ES2943085T3 - Método para realizar la detección temprana de cáncer de colon y/o de células precursoras de cáncer de colon y para supervisar la recurrencia del cáncer de colon - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un kit para detectar la presencia o ausencia de mutaciones en las regiones seleccionadas de los genes diana asociados con el cáncer colorrectal, que comprende pinzas y cebadores XNA; donde las pinzas XNA son capaces de hibridarse con las regiones seleccionadas que tienen secuencias de tipo salvaje en los genes diana, y los cebadores son capaces de amplificar las regiones seleccionadas que contienen cada una de las mutaciones en los genes diana. La invención también describe un método para detectar un gen mutante asociado con el cáncer colorrectal, que comprende: proporcionar una muestra que contiene ADN y una abrazadera de ácido xenonucleico capaz de hibridar con un gen de tipo salvaje; y detectar un mutante del gen en la muestra con una sonda de ácido xenonucleico capaz de hibridar con el gen mutante. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para realizar la detección temprana de cáncer de colon y/o de células precursoras de cáncer de colon y para supervisar la recurrencia del cáncer de colon

Campo de la invención

El campo de aplicación de la presente invención es el sector médico, en el campo de la Biología Molecular. Más específicamente, la invención se refiere al diagnóstico temprano del cáncer colorrectal y al kit para realizar el diagnóstico. Esta invención puede usarse para el diagnóstico de enfermedades, incluida la detección temprana de cáncer de colon en pacientes. Por lo tanto, la invención también puede incluir aislar ADN a partir de una muestra de heces, sangre periférica fresca (PB, por sus siglas en inglés) y muestra de tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE, por sus siglas en inglés) obtenidos de un paciente del que se sospecha que tiene una afección asociada con mutaciones del cáncer colorrectal.

La invención se refiere además a un kit que comprende dichas abrazaderas XNA y cebadores (es decir, SEQ ID NOs: 22­ 53), y, además, al uso de dicho kit en el análisis mutacional, particularmente en la detección temprana de cáncer de colon y/o células precursoras de cáncer de colon.

Antecedentes de la invención

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica ampliamente utilizada para la detección de patógenos. La técnica usa una polimerasa de ADN utilizada para amplificar un fragmento de ADN mediante replicación enzimática in vitro. El proceso de PCR genera ADN que se utiliza como plantilla para la replicación.

Esto da como resultado una reacción en cadena que amplifica exponencialmente la plantilla de ADN.

Las tecnologías para la detección genómica suelen utilizar sondas de ADN comúnmente para hibridar con secuencias objetivo. Para lograr la sensibilidad requerida, el uso de PCR para amplificar las secuencias objetivo se ha mantenido como una práctica estándar en muchos laboratorios. Si bien la PCR ha sido el método principal para identificar genes asociados con estados de enfermedad, el método ha permanecido confinado al uso dentro de un entorno de laboratorio. La mayoría de las aplicaciones de diagnóstico actuales que se pueden utilizar fuera del laboratorio se basan en el reconocimiento de anticuerpos de proteínas objetivo y utilizan tecnologías basadas en ELISA para señalar la presencia de una enfermedad. Estos métodos son rápidos y bastante robustos, pero pueden carecer de la especificidad asociada con la detección de ácidos nucleicos.

Con el advenimiento del diagnóstico molecular y el descubrimiento de numerosos biomarcadores de ácidos nucleicos útiles en el diagnóstico y tratamiento de afecciones y enfermedades, la detección de secuencias de ácidos nucleicos y variantes de secuencias, mutaciones y polimorfismos se ha vuelto cada vez más importante. En muchos casos, es deseable detectar variantes de secuencia o mutaciones (que en algunos casos pueden diferir en un solo nucleótido) presentes en números bajos de copias frente a un nivel elevado de fondo de secuencias de tipo nativo. Por ejemplo, a medida que se demuestra que cada vez más mutaciones somáticas son biomarcadores para el pronóstico del cáncer y la predicción de la eficacia terapéutica, la necesidad de métodos eficientes y efectivos para detectar mutaciones raras en una muestra se vuelve cada vez más crítica. En el caso de que una o más variantes alélicas este(n) presentes en un número bajo de copias en comparación con las secuencias de tipo nativo, la presencia de un exceso de secuencia objetivo de tipo nativo crea desafíos para la detección de la secuencia objetivo variante menos abundante. Las reacciones de amplificación/detección de ácidos nucleicos casi siempre se realizan utilizando cantidades limitadas de reactivos. Un gran exceso de secuencias objetivo de tipo nativo compite por los reactivos limitantes y los consume. Como resultado, se suprime sustancialmente la amplificación y/o detección de alelos variantes o mutantes raros en estas condiciones, y los métodos pueden no ser lo suficientemente sensibles para detectar las variantes o mutantes raros. Se han intentado varios métodos para superar este problema. Sin embargo, estos métodos no son ideales porque requieren el uso de un cebador único para cada alelo o la realización de un análisis complejo de la curva de fusión. Ambas deficiencias limitan la capacidad y la viabilidad para una detección multiplex de alelos variantes múltiples a partir de una sola muestra.

Además, también se sabe que el cáncer colorrectal es una de las principales causas de muerte en la sociedad occidental. Sin embargo, si se diagnostica a tiempo, puede tratarse eficazmente mediante la extirpación quirúrgica del tejido canceroso. Los cánceres colorrectales se originan en el epitelio colorrectal y, por lo general, no están muy vascularizados (y, por lo tanto, no son invasivos) durante las primeras etapas de desarrollo. Se cree que el cáncer colorrectal resulta de la expansión clonal de una única célula mutante en el revestimiento epitelial del colon o del recto. La transición a un cáncer altamente vascularizado, invasivo y finalmente metastásico que se disemina por todo el cuerpo suele tardar comúnmente diez años o más. Si el cáncer se detecta antes de la invasión, la extirpación quirúrgica del tejido canceroso es una cura eficaz. Sin embargo, el cáncer colorrectal a menudo se detecta sólo cuando se manifiestan síntomas clínicos, como dolor y heces de color negro alquitrán. Generalmente, tales síntomas están presentes sólo cuando la enfermedad está bien establecida, a menudo después de que se ha producido la metástasis, y el pronóstico para el paciente es malo, incluso después de la resección quirúrgica del tejido canceroso. Por lo tanto, la detección temprana del cáncer colorrectal es importante porque la detección puede reducir significativamente su morbilidad.

Los métodos de diagnóstico invasivos, como el examen endoscópico, permiten la identificación visual directa, la extracción y la biopsia de crecimientos potencialmente cancerosos, como los pólipos. La endoscopia es costosa, incómoda, intrínsecamente riesgosa y, por lo tanto, no es una herramienta práctica para evaluar poblaciones para identificar a las personas con cáncer colorrectal. El análisis no invasivo de muestras de heces en busca de características indicativas de la presencia de cáncer o precáncer colorrectal es una alternativa preferida para el diagnóstico temprano, pero no se dispone de ningún método de diagnóstico conocido que logre este objetivo de manera confiable.

Mutaciones genéticas y cáncer colorrectal (CCR)

Vías de señales complejas están implicadas en la patogenia del cáncer colorrectal, como las vías WNT y RAS/RAF/MAPK. Los cambios genéticos y epigenéticos en los componentes de la vía se han estudiado ampliamente en relación con sus funciones en el inicio y desarrollo del CCR. Las mutaciones de KRAS se encuentran en varios cánceres, incluidos el cáncer colorrectal, de pulmón, de tiroides y de páncreas y el colangiocarcinoma. Más del 90 % de las mutaciones de KRAS están ubicadas dentro de los codones 12 y 13 del exón 2, lo que puede conducir a una señalización de crecimiento anormal por parte de la proteína p21-ras. Estas alteraciones en el crecimiento y la división celular pueden desencadenar el desarrollo de cáncer ya que la señalización es excesiva. También se han detectado mutaciones de KRAS en muchos pacientes con cáncer colorrectal.

La proteína Raf quinasa de tipo B (BRAF) es una quinasa de serina/treonina que tiene funciones importantes en la regulación de las vías de señalización de MAP quinasa/ERK, lo que afecta la proliferación celular, la diferenciación y la muerte celular programada. Una mutación BRAF se encuentra comúnmente en muchos cánceres humanos, incluidos el melanoma, el cáncer colorrectal, el cáncer de pulmón y el carcinoma papilar de tiroides. Las mutaciones más comunes en BRAF ocurren en el codón 600, donde una sustitución de aminoácidos en el segmento de activación del dominio de la quinasa crea una forma constitutivamente activa de la proteína. Las mutaciones V600E y V600K se encuentran con mucha frecuencia en el cáncer humano V600E 70-90% y V600K 10-15%. Las mutaciones BRAf generalmente se encuentran en tumores que son de tipo nativo para KRAS.

El gen poliposis adenomatosa coli (APC, por sus siglas en inglés) es un gen supresor de tumores clave y se ha encontrado una mutación de APC en la mayoría de los cánceres de colon. El gen codifica una proteína multidominio que se une a varias proteínas, incluidas -catenina, axina, CtBP, Asefs, IQGAP1, EB1 y microtúbulos. La mayoría (-60 %) de las mutaciones de APC ligadas al cáncer ocurren en una región conocida como la región del grupo de mutaciones (MCR, por sus siglas en inglés) y dan como resultado el truncamiento C-terminal de la proteína. Las mutaciones en el gen supresor de tumores APC dan como resultado la acumulación de catenina que activa la vía de señalización de Wnt, lo que lleva a la tumorigénesis. APC también desempeña funciones en otros procesos celulares fundamentales, como la adhesión y migración celular, la organización de las redes de actina y microtúbulos, la formación del huso y la segregación cromosómica. Las mutaciones en APC provocan la desregulación de estos procesos celulares, lo que lleva al inicio y expansión del cáncer de colon. APC ha sido utilizado como biomarcador para la detección temprana del cáncer de colon.

El gen p-catenina (CTNNB 1 o más bien BCT) también es un componente importante de la vía Wnt. Las mutaciones en los sitios de fosforilación de serina o treonina en el dominio regulador (exón 3, codón 29-48) del gen conducen a la acumulación del producto génico (a-catenina) que activa la vía Wnt.

El documento US 2016/0194691 A1 se refiere al kit de detección de mutaciones QClamp™ KRAS, que se basa en una tecnología de fijación de PCR cuantitativa mediada por XNA para la detección de mutaciones somáticas útiles en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de diversos tumores.

Los autores de Chen, Z. et al. (6 de enero de 2011), "Molecular diagnosis of response to neoadjuvant chemoradiation therapy in patients with locally advanced rectal cancer", J. Am. Coll. Surg. 212: págs. 1008-1017 (City of Hope, Duarte, CA, EE. u U.); realizó una PCR con una abrazadera de PNA para identificar mutaciones en los genes KRAS, p53 y APC, porque estas mutaciones son las aberraciones genéticas comunes que se encuentran en el cáncer colorrectal.

Kwon, MJ et al. (6 de octubre de 2011), "Frequency of KRAS, BRAF and PIK3CA mutations in advanced colorectal cancers: comparison of peptide nucleic acid-mediated PCR clamping and direct sequencing in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue”, Pathol. Res. Pract. 207: pp. 762-768 (Hallym University College of Medicine, Anynag, KR) se refiere a la tecnología de fijación de PCR mediada por PNA para la detección de mutaciones en KRAS, BRAF y PIK3CA antes de la administración de la terapia anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico del cáncer colorrectal metastásico.

Oltedal, S. et al. (15 de mayo de 2011), "Heterogenous distribution of K-ras mutations in primary colon carcinomas: implications for EGFR-directed therapy", Int. J. Colorectal Dis. 26: pp. 1271-1277 (Stavanger University Hospital, Stavanger, NO) revela que se analizaron biopsias de tumores de 158 pacientes con cáncer de colon no metastásico para mutaciones KRAS mediante un ensayo sensible y cuantitativo de PCR con abrazadera de PNA.

WO 2011/093606 A2 se refiere a la detección de mutantes en el gen BRAF usando una sonda PNA para examinar el cáncer colorrectal en las primeras etapas para permitir un tratamiento efectivo a través del diagnóstico temprano del cáncer.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 ilustra el principio de la Prueba de Detección de Mutaciones de la invención.

La Figura 2 muestra las curvas de amplificación de qPCR generadas por el ensayo de la invención en tejido FFPE. Las Figuras 3-6 ilustran los ejemplos de rendimiento de los ensayos con el cebador óptimo, sonda, concentración de XNA y ACt entre tipo nativo (Wt) y mutante.

La Figura 7 muestra la PCR cuantitativa con p-actina para diferentes cantidades de entrada de ADN y demuestra la eficacia de la PCR en el ensayo de la invención.

La Figura 8 ilustra el apareamiento de bases de Watson-Crick de ADN con XNA afín.

La Figura 9 muestra cómo la abrazadera de XNA detecta ADN mutado por debajo del 0,1 %.

Breve descripción de la invención

La invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de un gen mutado conocido contenido en una muestra biológica, comprendiendo dicho método los pasos de: (1) permitir una mezcla de un cebador de abrazadera que consta de XNA que se hibrida con todo o parte de un sitio objetivo que tiene una secuencia de un gen de tipo nativo o una secuencia complementaria al gen de tipo nativo, un cebador capaz de amplificar una región que comprende un sitio objetivo que tiene una secuencia del gen mutado, y la muestra biológica para coexistir en una solución de reacción para la amplificación génica, y amplificar selectivamente la región que comprende un sitio objetivo del gen mutado mediante un método de amplificación génica, y (2) detectar selectivamente una región de detección que comprende el sitio objetivo del gen mutado mediante un método de detección de genes, utilizando un producto amplificado obtenido en el paso (1) o parte del mismo como plantilla, para detectar la presencia o ausencia del gen mutado, donde los genes mutados se seleccionan del grupo que consiste de APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, KRAS 12, KRAS 13 y BRAF V600, y donde las abrazaderas de XNA y los cebadores de la presente invención se seleccionan del grupo que consiste en

SEQ ID NO:22 - ACGACACAGGAAGCAGATT CT.

SEQ ID NO:23 - TCACAGGATCTTCAGCTGACCT,

SEQ ID NO:24 - TTCCAATCTTTTATTTCTGCTATT,

SEQ ID NO:25 - Lys-0-(CTGACCTAGTTCCAATCTTTTCTT) PNA.

SEQ ID NO:26 - TT CAGGAGCGAAAT CT CCC,

SEQ ID NO:27 - T G AAC ATAGT GTT CAGGT G,

SEQ ID NO:28 - 5756-FAM/CAAAAGTGG/ZE N/TGCTTAGACACCCAAAAG.

SEQ ID NO:29 - Lys-0-(AGTGGTGCTCAGACA)PNA,

SEQ ID NO:30 - CCAGATAGCCCTGGACAAACC,

SEQ ID NO:31 - CTTTTCAGCATGTAGGTGCTTTATTTTTA.

SEQ ID NO:32 - AGGTACTT CTCACTT GGTTT,

SEQ ID NO:33 - TAGGTACTTCTCGCTTGGTTT.

SEQ ID NO:34 - ACTTCGGAATCCATTCTGGTGC,

SEQ ID N035 - AGAAAAT CCCT GTT CCCACT CATA,

SEQ ID NO:36 - AGGAAGAGGATGTGGATACCTCCCAAG,

SEQ ID NO:37 - Lys-0-(TGCCACTACCACAGCTC )PNA.

SEQ ID NO:38 - ACTT CT GGAAT CCATT CTGGTGC,

SEC ID NO:39 - AGAAAATCCCTGTTCCCACTCATA,

SEQ ID NO:40 - AGGAAGAGGAT GT GGAT ACCT CCCAAG,

SEQ ID NO:41 - Ac-CTCCTTCTCTGAGTG-NH2,

SEQ ID NO:42 - AAGGCCTGCTGAAAATGACTG,

SEQ ID NO:43 - GTTGGATCATATTCGTCCAC,

SEQ ID NO:44 - T CT GAATT AGCT GT AT CGT CAAGGCACTC,

SEQ ID NO:45 - CTACGCCACCAGCTCCAACTACCA-O-D-Lys,

SEQ ID NO:46 - ACTT GT GGT AGTT GGAGCT GGT,

SEQ ID NO:47 - GTT GGAT CAT ATT CGT CCAC,

SEQ ID NO:48 - TCT GAATT AGCT GT ATCGT CAAGGCACT C,

SEQ ID NO:49 - D-LYS-PEG2-TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCA-NH2,

SEQ ID NO:50 - ACAGT AAAAAT AGGT GATTTTGGT CTAGCT A,

SEQ ID NO:51 - CATCCACAAAATGGATCCAGACAA,

SEQ ID NO:52 - CAAACTGATGGGACCCACTCCATCG, y

SEQ ID NO:53 - ATCGAGATTT CACT GT AGCT AGAC.

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjunto. De acuerdo con la presente invención, el método puede comprender: aislar ADN de una muestra de heces, sangre periférica (PB) fresca, plasma y una muestra de tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) obtenidos del paciente bajo sospecha de tener una afección asociada con mutaciones de cáncer colorrectal; realizar PCR en el ADN extraído para producir ADN amplificado mientras se usa una abrazadera de ácido xenonucleico para bloquear la amplificación del ADN de tipo nativo; secuenciar el ADN amplificado en un secuenciador automático; analizar una salida del secuenciador automatizado para identificar mutaciones en la secuencia.

La invención también proporciona un kit para realizar el método de la presente invención, donde las abrazaderas de XNA y los cebadores también se seleccionan del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 22-53 como se indica arriba.

Descripción de la invención

El método de la presente invención es una PCR en tiempo real basada en un ensayo de diagnóstico in vitro para la detección cualitativa de biomarcadores asociados al cáncer colorrectal o más bien mutaciones seleccionadas de APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, KRAS 12 , KRAS 13 y BRAF V600.

El ensayo de detección de mutaciones de la invención se basa en la tecnología de fijación de PCR mediada por ácido xenonucleico (XNA, por sus siglas en inglés) que utiliza las abrazaderas XNA y los cebadores seleccionados del grupo que consta de las ^s E^q ID NOs: 22-53 como se indica arriba. Los ácidos xenonucleicos (XNA) son polímeros genéticos sintéticos que contienen componentes no naturales como nucleobases alternativas, azúcares o un esqueleto conector con una estructura química diferente. Esta introducción de una selección más amplia de bloques de construcción funcionales podría permitir que las secuencias de XNA participen en una selección más amplia de reacciones químicas que sus equivalentes de ADN o ARN. XNA es un análogo de ADN sintético en el que el esqueleto de fosfodiéster ha sido reemplazado por una repetición formada por unidades de (2-aminoetil)-glicina. Los XNA se hibridan estrechamente con secuencias objetivo de ADN complementarias sólo si la secuencia es una coincidencia completa. La unión de XNA a su secuencia objetivo bloquea el alargamiento de la cadena por la ADN polimerasa. Cuando hay una mutación en el sitio objetivo y, por lo tanto, un desajuste, el dúplex XNA:DNA es inestable, lo que permite la elongación de la cadena por la ^a Dⁿ polimerasa. La adición de un XNA, cuya secuencia con una coincidencia completa con el ADN de tipo nativo, a una reacción de PCR bloquea la amplificación del ADN de tipo nativo, lo que permite la amplificación selectiva del ADN mutante. Los oligómeros de XNA no son reconocidos por las ADN polimerasas y no pueden utilizarse como cebadores en reacciones posteriores de PCR en tiempo real.

La invención se puede usar para realizar la detección temprana y/o supervisar la recurrencia del cáncer de colon y para la detección de células precursoras de cáncer de colon, empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando los cebadores y los oligómeros de abrazadera de ácido xenonucleico (XNA) como se describe arriba (es decir, SEQ ID NOs: 22-53) con el que se pueden llevar a cabo los análisis de mutación en las regiones seleccionadas de los genes APC, K-ras, p-catenina y B-raf como se ha descrito anteriormente (es decir, APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, KRAS 12, KRAS 13 y BRAF V600). La invención también se refiere a un kit que contiene dichos cebadores y oligómeros de abrazadera de ácido xenonucleico (XNA).

Los oligómeros moleculares de ácido nucleico de la presente invención que se hibridan mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick con secuencias de ADN objetivo aún tienen un esqueleto químico modificado. Los oligómeros de ácido xenonucleico (Fig. 8) son muy eficaces para hibridarse con secuencias objetivo y pueden emplearse como abrazaderas moleculares en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativas en tiempo real o como sondas moleculares altamente específicas para la detección de secuencias objetivo de ácido nucleico.

La invención permite una nueva forma de detectar mutaciones somáticas que utiliza las abrazaderas de XNA específicas de secuencia como se describió anteriormente (es decir, las SEQ ID NOs: 22-53) que suprimen la amplificación por PCR del ADN molde de tipo nativo. Las abrazaderas permiten la amplificación por ^p C^r selectiva únicamente de plantillas mutantes, lo que permite la detección de ADN mutante en presencia de un gran exceso de plantillas de tipo nativo de una variedad de muestras que incluyen FFPE, biopsia líquida y muestras de citología tradicionalmente desafiantes, donde las mutaciones se seleccionan del grupo que consta de APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, KRAS 12, KRAS 13 y BRAF V600.

Las abrazaderas moleculares de la presente invención para qPCR son oligómeros sintéticos que contienen A, T, C, G naturales o nucleósidos modificados (de 15 a 25 nt de largo) y tienen un esqueleto hidrofílico y neutro (sin grupo fosfato como PNA) y experimentan hibridación por apareamiento de bases de Watson-Crick. Los beneficios de XNA incluyen la resistencia a cualquier nucleasa conocida, una afinidad de unión mucho mayor ya que la unión al ADN es independiente de la concentración de sal y un gran diferencial de temperatura de fusión (ATm = 15-20 °C) en mononucleótidos (SNP, por sus siglas en inglés) e inserción/deleciones (indeles) (5-7 °C para ADN natural).

El método de la invención utiliza abrazaderas específicas de secuencia (sonda XNA de ácido xenonucleico) que suprime la amplificación por PCR de la plantilla de ADN de tipo nativo y amplifica selectivamente solo la plantilla mutante, donde las mutaciones, las abrazaderas XNA y los cebadores de la presente invención se seleccionan de los grupos que se describen anteriormente (es decir, las SEQ ID NOs: 22-53). El ensayo y los kits de la invención representan una solución rápida y reproducible que emplea un flujo de trabajo simple y máquinas de PCR que se usan comúnmente en laboratorios clínicos y de investigación.

Los ácidos xenonucleicos que se pueden usar en la presente invención incluyen una funcionalidad seleccionada del grupo que consiste en azida, oxaaza y aza. Muchos XNA se divulgan en la solicitud pendiente de EE. UU. No. 15/786,591 presentada el 17 de octubre de 2017 a nombre del Solicitante.

Las muestras biológicas útiles para realizar el ensayo de la invención incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, líquido linfático, suero, plasma, células bucales, sudor, lágrimas, saliva, esputo, cabello, piel, biopsia, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido amniótico, líquido seminal, excreciones vaginales, líquido seroso, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, trasudados, exudados, líquido quístico, bilis, orina, líquidos gástricos, líquidos intestinales, muestras fecales y exudados, aspirados (p. ej., médula ósea, aguja fina, etc.), lavados (p. ej., oral, nasofaríngeo, bronquial, bronquioalveolar, óptico, rectal, intestinal, vaginal, epidérmico, etc.) y/u otras muestras.

Cualquier muestra de tejido o fluido corporal puede usarse como fuente de ácido nucleico para usar en la tecnología, incluidas muestras forenses, muestras archivadas, muestras conservadas y/o muestras almacenadas durante largos períodos de tiempo, por ejemplo, recién congeladas, muestras y especímenes fijados en metanol/ácido acético o fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE). Las moléculas molde de ácido nucleico también se pueden aislar de células cultivadas, como un cultivo celular primario o una línea celular. Las células o tejidos de los que se obtienen los ácidos nucleicos molde pueden infectarse con un virus u otro patógeno intracelular. Una muestra también puede ser ARN total extraído de una muestra biológica, una biblioteca de ADNc, ADN viral o genómico. Una muestra también puede ser ADN aislado de un origen no celular, p. ADN amplificado/aislado que ha sido almacenado en un congelador.

Las moléculas de ácido nucleico se pueden obtener, por ejemplo, mediante extracción de una muestra biológica, por ejemplo, mediante una variedad de técnicas tales como las descritas por Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (ver, por ejemplo, págs. 280-281).

La química XNA-PCR también es la herramienta más fiable y es la única tecnología que proporciona una sensibilidad de detección del 0,1 % o inferior, un nivel que no se puede lograr mediante la PCR digital de gotas y la secuenciación de Sanger. Los ensayos se pueden completar en dos horas para una variedad de muestras, incluidos tumores sólidos (p. ej., tejidos FFPE) y biopsias líquidas (p. ej., ADN tumoral circulante).

Mutaciones interrogadas por cebadores y XNA:

KRAS codón 12 cualquier no sinónimo que no sea GGT de tipo salvaje — > GXT, XGT etc. Gly — > Asp, Ser, Val, Arg, Ala, Cys

KRAS codón 13 - GGC ^ GAC Gly > Asp

BRAF codón 600 GTG ^ GAG, V600E (V600K, D, R o M)

CTNNB1

codón 33 T C T ^ TAT, Ser^ Tyr,

codón 41 ACC > GCC Thr > Ala, ACC > ATC Thr > Ile

codón 45 TCT > CCT Ser > Pro, TCT > TTT Ser > Phe

APC codón 1309 delAAAAG

codón 1367 CAG > TAG Glu > Alto

codón 1450 CGA > TGA Arg > Alto, 7bpdel

codón 1465 delAG

codón 1556 insA, delA

codón 877

TGFBR2 c449_458del p.E150fs

Los cebadores diseñados para amplificar las regiones que contienen cada una de las mutaciones objetivo en los genes objetivo se utilizan junto con oligómeros de abrazaderas de PCR específicos para una secuencia de tipo nativo: ácido nucleico peptídico (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácido nucleico en puente (BNA) o más preferiblemente oligómeros de abrazadera de ácido xenonucleico como se describió previamente (Ref. DiaCarta XNA patente presentada). Se realiza la reacción de PCR y los amplicones resultantes generados se detectan mediante PCR basada en fluorescencia en tiempo real utilizando colorante intercalado verde SYBR o sondas de hidrólisis de 5'-exonucleasa fluorescentes (taqman). Alternativamente, los amplicones se pueden detectar empleando técnicas de captura y detección de hibridación específicas de secuencia y de separación de fase sólida.

Los cebadores específicos de mutaciones genéticas y las reacciones de abrazaderas de PCR se realizan junto con cebadores diseñados para amplificar un gen de mantenimiento como la p-actina (ACTB). El gen de mantenimiento proporciona un medio para supervisar la calidad y la cantidad del ADN de entrada que se obtiene de muestras de biopsia de tejido de cáncer de colon, ADN tumoral libre circulante en el plasma del paciente o ADN tumoral extraído de muestras de heces del paciente.

Ejemplo I

Reactivos para la preparación de muestras de heces.

Mini kit QlAamp ADN Heces. Ca# 51504. Sirve para 50 muestras de heces de 200 mg.

Reactivos de Qiagen para la preparación a gran escala (heces enteras):

Tampón ASL. Ca# 1014755. Tampón AL, Ca# 1014600, Tampón AW1 Ca# 1014792, Tampón AW2 Ca# 1014592, InhibitEx tabletas, Ca# 19590, RNAsa A Ca# 1007885, Proteinasa K Ca#19131.

Nuestro tampón de almacenamiento: NaCl 10 mM, TrisHCl 500 mM pH 9,5, EDTA 100 mM. Tampón de neutralización: MES 1M pH 5,76 (Teknova). Columnas maxi de sílice Spin. Epoch BioSciences (Ca# 2040-050).

Las Dynabeads magnéticas recubiertas de estreptavidina MyOne (Thermo Fisher Scientific, Ca# 00351575) son las mejores para la captura de ADN. Tampón 20XSSC. Centrífuga Beckman Coulter Sorvall con rotor JA25.50 y tubos de centrifugación de 50 ml con tapones de rosca (Ca# 357003). Centrífuga de sobremesa BeckmanCoulter AllegraX-15 con rotor SX4750 para maxicolumnas.

El procedimiento que se describe a continuación es para las heces completas cubiertas con el tampón de almacenamiento agregado por el paciente. Si las heces están congeladas, recomendamos tomar alrededor de 10 piezas de 2 g y agregar 10 volúmenes (20 ml) de tampón ASL a cada pieza. Permita que las heces se descongelen y continúe como se describe. Agregue el volumen mínimo de tampón de almacenamiento a las heces frescas solo para cubrir la superficie de las heces (¡no más!) Mezcle la suspensión con una varilla de vidrio durante unos minutos para que quede más homogénea. Cerrar el recipiente e incubar durante 16-24h a temperatura ambiente.

Determinación de la concentración de heces.

Mezcle las heces y transfiera 2-3 cucharadas de suspensión de heces al tubo cónico graduado de 50 ml para determinar el volumen de una alícuota.

Centrifugar la alícuota a ~ 20000 g durante 5 min. Descartar el sobrenadante y determinar el peso del sedimento.

Ejemplo

Desechar el tubo con el sedimento.

Para iniciar la purificación de ADN a partir de 2 g de heces toma 2 g / 0,55 g/ml = 3,6 ml de las heces líquidas. Para empezar desde 200 mg usar 360 ^l de heces.

Aislamiento de ADN humano a partir de 200 mg de heces en el tampón de almacenamiento.

Este procedimiento es una modificación del protocolo QIAamp de Qiagen. Se recomienda para fines de entrenamiento. Es rápido y se puede realizar con el mini kit de heces de ADN (Ca# 51504). Mezcle las heces líquidas y transfiera 360 | il (200 mg) a un tubo cónico graduado de 15 ml. Agregue 3,6 ml (10 volúmenes) de tampón ASL. Vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 360 |il de tampón MES 1M pH 5,76. Vórtice. Volumen = 4,32 ml Distribuya 2 ml x 2 en dos tubos de centrifugación de 2 ml. Centrifugar a 10000-13000 g durante 5 min en la centrífuga de mesa. Combinar los sobrenadantes en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 1 | il de ARNasa A (100 mg/ml, Qiagen). Mezclar e incubar durante 5 min. Agregue 1 tableta InhibitEx (Qiagen). Vortex durante aproximadamente 1 min hasta que la tableta se disperse por completo. Transfiera toda la mezcla en dos tubos de 2 ml. Centrifugar a 13000 g durante 5 min. Combinar los sobrenadantes en un tubo cónico de 15 ml. Añadir 25|il Proteinasa K. Mezcla. Agregue el mismo volumen de tampón AL. Mezcla. Incubar a 70°C durante 20 min en el baño de agua. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Añadir el volumen de etanol igual al del tampón AL.

Mezcla. Cargue 0,7 ml de mezcla repetidamente en una columna de sílice. (Puede tomar más de 10 cargas. Ver detalles en las instrucciones del kit).

Brevemente:

a) . Realizar cada carga de muestra a 6000 g durante 1 min.

b) . Lavados. 500 |il de tampón AW1 a 6000 g durante 1 min.

500 |il de tampón AW2 a 10000 durante 1 min, dos veces.

c) . Girar la columna seca a 13000 g durante 2 min.

d). Elución Cargue 50-100 ul de tampón AE en la columna de sílice. Incubar durante 1 min. Girar a 13000 g durante 2 min. Aislamiento de ADN humano a partir de 2 g de heces en el tampón de almacenamiento.

Mezcle las heces líquidas y transfiera 3,6 ml (2 g) a un tubo cónico graduado de 50 ml. Añadir 36ml

(10 volúmenes) de tampón ASL. Vórtice. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 3,6 ml de tampón MES 1M pH 5,76. Vórtice. Volumen = 43,2 ml. Transfiera la mezcla a un tubo de centrifugación de 50 ml (Beckman Coulter, Ca# 357003). Centrifugar a 20000 g durante 10 min. Recoja el sobrenadante en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 4 ul de ARNasa A (100 mg/ml, Qiagen). Mezclar e incubar durante 5 min. Agregue 4 ul tabletas InhibitEx (Qiagen). Vortex durante aproximadamente 1 min hasta que las tabletas estén completamente dispersas. Transfiera toda la mezcla a un tubo de centrifugación de 50 ml. Centrifugar a 20000 g durante 10 min. Recoja el sobrenadante en un tubo cónico de 50 ml. Añadir 250 |il de Proteinasa K. Mezclar. Agregue el mismo volumen de tampón AL. Mezclar. Incubar a 70°C durante 20 min en el baño de agua. Enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Añadir el volumen de etanol igual al del tampón AL.

Opción 1:

1. Utilice las microesferas del vial de microesferas del Promega Maxwell® RSC Whole Blood DNA Kit

1.1. Vuelva a suspender la mezcla de perlas en el segundo pozo del cartucho del kit y

1.2. Transfiera todo el contenido de la mezcla de perlas a la solución del paso 3.7

1.3. Incube durante 0,5 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital a velocidad moderada para unir NA a las bolas de unión de NA.

1.4. Tire hacia abajo de las cuentas con el imán (opcional: centrifugar y desechar el sobrenadante). Guarde unos 500 ul de sobrenadante con perlas.

1.5. Transfiera la suspensión de perlas al compartimento de las perlas del cartucho del kit y continúe con el programa específico del kit.

1.6. Utilice un volumen de elución de 150 ul

El ADN está listo para qPCR.

Opcion 2:

Mezcla. Cargue ~20 ml de mezcla repetidamente en una columna de sílice Maxi insertada en un tubo cónico de 50 ml. (Puede tomar más de 5 cargas).

a) Realizar cada carga de muestra a 1850 g durante 3 min en "centrífuga Allegra X-15R, rotor de cubeta SX4750, Beckman Coulter)

b) Lavados. 5 ml de tampón AW1 a 4500 g durante 1 min.

5 ml de tampón AW2 a 4500 g durante 15 min.

d) Elución. Cargue 1 ml de tampón AE en la columna de sílice. Incubar durante 5 min. Girar a 4500 g durante 2 min. Concentración de ADN aislado a partir de 2 g de heces antes de la captura dependiente de la secuencia.

El volumen de ADN eluido de la columna maxi es de unos 700 ul. Desnaturalice el ADN calentando a 95°C durante 5 min. Precipitación de ADN.

Transfiera el ADN a un tubo de centrifugación de 2 ml. Añadir 70 ul de NaCl 5 M 70 ul de NH4Ac 5 N 700 ul de isopropanol. Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Precipitar el ADN por centrifugación a 13000 g durante 15 min en la centrífuga de mesa. Lave el sedimento con EtOH al 70%. Secar el sedimento a 55°C durante 5 min.

Disolver el ADN en 35 ul de Tris 10 mM pH 8,0.

Enriquecimiento del ADN eluido con la sonda 5'-BIO de captura específica del objetivo en las perlas magnéticas.

Coloque 35 ul de ADN eluido en un tubo de 0,2 ml e incube a 95°C durante 2 minutos en un termociclador con la tapa precalentada. Enfriar el tubo en hielo durante 2 minutos. Transfiera el ADN desnaturalizado al nuevo tubo de 0,2 ml. Ensamble la mezcla de hibridación como se muestra en la siguiente tabla.

Realizar hibridación en termociclador a: 95 °C 4 min - 58 °C 1 h.

Prepare las perlas magnéticas durante la hibridación.

Lavado de perlas magnéticas.

Mezcle con vortex las perlas en una botella durante 20 seg. Transfiera 10 |il (10A9 perlas) al fondo del tubo de 0,5 ml. Coloque el tubo en el imán durante 1 min. Retire el líquido que cubre las perlas concentradas. Retire el tubo del imán. Agregue 100 |il de tampón B&W 1X y suspenda las perlas mediante una aspiración suave. Coloque el tubo en el imán. Repita el paso de lavado con 50 |il de B&W 1X. Cubra las perlas con 50 |il de B&W 1X para evitar que las perlas se sequen.

Captura del producto de hibridación en las perlas magnéticas.

Coloque el tubo con las perlas lavadas cubiertas con B&W 1X en el imán y retire el sobrenadante sin perturbar las perlas. Retire el tubo del imán e inmediatamente suspenda las perlas en 10 |il de tampón B&W. Retire la mezcla post hibridación del termociclador. Añadir 7 |il de perlas lavadas. Suspender las perlas con aspiración suave. Coloque los tubos en el agitador durante 2 horas a 1100 rpm. La velocidad de agitación debe ser lo suficientemente alta como para no permitir que se precipiten perlas.

Lavado de perlas con ADN capturado.

Recoger las perlas en el imán. Aspirar el sobrenadante. Suspender perlas en 100 |il de B&W. Repita este paso de lavado con 50 |il de B&W. Repita el paso con perlas de suspensión en 50 |il de NaCl 10 mM TrisHCl 20 mM pH 7,5 (tampón de lavado de alta astringencia).

Elución de ADN de las perlas.

Aspire el tampón de lavado de baja astringencia de las perlas. Suspenda las perlas en 20 |il de 20 ng/|il de poli A u otro portador de homopolímero. Coloque los tubos en el termociclador y caliéntelos a 70°C durante 5 min para eluir el ADN. Coloque el tubo en el imán y recolecte ~ 20 |il de ADN humano capturado.

Secuencias de sondas de captura biotiniladas

KRAS 01S SEQ ID NO: 1

5' -/5Biosg/ GAT ACA GCT AAT TCA GAA TCA TTT TGT GGA CGA ATA TGA TCC AAC AAT AGA GGT AAA TCT TGT TTT AAT ATG CAT ATT ACT GGT GCA GGA CCA TT-3'

BRAF 01S SEQ ID NO: 2

5' -/5Biosg/ AAG TCA ATC ATC CAC AGA GAC CTC AAG AGT AAT AAT ATA TTT CTT CAT GAA GAC CTC ACA GTA AAA ATA GGT GAT TTT GGT CTA GCT ACA-3'

ACTB 02AS SEQ ID NO: 3

5' -/5Biosg/ AGG AAG GAA GGC TGG AAG AGT GCC TCA GGG CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG GTG ATG ACC-3'

APC 01S SEQ ID NO: 4

5' -/5Biosg/ TTG TCA TCA GCT GAA GAT GAA ATA GGA TGT AAT CAG ACG ACA CAG GAA GCA GAT TCT GCT AAT ACC CTG CAA ATA GCA GA-3'

CTNNB 02AS SEQ ID NO: 5

5'-/5Biosg/ GTA AAG GCA ATC CTG AGG AAG AGG ATG TGG ATA CCT CCC AAG

TCC TGT ATG AGT GGG AAC AGG GAT TTT CTC AGT-3'

Ejemplo II

Se proporcionaron 55 muestras ciegas de ADN extraído de plasma y FFPE de pacientes con estado clínico y mutacional conocido en alícuotas de 15 |il en tubos de microcentrífuga. Algunas muestras procedían de tejido tumoral de pacientes con cáncer de colon. Las muestras se etiquetaron del 1 al 55 con el número de ID en los lados de los tubos.

El objetivo de la prueba era la detección de mutaciones en plasma de pacientes con cáncer de colon. Las muestras se accedieron de acuerdo con los Procedimientos de Operación Estándar (SOP, por sus siglas en inglés) de acceso y trazabilidad de muestras.

La cantidad y la preparación para qPCR del ADN se comprobaron mediante qPCR utilizando el amplicón de referencia del control interno del ensayo. A continuación, las muestras se diluyeron en consecuencia y se analizaron utilizando el ensayo. Todas los resultados positivos para cualquiera de las mutaciones objetivo se confirmaron mediante la secuenciación de Sanger de los amplicones.

1. Metodología

Tecnología para la detección de mutaciones

El kit de detección de mutaciones del cáncer colorrectal de la invención se basa en la tecnología de sujeción de PCR mediada por ácido xenonucleico (XNA). El XNA es un análogo de ADN sintético en el que el esqueleto de fosfodiéster ha sido reemplazado por una repetición formada por unidades de (2-aminoetil)-glicina. Los XNA se hibridan estrechamente con secuencias objetivo de ADN complementarias sólo si la secuencia es una coincidencia completa. La unión de XNA a su secuencia objetivo bloquea el alargamiento de la cadena por la ADN polimerasa. Cuando hay una mutación en el sitio objetivo y, por lo tanto, un desajuste, el dúplex XNA:DNA es inestable, lo que permite la elongación de la cadena por la ^a Dⁿ polimerasa. La adición de un XNA, cuya secuencia con una coincidencia completa con el ADN de tipo nativo, a una reacción de PCR bloquea la amplificación del ADN de tipo nativo, lo que permite la amplificación selectiva del ADN mutante. Los oligómeros de XNA no son reconocidos por las ADN polimerasas y no pueden utilizarse como cebadores en reacciones posteriores de PCR en tiempo real. La detección de qPCR está basada en Taqman.

Ensayo qPCR

El ensayo de la invención es una PCR en tiempo real basada en un ensayo de diagnóstico in vitro para la detección cualitativa de cáncer colorrectal - biomarcadores asociados, incluidos APC (codones 1309, 1367, 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600) y CTNNB1 (codones 41 y 45) . El kit de detección identifica la presencia o ausencia de mutaciones en las regiones objetivo, pero no especifica la naturaleza exacta de la mutación. Los kits de detección están diseñados para detectar cualquier mutación en o cerca del sitio del codón indicado sin especificar el cambio de nucleótido exacto.

La Tabla 1 anterior muestra una lista de mutaciones que se encuentran comúnmente en el gen objetivo que puede detectar el kit. El ensayo y el kit deben ser utilizados por profesionales de laboratorio capacitados dentro de un entorno de laboratorio.

Tabla 2 Reactivos e instrumentos utilizados

Materiales necesarios

Reactivos para aislamiento de ADN

Kit de tejido QlAamp DSP DNA FFPE (QIAGEN, Cat. No. 60404) o equivalente

Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (QIAGEN, Cat. No. 55114) o equivalente

Consumibles

Tubos o placas de PCR libres de DNasa de 0,2 ml, microtubos de centrífuga de baja unión libres de nucleasas y puntas de pipeta con barrera contra aerosoles libres de nucleasas.

Equipo

Marcador permanente, instrumento de PCR en tiempo real, pipetas dedicadas* (ajustables) para la preparación de muestras, pipetas dedicadas* (ajustables) para la preparación de la mezcla maestra de ^p C^r , pipetas dedicadas* (ajustables) para la dispensación de ADN molde, microcentrífuga, centrífuga de mesa* con rotor para tubos de 1,5 ml, vortex, gradilla PCR, depósito de reactivos, agua destilada. *Antes de usar, asegúrese de que los instrumentos se hayan mantenido y calibrado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Instrumentos

Los ensayos se han desarrollado y validado en los instrumentos que se muestran en la siguiente tabla. Las plataformas de instrumentos que no figuran en la tabla deben ser validadas por los laboratorios individuales. Se puede obtener orientación para la validación de DiaCarta mediante una solicitud.

Tabla 3. Lista de instrumentos validados con este kit.

Los kits de la invención deben almacenarse a -20 °C inmediatamente después de su recepción, en un congelador a temperatura constante y protegidos de la luz. Cuando se almacena bajo las condiciones de almacenamiento especificadas, el kit es estable hasta la fecha de vencimiento indicada. Se recomienda almacenar los reactivos de PCR (Caja 2) en un área de preamplificación y los controles (Caja 3) en un área de postamplificación (manejo de plantillas de ADN). El kit puede someterse a hasta 6 ciclos de congelación y descongelación sin afectar el rendimiento.

Aislamiento de ADN

El ADN genómico humano debe extraerse de tejido fijado, incrustado en parafina, tejido congelado o plasma antes de su uso. Existen varios métodos para el aislamiento de ADN. Para mantener la coherencia, recomendamos utilizar un kit comercial, como el kit de extracción de ADN de Qiagen (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Núm. de cat. 56404, para muestras incrustadas en parafina; kit DNeasy Blood & Tissue, Núm. de cat. Núm. 69504 o 69506, para muestras de tejido y sangre, kit de ácido nucleico circulante QIAamp, Núm. de cat. No. 55114 para plasma). Siga el procedimiento de aislamiento de ADN genómico según el protocolo del fabricante. Se pueden aislar cantidades suficientes de ADN a partir de bloques FFPE o secciones frescas congeladas, así como del plasma (aprox. 2-10 |ig).

Este ensayo requiere un total de 22,5 a 35 ng de ADN por muestra (2,5 a 5 ng/reacción). Después del aislamiento del ADN, mida la concentración mediante análisis fluorométrico (es decir, Qubit) y diluya a 1,25-2,5 ng/|il. Si utiliza un análisis espectrofotométrico, asegúrese de que el valor A260/A230 sea superior a 2,0 y el valor A260/A280 esté entre 1,8 y 2,0.

Preparación de Reactivos

Un kit de 24 pruebas contiene suficiente material de control para 3 corridas. Descongele todas las mezclas de cebadores y sondas, XNA, control positivo, control negativo WT, agua libre de nucleasas y mezcla maestra de PCR 2X proporcionada. Descongele todas las mezclas de reacción a temperatura ambiente durante un mínimo de 30 minutos. Mezclar con vortex todos los componentes excepto Mezcla maestra de PCR y Mezcla de Primer y sonda durante 5 segundos y realice un centrifugado rápido. La mezcla maestra de PCR y la mezcla de cebador/sonda deben mezclarse suavemente invirtiendo el tubo varias veces. Antes de usar, asegúrese de que cualquier precipitado en la Mezcla maestra de PCR se vuelva a suspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. No deje los componentes del kit a temperatura ambiente durante más de 2 horas. Las reacciones de PCR se preparan en un volumen total de 10 |il/reacción.

La Tabla 4 ^ n de 10 |il.

Para mayor precisión, 2x PCR Mezcla maestra, cebadores y XNA deben pre-mezclarse en mezclas de ensayo como se describe en la Tabla 5 a continuación.

Preparación de mezclas de ensayo

Las mezclas de ensayo deben prepararse justo antes de su uso. Etiquete un tubo de microcentrífuga (no incluido) para cada mezcla de reacción, como se muestra en la Tabla 5. Para cada control y reacción de detección de mutaciones, prepare suficientes mezclas de ensayo de trabajo para las muestras de ADN, un control positivo, un agua libre de nucleasas para el control sin plantilla (NTC) y un control negativo WT, de acuerdo con los volúmenes de la Tabla 5. Incluya reactivos para 1 muestra adicional para permitir un excedente suficiente para la configuración de la PCR. Las mezclas de ensayo contienen todos los componentes necesarios para la PCR excepto la muestra.

Tabla 5. Pre aración de mezclas de ensa o.

El control negativo, el control positivo y el control sin plantilla deben ejecutarse con cada mezcla de reacción, cada vez que se realiza el ensayo.

Control negativo:

• Utiliza ADN genómico humano de tipo nativo disponible comercialmente como plantilla a una concentración de 2,5 ng/pl.

• Sin mutaciones objetivo, unión eficiente por abrazaderas XNA que suprimen la amplificación objetivo.

Control positivo:

• Una mezcla de plantillas mutantes de referencia sintéticas para cada objetivo del ensayo a una frecuencia alélica del 5 % en 2,5 ng/|il de ADN genómico humano WT (hgDNA).

• Las abrazaderas XNA no se unirán, lo que permitirá la amplificación de la plantilla mutante.

• Los controles positivos deben mostrar los valores adecuados en los canales HEX y FAM para que la ejecución sea válida.

Control sin plantilla (NTC):

• Se usa agua libre de nucleasas en lugar de la plantilla.

• No debe observarse amplificación en los canales HEX y FAM, lo que garantiza la ausencia de contaminación durante la configuración del ensayo.

El ensayo de control interno utiliza el gen de mantenimiento ACT-B como gen de referencia para evaluar la calidad del ADN amplificable y demostrar si los reactivos funcionan correctamente. Cuando se evalúa mediante el canal HEX, este control debe generar amplicones de manera eficiente para todas las muestras y controles, excepto NTC, lo que proporciona otra forma de supervisar el rendimiento de los cebadores, las sondas, la polimerasa y la calidad/cantidad del ADN de la muestra.

Utilice siempre placas, tiras o tubos blancos. En el área de preamplificación, agregue 8 |il de la mezcla de ensayo adecuada a la placa o los tubos. En el área de plantilla designada, agregue 2 |il de plantilla a cada pozo.

La Tabla 6 es una configuración de placa sugerida para un solo experimento que analiza 3 muestras desconocidas. Ignore las mezclas de ensayo enumeradas a continuación que no formen parte de su kit. Cuando se hayan agregado todos los reactivos a la placa, selle herméticamente la placa para evitar la evaporación. Centrifugar a 1000 rpm durante 1 minuto para recoger todos los reactivos. Colóquelo en el instrumento de PCR en tiempo real inmediatamente.

Configuración del instrumento

Roche Light Cycler 96 y Light Cycler 480, Bio-Rad CFX 384 y ABI QuantStudio 5

1) Selección de detectores:

i. Utilice 'FAM/HEX' como detector en el ciclo de luz de Roche

ii. Seleccione 'Todos los canales' como formato de detección en Bio-Rad CFX384

iii. Para ABI QuantStudio 5, asigne el objetivo de mutación individual como 'FAM', seleccione todos los objetivos y asígnelos a VIC

2) Configure los parámetros de ciclo como se muestra en la Tabla 7a o la Tabla 7b

3) Empieza la corrida

T l 7 . Pl f rm R h Li h l r Bi -R FX 4 P r m r i l

Tabla 7b. Parámetros de ciclos ABI QuantStudio 5

Evaluación de resultados de PCR en tiempo real

El instrumento de PCR en tiempo real genera un valor de umbral de ciclo (Cq, también llamado Ct) para cada muestra.

Cq es el número de ciclo en el que se detecta una señal por encima del umbral establecido para la fluorescencia. Cuanto menor sea el número de ciclo en la cual la señal se eleva por encima del fondo, más fuerte será la reacción de PCR que representa y mayor será la concentración inicial de la plantilla (**consulte las Directrices de MIQE en Referencias para obtener más información).

• Análisis de datos para Light Cycler 480

Para Light Cycler 480, abra LightCycler480 SW 1.5.1.61 y seleccione el algoritmo Abs Quant/2nd Derivative Max para analizar los datos del archivo de ejecución.

• Análisis de datos para Bio-Rad CFX384

Para BioRad CFX384, abra el archivo de ejecución de qPCR con el administrador de BioRad CFX. En la vista Escala de registro, ajuste el umbral a 100±20 para HEX y 300±60 para FAM. Exporte los datos de Cq a Excel. El ajuste exacto del umbral puede ser diferente para instrumentos individuales.

• Data Analysis for ABI QuantStudio 5

Para el instrumento ABI Quant Studio 5, ajuste el umbral según Tabla 8. El ajuste exacto del umbral puede ser diferente para instrumentos individuales.

Exporte los datos de Cq a Excel. Para cada control o muestra, calcule la diferencia en el valor de Cq entre el ensayo de mutación y el ensayo de control interno de la siguiente manera: Diferencia Cq

(ACq) = Cq del ensayo de mutación - Cq del ensayo control interno

Tabla 8. Umbral recomendado de ABI QuantStudio 5

Evaluación de Controles

Verifique que no se observe amplificación en los controles sin plantilla (NTC) para cada una de las mezclas de reacción. Cq debe ser Indeterminado. Para cada control o muestra, calcule la diferencia en el valor de Cq entre el ensayo de mutación y el ensayo de control externo de la siguiente manera:

Diferencia Cq (ACq) = Cq del ensayo de mutación - Cq del ensayo control interno

Controles negativos y positivos: Para que el ensayo sea válido, el control negativo y el control positivo deben cumplir los criterios de la Tabla 9a y la Tabla 9b.

Tabla 9a. Valores aceptables para controles positivos y controles negativos en Roche Light Cycler 480 y Bio-Rad

CFX384

Ta 5

Evaluación de la validez de los datos de muestra en función de los resultados del control interno

El valor Cq de la mezcla de control interno sirve como indicación de la pureza y concentración de ADN en cada pozo. Por lo tanto, la validez de la prueba puede decidirse por el valor de Cq de la mezcla de control interno. Los valores de Cq de cualquier muestra con la mezcla de control interno deben estar en el rango de 25<Cq<31 (Roche Light Cycler 480 y Bio-Rad CFX 384) o 25<Cq<30 (ABI QuantStudio 5). Si los valores de Cq caen fuera de este rango, los resultados de la prueba deben considerarse inválidos. El experimento debe repetirse siguiendo las recomendaciones de la Tabla 10.

T l 1 . R n nr l in rn l r m r

Puntuación del estado mutacional

Si un valor de Cq es Indeterminado, asigne un Cq de 50 y continúe con el análisis. Las siguientes tablas deben usarse para determinar el estado mutacional en función de los valores de ACq.

Nota: Si el valor de Cq de FAM es 50, el estado mutacional se calificará como "Negativo" independientemente de los valores de ACq.

T l 11. P n i n l ^ m i n l R h Li h l r 4

Tabla 12. Puntuación del estado mutacional de Bio-Rad CFX384

T l 1 . P n i n l m i n l r ABI n i

Diferenciación del estado mutacional de KRAS c12/KRAS c13

La mezcla de reacción de KRAS c12 detecta mutaciones tanto de KRAS c12 como de KRAS c13, mientras que la mezcla de reacción de KRAS c13 detecta solo mutaciones de KRAS c13. Por lo tanto, para diferenciar entre las mutaciones KRAS c12 y KRAS c 13, se debe usar una combinación de resultados de las dos mezclas como se describe en la Tabla 14 a continuación.

Tabla 14. Inter retación del estado mutacional G12/G13

Características de rendimiento del ensayo

Las características de rendimiento del ensayo se establecieron en los instrumentos de PCR en tiempo real Roche LightCycler 96, Roche LightCycler 480, Bio-Rad CFX 384 y ABI QuantStudio 5. Los estudios se realizaron utilizando estándares de referencia genéticamente definidos (ADN genómico y FFPE) de líneas celulares con mutaciones definidas obtenidas de Horizon Discovery (Cambridge, Inglaterra) y estándares de referencia de cfDNA de SeraCare (Massachusetts, EE. UU.). Estas muestras se han caracterizado genéticamente por contener mutaciones heterocigotas u homocigotas en la secuencia codificante de las respectivas regiones objetivo. Estos polimorfismos de un solo nucleótido en las regiones objetivo se han confirmado mediante secuenciación de ADN genómico y/o ddPCR. Las muestras adicionales consistieron en tejido de pacientes con cáncer, muestras de plasma y ADN de donantes sanos normales de tejido y plasma.

Reproducibilidad

La reproducibilidad del ensayo se determinó con niveles analíticos definidos de ADN genómico con estado mutacional y frecuencias alélicas conocidas.

• Para establecer la variación entre lotes, se realizó un estudio de reproducibilidad utilizando tres lotes diferentes de kit. Cada lote se probó en un control de tipo nativo y dos muestras de referencia que contenían cada mutación al 5% y al 1 % de frecuencia alélica en nueve réplicas en los instrumentos Roche LC480 y Bio-Rad CFX 384.

• El %CV entre ensayos se estableció para el mismo lote de reactivos probados en el mismo instrumento por el mismo usuario.

• El %CV intraensayo se estableció mediante la ejecución del kit en muestras de referencia analizadas en réplicas de nueve.

• La variabilidad del operador fue evaluada con un lote de reactivos por dos operadores.

La reproducibilidad se demuestra en función del %CV de los valores de Cq y la tasa de % de mutaciones correctas para todos los ensayos en dos lotes y operadores para instrumentos Roche y Bio-Rad.

Tabla 1 . R m n l r l r r i ilidad

T l 1 . R l r r i ili in r n n R h L 4 .

Los datos intraensayo demostraron una buena reproducibilidad con un %CV bajo (Tabla 16).

Sensibilidad analítica y límite de detección (LOD, por sus siglas en inglés)

Para determinar el límite de detección (LOD) y la sensibilidad analítica del kit, los estudios

se realizaron utilizando diluciones en serie de ADN mutante (referencia FFPE y cfDNA) en el fondo de tipo nativo. El ADN de tipo nativo utilizado para la dilución se obtuvo de FFPE libre de mutantes y plasma humano normal, respectivamente. Las frecuencias alélicas mutantes probadas fueron 1 %, 0,5 % y 0,1 % a niveles de entrada de ADN de 2,5, 5 y 10 ng/reacción. Los números de copias mutantes presentes en el ADN genómico con una frecuencia alélica del 1 %, 0,5 % y 0,1 % a diferentes niveles de entrada de ADN se muestran en la Tabla 17a.

Tabla 17a. Números de co ias de ADN mutantes en diferentes frecuencias alélicas

T l 17. R m n L D rmin iliz n n r r f r n i ADN n mi o

Tabla 17c. Resumen de LOD determinado usando estándares de referencia de cfDNA

Conclusión:

• Todos los objetivos se pueden detectar con una frecuencia alélica del 1 % con una entrada de ADN de 5 ng por reacción de PCR;

• Para muestras de ADN FFPE, se puede detectar una frecuencia de mutación del 0,5 % en APC 1309, APC 1307, APC 1450, CTNNB1 (c41,c45) y KRAS(c12) con una entrada de ADN de 5 ng;

• Para las muestras de plasma cfDNA, se puede detectar una frecuencia de mutación del 0,5 % en APC 1309, APC 1450 y CTNNB 141 con una entrada de 5 ng de ADN;

• L a entrada de ADN recomendada es un mínimo de 5 ng/pozo.

La entrada recomendada de FFPE no debe ser superior a 20 ng/pozo debido a la posible inhibición de la PCR. La entrada de muestra FFPE óptima está entre 25 y 31 Cq del control interno.

Especificidad Analítica

La especificidad analítica del kit se determinó como la decisión correcta de las muestras sin mutación a diferentes concentraciones de plantilla WT. No hubo decisiones falsos positivos hasta para 320 ng de ADNg por pozo y hasta 20 ng de ADN FFPE.

La reactividad cruzada de los ensayos dentro del kit se probó con una o más mutaciones presentes en un control positivo mixto con una frecuencia alélica del 50 %.

Tabla 18. Es ecificidad analítica: reactividad cruzada

Los datos demuestran que el Kit de la presente invención puede identificar correctamente varias mutaciones dentro de una plantilla. Existe reactividad cruzada entre KRAS12 y KRAS13, debido a la proximidad de las mutaciones, que se pueden diferenciar (Consultar la Tabla 13).

Rendimiento clínico del ensayo

La sensibilidad y la especificidad clínicas se probaron en las muestras extraídas de FFPE y plasma de pacientes con diferentes estadios de CCR, desde adenomas normales a avanzados (AA), hasta estadios 1 a 4 de cáncer colorrectal. Una muestra se consideró positiva si al menos una de las mutaciones objetivo resultó positiva en función de los límites presentados en las Tablas 10-12.

Tabla 19. Análisis de muestras clínicas

1 Productos utilizados en este estudio

- Ensayo de detección de cáncer colorrectal qPCR y Kit de la invención

- Prueba de mutación de genotipado QClamp® BRAF (60 muestras), Núm. de cat. DC-10-0066

2 Instrumental utilizado en este estudio

- Instrumento Roche LC480 qPCR

3 SOP utilizados en este estudio

- CL-OPS.0005 Accesión y gestión de muestras

- CL-OPS 0006 Gestión de pruebas de pacientes de laboratorio clínico

- CL-TF.0007 Registro de accesión y seguimiento de muestras de laboratorio clínico DiaCarta - CL-OPS.0013- NA Mediciones con el ensayo Qubit HS dsDNA para ensayos QClamp 4 Resultados informados

Resumen de los resultados de la prueba qPCR se presenta en la Tabla 20 a continuación:

En la columna que enumera las decisiones generales del ensayo (segunda desde la derecha), las muestras resaltadas en verde fueron positivas en verde claro: positivo débil. decisiones negativas - naranja. Dado que las muestras estaban cegadas y se esperaba que la mayoría de ellas se extrajeran del plasma, hemos utilizado decisiones positivas, negativas y positivas débiles debido a los puntos de corte no validados para el tipo de muestra de plasma. La columna también muestra todos los genes que se encontraron positivos/débilmente positivos para las mutaciones objetivo. En total hubo 29 decisiones positivas, 16 decisiones negativas y 10 decisiones positivas débiles.

Las muestras s22, s24, s34, s36, s39, s44, s52 y s55 tenían ADN insuficiente como lo demuestra el Cq del IC superior a 30. Estas muestras se procesaron mediante el ensayo de la presente invención, pero los resultados de estas pruebas deben interpretarse con precaución, especialmente las decisiones negativas en las Muestras s24, s34 y s55.

Los resultados de qPCR de todas las muestras positivas y positivas débiles se confirmaron aún más mediante la secuenciación de Sanger de los amplicones de qPCR. Algunas muestras de BRAF también se analizaron con el kit alternativo BRAF qPCR DiaCarta.

Los resultados se presentan en la última columna a la derecha. De las 49 muestras analizadas para todos los objetivos relevantes, la secuenciación de Sanger no produjo datos satisfactorios para 6 muestras. Se encontró que 2 muestras positivas débiles de BRAF eran negativas (ya sea WT por secuenciación de Sanger o Negativo por el ensayo qPCR DiaCarta alternativo para BRAF c600). Se demostró que varias mutaciones BRAF fuera del V600E estaban presentes en los otros casos positivos débiles que no cambiaron las decisiones generales para las muestras que portaban estas mutaciones. El 100 % de las decisiones positivas de la presente invención se confirmaron mediante secuenciación de Sanger con los datos disponibles. No se pudieron confirmar 3 decisiones debido a datos deficientes de Sanger.

3 de cada 10 decisiones positivas débiles fueron negativas por Sanger, 5 no produjeron datos de secuenciación o qPCR y 2 decisiones BRAF WP dieron positivo para mutaciones distintas a V600E.

1 Conclusiones:

Los resultados de la prueba demuestran claramente que el ensayo se puede utilizar para detectar mutaciones en las muestras de ADN de CRC extraídas del plasma del paciente. Tan solo 30 ng de ADN son suficientes para proporcionar resultados de prueba, como lo demuestra la tasa de concordancia del 100 % para decisiones positivas con los datos de Sanger disponibles. La mayoría de las muestras con baja cantidad/calidad de ADN son difíciles de analizar, pero pueden identificarse utilizando los datos de control interno.

La tabla anterior muestra el rendimiento del ensayo de muestras FFPE. La sensibilidad de detección de lesiones precancerosas es del 60 % (6 de 10 muestras).

La siguiente tabla compara los detalles técnicos y las características de rendimiento del ensayo de la invención con los ensayos de la técnica anterior.

Ejemplo III

Este ejemplo describe los estudios de viabilidad del Ensayo para la detección cualitativa de mutaciones en genes específicos de APC (codones 1309, 1367, 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600) y CTNNB1 o BCT (codones 41 y 13). 45) genes asociados con eventos iniciadores de cáncer colorrectal.

El ensayo es una prueba de diagnóstico in vitro basada en qPCR en tiempo real diseñada para la detección de mutaciones en APC (codones 1309, 1367, 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600) y CTNNB1 o más bien genes BCT (codones 41 y 45) en ADN extraído de secciones FFPE y muestras de heces humanas.

Dado que las muestras clínicas de pacientes con cáncer contienen con frecuencia trazas de alelo mutante en un gran exceso de ADN de tipo nativo, la tecnología patentada QClamp® XNA-PCR de DiaCarta se emplea en los ensayos Taqman de la presente invención para suprimir la amplificación de alelos WT para mejorar la sensibilidad de detección de mutaciones.

Selección de mutaciones y genes objetivo

Se seleccionó un panel de genes objetivo en función de su frecuencia de mutación en pacientes con cáncer colorrectal en etapa temprana (patente UP 0,172,823 A1 con licencia de la Universidad de Potsdam), ensayos clínicos preliminares realizados por el Dr. Sholttka (publicaciones). Estos biomarcadores tempranos relacionados con el cáncer colorrectal incluyen los genes APC (codones 1309, 1367, 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600), CTNNB1 o BCT (codones 41 y 45) y TGFp (a incluir). Se seleccionó un gen de mantenimiento, la beta-actina (ACTp), como control interno según los datos preliminares de B. Sholttka y porque el ensayo de la competencia (ColoGuard de Exact Sciences) también usa ese mismo gen para el control interno. El ensayo ACTp se utiliza para supervisar la eficiencia de extracción de ADN de la muestra y la presencia de inhibidores de la PCR, así como para proporcionar una forma de cuantificación de la plantilla amplificable en cada pozo de reacción para evitar resultados falsos positivos/negativos.

3.2. Diseño de cebador, sonda y XNA

3.2.1. Los cebadores y las sondas se diseñaron con la herramienta PrimerQuest siguiendo las reglas de diseño de cebadores y sondas de qPCR. Los cebadores se diseñaron con una Tm de 62-64°C mientras que las sondas se diseñaron con una Tm de 66-68°C.

3.2.2. Los tamaños de amplicón se diseñaron por debajo de 150 pb si era posible.

3.2.3. Los cebadores y las sondas se comprobaron in-silico en cuanto a especificidad (BLAST), dímeros de cebador/estructura secundaria (autoDimer) y estructura secundaria de amplicón (M-fold).

3.2.4. Los XNA se diseñaron para estar entre los cebadores directo e inverso o superponer algunas bases con el cebador directo.

3.2.5. Las sondas se diseñaron para ser paralelas (en la misma hebra que) a los XNA y superponerse con el XNA (sondas específicas de mutantes) o ser distales al XNA (sondas específicas de locus).

3.3. Estrategia de selección de diseño

3.3.1. Se realizaron pruebas de optimización de concentración y combinaciones de cebador, sonda y XNA para encontrar las condiciones óptimas para diferenciar los alelos mutantes y WT para cada mutación somática objetivo.

3.3.2. Se prueban varias mezclas maestras de qPCR para encontrar la mejor que proporcione el Ct más bajo y el delta Ct más alto para obtener el mejor rendimiento en la diferenciación de mutantes y WT.

3.3.3. Para una fijación eficiente por parte del XNA, se incluye un paso de hibridación del XNA a 70 °C antes de la unión de los cebadores y las sondas en el programa de ciclos de qPCR. La temperatura de hibridación óptima para cebadores y sondas se probará mediante análisis de gradiente.

4. Materiales y métodos

4.1. Composición de la mezcla de reacción de PCR

Tabla 21. Mezcla de reacción de PCR

1.1. Plantillas de referencia:

CTNNB1 CD 41: IDT gBlock, personalizado

CTNNB1 CD 45: ATCC CCL-247_D1

BRAF C600: BRAF C600 Estándar de referencia (Horizon Cat#: HD238)

KRAS c13: Estándar de referencia KRAS G13D (Horizon Cat#: HD290)

KRAS c12: Estándar de referencia KRAS G12D (Horizon Cat#: HD272)

APC 1309: ATCC CRL-2158_D1

APC 1367: ATCC CRL-2101_D1

APC 1450: ATCCCCL-235_D1

1.2. Instrumentos

Roche LC96 DC2034, Núm. de cat. 05815916001

Roche LC480II DC2035, Núm. de cat. 05015243001

BioRad CFX384 DC2044, Núm. de cat. 4329001

1.1. Reactivos/Kits

Takara Bio Premix Ex Taq (sonda qPCR) mezcla maestra 2X, Clontech/TAKARA, cat. #RR390A SensiFAST Sonda No-ROX mix (2x), Bioline, cat. # BIO-86002

STAT-NAT-DNA-Mezcla (liofilizado), SENTINEL, N.° de cat. #1N001)

KAPA Probe Fast qPCR Mezcla maestra (2x) Universal (Cat. #: KK4703)

SensiFAST Probe No-ROX mix (2x), Bioline, Núm. de cat. BIO-86002

1.2. Software

PrimerQuestT ool/IDT

Autodimer

M-fold

Visor de secuencias CLC 7

1.3. Herramientas basadas en navegador

Explorador del genoma de la UCSC

NCBI

dbSNP

dbVar

COSMIC

1.1. Documentos de referencia de DiaCarta

DDC.0007_ plan de proyecto qPCR de la presente invención

DDC.0006_Requisitos del producto para la prueba multiplex qPCR de la presente invención CO.0001 Desarrollo y comercialización del producto

2. Resultados de la evaluación del diseño

2.1. Selección de mezcla maestra

Basado en pruebas anteriores en mezclas maestras para ensayos de qPCR basados en Taqman, KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2x) Universal fue seleccionada como la mezcla maestra principal para reacciones de qPCR basadas en sondas Taqman para el desarrollo de ensayos de detección de mutaciones. Las siguientes mezclas maestras adicionales se compararon con la mezcla maestra de KAPA:

1) Takara Bio Premix Ex Taq (Probe qPCR) Mezcla maestra 2X, Clontech/TAKARA, Núm. de cat. RR390A

2) SensiFAST Probe No-ROX mix (2x), Bioline, n.° de cat. BIO-86002

3) STAT-NAT-DNA -Mix (liofilizado), SENTINEL, Cat. #1N001)

Tabla 22. Comparación de mezclas maestras para la detección de la mutación del codón 45 de CTNNB1 mediante PCR en tiem o real QClam Ta man

3.1.1. La mezcla maestra liofilizada se puede almacenar y enviar cómodamente a temperatura ambiente, por lo que la mezcla maestra liofilizada Bioline también se evaluó y comparó con la sonda KAPA Fast qPCR

Master Mix (2x) Universal (Tabla 23).

_ _ _ _ _ _ La mezcla maestra Bioline y la mezcla maestra KAPA Probe Fast qPCR (2x) se compararon aún más utilizando muestras con diferente frecuencia de mutación y en diferentes máquinas qPCR (Roche LC 480 frente a BioRad CFX 384). El control está en el canal HEX mientras que todas las mutaciones objetivo están en Fam. Delta Ct se calculó para cada muestra de la siguiente manera: Diferencia de Ct (ACt) = Ensayo de mutación Ct

- Ensayo de control Ct. Los datos se resumieron en la Tabla 24.

3.1.1.

___ __ 5.1. Conclusión de la Selección Master Mix

Bioline master mix y KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2x) Universal son comparables cuando la frecuencia de mutación es del 5 % o superior, mientras que cuando la frecuencia de mutación es inferior (0,5 % o 0,1 % o inferior), KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2x) Universal se desempeñó mejor con respecto a la diferenciación de alelos mutantes y WT. Por lo tanto, KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2x) Universal se utilizará en el ensayo de la presente invención.

5.2. Optimización de la composición del reactivo de ensayo y de las condiciones de termociclado.

5.2.1. Los cebadores para BRAF c600 y KRAS c12, c13 se diseñaron y optimizaron previamente en productos comerciales QClamp SYBR existentes (DC-10-1066, DC-10-0036, DC-10-0039, DC-10-1039, DC-10-0197, DC-10-0169).

5.2.2. Los cebadores APC, CTNNB1, beta-ACT se diseñaron para tener temperaturas de hibridación iguales a las de los pares de cebadores BRAF y KRAS (64 °C para instrumentos Roche y BioRad).

5.2.3. Los gradientes de temperatura de hibridación (60-70 °C) se realizaron utilizando Roche LC96 con KAPA Probe Fast qPCR Master Mix (2x) Universal para encontrar la temperatura de hibridación óptima de cada cebador y sonda objetivo. Los resultados del análisis de gradiente se resumen en la Tabla 25 y la Tabla 26.

Tabla 2 . An li i r i n m r r hi ri i n r r n n in XNA)

Ta l 2 . An li i r i n m r r hi ri i n r r n n n XNA)

5.2.1. Conclusión de la temperatura de hibridación de PCR: Se demostró que las temperaturas de hibridación de 63-64 °C son óptimas para la diferenciación de alelos mutantes y WT para todos los objetivos de ensayo de la invención. 5.2.2. Optimización de las condiciones de ciclo de PCR

Los XNA se emplean en los ensayos de detección de mutaciones Taqman de la invención para suprimir la amplificación wt con el fin de mejorar la sensibilidad de detección de mutaciones. Para una fijación eficiente por parte del XNA, se incluye un paso de hibridación del XNA a 70 °C antes de la unión de los cebadores y las sondas en el programa de ciclos de qPCR. En base al análisis de gradiente de la temperatura de hibridación del cebador y la sonda, las condiciones de termociclado para los ensayos de detección de mutaciones Taqman de la invención se optimizan de la siguiente manera: 5.2.3. 95°C durante 5 min seguido de 50 ciclos de 95°C 20 segundos, 70°C 40 segundos, 64°C 30 segundos y 72°C 30 segundos (adquisición de datos).

5.3. Optimización de las concentraciones de cebadores y sondas

5.3.1. Se llevaron a cabo experimentos de dilución de matriz de cebador y sonda para encontrar las concentraciones óptimas para diferenciar alelos mutantes y WT de genes objetivo.

Tabla 27. Concentraciones de cebador ro orción de cebador a sonda analizada:

5.3.1. El uso de XNA combinado con una concentración limitada de cebador/sonda dio como resultado una amplificación de fondo de WT menor o nula para sondas específicas de locus seleccionadas. Los resultados de la optimización de las concentraciones de cebador, sonda y XNA se resumen en las Tablas 28 - 36.

Tabla^ 2. Ti l i n XNA r l n TNNB1 41 n r n 2 nM1 nm n LC 96

T l . Ti l i n r n XNA r l n TNNB 1 4 n L

Tabla 1. Ti l i n XNA r l n BRAF n r n 1 nM nM n LC 96

Tabl . Ti l i n XNA r l n KRA n12 n r n 4 nM2 nM n LC96

T l 4. Ti l i n r n r l n KRA 12 n L 4

3.1.2.

Ta 96

Tabla 36. Titulación KRAS c13 XNA con cebador/sonda 200-100 nM/100-50 Nm en LC480

5.3. Concentraciones optimizadas de cebador y sonda

5.3.1. Las concentraciones óptimas son cebador 0,1 uM y sonda 0,05 uM para diferenciar mutantes y WT de CTNNB1 c45, BRAF c600 en Roche LightCycler 96, Roche LightCycler480 y BioRadCFX384.

5.3.2. Para CTNNB1 c41, 0,2 um de cebador y 0,1 um de sonda son óptimos para diferenciar alelos mutantes y WT en Roche Light Cycler 96, Roche Light Cycler 480.

5.3.1. Para KRAS12 y 13, 0,4/0,2 um de cebador y sonda son óptimos para diferenciar mutantes y WT en LC 96, 0,2 um de cebadores y 0,1 um de sonda son óptimos para diferenciar mutantes y WT en LC 480 y BioRad CFX384.

5.3.2. En general, el uso de cebadores limitados y concentración de sondas específicas de locus (100 Nm a 200 Nm/50 a 100 nM) da como resultado una amplificación de fondo de WT menor o nula con XNA. Concentración de cebador/sonda por encima de 0,4/0,2 um normalmente dan como resultado una amplificación de fondo de WT con XNA. El uso de una concentración limitada de cebador/sonda combinado con XNA dará como resultado una amplificación de fondo de WT menor o nula para las sondas específicas de locus seleccionadas.

5.4. Optimización de la concentración de XNA con cebadores-sondas

5.4.1. Los cebadores y las sondas se seleccionaron para diferenciar alelos mutantes y WT en presencia de XNA. Para la optimización, se utilizaron la titulación XNA y la concentración limitada de cebador y sonda (100 Nm a 200 nM/50 a 100 nM).

5.4.2. Los siguientes cebadores se seleccionaron mediante el ensayo SYBR para encontrar los pares de cebadores que dan como resultado el mejor ACt entre los alelos mutantes y WT (Tablas 37-39).

T l . r l i n r B T 41 B T 4.

Se ejecutó una matriz de cebador/XNA para encontrar las concentraciones óptimas de cebador/XNA que dieron el mejor diferencial entre WT y 5% MT de BCT c41. El análisis de la matriz de cebador/XNA se resumió en la Tabla 40.

T l 4. An li i ^ m rii l XNA ^ n nr i n r r B T 41.

5.3.1. Para las otras mutaciones específicas, incluidas BRAF V600 y KRAS c12 y c13, los pares de cebadores que se usaron en los kits DiaCarta Qclamp SYBR de los ensayos BRAF y KRAS c12 y KRAS c13 también se usaron en el desarrollo de la sonda Taqman basada en BRAF y KRAS c12 y Ensayos de detección de mutaciones KRAS c13.

5.3.2. Las combinaciones y concentraciones de cebador, sonda y XNA que dieron como resultado el delta Ct más alto (medido como la diferencia entre Cts del ensayo de detección de mutaciones para las muestras WT y 5%Mut) se seleccionaron para cada ensayo de detección de mutaciones objetivo.

5.3.3. Los siguientes cebadores y sondas y XNA mostraron el mejor rendimiento con respecto a la diferenciación de alelos mutantes y WT. Para obtener más detalles sobre la detección de cebadores mediante el ensayo SYBR, consulte el archivo adjunto a este documento.

T l 41. N m r r n XNA l i n r l nfi r i n fin l l n :

Tabla 42. Com osición final del ensa o de la invención

5.3. Ejemplos de curvas de amplificación para la configuración final de los ensayos de la invención

5.3.1. Las siguientes figuras ilustran los ejemplos de rendimiento que presentan los ensayos de la invención con cebador, sonda, concentración de XNA y ACt óptimos entre Wt y mutante.

5.3. Validación analítica preliminar para la presente invención

En base a los experimentos en cada uno de los cebadores objetivo de la invención, sonda y combinación y titulación de XNA, se obtuvieron condiciones óptimas para cada ensayo de detección de mutación objetivo como se enumera en la Tabla 22 y se ilustra en las figuras anteriores. Los ensayos finalizados de la invención se evaluaron para determinar la especificidad, la sensibilidad y la reproducibilidad de la prueba.

5.3.1. Exactitud

Se probó un conjunto de líneas celulares con un estado de mutación conocido para evaluar la precisión del ensayo de la invención. Los ensayos de la invención se realizaron en el instrumento Roche LC 96. Solo se detectaron mutaciones esperadas en todas las líneas celulares analizadas.

Tabla 43. Pruebas CTNNB1 c41, CTNNB1 c45, KRAS c12, KRAS c13 y BRAF c600 en líneas celulares con estado de mutación conocido.

5.3.1. Sensibilidad analítica

La sensibilidad analítica se determinó analizando muestras de ADN con una dilución en serie de ADN en ADN de tipo nativo. Los ensayos de detección de mutaciones se realizaron en muestras de ADN con 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 % de mutación de ADN de tipo nativo en el fondo, respectivamente. Se determina el porcentaje más bajo de ADN mutado en el fondo de tipo nativo que se puede detectar. Al menos el 0,5 % del ADN mutado en el fondo de tipo nativo puede detectarse mediante los ensayos Taqman de la invención (consulte la Tabla 18) y la Tabla 19.

Tabla 44. Ensayos de detección de mutaciones de la invención de ADN de mutación diluido en ADN tipo nativo (5 %, 1 %, 0,5 % y 0,10 %) con ciclos de PCR de 40 y análisis de datos de archivos de ejecución utilizando el algoritmo Abs Quant/Fit Points. El control está en el canal HEX mientras que todas las mutaciones objetivo están en Fam. Delta Ct se calculó para cada muestra de la siguiente manera: Diferencia de Ct (ACt) = Ct de ensayo de mutación - Ct de ensayo de control.

Tabla 45. Sensibilidad de la invención Ensa os de detección de mutaciones.

ADN mutante diluido en ADN WT al 5 %, 1 % y 0,10 %. 50 ciclos de PCR y análisis de datos de archivos de ejecución utilizando el algoritmo Abs Quant/2nd derivada max. El control está en el canal HEX mientras que todas las mutaciones objetivo están en FAM. Delta Ct se calculó para cada muestra de la siguiente manera: Diferencia de Ct (ACt) = Ct de ensayo de mutación - Ct de ensayo de control.

5.3.1. Precisión del ensayo

La reproducibilidad (precisión) de los ensayos de la invención se demostró comparando los resultados de los ensayos de detección de mutaciones en una muestra de AF al 5 % de varias ejecuciones a lo largo del período del estudio de viabilidad (véanse las tablas 46 y 47). Los valores de %CV se calcularon dentro de las ejecuciones y entre ejecuciones para probar la precisión interensayo e intraensayo (Tabla 47 y 48).

Los datos presentados en las tablas 47 y 48 indicaron que todos los ensayos de la invención tienen una buena precisión intraensayo e interensayo con %CV <10.

Tabla 46. Precisión del ensayo y comparación de instrumentos: Reproducibilidad entre ensayos: Los ensayos Taqman l inv n i n n n if r n f h n L

Tabla 47. Precisión del ensayo y comparación de instrumentos: Reproducibilidad entre ensayos: Los ensayos Taqman ________________________ de la invención se ejecutan en diferentes fechas en LC480________________________ Ensayo Corrida 1 Corrida 2

Ct promedio (media ± DE) Ct promedio (media ± D Mutación dirigida

CP A

5% CP WT

,37 ± 31,91 ±

APC 1309 _1,75

8,63 APC 1309 _0,07

40 ±

Tabla 48. Precisión del ensa o re roducibilidad intraensa o

Tabla 49. Tabla Precisión del ensa o re roducibilidad entre ensa os

5.3.1. Especificidad analítica

La especificidad analítica se probó realizando el ensayo en muestras de referencia con estado negativo de mutación conocido. Todos los resultados de las pruebas fueron los esperados (ver Tabla 43).

5.7.1. El límite de blanco se probó realizando el ensayo en las muestras de NTC.

Todas las muestras de NTC analizadas se consideraron negativas.

1. Conclusiones

1.1. El diseño final se presenta en las Tablas 41 y 42.

1.2. Los parámetros finales del ciclo de PCR del ensayo se presentan en la sección 5.2.3:

95 °C durante 5 min seguido de 50 ciclos de 95°C 20 segundos, 70 °C 40 segundos, 64°C 30 segundos y 72 °C 30 segundos (adquisición de datos).

1.3. El diseño de la presente invención demostró que los parámetros de rendimiento del diseño probado cumplieron o excedieron las especificaciones establecidas en el documento de requisitos del producto (DDC.0006) y el ensayo está listo para la etapa de desarrollo.

1.3.1. El requisito de producto 1 para los tipos de muestra probados se evaluará en la prueba de interferencia de matriz del estudio de verificación. Los requisitos 11-15 también serán probados en los estudios de Verificación y Estabilidad de la etapa de Desarrollo.

1.3.2. Se cumple el requisito de producto 2: Menos de 60 min para la preparación de la reacción y menos de 2,5 h para la PCR de la reacción en los tres instrumentos de qPCR probados.

1.3.3. El requisito 3 del producto se abordará en un estudio separado de preparación de ADN en heces.

1.3.4. El requisito de producto 4 se cumple al tener 7 mezclas de reacción donde cada gen se prueba en una mezcla de reacción separada, KRAS 12 y KRAS 13 están en dos reacciones separadas; CTNB 41 y 45

también están en 2 reacciones separadas. APC se prueba en 2 tubos.

1.3.5. El requisito de producto 5 se cumple al probar el ensayo en los tres instrumentos qPCR enumerados: Roche LC96 y LC480 y BioRad CFX

1.3.6. El requisito de producto 6 se cumple al incluir el ensayo de control interno en cada tubo de reacción que proporciona evidencia de la cantidad suficiente de ADN amplificable en cada pozo de reacción.

1.3.7. Se cumple el requisito 7 del producto, el kit contiene NTC, control WT y control positivo mixto.

1.3.8. Al menos el 0,5% del ADN mutante en el fondo de tipo nativo puede detectarse mediante los ensayos Taqman de la presente invención (alta sensibilidad) con una entrada de ADN total de 2,5 ng/pozo. Supera el requisito de producto 8 establecido para la detección de 1 % de ADN mutante.

1.3.9. Los datos presentados en este informe demuestran la viabilidad del diseño de la presente invención para detectar mutaciones previstas sin que se observe reactividad cruzada. Requisito del producto 91.3.10. El diseño también mostró una buena reproducibilidad intra e interensayo (CV < 10%).

Se cumple el requisito de producto 10.

1.4. El diseño final se presenta en las Tablas 41 y 42.

1.5. Los parámetros finales del ciclo de PCR del ensayo se presentan en la sección 5.2.3: 95 °C durante 5 min seguido de 50 ciclos de 95°C 20 segundos, 70°C 40 segundos, 64°C 30 segundos y 72°C 30 segundos (adquisición de datos).

Ejemplo IV

Este ejemplo describe además los estudios de verificación y validación del ensayo de la invención para la detección cualitativa de mutaciones en genes objetivo de APC (codones 1309, 1367, 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600) y CTNNB1 (codones 41 y 45) genes asociados con eventos iniciadores de cáncer colorrectal. El ensayo y el kit han sido validados en cuanto a precisión, límite de detección (LOD), estabilidad, especificidad/reactividad cruzada e interferencia de la matriz.

Los estudios de verificación y validación se realizaron en dos lotes de desarrollo de los ensayos y kits. Se usaron controles positivos mixtos como muestras de prueba, excepto que los controles positivos para APC 1309 y APC 1367 se prepararon individualmente para los estudios de LOD. El protocolo de detección de mutaciones es como se describe en la presente invención para hacer las muestras de prueba. Las pruebas de validación se realizaron en LC 480 (para la comparación de instrumentos, las pruebas también se realizaron en BioRad 384).

El ensayo de la invención es un qPCR en tiempo real basado en in vitro prueba diagnóstica destinada a

uso en la detección de mutaciones en el APC (codones 1309, 1367 y 1450), KRAS (codones 12 y 13), BRAF (codón 600) y CTNNB1 (codones 41 y 45) genes en ADN extraído de secciones FFPE y muestras de heces humanas.

Esquema del plan de validación

Prueba de sensibilidad analítica del ensayo (LOD) y frecuencia alélica

Límite de prueba del blanco del ensayo

Probar la interferencia de la matriz (p. ej., extracción FFPE, agregar etanol) para el efecto inhibidor potencial de varias sustancias que muy probablemente se encontrarían en las muestras de pacientes reales. Probar la reactividad cruzada (detección de cada uno de los ADN objetivo de la presente invención).

Probar la reproducibilidad del ensayo:

Intraensayo: replicar muestras representativas de todas las mutaciones cerca del LOD

Inter-ensayo: 3x3 muestras en 3 corridas por instrumento

Variación de lote a lote probada repitiendo 1.5.1 y 1.5.2 en el segundo lote, en la misma serie Comparación de instrumentos en Roche LC480, BioRad CFX384

Variabilidad del operador (2 operadores prueban el mismo lote el mismo día en el mismo instrumento)

Pruebe la especificidad analítica en ambos lotes

Prueba de especificidad analítica en alta concentración de muestras de referencia WT

Estudios de estabilidad de la invención

Estudios de estabilidad acelerada

Estudios de estabilidad congelación-descongelación

Estudios de estabilidad en tiempo real

Desviaciones de la V&V planificada del rendimiento analítico del ensayo de la invención

La mezcla maestra Bioline liofilizada de Sensifast se revirtió a la formulación líquida KAPA Universal 2x por dos razones: Los plazos de fabricación en el lado de Bioline eran demasiado largos y la sensibilidad del ensayo al 1 % de mutación no era tan buena como con la fabricación de KAPA: Los reactivos para algunas mezclas de cebador y sonda se compraron por separado para el lote 2, otros, lo mismo

Los tubos utilizados para la alícuota de los kits eran de USA Scientific, y se planificó cambiarlos al stock de tubos aprobados de Fisher Scientific que se utilizan para toda la fabricación actual de productos.

El tiempo de ejecución del instrumento BioRad CFX 384 supera el límite de 2 h establecido como requisito de producto Núm. 5. El requisito no era esencial y se consideró aceptable un tiempo de ejecución de 2,5 horas.

1. Materiales y métodos

Composición de la mezcla de reacción de PCR

Tabla 50. Mezcla de reacción de PCR

Plantillas de referencia:

CTNNB 1 CD 41: IDT gBlock, personalizado

CTNNB1 CD 45: ATCC CCL-247_D1

BRAF C600: BRAF C600 Estándar de referencia (Horizon Cat#: HD238)

KRAS c13: Estándar de referencia KRAS G13D (Horizon Cat#: HD290)

KRAS c12: Estándar de referencia KRAS G12D (Horizon Cat#: HD272)

APC 1309: ATCC CRL-2158_D1

APC 1367: ATCC CRL-2102_D1

APC 1450: ATCC CCL-235_D1

Instrumentos

Roche LC480II DC2035, S/N 5536

BioRad CFX384 DC2044, S/N 786BR02318

Reactivos/Kits

2 lotes de desarrollo (DL-1 y DL-2) de los kits de detección de cáncer colorrectal multiplexados que incluyen:

- 2X mezcla maestra PCR,

- 5X mezclas de cebadores y sondas de la invención,

- 10X mezclas de XNA de la presente invención y

- controles positivos mixtos como se describe en las plantillas de referencia y

- control sin plantilla (NTC, agua libre de nucleasas). El informe de los lotes de desarrollo se encuentra en DDC.0041

Verificación de los parámetros de rendimiento del ensayo

Sensibilidad analítica del ensayo (LOD)

La sensibilidad analítica del ensayo se evaluó analizando una plantilla de ADN mutante al 1 %, 0,5 % y 0,1 % a una entrada de 2,5 ng, 5 ng y 10 ng para todos los objetivos de la presente invención. Para cada objetivo, el 1 %, el 0,5 % y el 0,1 % de mutación en cada uno de los tres niveles de entrada de ADN se analizaron por triplicado y en 3 ejecuciones separadas en LC 480. En cada serie se incluyeron controles sin plantilla (NTC), ADN de tipo nativo (control de sujeción) y controles positivos mixtos (los controles positivos APC 1309 y APC 1367 se prepararon individualmente). Se calcularon los valores promedio de Ct, la desviación estándar (DE) y el coeficiente de variación (%CV) tanto para FAM (objetivo) como para HEX (control interno). Los valores de ACt (ACt = Ct Fam - Ct Hex) se calcularon a partir de los valores de Ct promediados (Tabla 51 a Tabla). Se calcularon los valores promedio de ACt sobre los 3 niveles de entrada de ADN para las tres ejecuciones. El ACt de corte se establece en los valores promedio de ACt - 1,5 ACt DE (Tabla). Se calculó el porcentaje de decisiones correctas para la detección de mutaciones del 1 %, 0,5 % y 0,1 % de todos los objetivos con una entrada de ADN de 2,5 ng, 5 ng y 10 ng (Tabla 53 y Tabla 54). También se calculó el porcentaje de decisión correcta para la detección de mutaciones del 1 % de todos los objetivos con una entrada de ADN de 5 ng con todas las ejecuciones durante el período de V&V y los resultados se incorporaron en las Tablas 53 y 54.

Tabla 51. Valores promedio de FAM CT para WT, 1 %, 0,5 % y 0,1 % de plantilla de ADN mutante de 2,5 ng, 5 ng y 10 n de entrada de ADN.

Tabla 52. Promedio AValores de CT para WT, 1%, 0,5% y 0,1% de plantilla de ADN mutante de 2,5 ng, 5 ng y 10 ng de entrada de ADN.

T l . R m n l lími i n r L 4 0

Conclusión:

- La frecuencia de mutación del 0,5 % en APC (c1367, c1450), BCT (c41, c45), KRAS (c12, c13) se puede detectar de forma fiable (decisión 100 % correcta) con una entrada de ADN de tan solo 2,5 ng por reacción de PCR.

- con una entrada de ADN de 5 ng, se puede detectar una mutación del 1 % en APC 1309 y BRAF V600 con un 94 % y un 100 % de decisiones correctas, respectivamente. Para APC (c1367, c1450), BCT (c41, c45) y KRAS (c12, c13), la sensibilidad analítica es del 0,5 % en esta entrada con un 100 % de decisiones correctas.

Límite de blanco del ensayo

Se ejecutaron controles sin plantilla (agua libre de nucleasas) con cada prueba de validación para supervisar la contaminación en la PCR. Los datos de NTC de 50 repeticiones de múltiples ejecuciones se compilaron (Tabla 56) y se analizaron para estimar el nivel de ruido de fondo de los ensayos de la presente invención.

T l . Lími l r l l r n l n

Interferencia de matriz

Para determinar si la sustancia común residual en el ADN aislado de FFPE tiene un efecto inhibitorio que interfiere en el rendimiento del ensayo de la presente invención, se añadió etanol (ETOH) en las muestras de ADN a una concentración del 2 %, 5 % y 10 % y se analizó en 5 repeticiones en Roche LC 480. Se calcularon los valores medios de Ct para cada muestra. La diferencia promedio de Ct entre cada muestra enriquecida con alcohol y la muestra no enriquecida se calculó y resumió en la Tabla 57.

Tabla 57. Interferencia de matriz

Conclusión:

La diferencia de Ct entre la prueba no enriquecida y enriquecida se usó para determinar si la cantidad de ETOH analizada causaba la inhibición de las reacciones de qPCR de la presente invención. Los datos de la tabla muestran que no hay interferencia de EHOH en los ensayos de la presente invención con hasta un 10 % de ETOH en las muestras para la mayoría de los objetivos de la presente invención, incluidos APC 1309/1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45 y BRAF V600. La amplificación de KRAS 13 fue inhibida por tan solo 2% de ETOH (dCT sobre 2).

Reactividad cruzada.

Hay 8 reacciones de detección de mutaciones objetivo en el ensayo de la presente invención. Cada ensayo objetivo se analizó frente a todo el material de referencia positivo para evaluar la reactividad cruzada. Cada mezcla de ensayo se analizó con tres réplicas de los ocho estándares de mutación al 1 % individuales. Algunos de los materiales de referencia tienen más de una mutación objetivo (p. ej., el estándar de referencia BRAF de Horizon lleva mutaciones BRAF V600E, BCT 45 y KRAS 13 con una frecuencia del 50 %, el estándar BCT 45 de ATCC también lleva la mutación KRAS 13 con una frecuencia del 50 %) . ACt (Ct Fam-CtHex) se calculó para cada estándar con todas las reacciones de mutación y se resume en la Tabla 58. El estado mutacional (positivo o negativo) de cada muestra de prueba se determinó sobre la base de los valores de dCT de corte (consulte la Tabla 53).

Tabla 58. Ensa os de reactividad cruzada de la invención

Conclusión:

Todas las mutaciones objetivo, incluidas APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, BRAF V600, se detectaron como se esperaba mediante el ensayo de la presente invención, lo que indica que no hay reactividad cruzada de la detección de diferentes objetivos. KRAs 12 está produciendo una señal en muestras positivas de KRAS 13, pero hay una diferencia de 6 Ct entre la verdadera señal de KRAS 13 y la señal de diafonía de KRAS 12. Este patrón se puede utilizar para diferenciar entre muestras positivas verdaderas para KRAS 12 y KRAS 13. Dado que el kit es para detectar mutaciones de KRAS 12 y KRAS 13 pero no para diferenciarlas, la diafonía no afectará el rendimiento del kit. Por lo tanto, el kit de la presente invención sólo puede detectar las mutaciones objetivo previstas.

Límites de entrada de ADN

Según los estudios de sensibilidad analítica (sección 5.1), se encontró que 2,5 ng o 5 ng era el mínimo

Entrada de ADN para el kit de la presente invención para detectar mutaciones del 1%. Para determinar la entrada de muestra de ADN máxima permitida para los ensayos de qPCR de la presente invención, se analizaron grandes cantidades de ADN genómico humano de tipo nativo. Se realizaron ensayos de qPCR de la presente invención (Fam y Hex) con diferentes entradas de ADN WT para todos los objetivos por triplicado. Se esperaba que el LOD superior se determinara como los niveles de entrada de ADN más bajos que producían resultados de prueba falsos positivos. Se usó qPCR con p-actina (Hex) para estimar la cantidad de ADN y demostrar la eficiencia de la PCR (Fig. 1). Se calculó ACt (ACt = Ct Fam -Ct Hex) para cada muestra de entrada de ADN y se comparó con los valores de corte de ACt para determinar el estado de mutación de cada muestra de entrada de ADN (Tabla 53).

T l . R m n l r l l r L D ri r A = F m - H x .

Conclusión:

Se demostró que la cantidad de entrada de ADN (valor Ct de control) entre 31 < Ct < 24 era aceptable para el ensayo de la presente invención correspondiente a 2,5 ng a 320 ng por gDNA por pozo. El análisis de ACt de diferentes cantidades de entrada de ADN mostró decisiones 100% correctas. No se observaron resultados falsos positivos con una entrada de ADN de hasta 320 ng. Dado que la entrada de ADN recomendada para los ensayos de detección de mutaciones de la presente invención es de solo 5 ng/por reacción, es poco probable que haya un resultado falso positivo debido a la sobrecarga de muestras a este nivel de entrada.

Resultados del estudio de precisión del ensayo

Se usaron dos lotes de desarrollo de los reactivos del kit de la presente invención en los experimentos de reproducibilidad: DL1 y DL2. Dos operadores (Qing Sun y Larry Pastor) estaban probando los kits en dos instrumentos diferentes. El instrumento principal fue LC480 de Roche, el segundo instrumento de prueba fue BioRad CFX384. Estas pruebas se realizaron para evaluar que el producto cumple con los requisitos establecidos en DDC.0006.

Se realizaron experimentos para evaluar la reproducibilidad de los ensayos de la presente invención, incluidos intraensayo, interensayo, lote a lote, comparación de instrumentos y reproducibilidad del operador. Para la reproducibilidad intraensayo y la comparación de instrumentos, se analizaron 9 réplicas de cada muestra, incluidos NTC, WT y PC, en un ciclo de cada lote en una placa. Para evaluar la reproducibilidad entre ensayos, lote a lote y operador, se analizaron 3 réplicas de cada muestra, incluidos NTC, WT y PC, en una serie de cada lote para todos los objetivos de la presente invención en una placa. Los experimentos de reproducibilidad intraensayo e interensayo se repitieron en DL2. Se calculó el valor medio, s D, %CV para cada marcador o cada lote y muestra de prueba. Los datos se resumen en las Tablas 50 a 66 a continuación.

Todos los valores objetivo de Ct son señales FAM, Control- del control interno medido en el canal HEX. Los valores de control se calcularon como promedios para todas las réplicas de cada ejecución.

_ _ _ Tabla 62. Resultados de las pruebas de reproducibilidad entre ensayos. Se muestran los valores promedio de Ct para i n. Pr m i Av n r m i l r i n .

Tabla 63. Variabilidad lote a lote Roche LC 480 DL1 DL2.

Tabla 64. Variabilidad lote a lote BioRad CFX384 DL1 DL2.

Tabla 65. Prueba de variabilidad del operador (DL2, QS y LP). Se muestran los valores promedio de Ct para cada o erador.

Tabla 66. Com aración de instrumentos en Roche LC 480 BioRad 384.

Resumen de precisión del ensayo:

Los datos sobre las pruebas de precisión de los reactivos del kit de la presente invención resumidos en las Tablas 10 a 16 demostraron que todos los ensayos de la presente invención tienen una buena reproducibilidad intraensayo, interensayo, lote a lote y operador con %CV <10 (Requisito de producto PR10 cumplido).

Se probaron todas las pruebas planificadas de las fuentes de variación que podrían afectar la reproducibilidad del ensayo de la presente invención y los resultados muestran que el ensayo es robusto y cumple con los requisitos del producto establecidos en DDC.0007.

7.7 Sensibilidad y especificidad del ensayo con muestras FFPE (interferencia de matriz).

El ADN de FFPE de referencia positivo (KRAS G12D, Horizon Diagnostics) y FFPE negativo (WT) se extrajo con el kit de tejido QIAamp DSP DNA F^f P^e (catálogo, Qiagen, REF 60604. QIAGEN GmbH, Hilden, Alemania) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para determinar el límite superior de entrada de ADN FFPE para el ensayo de la presente invención (la cantidad máxima de ADN WT que se puede analizar sin producir resultados falsos positivos), se usaron diferentes cantidades de ADN FFPE WT (10 y 20 ng/pozo según los datos de Qubit), utilizado en las reacciones de la presente invención y probado en el instrumento LC 480. Los datos se resumen en la Tabla 67.

Tabla 67. R m n l r l ri r l r n r ADN FFPE A = F m - Ct Hex)

Para estimar la sensibilidad del ensayo utilizando ADN de FFPE, la entrada de ADN se estableció en 5 ng/pozo según los datos de Qubit. Se analizaron muestras de ADN que contenían la mutación KRAS G12D al 2 % y al 4 % de frecuencia alélica y los datos se resumieron en la Tabla 68.

Tabla 68. Resumen de los resultados de la prueba de ADN FFPE (2 % y 4 % de KRAS G12D), 5 ng/pozo (ACt = Ct Fam - H x . L i i n iiv n r l n iv n n r

Conclusiones:

Evaluación de especificidad para muestras FFPE:

Los resultados de las pruebas de diferentes entradas de ADN FFPE indicaron que la entrada de ADN FFPE de hasta 20 ng/por pozo no produjo resultados falsos positivos.

Evaluación de sensibilidad para muestras FFPE:

Las pruebas iniciales en el ADN FFPE con una mutación KRAS G12D del 2 % y el 4 % sugirieron que el 2 % de KRAS G12D se puede detectar con una precisión del 100 % con un nivel de ADN FFPE de entrada de 5 ng.

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar la presencia o ausencia de un gen mutado conocido asociado con el cáncer colorrectal contenido en una muestra biológica, comprendiendo dicho método los pasos de:

(1) permitir una mezcla de un cebador con abrazaderas que consta de XNA que se hibrida con todo o parte de un sitio objetivo que tiene una secuencia de un gen de tipo nativo o una secuencia complementaria al gen de tipo nativo, un cebador capaz de amplificar una región que comprende un objetivo el sitio que tiene una secuencia del gen mutado y la muestra biológica coexisten en una solución de reacción para la amplificación del gen, y la amplificación selectiva de la región que comprende un sitio objetivo del gen mutado mediante un método de amplificación del gen, y

(2) detectar selectivamente una región de detección que comprende el sitio objetivo del gen mutado mediante un método de detección de genes, usando un producto amplificado obtenido en el paso (1) o parte del mismo como plantilla, para detectar la presencia o ausencia del gen mutado,

donde las mutaciones se seleccionan del grupo que consiste en APC 1309, APC 1367, APC 1450, BCT 41, BCT 45, KRAS 12, KRAS 13 y BRAF V600, y

donde las abrazaderas XNA y los cebadores se seleccionan del grupo que consta de:

SEQ ID NO:22 - ACGACACAGGAAGCAGATT CT,

SEQ ID NO:23 - TCACAGGATCTTCAGCTGACCT,

SEQ ID NO:24 - TTCCAATCTTTTATTTCTGCTATT,

SEQ ID NO:25 - Lys-0-(CTGACCTAGTTCCAATCTTTTCTT) PNA,

SEQ ID NO:26 - TTCAGGAGCGAAATCTCCC,

SEQ ID NO:27 - TGAACATAGTGTTCAGGTG,

SEQ ID NO:28 - 5756-FAM/CAAAAGTGG/ZE N/TGCTTAGACACCCAAAAG,

SEQ ID NO:29 - Lys-0-(AGTGGTGCTCAGACAJPN A,

SEQ ID NO:30 - CCAGATAGCCCTGGACAAACC,

SEQ ID NO:31 - CTTTTCAGCATGTAGGTGCTTTATTTTTA,

SEQ ID NO:32 - AGGTACTTCTCACTTGGTTT,

SEQ ID NO:33 - T AGGT ACTT CT CGCTT GGTTT,

SEQ ID NO:34 - ACTT CT GGAAT CCATT CTGGTGC,

SEC ID NO:35 - AGAAAAT CCCT GTT CCCACT CAT A,

SEQ ID NO:36 - AGGAAGAGGATGTGGATACCTCCCAAG.

SEQ ID NO:37 - Lys-0-(TGCCACTACCACAGCTC)PNA,

SEQ ID NO:38 - ACTT CT GGAAT CCATT CT GGT GC,

SEC ID NO:39 - AGAAAATCCCTGTTCCCACTCAT A,

SEQ ID NO:40 - AGGAAGAGGAT GT GGAT ACCT CCCAAG.

SEQ ID NO:41 - Ac-CTCCTTCTCTGAGTG-NH2,

SEQ ID NO:42 - AAGGCCTGCTGAAAATGACTG,

SEQ ID NO:43 - GTTGGATCATATTCGTCCAC,

SEQ ID NO:44 - TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC,

SEQ ID NO:45 - CTACGCCACCAGCTCCAACTACCA-O-D-Lys,

SEQ ID NO:46 - ACTT GT GGT AGTT GGAGCT GGT,

SEQ ID NO:47 - GTTGGATCATATTCGTCCAC,

SEQ ID NO:48 - TCT GAATTAGCT GT AT CGT CAAGGCACTC.

SEQ ID NO:49 - D-LYS-PEG2-TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCA-NH2,

SEQ ID NO:50 - ACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTA,

SEQ ID NO:51 - CATCCACAAAATGGATCCAGACAA.

SEQ ID NO:52 - CAAACTGATGGGACCCACTCCATCG, y

SEQ ID NO:53 - AT CGAGATTT CACT GT AGCT AGAC.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, el método comprendiendo: aislar ADN de una muestra de heces, sangre periférica fresca (PB) y muestra de tejidos fijados en formalina e incrustados en parafina (FFPE) obtenidos del paciente del que se sospecha que tiene una afección asociada con mutaciones del cáncer colorectal; realizar PCR en el ADN extraído para producir ADN amplificado mientras se usa una abrazadera de ácido xenonucleico para bloquear la amplificación del ADN de tipo nativo; secuenciar el ADN amplificado en un secuenciador automático; analizar una salida del secuenciador automatizado para identificar mutaciones en la secuencia.

3. Un kit para realizar el método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2,

donde las abrazaderas de XNA y los cebadores se seleccionan del grupo que consta de:

SEQ ID NO:22 - ACGACACAGGAAGCAGATTCT,

SEQ ID NO:23 - T CACAGGAT CTT CAGCT GACCT,

SEQ ID NO:24 - TTCCAATCTTTTATTTCTGCTATT,

SEQ ID NO:25 - Lys-0-(CT GACCT AGTT CCAAT CTTTT CTT) PNA.

SEQ ID NO:26 - TTCAGGAGCGAAATCTCCC,

SEQ ID NO:27 - TGAACATAGTGTTCAGGTG,

SEQ ID NO:28 - 5756-FAM/CAAAAGTGG/ZEN/TGCTTAGACACCCAAAAG,

SEQ ID NO:29 - Lys-0-(AGTGGTGCTCAGACA)PNA,

SEQ ID NO:30 - CCAGATAGCCCTGGACAAACC,

SEQ ID NO:31 - CTTTTCAGCATGTAGGTGCTTTATTTTTA,

SEQ ID NO:32 - AGGTACTTCTCACTTGGTTT,

SEQ ID NO:33 - TAGGTACTTCTCGCTTGGTTT,

SEQ ID NO:34 - ACTT CT GGAAT CCATT CT GGT GC,

SEC ID NO:35 - AGAAAATCCCTGTTCCCACTCATA,

SEQ ID NO:36 - AGGAAGAGGATGTGGATACCTCCCAAG.

SEQ ID NO:37 - Lys-0-(TGCCACTACCACAGCTC)PNA,

SEQ ID NO:38 - ACTT CT GGAAT CCATTCT GGTGC,

SEC ID NO:39 - AGAAAAT CCCT GTT CCCACT CATA,

SEQ ID NO:40 - AGGAAGAGGATGTGGATACCTCCCAAG.

SEQ ID NO:41 - Ac-CTCCTTCTCTGAGTG-NH2,

SEQ ID NO:42 - AAGGCCTGCTGAAAATGACTG,

SEQ ID NO:43 - GTT GGAT CAT ATT CGTCCAC,

SEQ ID NO:44 - TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC.

SEQ ID NO:45 - CTACGCCACCAGCTCCAACTACCA-O-D-Lys,

SEQ ID NO:46 - ACTT GT GGT AGTT GGAGCT GGT,

SEQ ID NO:47 - GTT GGAT CAT ATT CGT CCAC,

SEQ ID NO:48 - TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTC,

SEQ ID NO:49 - D-LYS-PEG2-TCTTGCCTACGCCACCAGCTCCA-NH2,

SEQ ID NO:50 - ACAGT AAAAAT AGGT GATTTT GGT CT AGCT A,

SEQ ID NO:51 - CATCCACAAAATGGATCCAGACAA,

SEQ ID NO:52 - CAAACTGATGGGACCCACTCCATCG, y

SEQ ID NO:53 - AT CGAGATTT CACT GT AGCT AGAC.