KR20220085748A - 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 - Google Patents

유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명에 따른 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 한 번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 변이 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시켜 극도로 낮은 농도로 존재하는 유방암 관련 유전자 또는 단일염기다형성을 증폭시킬 수 있으므로, 유방암 진단, 유방암 치료를 위한 약물 평가에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물{BREAST CANCER GENE MUTATION-SELECTIVE AMPLIFICATION METHOD WITH ULTRA-HIGH SENSITIVITY AND COMPOSITION THEREFOR}
본 발명은 유방암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
변이 유전자란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 변이 유전자는 여러 질병과 관련이 깊다. 예를 들어, 종양의 경우, TP53 변이 유전자 또는 KRAS 변이 유전자는 여러 고형 종양에 관찰되며, BRAF 변이 유전자는 갑상선암 및 대장암 등에서 관찰된다. EGFR 변이 유전자는 폐암 및 대장암 등에서 관찰된다. 이러한 변이 유전자의 상당수는 유전자 내 특정 위치에 발생한다. 구체적으로, TP53 변이 유전자로는 Arg175His, Arg248Gln, Arg273His가 있으며, KRAS 변이 유전자에는 코돈 12 및 13 변이가 있다. 또한, BRAF 변이 유전자로는 Val600Glu이 있으며, EGFR 변이 유전자에는 Leu858Arg 및 Thr790Met가 있다.
이러한 질병 특이적 변이 유전자를 검출하는 것은 질병의 진단과 치료 방법 결정 및 치료 후 질병의 예후 판단에 아주 유용하다. 이에 따라 질병 특이적인 변이 유전자를 검출하는 방법들이 개발되고 있으며, 대표적인 방법으로 직접염기서열분석법(direct sequencing), 대립유전자특이증폭법(allele-specific PCR), 제한효소절편길이다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), Taqman 소식자(probe)법, ARMS(amplification refractory mutation system)-PCR, 변성(denaturing) HPLC(dHPLC), real-time PCR fall short, Mass-array 등이 있다.
질병 특이적인 변이 유전자 검출에서 중요하게 요구되는 사항으로는 (1) 정상 DNA 속에서 낮은 비율로 존재하는 변이 DNA를 검출할 수 있는 민감도 (sensitivity)와 (2) 정상 DNA를 변이 DNA로 잘못 판정하는 위양성(false positive) 비율을 최대한 낮출 수 있는 특이도(specificity)를 갖추는 것이다. 그러나, 기존에 사용되었던 방법들은 민감도와 특이도에 있어서 만족할 만한 결과를 보여주지 못하였다. 직접염기서열분석법은 가장 특이도가 높으나 위양성의 비율이 낮은 반면, 20% 내지 30% 이상의 변이 DNA가 존재할 경우에만 검출이 가능한 단점이 있다. 반면, 대립유전자특이증폭법이나 제한효소절편길이다형성, Taqman 소식자법 등은 민감도는 높으나, 특이도가 낮아 위양성의 문제점을 항상 가지고 있다.
한편, 유방암은 전 세계적으로 여성에서 가장 흔히 진단되는 종양성 질환이며 서양 국가에서 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. 유방암 환자들은 외과적 수술, 수술 후 표준 치료와 함께, 다양한 작용 기전을 통해 종양의 성장을 멈추거나 지연시키는 내분비계 요법이 처치되는데, 내분비계 요법에 대한 불량한 반응 또는 장기 치료 중 후발적으로 얻어지는 체세포 변이(예컨대, HER2, NF1, FGFR, ESR1, PIK3CA 유전자 변이)로 인해 유발되는 약물 저항성 및/또는 암 전이를 확인하여 환자에 적합한 치료를 수행하기 위해서는 그러한 변이의 존재 여부를 빠르고 손쉽게 확인하는 것이 무엇보다 중요하다.
종양환자 치료 반응을 제때 정확하게 확인하기 위해서는, 치료 과정 여러 시점에서 자유롭게 검체를 확보하는 것이 필수적이다. 그러나, 기존의 조직 생검의 경우, 환자에게 주는 고통과 비용, 또는 감염위험성 등으로 인해 많은 제약이 따르고 있다. 반면, 혈중 순환 종양 DNA(ctDNA) 검체는, 간단한 혈액 채취만으로, 환자의 종양 유래 DNA를 확보할 수 있다는 점에서, 현재 임상활용에 적극적으로 활용되고 있다. 하지만, 환자의 혈액에 존재하는 대부분의 혈중 순환 DNA는 주변 조직의 괴사에 의해 생성된 정상 세포 유래 DNA이며, 종양 유래 DNA(ctDNA)는 그 비율이 극히 낮아, 일반적인 방법으로는 ctDNA의 돌연변이 검출이 어렵다.
따라서, 생체 시료 내 적은 양으로 존재하는 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 높은 민감도 및 특이도로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법에 대해 연구개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 우수한 민감도 및 특이도로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 간편하고 효율적인 방법으로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 유방암 관련 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 유방암 관련 변이 유전자를 검출하여 암의 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 유방암 관련 변이 유전자를 포함하는 염기서열을 주형으로 하되 일부 염기에 대해 불일치된 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP) 및 상기 유방암 관련 변이 유전자를 증폭하기 위한 정방향 및/또는 역방향 프라이머를 특정 농도비로 포함하는 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 상기 정방향 및 역방향 프라이머만을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우보다 변이 유전자가 더 많이 증폭되어 매우 높은 민감도와 특이도로 유방암 관련 변이 유전자를 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 1) 유방암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP); 및 2) 상기 변이 유전자를 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 1) 유방암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP); 및 2) 상기 변이 유전자를 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하되, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 특정 비율 범위로 한정된 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체로부터 수득한 DNA 시료와 상기 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 유방암 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 한 번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 변이 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시켜 극도로 낮은 농도로 존재하는 유방암 관련 유전자 또는 단일염기다형성을 증폭시킬 수 있으므로, 유방암 진단, 유방암 치료를 위한 약물 평가에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 변이 유전자 증폭 방법을 도식화한 도면이다.
도 2는 일반적인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 조성물 또는 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 돌연변이 유전자의 증폭과정을 도식화한 도면이다.
도 3a 내지 도 3f는 역방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 3g는 특정 농도비를 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 도 4f는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_E542K 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 4g는 특정 농도비를 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 도 5g는 역방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_E545K 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 5h는 특정 농도비를 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a 내지 도 6c는 역방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 ESR1_L536R 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 6d는 도 6a 내지 도 6c에서 돌연변이(MT) 피크가 야생형(WT) 피크를 역전하는 농도비 범위를 채택하여 WT와 함께 반복 확인을 진행한 도면이고; 도 6e 내지 도 6g는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 도 7c는 역방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 ESR1_Y537N 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 7d 및 도 7e는 도 7a 내지 도 7c에서 돌연변이(MT) 피크가 야생형(WT) 피크를 역전하는 농도비 범위를 채택하여 WT와 함께 반복 확인을 진행한 도면이고; 도 7f 내지 도 7h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도 8c는 역방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 ESR1_Y537C 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 8d 및 도 8e는 도 8a 내지 도 8c에서 돌연변이(MT) 피크가 야생형(WT) 피크를 역전하는 농도비 범위를 채택하여 WT와 함께 반복 확인을 진행한 도면이고; 도 8f 내지 도 8h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9은 역방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별, 그리고 PCR 온도 조건별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 10은 역방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 1:2 농도비, 그리고 PCR 온도 조건(60℃)에서의 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 11은 역방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 1:3 농도비, 그리고 PCR 온도 조건(64℃)에서의 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 12는 역방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 1:3 농도비, 그리고 PCR 온도 조건(60℃)에서의 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 13은 역방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별, 그리고 MgCl2 농도별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047L 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 14는 정방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별, 그리고 MgCl2 농도별 변이 유전자 증폭용 조성물의 PIK3CA_H1047R 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 15는 환자의 cfDNA로부터 약물에 내성과 관련된 돌연변이 유전자인 ESR1_Y537N 변이 유전자를 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 검출 및 확인한 도면이다.
도 16은 환자의 cfDNA로부터 유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_E542K 변이 유전자를 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 검출 및 확인한 도면이다(Wild_reference material: Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT, Wild_임상검체: 정상인 cfDNA, Mutant_임상검체: 환자의 cfDNA).
도 17은 환자의 cfDNA로부터 유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_E545K 변이 유전자를 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 검출 및 확인한 도면이다.
도 18은 환자의 cfDNA로부터 유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_H1047L 변이 유전자를 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 검출 및 확인한 도면이다.
도 19는 환자의 cfDNA로부터 유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_H1047R 변이 유전자를 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 검출 및 확인한 도면이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 1) 유방암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP) 및 2) 상기 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는, 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 "변이 유전자"는 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화가 유발된 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 변이는 바람직하게는 유전자 단위의 변이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된 점 돌연변이(point mutation) 또는 다중 돌연변이(multiple mutation)일 수 있다. 또한 상기 변이는 침묵 돌연변이, 중성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 변이는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)일 수 있다. 단일염기다형성이란 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, 개체, 질병군, 또는 지역군 등에서 단일 위치에 여러가지 DNA 염기들이 다양하게 나타날 수 있으며, 본 발명의 조성물은 이러한 단일염기다형성의 증폭 역시 가능하다.
상기 "주형 염기서열"은 상기 변이 유전자 내 돌연변이가 일어난 염기서열 또는 단일염기다형성으로부터 5'-말단 또는 3'-말단 방향으로 1 bp 내지 30 bp 연속적인 염기서열의 상보적인 염기서열인 것일 수 있다.
상기 주형 염기서열은 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 또는 단일염기다형성이 존재하는 표적 유전자(전장 유전자), 또는 상기 표적 유전자 내의 유전자 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 일부분을 포함하는 것으로, 상기 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 일부분은 약 5 bp 내지 1,000,000 bp, 바람직하게는 약 5 bp 내지 100,000 bp, 더욱 바람직하게는 약 50 bp 내지 500 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 "프라이머 세트"는 순방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성될 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 유전자 변이 또는 SNP를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 프라이머 쌍을 의미한다. 이러한 프라이머 세트는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출하고자 하는 유전자 변이 또는 SNP, 및 상기 변이를 포함하는 유전자에 따라서 용이하게 결정 및 제작할 수 있다. 상기 순방향 프라이머 또는 역방향 프라이머의 길이는 연속하는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp 길이로 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 “변이 유전자 특이적 프라이머(mutation specific primer, MSP)”는 짧은 자유 3'-말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(예컨대, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 5 bp 내지 50 bp, 구체적으로 5 bp 내지 30 bp의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
상기 "염기쌍오류"는 주형 염기서열과 미스매치된 염기쌍을 의미한다. 상기 변이 유전자 특이적 프라이머에서, 염기쌍오류인 염기는 유전자 변이 위치로부터 1 bp 내지 10 bp 거리에 위치할 수 있다.
상기 프라이머는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로, 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태일 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1 핫스팟(hotspot) 또는 PIK3CA 핫스팟의 변이 유전자일 수 있다.
구체적으로, 상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_D538G, ESR1_L536R, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047L, ESR1_S463P, ESR1_Y537C, ESR1_Y537S, PIK3CA_E545K, PIK3CA_H1047R, ESR1_Y537N 또는 ESR1_E380Q일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_D538G, ESR1_L536R, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047L, ESR1_S463P, ESR1_Y537C, ESR1_Y537S, PIK3CA_E545K, PIK3CA_H1047R, ESR1_Y537N 및 ESR1_E380로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이 유전자이거나 이를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K, PIK3CA_E545K, ESR1_L536R, ESR1_Y537N 또는 ESR1_Y537C를 포함할 수 있다. 또한 상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K, PIK3CA_E545K, ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물 내 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비는 1:0.1 내지 1:20일 수 있다. 구체적으로 상기 조성물 내 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1 내지 1:20, 1:2.7 내지 1:20, 1:9.3 내지 1:20, 1:2.7 내지 1:4.3, 1:2.7 내지 1:3.3, 1:1 내지 1:10, 7:10 내지 1:10, 7:10 내지 6:10, 4:10 내지 1:10, 7:10 내지 5:10일 수 있다. 예를 들어, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 PIK3CA 상의 유전자 변이인 경우에, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비는 1:2.7 내지 1:20일 수 있다. 또한, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 ESR1 상의 유전자 변이인 경우에, 상기 하나의 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비는 7:10 내지 1:10일 수 있다.
상기 하나의 프라이머(outer primer)는 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 방향(5'→ 3'또는 3'→ 5')에 따라 순방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 예를 들어, 변이 유전자 특이적인 프라이머가 순방향으로 제작되는 경우에, 상기 농도비가 결정되는 프라이머 세트 중 하나의 프라이머는 순방향 프라이머이다.
일 실시예에 따르면, 상기 조성물 내 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비를 특정 비율 또는 특정 범위의 비율로 제어하는 경우에, 변이 유전자를 매우 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 PIK3CA_H1047L 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:9.3 내지 1:20이다. 또한 상기 농도비는 1:9.3, 1:11, 1:13, 1:14.7, 1:16.3, 1:18 또는 1:20일 수 있다. 상기 농도비는 바람직하게는 1:13일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 PIK3CA 유전자에 대한 프라이머와 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:9.3, 1:11, 1:13, 1:14.7, 1:16.3, 1:18 또는 1:20의 농도비로 각각 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 PIK3CA_E542K 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:2.7 내지 1:4.3이다. 또한 상기 농도비는 1:2.7 또는 1:4.3일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 PIK3CA 유전자에 대한 프라이머와 PIK3CA_E542K 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:2.7 또는 1:4.3의 농도비로 각각 혼합한 PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 PIK3CA_E545K 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:2.7 내지 1:3.3이다. 또한 상기 농도비는 1:2.7 또는 1:3.3일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 PIK3CA 유전자에 대한 프라이머와 PIK3CA_E545K 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:2.7 또는 1:3.3의 농도비로 각각 혼합한 PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 ESR1_L536R 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 7:10 내지 6:10이다. 또한 상기 농도비는 7:10 또는 6:10일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 ESR1 유전자에 대한 프라이머와 ESR1_L536R 변이 유전자 특이적인 프라이머를 7:10 또는 6:10의 농도비로 각각 혼합한 ESR1_L536R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 ESR1_Y537N 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 4:10 내지 1:10이다. 또한 상기 농도비는 4:10, 3:10, 2:10 또는 1:10일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 ESR1 유전자에 대한 프라이머와 ESR1_Y537N 변이 유전자 특이적인 프라이머를 4:10, 3:10, 2:10 또는 1:10의 농도비로 각각 혼합한 ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 유방암 관련 변이 유전자가 ESR1_Y537C 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 7:10 내지 5:10이다. 또한 상기 농도비는 7:10, 6:10 또는 5:10일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 ESR1 유전자에 대한 프라이머와 ESR1_Y537C 변이 유전자 특이적인 프라이머를 7:10, 6:10 또는 5:10의 농도비로 각각 혼합한 ESR1_Y537C 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도 및 낮은 위양성으로 해당 돌연변이를 확인하였다.
다른 구현예에서, 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 서열번호 3, 7, 11, 15, 17, 19, 21, 25, 27 또는 29로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 하나의 프라이머(outer primer)는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1, 5, 9, 13 또는 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2, 6, 10, 14, 24 또는 28로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 유방암 관련 변이 유전자별 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머는 표 1에 예시되어 있다. 표 1에는 확인하고자 하는 변이 염기서열 직전까지 상보 결합하는 올리고뉴클레오타이드(Unextended primer, UEP 프라이머)에 대한 정보도 함께 제시된다.
변이 유전자 프라이머 서열정보 서열번호
ESR1_Y537N Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
Reverse ACGTTGGATGACGGCTAGTGGGCGCATGTA 2
MSP ATCTCCAGCAGCAGGTCTTT 3
UEP AGAACGTGGTGCCCCTC 4
ESR1_E380Q Forward ACGTTGGATGGCTTTGTGGATTTGACCCTC 5
Reverse ACGTTGGATGAGACGAGACCAATCATCAGG 6
MSP TCTAGCCAGGCACAGTG 7
UEP ATCAGGTCCACCTTCTA 8
PIK3CA_E542K Forward ACGTTGGATGGGGAAAATGACAAAGAACAGC 9
Reverse ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC 10
MSP TACACGAGATCCTCTCTATA 11
UEP TTCTCCTGCTCAGTGATTT 12
PIK3CA_H1047L Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
MSP TTGTTGTCCAGCCACCATTAA 15
UEP GAAACAAATGAATGATGCAC 16
ESR1_Y537C Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
Reverse ACGTTGGATGACGGCTAGTGGGCGCATGTA 2
MSP ATCTCCAGCAGCAGGTAAG 17
UEP GAACGTGGTGCCCCTCT 18
PIK3CA_E545K Forward ACGTTGGATGGGGAAAATGACAAAGAACAGC 9
Reverse ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC 10
MSP ACGTTGGATGAGAAAATCTTTCTCCTGGTT 19
UEP TCCTCTCTCTGAAATCACT 20
PIK3CA_H1047R Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
MSP GAAACAAATGAATGATGCCCG 21
UEP TTGTTGTCCAGCCACCATGA 22
ESR1_S463P Forward ACGTTGGATGAGCTTCTCTCTCTCACTCTC 23
Reverse ACGTTGGATGCAGGACTCGGTGGATATGGT 24
MSP AGACTTCAGGGTGCTTGG 25
UEP GGAGTGTACACATTTCTG 26
ESR1_Y537S Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
Reverse ACGTTGGATGACGGCTAGTGGGCGCATGTA 2
MSP ATCTCCAGCAGCAGGTAAC 27
UEP GAACGTGGTGCCCCTCT 18
ESR1_L536R Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
Reverse ACGTTGGATGCTAGTGGGCGCATGTAGGC 28
MSP CCAGCAGCAGGTCATTGC 29
UEP CAAGAACGTGGTGCCCC 30
다른 구현예서, 상기 조성물은 MgCl2를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 추가로 포함되지 않더라도, 핵산 증폭 수행시 상기 조성물과 시료, 기타 핵산 증폭을 위한 용액들과 혼합하는 단계에서 MgCl2를 추가할 수 있다. 이때, 상기 MgCl2는 1 mM 내지 5 mM 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로, MgCl2는 1 mM 내지 5 mM, 1.2 mM 내지 3.5 mM 또는 1.9 mM 내지 2.7 mM 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 MgCl2를 1.9 mM, 2.7 mM 및 3.1 mM 농도로 포함되도록 하였으며, 이를 이용하여 합성한 핵산 증폭 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.그 밖에, 본 발명의 조성물은 상술한 핵산을 증폭 또는 검출하는데 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, PCT 반응에 요구되는 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase) 등을 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 증폭용 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
상기 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플, 플레이트 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 ESR1_D538G, ESR1_L536R, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047L, ESR1_S463P, ESR1_Y537C, ESR1_Y537S, PIK3CA_E545K, PIK3CA_H1047R, ESR1_Y537N 및 ESR1_E380Q로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K, PIK3CA_E545K, ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다.
상기 키트는 유방암 관련 변이 유전자의 증폭을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 유방암 진단 또는 치료를 위한 정보를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체로부터 수득한 DNA 시료와 상기 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 유방암 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 핵산 증폭 산물에 단일 염기 확장(SBE, single base extension)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 단일 염기 확장을 수행하는 단계 전에, 상기 핵산 증폭의 산물 내 잔존하는 dNTP를 제거하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 핵산 증폭을 위해 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법은 PCR로, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hotstart) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR일 수 있다. 또한, 상기 PCR은 실시간(real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNAends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 또는 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)일 수 있다.
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 50℃ 내지 72℃일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 56℃ 내지 64℃인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계의 온도를 56℃, 60℃ 및 64℃로 설정하였으며, 이때, 56℃, 60℃ 및 64℃ 온도에서 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
상기 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 내 MgCl2가 추가적으로 포함되지 않았을 경우, 상기 핵산 증폭 단계에서 DNA 시료와 유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 혼합할 때, MgCl2를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 MgCl2는 1 mM 내지 5 mM 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로, MgCl2는 1 mM 내지 5 mM, 1.2 mM 내지 3.5 mM 또는 1.9 mM 내지 2.7 mM 농도로 포함될 수 있다.
상기 핵산 증폭 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), MgCl2 등의 금속이온염을 포함시킬 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.
상기 핵산 증폭은, PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제(self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)으로 대체될 수 있다.
상기 DNA 시료는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 의미한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자 (예컨대, 병원성 박테리아 및/또는 바이러스)일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류(예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 개체 또는 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 유전자 돌연변이 검출을 통한 종양 진단을 위한 경우, 상기 유전자 시료는 진단 대상 환자에서 유래한 검체로부터 추출된 것일 수 있고, 종양 치료 후 잔존 종양 검사를 위한 경우, 상기 유전자 시료는 종양 치료를 받은 환자의 종양 혹은 체액, 혈액, 혈장, 뇌척수액, 흉수, 복수 등으로부터 수득된 것일 수 있으며, 약제 내성 변이 균주 검출을 위한 경우에는 박테리아 또는 바이러스 등의 균주로부터 추출된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 DNA 시료는 종양 조직, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 복수, 기관지세척액(bronchial washing solution), 타액 또는 체액으로부터 수득된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 DNA 시료는 혈중 순환 종양 DNA이다.
상기 “유방암 진단 또는 치료에 대한 정보”의 제공은 유방암 진단과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 유방암의 발병 또는 진행, 약물 선택에 대한 정보, 약물 저항성 획득여부 평가 및 치료 후 재발 평가, 유방암의 예방 또는 치료에 관련된 정보를 제공하는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 유방암 진단은 유방암 치료 약물에 대한 약물 저항성 획득여부 평가 또는 약물 선택에 대한 정보 제공을 포함할 수 있다. 예컨대, 유방암 수술 후 약물 치료 중에 본 발명의 방법을 수행하여 약물에 내성을 나타내는 변이 유전자가 검출된 경우에는 그러한 정보를 제공할 수 있으며, 그러한 정보에 따라 치료 약물을 변경할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 수득된 핵산 증폭 산물의 염기 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 염기 서열의 확인은 당업계에 알려진 통상의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 차세대 서열 분석기(next-generation sequencer, NGS), Sequence-based typing(SBT)와 같은 지노타이핑(genotyping), 마이크로어레이(microarray), real time PCR 등이 있으니 이에 제한되지 않는다.
한편, 달리 기술되지 않는 한, 본 명세서에서 정의된 용어는 가장 넓은 의미로 해석되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 프라이머 혼합 농도비에 따른 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 돌연변이 검출 민감도 확인
변이 유전자만을 증폭시키기 위해 필요한 프라이머들의 최적의 PCR 조건을 찾기 위해 프라이머 혼합 농도비에 따른 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 돌연변이 검출 민감도를 비교하였다.
먼저, 민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, PIK3CA 유전자의 H1047L, E542K 및 E545K 돌연변이에 대해 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어진 중간 위치에 각각의 돌연변이에 해당하는 변이 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
구체적으로, 해당 올리고뉴클레오타이드의 양 말단에 해당하는 염기서열을 프라이머로 하여, 35 사이클(cycle)의 PCR 수행하여 dsDNA 형태의 증폭산물을 생산하고, 이를 Illumina y-shape adaptor를 라이게이션(ligation) 시킨 후 10 사이클의 PCR을 수행하여, 최종적으로 NGS 라이브러리(library) 형태의 dsDNA로 만들어, 각 돌연변이에 대한 양성 주형(template)으로 사용하였다.
합성한 각각의 돌연변이를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 올리고뉴클레오타이드의 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. Seraseq Wild type DNA 100% 및 3차 증류수(DW)를 대조군으로 준비하였다. 상기 Seraseq Wild type DNA는 상기 해당 올리고뉴클레오타이드와 동일한 방법으로, 돌연변이 위치의 염기에 정상적인 염기를 포함하는 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어지도록 제조하였다.
이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 및 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 15)를 포함하는 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 또한, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 9) 및 역방향 프라이머(서열번호 10)와 ii) PIK3CA 유전자의 E542K 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 11) 또는 PIK3CA 유전자의 E545K 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 19)를 포함하는 각각의 PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물 또는 PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
이때, 상기 정방향 또는 역방향 프라미어(PIK3CA_H1047L의 경우 역방향 프라이머, PIK3CA_E542K의 경우 정방향 프라이머, PIK3CA_E545K의 경우 역방향 프라이머)와 MSP를 1:1(0.15 uM: 0.15 uM), 1:2.7(0.15 uM: 0.40 uM), 1:4.3(0.15 uM: 0.65 uM), 1:6(0.15 uM: 0.90 uM), 1:7.7(0.15 uM: 1.15 uM), 1:9.3(0.15 uM: 1.40 uM), 1:11(0.15 uM: 1.65 uM), 1:13(0.15 uM: 1.95 uM), 1:14.7(0.15 uM: 2.20 uM), 1:16.3(0.15 uM: 2.45 uM), 1:18(0.15 uM: 2.70 uM), 1:20(0.15 uM: 3.00 uM) 농도비로 혼합하여 각각의 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
PIK3CA_H1047L_Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
PIK3CA_H1047L_Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
PIK3CA_H1047L_MSP TTGTTGTCCAGCCACCATTAA 15
PIK3CA_H1047L_UEP GAAACAAATGAATGATGCAC 16
PIK3CA_E542K_Forward ACGTTGGATGGGGAAAATGACAAAGAACAGC 9
PIK3CA_E542K_Reverse ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC 10
PIK3CA_E542K_MSP TACACGAGATCCTCTCTATA 11
PIK3CA_E542K_UEP TTCTCCTGCTCAGTGATTT 12
PIK3CA_E545K_Forward ACGTTGGATGGGGAAAATGACAAAGAACAGC 9
PIK3CA_E545K_Reverse ACGTTGGATGTAGCACTTACCTGTGACTCC 10
PIK3CA_E545K_MSP ACGTTGGATGAGAAAATCTTTCTCCTGGTT 19
PIK3CA_E545K_UEP TCCTCTCTCTGAAATCACT 20
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 하기와 표 3과 같은 농도비로 제조하였다.
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 .
10X PCR 완중용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 0.325 ㎕
25 mM dNTP 0.1 ㎕
PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물, PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물 또는 ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 하기 표 4와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
PCR 조건
94℃, 15 분 1 사이클
94℃, 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
56℃, 30 초
(annealing step)
72℃, 60 초(extension step)
72℃, 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 16), 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 E542K 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 12) 또는 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 E545K 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 20) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 하기 표 5에 나타내었다.
PCR 조건
94℃, 30 초 1 사이클
94℃, 5 초 40 사이클
52℃, 5 초
80℃, 5 초
52℃, 5초
80℃, 5 초
52℃, 5초
80℃, 5 초
52℃, 5초
80℃, 5 초
52℃, 5초
80℃, 5 초
72℃, 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응이 완료된 후, 15 ㎕의 증류수와 레진(resin)을 첨가하고 20분간 반응시켜 염 제거 반응을 수행하여 반응을 완료시켰다. 그 후, SpectroChip II에 대략 10 nl 정도를 집적한 후, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 3a 내지 도 3f로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:9.3 내지 1:20의 농도비로 혼합하여 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 대립유전자 빈도(allele frequency, AF) 0.5% 샘플에서 돌연변이(L) 피크가 야생형(WT) 피크보다 높게 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 1:13의 농도비에서 AF 0.5% 샘플의 피크가 가장 높았다. 이에, 1:13의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 3g).
또한, 도 4a 내지 도 4f로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:2.7 내지 1:4.3의 농도비로 혼합하여 PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 대립유전자 빈도(AF) 0.5% 샘플에서 돌연변이 피크가 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 1:4.3의 농도비에서 돌연변이 피크가 야생형 피크보다 높게 나타나는 현상이 확인되었다(컷오프는 평균값 10으로 지정됨). 이에, 1:4.3의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 4g).
또한, 도 5a 내지 도 5g로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:2.7 내지 1:3.3의 농도비로 혼합하여 PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 대립유전자 빈도(AF) 0.5% 샘플에서 돌연변이 피크가 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 1:3.3의 농도비에서 돌연변이 피크가 가장 높았다(컷오프는 평균값 10으로 지정됨). 이에, 1:3.3의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 5h).
실시예 2. 프라이머 혼합 농도비에 따른 ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C 돌연변이 검출 민감도 확인
변이 유전자만을 증폭시키기 위해 필요한 프라이머들의 최적의 PCR 조건을 찾기 위해 프라이머 혼합 농도비에 따른 ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C 돌연변이 검출 민감도를 비교하였다.
먼저, 민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, ESR1 유전자의 L536R, Y537N 및 Y537C 돌연변이에 대해 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어진 중간 위치에 각각의 돌연변이에 해당하는 변이 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다.
구체적으로, 해당 올리고뉴클레오타이드의 양 말단에 해당하는 염기서열을 프라이머로 하여, 35 사이클의 PCR 수행하여 dsDNA 형태의 증폭산물을 생산하고, 이를 Illumina y-shape adaptor를 라이게이션 시킨 후 10 사이클의 PCR을 수행하여, 최종적으로 NGS 라이브러리 형태의 dsDNA로 만들어, 각 돌연변이에 대한 양성 주형으로 사용하였다.
합성한 각각의 돌연변이를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 올리고뉴클레오타이드의 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. Seraseq Wild type DNA 100% 및 3차 증류수(DW)를 대조군으로 준비하였다. 상기 Seraseq Wild type DNA는 상기 해당 올리고뉴클레오타이드와 동일한 방법으로, 돌연변이 위치의 염기에 정상적인 염기를 포함하는 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어지도록 제조하였다.
이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, ESR1 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 1) 또는 역방향 프라이머(서열번호 28), ii) ESR1 유전자의 L536R 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 29)를 포함하는 ESR1_L536R 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 또한, ESR1 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 2)와 ii) ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 3) 또는 ESR1 유전자의 Y537C 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 17)를 포함하는 각각의 ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물 또는 ESR1_Y537C 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
이때, 상기 (L536R, Y537N 및Y537C 돌연변이의) 역방향 프라이머와 MSP를 10:10(0.12 uM: 0.12 uM), 9:10(0.108 uM: 0.12 uM), 8:10(0.096 uM: 0.12 uM), 7:10(0.084 uM: 0.12 uM), 6:10(0.072 uM: 0.12 uM), 5:10(0.06 uM: 0.12 uM), 4:10(0.048 uM: 0.12 uM), 3:10(0.036 uM: 0.12 uM), 2:10(0.024 uM: 0.12 uM), 1:10(0.012 uM: 0.12 uM) 농도비로 혼합하여 각각의 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 6에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
ESR1_L536R_Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
ESR1_L536R_Reverse ACGTTGGATGCTAGTGGGCGCATGTAGGC 28
ESR1_L536R_MSP CCAGCAGCAGGTCATTGC 29
ESR1_L536R_UEP CAAGAACGTGGTGCCCC 30
ESR1_Y537N_Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
ESR1_Y537N_Reverse ACGTTGGATGACGGCTAGTGGGCGCATGTA 2
ESR1_Y537N_MSP ATCTCCAGCAGCAGGTCTTT 3
ESR1_Y537N_UEP AGAACGTGGTGCCCCTC 4
ESR1_Y537C_Forward ACGTTGGATGACAAAGGCATGGAGCATCTG 1
ESR1_Y537C_Reverse ACGTTGGATGACGGCTAGTGGGCGCATGTA 2
ESR1_Y537C_MSP ATCTCCAGCAGCAGGTAAG 17
ESR1_Y537C_UEP GAACGTGGTGCCCCTCT 18
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 1의 표 3에 기재된 바와 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 1의 표 4에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 L536R 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 30), 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 4) 또는 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 Y537C 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 18) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 6a 내지 도 6d로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 7:10 내지 6:10의 농도비로 혼합하여 ESR1_L536R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 돌연변이 피크가 야생형 피크보다 높게 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 6:10의 농도비에서 돌연변이 피크가 더 높았다. 이에, 6:10의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 6e 내지 도 6g).
또한, 도 7a 내지 도 7e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 4:10 내지 1:10의 농도비로 혼합하여 ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 돌연변이 피크가 야생형 피크보다 높게 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 3:10의 농도비에서 돌연변이 피크가 가장 높았다. 이에, 3:10의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 7f 내지 도 7h).
또한, 도 8a 내지 도 8e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 7:10 내지 5:10의 농도비로 혼합하여 ESR1_Y537C 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 돌연변이 피크가 야생형 피크보다 높게 나타났고, 야생형 100% 샘플에서는 위양성이 발생하지 않았으며; 특히, 6:10의 농도비에서 돌연변이 피크가 가장 높았다. 이에, 6:10의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT 샘플에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% AF 샘플에서는 UEP 피크가 감소하며 돌연변이 피크가 증가하였다(도 8f 내지 도 8h).
실시예 3. PCR 온도 조건에 따른 PIK3CA_H1047L 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, 실시예 1과 동일한 방법으로 PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이에 대해 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어진 중간 위치에 각각의 돌연변이에 해당하는 변이 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 각각의 돌연변이를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 올리고뉴클레오타이드의 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 또는 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 15)를 포함하는 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:1(1.5 μM: 1.5 μM), 1:2(0.5 μM: 1 μM), 1:3(0.5 μM: 1.5 μM) 농도비로 혼합하여 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 7에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
PIK3CA_H1047L_Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
PIK3CA_H1047L_Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
PIK3CA_H1047L_MSP TTGTTGTCCAGCCACCATTAA 15
PIK3CA_H1047L_UEP GAAACAAATGAATGATGCAC 16
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 1의 표 3과 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 하기 표 8 내지 표 10의 세 가지 조건으로 PCR을 수행하였다.
PCR 조건
94℃, 15 분 1 사이클
94℃, 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
56℃, 30 초
(annealing step)
72℃, 60 초(extension step)
72℃, 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
PCR 조건
94℃, 15 분 1 사이클
94℃, 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
60℃, 30 초
(annealing step)
72℃, 60 초(extension step)
72℃, 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
PCR 조건
94℃, 15 분 1 사이클
94℃, 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
64℃, 30 초
(annealing step)
72℃, 60 초(extension step)
72℃, 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 8) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다. 반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:2 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 9(60℃)의 조건에서 매우 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 8(56℃) 및 표 10(64℃)의 조건에서 매우 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 8(60℃)의 조건에서 낮은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다.
이에, 상기 높은 민감도를 나타내는 2가지 조건 및 낮은 민감도를 나타낸 1가지 조건에 대해 5회 반복실험을 동일한 조건으로 추가 진행하였다.
그 결과, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:2 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 9(60℃)의 조건에서 5회의 반복실험에서 모두 매우 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다(도 10). 또한, 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 10(64℃)의 조건에서 5회의 반복실험에서 모두 매우 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다(도 11). 나아가, 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 8(60℃)의 조건에서 5회의 반복실험에서 모두 매우 높은 민감도를 나타내는 것을 확인하였다(도 12).
실시예 4. MgCl 2 농도에 따른 PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047R 돌연변이 검출 민감도 확인
실시예 1과 동일한 방법으로 PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이 및 H1047R 돌연변이에 대해 약 80 mer 내지 90 mer로 이루어진 중간 위치에 각각의 돌연변이에 해당하는 변이 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 합성한 각각의 돌연변이를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 올리고뉴클레오타이드의 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 및 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 15)를 포함하는 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물 준비하였다. 또한, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 또는 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047R 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 21)를 포함하는 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 또는 역방향 프라이머(H1047L의 경우, 역방향 프라이머; H1047R의 경우 정방향 프라이머)와 MSP를 1:2(0.5 μM: 1 μM) 및 1:3(0.5 μM: 1.5 μM) 농도비로 혼합하여 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물 및 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 각각 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 11에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
PIK3CA_H1047L_Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
PIK3CA_H1047L_Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
PIK3CA_H1047L_MSP TTGTTGTCCAGCCACCATTAA 15
PIK3CA_H1047L_UEP GAAACAAATGAATGATGCAC 16
PIK3CA_H1047R_Forward ACGTTGGATGAACTGAGCAAGAGGCTTTGG 13
PIK3CA_H1047R_Reverse ACGTTGGATGGCATGCTGTTTAATTGTGTGG 14
PIK3CA_H1047R_MSP GAAACAAATGAATGATGCCCG 21
PIK3CA_H1047R_UEP TTGTTGTCCAGCCACCATGA 22
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 하기 표 12(MgCl2: 2.7 mM) 및 표 13(MgCl2: 1.9 mM)과 같은 농도비로 제조하였다.
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 0.1625㎕
10X PCR 완중용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 0.1625 ㎕
25 mM dNTP 0.1 ㎕
PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 0.325 ㎕
10X PCR 완중용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 -
25 mM dNTP 0.1 ㎕
PIK3CA_H1047L 또는 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 1의 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 16) 및 7 uM 농도의 PIK3CA 유전자의 H1047R 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(서열번호 22) 1.2 ㎕를 각각 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다.반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:2 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 12(MgCl2: 1.9 mM)의 조건에서 해당 돌연변이에 대해 매우 높은 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 또한, 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 13(MgCl2: 1.9 mM) 및 표 12(MgCl2: 2.7 mM)의 조건에서 해당 돌연변이에 대해 매우 높은 민감도를 나타내었음을 확인하였다.
또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:2 및 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 13(MgCl2: 1.9 mM)의 조건에서 해당 돌연변이에 대해 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 또한, 특히, 1:3 농도비로 혼합한 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 표 12(MgCl2: 2.7 mM)의 조건에서 해당 돌연변이에 대해 매우 높은 민감도를 나타내었음을 확인하였다.
실시예 5. ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 약물내성에 대한 정보 제공
타목시펜(Tamoxifen), 풀베스트란트(Fulvestrant) 등의 항-호르몬 치료제에 내성과 관련된 돌연변이 유전자인 ESR1_Y537N 변이 유전자 검출을 통해 환자에게 약물내성에 대한 정보를 제공하기 위해, 먼저, 타목시펜 또는 풀베스트란트 항-호르몬 치료제를 투약받은 2명의 환자의 검체로부터 얻은 cfDNA를 각각 Seraseq Wild type DNA를 이용하여 cfDNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이때, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA 시료 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT (cat# 0710-0208)을 대조군으로 준비하였다.
그 후, ESR1 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 2)와 ii) ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 3)를 포함하는 ESR1_Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:1(0.5 μM: 0.5 μM) 농도비로 혼합하여 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 하기 표 14(MgCl2: 2.3 mM)과 같은 농도비로 제조하였다.
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 0.24375㎕
10X PCR 완중용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 0.08125 ㎕
25 mM dNTP 0.1 ㎕
ESR1 Y537N 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 1의 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 4) 1.2 ㎕를 각각 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다.이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 2명의 환자의 검체로부터 얻은 cfDNA 시료로부터 ESR1_Y537N 돌연변이에 대한 피크(peak)가 검출되었다. 반면, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA 시료 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT(cat# 0710-0208) 시료에서는 ESR1_Y537N 돌연변이에 대한 피크가 검출되지 않았다.
실시예 6. 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 유방암 재발에 대한 정보 제공
실시예 6.1. PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물 및 PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 유방암 재발에 대한 정보 제공
유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 변이 유전자 검출을 통해 환자에게 유방암 재발에 대한 정보를 제공하기 위해, 먼저, 환자의 검체(종양조직 또는 혈액)로부터 얻은 cfDNA를 각각 Seraseq Wild type DNA를 이용하여 cfDNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이때, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA(0.5%) 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT (cat# 0710-0208)을 대조군으로 준비하였다.
그 후, PIK3CA 유전자에 대한 i) PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 9) 및 역방향 프라이머(서열번호 10)와 ii) PIK3CA 유전자의 E542K 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 11) 또는 PIK3CA 유전자의 E545K 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 19)를 각각의 PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물 또는 PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, PIK3CA_E542K 변이 유전자 증폭용 조성물은 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:2(0.5 μM: 1 μM) 농도비로 혼합하여 준비하였으며, PIK3CA_E545K 변이 유전자 증폭용 조성물은 상기 역방향 프라이머와 MSP를 1:3(0.5 μM: 1.5 μM) 농도비로 혼합하여 준비하였다.
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 상기 실시예 4의 표 13과 같은 농도비로 제조하였다. 그 후, 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 1의 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 4) 1.2 ㎕를 각각 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 16 및 17에 나타난 바와 같이, 환자의 검체로부터 얻은 cfDNA 시료 모두에서 PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 돌연변이에 대한 피크가 검출되었다. 반면, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA 시료 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT(cat# 0710-0208) 시료에서는 PIK3CA_E542K 및 PIK3CA_E545K 돌연변이에 대한 피크가 검출되지 않았다.
실시예 6.2. PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물 및 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 유방암 재발에 대한 정보 제공
유방암 재발과 관련된 돌연변이 유전자인 PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 검출을 통해 환자에게 유방암 재발에 대한 정보를 제공하기 위해, 먼저, 환자의 검체(종양조직 또는 혈액)로부터 얻은 cfDNA를 각각 Seraseq Wild type DNA를 이용하여 cfDNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이때, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA(0.5%) 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT (cat# 0710-0208)을 대조군으로 준비하였다.
PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 또는 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047L 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 15)를 포함하는 PIK3CA_H1047L 변이 유전자 증폭용 조성물 준비하였다. 또한, PIK3CA 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 13) 또는 역방향 프라이머(서열번호 14), ii) PIK3CA 유전자의 H1047R 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 21)를 포함하는 PIK3CA_H1047R 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 변이 유전자 증폭용 조성물은 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:3(0.5 μM: 1.5 μM) 농도비로 혼합하여 준비하였다.
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 상기 실시예 3의 표 11과 같은 농도비로 제조하였다. 그 후, 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 1의 표 4의 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 ESR1 유전자의 Y537N 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 4) 1.2 ㎕를 각각 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 1의 표 5와 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 18 및 19에 나타난 바와 같이, 환자의 검체로부터 얻은 cfDNA 시료 모두에서 PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047R 돌연변이에 대한 피크가 검출되었다. 반면, 정상인의 검체로부터 얻은 얻은 cfDNA 시료 및 Seraseq® ctDNA Reference Material v2 WT(cat# 0710-0208) 시료에서는 PIK3CA_H1047L 및 PIK3CA_H1047R 돌연변이에 대한 피크가 검출되지 않았다.
<110> GenoPeaks Co. Ltd. <120> BREAST CANCER GENE MUTATION-SELECTIVE AMPLIFICATION METHOD WITH ULTRA-HIGH SENSITIVITY AND COMPOSITION THEREFOR <130> KC21649 <160> 30 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537N, Y537C, Y537S, L536R_Forward <400> 1 acgttggatg acaaaggcat ggagcatctg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537N, Y537C,Y537S_Reverse <400> 2 acgttggatg acggctagtg ggcgcatgta 30 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537N_MSP <400> 3 atctccagca gcaggtcttt 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537N_UEP <400> 4 agaacgtggt gcccctc 17 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_E380Q_Forward <400> 5 acgttggatg gctttgtgga tttgaccctc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_E380Q_Reverse <400> 6 acgttggatg agacgagacc aatcatcagg 30 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_E380Q_MSP <400> 7 tctagccagg cacagtg 17 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_E380Q_UEP <400> 8 atcaggtcca ccttcta 17 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E542K, E545K_Forward <400> 9 acgttggatg gggaaaatga caaagaacag c 31 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E542K, E545K_Reverse <400> 10 acgttggatg tagcacttac ctgtgactcc 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E542K_MSP <400> 11 tacacgagat cctctctata 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E542K_UEP <400> 12 ttctcctgct cagtgattt 19 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047L, H1047R_Forward <400> 13 acgttggatg aactgagcaa gaggctttgg 30 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047L, H1047R_Reverse <400> 14 acgttggatg gcatgctgtt taattgtgtg g 31 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047L_MSP <400> 15 ttgttgtcca gccaccatta a 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047L_UEP <400> 16 gaaacaaatg aatgatgcac 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537C_MSP <400> 17 atctccagca gcaggtaag 19 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537C, Y537S_UEP <400> 18 gaacgtggtg cccctct 17 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E545K_MSP <400> 19 acgttggatg agaaaatctt tctcctggtt 30 <210> 20 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_E545K_UEP <400> 20 tcctctctct gaaatcact 19 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047R_MSP <400> 21 gaaacaaatg aatgatgccc g 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_H1047R_UEP <400> 22 ttgttgtcca gccaccatga 20 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_S463P_Forward <400> 23 acgttggatg agcttctctc tctcactctc 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_S463P_Reverse <400> 24 acgttggatg caggactcgg tggatatggt 30 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_S463P_MSP <400> 25 agacttcagg gtgcttgg 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_S463P_UEP <400> 26 ggagtgtaca catttctg 18 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_Y537S_MSP <400> 27 atctccagca gcaggtaac 19 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_L536R_Reverse <400> 28 acgttggatg ctagtgggcg catgtaggc 29 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_L536R_MSP <400> 29 ccagcagcag gtcattgc 18 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ESR1_L536R_UEP <400> 30 caagaacgtg gtgcccc 17

Claims (35)

1) 유방암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP); 및
2) 상기 변이 유전자를 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는
유방암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1 내지 1:20인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 동일하게 5'→3' 방향이거나 3'→5' 방향인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 유전자 변이는 뉴클레오타이드가 치환, 삽입 또는 결실된 것이거나 점돌연변이(point mutation) 또는 다중 돌연변이(multiple mutation)인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIC3A 또는 ESRI 유전자 상의 유전자 변이인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 염기쌍오류인 염기는 상기 변이 유전자 특이적 프라이머에서 유전자 변이 위치로부터 1 bp 내지 10 bp 거리에 위치하는
조성물.
제5항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_D538G, ESR1_L536R, PIK3CA_E542K, PIK3CA_H1047L, ESR1_S463P, ESR1_Y537C, ESR1_Y537S, PIK3CA_E545K, PIK3CA_H1047R, ESR1_Y537N 및 ESR1_E380Q로부터 선택된 하나 이상인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIC3A 상의 유전자 변이이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:2.7 내지 1:20인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_E542K이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:2.7 내지 1:4.3인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_E542K이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:4.3인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_E545K이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:2.7 내지 1:3.3인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_E545K이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:3.3인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_H1047L이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:9.3 내지 1:20인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 PIK3CA_H1047L이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:13인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1 상의 유전자 변이이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 7:10 내지 1:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_L536R이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 7:10 내지 6:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_L536R이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 6:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_Y537N이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 4:10 내지 1:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_Y537N이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 3:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_Y537C이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 7:10 내지 5:10인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 유방암 관련 변이 유전자는 ESR1_Y537C이고, 상기 조성물 내 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 6:10인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 서열번호 3, 7, 11, 15, 17, 19, 21, 25, 27 또는 29로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1, 5, 9, 13 또는 23으로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2, 6, 10, 14, 24 또는 28로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 MgCl2를 추가로 포함하는
조성물.
제22항에 있어서,
상기 MgCl2의 농도는 1.9 mM 내지 2.7 mM인
조성물.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
키트.
제27항에 있어서,
상기 키트는 PIK3CA_H1047L, PIK3CA_E542K, PIK3CA_E545K, ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C 변이 유전자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이 유전자 증폭용 조성물을 포함하는
키트.
제27항에 있어서,
상기 키트는 ESR1_L536R, ESR1_Y537N 및 ESR1_Y537C 변이 유전자 증폭용 조성물을 포함하는
키트.
개체로부터 수득한 DNA 시료 및 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는
유방암 진단 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법.
제30항에 있어서,
상기 핵산 증폭의 산물 내 잔존하는 dNTP를 제거하는 단계; 및
상기 dNTP를 제거한 핵산 증폭 산물에 단일 염기 확장(SBE, single base extension)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는
방법.
제30항에 있어서,
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도는 50℃ 내지 72℃인
방법.
제30항에 있어서,
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도는 56℃ 내지 64℃인
방법.
제30항에 있어서,
상기 방법은 핵산 증폭 산물의 염기 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함하는
방법.
제34항에 있어서,
상기 염기 서열을 확인하는 단계는 차세대 서열 분석기(next-generation sequencer, NGS), Sequence-based typing(SBT), 마이크로어레이(microarray), 또는 real time PCR을 이용하여 수행되는
방법.
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