ES2601898T3 - Supresión de amplificación no específica - Google Patents

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Abstract

Un método para diseñar un oligonucleótido supresor para su uso en una reacción de amplificación de ácido nucleico para reducir la amplificación no específica, comprendiendo el método (a) identificar una o más regiones de interés en el genoma de un organismo diana; (b) para cada región de interés, realizar una búsqueda de la secuencia de genoma diana usando la región de interés como una consulta para identificar regiones de homología entre la región de interés y el genoma diana; (c) seleccionar secciones de la región de interés que tienen las mayores regiones de homología en el genoma diana; (d) diseñar uno o más oligonucleótidos en las secciones seleccionadas en la etapa (c); (e) realizar una búsqueda del genoma diana con los oligonucleótidos diseñados en la etapa (d) para identificar los oligonucleótidos con el número máximo de regiones de homología con el genoma diana que son de al menos 15 pares de longitud, tienen al menos 75 % de identidad con dicho número de regiones de homología y que abarcan el extremo 3' del oligonucleótido supresor mientras que no están presentes más de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleótidos de la región 3' terminal del oligonucleótido y que no tienen regiones de complementariedad con la secuencia diana que se va a amplificar en la reacción de amplificación; (f) seleccionar el oligonucleótido identificado en la etapa (e) como el oligonucleótido supresor.

Description

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DESCRIPCION
Supresion de amplificacion no espedfica Antecedentes de la invencion
La amplificacion de acidos nucleicos por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) tiene muchas aplicaciones en la investigacion biomedica, el diagnostico y la biotecnologfa. La especificidad unica de PCR permite la amplificacion selectiva de una secuencia de acido nucleico particular en presencia de una cantidad excesiva de otras secuencias. Ademas, la PCR puede distinguir una secuencia diana de otra secuencia que es diferente en tan poco como un unico par de bases. Por ejemplo, la PCR espedfica de alelo (AS-PCR) es capaz de detectar alteraciones pequenas en ADN e incluso mutaciones de un unico nucleotido en presencia de ADN no mutante, de tipo silvestre (patente de Estados Unidos N.° 6.627.402). En un ensayo de PCR espedfico de alelo, al menos un cebador es espedfico de alelo, es decir, se ha disenado para coincidir preferentemente con la secuencia (una variante espedfica de la secuencia), pero contiene desapareamientos diferenciadores con secuencias no diana (otras variantes de la secuencia). Idealmente, se produce extension de cebadores solamente cuando el cebador espedfico de alelo se hibrida con la secuencia diana. En una PCR espedfica de alelo exitosa, la variante diana del acido nucleico se amplifica, mientras que las otras variantes no diana no, al menos no a un nivel detectable. Desafortunadamente, con muchas dianas, no se puede conseguir este ideal. Es habitual que en ciclos posteriores de PCR, tambien se haga detectable la amplificacion de las variantes no diana de la secuencia. Este fenomeno se denomina “amplificacion de avance”. Incluso aunque los cebadores de AS-PCR sean perfectamente complementarios (o al menos compartan el mayor grado de complementariedad) con la secuencia diana y esten desapareados (o tengan mas desapareamientos) con secuencias no diana, con frecuencia no puede evitarse completamente la amplificacion de secuencias no diana.
La amplificacion de avance es especialmente preocupante en ensayos en los que la muestra contiene cantidades pequenas de la secuencia diana y cantidades grandes de la secuencia no diana. Por ejemplo, en un ensayo que se dirige a una mutacion somatica en un tumor, solamente una fraccion de las celulas de la muestra del paciente son celulas tumorales. Una fraccion de celulas tumorales pueden contener mutaciones que indican susceptibilidad a un farmaco antitumoral particular (vease, por ejemplo, mutaciones descritas en la patente de Estados Unidos N.° 7.294.468 y 7.960.118). En dicha muestra, se mezcla un numero pequeno de secuencias diana (mutantes) con un gran numero de secuencias no diana (no mutantes). La amplificacion de avance de la secuencia mutante producina un resultado de falso positivo, lo que indica falsamente la presencia de una mutacion y direccion erronea de la terapia de paciente. Si la especificidad del ensayo esta limitada por la amplificacion de avance, tambien lo esta la utilidad clmica del ensayo.
Se han propuesto diversos medios para prevenir o reducir la amplificacion no espedfica (por ejemplo, modificaciones qrnmicas que afectan a la especificidad de cebadores de amplificacion, vease patente de Estados Unidos N.° 6.011.611; uso de un oligonucleotido bloqueador, vease la publicacion de solicitud de Estados Unidos N.° 200953720). Sin embargo, estos metodos no siempre tienen exito en la eliminacion completa de la amplificacion de avance. En consecuencia, existe la necesidad de metodos alternativos para prevenir o minimizar la amplificacion de avance en una reaccion de amplificacion de acido nucleico.
Sumario de la invencion
Se desvela un oligonucleotido supresor para su uso en una reaccion de amplificacion de acido nucleico, que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana.
En una realizacion, la invencion es un metodo para disenar un oligonucleotido supresor para su uso en una region de amplificacion de acido nucleico, que comprende usar algoritmos de alineamiento de secuencias para seleccionar un oligonucleotido que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
En otra realizacion, la invencion es un metodo para reducir la amplificacion de un molde de acido nucleico no diana en una reaccion de amplificacion de acido nucleico, que comprende realizar la reaccion de amplificacion en presencia de un oligonucleotido supresor que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
En otra realizacion mas, la invencion es un kit para realizar una reaccion de amplificacion con amplificacion reducida de las secuencias no diana, que comprende un oligonucleotido supresor que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad en multiples sitios en el genoma de un organismo diana de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
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En otra realizacion mas, la invencion es una mezcla de reaccion para realizar una reaccion de amplificacion con amplificacion reducida de las secuencias no diana, que comprende un oligonucleotido supresor que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.
Tambien se desvela el uso de un oligonucleotido supresor que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana, en una region de amplificacion de acido nucleico para reducir la amplificacion no espedfica.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 muestra amplificacion del exon 2 (incluyendo codon 12) del gen NRAS humano mediante PCR espedfica de alelo con supresion de avance mediante el oligonucleotido supresor, usado tambien como uno de los cebadores. La Figura 1A muestra amplificacion de avance no suprimida (lmea discontinua) y la Figura 1B muestra supresion de la amplificacion de secuencia no diana.
La Figura 2 muestra amplificacion del exon 3 (incluyendo codon 61) del gen NRAS humano mediante PCR espedfica de alelo con supresion de avance mediante el oligonucleotido supresor que no es complementario de la secuencia diana. La Figura 2A no muestra supresion de la amplificacion de avance sin el oligonucleotido supresor, la Figura 2B no muestra supresion cuando el oligonucleotido supresor estaba presente a baja concentracion y
La Figura 2C muestra supresion cuando el oligonucleotido supresor estaba presente a una concentracion relativa mayor.
La Figura 3 muestra amplificacion del gen de PI3KCA humano mediante PCR espedfica de alelo con supresion de avance mediante el oligonucleotido supresor que no es complementario de la secuencia diana. La Figura 3A muestra amplificacion de avance en ausencia del oligonucleotido supresor y la Figura 3B muestra supresion de la amplificacion de avance en presencia del oligonucleotido supresor.
La Figura 4 muestra amplificacion del gen BRAF humano (incluyendo codones 469 y 600) mediante PCR espedfica de alelo con supresion de amplificacion de avance mediante el oligonucleotido supresor que no es complementario de la secuencia diana. La Figura 4A muestra amplificacion de avance en ausencia del oligonucleotido supresor y la Figura 4B muestra la supresion de la amplificacion de avance en presencia del oligonucleotido supresor en la reaccion de codon 469. La Figura 4C muestra amplificacion de avance en ausencia del oligonucleotido supresor y la Figura 4D muestra supresion de la amplificacion de avance en presencia del oligonucleotido supresor en la reaccion de codon 600.
La Figura 5 muestra amplificacion de los exones 2 y 3 del gen NRAS humano mediante PCR espedfico de alelo con supresion de avance mediante amplificacion lineal simultanea de la diana M13 para el exon 3 (codon 61), pero sin supresion de avance para el exon 2 (codon 12).
La Figura 6 muestra amplificacion del exon 2 del gen NRAS humano mediante PCR espedfica de alelo con supresion de avance mediante oligonucleotidos supresores con diversos grados de homologfa con el genoma diana La Figura 6A no muestra supresion de la amplificacion de avance mediante un oligonucleotido supresor con bajo grado de homologfa; La Figura 6B muestra la supresion parcial mediante un oligonucleotido con grado de homologfa medio; la Figura 6C muestra supresion completa mediante un oligonucleotido con alto grado de homologfa.
La Figura 7 muestra resultados de una busqueda de BLAST' con respecto a las regiones de interes en el exon 2 del gen NRAS humano para el diseno de oligonucleotidos supresores.
La Figura 8 muestra un ejemplo de seleccion de oligonucleotidos supresores de la region interes en el exon 2 del gen NRAS humano.
Descripcion detallada de la invencion
Para facilitar el entendimiento de la presente divulgacion, se proporcionan las siguientes definiciones de los terminos usados en el presente documento.
La expresion “cebador espedfico de alelo” o “cebador AS” se refiere a un cebador que puede hibridar con mas de una variante de la secuencia diana, pero que es capaz de diferenciar entre variantes de la secuencia diana, de modo que se produzca extension eficaz del cebador mediante la acido nucleico polimerasa en condiciones adecuadas solamente tras hibridacion del cebador con una variante particular. Con otras variantes de la secuencia diana, la extension es menos eficaz o ineficaz.
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El termino "amplicon" se refiere a un acido nucleico formado como un producto de una reaccion en cadena de la polimerasa.
La expresion “cebador comun” se refiere al segundo cebador en el par de cebadores que incluye un cebador espedfico de alelo. El cebador comun no es espedfico de alelo; es decir, no diferencia entre las variantes de la secuencia diana entre las que diferencia el cebador espedfico de alelo.
Los terminos “complementario” o “complementariedad” se usan en referencia a cadenas antiparalelas de polinucleotidos relacionados por las reglas de formacion de pares de bases de Watson-Crick. Las cadenas de acido nucleico complementarias son capaces de formar dobles cadenas en condiciones de hibridacion convencionales. Las expresiones “perfectamente complementarias” o “100% complementarias” se refieren a secuencias complementarias que tienen emparejamiento de Watson-Crick de todas las bases entre las cadenas antiparalelas, es decir, no hay desapareamientos entre dos bases cualesquiera en la doble cadena polinucleotidica. Las expresiones “parcialmente complementarias” o “incompletamente complementarias” se refieren a cualquier alineamiento de bases entre cadenas polinucleotfdicas antiparalelas que sea menos de 100 % perfecto (por ejemplo, existe al menos un desapareamiento o base no apareada en la doble cadena polinucleotidica). Una cadena de acido nucleico menor (por ejemplo, un oligonucleotido) puede ser complementario de una region (sitio) en un acido nucleico mayor, por ejemplo, un gen o un genoma. En condiciones de hibridacion convencionales, se forman dobles cadenas entre cadenas antiparalelas incluso en ausencia de complementariedad perfecta. Sin embargo, las dobles cadenas entre cadenas parcialmente complementarias son generalmente menos estables que las dobles cadenas entre cadenas perfectamente complementarias.
Una “curva de crecimiento” en el contexto de un ensayo de amplificacion de acido nucleico es un grafico de una funcion, en el que una variable independiente es el numero de ciclos de amplificacion y una variable dependiente es un parametro medible dependiente de la amplificacion medido en cada ciclo de amplificacion. Tfpicamente, el parametro medible dependiente de la amplificacion es la cantidad de florescencia emitida por la sonda tras hibridacion, o tras la hidrolisis de la sonda mediante la actividad nucleasa de la acido nucleico polimerasa, vease, Holland et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280 y patente de Estados Unidos N.° 5.210.015. En una reaccion en cadena de la polimerasa tfpica, una curva de crecimiento comprende un segmento de crecimiento exponencial seguido de un nivel estable. Una curva de crecimiento se caracteriza tfpicamente por un valor de “ciclos hasta umbral” o valor “Ct” que es un numero de ciclos en el que se consigue una magnitud predeterminada del parametro medible. Un valor de Ct menor o “mas temprano” representa amplificacion mas rapida, mientras que el valor de Ct mayor o “posterior” representa amplificacion mas lenta.
Las expresiones “homologfa” y “regiones de homologfa” se refieren a regiones (sitios) en los que dos acidos nucleicos comparten al menos complementariedad parcial. Una region de homologfa puede abarcar solamente una parte de las secuencias. Por ejemplo, solamente una parte de un oligonucleotido puede ser homologo de un sitio en el genoma. Diferentes partes del oligonucleotido pueden ser homologas de varios sitios distintos en el genoma, mientras que un oligonucleotido completo puede ser homologo de otro sitio mas en el genoma. Como con cualquier secuencia de acido nucleico parcialmente complementaria, una region de homologfa puede contener uno o mas desapareamientos y huecos cuando se alinean las dos secuencias. Una cadena de acido nucleico mas pequena (por ejemplo, un oligonucleotido) puede ser homologo de una region (sitio) en un acido nucleico mayor, por ejemplo, un gen o un genoma. La expresion “grado de homologfa” entre dos secuencias se refiere al grado de identidad entre las secuencias. El grado de identidad se expresa habitualmente como una relacion de nucleotidos desapareados en la region homologa con respecto al numero total de nucleotidos, expresada en porcentaje. Por ejemplo, se dice que un oligonucleotido de 20 bases que hibrida con una region (sitio) homologa en el genoma diana con dos desapareamientos tiene 90 % de identidad con esa region. La expresion “grado de homologfa con el genoma diana” es una medida del numero y porcentaje de identidad de regiones de homologfa con el oligonucleotido presente en el genoma diana. Un oligonucleotido con alto grado de homologfa tiene muchas regiones de homoiogfa con alto porcentaje de identidad a lo largo del genoma diana, mientras que un oligonucleotido con una region de bajo grado de homologfa tendna menos regiones de homologfa con bajo porcentaje de identidad en el genoma diana.
Los terminos “hibridado” e “hibridacion” se refieren a la interaccion de formacion de pares de bases entre dos cadenas de acido nucleico al menos parcialmente complementarias (como se define en el presente documento) que da como resultado la formacion de una doble cadena. No se requiere que dos acidos nucleicos tengan 100% de complementariedad sobre su longitud completa para conseguir hibridacion. Una cadena de acido nucleico mas pequena (por ejemplo, un oligonucleotido) puede hibridar con una region (sitio) en un acido nucleico mayor, por ejemplo, un gen o un genoma.
La expresion “multiples regiones de homologfa” en relacion con oligonucleotidos supresores homologos de regiones de un genoma diana se usa para describir el numero de dichas regiones en el genoma diana que es suficiente para apoyar la propiedad supresora del oligonucleotido. En general, “multiple” significa mas de uno, por ejemplo, 2, 3, 20, 30, 200, 300, 2000, 3000, etc., y cualquier numero entero entre medias. Sin embargo, un numero suficiente vana dependiendo de la complejidad del genoma diana, es decir, para genomas menos complejos, puede ser suficiente un numero menor para que se produzca el fenomeno de supresion, mientras que, para genomas mas complejos, se requerina un mayor numero.
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Las expresiones “acido nucleico”, “oligonucleotido” y “polinucleotido” se usa indistintamente para describir poKmeros de acido desoxirribo (o ribo) nucleico, incluyendo cebadores, sondas, ADN genomico o ARN de diversos organismos y fragmentos de ADN genomico o ARN, asf como otros elementos geneticos, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, etc. Las expresiones no se limitan en longitud y son genericas para poKmeros de polidesoxirribonucleotidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), polirribonucleotidos (que contienen D-ribosa), y cualquier otro N-glucosido de una base de purina o pirimidina, o bases de purina o pirimidina modificadas. Estas expresiones incluyen acidos nucleicos bi y monocatenarios. Los acidos nucleicos pueden comprender enlaces fosfodiester de origen natural o enlaces modificados incluyendo, pero sin limitacion, enlaces tioester. De forma similar, los acidos nucleicos pueden comprender las cinco bases de origen biologico (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) u otros restos de bases modificadas, no convencionales o derivatizadas.
Los terminos “polinucleotido” y “oligonucleotido” se usan indistintamente. “Oligonucleotido” es un termino usado en ocasiones para describir un polinucleotido mas corto. Un oligonucleotido puede comprender al menos 6 nucleotidos y hasta 100 nucleotidos.
La expresion “secuencia primaria” se refiere a la secuencia de nucleotidos en un polinucleotido u oligonucleotido. Las modificaciones de nucleotidos tales como modificaciones de bases nitrogenadas, modificaciones de azucares u otras modificaciones de la cadena principal no son parte de la secuencia primaria. Los marcadores, tales como cromoforos conjugados con los oligonucleotidos tampoco son una parte de la secuencia primaria. Por lo tanto, dos oligonucleotidos pueden compartir la misma secuencia primaria, pero diferir con respecto a modificaciones y marcadores.
El termino “cebador” se refiere a un oligonucleotido que hibrida con una secuencia en el acido nucleico diana y es capaz de actuar como un punto de inicio de la smtesis a lo largo de una cadena complementaria de acido nucleico en condiciones adecuadas para dicha smtesis. No se requiere una complementariedad perfecta para que se produzca la extension de cebadores. Sin embargo, un cebador con complementariedad perfecta (especialmente cerca del extremo 3' terminal) se extendera mas eficazmente que un cebador con desapareamientos, especialmente desapareamientos en o cerca del extremo 3' terminal.
El termino “sonda” se refiere a un polinucleotido que hibrida en una secuencia en el acido nucleico diana y puede marcarse de forma detectable. La sonda puede tener modificaciones, tales como una modificacion 3' terminal que hace a la sonda no extensible por acido nucleico polimerasas; y uno o mas cromoforos. Un oligonucleotido con la misma secuencia puede actuar como un cebador en un ensayo y una sonda en un ensayo diferente.
La expresion “region de interes” se refiere a una region del genoma diana a partir de la que va a disenarse el oligonucleotido supresor.
El termino “muestra” se refiere a cualquier composicion que contiene o se supone que contiene acido nucleico. Esto incluye una muestra de tejido o fluido aislado de un individuo. Por ejemplo, piel, plasma, suero, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido linfatico, lfquido sinovial, orina, lagrimas, celulas sangumeas, organos y tumores, y tambien muestras de cultivos in vitro establecidos a partir de celulas tomadas de un individuo, incluyendo los tejidos incluidos en parafina fijados en formalina (FFPET) y acidos nucleicos aislados de los mismos.
La expresion “oligonucleotido supresor” se refiere a un oligonucleotido que, cuando esta presente en la mezcla de PCR, suprime o reduce de forma detectable la amplificacion de cualquier secuencia no diana. En algunos casos, el oligonucleotido supresor reduce de forma detectable la amplificacion exponencial de la secuencia no diana en PCR espedfica de alelo. El oligonucleotido supresor puede tener opcionalmente funciones adicionales, incluyendo actuar como un cebador para amplificacion de la secuencia diana.
Un “molde” o “diana” se refiere a un acido nucleico que se va a amplificar, detectar o ambos. La diana o el molde es una secuencia con la que puede hibridar un cebador o una sonda. Los acidos nucleicos molde pueden derivar de esencialmente cualquier fuente, incluyendo microorganismos, mezclas biologicas complejas, tejidos, fluidos corporales, sueros, muestras biologicas conservadas, aislados ambientales, preparaciones in vitro o similares. El molde o la diana pueden constituir toda o una parte de una molecula de acido nucleico.
La expresion “organismo diana” se refiere a un organismo cuya muestra de acido nucleico se esta analizando. El genoma del organismo diana se denomina “genoma diana”.
La expresion “secuencia diana” se refiere a una secuencia del organismo diana de la que se desea amplificacion. La expresion “secuencia no diana” se refiere a otra secuencia de la que no se desea amplificacion y que debe evitarse. En el contexto de PCR espedfica de alelo, la secuencia no diana de interes es consecuencia una variante muy similar de la secuencia diana. Aunque no se desee, la secuencia no diana en ocasiones se amplifica mediante PCR espedfica de alelo junto con la secuencia diana, pero con menor eficacia.
La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) capaz de amplificar espedficamente una secuencia de acido nucleico diana presente entre un numero mucho mayor de otras secuencias. La PCR espedfica de alelo (AS-PCR) es un
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metodo capaz de distinguir entre secuencias que difieren en tan poco como un unico nucleotido. La sensibilidad y especificidad de PCR y AS-PCR es tal que la variante diana del acido nucleico puede amplificarse selectivamente incluso en presencia de cantidades mucho mayores de variantes no diana y secuencias no relacionadas. Idealmente, los acidos nucleicos no diana nunca se amplifican hasta un nivel detectable. Sin embargo, la sensibilidad de ensayos de PCR y AS-PCR tiene un reto en un fenomeno denominado “amplificacion de avance”, que es amplificacion detectable de la secuencia de acido nucleico no diana durante los ciclos posteriores de PCR.
Al realizar PCR espedfica de alelo, los inventores descubrieron que ciertos oligonucleotidos (inicialmente usados como cebadores) reducen significativamente la amplificacion de avance cuando estan presentes en ensayos de AS- PCR (Ejemplo 1, Figura 1). Cuando estos oligonucleotidos supresores se investigaron adicionalmente, se descubrio que, mas sorprendentemente, los oligonucleotidos ejercen el mismo efecto en dianas no relacionadas, es decir, dianas que no tienen regiones de complementariedad con los oligonucleotidos supresores (Ejemplo 2, Figura 2, Ejemplo 3, Figura 3 y Ejemplo 4, Figura 4). En consecuencia, los inventores idearon metodos de diseno y uso de dichos oligonucleotidos para mejorar los ensayos de PCR y AS-PCR.
Sin desear quedar ligado a ninguna teona particular, los inventores platean la hipotesis de que uno de los mecanismos de supresion de avance puede ser secuestro de reactivos de PCR en los ciclos posteriores de amplificacion cuando se produce habitualmente la amplificacion de avance. En los ciclos posteriores de PCR, la amplificacion de la secuencia diana cesa (se alcanza el nivel estable), en parte debido a que la rehibridacion de amplicones bicatenarios esta favorecida cineticamente frente a la hibridacion de cebadores con cadenas individuales de amplicones desnaturalizados. En ese estadio, los cebadores en exceso se ponen a disposicion para amplificacion de avance menos espedfica (y por tanto menos eficaz) que implica extension de un cebador desapareado hibridado con la secuencia no diana. Sin embargo, los parametros termodinamicos de la extension de cebadores desapareados son desfavorables. En consecuencia, la extension de cebadores desapareados se ve afectada en gran medida por el agotamiento o secuestro de componentes tales como nucleotidos y acido nucleico polimerasa. Las propiedades del oligonucleotido supresor permiten la extension de cebadores lineales en otra parte del genoma y (opcionalmente) para generacion exponencial de amplicones adicionales en otra parte del genoma. Estas reacciones ajenas, aunque se puede discutir que no son muy eficaces en sf mismas, secuestran reactivos cnticos e inhiben la amplificacion de avance que requiere estos reactivos. Para ensayar esta hipotesis, los inventores realizaron un experimento descrito en el Ejemplo 5. En ese Ejemplo, se realizo un ensayo de AS-PCR conocido por su amplificacion de avance (Figura 5A) en presencia de una combinacion de cebador/diana modificada tecnicamente capaz de iniciar multiples reacciones de extension lineal. Se ha predicho que las multiples reacciones de extension lineal generan parte del efecto de agotamiento y suprimen la amplificacion de avance. De hecho, se observo algo de supresion de la amplificacion de avance (Figura 5B).
Se desvela un oligonucleotido supresor para suprimir la amplificacion de secuencias no diana en una reaccion de amplificacion, por ejemplo, PCR o PCR espedfica de alelo (AS-PCR). El oligonucleotido supresor es homologo de multiples sitios en el genoma del organismo diana. Estos sitios en el genoma diana comprenden regiones de homologfa con el oligonucleotido supresor. En algunas realizaciones, las regiones de homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana tienen al menos 75 % de identidad. En algunas realizaciones, las regiones de homologfa son de al menos 15 pares de bases de longitud. Sin embargo, se entiende que para ciertas secuencias (por ejemplo, secuencias ricas en GC) regiones mas cortas de homologfa o regiones con menos de 75 % de identidad pueden tambien ofrecer resultados satisfactorios. En general, cuanto mayor sea la identidad de cada una de las regiones de homologfa, mejor sera el efecto supresor como se demuestra en el Ejemplo 6, Figura 6. En otras realizaciones mas, la region de homologfa abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor. En otras realizaciones mas, dentro de los ultimos 4 pares de bases en el extremo 3' del oligonucleotido, la region de homologfa no contiene mas de 2 desapareamientos. En algunas realizaciones la al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud y/o abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y/o no contienen mas de dos desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas realizaciones la al menos una region de homologfa ademas de tener una homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana de al menos 75 % de identidad tiene una o mas de las siguientes propiedades: es de al menos 15 pares de bases de longitud; abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor; no contiene mas de dos desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas otras realizaciones los oligonucleotidos supresores comprenden o consisten en una secuencia de acido nucleico que tiene SEQ ID NO: 1-5 (vease Tabla 1).
Es deseable que el oligonucleotido supresor provoque minima interferencia con la amplificacion y deteccion de la secuencia diana. Si un oligonucleotido supresor es capaz de generar amplicones adicionales (no diana), estos amplicones adicionales pueden detectarse y por tanto interferir con la deteccion de la secuencia diana. Preferentemente se evita la generacion de los amplicones mediante el oligonucleotido supresor. En variaciones de esta realizacion, el oligonucleotido supresor posee una propiedad adicional: no es capaz de generar amplicones adicionales. Un amplicon de PCR se genera de una manera exponencial solamente cuando estan presentes cebadores tanto directos como inversos. Por lo tanto, un oligonucleotido es capaz de cebar smtesis exponencial de un amplicon si se empareja con otro oligonucleotido (incluyendo el mismo) que es capaz de hibridar con una secuencia en la cadena opuesta del mismo acido nucleico, localizandose dicha secuencia a no mas de aproximadamente 1000 pares de bases del sitio de hibridacion del primer oligonucleotido. Se entiende que, en algunos casos, por ejemplo, cuando se usa una acido nucleico polimerasa de alta capacidad de procesamiento
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(vease por ejemplo patente de Estados Unidos N.° 7.855.055), tambien pueden generarse amplicones no diana mayores de 1000 pares de bases e interferir con amplificacion y deteccion del acido nucleico diana. En consecuencia, cuando se usa una polimerasa de alta capacidad de procesamiento, puede excluirse un oligonucleotido supresor potencial basandose en un Umite superior mayor de 1000 pares de bases. En ese caso, se excluinan mas oligonucleotidos supresores potenciales. Porotro lado, con acido nucleico fragmentado (por ejemplo, acido nucleico aislado de tejidos incluidos en parafina fijados en formalina, FFPET), no son posibles amplicones mas largos y un oligonucleotido supresor potencial puede excluirse basandose en un lfmite de menos de 1000 pares de bases. En ese caso, se excluinan menos oligonucleotidos supresores potenciales.
No se usa un oligonucleotido como un oligonucleotido supresor si tiene al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones al menos 75 % de identidad entre el oligonucleotido y la secuencia de genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas por menso de aproximadamente 1000 pares de bases.
Un oligonucleotido supresor puede preparase por cualquier metodo adecuado para preparar un oligonucleotido, habitualmente smtesis qrnmica usando practicos e instrumentos disponibles en el mercado. Como alternativa, un oligonucleotido puede obtenerse a traves de fuentes comerciales. Se conocen bien en la tecnica metodos para sintetizar oligonucleotidos (vease, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; o patente de Estados Unidos N.° 4.458.066).
En variaciones de esta realizacion, la invencion comprende oligonucleotidos supresores de SEQ ID NO: 1-5.
Se desvela un metodo para disenar un oligonucleotido supresor para suprimir la amplificacion de secuencias no diana en reaccion de amplificacion, por ejemplo, PCR o PCR espedfica de alelo (AS-PCR). El metodo para disenar oligonucleotidos supresores de la presente invencion se basa en algoritmos de alineamiento de secuencias. En algunas realizaciones, el metodo de diseno de oligonucleotidos de la presente invencion usa software de alineamiento de secuencias. Dicho software esta ampliamente disponible en la actualidad y en muchos casos, es accesible al publico sin coste. Por ejemplo, los Institutos Nacionales de Salud han puesto a disponibilidad sin coste a traves de su sitio web el paquete de software BLAST® (Herramienta de Busqueda de Alineamiento Local Basica). La invencion no se limita al uso de BLAST®, sino que BLAST® es solamente un ejemplo de un paquete de software adecuado. Otros ejemplos de software de alineamiento de secuencias por pares incluyen ACANA (Huang et al. (2006) Accurate anchoring alignment of divergent sequences. Bioinformatics 22: 29-34), Bioconductor (software de codigo abierto libremente distribuido por el Centro de Investigacion de Cancer Fred Hutchinson), FEAST (paquete de software distribuido sin coste por la Universidad de Waterloo, Canada), FASTA (paquete de software distribuido sin coste por la Universidad de Virginia), REPuter (Kurtz et al. (2001) REPuter: The Manifold Applications of Repeat Analysis on a Genomic Scale, Nucleic Acids Res., 29(22):4633-4642), SWIFT BALSAM (fiLtro BAsico para busqueda de AlineaMiento sin huecos Semiglobal) (Rasmussen et al. (2006) Efficient q-Gram Filters for Finding All epsilon- Matches over a Given Length, J. Comp. Biol. 13(2), 296-308). Por lo tanto, en algunas realizaciones el algoritmo del alineamiento de secuencias usado en el metodo para disenar un oligonucleotido supresor segun la invencion se selecciona de herramienta de busqueda del alineamiento local basica, proceso de Smith-Waterman, ACANA, Bioconductor, FEAST, FASTA, REPuter y SWIFT BALSAM.
En una realizacion, el metodo de la presente invencion comprende el uso de algoritmos de alineamiento de secuencia para seleccionar un oligonucleotido caracterizado por tener multiples regiones de homologfa con el genoma diana. En algunas realizaciones, el metodo usa algoritmos de alineamientos de secuencias para seleccionar un oligonucleotido en el que las regiones de homologfa entre el supresor y el genoma diana tienen al menos el 75 % de identidad. En algunas realizaciones, el metodo usa algoritmos de alineamiento de secuencias para seleccionar un oligonucleotido en el que las regiones de homologfa son de al menos 15 pares de bases de longitud. En otras realizaciones mas, el metodo usa algoritmos de alineamiento de secuencias para seleccionar un oligonucleotido en el que las regiones de homologfa abarcan el extremo 3' del oligonucleotido. En otras realizaciones mas, el metodo usa algoritmos de alineamiento de secuencias para seleccionar un oligonucleotido en el que dentro de los ultimos cuatro pares de bases en el extremo 3' del oligonucleotido, la region de homologfa no contiene mas de 2 desapareamientos. En algunas realizaciones la al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud y/o abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y/o no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas realizaciones la al menos una region de homologfa ademas de tener una homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana de al menos 75 % de identidad tiene una o mas de las siguientes propiedades: es de al menos 15 pares de bases de longitud; abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor; no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos desde el extremo 3'. En variaciones de esta realizacion, el metodo de la presente invencion comprende el uso de algoritmos de alineamiento de secuencias para excluir un oligonucleotido de su uso como un oligonucleotido supresor si el oligonucleotido tiene al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones al menos el 75 % de identidad entre el oligonucleotido y la secuencia del genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas por menos de aproximadamente 1000 pares de bases.
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El oligonucleotido supresor deriva de una region de interes seleccionada por el usuario. La region de interes puede contener o estar adyacente a la secuencia diana, o puede ser una region no realizada del genoma. No existe limitacion sobre el tamano de la region de interes, aunque en general una region mayor puede producir mas opciones para el diseno de los oligonucleotidos supresores. En general, la region de interes debena poseer algunas de las caractensticas deseadas en los oligonucleotidos supresores. En algunas realizaciones del metodo, la region de interes comprende multiples regiones de homologfa con el genoma diana que tienen al menos el 75 % de identidad y son al menos de 15 nucleotidos de longitud.
Se desvela un metodo que comprende las siguientes etapas realizadas con el uso de algoritmos de alineamiento de secuencias:
(a) identificar una o mas regiones de interes;
(b) realizar una busqueda de la secuencia de genoma diana usando las regiones de interes como una consulta para identificar regiones de homologfa entre la region de interes y el genoma diana;
(c) seleccionar secciones de la region de interes que tienen mas regiones de homologfa con el genoma diana;
(d) disenar uno o mas oligonucleotidos en las secciones seleccionadas en la etapa (c);
(e) realizar una busqueda del genoma diana con los oligonucleotidos disenados en la etapa (d) para identificar los oligonucleotidos con el numero maximo de regiones de homologfa con el genoma diana que cumplen uno o ambos de los siguientes criterios: al menos 75 % de identidad y no mas de 2 desapareamientos presentes en la region 3' terminal del oligonucleotido;
(f) opcionalmente, realizar una busqueda del genoma diana con los oligonucleotidos disenados en la etapa (d) para identificar y excluir los oligonucleotidos que tienen al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas de la secuencia de genoma diana que estan separadas por menos de aproximadamente 1000 pares de bases.
En general, se van a seleccionar la region de interes y el oligonucleotido con mas regiones de homologfa identificadas en la etapa (e) y, opcionalmente, seleccionados como no capaces de generar un amplicon no diana (f). Se entiende, sin embargo, que un numero excesivo de regiones de homologfa puede ser perjudicial para el ensayo en su conjunto. Por ejemplo, un oligonucleotido homologo de un elemento altamente repetitivo en el genoma diana iniciara un numero excesivo de extensiones de cebadores que sobrepasaran la reaccion. Vease por ejemplo, Kazazian, H (2004) Mobile Elements: Drivers of Genome Evolution, Science 303 (5664): 1626-1632 (el elemento repetitivo Alu constituye el 11 % del genoma humano, es decir, aparece aproximadamente 3x108 a lo largo del genoma).
El Ejemplo 6 demuestra la aplicacion del metodo. La Figura 7 es una ilustracion de las etapas (a) a (c) realizada usando BLAST®. La Figura 8 es una ilustracion de las etapas (d) a (e) realizadas usando BLAST®.
Tabla 1
Oligonucleotidos supresores
SEQ ID NO:
Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 1
CTACCACTGGGCCTCACCT
SEQ ID NO: 2
CAGGATCAGGTCAGCGGGCT
SEQ ID NO: 3
AGACAGGATCAGGTCAGCGGG
SEQ ID NO: 4
CAGGTCAGCGGGCTACCACT
SEQ ID NO: 5
ACAAGTGAGAGACAGGATCAGG
Para una extension exitosa de un cebador, es necesario que el cebador tenga al menos complementariedad parcial con la secuencia diana. En general, la complementariedad en el extremo 3' del cebador es mas cntica que la complementariedad en el extremo 5' del cebador (Innis et al. Eds. PCR Protocols, (1990) Academic Press, Capttulo 1, pp. 9-11). Por lo tanto la presente invencion abarca los oligonucleotidos desvelados en la Tabla 1, asf como variantes de estos oligonucleotidos con variaciones en el extremo 5'.
En una realizacion, la invencion es un metodo para suprimir o reducir la amplificacion de una secuencia no diana en una reaccion de amplificacion, por ejemplo, PCR o PCR espedfica de alelo (AS-PCR), que comprende realizar la amplificacion tal como, por ejemplo, la AS-PCR en presencia de un oligonucleotido supresor que es homologo de multiples sitios en la secuencia genomica del organismo diana. En algunas realizaciones, las regiones de homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana tienen al menos el 75 % de identidad. En algunas realizaciones, las regiones de homologfa son de al menos 15 pares de bases de longitud. En otras realizaciones mas, la region de homologfa abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor. En otras realizaciones mas, dentro de los ultimos cuatro pares de bases del extremo 3' del oligonucleotido, la region de homologfa contiene no mas de 2 desapareamientos. En algunas realizaciones, la al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud y/o abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y/o no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas realizaciones la al menos una region de homologfa
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ademas de tener una homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana de al menos 75 % de identidad tiene una o mas de las siguientes propiedades: es de al menos 15 pares de bases de longitud; abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor; no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En otras realizaciones mas, un oligonucleotido no se usa como un oligonucleotido supresor si tiene al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones de homologfa al menos 75 % de identidad entre el oligonucleotido y la secuencia de genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas por menos de aproximadamente 1000 pares de bases. En variaciones de esta realizacion, el metodo comprende el uso de oligonucleotidos supresores que comprenden o consisten en una secuencia de acido nucleico que tiene SEQ ID NO: 1-5.
El metodo de la presente solicitud es aplicable a PCR tradicional asf como PCR espedfica de alelo. La PCR espedfica de alelo es una variacion de pCr en la que los cebadores se disenan para amplificar la secuencia diana para evitar la aplicacion de otra secuencia estrechamente relacionada. La PCR espedfica de alelo se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 6.627.402. En PCR espedfica de alelo, al menos uno de los cebadores es el cebador diferenciador que tiene una secuencia complementaria de la secuencia diana, pero que tienen desapareamientos con la secuencia no diana. Tfpicamente, el nucleotido diferenciador en el cebador, es decir el nucleotido que coincide solamente con la secuencia diana, es el nucleotido 3' terminal. En casos en los que el cebador no es perfectamente complementario de la secuencia diana, aun comprende un mayor grado de complementariedad de la secuencia diana en comparacion con la secuencia no diana. El diseno de cebadores espedficos de alelo y metodos generales de optimizacion de los cebadores para amplificacion de acido nucleico se ha descrito, por ejemplo, en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., (1990) Academic Press.
Tfpicamente, los cebadores son oligonucleotidos sinteticos, compuestos de nucleotidos A, C, G y T. Sin embargo, tambien pueden usarse nucleotidos de bases no convencionales, no hallados normalmente en acidos nucleicos. Por ejemplo, se sabe que ciertas bases modificadas aumentan la especificidad de amplificacion, vease Patente de Estados Unidos n.° 6.001.011. Innis et al. (mencionada anteriormente) tambien contiene instrucciones sobre la seleccion de acido nucleico polimerasas para su uso en PCR. Las ADN polimerasas termoestables ejemplares incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. ZO5 (vease, por ejemplo, Patente de Estados Unidos n.° 5.674.738), Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, familia de Fuente Caliente B/clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus.
Puede conseguirse deteccion de los productos de amplificacion mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Estos metodos de deteccion incluyen el uso de cebadores y sondas marcados asf como diversos colorantes de union a acido nucleico. El medio de deteccion puede ser espedfico de una variante de la secuencia diana, o puede ser generico para todas las variantes de la secuencia diana o incluso para todo el ADN bicatenario. Los productos de amplificacion pueden detectarse despues de haberse completado la amplificacion, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de los productos no marcados y tincion del gel con un colorante de union a acido nucleico. Como alternativa, los productos de amplificacion pueden portar un marcador radiactivo o uno qmmico, bien en virtud de incorporacion durante la smtesis o en virtud de tener un cebador marcado. Durante o despues de la electroforesis, los productos de amplificacion marcados pueden detectarse con herramientas radiologicas o qmmicas adecuadas conocidas en la tecnica. Despues de electroforesis, el producto tambien puede detectarse con una sonda espedfica de diana marcada por uno cualquiera de los metodos conocidos en la tecnica. La sonda marcada tambien puede aplicarse a la diana sin electroforesis, es decir, en un ensayo de “transferencia puntual” o similares.
En algunas realizaciones, la presencia del producto de amplificacion puede detectarse en un ensayo homogeneo, es decir, un ensayo en el que se detecta un producto naciente durante los ciclos de amplificacion, y no se requiere ninguna manipulacion pos-amplificacion. Se ha descrito un ensayo de amplificacion homogeneo usando una sonda de nucleasa, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos n.° 5.210.015. El ensayo de amplificacion homogeneo usando colorantes intercalantes de acido nucleico se ha descrito por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos n.° 5.871.908 y 6.569.627. El ensayo homogeneo tambien puede emplear una o mas sondas fluorescentes cuando la hibridacion de las sondas con el producto de extension da como resultado digestion enzimatica de la sonda y deteccion de la fluorescencia resultante (metodo de sonda TaqMan™, Holland et al. (1991) P.N.A.S. USA 88: 72767280). Otros metodos usan dos sondas marcadas con dos fluoroforos de interaccion. Los ejemplos de dichas sondas incluyen sondas de “baliza molecular” (Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14: 303-308) o sondas de nucleasa marcadas con fluorescencia (Livak et al., (1995) PCR Meth. Appl., 4: 357-362).
En un ensayo homogeneo, la reaccion se caracteriza por una curva de crecimiento que muestra el aumento de fluorescencia de una sonda con cada ciclo de PCR (vease Holland et al. (mencionado anteriormente) y Patente de Estados Unidos n.° 5.210.015). Cada curva de crecimiento se caracteriza por un valor de “ciclos hasta umbral” o valor “Ct”. Un valor de Ct inferior representa una complecion mas rapida de la amplificacion, mientras que el valor Ct mayor representa complecion de amplificacion mas lenta. Un valor Ct menor tambien puede representar una aportacion inicial mayor del acido nucleico diana, mientras que un valor Ct mayor puede representar una aportacion inicial menor. En el caso de PCR espedfica de alelo, sin embargo, el valor Ct menor representa amplificacion eficaz.
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Durante la amplificacion de avance, la secuencia no diana produce un valor Ct muy alto a pesar de la gran cantidad de la secuencia no diana presente. El valor Ct alto refleja una amplificacion muy ineficaz del acido nucleico no diana.
Se desvela un kit que contiene reactivos necesarios para realizar una reaccion de amplificacion, por ejemplo PCR o AS-PCR, con amplificacion reducida de secuencias no diana. Los reactivos comprenden al menos un oligonucleotido supresor caracterizado por tener multiples regiones de homologfa con el genoma diana. En algunas realizaciones la al menos una region de homologfa es de al menos de 15 pares de bases de longitud y/o abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y/o no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas realizaciones la al menos una region de homologfa ademas de tener una homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana de al menos 75 % de identidad tiene una o mas de las siguientes propiedades: es de al menos 15 pares de bases de longitud; abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor; no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En otras realizaciones mas, no se incluye un oligonucleotido en el kit como un oligonucleotido supresor si tiene al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones de homologfa al menos 75 % de identidad entre el oligonucleotido y la secuencia de genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas en menos de aproximadamente 1000 pares de bases. En variaciones de estas realizaciones los oligonucleotidos supresores comprenden o consisten en una secuencia de acido nucleico que tiene SEQ ID NO: 1-5.
El kit comprende el oligonucleotido supresor y al menos otro reactivo seleccionado del grupo que consiste en uno o mas cebadores espedficos de alelo, uno o mas cebadores comunes correspondientes y opcionalmente, una o mas sondas. El kit puede comprender ademas reactivos necesarios para la realizacion de una amplificacion y ensayo de deteccion, tal como nucleosido trifosfatos, al menos una acido nucleico polimerasa y/o tampones necesarios para la funcion de la polimerasa. En algunas realizaciones, la sonda se marca de forma detectable. En dichas realizaciones, el kit puede comprender reactivos para detectar el marcador. Opcionalmente, el kit tambien puede contener reactivos que potencian el rendimiento de la PCR, incluyendo dUTP y uracilo-N-glucosilasa (UNG) para reducir la contaminacion, y betama para mejorar la especificidad.
Se desvela una mezcla de reaccion para realizar una reaccion de amplificacion, por ejemplo, PCR o PCR espedfica de alelo, con amplificacion reducida de secuencias no diana. La mezcla comprende al menos un oligonucleotido supresor caracterizado por tener multiples regiones de homologfa con el genoma diana. En algunas realizaciones, las regiones de homologfa tienen una o mas de las siguientes propiedades: al menos 75 % de identidad entre el oligonucleotido supresor y la secuencia de genoma diana; al menos 15 pares de bases de longitud; abarcan el extremo 3' del oligonucleotido supresor; y dentro de los ultimos cuatro pares de bases del extremo 3' del oligonucleotido, la region de homologfa no contiene mas de 2 desapareamientos. En algunas realizaciones la al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud y/o abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y/o no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En ciertas realizaciones la al menos una region de homologfa ademas de tener una homologfa entre el oligonucleotido supresor y el genoma diana de al menos 75 % de identidad tiene una o mas de las siguientes propiedades: es de al menos de 15 pares de bases de longitud; abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor; no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'. En algunas realizaciones la mezcla ademas del oligonucleotido supresor comprende uno o mas cebadores espedficos de alelo, uno o mas cebadores comunes correspondientes y opcionalmente, una o mas sondas. En ciertas realizaciones la mezcla de reaccion puede comprender ademas reactivos tales como nucleosido trifosfatos, al menos una acido nucleico polimerasa y/o tampones necesarios para la funcion de la polimerasa. En otras realizaciones mas, no se incluye un oligonucleotido en la mezcla de reaccion como un oligonucleotido supresor si tiene al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones de homologfa al menos 75 % de identidad entre el oligonucleotido y la secuencia de genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas por menos de aproximadamente 1000 pares de bases. En variaciones de estas realizaciones los oligonucleotidos supresores comprenden o consisten en una secuencia de acido que tiene SEQ ID NO: 1-5.
Ejemplos
Ejemplo 1
Supresion de amplificacion de avance por un cebador de PCR
En este ejemplo, se observo supresion de la amplificacion de avance en una AS-PCR que se dirigfa a mutaciones en el codon 12 del gen NRAS humano. Los cebadores y sondas usados en el Ejemplo 1 se muestran en la Tabla 2. Un cebador cadena arriba seleccionado de entre SEQ ID NO: 6-23 se empareja con una de las mutaciones 35G>C, 34G>T, 35G>A, 34G>C, 34G>A y 35G>T correspondientes a los cambios de aminoacidos G12A, G12C, G12D, G12R, G12S y G12V en el exon 2 del gen NRAS humano y esta desapareado con la secuencia de tipo silvestre. Un cebador cadena abajo seleccionado de SEQ ID NO: 24-26 es habitual entre las secuencias mutantes y de tipo silvestre del exon 2 en el gen NRAS humano y la sonda de deteccion se selecciona de SEQ ID NO: 27-29.
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Tabla 2
Cebadores y sondas para el exon 2 del gen NRAS usado en el Ejemplo 1
SEQ ID NO:
Funcion Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 6
Cebador AS 35G>C CTGGTGGTGGTTGGAGCCGC
SEQ ID NO: 7
Cebador AS 35G>C CTGCTGGTGGTTGGAGEAGC
SEQ ID NO: 8
Cebador AS 35G>C CTGCTGGTGGTTGGAGCMGC
SEQ ID NO: 9
Cebador AS 34G>T CAAACTGGTGGTGGTTGGAGCTT
SEQ ID NO: 10
Cebador AS 34G>T TACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCTT
SEQ ID NO: 11
Cebador AS 34G>T CAGAGTGGTGGTGGTTGGAGCDT
SEQ ID NO: 12
Cebador AS 35G>A AAGTGGTGGTGGTTGGAGCDGA
SEQ ID NO: 13
Cebador AS 35G>A AACTTGGTGGTGGTTGGAGTMGA
SEQ ID NO: 14
Cebador AS 35G>A AACTGGTGGTGGTTGGAGCTGA
SEQ ID NO: 15
Cebador AS 34G>C AACTGGTGGTGGTTGGAACAC
SEQ ID NO: 16
Cebador AS 34G>C AACTGGTGGTGGTTGGATCAC
SEQ ID NO: 17
Cebador AS 34G>C ATCGGGTGGTGGTTGGAGFAC
SEQ ID NO: 18
Cebador AS 34G>A CAGACTGGTGGTGGTTGGAGFAA
SEQ ID NO: 19
Cebador AS 34G>A AGACTGGTGGTGGTTGGAGCDA
SEQ ID NO: 20
Cebador AS 34G>A AGACTGGTGGTGGTTGGAGFAA
SEQ ID NO: 21
Cebador AS 35G>T AACTGGTGGTGGTTGGAGCAAT
SEQ ID NO: 22
Cebador AS 35G>T AACTGGTGGTGGTTGGAGCATT
SEQ ID NO: 23
Cebador AS 35G>T AACTGGTGGTGGTTGGAGEAAT
SEQ ID NO: 24
Comun de exon 2 GAATATGGGTAAAGATGATCCGACAA
SEQ ID NO: 25
Comun de exon 2 GTAAAGATGATCCGACAAGTGAGAGA
SEQ ID NO: 26
Comun de exon 2 GAATATGGGTAAAGATGATCCGACAAGT
SEQ ID NO: 27
Sonda de exon 2 JCACTGAECAATCCAGCTAATCCAGAACCACP
SEQ ID NO: 28
Sonda de exon 2 JCACTGAECAATCCAGCTAATCCAGAACCACP
SEQ ID NO: 29
Sonda de exon 2 JGTGGTTECTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGP
Clave:
Cebador AS: cebador espedfico de alelo, Comun: cebador comun, E=N4-Metil-dC, M=N6- Metil-dA, D=N6-terciario-butil-benzil-dA, F=N4-terciario-butil-benzil-dC, J=HEX, Q=BHQ-2, P=Fosfato
La mezcla de PCR convencional incluyo nucleosido trifosfatos (incluyendo dUTP), ADN polimerasa, 0,1 |iM de cada uno de los cebadores selectivos, cebador comun 0,1-0,7 |iM, una sonda de deteccion, ADN diana (9900 copias de lmea celular K562 de tipo silvestre con 100 copias de plasmido mutante, o 10.000 copias de ADN de lmea celular de tipo silvestre o 10.000 copias de plasmido del exon 2 o 3 de tipo silvestre de NRAS), y uracil-N-glucosilasa. Se realizo amplificacion y analisis usando el instrumento Roche LightCycler® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, Ind.) Se uso el siguiente perfil de temperatura: 2 ciclos de 95 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos) seguido de ciclacion de 93 °C (10 segundos) a 62 °C (30 segundos) 55 veces. Se recogieron datos de fluorescencia al comienzo de cada etapa de 62 °C en el programa de 55 ciclos.
Los resultados se muestran en la Figura 1. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre mediante lmeas discontinuas; se muestra la amplificacion del plasmido que contiene la secuencia de tipo silvestre mediante lmeas continuas en negrita y se muestra la amplificacion del ADN mutante (secuencia diana) por lmeas continuas estrechas. Los resultados demuestran que cuando se empareja un cebador espedfico de mutacion corriente arriba con uno de los cebadores cadena abajo seleccionados de entre SEQ ID NO: 24-26, se detecto la amplificacion de avance de la secuencia no diana (de tipo silvestre). Vease Figura 1A (lmea discontinua). Cuando se emparejo el mismo cebador espedfico de mutacion con un cebador cadena abajo diferente, seleccionado de entre SEQ ID NO: 1-5, se suprimio la amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre), vease Figura 1B. Notablemente, la amplificacion de la secuencia no diana presente en un plasmido no esta afectada y no esta suprimida (lmea continua en negrita).
Ejemplo 2
Supresion de amplificacion de avance mediante un oligonucleotido supresor adicional
5
10
15
20
25
En este ejemplo, se observo supresion de la amplificacion de avance en una AS-PCR que se dirige a mutaciones en el codon 61 del gen NRAS humano. Los cebadores y sondas usados en el Ejemplo 2 se muestran en la Tabla 3. Un cebador cadena arriba seleccionado de entre SEQ ID NO: 30-47 coincide con una de las mutaciones 183A>T, 183A>C, 181C>A, 182A>T, 182A>C, 182A>G correspondiente a los cambios de aminoacidos Q61Ha, Q61Hb, Q61K, Q61L, Q61P y Q61R en el gen NRAS humano y esta desapareado con la secuencia de tipo silvestre. Un cebador cadena abajo seleccionado de entre SEQ ID NO: 48-50 y sonda de deteccion seleccionada de entre SEQ ID NO: 51-53 son habituales entre las secuencias mutantes y de tipo silvestre en el exon 3 del gen NRAS. Los oligonucleotidos supresores seleccionados de entre SEQ ID NO: 1-5 no hibridan con ninguno de los amplicones definidos por los pares de cebadores usados en este ejemplo.
Tabla 3
Cebadores y sondas para el exon 3 del gen NRAS usado en el Ejemplo 2
SEQ ID NO:
Funcion Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 30
Cebador AS 183A>T GGATATACTGGATACAGCTGGACDT
SEQ ID NO: 31
Cebador AS 183A>T GGACATACTGGATACAGCTGGACTT
SEQ ID NO: 32
Cebador AS 183A>T GGACATACTGGAT ACAGCTGGAGAT
SEQ ID NO: 33
Cebador AS 183A>C ACATACTGGATACAGCTGGACTC
SEQ ID NO: 34
Cebador AS 183A>C ATACTGGATACAGCTGGACTC
SEQ ID NO: 35
Cebador AS 183A>C ATACTGGATACAGCTGGATAC
SEQ ID NO: 36
Cebador AS 181C>A TGGATATACTGGATACAGCTGIAA
SEQ ID NO: 37
Cebador AS 181C>A GACATACTGGATACAGCTGGAA
SEQ ID NO: 38
Cebador AS 181C>A TGGATATACTGGATACAGCTGGMA
SEQ ID NO: 39
Cebador AS 182A>T GAGATACTGGATACAGCTGGAFT
SEQ ID NO: 40
Cebador AS 182A>T GACATACTGGATACAGCTGTACT
SEQ ID NO: 41
Cebador AS 182A>T GACATACTGGATACAGCTGAACT
SEQ ID NO: 42
Cebador AS 182A>C GACGTACTGGATACAGCTGGAFC
SEQ ID NO: 43
Cebador AS 182A>C CGTACTGGATACAGCTGGAFC
SEQ ID NO: 44
Cebador AS 182A>C GACATACTGGATACAGCTGAACC
SEQ ID NO: 45
Cebador AS 182A>G GACATACTGGATACAGCTGGTEG
SEQ ID NO: 46
Cebador AS 182A>G ACGTACTGGATACAGCTGGAFG
SEQ ID NO: 47
Cebador AS 182A>G GACACACTGGATACAGCTGGAFG
SEQ ID NO: 48
Comun de exon 3 AGAGAAAATAATGCTCCTAGTACCTGTAG
SEQ ID NO: 49
Comun de exon 3 TCCTTTCAGAGAAAATAATGCTCCTAGT
SEQ ID NO: 50
Comun de exon 3 GTTAATATCCGCAAATGACTTGCTATTATT
SEQ ID NO: 51
Sonda de exon 3 JCTGTCCETCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGP
SEQ ID NO: 52
Sonda de exon 3 JCTCATGETATTGGTCTCTCATGGCACTGTACP
SEQ ID NO: 53
Sonda de exon 3 JCTTCGCECTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCP
Clave:
Cebador AS: cebador espedfico de alelo, Comun: cebador comun, E=N4-Metil-dC, M=N6- Metil-dA, D=N6-terciario-butil-benzil-dA, F=N4-terciario-butil-benzil-dC, I=Inosina, J=FAM, Q=BHQ-2, P=Fosfato
En este ejemplo, se usaron las mismas condiciones de reaccion que en el Ejemplo 1, excepto que ademas del cebador cadena abajo y corriente arriba, se anadio uno de los oligonucleotidos supresores seleccionados de entre SEQ ID NO: 1-5 a la reaccion a 0,1 o 0,7 |iM.
Los resultados se muestran en la Figura 2. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre por lmeas discontinuas y se muestra la amplificacion del ADN mutante (secuencia diana) por lmeas continuas estrechas. Los resultados demuestran que cuando se usa el par de cebadores compuesto de un cebador comun y un cebador espedfico de mutacion Q61, se detecto amplificacion de avance de las secuencias no diana. Vease Figura 2A (lmeas discontinuas). Cuando el oligonucleotido supresor tambien estaba presente en la mezcla de reaccion a 0,1 |iM, no se suprimio la amplificacion de avance de las secuencias no diana, vease Figura 2B. Pero cuando el oligonucleotido supresor estaba presente en la mezcla de reaccion a 0,7 |iM, se suprimio la amplificacion de avance de la secuencia no diana, vease Figura 2C. En este ejemplo, todos los cebadores estan presentes a 0,1 |iM mientras que el oligonucleotido supresor estaba presente a 0,1 |iM o 0,7 |iM.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ejemplo 3
Supresion de amplificacion de avance del molde no relacionado PI3KCA mediante un oligonucleotido supresor
En este ejemplo, se observo supresion de la amplificacion de avance en una AS-PCR que se dirige a mutaciones en codon 1049 del gen PI3KCA humano. Los cebadores y sondas usados en el Ejemplo 3 se muestran en la Tabla 4. Un cebador cadena arriba seleccionado de entre SEQ ID NO: 54-56 coincide con la mutacion 3145G>C correspondiente al cambio de aminoacido G1049R en el gen PI3KCA humano y esta desapareado con la secuencia de tipo silvestre. Un cebador cadena abajo seleccionado de entre SEQ ID NO: 57-59 y una sonda seleccionada de entre SEQ ID NO: 60 y 96 y 61 y 97 son comunes entre las secuencias mutantes y de tipo silvestre. Los oligonucleotidos supresores seleccionados de entre SEQ ID NO: 1-5 (espedficos para el gen NRAS humano) no hibridan con los amplicones de PI3KCA usados en este ejemplo.
Tabla 4
Cebadores y sondas para el gen PI3KCA usado en el Ejemplo 3
Funcion
Funcion
Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 54
Cebador AS 3145G>C CATGAAACAAATGAATGATGCACATCCTC
SEQ ID NO: 55
Cebador AS 3145G>C CATGAAACAAATGAATGATGCACATCGTC
SEQ ID NO: 56
Cebador AS 3145G>C CATGAAACAAATGAATGATGCACATTATC
SEQ ID NO: 57
Comun 3145 CAATGCATGCTGTTTAATTGTGTGGA
SEQ ID NO: 58
Comun 3145 TTCAGTTCAATGCATGCTGTTTAATTGTG
SEQ ID NO: 59
Comun 3145 GTGGAATCCAGAGTGAGCTTTCAT
SEQ ID NO: 60 y 96
Sonda 3145 JTGGCTGGACAAQCAAAAATGGATTGGATCP
SEQ ID NO: 61 y 97
Sonda 3145 JATGGATTGGAQTCTTCCACACAATTAAACAGCATGP
Clave:
Cebador AS: cebador espedfico de alelo, Comun: cebador comun, J=JA270, Q= BHQ-2, P=fosfato
En este ejemplo, se usaron las mismas condiciones de reaccion que en el Ejemplo 1, excepto que ademas del cebador cadena arriba y cadena abajo, se anadio uno de los oligonucleotidos supresores seleccionados de entre SEQ ID NO: 1-5 a la reaccion a 1,0 |iM.
Los resultados se muestran en la Figura 3. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre mediante lmeas discontinuas; y se muestra la amplificacion del ADN mutante (secuencia diana) mediante lmeas continuas estrechas. Los resultados demuestran que cuando se uso el par de cebadores compuesto de un cebador espedfico de G1049R y un cebador comun, se detecto amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre). Vease Figura 3A (lmeas discontinuas). Cuando el oligonucleotido supresor seleccionado de entre SEQ ID NO: 1-5 tambien estaba presente en la mezcla de reaccion, se suprimio la amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre), sin ningun impacto sobre la amplificacion espedfica de la secuencia diana (G1049R mutante) (lmeas continuas). Vease Figura 3B. El mismo oligonucleotido supresor seleccionado de entre SEQ ID NO: 1-5 tambien se anadio a PCR espedfica de alelo disenada para detectar mutaciones de PI3KCA 1258T>C, 1635G>T, 1634A>G y 1633G>A. Se observo la misma tendencia: ningun impacto sobre la amplificacion espedfica de la secuencia diana (mutante) y supresion de la amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre) (datos no mostrados).
Ejemplo 4
Supresion de amplificacion de avance del molde no relacionado BRAF mediante un oligonucleotido supresor
En este ejemplo, se observo supresion parcial de amplificacion de avance en una AS-PCR que se dirigfa a mutaciones en los codones 469 y 600 del gen BRAF humano. Los cebadores y sondas usados en el Ejemplo 4 se muestran en la Tabla 5. Para mutaciones en el codon 469, el cebador cadena arriba se selecciono de entre SEQ ID NO: 62-70. Estos cebadores se emparejan con diversas mutaciones en el codon 469 en el exon 11. Para mutaciones en el codon 600, el cebador cadena arriba se selecciono de entre SEQ ID NO: 75-86. Estos cebadores coinciden con diversas mutaciones en el codon 600 en el exon 15. Para las mutaciones del codon 469, el cebador cadena abajo comun se selecciono de entre SEQ ID NO: 71-72, y la sonda se selecciono de entre SEQ ID NO: 73 y 98 y 74 y 99. Para las mutaciones del codon 600, se selecciono el cebador cadena abajo de entre SEQ ID NO: 87-89, y la sonda se selecciono de entre SEQ ID NO: 90-92. Los oligonucleotidos supresores seleccionados de entre SEQ ID NO: 1-5 (espedficos para el gen NRAS humano) no hibridan con los amplicones de BRAF definidos por cualquiera de los pares de cebadores en este ejemplo.
Tabla 5
Cebadores y sondas para el gen BRAF usado en el Ejemplo 4.
SEQ ID NO:
Funcion Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 62
Cebador AS 1406G>C AAAGAATTGGATCTGGATCATTAGC
SEQ ID NO: 63
Cebador AS 1406G>C AAAGAATTGGATCTGGATCATTCGC
SEQ ID NO: 64
Cebador AS 1406G>C AAAGAATTGGATCTGGATCATGTGC
SEQ ID NO: 65
Cebador AS 1405G>A AAAGAATTGGATCTGGATCATATA
SEQ ID NO: 66
Cebador AS 1405G>A ACAAAGAATTGGATCTGGATCATTAA
SEQ ID NO: 67
Cebador AS 1406G>T AGTGGGACAAAGAATTGGATCAGT
SEQ ID NO: 68
Cebador AS 1406G>T AGTGGGACAAAGAATTGGATCTAT
SEQ ID NO: 69
Cebador AS 1406G>A ACAAAGAATTGGATCTGGATCATTTAA
SEQ ID NO: 70
Cebador AS 1406G>A GACAAAGAATTGGATCTGGATCATTTAA
SEQ ID NO: 71
Comun de exon 11 GCGAACAGTGAATATTTCCTTTGATG
SEQ ID NO: 72
Comun de exon 11 GACTTGTCACAATGTCACCACATTACATA
SEQ ID NO: 73 y 98
Sonda de exon 11 EAGTCTACAAGQGGAAAGTGGCATGGTAAP
SEQ ID NO: 74 y 99
Sonda de exon 11 ETGGCATGGTAQAGTATGTAATGTGGTGACATTP
SEQ ID NO: 75
Cebador AS 1798 1799GT>AA, 1798_1799GT>AG, 1798G>A AGTAAGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACFA
SEQ ID NO: 76
Cebador AS 1798 1799GT>AA, 1798_1799GT>AG, 1798G>A AGTAAGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTALAA
SEQ ID NO: 77
Cebador 1798 1799GT>AA, 1798 1799GT>AG, 1798G>A AS AGTAAGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTCLAA
SEQ ID NO: 78
Cebador AS 1798G>T AGTAAGAATAGGTGATTTTGITCTAGCTACFT
SEQ ID NO: 79
Cebador AS 1798G>T AGTAAGAATAGGTGATTTTGGTCTAICTACFT
SEQ ID NO: 80
Cebador AS 1798G>T AGTAAGAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACFT
SEQ ID NO: 81
Cebador AS 1799T>G AATGGGTGATTTTGGTCTAGCTFCTGG
SEQ ID NO: 82
Cebador AS 1799T>G AATGGGTGATTTTGGTCTAGCTFTAIG
SEQ ID NO: 83
Cebador AS 1799T>G AGTAGGTGATTTTGGTCTAGCTATFGG
SEQ ID NO: 84
Cebador AS 1799T>C AATGGGTGATTTTGGTCTAGCTFTAIC
SEQ ID NO: 85
Cebador AS 1799T>C AATGGGTGATTTTGGTCTAGCTALTIC
SEQ ID NO: 86
Cebador AS 1799T>C AATGGGTGATTTTGGTCTAGCTALTGC
SEQ ID NO: 87
Comun de exon 15 GTGGAAAAATAGCCTCAATTCTTACCA
SEQ ID NO: 88
Comun de exon 15 TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA
SEQ ID NO: 89
Comun de exon 15 CTAGTAACTCAGCAGCATCTCAG
SEQ ID NO: 90
Sonda de exon 15 ETGGATCQCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGP
SEQ ID NO: 91
Sonda de exon 15 ETCCCATQCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCAP
SEQ ID NO: 92
Sonda de exon 15 ETCTCGATGGAGTGGGTCCQP
CLAVE Cebador AS: cebador espedfico de alelo, Comun: cebador comun, F=N6-terciario-butil-benzil- dA, L=N4-terciario-butil-benzil-dC, I=Inosina, E=FAM, Q=BHQ-2, P= Fosfato
En este ejemplo, se usaron las mismas condiciones de reaccion que en el Ejemplo 3.
5 Los resultados se muestran en la Figura 4. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre mediante lmeas discontinuas y se muestra la amplificacion de las dianas del codon de BRAF 469 y 600 mediante lmeas continuas. Los resultados demuestran que cuando se uso el par de cebadores que consiste en un cebador coincidente con una de las mutaciones del codon 469 y un cebador comun, se detecto amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre), vease la Figura 4A (lmeas discontinuas). Cuando tambien estaba presente un 10 oligonucleotido supresor seleccionado de entre SEQ ID NO: 1-5 en la mezcla de reaccion, se suprimio la amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre) (lmeas discontinuas), con ligero impacto sobre la amplificacion espedfica de la secuencia mutante (lmeas continuas). Vease Figura 4B. Cuando se uso el par de cebadores consistente en un cebador coincidente con una de las mutaciones de codon 600 y un cebador comun, se detecto amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre). Vease Figura 4C (lmeas discontinuas). 15 Cuando tambien estaba presente un oligonucleotido supresor seleccionado de entre SEQ ID NO: 1-5 en la mezcla de reaccion, se suprimio parcialmente la amplificacion de avance de la secuencia no diana (tipo silvestre), vease
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Figura 4D. La supresion incompleta de la amplificacion no diana y ligero impacto sobre la amplificacion diana observados con el sistema BRAF sugieren que el fenomeno de supresion puede depender de la secuencia.
Ejemplo 5
Supresion de amplificacion de avance por reacciones de extension de cebadores lineales.
En este ejemplo, se observo supresion de amplificacion de avance del molde de NRAS en presencia del molde de M13 y una serie de cebadores espedficos de M13. La AS-PCR se dirigio a mutaciones en los codones 12 y 61 del gen NRAS humano. Los cebadores M13 usados en el Ejemplo 5 se muestran en la Tabla 6. Para la diana de NRAS, el cebador cadena arriba se selecciono de entre SEQ ID NO: 30-47. Estos cebadores coinciden con una de las mutaciones 183A>T, 183A>C, 181C>A, 182A>T, 182A>C, 182A>G correspondientes a los cambios de aminoacidos Q61Ha, Q61Hb, Q61K, Q61L, Q61P y Q61R en el gen de NRAS humano y estan desapareados con la secuencia de tipo silvestre. El cebador cadena abajo seleccionado de entre SEQ ID NO: 48-50 y la sonda seleccionada de entre SEQ ID NO: 51-53 son comunes entre las secuencias mutantes y de tipo silvestre el gen NRAS humano. El cebador cadena arriba seleccionado de entre SEQ ID NO: 6-23, coincide con una de las mutaciones 35G>C, 34G>T, 35G>A, 34G>C, 34G>A y 35G>T en el exon 2 del gen NRAS humano y esta desapareado con la secuencia de tipo silvestre. El cebador cadena abajo seleccionado de SEQ ID NO: 24-26 y la sonda de deteccion seleccionada de SEQ ID NO: 27-29 son comunes entre las secuencias mutantes y de tipo silvestre del exon 2 en el gen NRAS humano. La mezcla de reaccion tambien contema ADN circular monocatenario del bacteriofago M13 y tres cebadores (SEQ ID NO: 9395, Tabla 6) orientados en la misma direccion para asegurar la amplificacion lineal del molde viral.
Tabla 6
Cebadores M13 usados en el Ejemplo 5
SEQ ID NO:
Funcion Secuencia 5'-3'
SEQ ID NO: 93
Cebador M13 ACATGAAAGTATTAAGAGGCTGAGACTCCTCA
SEQ ID NO: 94
Cebador M13 GAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGC
SEQ ID NO: 95
Cebador M13 GGAACGAGGGTAGCAACGGCTACA
En este ejemplo, se usaron las mismas condiciones de reaccion que en el Ejemplo 1, excepto que se anadio el molde de bacteriofago monocatenario M13 a 10.000 copias por reaccion, y se anadieron cebadores, SEQ ID NO: 6365, a concentraciones equimolares de 0,033 |iM cada una para una concentracion total de 0,1 |iM.
Los resultados se muestran en la Figura 5. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre por lmeas discontinuas y se muestra la amplificacion de las dianas mutantes de codon 12 o codon 61 de NRAS por lmeas continuas. Los resultados demuestran que cuando se uso el par de cebadores consistente en un cebador espedfico de alelo que coincide con una de las mutaciones en el codon 61 y un cebador comun, se detecto amplificacion de avance de la secuencia de NRAS no diana (tipo silvestre). Vease Figura 5A (lmeas discontinuas). Cuando tambien estaban presentes en la mezcla de reaccion el ADN de M13 y los tres cebadores con capacidad de amplificacion lineal del ADN del M13, se suprimio la amplificacion de avance de la secuencia de NRAS no diana (tipo silvestre). Vease Figura 5B. Por comparacion, cuando se uso el par de cebadores consistente en un cebador espedfico de alelo coincidente con una de las mutaciones en el codon 12 y un cebador comun, se detecto amplificacion de avance de la secuencia de NRAS no diana (tipo silvestre). Vease Figura 5C (lmeas discontinuas). Esta amplificacion de avance no se suprimio por el ADN de M13 y los tres cebadores con capacidad de amplificacion lineal. Vease Figura 5D.
Ejemplo 6
Supresion de avance mediante oligonucleotidos supresores con diversos grados de homolog^a con el genoma diana
En este ejemplo, se observo supresion de amplificacion de avance con varios oligonucleotidos supresores en una AS-PCR que se dirigfa a mutaciones en el codon 12 del gen NRAS humano. Se selecciono un cebador cadena arriba de entre SEQ ID NO: 6-23, los cebadores coincidentes con una de las mutaciones de codon 12 (35G>C, 34G>T, 35G>A, 34G>C, 34G>A y 35G>T, correspondientes a los cambios de aminoacidos G12A, G12C, G12D, G12R, G12S y G12V) en el gen NRAS humano y desapareados con la secuencia de tipo silvestre. El cebador cadena arriba se emparejo con diferentes cebadores cadena abajo que actuaban como supresores de la amplificacion de avance. Estos cebadores cadena abajo representados por SEQ ID NO: 1-5 y 24-26 tienen diversos grados de homologfa con el genoma diana que vanan entre bajo, medio y alto como se determina de acuerdo con el metodo de la presente invencion (vease Ejemplo 8 y Figura 8).
En este ejemplo, se usaron las mismas condiciones de reaccion que en el Ejemplo 1. Los oligonucleotidos supresores con homologfa baja, media y alta se usaron a 0,1 |iM.
5
10
15
20
25
30
35
Los resultados se muestran en la Figura 6. Se muestra la amplificacion del ADN genomico de tipo silvestre por lmeas discontinuas; se muestra la amplificacion de las dianas de codon 12 de NRAS por lmeas continuas. Los resultados demuestran que el cebador cadena abajo con el mayor grado de homologfa con el genoma diana como se determina por el metodo de la presente invencion (SEQ ID NO: 1), produjo el mayor nivel de supresion (vease Figura 6C), mientras que los cebadores cadena abajo con el grado medio de homologfa (SEQ ID NO: 2-5) produjeron un menor nivel de supresion, vease Figura 6B. Los cebadores cadena abajo con el menor grado de homologfa (SEQ ID NO: 24-26) no tuvieron ningun efecto en el avance de tipo silvestre y no mostraron supresion, vease Figura 6A. Tambien vale la pena observar que los oligonucleotidos supresores (SEQ ID NO: 1-5) tuvieron diversos grados de supresion, pero no tuvieron impacto negativo en la amplificacion espedfica como se mide por Ct.
Ejemplo 7
Seleccion de regiones de homolog^a dentro de la region de interns
En este ejemplo, se selecciono el gen NRAS humano como la region de interes para disenar oligonucleotidos supresores. La region de 488 pares de bases del exon 2 del gen NRAS se uso como una secuencia de consulta para comparar con la secuencia de genoma humano en condiciones relajadas seleccionando la opcion que encuentra “secuencias algo similares” usando el algoritmo “blastn”. La Figura 7 muestra que la busqueda revelo regiones de multiples homologfas en las partes definidas por los oligonucleotidos 180-270 y 360-450 de la secuencia de consulta. Estas regiones se seleccionaron como regiones de interes para diseno de oligonucleotidos supresores.
Ejemplo 8
Seleccion de oligonucleotidos supresores de la region de interes
En este ejemplo, se disenaron varios oligonucleotidos de las regiones de interes y se sometieron a un analisis de BLAST® para determinar regiones de homologfa en el genoma humano que cumple los criterios expuestos por la presente invencion. La Figura 8 muestra parametros para cada oligonucleotido y la capacidad real de suprimir la amplificacion de avance en las reacciones. Los parametros incluyen la longitud del oligonucleotido en la columna “nMer”. En la columna “Aciertos Totales” esta el numero total de “Aciertos de Blast” entre el oligonucleotido y el genoma diana que el programa Blastn fue capaz de encontrar. La rigurosidad del programa se ajusto a “secuencias algo similares”. En la columna “Aciertos con criterios”, este es el numero total de aciertos que cumplen los criterios de 75 % de identidad y menos de dos desapareamientos en el extremo 3'. La columna “Grado de Homologfa” contiene un valor asignado de la siguiente manera: se dice que el grado de homologfa con el genoma diana es “bajo” cuando solamente hay un acierto que cumple los criterios expuestos por la presente invencion. Se dice que el grado de homologfa es “medio” cuando hay diez o menos aciertos que cumplen los criterios, y se dice que el grado de homologfa es “alto” cuando hay mas de 10 aciertos que cumplen los criterios. Finalmente, se observo que la columna de “avance” indica si hay o no amplificacion de avance en presencia del oligonucleotido.

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para disenar un oligonucleotido supresor para su uso en una reaccion de amplificacion de acido nucleico para reducir la amplificacion no espedfica, comprendiendo el metodo
    (a) identificar una o mas regiones de interes en el genoma de un organismo diana;
    (b) para cada region de interes, realizar una busqueda de la secuencia de genoma diana usando la region de interes como una consulta para identificar regiones de homologfa entre la region de interes y el genoma diana;
    (c) seleccionar secciones de la region de interes que tienen las mayores regiones de homologfa en el genoma diana;
    (d) disenar uno o mas oligonucleotidos en las secciones seleccionadas en la etapa (c);
    (e) realizar una busqueda del genoma diana con los oligonucleotidos disenados en la etapa (d) para identificar los oligonucleotidos con el numero maximo de regiones de homologfa con el genoma diana que son de al menos 15 pares de longitud, tienen al menos 75% de identidad con dicho numero de regiones de homologfa y que abarcan el extremo 3' del oligonucleotido supresor mientras que no estan presentes mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos de la region 3' terminal del oligonucleotido y que no tienen regiones de complementariedad con la secuencia diana que se va a amplificar en la reaccion de amplificacion;
    (f) seleccionar el oligonucleotido identificado en la etapa (e) como el oligonucleotido supresor.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que entre la etapa (e) y (f), comprende ademas una etapa de realizar una busqueda del genoma diana con los oligonucleotidos disenados en la etapa (d) para identificar y excluir oligonucleotidos que tienen al menos dos regiones de homologfa localizadas en las cadenas opuestas del genoma diana, teniendo dichas regiones de homologfa al menos 75 % de homologfa entre el oligonucleotido y la secuencia de genoma diana, en el que dichas regiones de homologfa estan separadas por menos de aproximadamente 1000 pares de bases.
  3. 3. Un metodo para reducir la amplificacion de un molde de acido nucleico no diana en una reaccion de amplificacion de acido nucleico de una secuencia diana en el genoma de un organismo diana que comprende realizar una reaccion de amplificacion usando un conjunto de cebadores que comprenden al menos un cebador espedfico de alelo espedfico para una variante de la secuencia diana en presencia de un oligonucleotido supresor, siendo el oligonucleotido supresor extensible por extension de cebadores lineal, que no tiene regiones de complementariedad con la secuencia diana; y que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana, en el que dicha al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud, abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor, y no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que el oligonucleotido supresor comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada de un grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5.
  5. 5. Un kit para realizar una reaccion de amplificacion de la secuencia diana en el genoma de un organismo diana con amplificacion reducida de las secuencias no diana que comprende
    - un conjunto de cebadores que comprende al menos un cebador espedfico de alelo espedfico para una variante de la secuencia diana; y
    - un oligonucleotido supresor que puede extenderse por extension de cebador lineal, que no tiene regiones de complementariedad con la secuencia diana; y que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana, en el que dicha al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud, abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'.
  6. 6. El kit de la reivindicacion 5 que comprende ademas uno o mas de los siguientes: al menos un cebador comun, sondas, nucleosido trifosfatos, acido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la funcion de la polimerasa.
  7. 7. Una mezcla de reaccion para realizar una reaccion de amplificacion de la secuencia diana en el genoma de un organismo diana con amplificacion reducida de las secuencias no diana, que comprende:
    - un conjunto de cebadores adecuado para amplificacion de la secuencia diana que comprende al menos un cebador espedfico de alelo espedfico para una variante de la secuencia diana; y
    - un oligonucleotido supresor que puede extenderse por extension de cebador lineal, que no tiene regiones de complementariedad con la secuencia diana; y que tiene una secuencia que comprende al menos una region de homologfa con al menos 75 % de identidad con multiples sitios en el genoma de un organismo diana, en el que dicha al menos una region de homologfa es de al menos 15 pares de bases de longitud, abarca el extremo 3' del oligonucleotido supresor y no contiene mas de 2 desapareamientos a una distancia de 4 nucleotidos del extremo 3'.
  8. 8. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7 que comprende ademas uno o mas de los siguientes: uno o mas cebadores comunes correspondientes, una o mas sondas, nucleosido trifosfatos, al menos una acido nucleico polimerasa y tampones necesarios para la funcion de la polimerasa.
    5 9. La mezcla de reaccion de una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en la que el oligonucleotido supresor
    comprende una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-5.
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