KR20220079492A - 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 - Google Patents

폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다. 본 발명에 따른 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 한 번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 변이 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시켜 극도로 낮은 농도로 존재하는 폐암 관련 유전자 또는 단일염기다형성을 증폭시킬 수 있으므로, 폐암 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물{LUNG CANCER GENE MUTATION-SELECTIVE AMPLIFICATION METHOD WITH ULTRA-HIGH SENSITIVITY AND COMPOSITION THEREFOR}
본 발명은 폐암 유전자 돌연변이 초고감도 선택적 증폭 방법 및 이를 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 및 이의 용도에 대한 것이다.
변이 유전자란 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화를 유발하는 현상을 의미한다. 변이 유전자는 여러 질병과 관련이 깊다. 예를 들어, 종양의 경우, TP53 변이 유전자 또는 KRAS 변이 유전자는 여러 고형 종양에 관찰되며, BRAF 변이 유전자는 갑상선암 및 대장암 등에서 관찰된다. EGFR 변이 유전자는 폐암 및 대장암 등에서 관찰된다. 이러한 변이 유전자의 상당수는 유전자 내 특정 위치에 발생한다. 구체적으로, TP53 변이 유전자로는 Arg175His, Arg248Gln, Arg273His가 있으며, KRAS 변이 유전자에는 코돈 12 및 13 변이가 있다. 또한, BRAF 변이 유전자로는 Val600Glu이 있으며, EGFR 변이 유전자에는 Leu858Arg 및 Thr790Met가 있다.
이러한 질병 특이적 변이 유전자를 검출하는 것은 질병의 진단과 치료 방법 결정 및 치료 후 질병의 예후 판단에 아주 유용하다. 이에 따라 질병 특이적인 변이 유전자를 검출하는 방법들이 개발되고 있으며, 대표적인 방법으로 직접염기서열분석법(direct sequencing), 대립유전자특이증폭법(allele-specific PCR), 제한효소절편길이다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), Taqman 소식자(probe)법, ARMS(amplification refractory mutation system)-PCR, 변성(denaturing) HPLC(dHPLC), real-time PCR fall short, Mass-array 등이 있다.
질병 특이적인 변이 유전자 검출에서 중요하게 요구되는 사항으로는 (1) 정상 DNA 속에서 낮은 비율로 존재하는 변이 DNA를 검출할 수 있는 민감도 (sensitivity)와 (2) 정상 DNA를 변이 DNA로 잘못 판정하는 위양성(false positive) 비율을 최대한 낮출 수 있는 특이도(specificity)를 갖추는 것이다. 그러나, 기존에 사용되었던 방법들은 민감도와 특이도에 있어서 만족할 만한 결과를 보여주지 못하였다. 직접염기서열분석법은 가장 특이도가 높으나 위양성의 비율이 낮은 반면, 20% 내지 30% 이상의 변이 DNA가 존재할 경우에만 검출이 가능한 단점이 있다. 반면, 대립유전자특이증폭법이나 제한효소절편길이다형성, Taqman 소식자법 등은 민감도는 높으나, 특이도가 낮아 위양성의 문제점을 항상 가지고 있다.
한편, 폐암 환자에서 EGFR 유전자의 특정 돌연변이(EGFR exon19 deletion mutations, L858R 등)가 있을 경우, TKI(Tyrosine Kinase Inhibitor; Gefitinib 등)를 사용하여 치료하는데, 시간이 지남에 따라 해당 약제 저항성 돌연변이 (EGFR_T790M(1차 저항성), EGFR_C797S(2차 저항성) 등)가 발생하여 기존 약제에 반응하지 않게 된다. TKI 치료 중 내성기작으로 발생하는 이러한 저항성 돌연변이들은, 먼저 확인되는 EGFR 돌연변이(exon 19 del, L858R 등)에 비해, 돌연변이 비율이 극히 낮아서, 일반적인 방법으로는 확인이 어려운 실정이다.
또한, 종양환자 치료 반응을 제때 정확하게 확인하기 위해서는, 치료 과정 여러 시점에서 자유롭게 검체를 확보하는 것이 필수적이다. 그러나, 기존의 조직 생검의 경우, 환자에게 주는 고통과 비용, 또는 감염위험성 등으로 인해 많은 제약이 따르고 있다. 반면, 혈중 순환 종양 DNA(ctDNA) 검체는, 간단한 혈액 채취만으로, 환자의 종양 유래 DNA를 확보할 수 있다는 점에서, 현재 임상활용에 적극적으로 활용되고 있다. 하지만, 환자의 혈액에 존재하는 대부분의 혈중 순환 DNA는 주변 조직의 괴사에 의해 생성된 정상 세포 유래 DNA이며, 종양 유래 DNA(ctDNA)는 그 비율이 극히 낮아, 일반적인 방법으로는 ctDNA의 돌연변이 검출이 어렵다.
따라서, 생체 시료 내 적은 양으로 존재하는 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 높은 민감도 및 특이도로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법에 대해 연구개발이 필요한 실정이다.
본 발명은 상술한 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 우수한 민감도 및 특이도로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 간편하고 효율적인 방법으로 특정 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 폐암 관련 변이 유전자를 검출할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 혈중 순환 종양 DNA를 이용하여 폐암 관련 변이 유전자를 검출하여 암의 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하기 위한 방법, 조성물 및 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 폐암 관련 변이 유전자를 포함하는 염기서열을 주형으로 하되 일부 염기에 대해 불일치된 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP) 및 상기 폐암 관련 변이 유전자를 증폭하기 위한 정방향 및/또는 역방향 프라이머를 특정 농도비로 포함하는 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 상기 정방향 및 역방향 프라이머만을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우보다 변이 유전자가 더 많이 증폭되어 매우 높은 민감도로 폐암 관련 변이 유전자를 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 1) 폐암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP); 및 2) 상기 변이 유전자를 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체로부터 수득한 DNA 시료와 상기 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 폐암 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 변이 유전자를 증폭하는 경우, 한 번의 유전자 증폭 반응만으로 특정 염기서열을 지닌 변이 유전자만을 선택/집중적으로 증폭시켜 극도로 낮은 농도로 존재하는 폐암 관련 유전자 또는 단일염기다형성을 증폭시킬 수 있으므로, 폐암 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 변이 유전자 증폭 방법을 도식화한 도면이다.
도 2는 일반적인 중합효소 연쇄 반응(PCR) 조성물 또는 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용한 돌연변이 유전자의 증폭과정을 도식화한 도면이다.
도 3은 일반적인 PCR 조성물 또는 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물을, 변이 특이적 프라이머를 이용한 iPLEX 반응 수행하여 진단할 경우의 KRAS_Q61H 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 도 4e는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 KRAS_G13D 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 4f 내지 도 4h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별, 그리고 PCR 온도 조건별 변이 유전자 증폭용 조성물의 EGFR_C797S 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 6은 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별, 그리고 MgCl2 농도별 변이 유전자 증폭용 조성물의 EGFR_C797S 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이다.
도 7a 내지 도 7e는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 EGFR_C797S 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 7f 내지 도 7h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a 내지 도 8e는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 EGFR_E746_A750del 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 8f 내지 도 8h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a 내지 도 9e는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 KRAS_G12V 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 9f 내지 도 9h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a 내지 도 10e는 정방향 프라이머(Outer) 및 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비별 변이 유전자 증폭용 조성물의 BRAF_V600E 돌연변이 진단 민감도를 나타낸 도면이고; 도 10f 내지 도 10h는 특정 농도비를 각각 1차 내지 3차로 반복하여 실험한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은, 1) 폐암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP) 및 2) 상기 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 제공한다.
상기 "변이 유전자"는 유전자 또는 염색체의 이상에 의해 유전자에 질적 또는 양적인 변화가 생겨 유전형질에 변화가 유발된 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 변이는 바람직하게는 유전자 단위의 변이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 치환, 삽입 및 결실로부터 선택된 점 돌연변이(point mutation) 또는 다중 돌연변이(multiple mutation)일 수 있다. 또한 상기 변이는 침묵 돌연변이, 중성 돌연변이, 미스센스 돌연변이, 넌센스 돌연변이, 프레임 시프트 돌연변이 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 변이는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)일 수 있다. 단일염기다형성이란 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열(A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미하며, 개체, 질병군, 또는 지역군 등에서 단일 위치에 여러가지 DNA 염기들이 다양하게 나타날 수 있으며, 본 발명의 조성물은 이러한 단일염기다형성의 증폭 역시 가능하다.
상기 "주형 염기서열"은 상기 변이 유전자 내 돌연변이가 일어난 염기서열 또는 단일염기다형성으로부터 5'-말단 또는 3'-말단 방향으로 1 bp 내지 30 bp 연속적인 염기서열의 상보적인 염기서열인 것일 수 있다.
상기 주형 염기서열은 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 또는 단일염기다형성이 존재하는 표적 유전자(전장 유전자), 또는 상기 표적 유전자 내의 유전자 돌연변이 또는 SNP 부위를 포함하는 일부분을 포함하는 것으로, 상기 유전자 돌연변이 또는 SNP를 포함하는 일부분은 약 5 bp 내지 1,000,000 bp, 바람직하게는 약 5 bp 내지 100,000 bp, 더욱 바람직하게는 약 50 bp 내지 500 bp의 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
상기 "프라이머 세트"는 순방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성될 수 있으며, 이는 검출하고자 하는 유전자 변이 또는 SNP를 포함하는 유전자 시료의 증폭에 통상적으로 사용되는 일반적인 프라이머 쌍을 의미한다. 이러한 프라이머 세트는 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 검출하고자 하는 유전자 변이 또는 SNP, 및 상기 변이를 포함하는 유전자에 따라서 용이하게 결정 및 제작할 수 있다. 상기 순방향 프라이머 또는 역방향 프라이머의 길이는 연속하는 10 내지 50 bp, 바람직하게는 15 내지 35 bp 길이로 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 "변이 유전자 특이적 프라이머(mutation specific primer, MSP)"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(예컨대, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 5 bp 내지 50 bp, 구체적으로 5 bp 내지 30 bp의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으며, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
상기 "염기쌍오류"는 주형 염기서열과 미스매치된 염기쌍을 의미한다. 상기 변이 유전자 특이적 프라이머에서, 염기쌍오류인 염기는 유전자 변이 위치로부터 1 bp 내지 10 bp 거리에 위치할 수 있다.
상기 프라이머는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid) 또는 이들의 혼합 등으로, 유전자 증폭에 이용될 수 있는 다양한 형태일 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_G719A, EGFR_E746_A750delELREA, EGFR_L747_P753>S, EGFR_E709K, EGFR_C797S, KRAS_G13V, KRAS_G13D, EGFR_G719D, EGFR_E746_A750del(frame shift), EGFR_L858R, EGFR_T790M, BRAF_V600E, KRAS_G12V 또는 KRAS_G12D일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_C797S, KRAS_G13D, EGFR_E746_A750del, KRAS_G12V, 또는 BRAF_V600E를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물 내 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비는 1:0.1 내지 1:20일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물 내 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:0.1 내지 1:20, 1:0.5 내지 1:15, 1:1 내지 1:10, 1:1 내지 1:5, 1:1 내지 1:2, 1:2 내지 1:6, 1:3 내지 1:5, 또는 1:5 내지 1:7일 수 있다.
상기 하나의 프라이머(outer primer)는 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 방향(5'→ 3'또는 3'→ 5')에 따라 순방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 예를 들어, 변이 유전자 특이적인 프라이머가 순방향으로 제작되는 경우에, 상기 농도비가 결정되는 프라이머 세트 중 하나의 프라이머는 순방향 프라이머이다.
일 실시예에 따르면, 상기 조성물 내 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)의 농도비를 특정 비율 또는 특정 범위의 비율로 제어하는 경우에, 변이 유전자를 매우 높은 민감도로 검출할 수 있음을 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 폐암 관련 변이 유전자가 KRAS_G13D 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:1 내지 1:2이다. 또한 상기 농도비는 1:1 또는 1:2일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 조성물 내 KRAS 유전자에 대한 프라이머와 KRAS_G13D 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:1 및 1:2의 농도비로 각각 혼합한 KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 폐암 관련 변이 유전자가 EGFR_C797S 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:2 내지 1:6이다. 또한 상기 농도비는 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 1:6일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 EGFR 유전자에 대한 프라이머와 EGFR_C797S 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 또는 1:6의 농도비로 각각 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 폐암 관련 변이 유전자가 EGFR_E746_A750del 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머(MSP)의 농도비는 바람직하게는 1:1 내지 1:5이다. 또한 상기 농도비는 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 EGFR 유전자에 대한 프라이머와 EGFR_E746_A750del 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5의 농도비로 각각 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 폐암 관련 변이 유전자가 KRAS_G12V 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머의 농도비는 바람직하게는 1:5 내지 1:7이다. 또한 상기 농도비는 1:5, 1:6 또는 1:7일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 KRAS 유전자에 대한 프라이머와 KRAS_G12V 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:5, 1:6 또는 1:7의 농도비로 각각 혼합한 KRAS_G12V 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
일 구현예에서, 상기 폐암 관련 변이 유전자가 BRAF_V600E 변이 유전자인 경우에, 상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머(outer primer)와 변이 유전자 특이적 프라이머의 농도비는 바람직하게는 1:3 내지 1:5이다. 또한 상기 농도비는 1:3, 1:4 또는 1:5일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 BRAF 유전자에 대한 프라이머와 BRAF_V600E 변이 유전자 특이적인 프라이머를 1:3, 1:4 또는 1:5의 농도비로 각각 혼합한 BRAF_V600E 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
다른 구현예에서, 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 서열번호 3, 7, 11, 13, 15, 19, 23, 25, 26, 29, 33, 37, 41, 45 또는 47로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 하나의 프라이머(outer primer)는 정방향 프라이머 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1, 5, 9, 17, 21, 27, 31, 35, 39 또는 43으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 역방향 프라이머는 서열번호 2, 6, 10, 18, 22, 28, 32, 36, 40 또는 44로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 폐암 관련 변이 유전자별 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머는 표 1에 예시되어 있다. 표 1에 확인하고자 하는 변이 염기서열 직전까지 상보 결합하는 올리고뉴클레오타이드(Unextended primer, UEP 프라이머)에 대한 정보도 함께 제시된다.
변이 유전자 프라이머 서열정보 서열번호
KRAS_Q61H Forward ACGTTGGATGCATGTACTGGTCCCTCATTG 1
Reverse ACGTTGGATGTGGAGAAACCTGTCTCTTGG 2
MSP ATTCTCGACACAGCAGGTGAY 3
UEP ATTGCACTGTACTCCTC 4
EGFR_G719A Reverse ACGTTGGATG AGGGACCTTACCTTATACACC 5
Forward ACGTTGGATG AGTGGAGAAGCTCCCAACCA 6
MSP AATAAATCATAACGTGCCGAACGCACCGGGGG 7
UEP CAAAAGATCAAAGTGCTGG 8
EGFR_E746_
A750delELREA		 Reverse ACGTTGGATGAGCAGAAACTCACATCGAGG 9
Forward ACGTTGGATGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG 10
MSP AATAAATCATAACCTTGTTGGCTTTCGGAGATGCTT 11
UEP AAAATTCCCGTCGCTATCAA 12
EGFR_L747_
P753>S		 Reverse ACGTTGGATGAGCAGAAACTCACATCGAGG 9
Forward ACGTTGGATGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG 10
MSP ACGTTGGATGCCCGTCGCTATCAAGGATTC 13
UEP GATTTCCTTGTTGGCTTTCG 14
EGFR_E709K Reverse ACGTTGGATGAGGGACCTTACCTTATACACC 5
Forward ACGTTGGATGAGTGGAGAAGCTCCCAACCA 6
MSP ACGTTGGATGGCTCTCTTGAGGATCTTGAGGA 15
UEP TTGATCTTTTTGAATTCAGTTT 16
EGFR_C797S Reverse ACGTTGGATGTACTGGGAGCCAATATTGTC 17
Forward ACGTTGGATGCAGCTCATCACGCAGCTCAT 18
MSP ACGTTGGATGTCACGCAGCTCATGCCCTTCGTCA 19
UEP GGACATAGTCCAGGAGGC 20
KRAS_G13V Reverse ACGTTGGATGTAGCTGTATCGTCAAGGCAC 21
Forward ACGTTGGATGTAAGGCCTGCTGAAAATGAC 22
MSP ACGTTGGATGTGTGGTAGTTGGAGCTGGGGT 23
UEP AGGCACTCTTGCCTACG 24
KRAS_G13D Reverse ACGTTGGATGTAGCTGTATCGTCAAGGCAC 21
Forward ACGTTGGATGTAAGGCCTGCTGAAAATGAC 22
MSP ACGTTGGATGTGTGGTAGTTGGAGCTGGGGA 25
UEP AGGCACTCTTGCCTACG 24
EGFR_G719D Reverse ACGTTGGATGAGGGACCTTACCTTATACACC 5
Forward ACGTTGGATGAGTGGAGAAGCTCCCAACCA 6
MSP AATAAATCATAACGTGCCGAACGCACCGAGGT 26
UEP CAAAAGATCAAAGTGCTGG 8
EGFR_E746_A750del(frame shift) Reverse ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC 27
Forward ACGTTGGATGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG 28
MSP ACGTTGGATGAATTCCCGTCGCTATCACGA 29
UEP TTGGCTTTCGGAGATGT 30
EGFR_L858R Forward ACGTTGGATGAGCCAGGAACGTACTGGTGA 31
Reverse ACGTTGGATGAAAGCCACCTCCTTACTTTGC 32
MSP ACGTTGGATGGTTCAAGATCACAGATTTTGGTCG 33
UEP GCACCCAGCAGTTTGGCC 34
EGFR_T790M Forward ACGTTGGATGATCTGCCTCACCTCCACCGT 35
Reverse ACGTTGGATGTGTTCCCGGACATAGTCCAG 36
MSP AGCCGAAGGGCATGAGCTGAA 37
UEP CACCGTGCAGCTCATCA 38
BRAF_V600E Forward ACGTTGGATGTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA 39
Reverse ACGTTGGATGAGCCTCAATTCTTACCATCCA 40
MSP CTGTGATTTTGGTCTAGCTACGGA 41
UEP CCCACTCCATCGAGATTTC 42
KRAS_G12V Forward ACGTTGGATGTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATG 43
Reverse ACGTTGGATGATTGTTGGATCATATTCGTCCAC 44
MSP ACTTGTGGTAGTTGGAGCAGT 45
UEP CACTCTTGCCTACGCCA 46
KRAS_G12D Forward ACGTTGGATGTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATG 43
Reverse ACGTTGGATGATTGTTGGATCATATTCGTCCAC 44
MSP ACTTGTGGTAGTTGGAGCGGA 47
UEP CACTCTTGCCTACGCCA 46
다른 구현예에서, 상기 조성물은 MgCl2를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 추가로 포함되지 않더라도, 핵산 증폭 수행시 상기 조성물과 시료, 기타 핵산 증폭을 위한 용액들과 혼합하는 단계에서 MgCl2를 추가할 수 있다. 이때, 상기 MgCl2는 1 mM 내지 5 mM 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로, MgCl2는 1 mM 내지 5 mM, 1.5 mM 내지 4.5 mM, 2 mM 내지 4 mM 또는 2.5 mM 내지 3.5 mM 농도로 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 조성물 내 MgCl2를 1.875 mM, 2.7 mM 및 3.5 mM 농도로 포함되도록 하였으며, 이를 이용하여 합성한 핵산 증폭 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
그 밖에, 본 발명의 조성물은 상술한 핵산을 증폭 또는 검출하는데 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예컨대, PCT 반응에 요구되는 dNTP(deoxynucleotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase) 등을 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 유전자 증폭용 조성물을 포함하는 키트가 제공된다.
상기 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플, 플레이트 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 EGFR_G719A, EGFR_E746_A750delELREA, EGFR_L747_P753>S, EGFR_E709K, EGFR_C797S, KRAS_G13V, KRAS_G13D, EGFR_G719D, EGFR_E746_A750del(frame shift), EGFR_L858R, EGFR_T790M, BRAF_V600E, KRAS_G12V 및 KRAS_G12D로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 EGFR_C797S, KRAS_G13D, EGFR_E746_A750del, KRAS_G12V 및 BRAF_V600E로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 EFGR_C797S 및 KRAS_G13D 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 EGFR_E746_A750del, KRAS_G12V 및 BRAF_V600E 변이 유전자에 대한 증폭용 조성물을 포함할 수 있다.
상기 키트는 폐암 관련 변이 유전자의 증폭을 위해 사용될 수 있다. 또한, 상기 키트는 폐암 진단 또는 치료를 위한 정보를 제공하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 개체로부터 수득한 DNA 시료와 상기 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는 폐암 진단 또는 치료에 대한 정보를 제공하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 상기 핵산 증폭 산물에 단일 염기 확장(SBE, single base extension)을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 단일 염기 확장을 수행하는 단계 전에, 상기 핵산 증폭의 산물 내 잔존하는 dNTP를 제거하는 단계를 수행할 수 있다.
상기 핵산 증폭을 위해 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법은 PCR로, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hotstart) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR일 수 있다. 또한, 상기 PCR은 실시간(real-time) PCR, 분별디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNAends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 또는 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)일 수 있다.
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 50℃내지 72℃일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 56℃내지 60℃인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계의 온도를 56℃, 60℃ 및 64℃로 설정하였으며, 이때, 56℃ 및 60℃ 온도에서 합성한 PCR 산물의 경우에서 높은 민감도로 해당 돌연변이를 확인하였다.
상기 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물 내 MgCl2가 추가적으로 포함되지 않았을 경우, 상기 핵산 증폭 단계에서 DNA 시료와 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물을 혼합할 때, MgCl2를 추가적으로 더 포함할 수 있다. 이때, 상기 MgCl2는 1 mM 내지 5 mM 농도로 포함될 수 있다. 구체적으로, MgCl2는 1 mM 내지 5 mM, 1.5 mM 내지 4.5 mM, 2 mM 내지 4 mM 또는 2.5 mM 내지 3.5 mM 농도로 포함될 수 있다.
상기 핵산 증폭 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), MgCl2 등의 금속이온염을 포함시킬 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.
상기 핵산 증폭은, PCR, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭 (transcription-mediatedamplification; TMA) (WO88/10315), 자가유지염기서열복제 (self sustained sequence replication)(20)(WO90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)으로 대체될 수 있다.
상기 DNA 시료는 검출하고자 하는 유전자 돌연변이 부위를 포함하는 유전자 시료를 의미한다. 구체적으로, 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액 등, 또는 이들로부터 추출된 내인성 유전자 또는 외인성(exogenous) 유전자(예컨대, 병원성 박테리아 및/또는 바이러스)일 수 있다. 상기 세포, 조직, 기관, 체액 등은 포유류(예컨대, 인간, 영장류, 설치류 등)의 개체 또는 환자로부터 채취된 것일 수 있으며, 상기 세포는 바이러스 또는 박테리아 등의 단세포 동물의 세포를 포함할 수 있다.
예를 들면, 유전자 돌연변이 검출을 통한 종양 진단을 위한 경우, 상기 유전자 시료는 진단 대상 환자에서 유래한 검체로부터 추출된 것일 수 있고, 종양 치료 후 잔존 종양 검사를 위한 경우, 상기 유전자 시료는 종양 치료를 받은 환자의 종양 혹은 체액, 혈액, 혈장, 뇌척수액, 흉수, 복수 등으로부터 수득된 것일 수 있으며, 약제 내성 변이 균주 검출을 위한 경우에는 박테리아 또는 바이러스 등의 균주로부터 추출된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 DAN 시료는 종양 조직, 소변, 뇌척수액, 혈장, 혈액, 흉수, 복수, 기관지세척액(bronchial washing solution), 타액 또는 체액으로부터 수득된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 DNA 시료는 혈중 순환 종양 DNA이다.
상기 "폐암 진단 또는 치료에 대한 정보"의 제공은 폐암 진단과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 폐암의 발병 또는 진행, 약물 선택에 대한 정보, 약물 저항성 획득여부 평가 및 치료 후 재발 평가, 폐암의 예방 또는 치료에 관련된 정보를 제공하는 것을 의미한다. 예컨대, 폐암 수술 후 약물 치료 중에 본 발명의 방법을 수행하여 약물에 내성을 나타내는 변이 유전자가 검출된 경우에는 그러한 정보를 제공할 수 있으며, 그러한 정보에 따라 치료 약물을 변경할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 수득된 핵산 증폭 산물의 염기 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 염기 서열의 확인은 당업계에 알려진 통상의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 차세대 서열 분석기(next-generation sequencer, NGS), Sequence-based typing(SBT)와 같은 지노타이핑(genotyping), 마이크로어레이(microarray), real time PCR 등이 있으니 이에 제한되지 않는다.
한편, 달리 기술되지 않는 한, 본 명세서에서 정의된 용어는 가장 넓은 의미로 해석되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. KRAS_Q61H 돌연변이 검출 민감도 확인
먼저, 민감도 확인에 필요한 표준 양성 대조군 시료를 준비하기 위해, KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이를 지니는 폐암 세포주인 H460 세포주에서 순수 분리한 DNA를, 해당 유전자에 대해 정상 염기서열을 지니는 세포주인 Beas2B 세포주에서 순수 분리한 DNA로 점차적으로 희석하여, H460 세포주의 DNA 농도가 100%, 10%, 5%, 1%, 0.5%, 및 0%가 되도록 준비하였다.
그 후, KRAS 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 1) 및 역방향 프라이머(서열번호 2), 및 ii) KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(서열번호 3)를 KRAS_Q61H 변이 유전자 증폭용 조성물로 준비하였다.
DNA 농도별 준비된 표준 양성 대조군 시료를 이용하여 KRAS_Q61H 변이 유전자 증폭용 조성물이 얼마나 낮은 농도에서까지 KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이를 검출할 수 있는지를 확인하였다. KRAS 유전자에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머만을 이용하는 경우와 KRAS_Q61H 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하는 경우의 KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이 검출 민감도를 비교하였다. 이때, 일반적인 PCR 반응을 통해 합성된 PCR 산물을 이용하여 iPLEX 반응을 함께 수행하여 비교하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 2에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
KRAS_Q61H_Forward ACGTTGGATGCATGTACTGGTCCCTCATTG 1
KRAS_Q61H_Reverse ACGTTGGATGTGGAGAAACCTGTCTCTTGG 2
KRAS_Q61H_MSP ATTCTCGACACAGCAGGTGAY 3
KRAS_Q61H_UEP ATTGCACTGTACTCCTC 4
KRAS 유전자의 61번 코돈 부위를 포함하는 PCR 산물을 합성하기 위해 다음과 같은 조건으로 각 시약을 혼합하였다. 먼저, KRAS_Q61H 유전자에 대한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 변이 유전자 특이적인 프라이머를 각각 0.5 μM 농도가 되도록 혼합한 프라이머 믹스 1.2 ㎕를, 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.5 ㎕, 25 mM MgCl2 0.7 ㎕, 25 mM dNTP 혼합물 0.1 ㎕, HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.5 unit과 3차 증류수를 섞어서 총 3 ㎕ 부피로 맞춰준 후, DNA 농도별 준비된 표준 양성 대조군 시료 2 ㎕를 첨가하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 하기 표 3에 나타내었다.
PCR 조건
94℃ 15 분 1 사이클
94℃ 20 초
(denaturation step)		 25 사이클
56℃ 30 초
(annealing step)
72℃ 60 초(extension step)
94℃ 20 초 20 사이클
62℃ 30 초
72℃ 60 초
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 KRAS 유전자의 Q61H 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 4) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase)과 섞어서 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 하기 표 4에 나타내었다.
PCR 조건
94℃ 30 초 1 사이클
94℃ 5 초 40 사이클
52℃ 5 초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
52℃ 5 초
80℃ 5 초
52℃ 5 초
80℃ 5 초
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응이 완료된 후, 15 ㎕의 증류수와 레진(resin)을 첨가하고 20분간 반응시켜 염 제거 반응을 수행하여 반응을 완료시켰다. 그 후, SpectroChip II에 대략 10 nl 정도를 집적한 후, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, KRAS 유전자에 대한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머만을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우, 전체 시료에서 KRAS_Q61H 돌연변이 염기서열을 지니는 H460 세포주의 gDNA가 5% 이상 존재하는 경우에서만 해당 돌연변이를 확인할 수 있었다. 반면, KRAS_Q61H 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우 H460 세포주의 gDNA가 0.5% 존재하는 경우까지 정확하게 해당 돌연변이를 확인하였다.
상기 두 경우의 PCR 산물 모두, Beas2B 세포주의 DNA 100%인 경우에는 정상 KRAS 유전자만 확인이 되었으며, 주형 DNA를 넣지 않은 water only의 경우에는 KRAS 유전자의 PCR 산물이 합성되지 않아, 정상 및 돌연변이 모두 나타나지 않았다.
실시예 2. 프라이머 혼합 농도비에 따른 KRAS_G13D 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, KRAS 유전자의 G13D 돌연변이를 지니는 HCT-15 세포주에서 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 HCT-15 세포주의 DNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, KRAS 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 22) 및 역방향 프라이머(서열번호 21), ii) KRAS 유전자의 G13D 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 25)를 이용하여 KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1(0.24 μM: 0.24 μM), 1:2(0.12 μM: 0.24 μM), 1:3(0.08 μM: 0.24 μM), 1:4(0.06 μM: 0.24 μM), 1:5(0.048 μM: 0.24 μM), 1:6(0.04 μM: 0.24 μM), 1:7(0.034 μM: 0.24 μM), 1:8(0.03 μM: 0.24 μM), 1:9(0.027 μM: 0.24 μM), 및 1:10(0.024 μM: 0.24 μM) 농도비로 혼합하여 KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 5에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
KRAS_G13D_Reverse ACGTTGGATGTAGCTGTATCGTCAAGGCAC 21
KRAS_G13D_Forward ACGTTGGATGTAAGGCCTGCTGAAAATGAC 22
KRAS_G13D_MSP ACGTTGGATGTGTGGTAGTTGGAGCTGGGGA 25
KRAS_G13D_UEP AGGCACTCTTGCCTACG 24
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 하기와 표 6과 같은 농도비로 제조하였다.
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 .
10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 0.325 ㎕
25 mM dNTP 0.1 ㎕
KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
상기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 하기 표 7과 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
PCR 조건
94℃ 15 분 1 사이클
94℃ 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
60℃ 30 초
(annealing step)
72℃ 60 초(extension step)
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃ 에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃ 에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 KRAS 유전자의 G13D 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 24) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 하기 표 8에 나타내었다.
PCR 조건
94℃ 30 초 1 사이클
94℃ 5 초 40 사이클
52℃ 5 초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
52℃ 5초
80℃ 5 초
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 4a 내지 도 4e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1 내지 1:2의 농도비로 혼합하여 KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 야생형(WT) 및 돌연변이(MT) 모두에서 안정적으로 피크가 검출되었고, 특히 1:1의 농도비에서 피크가 가장 안정적으로 나타났다. 이에, 1:1의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% MT에서는 UEP가 감소하며 MT가 증가하였다(도 4f 내지 도 4h).
실시예 3. EGFR_C797S 돌연변이 검출 민감도 확인
실시예 3.1. PCR 온도 조건에 따른 EGFR_C797S 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, 변이체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency, VAF)값이 7%로 확인된 EGFR 유전자의 C797S 돌연변이를 지니는 환자 검체로부터 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 환자 검체로부터 얻은 DNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, EGFR 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 18) 및 역방향 프라이머(서열번호 17), ii) EGFR 유전자의 C797S 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 19)를 이용하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:0(0.12 μM: 0μM), 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 9에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
EGFR_C797S_Reverse ACGTTGGATGTACTGGGAGCCAATATTGTC 17
EGFR_C797S_Forward ACGTTGGATGCAGCTCATCACGCAGCTCAT 18
EGFR_C797S_MSP ACGTTGGATGTCACGCAGCTCATGCCCTTCGTCA 19
EGFR_C797S_UEP GGACATAGTCCAGGAGGC 20
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6과 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 하기 표 10 내지 표 12의 세 가지 조건으로 PCR을 수행하였다.
PCR 조건
94℃ 15 분 1 사이클
94℃ 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
56℃, 30 초
(annealing step)
72℃ 60 초(extension step)
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
PCR 조건
94℃ 15 분 1 사이클
94℃ 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
60℃, 30 초
(annealing step)
72℃ 60 초(extension step)
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
PCR 조건
94℃ 15 분 1 사이클
94℃ 20 초
(denaturation step)		 45 사이클
64℃, 30 초
(annealing step)
72℃ 60 초(extension step)
72℃ 3 분 1 사이클
12℃ 고정(Hold)
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 EGFR 유전자의 C797S 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 20) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다. 반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 표 10(56℃) 및 표 11(60℃)의 조건에서 정방향 프라이머와 MSP를 1:1 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이가 확인되었다. 반면, 표 12의 조건(64℃)에서 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이가 확인되지 않았다. 즉, 표 10(60℃)의 조건에서는 1:1, 1:2 또는 1:3 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 사용한 경우에 돌연변이가 확인되었고, 표 9(56℃) 및 표 11의 조건(64℃)에서는 1:2 또는 1:3 농도비로 혼합한 경우에 돌연변이가 확인되었다.
실시예 3.2. MgCl 2 농도에 따른 EGFR_C797S 돌연변이 검출 민감도 확인
실시예 3.1과 동일하게 VAF값이 7%로 확인된 EGFR 유전자의 C797S 돌연변이를 지니는 환자 검체로부터 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA를 이용하여 환자 검체로부터 얻은 DNA 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, EGFR 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 17) 및 역방향 프라이머(서열번호 18), ii) EGFR 유전자의 C797S 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 19)를 이용하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:0(0.12 μM: 0μM), 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6(MgCl2: 3.5 mM), 하기 표 13(MgCl2: 2.7 mM) 및 표 14(MgCl2: 1.875 mM)과 같은 농도비로 제조하였다.
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 0.1625㎕
10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 0.1625 ㎕
25 mM dNTP 0.1 ㎕
KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
iPLEX-PCR mixture 조성 1X
3차 증류수 0.325 ㎕
10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.625 ㎕
25 mM MgCl2 -
25 mM dNTP 0.1 ㎕
KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물 1.2 ㎕
HotStarTaq 중합효소(Qiagen) 0.1 ㎕
시료 2.65 ㎕
총 부피 5 ㎕
시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 상기 표 10의 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 EGFR 유전자의 C797S 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 20) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다.
이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 표 6(MgCl2: 3.5 mM)의 조건에서 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1, 1:2 또는 1:3 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이가 확인되었다. 표 13(MgCl2: 2.7 mM)의 조건에서 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:2 또는 1:3 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이에 대한 민감도가 높은 것을 확인되었다.
반면, 표 14(MgCl2: 1.875 mM) 조건에서 1:1 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이가 확인되지 않았으며, 1:2 또는 1:3 농도비로 혼합한 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 해당 돌연변이에 대한 민감도가 높지 않은 것을 확인되었다.
실시예 3.3. 프라이머 혼합 농도비에 따른 EGFR_C797S 돌연변이 검출 민감도 확인
상기 실시예 3.1에서와 같이 민감도 확인에 필요한 시료를 준비하고, EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 서열번호 18의 정방향 프라이머와 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)를 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM), 1:4(0.03 μM: 0.12 μM), 1:5(0.024 μM: 0.12 μM), 1:6(0.02 μM: 0.12 μM), 1:7(0.017 μM: 0.12 μM), 1:8(0.015 μM: 0.12 μM), 1:9(0.013 μM: 0.12 μM), 및 1:10(0.012 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6에 기재된 바와 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 2의 표 7에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 EGFR 유전자의 C797S 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 20) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 7a 내지 도 7e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:2 내지 1:6의 농도비로 혼합하여 EGFR_C797S 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 특히, 1:3의 농도비에서 UEP 소모량이 가장 높아서 안정적인 반응을 보였다. 이에, 1:3의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% MT에서는 UEP가 감소하며 MT가 증가하였다(도 7f 내지 도 7h).
실시예 4. 프라이머 혼합 농도비에 따른 EGFR_E746_A750del 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, 변이체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency, VAF)값이 7%로 확인된 EGFR 유전자의 E746_A750del 돌연변이를 지니는 환자 검체로부터 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 환자 검체로부터 얻은 DNA(mutation) 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, EGFR 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 28) 및 역방향 프라이머(서열번호 27), ii) EGFR 유전자의 E746_A750del 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 29)를 이용하여 EGFR_E746_A750del 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM), 1:4(0.03 μM: 0.12 μM), 1:5(0.024 μM: 0.12 μM), 1:6(0.02 μM: 0.12 μM), 1:7(0.017 μM: 0.12 μM), 1:8(0.015 μM: 0.12 μM), 1:9(0.013 μM: 0.12 μM), 및 1:10(0.012 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 EGFR_E746_A750del 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 15에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
EGFR_E746_A750del_Reverse ACGTTGGATGTCGAGGATTTCCTTGTTGGC 27
EGFR_E746_A750del_Forward ACGTTGGATGGATCCCAGAAGGTGAGAAAG 28
EGFR_E746_A750del_MSP ACGTTGGATGAATTCCCGTCGCTATCACGA 29
EGFR_E746_A750del_UEP TTGGCTTTCGGAGATGT 30
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6에 기재된 바와 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 2의 표 7에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 EGFR 유전자의 E746_A750del 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 30) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 8a 내지 도 8e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1 내지 1:5의 농도비로 혼합하여 EGFR_E746_A750del 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 야생형(WT) 및 돌연변이(MT) 모두에서 안정적으로 피크가 검출되었고, 특히 1:5의 농도비에서 피크가 가장 안정적으로 나타났다. 이에, 1:5의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% MT에서는 UEP가 감소하며 MT가 증가하였다(도 8f 내지 도 8h).
실시예 5. 프라이머 혼합 농도비에 따른 KRAS_G12V 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, 변이체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency, VAF)값이 7%로 확인된 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이를 지니는 환자 검체로부터 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 환자 검체로부터 얻은 DNA(mutation) 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, KRAS 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 43) 및 역방향 프라이머(서열번호 44), ii) KRAS 유전자의 G12V 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(MSP)(서열번호 45)를 이용하여 KRAS_G12V 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM), 1:4(0.03 μM: 0.12 μM), 1:5(0.024 μM: 0.12 μM), 1:6(0.02 μM: 0.12 μM), 1:7(0.017 μM: 0.12 μM), 1:8(0.015 μM: 0.12 μM), 1:9(0.013 μM: 0.12 μM), 및 1:10(0.012 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 KRAS_G12V 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 16에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
KRAS_G12V_Forward ACGTTGGATGTTTATTATAAGGCCTGCTGAAAATG 43
KRAS_G12V_Reverse ACGTTGGATGATTGTTGGATCATATTCGTCCAC 44
KRAS_G12V_MSP ACTTGTGGTAGTTGGAGCAGT 45
KRAS_G12V_UEP CACTCTTGCCTACGCCA 46
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6에 기재된 바와 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 2의 표 7에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 KRAS 유전자의 G12V 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 46) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 9a 내지 도 9e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:5 내지 1:7의 농도비로 혼합하여 KRAS_G12V 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 야생형(WT) 및 돌연변이(MT) 모두에서 안정적으로 피크가 검출되었고, 특히 1:5의 농도비에서 WT의 피크가 가장 안정적으로 나타났을뿐만 아니라 multiplex PCR 과정에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않았다. 이중, 1:5의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% MT에서는 UEP가 감소하며 MT가 증가하였다(도 9f 내지 도 9h).
실시예 6. 프라이머 혼합 농도비에 따른 BRAF_V600E 돌연변이 검출 민감도 확인
민감도 확인에 필요한 시료를 준비하기 위해, 변이체 대립유전자 빈도(Variant Allele Frequency, VAF)값이 7%로 확인된 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이를 지니는 환자 검체로부터 얻은 gDNA를 Seraseq Wild type DNA와 혼합하여 환자 검체로부터 얻은 DNA(mutation) 농도가 0.5%가 되도록 준비하였다. 이 때, DNA 농도는 11.5 ng/㎕로 만들어 2.65 ㎕를 덜었을 때 30 ng 정도의 DNA가 각 웰에 주입되도록 하였다. 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.65 ㎕(30 ng DNA)의 시료를 각 웰에 넣어주었다.
그 후, BRAF 유전자에 대한 i) 정방향 프라이머(서열번호 39) 및 역방향 프라이머(서열번호 40), ii) BRAF 유전자의 V600E 돌연변이에 대한 변이 유전자 특이적인 프라이머(서열번호 41)를 이용하여 BRAF_V600E 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다. 이때, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:1(0.12 μM: 0.12 μM), 1:2(0.06 μM: 0.12 μM), 1:3(0.04 μM: 0.12 μM), 1:4(0.03 μM: 0.12 μM), 1:5(0.024 μM: 0.12 μM), 1:6(0.02 μM: 0.12 μM), 1:7(0.017 μM: 0.12 μM), 1:8(0.015 μM: 0.12 μM), 1:9(0.013 μM: 0.12 μM), 및 1:10(0.012 μM: 0.12 μM) 농도비로 혼합하여 BRAF_V600E 변이 유전자 증폭용 조성물을 준비하였다.
상기 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 변이 유전자 특이적인 프라이머와 하기 사용될 UEP 프라이머의 염기서열 정보는 하기 표 17에 나타내었다.
프라이머 서열정보 서열번호
BRAF_V600E_Forward ACGTTGGATGTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAA 39
BRAF_V600E_Reverse ACGTTGGATGAGCCTCAATTCTTACCATCCA 40
BRAF_V600E_MSP CTGTGATTTTGGTCTAGCTACGGA 41
BRAF_V600E_UEP CCCACTCCATCGAGATTTC 42
상기 시료를 제외한 PCR 혼합물을 실시예 2의 표 6에 기재된 바와 같은 농도비로 제조하였다. 시료를 제외한 PCR 혼합물을 준비해둔 384-웰-플레이트에 각 웰당 2.35 ㎕씩 넣어 총 부피가 5 ㎕가 되도록 하였다. 그 후, 실시예 2의 표 7에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
상기 PCR 반응을 통해 합성한 5 ㎕의 PCR 산물에, SAP(Shrimp Alkaline Phosphatase) 혼합물(Sequenom) 2 ㎕를 추가하고 37℃에서 40분 반응시켜, PCR 산물 합성에 사용되지 않고 남아있는 dNTP(deoxy nucleotide triphosphate) 혼합물을 비활성화 시켰다. 그 후, 85℃에서 5분 가열반응시켜 SAP 효소를 비활성화시켰다. 7 uM 농도의 BRAF 유전자의 V600E 돌연변이 염기서열 직전까지 상보적으로 결합하는 UEP 프라이머(Unextended primer, 서열번호 42) 1.2 ㎕를 iPLEX-Pro kit 혼합물(Sequenom, 0.1 ㎕ iPLEX Termination mix, 및 0.0205 ㎕ Thermosequenase), 10X PCR 완충용액(Qiagen) 0.2 ㎕ 및 3차 증류수 0.48 ㎕과 섞어서 총 2 ㎕ 추가하여 다시 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건을 실시예 2의 표 7과 동일하게 진행하였다.
반응이 완료된 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로, MALDI-ToF 장비를 이용하여 분자량 차이를 확인하였으며, 이를 통해 단일확장된 염기서열이 정상 염기서열인지, 아니면 돌연변이 염기서열인지를 확인하였다. 그 결과, 도 10a 내지 도 10e로부터 알 수 있는 바와 같이, 상기 정방향 프라이머와 MSP를 1:3 내지 1:5의 농도비로 혼합하여 BRAF_V600E 변이 유전자 증폭용 조성물을 이용하여 합성한 PCR 산물의 경우에 양호한 민감도를 나타내었음을 확인하였다. 이러한 비율의 경우, 야생형(WT) 및 돌연변이(MT) 모두에서 안정적으로 피크가 검출되었고, 특히 1:3의 농도비에서 피크가 가장 안정적으로 나타났다. 이에, 1:3의 농도비를 채택하여 위와 동일하게 3회 반복 실험한 결과, 3회 실험 모두에서, WT에서는 돌연변이가 검출되지 않았고 0.5% MT에서는 UEP가 감소하며 MT가 증가하였다(도 10f 내지 도 10h).
<110> GenoPeaks Co. Ltd. <120> LUNG CANCER GENE MUTATION-SELECTIVE AMPLIFICATION METHOD WITH ULTRA-HIGH SENSITIVITY AND COMPOSITION THEREFOR <130> KC21648 <150> KR 10-2020-0168965 <151> 2020-12-04 <160> 47 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H_Forward <400> 1 acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H_Reverse <400> 2 acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H_MSP <400> 3 attctcgaca cagcaggtga y 21 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_Q61H_UEP <400> 4 attgcactgt actcctc 17 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_G719A/EGFR_E709K/EGFR_G719D_Reverse <400> 5 acgttggatg agggacctta ccttatacac c 31 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_G719A/EGFR_E709K/EGFR_G719D_Forward <400> 6 acgttggatg agtggagaag ctcccaacca 30 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_G719A_MSP <400> 7 aataaatcat aacgtgccga acgcaccggg gg 32 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_G719A/EGFR_G719D_UEP <400> 8 caaaagatca aagtgctgg 19 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750delELREA/EGFR_L747_P753>S_Reverse <400> 9 acgttggatg agcagaaact cacatcgagg 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750delELREA/EGFR_L747_P753>S_Forward <400> 10 acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750delELREA_MSP <400> 11 aataaatcat aaccttgttg gctttcggag atgctt 36 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750delELREA_UEP <400> 12 aaaattcccg tcgctatcaa 20 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L747_P753>S_MSP <400> 13 acgttggatg cccgtcgcta tcaaggattc 30 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L747_P753>S_UEP <400> 14 gatttccttg ttggctttcg 20 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E709K_MSP <400> 15 acgttggatg gctctcttga ggatcttgag ga 32 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E709K_UEP <400> 16 ttgatctttt tgaattcagt tt 22 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_C797S_Reverse <400> 17 acgttggatg tactgggagc caatattgtc 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_C797S_Forward <400> 18 acgttggatg cagctcatca cgcagctcat 30 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_C797S_MSP <400> 19 acgttggatg tcacgcagct catgcccttc gtca 34 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_C797S_UEP <400> 20 ggacatagtc caggaggc 18 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G13V/G13D_Reverse <400> 21 acgttggatg tagctgtatc gtcaaggcac 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G13V/G13D_Forward <400> 22 acgttggatg taaggcctgc tgaaaatgac 30 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G13V_MSP <400> 23 acgttggatg tgtggtagtt ggagctgggg t 31 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G13V/G13D_UEP <400> 24 aggcactctt gcctacg 17 <210> 25 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G13D_MSP <400> 25 acgttggatg tgtggtagtt ggagctgggg a 31 <210> 26 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_G719D_MSP <400> 26 aataaatcat aacgtgccga acgcaccgag gt 32 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750del(frame shift)_Reverse <400> 27 acgttggatg tcgaggattt ccttgttggc 30 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750del(frame shift)_Forward <400> 28 acgttggatg gatcccagaa ggtgagaaag 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750del(frame shift)_MSP <400> 29 acgttggatg aattcccgtc gctatcacga 30 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_E746_A750del(frame shift)_UEP <400> 30 ttggctttcg gagatgt 17 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L858R_Forward <400> 31 acgttggatg agccaggaac gtactggtga 30 <210> 32 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L858R_Reverse <400> 32 acgttggatg aaagccacct ccttactttg c 31 <210> 33 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L858R_MSP <400> 33 acgttggatg gttcaagatc acagattttg gtcg 34 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_L858R_UEP <400> 34 gcacccagca gtttggcc 18 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_T790M_Forward <400> 35 acgttggatg atctgcctca cctccaccgt 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_T790M_Reverse <400> 36 acgttggatg tgttcccgga catagtccag 30 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_T790M_MSP <400> 37 agccgaaggg catgagctga a 21 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_T790M_UEP <400> 38 caccgtgcag ctcatca 17 <210> 39 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_V600E_Forward <400> 39 acgttggatg ttcatgaaga cctcacagta aaaa 34 <210> 40 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_V600E_Reverse <400> 40 acgttggatg agcctcaatt cttaccatcc a 31 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_V600E_MSP <400> 41 ctgtgatttt ggtctagcta cgga 24 <210> 42 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_V600E_UEP <400> 42 cccactccat cgagatttc 19 <210> 43 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G12V/G12D_Forward <400> 43 acgttggatg tttattataa ggcctgctga aaatg 35 <210> 44 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G12V/G12D_Reverse <400> 44 acgttggatg attgttggat catattcgtc cac 33 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G12V_MSP <400> 45 acttgtggta gttggagcag t 21 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G12V/G12D_UEP <400> 46 cactcttgcc tacgcca 17 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_G12D_MSP <400> 47 acttgtggta gttggagcgg a 21

Claims (29)

1) 폐암 관련 변이 유전자를 포함하는 주형 염기서열 중 적어도 하나의 염기에 대해 염기쌍오류(mispairing)인 염기를 포함하는 변이 유전자 특이적인 프라이머(mutation specific primer, MSP); 및
2) 상기 변이 유전자를 포함하는 염기서열의 증폭을 위한 프라이머 세트를 포함하는
폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트 중 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1 내지 1:10인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 동일하게 5'→ 3'방향이거나 3'→ 5'방향인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 유전자 변이는 뉴클레오타이드가 치환, 삽입 또는 결실된 것이거나 점돌연변이(point mutation) 또는 다중 돌연변이(multiple mutation)인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_G719A, EGFR_E746_A750delELREA, EGFR_L747_P753>S, EGFR_E709K, EGFR_C797S, KRAS_G13V, KRAS_G13D, EGFR_G719D, EGFR_E746_A750del(frame shift), EGFR_L858R, EGFR_T790M, BRAF_V600E, KRAS_G12V 또는 KRAS_G12D인 것인, 폐암 관련 변이 유전자 증폭용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 KRAS_G13D이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1 내지 1:2인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 KRAS_G13D이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_C797S이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:2 내지 1:6인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_C797S이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:3인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_E746_A750del이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:1 내지 1:5인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 EGFR_E746_A750del이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:5인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 KRAS-G12V이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:5 내지 1:7인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 KRAS-G12V이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:5인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 BRAF_V600E이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:3 내지 1:5인
조성물.
제2항에 있어서,
상기 폐암 관련 변이 유전자는 BRAF_V600E이고, 상기 하나의 프라이머와 상기 변이 유전자 특이적인 프라이머의 농도비가 1:3인
조성물.
제1항에 있어서,
상기 변이 유전자 특이적인 프라이머는 서열번호 3, 7, 11, 13, 15, 19, 23, 25, 26, 29, 33, 37, 41, 45 또는 47로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 정방향 프라이머를 포함하고, 상기 정방향 프라이머는 서열번호 1, 6, 10, 18, 22, 28, 31, 35, 39 또는 43으로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 역방향 프라이머가 서열번호 2, 5, 9, 17, 21, 27, 32, 36, 40 또는 44로 표시되는 염기서열을 포함하는
조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 MgCl2를 추가로 포함하는
조성물.
제19항에 있어서,
상기 MgCl2의 농도가 2.5 mM 내지 3.5 mM인
조성물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 키트.
제21항에 있어서,
상기 키트는 EGFR_C797S 및 KRAS_G13D 변이 유전자 증폭용 조성물을 포함하는
키트.
제21항에 있어서,
상기 키트는 EGFR_E746_A750del, KRAS_G12V 및 BRAF_V600E 변이 유전자 증폭용 조성물을 포함하는
키트.
개체로부터 수득한 DNA 시료 및 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 혼합하여 핵산 증폭을 수행하는 단계를 포함하는
폐암 진단 또는 치료를 위한 정보를 제공하는 방법.
제24항에 있어서,
상기 핵산 증폭의 산물 내 잔존하는 dNTP를 제거하는 단계; 및
상기 dNTP를 제거한 핵산 증폭 산물에 단일 염기 확장(SBE, single base extension)을 수행하는 단계를 추가로 포함하는
방법.
제24항에 있어서,
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 50℃내지 72℃인
방법.
제24항에 있어서,
상기 핵산 증폭 수행시 혼성화 단계(annealing step)의 온도가 56℃내지 60℃인
방법.
제24항에 있어서,
상기 방법은 핵산 증폭 산물의 염기 서열을 확인하는 단계를 추가로 포함하는
방법.
제28항에 있어서,
상기 염기 서열을 확인하는 단계는 차세대 서열 분석기(next-generation sequencer, NGS), Sequence-based typing(SBT), 마이크로어레이(microarray), 또는 real time PCR을 이용하여 수행되는
방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2013501523A (ja) * 2009-08-11 2013-01-17 レスポンス ジェネティクス，インコーポレイティド Ｂｒａｆ変異の検出に有用な方法、プライマー、プローブ、及びキット
CA2786696C (en) * 2010-01-12 2021-05-25 Jill Detmer Oligonucleotides and methods for detecting pik3ca mutations
AU2012206487A1 (en) * 2011-01-14 2013-07-18 Genefirst Limited Methods, compositions, and kits for determining the presence/absence of a variant nucleic acid sequence
KR101720050B1 (ko) * 2014-02-28 2017-04-20 재단법인 아산사회복지재단 폐암관련 돌연변이 증폭용 프라이머 세트, 및 상기 돌연변이에 상보적인 프로브를 포함하는, 폐암 진단용 키트
KR20150102455A (ko) * 2014-02-28 2015-09-07 재단법인 아산사회복지재단 초고감도 돌연변이 증폭 방법 및 이를 위한 시발체

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