ES2575378T3 - Métodos y reactivos para reducir la amplificación no específica - Google Patents

Abstract

Método para impedir la extensión por una ADN polimerasa termoestable de un oligonucleótido cebador que se hibrida con una secuencia de nucleótidos molde en un ensayo que utiliza la extensión de un cebador de una manera dependiente del molde, en el que el ensayo se selecciona de entre el grupo que consiste de amplificación por PCR, secuenciación del ADN y genotipado, que comprende incorporar un nucleótido N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dG) en la secuencia de nucleótidos molde, en el que el oligonucleótido cebador no puede ser extendido en más de 2 nucleótidos más allá de la posición del nucleótido N2-bencil-dG.

Description

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Metodos y reactivos para reducir la amplificacion no especffica Campo de la invencion

La presente invencion se refiere al campo de la biologfa molecular y de la qufmica de los acidos nucleicos. Mas concretamente, se refiere a metodos y reactivos para mejorar la fiabilidad de las reacciones de amplificacion de acidos nucleicos.

Antecedentes de la invencion

La invencion de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en ingles) hizo posible la amplificacion in vitro de las secuencias de acidos nucleicos. La PCR se describe en las patentes US n° 4.683.195, n° 4.683.202 y n° 4.965.188; Saiki et al., Science 230:1350-1354, 1985; Mullis et al., Cold Springs Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273, 1986, y Mullis and Faloona, Methods Enzymol. 155:335-350, 1987. El desarrollo y la aplicacion de la PCR se describen ampliamente en la literatura. Por ejemplo, se comenta un abanico de temas relacionados con la PCR en PCR Technology -principles and applications for DNA amplification, 1989, (ed. H.A.Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; and PCR Strategies, 1995 (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego. Los proveedores comerciales, tales como Applied Biosystems (Foster City, CA), comercializan reactivos de PCR y han publicado protocolos de PCR.

Desde la publicacion original de la amplificacion de acidos nucleicos, se han descrito diversos metodos de amplificacion de acidos nucleicos basados en cebadores, entre ellos, aunque sin limitacion, el ensayo de desplazamiento de cadena (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; Walker et al., Nucleic Acids Res. 20:1691-1696, 1992, y la patente US n° 5.455.166) y los sistemas de amplificacion basados en la transcripcion, incluyendo los metodos descritos en las patentes US n° 5.437.990, n° 5.409.818 y n° 5.399.491, el sistema de amplificacion basado en la transcripcion (SaT) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989) y la replicacion autosostenida de secuencias (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990, y el documento n° WO 92/08800). Se proporciona una revision de los sistemas de amplificacion en Abramson y Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993.

La especificidad de las reacciones de amplificacion basadas en cebadores depende en gran medida de la especificidad de la hibridacion y extension de los cebadores. Bajo las temperaturas elevadas utilizadas en una amplificacion tfpica, los cebadores se hibridan unicamente con la secuencia diana deseada. Sin embargo, las mezclas de reaccion de amplificacion tfpicamente se ensamblan a temperatura ambiente, a una temperatura muy inferior a la necesaria para garantizar la especificidad de la hibridacion del cebador. Bajo estas condiciones menos restrictivas, los cebadores pueden unirse no especfficamente a otras secuencias de acidos nucleicos complementarias solo parcialmente, o a otros cebadores e iniciar la sfntesis de productos de extension no deseados, los cuales pueden resultar amplificados conjuntamente con la secuencia diana. La amplificacion de productos de extension de cebador no especfficos puede competir con la amplificacion de las secuencias diana y puede reducir significativamente la eficiencia de la amplificacion de la secuencia deseada.

Un tipo observado frecuentemente de producto de amplificacion no especffico es un artefacto independiente del molde de reacciones de amplificacion denominadas "dfmero de cebadores". El dfmero de cebadores es un fragmento de doble cadena la longitud del cual tfpicamente es similar a la suma de las longitudes de los dos cebadores y aparentemente se produce en el caso de que se extienda un cebador sobre el otro cebador. El producto de extension resultante forma un molde no deseado que, debido a su corta longitud, se amplifica eficientemente.

La amplificacion no especffica puede reducirse mediante la reduccion de la formacion de productos de extension de cebador antes del inicio de la reaccion. En un metodo, denominado protocolo de "inicio en caliente", se omiten de la mezcla de reaccion uno o mas reactivos crfticos hasta que la temperatura se ha elevado suficientemente para proporcionar la especificidad de hibridacion necesaria. Los metodos de inicio en caliente manuales, en los que los tubos de reaccion se abren despues de la etapa de incubacion a alta temperatura y se han anadido los reactivos faltantes, resultan laboriosos e incrementan el riesgo de contaminacion de la mezcla de reaccion. Alternativamente puede utilizarse un material sensible al calor, tal como cera, para separar o secuestrar componentes de la reaccion, tal como se indica en la patente US n° 5.411.876 y en Chou et al., Nucl. Acids Res. 20(7):1717-1723, 1992. En estos metodos, una incubacion pre-reaccion a temperatura elevada funde el material sensible al calor, permitiendo de esta manera que se mezclen los reactivos.

Otro metodo para reducir la formacion de productos de extension de cebador antes del inicio de la reaccion se basa en la inactivacion reversible por calor de la ADN polimerasa. Las patentes US n° 5.773.258 y n° 5.677.152 describen ADN polimerasas modificadas reversiblemente mediante la union covalente de un grupo modificador. La incubacion de la ADN polimerasa inactivada a temperatura elevada resulta en el corte del enlace modificador-enzima, reactivando de esta manera el enzima.

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La inhibicion reversible no covalente de una ADN polimerasa por anticuerpos especfficos de la ADN polimerasa se describe en la patente US n° 5.338.671.

La amplificacion no especffica tambien puede reducirse mediante degradacion enzimatica de los productos de extension formados antes del inicio de la reaccion, utilizando los metodos descritos en la patente US

n° 5.418.149. La degradacion de los productos de extension recien sintetizados se consigue incorporando en la mezcla de reaccion dUTP y UNG, e incubando la mezcla de reaccion a una temperatura de entre 45°C y 60°C antes de llevar a cabo la reaccion de amplificacion. La extension del cebador resulta en la formacion de ADN que contiene uracilo, que es degradada por la UNG bajo las condiciones pre-amplificacion. Una desventaja de dicho metodo es que la degradacion del producto de extension compite con la formacion de producto de extension y la eliminacion del producto de extension de cebador no especffico puede ser menos completa. Una ventaja de dicho metodo es que el ADN que contiene uracilo que se ha introducido en la mezcla de reaccion como contaminacion de una reaccion anterior tambien resulta degradado y, de esta manera, el metodo reduce tambien el problema de la contaminacion de una PCR por el acido nucleico amplificado de reacciones anteriores.

Otro metodo para reducir la formacion de productos de extension de cebador antes del inicio de la reaccion se basa en la utilizacion de cebadores modificados en el extremo 3' o en una posicion proxima al mismo mediante la adicion de una fraccion a una amina exocfclica, tal como se indica en la patente US n° 6.001.611.

Otro metodo de prevencion de la amplificacion no especffica se basa en la utilizacion de nucleotidos modificados qufmicamente de manera reversible en los cebadores o en el molde, tal como se indica en el documento n° WO 01/75139. Las modificaciones pueden encontrarse en la posicion N2 de la guanosina y la modificacion puede ser un grupo glioxal.

Las tecnicas convencionales de biologfa molecular y qufmica de los acidos nucleicos, las cuales se encuentran comprendidas en los conocimientos del experto en la materia, se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames y S.J. Higgins. eds., 1984); PCR Technology -principles and applications for DNA amplification, 1989, (ed. H.A. Erlich) Stockton Press, New York; PCR Protocols: A guide to methods and applications, 1990, (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego; and PCR Strategies, 1995 (ed. M.A. Innis et al.) Academic Press, San Diego.

El documento n° WO 01/75139 da a conocer un metodo para prevenir la amplificacion no especffica utilizando nucleotidos modificados qufmicamente de manera reversible en los cebadores o en el molde. Entre las modificaciones se incluyen un grupo glioxal en la posicion N2 de la guanosina.

Descripcion resumida de la invencion

La presente invencion se basa en el inesperado descubrimiento de que en determinadas reacciones de amplificacion, en particular en reacciones que contienen multiples cebadores y sondas para la amplificacion y deteccion de multiples acidos nucleicos diana (por ejemplo reaccion de PCR multiplex), la sonda o sondas pueden servir como molde que podrfa conducir a la amplificacion no especffica que, a su vez, proporcionarfa la senal de falsos positivos. Para reducir la amplificacion no especffica basada en las sondas en la PCR, pueden utilizarse modificadores del surco menor que interfieren con la actividad de la ADN polimerasa pero que permiten el apareamiento de bases con un nucleotido complementario. Un ejemplo de lo anterior, de un modificador de surco menor, es el analogo de la desoxiguanosina, N2-bencil-guanosina (N2-bencil-dG), que es el objeto de la presente invencion tal como se describe en la presente memoria.

De esta manera, un aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para prevenir la extension por una ADN polimerasa termoestable de un oligonucleotido cebador que se hibrida con una secuencia de nucleotidos molde en un ensayo que utiliza la extension de un cebador de una manera dependiente del molde, en el que el ensayo se selecciona de entre el grupo que consiste de amplificacion por PCR, secuenciacion del ADN y genotipado, que comprende incorporar un nucleotido N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dG) en la secuencia de nucleotidos molde, en el que el oligonucleotido cebador no puede ser extendido en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del nucleotido N2-bencil-desoxiguanosina.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo para reducir o prevenir la amplificacion no especffica de acidos nucleicos durante una reaccion de amplificacion que comprende proporcionar por lo menos una pareja de oligonucleotidos cebadores capaz de amplificar una secuencia diana de acidos nucleicos, proporcionar una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG que bloquea la extension del oligonucleotido cebador por una ADN polimerasa en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del nucleotido N2-bencil-dG, al hibridarse el cebador oligonucleotido con la sonda oligonucleotida. En una realizacion, el ligante del surco menor es un nucleosido modificado.

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Un tercer aspecto de la presente invencion se refiere a una mezcla de reaccion para la amplificacion de acidos nucleicos, que comprende por lo menos una pareja de cebadores oligonucleotidos y por lo menos una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG.

Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un kit para la amplificacion de acidos nucleicos, que comprende por lo menos una pareja de cebadores oligonucleotidos, por lo menos una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG, por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleotidos, nucleosidos trifosfato, un tampon adecuado para la amplificacion de acidos nucleicos por como mfnimo un biocatalizador que incorpora nucleotidos, y un juego de instrucciones para llevar a cabo la amplificacion de acidos nucleicos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra (A) la estructura de la N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dg) y (B) el apareamiento de bases entre la N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dg) y la desoxicitosina (dc).

La figura 2 es una representacion grafica del bloqueo de la extension del cebador utilizando un acido nucleico molde que contiene N2-bencil-dg: (A) muestra un molde sin modificacion, (B) y (C) muestra moldes con modificaciones, en los que X es N2-bencil-dg.

La figura 3 muestra los resultados de la reaccion de extension de cebador del Ejemplo 1 en los puntos temporales de 0 min. (A) y 5 min. (B).

La figura 4 muestra las temperaturas de fusion de un oligonucleotido complemento contra tres oligonucleotidos de ensayo, un oligonucleotido de control no modificado y dos oligonucleotidos con la secuencia identica como oligonucleotido de control con la modificacion de N2-bencil-dg en la posicion N-4 o N-9.

La figura 5 muestra la eficiencia de corte de un residuo de N2-bencil-dg que contenfa sondas taqman® en comparacion con la sonda taqman® de control con una secuencia identica.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

A menos que se indique lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente memoria presentan los mismos significados entendidos comunmente por el experto ordinario en la materia a la que se refiere la presente invencion. En la descripcion y reivindicacion de la presente invencion, se utilizaron las definiciones siguientes.

La expresion "acido nucleico" se refiere a polfmeros de nucleotidos (por ejemplo ribonucleotidos, desoxirribonucleotidos, analogos de nucleotidos, etc.) y comprende acidos desoxirribonucleicos (ADN), acidos ribonucleicos (ARN), hfbridos de ADN-ARN, oligonucleotidos, polinucleotidos, aptameros, acidos peptido-nucleicos (APN), conjugados APN-ADN, conjugados APN-ARN, etc., que comprenden nucleotidos unidos entre si covalentemente, de manera lineal o ramificada. Un acido nucleico es tfpicamente de cadena sencilla o de doble cadena y generalmente contiene enlaces fosfodiester, aunque en algunos casos, se incluyen analogos de acidos nucleicos que pueden presentar esqueletos alternativos, incluyendo, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al., Tetrahedron 49(10):1925, 1993), fosforotioato (Mag et al., Nucleic Acids Res. 19:1437, 1991, y la patente US n° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321, 1989), enlaces O-metilfosforoamidita (ver Eckstein, Oligonucleotides and Analogue: A Practical Approach, Oxford University Press, 1992), y esqueletos y enlaces de acidos peptido-nucleicos (ver Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114:1895, 1992). Entre otros analogos de acidos nucleicos se incluyen aquellos con esqueletos cargados positivamente (Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6097), esqueletos no ionicos (patentes US n° 5.386.023, n° 5.637.684, n° 5.602.240, n° 5.216.141 y n° 4.469.863) y esqueletos no de ribosa, incluyendo los indicados en las patentes US n° 5.235.033 y n° 5.034.506. Los acidos nucleicos que contienen uno o mas azucares carbocfclicos tambien se encuentran incluidos en la definicion de acidos nucleicos (ver Jenkins et al., Chem. Soc. Rev., paginas 169 a 176, 1995) y tambien se describen analogos de acidos nucleicos en, por ejemplo, Rawls C. y E. News, 2 de junio de 1997, pagina 35. Estas modificaciones del esqueleto de ribosa-fosfato pueden llevarse a cabo para facilitar la adicion de fracciones adicionales, tales como marcajes, o para alterar la estabilidad y vida media de dichas moleculas en medios fisiologicos.

Ademas de dichas bases heterocfclicas naturales que se observan tfpicamente en los acidos nucleicos (por ejemplo adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), entre los analogos de nucleotidos tambien se incluyen las bases heterocfclicas no naturales, tales como las indicadas en, por ejemplo Seela et al., Helv. Chim. Acta 82:1640, 1999. Determinadas bases utilizadas en analogos de nucleotidos actuan como modificadores de la temperatura de fusion (Tf). Por ejemplo, algunos de ellos incluyen 7-deazapurinas (por ejemplo 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo propinil-dU, propinil-dC, etc.) y similares; ver, por ejemplo, la patente US n° 5.990.303. Entre otras bases heterocfclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina, derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y

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xantina, derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina, 6-azacitidina, 5-fluorocitidina, 5-clorocitidina, 5-yodocitidina, 5-bromocitidina, 5- metilcitidina, 5-propinilcitidina, 5-bromoviniluracilo, 5-fluorouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromouracilo, 5- trifluorometiluracilo, 5-metoximetiluracilo, 5-etiniluracilo, 5-propiniluracilo y similares.

Un "nucleosido" se refiere a un componente de los acidos nucleicos que comprende una base o grupo basico (que comprende por lo menos un anillo homocfclico, por lo menos un anillo heterocfclico, por lo menos un grupo arilo y/o similar) unido covalentemente a una fraccion sacarida (un azucar ribosa o un azucar desoxirribosa), un derivado de una fraccion sacarida, o un equivalente funcional de una fraccion sacarida (por ejemplo un anillo carbocfclico). Por ejemplo, en el caso de que un nucleosido incluya una fraccion sacarida, la base tfpicamente se une a una posicion 1' de dicha fraccion sacarida. Tal como se ha indicado anteriormente, una base puede ser una base natural o una base no natural. Entre los nucleosidos ejemplares se incluyen ribonucleosidos, desoxirribonucleosidos, dideoxirribonucleosidos y nucleosidos carbocfclicos.

Un "nucleotido" se refiere a un ester de un nucleosido, por ejemplo, un ester de fosfato de un nucleosido, que presenta uno, dos, tres o mas grupos fosfato unidos covalentemente a una posicion 5' de una fraccion sacarida del nucleosido.

Un "nucleotido purina" se refiere a un nucleosido que comprende una base purina, mientras que un "nucleotido pirimidina" se refiere a un nucleotido que comprende una base pirimidina.

Un "nucleotido modificado" se refiere a bases de acidos nucleicos raras o menores, nucleotidos y modificaciones, derivaciones o analogos de bases convencionales o nucleotidos e incluye nucleotidos sinteticos que presentan fracciones bases modificadas y/o fracciones sacaridas modificadas (ver Protocols for Oligonucleotide Conjugates, Methods in Molecular Biology, Vol. 26 (Suhier Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N.J., (1994)), y Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach (Fritz Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford University Press, Oxford).

Un "oligonucleotido" se refiere a un polfmero de acidos nucleicos que incluye por lo menos dos, aunque tfpicamente 5 a 50 nucleotidos, y mas tfpicamente entre 15 y 35 nucleotidos. El tamano exacto de un oligonucleotido depende generalmente de muchos factores, incluyendo la funcion ultima o utilizacion del oligonucleotido. Los oligonucleotidos pueden prepararse mediante cualquier metodo adecuado conocido de la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la clonacion y digestion de restriccion de secuencias apropiadas, o la sfntesis qufmica directa mediante un metodo tal como el metodo de fosfotriester de Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; el metodo de fosfodiester de Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; el metodo de dietilfosforamidita de Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; el metodo de triester de Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981; los metodos de sfntesis automatizada, o el metodo de soporte solido de la patente US n° 4.458.066, o cualquier otro metodo qufmico conocido de la tecnica.

Un "apareamiento de bases de Watson-Crick" o simplemente "apareamiento de bases" se refiere a los enlaces de hidrogeno "convencionales" dentro de una molecula de acidos nucleicos de doble cadena. El apareamiento de bases de Watson-Crick son enlaces de hidrogeno entre adenina y timina, entre guanina y citosina, entre adenina y uracilo y entre analogos de dichas bases.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "hibridacion" y similares se utiliza intercambiablemente y se refiere a la interaccion de apareamiento de bases de un polinucleotido con otro polinucleotido (tfpicamente un polinucleotido antiparalelo) que resulta en la formacion de un duplex u otra estructura de orden mas alto, tfpicamente denominado complejo de hibridacion. La interaccion primaria entre las moleculas polinucleotidas antiparalelas tfpicamente es especffica de base, por ejemplo A/T y G/C, mediante enlaces de hidrogeno de Watson/Crick y/o de tipo Hoogsteen. No es un requisito que dos polinucleotidos presenten una complementariedad de 100% a lo largo de su longitud completa para conseguir la hibridacion. En algunos aspectos, puede formarse un complejo de hibridacion a partir de interacciones intermoleculares, o alternativamente, puede formarse a partir de interacciones intramoleculares.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "amplificacion" y "amplificando" y similares se refieren de manera general a cualquier procedimiento que resulte en un incremento del numero de copias de una molecula o juego de moleculas relacionadas. Tal como se aplica a las moleculas polinucleotidas, la amplificacion se refiere a la produccion de multiples copias de una molecula polinucleotida, o una parte de una molecula polinucleotida, tfpicamente partiendo de una cantidad reducida de un polinucleotido (por ejemplo un genoma vfrico), en el que el material amplificado (por ejemplo un amplicon de pCr vfrico) tfpicamente es detectable. La amplificacion de polinucleotidos comprende una diversidad de procedimientos qufmicos y enzimaticos. La generacion de multiples copias de ADN a partir de una o unas cuantas copias de una molecula de ADN molde durante una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), una reaccion de amplificacion por desplazamiento de cadena (ADC), una reaccion de amplificacion mediada por transcripcion (AMT) , una reaccion de amplificacion basada en una secuencia de acidos nucleicos (ABSAN) o una reaccion en cadena de la ligasa (RCL) son formas de amplificacion. La amplificacion no se encuentra limitada a la duplicacion estricta de la molecula de partida. Por ejemplo, la generacion

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de multiples moleculas de ADNc a partir de una cantidad limitada de ARN vfrico en una muestra utilizando RT-PCR es una forma de amplificacion. Ademas, la generacion de multiples moleculas de ARN a partir de una unica molecula de ADN durante el procedimiento de transcripcion tambien es una forma de amplificacion.

En algunas realizaciones, tras la amplificacion opcionalmente se llevan a cabo etapas adicionales, por ejemplo, aunque sin limitacion, el marcaje, la secuenciacion, la purificacion, el aislamiento, la hibridacion, la resolucion de tamanos, la expresion, la deteccion y/o la clonacion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "reaccion en cadena de la polimerasa" (PCR) se refiere a un metodo para la amplificacion bien conocido de la tecnica para incrementar la concentracion de un segmento de un polinucleotido diana en una muestra, en el que la muestra puede ser una unica especie polinucleotida o multiples polinucleotidos. Generalmente, el procedimiento de PCR consiste en la introduccion de un exceso molar de dos o mas cebadores oligonucleotidos extensibles a una mezcla de reaccion que comprende la secuencia o secuencias diana deseadas, en la que los cebadores son complementarios respecto a cadenas opuestas de la secuencia diana de doble cadena. La mezcla de reaccion se somete a un programa de ciclado termico en presencia de una ADN polimerasa, resultando en la amplificacion de la secuencia diana deseada flanqueada por los cebadores de ADN. La PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es una reaccion de PCR que utiliza un molde de ARN y una transcriptasa inversa, o un enzima que presenta actividad de transcriptasa inversa, para generar en primer lugar una molecula de ADN de cadena sencilla antes de los ciclos multiples de alargamiento de cebador de ADN polimerasa dependiente de ADN. La PCR multiplex se refiere a reacciones de PCR que producen mas de un producto amplificado en una unica reaccion, tfpicamente mediante la inclusion de mas de dos cebadores en una unica reaccion. Los metodos para una amplia diversidad de aplicaciones de PCR son ampliamente conocidos de la tecnica y se describen en muchas fuentes, por ejemplo Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, vol. 15, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1994.

Un "cebador de acidos nucleicos" o "cebador" es un oligonucleotido que puede hibridarse con un acido nucleico molde y que permite la extension o alargamiento de la cadena utilizando un biocatalizador que incorpora nucleotidos. Aunque se utilizan en ocasiones otras longitudes de cebador, tfpicamente los cebadores presentan longitudes de entre 15 y 35 nucleotidos. Los acidos nucleicos de cebadores cortos generalmente requieren temperaturas mas bajas para formar complejos hfbridos suficientemente estables con acidos nucleicos de molde. Un acido nucleico cebador que es por lo menos parcialmente complementario a una subsecuencia de un acido nucleico molde tfpicamente resulta suficiente para hibridarse con el acido nucleico molde para que pueda producirse la extension. Sin embargo, el exito de la extension generalmente requiere una mayor complementariedad (es decir, menos no correspondencias respecto al molde) en el extremo 3' del cebador. Un acido nucleico cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporacion de un marcaje detectable mediante tecnicas radiologicas, espectroscopicas, fotoqufmicas, bioqufmicas, inmunoqufmicas o qufmicas.

Un "cebador extendido" se refiere a un cebador al que se ha anadido uno o mas nucleotidos adicionales. La "extension de cebador" es la accion del enzima por la que se anaden nucleotidos adicionales al cebador.

Un "acido nucleico molde", "molde" o "diana" se refiere a un acido nucleico con el que puede hibridarse un acido nucleico cebador y que puede extenderse bajo condiciones adecuadas. En el contexto de la amplificacion de acidos nucleicos, la "diana" preferentemente es una region de acidos nucleicos de doble cadena, que consiste de las secuencias complementarias por lo menos parcialmente a por lo menos dos secuencias de cebador y la secuencia intermedia. Una diana tambien puede ser un acido nucleico de cadena sencilla, que consista de una secuencia complementaria por lo menos parcialmente respecto a un cebador y una secuencia parcialmente identica al segundo cebador. Los acidos nucleicos molde pueden existir en forma de fragmentos aislados de acidos nucleicos o formar parte de un fragmento de acido nucleico de mayor tamano. Los acidos nucleicos diana pueden derivarse o aislarse a partir de esencialmente cualquier fuente, tal como microorganismos en cultivo, microorganismos no en cultivo, mezclas biologicas complejas, tejidos, sueros, tejidos o muestras antiguas o conservadas, aislados ambientales o similares. Ademas, entre los acidos nucleicos molde se incluyen opcionalmente, o se derivan a partir de, ADNc, ARN, ADN genomico, ADN genomico clonado, bibliotecas de ADN genomico, ADN o aRn fragmentado enzimaticamente, ADN o ARN qufmicamente fragmentado, ADN o ARN fragmentado ffsicamente, o similares. Los acidos nucleicos molde tambien pueden sintetizarse qufmicamente utilizando tecnicas conocidas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "sonda" se refiere tfpicamente a un polinucleotido que es capaz de hibridarse con un acido nucleico diana de interes. Tfpicamente, aunque no exclusivamente, una sonda esta asociada a un marcaje o fraccion informadora adecuada de manera que la sonda (y por lo tanto, su diana) puede ser detectada, visualizada, medida y/o cuantificada. Entre los sistemas de deteccion para sondas marcadas se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, la deteccion de fluorescencia, la inhibicion de fluorescencia (por ejemplo al utilizar un sistema de deteccion de parejas de FRET), la actividad enzimatica, la absorbancia, la masa molecular, la radioactividad, la luminiscencia o las propiedades de union que permiten la union especffica del informador (por ejemplo en el caso de que el informador sea un anticuerpo). En algunas realizaciones, una sonda puede ser un anticuerpo, y no un polinucleotido, que presenta especificidad de union para una secuencia nucleotida de acidos nucleicos de interes. No se pretende que la presente invencion se encuentre limitada a cualquier sonda, marcaje o sistema de deteccion de sondas en particular. La fuente del polinucleotido utilizado en la sonda no se encuentra

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limitada y puede producirse sinteticamente en un sistema no enzimatico o puede ser un polinucleotido (o una parte de un polinucleotido) que se produce utilizando un sistema biologico (por ejemplo enzimatico) (por ejemplo en una celula bacteriana).

Tfpicamente una sonda es suficientemente complementaria a una secuencia diana especffica contenida en un acido nucleico para formar un complejo de hibridacion estable con la secuencia diana bajo condiciones de hibridacion seleccionadas, tales como, aunque sin limitacion, condiciones de hibridacion restrictiva. Un ensayo de hibridacion que se lleve a cabo utilizando la sonda bajo condiciones de hibridacion suficientemente restrictivas permite la deteccion selectiva de una secuencia diana especffica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un cebador es "especffico" para una secuencia molde en el caso de que el numero de no correspondencias presentes entre la secuencia del cebador y la secuencia diana es inferior al numero de no correspondencias presente entre la secuencia del cebador y secuencias no diana que pueden encontrarse presentes en la muestra. Pueden seleccionarse condiciones de hibridacion bajo las que se forman duplex estables unicamente en el caso de que el numero de no correspondencias presentes no sea superior al numero de no correspondencias presentes entre la secuencia del cebador y la secuencia diana. Bajo dichas condiciones, el cebador puede formar un duplex estable unicamente con una secuencia diana. De esta manera, la utilizacion de cebadores especfficos de diana bajo condiciones de amplificacion convenientemente restrictivas de dichas secuencias diana que contienen los sitios de union del cebador a la diana. La utilizacion de condiciones de amplificacion especfficas de secuencia permite la amplificacion especffica de aquellas secuencias diana que contienen los sitios de union a cebador exactamente complementarios.

La expresion "amplificacion no especffica" se refiere a la amplificacion de secuencias de acidos nucleicos diferentes de la secuencia diana, que resulta de la hibridacion de los cebadores con secuencias diferentes de la secuencia diana y que despues sirven como sustrato para la extension de cebadores. La hibridacion de un cebador con una secuencia no diana se denomina "hibridacion no especffica" y puede producirse durante las condiciones de temperatura mas baja y de astringencia reducida previas a la amplificacion.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "amplicon" se refiere a una molecula polinucleotida (o colectivamente, la pluralidad de moleculas) producidas tras la amplificacion de un acido nucleico diana particular. El metodo de amplificacion utilizado para generar el amplicon puede ser cualquier metodo adecuado, mas tfpicamente, por ejemplo, mediante la utilizacion de una metodologfa de PCR. Un amplicon es tfpicamente, aunque no exclusivamente, un amplicon de ADN. Un amplicon puede ser de cadena sencilla o de doble cadena, o una mezcla de los mismos en cualquier proporcion de concentraciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "deteccion en tiempo real de la acumulacion de amplicones" se refiere a la deteccion y, tfpicamente, a la cuantificacion de los mismos, de un amplicon o amplicones especfficos, a medida que el amplicon o amplicones son producidos (tfpicamente mediante PCR) sin necesidad de una etapa de deteccion o cuantificacion tras completarse la amplificacion. Las expresiones "PCR en tiempo real" o "PCR cinetica" se refieren a la deteccion y/o cuantificacion en tiempo real de amplicones generados en una PCR.

Un metodo comun para la deteccion en tiempo real de la acumulacion de amplicones es mediante un ensayo de nucleasa 5', tambien denominado ensayo de nucleasa 5' fluorogenica, por ejemplo un analisis de TaqMan; ver Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280, 1991, y Heid et al., Genome Research 6:986-994, 1996. En el procedimiento de PCR TaqMan, se utilizan dos cebadores oligonucleotidos para generar un amplicon especffico de la reaccion de PCR. Se disena un tercer oligonucleotido (la sonda TaqMan) para hibridarlo con una secuencia de nucleotidos en el amplicon situado entre los dos cebadores de PCR. La sonda puede presentar una estructura que no es extensible por la ADN polimerasa utilizada en la reaccion de PCR y tfpicamente (aunque no necesariamente) se encuentra comarcada con un pigmento informador fluorescente y una fraccion inhibidora en estrecha proximidad entre sf. La emision del pigmento informador es inhibida por la fraccion inhibidora en el caso de que el emisor fluorescente y el inhibidor se encuentran en estrecha proximidad, tal como se encuentran en la sonda. En algunos casos, la sonda puede marcarse con unicamente un pigmento informador fluorescente u otra fraccion detectable.

La reaccion de PCR TaqMan utiliza una ADN polimerasa dependiente de ADN termoestable que presenta una actividad de nucleasa 5' a 3'. Durante la reaccion de amplificacion por PCR, la actividad de nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa corta la sonda marcada que se encuentra hibridada con el amplicon de una manera dependiente del molde. Los fragmentos de sonda resultantes se disocian del complejo de cebador/molde, de manera que el pigmento informador se encuentra libre del efecto inhibidor de la fraccion inhibidora. Se libera aproximadamente una molecula de pigmento informador por cada nueva molecula de amplicon sintetizada, y la deteccion del pigmento informado no inhibido proporciona la base para la interpretacion cuantitativa de los datos, de manera que la cantidad de pigmento informador fluorescente liberado es directamente proporcional a la cantidad de amplicon molde.

Una medida de los datos de ensayo de TaqMan tfpicamente se expresa como ciclo umbral (CU). Se registraron los niveles de fluorescencia durante cada ciclo de PCR y son proporcionales a la cantidad de producto amplificado hasta este punto en la reaccion de amplificacion. El ciclo de PCR en el que se registra por primera vez la senal

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fluorescente como estadfsticamente significativa, o en que la senal fluorescente es superior a algun otro nivel arbitrario (por ejemplo el nivel arbitrario de fluorescencia, o NAF), es el ciclo umbral (CU).

Los protocolos y reactivos para los ensayos de nucleasas 5' son bien conocidos por el experto en la materia y se han descrito en diversas fuentes. Por ejemplo, las reacciones de nucleasa 5' y las sondas se indican en la patente US n° 6.214.979, titulada "Homogeneous assay system", publicada el 10 de abril de 2001, de Gelfand et al.; la patente US n° 5.804.375, titulada "Reaction mixtures for detection of target nucleic acids", publicada el 8 de septiembre de 1998, de Gelfand et al.; patente US n° 5.487.972, titulada "Nucleic acid detection by the 5'-3' exonucleasa activity of polymerases acting on adjacently hybridized oligonucleotides", publicada el 30 de enero de 1996, de Gelfand et al., y la patente US n° 5.210.015, titulada "Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase", publicada el 11 de mayo de 1993, de Gelfand et al.

Tambien se conocen variaciones de las metodologfas de deteccion de amplicones en tiempo real y en particular en las que la sonda nucleasa 5' se sustituye por pigmento intercalante de ADN de doble cadena, resultando en fluorescencia que depende de la cantidad de amplicon de doble cadena que se encuentra presente en la reaccion de amplificacion; ver, por ejemplo, la patente US n° 6.171.785, titulada "Methods and devices for homogeneous nucleic acid amplification and detector", publicada el 9 de enero de 2001, de Higuchi, y la patente US n° 5.994.056, titulada "Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection", publicada el 30 de noviembre de 1999, de Higuchi.

Puede llevarse a cabo la PCR TaqMan® utilizando kits y equipos disponibles comercialmente, tales como, por ejemplo, el sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, Calif.) o LightCycler® (Roche Applied Sciences, Mannheim, Alemania). En una realizacion preferente, el procedimiento de ensayo de nucleasa 5' se lleva a cabo en un dispositivo de PCR cuantitativa en tiempo real, tal como el sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7700. El sistema consiste de un termociclador, laser, dispositivo de carga acoplada (DCC), camara y ordenador. El sistema amplifica muestras en un formato de placa de microtitulacion de 96 pocillos en un termociclador. Durante la amplificacion, se recoge en tiempo real la senal fluorescente inducida por laser a traves de cables de fibra optica para la totalidad de los 96 pocillos y se detecta en la camara de DCC. El sistema incluye software para operar el aparato y para analizar los datos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, un "gen" se refiere a cualquier segmento de ADN asociado a una funcion biologica. De esta manera, entre los genes se incluyen secuencias codificantes y, opcionalmente, las secuencias reguladoras requeridas para la expresion de las secuencias codificantes.

Los acidos nucleicos se "extienden" o "alargan" al incorporar nucleotidos adicionales en los acidos nucleicos, por ejemplo por un biocatalizador incorporador de nucleotidos, en el extremo 3' de un acido nucleico.

Una "fraccion" o "grupo" se refiere a una de las partes en las que algo, tal como una molecula, se divide (por ejemplo un grupo funcional, un grupo sustituyente, o similar). Por ejemplo, un nucleotido tfpicamente comprende un grupo basico (por ejemplo adenina, timina, citosina, guanina, uracilo o un analogo), una fraccion sacarida y uno o mas grupos fosfato.

Un "grupo bencilo" se refiere a un grupo aromatico monovalente con la formula C6H5CH2- y se utiliza intercambiablemente con el termino "fenilmetilo".

Un "genotipo" se refiere a la totalidad o parte de la constitucion genetica de una celula o sujeto, o grupo de celulas o sujetos. Por ejemplo, un genotipo incluye las mutaciones y/o alelos particulares (por ejemplo polimorfismos tales como los polimorfismos de nucleotido unico (PNU) o similares) presentes en un locus dado o distribuidos en un genoma. El "genotipado" se refiere a un ensayo que determina el genotipo de una celula o sujeto.

Un "biocatalizador que incorpora nucleotidos" o "enzima incorporador de nucleotidos" se refiere a un catalizador (o enzima) que cataliza la incorporacion de nucleotidos en un acido nucleico. Entre los enzimas incorporadores de nucleotidos ejemplares se incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, transferasas terminales, transcriptasas inversas, telomerasas y similares.

Un "enzima termoestable" se refiere a un enzima que es estable (es decir, que resiste la degradacion o la desnaturalizacion) y que conserva suficiente actividad catalftica al someterlo a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo seleccionados. Por ejemplo, una polimerasa termoestable conserva suficiente actividad para llevar a cabo posteriores reacciones de extension de cebador al someterla a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para desnaturalizar los acidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalizacion de los acidos nucleicos son bien conocidas de la tecnica y se ejemplifican en las patentes US n° 4.683.202 y n° 4.683.195. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable tfpicamente resulta adecuada para la utilizacion en una reaccion de ciclado termico, tal como la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR"). Entre los ejemplos de polimerasas de acidos nucleicos termoestables se incluyen ADN polimerasa Taq de Thermus aquaticus, polimerasa Z05 de Thermus sp., polimerasa de Thermus flavus, polimerasas de Thermotoga maritima, tales como las polimerasas TMA-25 y TMA-30, la ADN polimerasa Tth,

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Un "enzima modificado" se refiere a un enzima que comprende un polfmero de aminoacidos en el que por lo menos un monomero difiere de la secuencia de referencia, tal como una forma nativa o de tipo salvaje del enzima u otra forma modificada del enzima. Entre las modificaciones ejemplares se incluyen inserciones, deleciones y sustituciones de monomeros. Entre los enzimas se incluyen ademas enzimas quimericos que presentan secuencias componentes identificables (por ejemplo dominios estructurales o funcionales, etc.) derivadas de dos o mas pacientes. Tambien se encuentra incluida en la definicion de enzimas modificados aquellos que comprenden modificaciones qufmicas de la secuencia de referencia. Entre los ejemplos de polimerasas modificadas se incluyen la ADN polimerasa CS5 G46E E678G, la ADN polimerasa CS5 G46E L329A E678G, la ADN polimerasa CS5 G46E L329A D640G S671F, la ADN polimerasa CS5 G46E L329A D640G S671F E678G, la ADN polimerasa CS6 G46E E678G, la polimerasa AZ05, la polimerasa AZ05-Gold, la polimerasa AZ05, la ADN polimerasa Taq E615G, la polimerasa TMA-25 E678G, la polimerasa TMA-30 E678G y similares.

La expresion "actividad de nucleasa 5' a 3'" o "actividad de nucleasa 5'-3'" se refiere a una actividad de una acido nucleico polimerasa, tfpicamente asociada a la sfntesis de cadenas de acidos nucleicos, en la que se extraen nucleotidos del extremo 5' de la cadena de acidos nucleicos, por ejemplo la ADN polimerasa I de E. coli presenta esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no la presenta.

Una polimerasa que "no presenta sustancialmente actividad de nucleasa 5' a 3'" se refiere a una polimerasa que presenta 50% o menos (por ejemplo <25%, <20%, <15% o <10%) de la actividad de nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa Taq. Los metodos para medir la actividad de la nucleasa 5' a 3' y las condiciones para la medicion son bien conocidas de la tecnica; ver, por ejemplo, la patente US n° 5.466.591. Entre los ejemplos de ADN polimerasas que sustancialmente no presentan actividad de nucleasa 5' a 3' se incluyen el fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, una ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) que no presenta los 235 aminoacidos N-terminales (por ejemplo tal como se indica en la patente US n° 5.616.494 y denominado comunmente en la tecnica, "fragmento Stoffel"). Entre otros ejemplos se incluyen una ADN polimerasa termoestable que presenta suficientes deleciones (por ejemplo deleciones N-terminales), mutaciones o modificaciones para eliminar o inactivar el dominio responsable de la actividad de nucleasa 5' a 3'; ver, por ejemplo, la patente US n° 5.795.762.

Un "marcaje" se refiere a una fraccion unida (covalente o no covalentemente) a una molecula y capaz de proporcionar informacion sobre la molecula. Entre los marcajes ejemplares se incluyen marcajes fluorescentes, marcajes colorimetricos, marcajes quimioluminiscentes, marcajes bioluminiscentes, marcajes radioactivos, grupos modificadores de masa, anticuerpos, antfgenos, biotina, haptenos y enzimas (incluyendo peroxidasa, fosfatasa, etc.).

Un "inicio en caliente" en el contexto de una reaccion de amplificacion de acidos nucleicos se refiere a un protocolo en el que se omite de la mezcla de reaccion por lo menos un reactivo crftico (o, en caso de hallarse presente en la mezcla de reaccion, el reactivo se mantiene inactivo) hasta que la temperatura se eleva suficientemente para proporcionar la especificidad de hibridacion necesaria del cebador o cebadores. Un "enzima de inicio en caliente" es un enzima, tfpicamente una polimerasa de acidos nucleicos, capaz de actuar como el reactivo "omitido" o inactivo en un protocolo de inicio en caliente.

La expresion "mezcla de reaccion" se refiere a una solucion que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reaccion dada. Una "mezcla de reaccion de amplificacion", referida a una solucion que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo una reaccion de amplificacion, tfpicamente contiene cebadores oligonucleotidos y una ADN polimerasa o ligasa en un tampon adecuado. Una "mezcla de reaccion de PCR" tfpicamente contiene cebadores oligonucleotidos, los dNTP de una ADN polimerasa termoestable y un cation metalico divalente en un tampon adecuado. Una mezcla reaccion se denomina completa en el caso de que contenga todos los reactivos necesarios para permitir la reaccion e incompleta en el caso de que contenga solo un subgrupo de los reactivos necesarios. El experto en la materia entendera que los componentes de la reaccion se almacenan rutinariamente en forma de soluciones separadas, conteniendo cada una un subgrupo de los componentes totales, por motivos de comodidad, almacenamiento o estabilidad, o para permitir el ajuste dependiente de la aplicacion de las concentraciones de los componentes y que los componentes de la reaccion se agrupan antes de la reaccion para crear una mezcla de reaccion completa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "kit" se utiliza en referencia a una combinacion de artfculos que facilita un procedimiento, metodo, ensayo analisis o manipulacion de una muestra. Los kits pueden contener instrucciones escritas que describen como utilizar el kit (por ejemplo instrucciones que describen los metodos de la presente invencion), reactivos qufmicos o enzimas requeridos para el metodo, cebadores y sondas, asf como cualesquiera otros componentes.

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que determinados nucleotidos modificados, en caso de hallarse presentes en un acido nucleico molde, son capaces de impedir o inhibir la extension de un cebador oligonucleotido por la ADN polimerasa, aunque todavfa pueden mantener el apareamiento de bases de Watson- Crick con su base complementaria en el cebador. Uno de estos nucleotidos modificados es el analogo de la desoxiguanosina denominado N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dG) que, tal como se muestra en la figura 1A,

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contiene un grupo bencilo en el nitrogeno de C-2 del grupo amino exocfclico. Los nucleotidos con modificaciones covalentes de los grupos amino exocfclicos se indican en la patente US n° 6.001.611. La sfntesis de dichos nucleotidos y los oligonucleotidos que incorporan dichos nucleotidos tambien se indican en la patente US n° 6.001.611.

Aunque sin restringirse a ninguna teorfa en particular, se cree que N2-bencil-dG es capaz de impedir la extension de los cebadores al ocupar el surco menor del ADN de doble cadena, comportandose de esta manera como un "ligante de surco menor" e interfiriendo con el sitio activo de la ADN polimerasa. Sin embargo, el apareamiento de bases con un nucleotido desoxicitosina (dG) complementario todavfa puede producirse ya que los tres enlaces de hidrogeno no resultan afectados por la presencia de la fraccion bencilo (figura 1B).

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para impedir la extension de una ADN polimerasa termoestable de un cebador oligonucleotido que se hibrida con una secuencia de nucleotidos molde, que comprende incorporar un ligante de surco menor en la secuencia de nucleotidos molde, en la que el ligante de surco menor es un nucleotido modificado y el nucleotido modificado es N2-bencil-dG y en el que el cebador no puede ser extendido en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del nucleotido N2-bencil-dG. Dicho metodo serfa aplicable al rendimiento de la amplificacion por PCR, a la secuenciacion de acidos nucleicos, al genotipado y a otras aplicaciones que utilizan la extension de un cebador de una manera dependiente del molde.

Las propiedades unicas de N2-bencil-dG tambien permitirfan su utilizacion en la reduccion o bloqueo de la amplificacion no especffica en una reaccion de amplificacion basada en cebadores. Se cree que se produce la amplificacion no especffica en el caso de que se forme un duplex de hibridacion transitorio inestable entre un cebador y una molecula no diana, en el que el extremo 3' del cebador se aparea momentaneamente con una base complementaria en la otra molecula. La extension inicial del cebador resulta en la formacion de una secuencia complementaria que estabiliza el duplex y permite la extension posterior. La patente US n° 6.001.611 da a conocer la utilizacion de cebadores que contienen nucleotidos modificados para el bloqueo de la amplificacion no especffica que resulta de la formacion de dfmeros de cebadores en los que el duplex de hibridacion transitorio se forma entre un cebador y otro cebador. La N2-bencil-dG no se utilizarfa en un cebador para bloquear la amplificacion no especffica porque su presencia en los productos de extension de cebador que se utilizan como moldes en ciclos de amplificacion posteriores causarfa la terminacion de la extension del cebador. Sin embargo, en las reacciones de amplificacion que utilizan una sonda (por ejemplo una sonda nucleasa 5' en el ensayo de PCR Taqman), la incorporacion de N2-bencil-dG ha resultado en la reduccion o el bloqueo de la amplificacion no especffica que resulta de que tiene lugar la hibridacion entre un cebador y una sonda.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para reducir o impedir la amplificacion no especffica de acidos nucleicos durante una reaccion de amplificacion que comprende proporcionar por lo menos una pareja de oligonucleotidos cebadores capaz de amplificar una secuencia diana de acidos nucleicos, proporcionar una sonda oligonucleotida que incorpora un ligante de surco menor que bloquea la extension del cebador por parte de una ADN polimerasa en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del ligante de surco menor al hibridarse con la sonda oligonucleotida, en el que el ligante de surco menor es un nucleotido modificado y el nucleotido modificado es N2-bencil-dG.

En otro aspecto, la invencion proporciona una mezcla de reaccion para la amplificacion de acidos nucleicos, que comprende por lo menos una pareja de cebadores oligonucleotidos y por lo menos una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG. En algunas realizaciones, la mezcla de reaccion comprende ademas los reactivos y soluciones generalmente necesarios para la amplificacion de los acidos nucleicos, incluyendo un biocatalizador incorporador de nucleotidos, precursores de acidos nucleicos, es decir, nucleosidos trifosfato, e iones organicos e inorganicos, adecuados para el soporte de la activdiad del biocatalizador incorporador de nucleotidos.

En otro aspecto, la invencion proporciona kits para llevar a cabo la reaccion de amplificacion segun la invencion. El kit incluye generalmente componentes especfficos de ensayo, asf como componentes generalmente necesarios para llevar a cabo ensayos de amplificacion del ADN. Como componentes especfficos de ensayo, el kit de amplificacion de la presente invencion tfpicamente incluye por lo menos una pareja de oligonucleotidos cebadores, por lo menos un oligonucleotido sonda que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG y un juego de instrucciones para llevar a cabo la reaccion de amplificacion de la presente invencion. En algunas realizaciones, el kit incluye dos o mas parejas de oligonucleotidos cebadores y dos o mas sondas oligonucleotidas, en el que cada sonda oligonucleotida incorpora un nucleotido N2-bencil-dG. Como componentes generalmente requeridos para la amplificacion de los acidos nucleicos, el kit de la presente invencion tfpicamente incluye uno o mas de entre un biocatalizador incorporador de nucleotidos, precursores de acidos nucleicos, tales como nucleosidos trifosfato (desoxirribonucleosidos trifosfato o ribonucleosidos trifosfato), opcionalmente una pirofosfatasa, para minimizar la pirofosforolisis sde los acidos nucleicos, una uracil-N-glucosilasa (UNG) para la proteccion frente a la contaminacion cruzada de las reacciones de amplificacion, y reactivos y tampones previamente preparados necesarios para la reaccion y deteccion de la amplificacion.

Los ejemplos y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprension de la presente invencion, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas.

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Ejemplo 1: extension de cebadores

Con el fin de demostrar que un acido nucleico molde que contiene N2-bencil-dG es capaz de bloquear la extension de un cebador por parte de la ADN polimerasa, tal como se ilustra graficamente en la figura 2, se preparo un experimento de extension de cebador utilizando un cebador oligonucleotido marcado con FAM y tres oligonucleotidos molde complementarios con las secuencias que se indican a continuacion:

NJS01 FAM-CCCTCGCAGCCGTCCAACCAACTCA (SEC ID n° 1)

NJS03 GGGAGCGTCGGCAGGTTGGTTGAGTAGGTCTTGTTT (SEC ID n° 2)

NJS339-1A CGGAGCGTCGGCAGGTTGGTTGAGTAGETCTTGTTT (SEC ID n° 3)

NJS339-2A CGGAGCGTCGGCAGGTT GGTT GAGT AGGTCTTETTT (SEC ID n° 4)

(E = N2-bencil-dG)

Cada reaccion de extension de cebador (50 pl) contema cebador 50 nM y oligonucleotido molde 75 nM, con 15 unidades (20 nM) de ADN polimerasa Z05D, 337,5 pM de cada uno de entre dATP, dCTP, dGTP y dUTP, tricina 50 mM (pH 8,0), acetato potasico 100 mM (pH 7,0), acetato de manganeso 3 mM, glicerol al 4%, DMSO al 5% y Tween- 20 al 0,01%. La extension del cebador con ADN polimerasa Z05D se llevo a cabo a 60°C y la reaccion se termino mediante la adicion de EDTA en diversos puntos temporales. Los productos de extension de cebador se diluyeron en tampon de carga con formamida y se analizaron mediante electroforesis capilar (analizador genetico ABI PRISM® 3100) en presencia de estandares de tamano marcados.

Se muestran los resultados en la figura 3. Los productos de extension de los moldes que contenfan N2-bencil-dG son claramente mas pequenos que el producto de extension del molde de control. Lo anterior indica que un acido nucleico molde que contiene un residuo N2-bencil-dG puede detener o reducir drasticamente la tasa de extension de un cebador por la ADN polimerasa.

Eiemplo 2: estabilidad de los duplex

Para estudiar el efecto de la N2-bencil-dG sobre la hibridacion, se llevo a cabo un experimento de temperatura de fusion utilizando un oligonucleotido complementario no modificado y tres oligonucleotidos de ensayo. Los tres oligonucleotidos de ensayo para los que se determinaron las temperaturas de fusion representan: (a) un oligonucleotido de control no modificado, (b) un oligonucleotido con una secuencia identica a (a) con N2-bencil-dG en la posicion N-9 y (c) un oligonucleotido con una secuencia identica a (a) con N2-bencil-dG en la posicion N-4. Las secuencias de nucleotidos de dichos oligonucleotidos son las siguientes:

Complemento 3' -AAACAAGACCTACTCAACCAACCTGCCGACGCTCCG (SEC ID n° 5)

Control de ensayo 5' -TTTGTTCTGGATGAGTTGGTTGGACGGCTGCGAGGC (SEC ID n° 6)

Ensayo N-9 5' -TTTGTTCTEGAT GAGTT GGTT GGACGGCTGCGAGGC (SEC ID n° 7)

Ensayo N-4 5' -TTTETT CT GGAT GAGTT GGTT GGACGGCTGCGAGGC (SEC ID n° 8)

Las condiciones experimentales eran las siguientes: se preparo cada reaccion en un volumen de 50 pl y en dos replicas y contema 40 pmoles de cada oligonucleotido de ensayo y 40 pmoles de oligonucleotido complementario, en un tampon que contema acetato potasico 90 mM (pH 7,0), tricina 50 mM (pH 8,3), acetato manganoso 3 mM, glicerol al 3%, DMSO al 5%, y 300 pM de cada uno de entre dATP, dCTp y dGTp y 600 pM de dUTP. La temperatura de fusion para el duplex de hibridacion formado entre cada oligonucleotido de ensayo y el oligonucleotido complementario se determino utilizando el aparato LightCycler® 480 bajo las condiciones siguientes. Cada pocillo de reaccion en primer lugar se calento a 91°C y se enfrio rapidamente a 40°C para permitir que tuviese lugar la hibridacion. A continuacion se elevo continuamente la temperatura a una tasa de incremento de 0,06°C/s hasta 90°C. La deteccion de la fusion de los duplex de ADN se realizo a partir del cambio de la fluorescencia del pigmento ligante de ADN de doble cadena Syto-13 (concentracion final: 100 pM).

Los resultados del experimento se muestran en la figura 4, en la que el panel superior muestra la fluorescencia absoluta en un grafico como funcion de la temperatura e ilustrando el panel superior los mismos datos de la curva de fusion, aunque mostrando los datos como un grafico de primera derivada (como funcion de la temperatura). Solo se observo una pequena diferencia en la temperatura de fusion entre el oligonucleotido de control y los oligonucleotidos que contenfan N2-bencil-dG, con valores de ATf de entre 0,3°C y 0,5°C. De esta manera, la presencia de N2-bencil- dG en un oligonucleotido no conduce a una desestabilizacion significativa de un duplex de hibridacion formado entre el oligonucleotido que contiene N2-bencil-dG y una secuencia de acidos nucleicos complementaria. El presente experimento demuestra que puede incorporarse N2-bencil-dG dentro de una sonda oligonucleotida (por ejemplo una sonda TaqMan®) sin afectar negativamente las propiedades de hibridacion de la sonda.

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Ejemplo 3: eficiencia de corte

Con el fin de investigar si una sonda oligonucleotida 5'-nucleasa que contiene N2-bencil-dG puede ser cortada eficazmente por la actividad de nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa en un ensayo de PCR TaqMan®, se llevo a cabo el experimento a continuacion. Las sondas TaqMan® con diana en secuencias vfricas especfficas en VIH-1, VIH-2, VHB y VHC se modificaron para que contuviesen un residuo de N2-bencil-dG. A continuacion, se comparo cada una de las sondas TaqMan® modificadas con su sonda contrapartida TaqMan® no modificada en un ensayo de PCR cinetica estandar utilizando cebadores especfficos de diana y ADN polimerasa Z05 para su capacidad de deteccion de amplicon que indica la eficacia con que la sonda es cortada por la actividad de nucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa.

Se muestran los resultados en la figura 5 representados como curvas de crecimiento para cada reaccion de PCR con la fluorescencia representada frente al numero de ciclos de la PCR. Para cada diana existe poca o ninguna diferencia entre las curvas de crecimiento generadas utilizando sondas TaqMan® modificadas con N2-bencil-dG y las que utilizan sondas TaqMan® no modificadas. Lo anterior demuestra que la eficiencia de corte por parte de la ADN polimerasa de las sondas TaqMan® que contienen N2-bencil-dG es la misma que la de una sonda TaqMan® que no contiene N2-bencil-dG.

Ejemplo 4: reduccion de falsos positivos

Durante un ensayo de PCR multiplex, se observo que aparecfan datos falsos positivos como resultado de la amplificacion no especffica en un canal que contenfa una sonda TaqMan® especffica de VHC marcada con el pigmento fluorescente JA270. Tal como se muestra en la Tabla 1, la incorporacion de N2-bencil-dG en la sonda TaqMan® de VHC pudo eliminar la presencia de la senal de falsos positivos en el canal JA270 (canal 3).

Tabla 1

Reactivos inesperados (falsos positivos)

Resumen de muestras

Matriz Replicas Canal 3 Global

Sondas de control

NHP 120 3 3%

Sondas bencil-dG

NHP 120 0 0%

Ejemplo 5: reduccion de falsos positivos en un ensayo de PCR multiplex

Con el fin de mostrar el potencial de la modificacion de N2-bencil-dG de las sondas TaqMan® como medio para reducir los falsos positivos, se llevo a cabo un experimento en el que se midio la tasa de falsos positivos utilizando sondas convencionales y aquellas con N2-bencil-dG en localizaciones especfficas dentro de las secuencias de la sonda. Debido a que la falsa positividad es relativamente infrecuente en sistemas de amplificacion altamente optimizados, se desarrolla una mezcla maestra de PCR modificada que favorecfa la generacion de productos de amplificacion no especfficos. En este sistema modelo, pudo inducirse un nivel elevado de falsa positividad de manera que resultase evidente una diferencia estadfsticamente significativa entre las tasas a partir de un numero relativamente limitado de muestras de entrada.

Se procesaron muestras de plasma humano normal (PHN, 850 pl cada uno, N=388 para cada condicion sometida a ensayo) que habfan sido previamente confirmadas como negativas para los virus que debfan detectarse: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la hepatitis B (VHB), utilizando un sistema automatizado de preparacion y amplificacion de ADN (Roche Pilot System). Los eluidos de cada muestra sometidos al sistema de preparacion de muestros se recogieron y distribuyeron (25 pl en cada pocillo) en placas de amplificacion para la deteccion mediante PCR en tiempo real utilizando sondas TaqMan®. A continuacion se anadieron 25 pl de una mezcla maestra activada (acetato de manganeso 6,6 mM, pH 6,1, acetato sodico 0,036 mM, DMSO al 10,8%, acetato sodico 0,054 mM, pH 7,0, acetato potasico 240 mM, pH 7,0, glicerol al 6%, tricina 120 mM, pH 8,0, 0,4 U/ml de UNG, dGTP 800 mM, dATP 800 mM, dCTP 800 mM, dUTP 1.600 mM, 1,8 U/ml de ADN polimerasa Z05-D) que contenfa cebadores directos e inversos y sondas TaqMan® con o sin N2-bencil-dG, llevando el volumen de reaccion final a 50 pl y las placas se sellaron y se introdujeron en el termociclador. El perfil de termociclado se llevo a cabo tal como se muestra a continuacion, en la Tabla 2.

Tabla 2

Modo

Temperatura (°C) Modo de adquisicion Meseta (hh:mm:ss) Medicion (hh:mm:ss) Tasa de cambio (°C/s) Ciclos

Pre- PCR

Etapa de UNG 50 - 00:02:00 00:00:00 2.2 1

Desnaturalizacion de UNG/molde

94 - 00:00:05 00:00:00 4.4

5

10

15

20

25

Etapa a TA 55 - 00:02:00 00:00:00 2.2

60

- 00:06:00 00:00:00 4.4

65

- 00:04:00 00:00:00 4.4

1. Medicion

95 - 00:00:05 00:00:00 4.4 5

55

Sencillo 00:00:30 00:00:08 2.2

2. Medicion

91 - 00:00:05 00:00:00 4.4 45

58

Sencillo 00:00:25 00:00:08 2.2

Enfriamiento

40 - 00:02:00 00:00:00 2.2 1

Las secuencias de cebador directo e inverso utilizadas en el experimento presentaban concentraciones finales comprendidas entre 0,125 pM y 0,3 pM y se seleccionaron de entre las siguientes. SEC ID n° 9 a 24 para VIH de tipo 1 (VIH-1) GAG; SEC ID n° 25 a 32 para LTR de VIH; SEC ID n° 33 a 35 para VIH de tipo 2 (VIH-2); SEC ID n° 36 y 37 para el VHB; SEC ID n° 38 a 59 del VHC.

Las secuencias de sonda TaqMan® utilizadas en el experimento presentaban concentraciones finales comprendidas entre 0,15 pM y 0,3 pM y se seleccionaron de entre las siguientes. SEC ID n° 60 a 64 para VIH-1 GAG; Sec ID n° 65 a 66 para LTR de VIH; SEC ID n° 67 para VIH-2; SEC ID n° 68 para el VHB; SEC ID n° 69 a 76 para el VHC. Todas las sondas se marcaron en el extremo 5' con un pigmento fluorescente: FAM para las sondas de VIH (tanto VIH-1 como VIH-2), HEX para la sonda de VHB, y JA270 para la sonda de VHC, y contenfan una molecula inhibidora BHQ-2 interna.

Para las sondas TaqMan® que contenfan el nucleotido modificado N2-bencil-dG, un residuo interno desoxiguanosina situado aproximadamente en una posicion que es intermedia en la sonda se modifico de dG a N2-bencil-dG. Por ejemplo, en la sonda de VIH-2 (SEC ID n° 67), el residuo dG en la posicion 12 desde el extremo 5'-terminal se convirtio en N2-bencil-dG. De manera similar, para la sonda del VHB (SEC ID n° 68) se introdujo N2-bencil-dG en la posicion 20 desde el extremo 5'.

Los resultados del experimento indicados anteriormente para la reduccion de la falsa positividad por N2-bencil-dG son los siguientes. En los ensayos con sondas convencionales (es decir, sin N2-bencil-dG), no se detecto senal de FAM (para la deteccion del VIH-1 y VIH-2), una senal de HEX (para la deteccion del VHB) y 39 senales JA270 (para la deteccion del VHC) de entre 388 muestras. Lo anterior condujo a una tasa de falsa positividad de 10,3% y una especificidad de 348/388, o 89,7%. En los ensayos con sondas N2-bencil-dG, no se detecto senal de FAM, una senal de HEX y 19 senales de JA270, conduciendo a una tasa de falsa positividad de 5,15% y una especificidad de 368/388, o 94,85%. Por lo tanto, la incorporacion de N2-bencil-dG en la sonda TaqMan® del VHC resulto en una reduccion de 50% de la senal de falsos positivos en el canal JA270.

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para impedir la extension por una ADN polimerasa termoestable de un oligonucleotido cebador que se hibrida con una secuencia de nucleotidos molde en un ensayo que utiliza la extension de un cebador de una manera dependiente del molde, en el que el ensayo se selecciona de entre el grupo que consiste de amplificacion por PCR, secuenciacion del ADN y genotipado, que comprende incorporar un nucleotido N2-bencil-desoxiguanosina (N2-bencil-dG) en la secuencia de nucleotidos molde, en el que el oligonucleotido cebador no puede ser extendido en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del nucleotido N2-bencil-dG.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el ensayo es la amplificacion por PCR.
3. 3. Metodo para reducir o impedir la amplificacion no especffica de acidos nucleicos durante una reaccion de amplificacion que comprende proporcionar por lo menos una pareja de oligonucleotidos cebadores capaz de amplificar una secuencia diana de acidos nucleicos, proporcionar una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG que bloquea la extension del oligonucleotido cebador por una ADN polimerasa en mas de 2 nucleotidos mas alla de la posicion del nucleotido N2-bencil-dG, al hibridarse el cebador oligonucleotido con la sonda oligonucleotida.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que la reaccion de amplificacion es un ensayo de PCR TaqMan y la sonda oligonucleotida es una sonda nucleasa 5'.
5. 5. Mezcla de reaccion para la amplificacion de acidos nucleicos, que comprende por lo menos una pareja de cebadores oligonucleotidos y por lo menos una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG.
6. 6. Mezcla de reaccion segun la reivindicacion 5, que comprende ademas un biocatalizador incorporador de nucleotidos, nucleosidos trifosfato y un tampon adecuado para la amplificacion de acidos nucleicos por el biocatalizador que incorpora nucleotidos.
7. 7. Kit para la amplificacion de acidos nucleicos, que comprende por lo menos una pareja de cebadores oligonucleotidos, por lo menos una sonda oligonucleotida que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG, por lo menos un biocatalizador que incorpora nucleotidos, nucleosidos trifosfato, un tampon adecuado para la amplificacion de acidos nucleicos por como mfnimo un biocatalizador que incorpora nucleotidos, y un juego de instrucciones para llevar a cabo la amplificacion de acidos nucleicos.
8. 8. Kit segun la reivindicacion 7, que comprende ademas una o mas parejas de oligonucleotidos cebadores y dos o mas sondas oligonucleotidas que incorpora un nucleotido N2-bencil-dG.