1에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 9] 본 발명의 비교예1에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 10] (A)∼(H)는, 본 발명의 비교예2에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.
[도 11] (A)∼(C)는, 본 발명의 비교예3에 관한 다형 검출용 프로브를 사용하여 얻어진 융해 곡선.

본 발명의 프로브는, P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브이다.

본 발명에 의하면, ABCG2 유전자의 다형을 높은 감도로 간편하게 검출할 수 있다.

ABCG2 유전자의 염기 서열은, GeneID : 9429, GenBank 액세션 No.000004(버전 : 000004.11)에 해당하는 서열 중 89011415번째의 염기∼89080010번째의 염기의 서열에 상당한다. 본 명세서에서는, 당해 89011415번째의 염기∼89080010번째의 염기의 서열을 「ABCG2 유전자의 염기 서열」로 한다.

본 명세서에 있어서, 검출 대상인 시료 중의 1본쇄 핵산, 다형 검출용 프로브 또는 프라이머는 개개의 서열에 관하여, 이들 서로의 상보적인 관계에 의거하여 기술된 사항은, 특별히 언급하지 않는 한, 각각의 서열과, 각 서열에 대해서 상보적인 서열에 대해서도 적용된다. 각 서열에 대해서 상보적인 당해 서열에 대해서 본 발명의 사항을 적용할 때에는, 당해 상보적인 서열이 인식하는 서열은, 당업자에 있어서의 기술 상식의 범위 내에서, 대응하는 본 명세서에 기재된 서열에 상보적인 서열로, 명세서 전체를 바꿔 읽는 것으로 한다.

본 발명에 있어서, 「Tm값」이란, 2본쇄 핵산이 해리하는 온도(해리 온도 : Tm)로서, 일반적으로, 260㎚에 있어서의 흡광도가, 흡광도 전 상승분의 50%에 달했을 때의 온도로 정의된다. 즉, 2본쇄 핵산, 예를 들면, 2본쇄 DNA를 포함하는 용액을 가열해 가면, 260㎚에 있어서의 흡광도가 상승한다. 이는, 2본쇄 DNA에 있어서의 양쇄 간의 수소 결합이 가열에 의해 풀어지고, 1본쇄 DNA에 해리(DNA의 융해)하는 것이 원인이다. 그리고, 모든 2본쇄 DNA가 해리하여 1본쇄 DNA가 되면, 그 흡광도는 가열 개시시의 흡광도(2본쇄 DNA만의 흡광도)의 약 1.5배 정도를 나타내고, 이에 의해 융해가 완료했다고 판단할 수 있다. Tm값은, 이 현상에 의거해 설정된다.

본 발명에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 서열에 관하여 「3' 말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우는, 올리고뉴클레오티드쇄의 3' 말단을 1번째로 센다. 마찬가지로 「5' 말단으로부터 세어 1∼3번째」라고 하는 경우는, 올리고뉴클레오티드쇄의 5' 말단을 1번째로 센다.

본 명세서에 있어서 「공정」이라는 말은, 독립한 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우에도 본 공정의 소기(所期)의 작용이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

또한, 본 명세서에 있어서 「∼」을 사용하여 나타낸 수치 범위는, 「∼」의 전후에 기재되는 수치를 각각 최소값 및 최대값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

또한, 본 발명에 있어서, 조성물 중의 각 성분의 양은, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 존재하는 경우에는, 특별히 언급이 없는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수의 물질의 합계량을 의미한다.

이하, 본 발명에 대해 설명한다.

<다형 검출용 프로브>

본 발명의 다형 검출용 프로브(이하, 단지 「프로브」라고도 한다)는, 하기, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드(이하, 단지 「형광 표지 올리고뉴클레오티드」라고도 한다)를 포함한다.

이러한 특정의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 적어도 1종을 포함함으로써, ABCG2 유전자의 다형을 높은 감도로, 간편하게 검출할 수 있다.

서열 번호1에 나타내는 염기 서열은, ABCG2 유전자의 염기 서열의 일부로서, ABCG2 유전자의 1번째∼68595번째의 염기 중, 18597번째∼19196번째의 601염기에 대응하는 것이다.

ABCG유전자의 야생형에서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째에 대응하는 염기는, G(구아닌)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이하여 있다.

또한, 야생형의 ABCG2 유전자에서는, ABCG2 트랜스포터의 아미노산 서열 중, 12번째의 아미노산은 발린(Val)이지만, 변이형의 ABCG2 유전자에서는, 메티오닌(Met)이다(이하, 「V12M 변이」라고 칭한다).

또한 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서, 「311번째의 염기에 대응하는 염기」란, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 311번째의 염기G(구아닌)에 대한 상보적인 염기C(시토신)이다.

상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서는, 이 형광 표지된 상보적인 염기C가 5' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나의 위치에 존재할 수 있다. 또한, 5' 말단에 존재할 수 있다. 이에 의해, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상한다. 또한, P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 생산성 좋게 얻을 수 있다.

상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다. 이 염기는, 야생형이면 G, 변이형에서는 A이다.

상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이는 11∼50인 것을 요한다. 염기길이가 10 이하나, 51 이상인 경우에는, ABCG2 유전자 다형의 검출 감도가 저하한다. 또한, 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이로서는, 다형 검출 감도의 관점에서, 11∼40, 11∼28, 또는 14∼18로 할 수 있다.

또한 상기 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이를 변화시킴으로써, 예를 들면 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 상보쇄(표적 서열)와 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을, 원하는 값으로 조정할 수 있다.

본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 311번째의 염기가 구아닌인 것 이외는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열에 대해서 상동성을 갖는다.

구체적으로는, 본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대해서, 80% 이상의 동일성을 나타낸다.

또한, 검출 감도의 관점에서, 85% 이상의 동일성, 90% 이상의 동일성, 95% 이상의 동일성, 96% 이상의 동일성, 97% 이상의 동일성, 98% 이상의 동일성 또는 99% 이상의 동일성을 나타내도 된다.

본 발명의 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호1에 상보적인 서열이며, 311번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호1에 상보적인 서열을 비교했을 때의 동일성이 80% 미만인 경우에는, 변이형의 ABCG2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 낮아진다.

본 발명의 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 311번째의 염기가 구아닌인 것 이외는, 서열 번호1과 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈한다.

하이브리다이제이션은, 공지의 방법 혹은 그에 준하는 방법, 예를 들면, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재된 방법 등에 따라서 행할 수 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다.

스트린젠트한 조건이란, 특이적인 하이브리드가 형성되어, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 전형적인 스트린젠트한 조건이란, 예를 들면, 칼륨 농도는 약 25mM∼약 50mM, 및 마그네슘 농도는 약 1.0mM∼약 5.0mM 중에 있어서, 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있다. 본 발명의 조건의 일례로서 Tris-HCl(pH8.6), 25mM의 KCl, 및 1.5mM의 MgCl₂ 중에 있어서 하이브리다이제이션을 행하는 조건을 들 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 외, 스트린젠트한 조건으로서는, Molecular Cloning 3rd(J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001)에 기재되어 있다. 이 문헌은, 참조에 의해 본 명세서에 편입되는 것으로 한다. 당업자는, 하이브리다이제이션 반응이나, 하이브리다이제이션 반응액의 염농도 등을 변화시키는 것에 의해, 이러한 조건을 용이하게 선택할 수 있다.

이하에 본 발명에 있어서의 P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 1에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

또, 표 1에서는, 서열 번호1의 301번째의 염기에 대응하는 염기를 대문자로 표기하고, 당해 서열 번호1의 301번째의 염기에 대응하는 염기가 C, T, A 또는 G의 경우인 올리고뉴클레오티드와, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드의 Tm값을 합하여 나타냈다.

여기에서 Tm값은, Meltcalc 99 free(http://www.meltcalc.com/)를 사용하고, 설정 조건 : Oligoconc[μM]0.2, Naeq.[mM]50의 조건으로 산출했다.

[표 1]

본 발명에 있어서, P1 또는 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 1에 있어서의 Tm(mt(A)))과, 서열 번호1의 301번째의 염기에 대응하는 염기만이 비상보적인 DNA와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 1에 있어서의 Tm(ＷT(G)))의 차는, 예를 들면 1.0℃ 이상, 2.0℃ 이상, 또는 3.0℃ 이상 등으로 할 수 있다. 상기 Tm값의 차가 4.0℃ 이상인 것으로써, 예를 들면, 서열 번호1에 있어서의 301번째의 염기의 변이를 보다 고감도로 검출할 수 있다.

서열 번호2에 나타내는 염기 서열은, ABCG2 유전자의 염기 서열의 일부로서, ABCG2 유전자의 1번째∼68595번째의 염기 중 26821번째∼27300번째의 480염기에 대응하는 것이다.

ABCG2 유전자의 야생형에서는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째에 대응하는 염기는, C(시토신)이지만, 변이형에 있어서는 T(티민)로 변이하여 있다.

또한, 야생형의 ABCG2 유전자에서는, ABCG2 트랜스포터의 아미노산 서열 중, 126번째의 아미노산은 글루타민(Gln)이지만, 변이형의 ABCG2 유전자에서는, 종지(終止) 코돈(X)이다(이하, 「Q126X 변이」라고 칭한다).

또한 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서, 「251번째의 염기에 대응하는 염기」란, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 251번째의 염기G(구아닌)에 대한 상보적인 염기C(시토신)이다.

상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서는, 이 형광 표지된 상보적인 염기C가 5' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나의 위치에 존재할 수 있다. 또한, 5' 말단에 존재할 수 있다. 이에 의해, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상한다. 또한, P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 생산성 좋게 얻을 수 있다.

상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다. 이 염기는, 야생형이면 C, 변이형에서는 T이다.

상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이는 18∼50인 것을 요한다. 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이가, 17 이하나, 51 이상인 경우에는, 다형 검출 감도가 저하한다. 또한, 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이는, 다형 검출 감도의 관점에서, 18∼40, 20∼30, 또는 22∼26으로 할 수 있다.

또한 상기 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이를 변화시킴으로써, 예를 들면 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 표적 서열과 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을, 원하는 값으로 조정할 수 있다.

본 발명의 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 251번째의 염기가 구아닌인 것 이외는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열에 대해서 상동성을 갖는다.

구체적으로는, 본 발명의 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대해서, 80% 이상의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호2에 상보적인 서열이며, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호2에 상보적인 서열을 비교했을 때의 동일성이 80% 미만인 경우에는, 변이형의 ABCG2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 낮아진다.

본 발명의 상기 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 251번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호2와 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈한다. 또, 하이브리다이제이션을 행하는 방법, 및 스트린젠트한 조건에 대해서는, 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 같은 방법, 및 같은 조건으로 행하면 된다.

이하에 본 발명에 있어서의 P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 2에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

또, 표 2에서는, 서열 번호2의 234번째의 염기에 대응하는 염기를, 밑줄을 친 대문자로 표기하고, 당해 서열 번호2의 234번째의 염기에 대응하는 염기가 A, G, T 또는 C의 경우인 올리고뉴클레오티드와, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리드의 Tm값을 합하여 나타냈다. Tm값은, 상기와 같은 방법으로 산출했다. 또한, 밑줄을 치고 있지 않은 대문자로 표기된 염기는, 서열 번호2의 245번째의 Ｗ에 대응하는 염기를 나타낸다.

[표 2]

본 발명에 있어서, P2 또는 P2'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 2에 있어서의 Tm(mt(T)))과, 서열 번호2에 있어서의 234번째의 염기에 대응하는 염기만이 비상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 2에 있어서의 Tm(ＷT(C)))의 차는, 1.0℃ 이상, 2.0℃ 이상, 3.0℃ 이상으로 할 수 있다. 상기 Tm값의 차가 4.0℃ 이상인 것으로써, 예를 들면, 서열 번호2에 있어서의 234번째의 염기의 변이를 보다 고감도로 검출할 수 있다.

서열 번호3에 나타내는 염기 서열은, ABCG2 유전자의 염기 서열의 일부로서, ABCG2 유전자의 1번째∼68595번째의 염기 중 27528번째∼27868번째의 341염기에 대응하는 것이다.

ABCG2 유전자의 야생형에서는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째로 대응하는 염기는, C(시토신)이지만, 변이형에 있어서는 A(아데닌)로 변이하여 있다.

또한, 야생형의 ABCG2 유전자에서는, ABCG2 트랜스포터의 아미노산 서열 중, 141번째 아미노산은 글루타민(Gln)이지만, 변이형의 ABCG2 유전자에서는, 리신(Lys)이다(이하, 「Q141K 변이」라고 칭한다).

또한 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서, 「152번째의 염기에 대응하는 염기」란, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서의 152번째의 염기G(구아닌)에 대한 상보적인 염기C(시토신)이다.

상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서는, 이 형광 표지된 상보적인 염기C가 3' 말단으로부터 세어 1∼3번째의 어느 하나의 위치에 존재할 수 있다. 또한, 3' 말단에 존재할 수 있다. 이에 의해, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상한다. 또한, P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 생산성 좋게 얻을 수 있다.

상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째의 염기에 있어서의 다형을 검출할 수 있는 프로브이다. 이 염기는, 야생형이면 C, 변이형에서는 A이다.

상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이는 10∼50인 것을 요한다. 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이는 10∼40, 15∼30, 또는 18∼22로 할 수 있다. 이 범위의 염기길이에 의해, 예를 들면, 다형 검출 감도가 보다 향상한다.

또한 상기 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 염기길이를 변화시킴으로써, 예를 들면 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 그 표적 서열과 형성하는 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을, 원하는 값으로 조정할 수 있다.

본 발명의 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 152번째의 염기가 구아닌인 것 이외는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 상보적인 서열에 대해서 상동성을 갖는다.

구체적으로는, 본 발명의 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 상보적인 염기 서열에 대해서, 80% 이상의 동일성을 나타낸다.

본 발명의 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 서열 번호3에 상보적인 서열이며, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호3에 상보적인 서열을 비교했을 때의 동일성이 80% 미만인 경우에는, 변이형의 ABCG2 유전자를 포함하는 시료 핵산에 대한 검출 감도가 낮아진다.

본 발명의 상기 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 152번째의 염기에 대응하는 염기가 구아닌인 것 이외는 서열 번호3과 동일한 염기를 갖는 서열에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈한다. 또, 하이브리다이제이션을 행하는 방법, 및 스트린젠트한 조건에 대해서는, 상기 P1'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 같은 방법, 및 같은 조건으로 행하면 된다.

이하에 본 발명에 있어서의 P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 있어서의 염기 서열의 일례를 표 3에 나타내지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.

또, 표 3에서는, 서열 번호3의 161번째의 염기에 대응하는 염기를 대문자로 표기하고, 당해 서열 번호3의 161번째에 대응하는 염기가 T, G 및 A, C의 경우인 올리고뉴클레오티드와, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드의 Tm값을 합하여 나타냈다. Tm값은, 상기와 같은 방법으로 산출했다.

[표 3]

본 발명에 있어서, P3 또는 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 3에 있어서의 Tm(mt(A)))과, 서열 번호3에 있어서의 161번째의 염기에 대응하는 염기만이 비상보적인 DNA와 하이브리다이즈했을 경우의 Tm값(표 3에 있어서의 Tm(ＷT(C)))의 차는, 예를 들면 1.0℃ 이상, 2.0℃ 이상, 또는 3.0℃ 이상 등으로 할 수 있다. 상기 Tm값의 차가 4.0℃ 이상인 것으로써, 예를 들면, 서열 번호3에 있어서의 161번째의 염기의 변이를 보다 고감도로 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서의 상기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'의 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'의 어느 하나의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드도 포함된다.

당해 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 상기 P1∼P3의 어느 하나에 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 동등 정도의 작용을 나타내면 되며, 염기가 삽입, 결실 또는 치환되어 있는 경우, 그 삽입, 결실 또는 치환의 위치는, 특별히 한정되지 않는다. 삽입, 결실 또는 치환한 염기의 수로서는 1염기 또는 2염기 이상을 들 수 있고, 예를 들면 1염기로부터 10염기, 1염기로부터 5염기 등을 들 수 있다.

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하거나 또는 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다. 그 중에서도 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드로 할 수 있다. 이러한 형광 소광 현상(Quenching phenomenon)을 이용한 프로브는, 일반적으로, 구아닌 소광 프로브라고 불리고 있으며, 소위 Q Probe로서 알려져 있다. 그 중에서도, 3' 말단 혹은 5' 말단이 C가 되도록 설계되어, 그 말단의 C가, G에 가까워지면 발광이 약해지도록 형광 색소로 표지화된 올리고뉴클레오티드인 것을 들 수 있다.

또, Q Probe를 사용한 검출 방법 이외에도, 공지의 검출 양식을 적용해도 된다. 이러한 검출 양식으로서는, Taq-man Probe법, Hybridization Probe법, Moleculer Beacon법 또는 MGB Probe법 등을 들 수 있다.

상기 형광 색소로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 플루오레세인, 인광체, 로다민, 폴리메틴 색소 유도체 등을 들 수 있다. 이들 형광 색소의 시판품으로서는, 예를 들면, Pacific Blue, BODIPY FL, Fluore Prime, Fluoredite, FAM, Cy3 및 Cy5, TAMRA 등을 들 수 있다.

형광 표지 올리고뉴클레오티드의 검출 조건은 특별히 제한되지 않고, 사용하는 형광 색소에 따라 적절히 결정할 수 있다. 예를 들면, Pacific Blue는, 검출 파장 445㎚∼480㎚, TAMRA는, 검출 파장 585㎚∼700㎚, BODIPY FL은, 검출 파장 520㎚∼555㎚로 검출할 수 있다.

이러한 형광 색소를 갖는 프로브를 사용하면, 각각의 형광 시그널의 변동에 의해, 하이브리다이즈와 해리를 용이하게 확인할 수 있다. 형광 색소의 올리고뉴클레오티드로의 결합은, 통상의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 행할 수 있다.

또한 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 3' 말단에 인산기가 부가되어도 된다. 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 두는 것에 의해, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장(伸長)하는 것을 충분히 억제할 수 있다. 후술하는 바와 같이, 변이의 유무를 검출하는 DNA(표적 DNA)는, PCR 등의 유전자 증폭법에 의해 조제할 수 있다. 그 때, 3' 말단에 인산기가 부가된 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써, 이를 증폭 반응의 반응액 중에 공존시킬 수 있다.

즉, 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 인산기를 부가시켜 둠으로써, 프로브 자체가 유전자 증폭 반응에 의해 신장하는 것을 충분히 억제할 수 있다. 또한, 3' 말단에 상기한 바와 같은 표지화 물질(형광 색소)을 부가하는 것에 의해서도, 같은 효과를 얻을 수 있다.

상기 염기 서열을 갖고, 5' 말단 또는 3' 말단의 C가 형광 색소로 표지된 올리고뉴클레오티드의 구체예를 이하에 나타낸다(대문자의 염기는 변이점을 나타내고, P는 인산기를 나타낸다. 또한, Pacific Blue, BODIPY FL 및 TAMRA는, 각각 상기 형광 색소를 나타낸다). 단, 본 발명에 있어서의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 이하의 것에 한정되지 않는다.

[표 4]

상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 ABCG2 유전자에 있어서의 다형, 특히 V12M 변이, Q126X 변이 또는 Q141K 변이를 검출하는 다형 검출용 프로브로서 사용할 수 있다.

또한, ABCG2 유전자 다형 검출용 프로브는, 융해 곡선 분석용의 프로브로서 사용할 수 있다.

또, 본 발명에 관한 상기 P1∼P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드의 합성 방법으로서 알려져 있는 공지의 방법, 예를 들면 일본 특개2002-119291호 공보 등에 기재된 방법에 따라 제작할 수 있다.

<다형 검출 방법>

다형의 검출 방법은, 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 사용하여 ABCG2 유전자의 다형을 검출하는 방법이면, 특별히 제한되지 않는다. 상기 형광 표지 뉴클레오티드를 사용하는 다형 검출 방법의 일례로서, Tm 해석을 이용한 다형 검출 방법에 대해서, 이하에 설명한다.

본 발명의 다형 검출 방법은, ABCG2 유전자에 있어서의 다형의 검출 방법으로서, 하기 공정(Ⅰ)∼(Ⅳ)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 형광 검출용 프로브를 사용하는 것이 특징으로서, 그 외의 구성이나 조건 등은, 이하의 기재에 제한되지 않는다.

(Ⅰ) 상기 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈하여 하이브리드를 얻는 것.

(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시키는 것에 의해, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것.

(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것.

(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여 ABCG2 유전자에 있어서의 다형의 존재를 검출하는 것.

또한, 본 발명에 관한 검출 방법은, 상기 공정(Ⅰ)∼(Ⅳ)의 외에, 하기 공정(Ⅴ)을 포함하고 있어도 된다.

(Ⅴ) 상기 다형의 존재에 의거하여, 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, 다형을 갖는 1본쇄 핵산의 존재비를 검출하는 것.

또한, 본 발명에 있어서는, 상기 공정(Ⅰ)∼(Ⅳ) 또는 상기 공정(Ⅰ)∼(Ⅴ)에 더하여, 공정(Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 전 또는 공정(Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에, 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하고 있어도 된다.

또, (Ⅲ)에서 Tm값을 측정하는 것에는, 하이브리드의 해리 온도를 평가하는 것뿐만 아니라, 하이브리드 형성체의 융해시에 온도에 따라 변동하는 형광 시그널의 미분값의 크기를 평가하는 것을 포함한다. 미분값의 크기에 의해, 다형을 갖는 염기 서열(DNA)의 존재비를 평가할 수 있다.

본 발명에 있어서, 시료 중의 핵산은, 1본쇄 핵산이어도 되며 2본쇄 핵산이어도 된다. 상기 핵산이 2본쇄 핵산인 경우에는, 예를 들면, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와 하이브리다이즈하는 것에 앞서, 가열에 의해 상기 시료 중의 2본쇄 핵산을 융해(해리)시켜서 1본쇄 핵산으로 할 수 있다. 2본쇄 핵산을 1본쇄 핵산으로 해리하는 것에 의해, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와의 하이브리다이즈가 가능하게 된다.

본 발명에 있어서, 검출 대상인 시료에 포함되는 핵산은, 예를 들면, 생체 시료에 원래 포함되는 핵산이어도 되지만, 검출 정밀도를 향상할 수 있으므로, 생체 시료에 원래 포함되어 있는 핵산을 주형으로서 PCR 등에 의해 ABCG2 유전자의 변이한 부위를 포함하는 영역을 증폭시킨 증폭 산물인 것을 들 수 있다. 증폭 산물의 길이는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 50mer∼1000mer, 또는 80mer∼200mer로 할 수 있다. 또한, 시료 중의 핵산은, 예를 들면, 생체 시료 유래의 RNA(토털 RNA, mRNA 등)부터 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)에 의해 합성한 cDNA이어도 된다.

본 발명에 있어서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은 특별히 제한되지 않는다. 시료 중의 DNA에 대해서 예를 들면 1배 이하를 들 수 있다. 또한, 충분한 검출 시그널 확보의 관점에서, 상기 시료 중의 핵산에 대한, 본 발명의 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 0.1배 이하로 할 수 있다.

여기에서, 시료 중의 핵산이란, 예를 들면, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 핵산과 상기 다형이 발생하고 있지 않는 비검출 대상 핵산의 합계이어도 되며, 검출 목적의 다형이 발생하고 있는 검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물과 상기 다형이 발생하지 않는 비검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물의 합계여도 된다. 또, 시료 중의 핵산에 있어서의 상기 검출 대상 핵산의 비율은, 통상, 불분명하지만, 결과적으로, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해서 10배 이하로 할 수 있다. 또한, 상기 다형 검출용 프로브의 첨가 비율(몰비)은, 검출 대상 핵산(검출 대상 서열을 포함하는 증폭 산물)에 대해서, 5배 이하, 또는 3배 이하로 할 수 있다. 또한, 그 하한은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.001배 이상, 0.01배 이상, 또는 0.1배 이상으로 할 수 있다.

상기 DNA에 대한 본 발명의 프로브의 첨가 비율은, 예를 들면, 2본쇄 핵산에 대한 몰비여도 되고, 1본쇄 핵산에 대한 몰비여도 된다.

본 발명에 있어서, Tm값을 결정하기 위한 온도 변화에 따르는 시그널 변동의 측정은, 상술과 같은 원리에서 260㎚의 흡광도 측정에 의해 행할 수도 있지만, 상기 다형 검출용 프로브에 부가한 표지의 시그널에 의거하는 시그널로서, 1본쇄 DNA와 상기 다형 검출용 프로브의 하이브리드 형성의 상태에 따라 변동하는 시그널을 측정할 수 있다. 이 때문에, 상기 다형 검출용 프로브로서, 상술의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드로서는, 예를 들면, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소(소광)하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드, 또는 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 증가하는 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다.

전자와 같은 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하고 있을 때에는 형광 시그널을 나타내지 않거나, 형광 시그널이 약하지만, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널을 나타내도록 되거나, 형광 시그널이 증가한다.

또한, 후자의 프로브이면, 검출 대상 서열과 하이브리드(2본쇄 DNA)를 형성하는 것에 의해 형광 시그널을 나타내고, 가열에 의해 프로브가 해리하면 형광 시그널이 감소(소실)한다. 따라서, 이 형광 표지에 의거하는 형광 시그널의 변화를 형광 표지 특유의 조건(형광 파장 등)으로 검출하는 것에 의해, 상기 260㎚의 흡광도 측정과 마찬가지로, 융해의 진행 및 Tm값의 결정을 행할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 다형 검출 방법에 대해서, 형광 색소에 의거하는 시그널의 변화를 검출하는 방법에 대해서 구체적 예를 들어 설명한다. 또, 본 발명의 다형 검출 방법은, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하는 것 자체가 특징이며, 그 외의 공정이나 조건에 대해서는 조금도 제한되지 않는다.

핵산 증폭을 행할 때의 주형이 되는 핵산을 포함하는 시료로서는, 핵산, 특히 ABCG2 유전자를 포함하고 있으면 되며, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 대장이나 폐 등의 조직, 백혈구 세포 등의 혈구, 전혈, 혈장, 객담(喀痰), 구강 점막 현탁액, 손톱이나 모발 등의 체세포, 생식 세포, 젖, 복수액, 파라핀 포매 조직, 위액, 위세정액, 요(尿), 복막액, 양수, 세포 배양 등의 임의의 생물학적 기원에 유래하는 또는 유래할 수 있는 것을 들 수 있다. 또, 시료의 채취 방법, 핵산을 포함하는 시료의 조제 방법 등은, 제한되지 않고, 어느 것이나 종래 공지의 방법을 사용할 수 있다. 또한, 주형이 되는 핵산은, 당해 기원으로부터 얻어진 채로 직접적으로, 혹은 당해 샘플의 특성을 개변하기 위해 전처리한 후에 사용할 수 있다.

예를 들면, 전혈을 시료로 하는 경우, 전혈로부터의 게놈 DNA의 단리(單離)는, 종래 공지의 방법에 의해 행할 수 있다. 예를 들면, 시판의 게놈 DNA 단리 키트(상품명 GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE헬스케어바이오사이엔스사제) 등을 사용할 수 있다.

이하에 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서 사용할 수 있는 1본쇄 핵산의 염기 서열의 예를 나타낸다. 또, 이들은 예시로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 1본쇄 핵산으로서는, 이하의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 1본쇄 핵산을 사용할 수 있다.

[표 5]

또한, 상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 1본쇄 핵산으로서는, 이하의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 1본쇄 핵산을 사용할 수 있다.

[표 6]

또한, 상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 1본쇄 핵산으로서는, 이하의 염기 서열로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 1본쇄 핵산을 사용할 수 있다.

[표 7]

다음으로, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 시료에, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 다형 검출용 프로브를 첨가한다.

상기 다형 검출용 프로브는, 단리한 게놈 DNA를 포함하는 액체 시료에 첨가해도 되고, 적당한 용매 중에서 게놈 DNA와 혼합해도 된다. 상기 용매로서는, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, Tris-HCl 등의 완충액, KCl, MgCl₂, MgSO₄, 글리세롤 등을 포함하는 용매, PCR 반응액 등, 종래 공지의 것을 들 수 있다.

상기 다형 검출용 프로브의 첨가의 타이밍은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 후술하는 PCR 등의 증폭 처리를 행하는 경우, 증폭 처리 후에, PCR 증폭 산물에 대해서 첨가해도 되고, 증폭 처리 전에 첨가해도 된다.

이와 같이 PCR 등에 의한 증폭 처리 전에 상기 검출용 프로브를 첨가하는 경우는, 예를 들면, 상술과 같이, 그 3' 말단에, 형광 색소를 부가하거나, 인산기를 부가하거나 할 수 있다.

핵산 증폭의 방법으로서는, 예를 들면 폴리머라제를 사용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 예로서는, PCR법, ICAN법, LAMP법, NASBA법 등을 들 수 있다. 폴리머라제를 사용하는 방법에 의해 증폭하는 경우는, 본 발명 프로브의 존재 하에서 증폭을 행할 수 있다. 사용하는 프로브 및 폴리머라제에 따라, 증폭의 반응 조건 등을 조정하는 것은 당업자라면 용이하다. 이에 의해, 핵산의 증폭 후에 프로브의 Tm값을 해석하는 것만으로 다형을 검출할 수 있으므로, 반응 종료 후 증폭 산물을 취급할 필요가 없다. 따라서, 증폭 산물에 의한 오염의 걱정이 없다. 또한, 증폭에 필요한 기기와 같은 기기로 검출하는 것이 가능하므로, 용기를 이동할 필요가 없고, 자동화도 용이하다.

또한 PCR법에 사용하는 DNA 폴리머라제로서는, 통상 사용할 수 있는 DNA 폴리머라제를 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 예를 들면, GeneTaq(니뽄진사제), PrimeSTAR Max DNA Polymerase(다카라바이오사제), Taq 폴리머라제 등을 들 수 있다.

폴리머라제의 사용량으로서는, 통상 사용되고 있는 농도이면 특별히 제한은 없다. 예를 들면, Taq 폴리머라제를 사용하는 경우, 예를 들면, 반응 용액량 50㎕에 대해서 0.01U∼100U의 농도로 할 수 있다. 이에 의해, ABCG2 유전자 다형의 검출 감도가 높아지는 등의 경향이 있다.

또한 PCR법은, 통상 사용되는 조건을 적절히 선택함으로써 행할 수 있다.

또, 증폭 시, 리얼타임 PCR에 의해 증폭을 모니터링하고, 시료에 포함되는 DNA(검출 대상 서열)의 카피수를 조사할 수도 있다. 즉, PCR에 의한 DNA(검출 대상 서열)의 증폭에 따라 하이브리드를 형성하는 프로브의 비율이 늘어나므로 형광 강도가 변동한다. 이를 모니터링함으로써, 시료에 포함되는 검출 대상 서열(정상 DNA 또는 변이 DNA)의 카피수나 존재비를 검출할 수 있다.

본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜, 양자를 하이브리다이즈시킨다. 시료 중의 1본쇄 핵산은, 예를 들면, 상기와 같이 하여 얻어진 PCR 증폭 산물을 해리함으로써 조제할 수 있다.

상기 PCR 증폭 산물의 해리(해리 공정)에 있어서의 가열 온도는, 상기 증폭 산물을 해리할 수 있는 온도이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 85℃∼95℃이다. 가열 시간도 특별히 제한되지 않는다. 가열 시간은, 예를 들면 1초∼10분, 또는 1초∼5분으로 할 수 있다.

또한, 해리한 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리다이즈는, 예를 들면, 상기 해리 공정 후, 상기 해리 공정에 있어서의 가열 온도를 강하시키는 것에 의해 행할 수 있다. 온도 조건으로서는, 예를 들면, 40℃∼50℃이다.

하이브리다이즈 공정의 반응액에 있어서의 각 조성의 체적이나 농도는, 특별히 제한되지 않는다. 구체예로서는, 상기 반응액에 있어서의 DNA의 농도는, 예를 들면, 0.01μM∼1μM, 또는 0.1μM∼0.5μM으로 할 수 있다. 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 농도는, 예를 들면, 상기 DNA에 대한 첨가 비율을 만족하는 범위이며, 예를 들면, 0.001μM∼10μM, 또는 0.001μM∼1μM으로 할 수 있다.

그리고, 얻어진 상기 1본쇄 DNA와 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 수반하는 형광 시그널의 변동을 측정한다. 예를 들면, Q Probe를 사용했을 경우, 1본쇄 DNA와 하이브리다이즈한 상태에서는, 해리한 상태에 비하여 형광 강도가 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 형광이 감소(또는 소광)하고 있는 하이브리드를 서서히 가열하고, 온도 상승에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

형광 강도의 변동을 측정할 때의 온도 범위는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 개시 온도가 실온∼85℃, 또는 25℃∼70℃로 할 수 있다. 종료 온도는, 예를 들면, 40℃∼105℃로 할 수 있다. 또한, 온도의 상승 속도는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 0.1℃/초∼20℃/초, 또는 0.3℃/초∼5℃/초로 할 수 있다.

다음으로, 상기 시그널의 변동을 해석하여 Tm값으로서 결정한다. 구체적으로는, 얻어진 형광 강도로부터 각 온도에 있어서의 미분값(-d형광 강도/dt)을 산출하고, 가장 낮은 값을 나타내는 온도를 Tm값으로서 결정할 수 있다. 또한, 단위 시간당의 형광 강도 증가량(형광 강도 증가량/t)이 가장 높은 점을 Tm값으로서 결정할 수도 있다. 또, 표지화 프로브로서, 소광 프로브가 아니고, 하이브리드 형성에 의해 시그널 강도가 증가하는 프로브를 사용했을 경우에는, 반대로, 형광 강도의 감소량을 측정하면 된다.

또한, 본 발명에 있어서는, 상술과 같이, 하이브리드를 가열하여, 온도 상승에 수반하는 형광 시그널 변동(바람직하게는 형광 강도의 증가)을 측정하지만, 이 방법 대신에, 예를 들면, 하이브리드 형성시에 있어서의 시그널 변동의 측정을 행해도 된다. 즉, 상기 프로브를 첨가한 시료의 온도를 강하시켜서 하이브리드를 형성할 때의 상기 온도 강하에 수반하는 형광 시그널 변동을 측정해도 된다.

구체예로서, Q Probe를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 크지만, 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 상기 형광이 감소(또는 소광)한다. 따라서, 예를 들면, 상기 가열한 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 감소를 측정하면 된다.

한편, 하이브리드 형성에 의해 시그널이 증가하는 표지화 프로브를 사용했을 경우, 상기 프로브를 시료에 첨가했을 때에는, 상기 프로브는 해리 상태에 있기 때문에 형광 강도가 작지만(또는 소광), 온도의 강하에 의해 하이브리드를 형성하면, 형광 강도가 증가하게 된다. 따라서, 예를 들면, 상기 시료의 온도를 서서히 강하하여, 온도 하강에 수반하는 형광 강도의 증가를 측정하면 된다.

본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 목적으로 하는 염기를 포함하는 영역을 증폭 가능하면, 증폭하는 방법으로서는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 기술한 PCR법을 사용할 수 있다.

목적으로 하는 염기를 포함하는 영역은, 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 301번째의 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 234번째의 염기를 포함하는 염기 서열 또는 상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서의 141번째의 염기를 포함하는 염기 서열에서, 각각 염기길이 50∼500의 영역, 50∼300의 영역, 또는 50∼200의 영역을 들 수 있다.

PCR법에 적용하는 프라이머는, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이제이션할 수 있는 영역을 증폭할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않고, 서열 번호1로 나타내는 염기 서열로부터, 당업자라면 적절히 설계할 수 있다. 프라이머의 길이 및 Tm값은, 12mer∼40mer 및 40℃∼70℃, 또는 16mer∼30mer 및 55℃∼60℃로 할 수 있다.

또한, 프라이머 세트의 각 프라이머의 길이는 동일하지 않아도 되지만, 양프라이머의 Tm값은 거의 동일(또는, Tm값의 양프라이머에서의 차가 5℃ 이내)하게 할 수 있다.

이하에 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서, 본 발명의 다형 검출용 프로브가 하이브리다이즈하는 영역을 포함하는 염기 서열의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 예를 나타낸다. 또, 이들은 예시로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서는, 하기 P4 또는 P5로 나타내는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 어느 한쪽이면 된다.

(P4) 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 198∼230번째의 염기를 포함하는 염기길이 33∼50의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P4의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 198∼230번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 33∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P4의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P4의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

(P5) 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 332∼353번째의 염기를 포함하는 염기길이 22∼50의 염기 서열에 상보적인 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P5의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서 332∼3553번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 22∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P5의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P5의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

이하에, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서의 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 301번째의 염기를 포함하는 영역의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 일례를 나타낸다.

[표 8]

또한, 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위해서는, 상기 P4 및 P5로 나타내는 각 올리고뉴클레오티드를, 한 쌍의 프라이머 세트로서 사용할 수 있다.

상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서는, 하기 P6 또는 P7로 나타내는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 어느 한쪽이면 된다.

(P6) 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 132∼157번째의 염기를 포함하는 염기길이 26∼50의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P6의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서 132∼157번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 26∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P6의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P6의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

(P7) 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 268∼295번째의 염기를 포함하는 염기길이 28∼50의 염기 서열에 상보적인 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P7의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서 268∼295번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 28∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P7의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P7의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

이하에, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서의 상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 234번째의 염기를 포함하는 영역의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 일례를 나타낸다.

[표 9]

또한, 상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위해서는, 상기 P6 및 P7로 나타내는 각 올리고뉴클레오티드를, 한 쌍의 프라이머 세트로서 사용할 수 있다.

상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하기 위한 프라이머로서는, 하기 P8 또는 P9로 나타내는 올리고뉴클레오티드 중 적어도 어느 한쪽이면 된다.

(P8) 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 121∼145번째의 염기를 포함하는 염기길이 25∼50의 염기 서열에 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P8의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서 121∼145번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 25∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P8의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P8의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

(P9) 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 214∼235번째의 염기를 포함하는 염기길이 22∼50의 염기 서열에 상보적인 서열 대해서 적어도 80% 이상의 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드. 또한, 상기 P9의 올리고뉴클레오티드로서는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서 214∼235번째의 염기에 대응하는 염기를 포함하는 염기길이 22∼50의 염기 서열의 상보쇄에 대해서 스트린젠트한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드이어도 된다. 상기 P9의 올리고뉴클레오티드로서는, 상기 P9의 올리고뉴클레오티드의 염기가 삽입, 결실 또는 치환한 올리고뉴클레오티드이어도 된다.

이하에, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서의 상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서의 161번째의 염기를 포함하는 영역의 증폭에 사용할 수 있는 프라이머의 일례를 나타낸다.

[표 10]

또한, 상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하려면, 상기 P8 및 P9로 나타내는 각 올리고뉴클레오티드를, 한 쌍의 프라이머 세트로서 사용할 수 있다.

하이브리다이제이션을 행하는 방법에 대해서는 프로브의 항에 있어서 기재한 방법을 따르면 되며, 스트린젠트한 조건에 대해서도 프로브의 항에 있어서 기재의 조건과 같은 조건을 적용할 수 있다. 또한, 동일성의 범위나, 삽입, 결실 또는 치환에 대해서도, 프로브의 항에 기재한 것과 같은 범위를 적용할 수 있다.

또, 본 발명의 다형 검출 방법에 있어서는, 본 발명의 다형 검출용 프로브로서, 상기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 2종 이상을 병용해도 된다. 이에 의해 ABCG2 유전자의 다형을 동시, 또한 간편하게 검출할 수 있다.

또한, 상기 P1, P1', P2, P2', P3 및 P3'로 이루어지는 군에서 선택되는 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 2종 이상을 병용하고, V12M 변이, Q126X 변이 및 Q141K 변이로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 변이를 검출함으로써, 예를 들면, ABCG2 유전자에 유래하는 ABCG2 트랜스포터의 기능을 보다 정밀도 좋게 예측할 수 있다. 예를 들면, 상기 P1과 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 조합, 상기 P2와 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 조합 등이 조합으로서는 들 수 있고, 상기 P2와 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드의 조합을 들 수 있다.

<약효 판정 방법>

본 발명의 약효 판정 방법은, 상술한 다형 검출 방법에 의해 ABCG2 유전자의 다형을 검출하는 것, 및, 상기 검출 결과에 의거하여 약제에 대한 내성 또는 약제의 약효를 판정하는 것을 포함한다.

본 발명의 ABCG2 유전자의 다형 검출 방법에 의하면, ABCG2 유전자의 변이의 유무와 종류를 검출할 수 있고, 특히 V12M 변이, Q126X 변이 또는 Q141K 변이를 높은 감도로 간편하게 검출할 수 있다.

이에 의해 다형의 유무나 변이 서열과 정상 서열의 존재비에 의거하여 약제에 대한 내성이나 약제의 약효를 판정할 수 있다. 그리고, 본 발명의 약효 판정 방법은, 변이의 유무나 변이 서열의 존재비에 의거하여, 약제의 투여량의 증가, 다른 치료약으로의 변경 등으로의 교체 등의 질병의 치료 방침을 결정하는데도 유용하다.

또한, 판정 대상이 되는 약제로서는, 구체적으로는, 통풍 치료약, 고요산 혈증 치료약 등을 들 수 있고, 특히 통풍 치료약 및 고요산 혈증 치료약을 들 수 있다.

<질환 예측 방법>

본 발명의 질환 예측 방법은, 상기한 다형 검출 방법에 의해 ABCG2 유전자의 다형을 검출하는 것, 및, 상기 검출 결과에 의거하여 질환의 이환 리스크를 예측하는 것을 포함한다.

그 때문에, 본 발명에 의하면, 검출된 다형의 유무에 의거하고, 질환의 이환 리스크를 예측할 수 있다. ABCG2 유전자형의 조합과 질환의 발증 리스크 등에 대해서는, 구체적으로는, 실험 의학 2010년, 제28권, 제8호, p.1285-1289, British Journal of Clinical Pharmacology Volume 64, Issue 5, Article first published online : 17 MAY 2007 등에 기재된 내용을 참조하는 것에 의해 예측을 행하는 것이 가능하다.

또한, 예측 대상이 되는 질환으로서는, 구체적으로는, 통풍, 고요산 혈증, 포르피린증 등을 들 수 있고, 특히 통풍 및 고요산 혈증을 들 수 있다.

<다형 검출용 시약 키트>

본 발명의 다형 검출용 시약 키트는, 상기 서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서의 301번째의 염기의 변이를 검출 가능한 다형 검출용 프로브, 상기 서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서의 234번째의 염기의 변이를 검출 가능한 다형 검출용 프로브 또는 상기 서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서의 161번째의 염기의 변이를 검출 가능한 다형 검출용 프로브의 적어도 1종을 포함하는 것이다. 이에 의해, 본 발명의 다형 검출용 시약 키트는 ABCG2 유전자의 다형을 검출 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 2종 이상의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것이어도 된다.

다형 검출용 프로브로서 2종 이상의 형광 표지 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 혼합된 상태에서 포함되어 있어도, 별개로 포함되어 있어도 된다.

2종 이상의 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는 발광 파장이 서로 다른 형광 색소로 표지화되어 있어도 된다.

이와 같이 형광 색소의 종류를 바꿈으로써, 같은 반응계여도, 각각의 형광 표지 올리고뉴클레오티드에 대해서의 검출을 동시에 행하는 것도 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 상술의 검출 대상이 되는 ABCG2 유전자 다형을 포함하는 서열을 증폭 가능한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다. 이에 의해, 본 발명에 있어서의 다형 검출용 시약 키트는, 정밀도 좋게 ABCG2 유전자의 다형의 검출을 행할 수 있다.

또, 다형 검출용 시약 키트에 포함될 수 있는 프로브 및 프라이머에 대해서는, 상술한 사항을 그대로 적용할 수 있다.

본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, 서열 번호1에 나타내는 염기 서열의 301번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하는 시약(301 검출 시약)을 포함하고 있어도 된다. 시약으로서는, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, P4 및 P5로 나타내는 프라이머로 이루어지는 군 중 적어도 하나를 들 수 있다.

본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, 서열 번호2에 나타내는 염기 서열의 234번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하는 시약(234 검출 시약)을 포함하고 있어도 된다. 시약으로서는, 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, P6 및 P7로 나타내는 프라이머로 이루어지는 군 중 적어도 하나를 들 수 있다.

본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, 서열 번호3에 나타내는 염기 서열의 161번째의 염기에 있어서의 다형을 검출하는 시약(161 검출 시약)을 포함하고 있어도 된다. 시약으로서는, 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드와, P8 및 P9로 나타내는 프라이머로 이루어지는 군 중 적어도 하나를 들 수 있다.

본 발명에 관한 다형 검출용 시약 키트는, 상기 301 검출 시약, 상기 234 검출 시약 또는 상기 161 검출 시약을 1종 단독으로 사용해도 되며, 2종 이상을 병용해도 된다.

또한, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 구체적으로는, 서열 번호4, 서열 번호5, 서열 번호6, 서열 번호7, 서열 번호8 또는 서열 번호9로 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되어도 된다.

상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 구체적으로는, 서열 번호10, 서열 번호11, 서열 번호12, 서열 번호13, 서열 번호14, 서열 번호15, 서열 번호16 및 서열 번호17로 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되어도 된다.

상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 구체적으로는, 서열 번호18, 서열 번호19, 서열 번호20, 서열 번호21, 서열 번호22 및 서열 번호23으로 나타내는 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드로 구성되어도 된다.

본 발명에 있어서의 검출용 시약 키트는, 상기 프로브 및 상기 프라이머의 외에, 본 발명의 검출 방법에 있어서의 핵산 증폭을 행하는데도 필요한 시약류, 특히 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭을 위한 프라이머를 더 포함하고 있어도 된다.

또한, 프로브, 프라이머 및 그 외의 시약류는, 별개로 수용되어 있어도 되고, 그들의 일부가 혼합물로 되어 있어도 된다.

또한, 「별개로 수용」이란, 각 시약이 비접촉 상태를 유지할 수 있도록 구분된 것이면 되며, 반드시 독립하여 취급 가능한 개별의 용기에 수용될 필요는 없다.

다형 부위를 포함하는 서열(프로브가 하이브리다이즈하는 영역)을 증폭 가능한 프라이머 세트를 포함함으로써, 예를 들면, 보다 고감도로 다형을 검출할 수 있다.

또한 본 발명의 다형 검출용 시약 키트는, 상기 다형 검출용 프로브를 사용하여, 검출 대상인 핵산을 포함하는 시료에 대해서 미분 융해 곡선을 작성하고, 그 Tm값 해석을 행하여, ABCG2 유전자에 있어서의 다형을 검출하는 것이 기재된 취급 설명서, 또는 검출용 시약 키트에 포함되는 혹은 추가적으로 포함하는 것이 가능한 각종의 시약에 대해서 기재된 사용 설명서를 포함할 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 실시예에 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예1>

실시예1-1 : 1본쇄 핵산과 프로브의 Tm 해석

전자동 SNPs 검사 장치 IS-5310(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)과 하기 표 11에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, Tm 해석을 행했다.

[표 11]

Tm 해석은, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 이 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 여기 파장을 365㎚∼415㎚로 하고, 측정 파장을 445㎚∼480㎚로 하여, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

그 결과, 야생형(서열 번호1의 301번째의 염기가 G)과, 변이형(V12M, 서열 번호1의 301번째의 염기가 A)의 양쪽의 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 야생형의 Tm값은 49℃이며, 변이형의 Tm값은 56℃이었다.

도 2에, Tm 해석에 의해 얻어진 야생형(A) 및 변이형(B)의 그래프를 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

실시예1-2 : 인간 게놈과 프로브의 Tm 해석

변이의 검출 대상 시료로서 인간 게놈(Roche사제)을 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다. 또, 당해 인간 게놈은, 전혈로부터 통상의 방법에 의해 정제하고, 1㎕(100cp/㎕)의 양으로 사용했다.

전자동 SNPs 검사 장치 IS-5310(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)과 하기 표 12에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, PCR 및 Tm 해석을 행했다.

PCR은, 95℃에서 60초 처리한 후, 95℃에서 1초 및 60℃에서 30초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다.

또한 Tm 해석은, PCR 후, 95℃에서 1분, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 75℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 또, 여기 파장을 365㎚∼415㎚로 하고, 측정 파장을 445㎚∼480㎚로 하여, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

[표 12]

그 결과, 검출 대상 시료로서 전혈로부터 정제한 인간 게놈을 사용했을 경우에도, 야생형(서열 번호1의 301번째의 염기가 G)과, 변이형(V12M, 서열 번호1의 301번째의 염기가 A)의 양쪽의 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. Tm값은 47℃ 및 52℃이었다. Tm 해석에 의해 얻어진 그래프를 도 3에 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

또한 상기 기재의 프로브, 프라이머 및 1본쇄 핵산의 상세를 이하에 나타냈다. 또, 프로브에 있어서의 P는 3' 말단이 인산화되어 있는 것을 나타낸다.

[표 13]

<실시예2>

실시예1-1에 있어서, 1본쇄 핵산과 프로브를 하기 표 14에 기재된 것으로 변경한 것 및, Tm 해석에 있어서의 여기 파장을 420㎚∼485㎚로 하고, 측정 파장을 520㎚∼555㎚로 한 것 이외는, 실시예1-1과 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

[표 14]

상기 기재의 프로브 및 1본쇄 핵산의 상세를 이하에 나타냈다.

[표 15]

그 결과, 야생형(서열 번호2의 234번째의 염기가 G)1 및 2와, 변이형(Q126X, 서열 번호2의 234번째의 염기가 C)1 및 2의 양쪽의 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 인간 게놈 타입의 야생형의 1본쇄 핵산과 변이형의 1본쇄 핵산을 1:1로 혼합한 혼합형1∼4를 사용했을 경우에도, 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

야생형1 및 야생형2의 Tm값은 어느 것이나 50℃이며, 변이형1 및 변이형2의 Tm값은 어느 것이나 57℃이었다.

또한, 혼합형1의 Tm값은 50℃와 56℃이며, 혼합형2의 Tm값은 50℃와 56℃이며, 혼합형3의 Tm값은 48℃와 56℃이며, 혼합형4의 Tm값은 49℃와 57℃이었다.

도 4에 Tm 해석에 의해 얻어진 야생형1(A), 야생형2(C), 변이형1(B), 변이형2(D), 혼합형1(E), 혼합형2(F), 혼합형3(G) 및 혼합형4(H)의 그래프를 각각 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

<실시예3>

실시예1-1에 있어서, 1본쇄 핵산과 프로브를 하기 표 16에 기재된 것으로 변경한 것 및, Tm 해석에 있어서의 여기 파장을 520㎚∼555㎚로 하고 측정 파장을 585㎚∼700㎚로 한 것 이외는, 실시예1-1과 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

[표 16]

[표 17]

그 결과, 야생형(서열 번호3의 161번째의 염기가 C)과, 변이형(Q141K, 서열 번호2의 161번째의 염기가 A)의 양쪽의 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 인간 게놈 타입의 야생형의 1본쇄 핵산과 변이형의 1본쇄 핵산을 1:1로 혼합한 혼합형을 사용했을 경우에도, 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

야생형의 Tm값은 56℃이며, 변이형의 Tm값은 64℃이며, 혼합형의 Tm값은 55℃와 63℃이었다.

도 5에 Tm 해석에 의해 얻어진 야생형(A), 변이형(B) 및 혼합형(C)의 그래프를 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

<실시예4>

전자동 SNPs 검사 장치 IS-5310(상품명 i-densy(상표), 아크레이사제)과 하기 표 18에 기재한 처방의 검사용 시약을 사용하여, Tm 해석을 행했다.

[표 18]

상기 기재의 프라이머 및 프로브의 상세를 이하에 나타냈다.

[표 19]

Tm 해석 조건은, 95℃에서 1분 처리한 후, 95℃에서 1초 및 60℃에서 30초를 1사이클로 하여, 50사이클 반복했다. 그 후, 95℃에서 1초, 40℃에서 60초 처리하고, 이어서 온도의 상승 속도 1℃/3초로, 40℃부터 60℃까지 온도를 상승시키고, 그 사이의 경시적인 형광 강도의 변화를 측정했다. 또, 여기 파장 및 측정 파장은 각각 365㎚∼415㎚ 및 445㎚∼480㎚(Pacific Blue), 420㎚∼485㎚ 및 520㎚∼555㎚(BODIPY FL), 520㎚∼555㎚ 및 585㎚∼700㎚(TAMRA)로, 형광 표지 프로브에 유래하는 형광 강도의 변화를 각각 측정했다.

주형으로서는, 전혈과 정제 게놈(2000카피/test)을, 각각 사용했다. 또, 전혈의 조정 방법은, 이하와 같다.

전혈 10㎕를 70㎕의 희석액1에 가해, 잘 혼합한 후, 이 혼합액 10㎕를 70㎕의 희석액2에 가한다. 이 혼합액 17㎕를 95℃ 10분으로 가열하면 4㎕의 전처리된 전혈을 얻을 수 있다. 이를 1test당의 주형으로서 사용했다.

[표 20]

[표 21]

그 결과, 주형으로서 전혈을 사용했을 경우 및 정제 인간 게놈을 사용했을 경우의 어느 것이나, V12M 변이, Q126X 변이 및 Q141K 변이의 모든 피크를 확인할 수 있었다.

전혈의 경우도, 정제 인간 게놈의 경우도, V12M 변이는 Tm값이 47℃와 52℃이며, Q126X 변이는 Tm값이 45℃이며, Q141K 변이는 Tm값이 50℃이었다.

도 6에 Tm 해석에 의해 얻어진 전혈(V12M 변이)(A), 전혈(Q126X 변이)(B) 및 전혈(Q141K 변이)(C)의 그래프를 나타내고, 도 7에 정제 인간 게놈(V12M 변이)(A), 정제 인간 게놈(Q126X 변이)(B) 및 정제 인간 게놈(Q141K 변이)(C)의 그래프를 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

<비교예1>

프로브와 1본쇄 핵산을 이하의 것으로 변경한 이외는, 실시예1-1과 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

[표 22]

상기 기재의 프로브 및 1본쇄 핵산의 상세한 것은, 하기 표 23에 기재한 대로이다.

[표 23]

그 결과, 야생형(서열 번호1의 301번째의 염기가 G)과, 변이형(V12M, 서열 번호1의 301번째의 염기가 A)의 양쪽의 피크를 검출할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. 야생형의 Tm값은 49℃이며, 변이형의 Tm값은 57℃이었다.

도 8에 Tm 해석에 의해 얻어진 야생형(A) 및 변이형(B)의 그래프를 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

또한, 프로브를, 5PB-ABCG2V 12M-A-R1로부터, 5PB-ABCG2V 12M-A-FI로 변경한 이외는, 실시예1-2와 같은 방법에 의해, 인간 게놈과 프로브의 Tm 해석을 행했다.

그 결과, 검출 대상 시료로서 전혈로부터 정제한 인간 게놈을 사용했을 경우에는, 변이형의 Tm값은 55℃로 검출할 수 있었지만, 야생형의 Tm값을 검출할 수 없었다.

Tm 해석에 의해 얻어진 그래프를 도 9에 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

<비교예2>

실시예2에 있어서, 프로브를, 5FL-ABCG2 Q126X-T-RI로부터, 3FL-ABCG2 Q126X-T-R2로 변경한 이외는, 실시예2와 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

상기 기재의 프로브의 상세를 이하에 나타냈다.

[표 24]

그 결과, 야생형1 및 2와, 변이형2, 혼합형1∼4에서는, 피크를 검출하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 변이형1에서는 야생형의 Tm값 주변에 유사 피크가 확인되어, 혼합형으로 오인해 버릴 가능성이 시사되었다.

야생형1의 Tm값은 52℃, 야생형2의 Tm값은 49℃, 변이형1의 Tm값은 57℃, 변이형2의 Tm값은 어느 것이나 56℃, 혼합형1의 Tm값은 51℃와 57℃, 혼합형2의 Tm값은 49℃와 56℃, 혼합형3의 Tm값은 51℃와 56℃, 혼합형4의 Tm값은 50℃와 57℃이었다.

도 10에 Tm 해석에 의해 얻어진 야생형1(A), 야생형2(C), 변이형1(B), 변이형2(D), 혼합형1(E), 혼합형2(F), 혼합형3(G) 및 혼합형4(H)의 그래프를 각각 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

<비교예3>

실시예3에 있어서, 프로브를, 3T-ABCG2-mt-R1로부터, 5T-ABCG2-mt-R2로 변경한 이외는, 실시예3과 같이 하여, Tm 해석을 행했다.

상기 기재의 프로브의 상세를 이하에 나타냈다.

[표 25]

그 결과, 야생형(서열 번호3의 161번째의 염기가 C), 변이형(Q141K, 서열 번호2의 161번째의 염기가 A), 혼합형의 어디에 있어서도 피크를 확인할 수 없었다.

도 11에 Tm 해석에 의해 얻어진 야생형(A), 변이형(B) 및 혼합형(C)의 그래프를 나타낸다. 또, 세로축은 형광 강도의 온도 미분값을 나타내고, 가로축은 온도를 각각 나타낸다.

이상으로부터, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용함으로써, ABCG2 유전자의 다형 중, V12M 변이, Q126X 변이 및 Q141K 변이를 높은 빈도로 검출할 수 있고, 1시약을 사용하여 동시에 복수의 다형을 간편하게 검출할 수 있고, 또한, ABCG2 유전자의 다형을, 전혈을 정제하지 않고, 직접 간편하게 검출할 수 있는 것이 명확하게 되었다.

일본 출원 특원2011 -102987(출원일 2011년 5월 2일)의 개시는, 그 전체가 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원 및 기술 규격이 참조에 의해 편입되는 구체적 또한 개개에 기재된 경우와 동(同)정도로, 본 명세서 중에 참조에 의해 편입된다.

SEQUENCE LISTING <110> ARKRAY, INC. <120> PROBE FOR DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF DETECTING POLYMORPHISM, METHOD OF EVALUATING DRUG EFFICACY, DISEASE PREDICTION METHOD AND REAGNET KIT FOR DETECTING POLYMORPHISM <130> P1393A <150> JP 2011-102987 <151> 2011-05-02 <150> JP 2012-082390 <151> 2012-03-30 <160> 42 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 601 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (301)..(301) <223> h is a, c or t. <400> 1 attaggaccc atttacttat tagggatgta tttgacatct aattggagtt tatgcattcc 60 aagttgtgcc tgtcttccca tttaggtttt taggatgttc ttatcacaat ggtatgggcc 120 attcattgga aatgaagctg ctcattgcca cacatttaaa aatggacttg ttttaaatgt 180 attgtcacct agtgtttgca atctcattta tctggactat caacttacta ttgcttttct 240 gtctgcagaa agataaaaac tctccagatg tcttccagta atgtcgaagt ttttatccca 300 htgtcacaag gaaacaccaa tggcttcccc gcgacagctt ccaatgacct gaaggcattt 360 actgaaggag ctgtgttaag ttttcataac atctgctatc gagtaaaact gaagagtggc 420 tttctacctt gtcgaaaacc agttgagaaa gaaatattat cgaatatcaa gtatgtacat 480 gaacttgtaa aaagacagct ttttaattta cctacagtga acctcacagg ttttggctat 540 ttccaagaaa ctggctatga acatttttgt acaagtcttt gcacagatat acagacacat 600 g 601 <210> 2 <211> 480 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (234)..(234) <223> n is a, g, c or t. <220> <221> variation <222> (245)..(245) <223> w is a or t. <400> 2 agtagaattt ggattcaaag tagccatgag atatatagca tgtgttggag ggaaaaaaac 60 cccacaacat atatattctc ttataggtta ttagacccac aacatatatg tcctcttata 120 ggttattaga tgtcttagct gcaaggaaag atccaagtgg attatctgga gatgttctga 180 taaatggagc accgcgacct gccaatttca aatgtaattc aggttaygtg gtanaagtaa 240 gtatwagtgg gtttgcattt tctgtttcct ctgtttctat atgggtaagt gctttsgctg 300 atagttcaat gtgcttccag ttgattatgt gacatggtcc tagaactgac gttctttaca 360 gcagcttttc ttaatttctc atagacactt atgtgaaaag gcagggagaa tctggaatat 420 ggcccttgta aggacagtga taccaattct agtttttgta tcatttctaa aatgatacat 480 <210> 3 <211> 341 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (161)..(161) <223> n is a, g c or t. <400> 3 gctagaactt taccttagtt atgttatctt tgtggattat gttatgtata ctaaacagtc 60 atggtcttag aaaagactca ttatcattat gtctcattaa aatgctrttt gccttaagga 120 tgatgttgtg atgggcactc tgacggtgag agaaaactta nagttctcag cagctcttcg 180 gcttgcaaca actatgacga atcatgaaaa aaacgaacgg attaacaggg tcattsaaga 240 gttaggtctg gataaagtgg cagactccaa ggtaatgtgg aaaaactgaa agcatcatga 300 tcagcataag taggactttc cctgtgtgga taaaatgact c 341 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> proble 1-1 <400> 4 agccattggt gtttccttgt gacactggga taaaaacttc gacattactg 50 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 1-2 <400> 5 cattggtgtt tccttgtgac actgggataa aaacttcgac 40 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 1-3 <400> 6 ggtgtttcct tgtgacactg ggataaaaac tt 32 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 1-4 <400> 7 ccttgtgaca ttggga 16 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 1-5 <400> 8 ccttgtgaca atggga 16 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 1-6 <400> 9 cttgtgacag tggg 14 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-1 <400> 10 gaaacagagg aaacagaaaa tgcaaaccca ctaatactta cttataccac 50 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-2 <400> 11 aacccactaa tacttactta taccacgtaa cctgaattac 40 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-3 <400> 12 cccactaata cttacttata ccacgtaacc tgaattac 38 <210> 13 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-4 <400> 13 aacccactaa tacttactta taccacgtaa cctg 34 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-5 <400> 14 cccacttata cttacttata ccac 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-6 <400> 15 cccacttata cttacttgta ccac 24 <210> 16 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-7 <400> 16 tacttttacc ac 12 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 2-8 <400> 17 tatacttact tctaccac 18 <210> 18 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-1 <400> 18 ttgcaagccg aagagctgct gagaactgta agttttctct caccgtcaga g 51 <210> 19 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-2 <400> 19 gccgaagagc tgctgagaac tgtaagtttt ctctcaccgt 40 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-3 <400> 20 gagctgctga gaactgtaag ttttctctca 30 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-4 <400> 21 gctgagaact ttaagttttc 20 <210> 22 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-5 <400> 22 ctataagttt tc 12 <210> 23 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe 3-6 <400> 23 ctctaagttt tc 12 <210> 24 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 1-1 <400> 24 cagtaatgtc gaagttttta tcccagtgtc acaaggaaac accaatggct 50 <210> 25 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 1-2 <400> 25 cagtaatgtc gaagttttta tcccaatgtc acaaggaaac accaatggct 50 <210> 26 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 1-3 <400> 26 agccattggt gtttccttgt gacactggga taaaaacttc gacattactg 50 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 1-4 <400> 27 agccattggt gtttccttgt gacattggga taaaaacttc gacattactg 50 <210> 28 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 2-1 <400> 28 caaatgtaat tcaggttacg tggtacaagt aagtattagt gggtttgcat 50 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 2-2 <400> 29 caaatgtaat tcaggttacg tggtataagt aagtattagt gggtttgcat 50 <210> 30 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 2-3 <400> 30 ggttacgtgg tacaagtaag tatcagtggg tttgcatttt 40 <210> 31 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 2-4 <400> 31 ggttacgtgg tataagtaag tatcagtggg tttgcatttt 40 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 3-1 <400> 32 acggtgagag aaaacttaaa gttctcagca gctcttcggc 40 <210> 33 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template 3-2 <400> 33 acggtgagag aaaacttaca gttctcagca gctcttcggc 40 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 1-1-F <400> 34 gcaatctcat ttatctggac tatcaactta cta 33 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 1-1-R <400> 35 ttcaggtcat tggaagctgt cg 22 <210> 36 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 2-1-F <400> 36 gtcttagctg caaggaaaga tccaag 26 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 2-1-R <400> 37 aaagcactta cccatataga aacagagg 28 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 3-1-F <400> 38 tgatgttgtg atgggcactc tgacg 25 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer 3-2-R <400> 39 aatgaccctg ttaatccgtt cg 22 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe X-1 <400> 40 cccaatgtca caaggaaa 18 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe X-2 <400> 41 aaacccactc atacttactt atacc 25 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> probe X-3 <400> 42 ctgagaactt taagttttct 20

Claims

하기 P1, P2 및 P3로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 형광 표지 올리고뉴클레오티드인 ABCG2 유전자의 다형 검출용 프로브.
(P1) 서열 번호7에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 5'말단의 시토신 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드,
(P2) 서열 번호14에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 5'말단의 시토신 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드, 및
(P3) 서열 번호21에 나타내는 염기서열로 이루어지고, 3'말단의 시토신 염기가 형광 색소로 표지되어 있는 올리고뉴클레오티드.
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제1항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소 또는 증가하는, 다형 검출용 프로브.
제4항에 있어서,
상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드는, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있지 않을 때의 형광 강도에 비하여, 표적 서열에 하이브리다이즈하고 있을 때의 형광 강도가 감소하는, 다형 검출용 프로브.
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제1항 또는 제4항에 있어서,
융해 곡선 분석용의 프로브인, 다형 검출용 프로브.
제1항 또는 제4항에 기재된 다형 검출용 프로브를 사용하는 ABCG2 유전자의 다형 검출 방법.
제1항 또는 제4항에 기재된 상기 P1, P2 및 P3로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 2종의 다형 검출용 프로브를 사용하는 ABCG2 유전자의 다형 검출 방법.
(Ⅰ) 제1항 또는 제4항에 기재된 다형 검출용 프로브 및 시료 중의 1본쇄 핵산을 접촉시켜서, 상기 형광 표지 올리고뉴클레오티드 및 상기 1본쇄 핵산을 하이브리다이즈시켜서 하이브리드를 얻는 것과,
(Ⅱ) 상기 하이브리드를 포함하는 시료의 온도를 변화시킴으로써, 상기 하이브리드를 해리시켜, 상기 하이브리드의 해리에 의거하는 형광 시그널의 변동을 측정하는 것과,
(Ⅲ) 상기 형광 시그널의 변동에 의거하여 하이브리드의 해리 온도인 Tm값을 측정하는 것과,
(Ⅳ) 상기 Tm값에 의거하여 상기 시료 중의 1본쇄 핵산에 있어서의, ABCG2 유전자에 있어서의 다형의 존재를 검출하는 것
을 포함하는, ABCG2 유전자의 다형 검출 방법.
제12항에 있어서,
상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻기 전 또는 상기 (Ⅰ)의 하이브리드를 얻는 것과 동시에 핵산을 증폭하는 것을 더 포함하는, ABCG2 유전자의 다형 검출 방법.
제10항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCG2 유전자에 있어서의 다형의 유무 또는 변이 서열과 정상 서열의 존재비를 검출하는 것과,
검출 결과에 의거하여, 통풍 치료약 및 고요산 혈증 치료약으로 이루어지는 군에서 선택되는 약제에 대한 내성 또는 상기 약제의 약효를 판정하는 것
을 포함하는, 상기 약제의 약효 판정 방법.
제10항에 기재된 다형 검출 방법에 의해, ABCG2 유전자의 다형의 변이의 유무 또는 종류를 검출하는 것과,
검출 결과에 의거하여, 통풍, 고요산 혈증, 및 포르피린증으로 이루어지는 군에서 선택되는 질환의 이환(罹患) 리스크를 예측하는 것
을 포함하는, 상기 질환의 예측 방법.
제1항 또는 제4항에 기재된 다형 검출용 프로브를 포함하는, 다형 검출용 시약 키트.
제16항에 있어서,
서열 번호1에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P1의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트,
서열 번호2에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P2의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트, 또는
서열 번호3에 나타내는 염기 서열에 있어서, 상기 P3의 형광 표지 올리고뉴클레오티드가 하이브리다이즈하는 서열을 포함하는 영역을 증폭 가능한 프라이머 세트
의 어느 프라이머 세트의 적어도 하나를 더 포함하는, 다형 검출용 시약 키트.