CN104011224B - 用于降低非特异性扩增的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于核酸扩增的方法和试剂。与使用未经修饰的寡核苷酸进行的扩增相比较，使用含有N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸进行的扩增和检测可以导致更少的涉及探针的非特异性扩增，可能这是由于在模板中大量N2-苄基-dG小沟结合剂的存在防止通过DNA聚合酶的互补链的延伸。

Description

用于降低非特异性扩增的方法和试剂
发明领域
本发明涉及分子生物学和核酸化学领域。更具体而言，它涉及用于改进核酸扩增反应的可靠性的方法和试剂。
发明背景
聚合酶链反应（PCR）的发明使得核酸序列的体外扩增成为可能。PCR在美国专利号4,683,195；4,683,202；和4,965,188；Saiki等人，1985，Science230:1350-1354；Mullis等人，1986，ColdSpringsHarborSymp.Quant.Biol.51:263-273；以及Mullis和Faloona，1987，MethodsEnzymol.155:335-350中描述。PCR的开发和应用在文献中广泛描述。例如，一系列PCR相关主题在PCRTechnology-principlesandapplicationsforDNAamplification，1989，（H.A.Erlich编辑）StocktonPress，NewYork；PCRProtocols:Aguidetomethodsandapplications，1990，（M.A.Innis等人编辑）AcademicPress，SanDiego；和PCRStrategies，1995，（M.A.Innis等人编辑）AcademicPress，SanDiego中讨论。商业供应商例如AppliedBiosystems（FosterCity，CA）销售PCR试剂和公开PCR方案。
自从核酸扩增的原始出版物以后，多种基于引物的核酸扩增方法已得到描述，包括但不限于链置换测定（Walker等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396，Walker等人，1992，NucleicAcidsRes.20:1691-1696和美国专利号5,455,166）和基于转录的扩增系统，包括美国专利号5,437,990；5,409,818；和5,399,491中所述的方法；转录扩增系统（TAS）（Kwoh等人，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177）；和自主序列复制（3SR）（Guatelli等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878和WO92/08800）。扩增系统的调查在Abramson和Myers，1993，CurrentOpinioninBiotechnology4:41-47中提供。
基于引物的扩增反应的特异性在很大程度上依赖引物杂交和延伸的特异性。在典型扩增中使用的高温下，引物仅与预期靶序列杂交。然而，扩增反应混合物通常在室温下组合，远低于确保引物杂交特异性所需的温度。在此类较不严格的条件下，引物可以与其他仅部分互补的核酸序列或与其他引物非特异性结合，并且起始不希望的延伸产物的合成，其可以沿靶序列扩增。非特异性引物延伸产物的扩增可以与所需靶序列的扩增竞争，并且可以显著降低所需序列的扩增效率。
一种经常观察到的类型的非特异性扩增产物是被称为“引物二聚体”的模板不依赖性扩增反应假象(artifact)。引物二聚体是这样的双链片段，其长度通常接近于两条引物长度总和，并且看起来当一条引物在另一条引物上延伸时发生。所得到的延伸产物形成不希望的模板，因为其短长度，所以所述不希望的模板被有效扩增。
非特异性扩增可以通过在反应开始前降低引物延伸产物形成而降低。在被称为“热启动”方案的一种方法中，一种或多种关键试剂从反应混合物中扣留，直至温度足够升高以提供所需杂交特异性时。其中反应管在初始高温温育步骤后打开并加入缺少的试剂的手动热启动方法是费力的，并且增加反应混合物污染的风险。或者，热敏感材料例如蜡可以用于分开或隔离反应组分，如美国专利号5,411,876和Chou等人，1992，Nucl.AcidsRes.20（7）:1717-1723中所述。在这些方法中，高温反应前温育熔化热敏感材料，由此允许试剂混合。
在反应开始前降低引物延伸产物形成的另一种方法依赖DNA聚合酶的热可逆失活。美国专利号5,773,258和5,677,152描述了通过改性剂基团(modifiergroup)的共价连接可逆修饰的DNA聚合酶。失活的DNA聚合酶在高温下温育导致改性剂(modifier)-酶键的断裂，由此使酶再活化。
DNA聚合酶通过DNA聚合酶特异性抗体的非共价可逆抑制在美国专利号5,338,671中描述。
非特异性扩增还可以使用美国专利号5,418,149中描述的方法，通过在反应开始前酶促降解形成的延伸产物而降低。新近合成的延伸产物的降解通过下述实现：将dUTP和UNG掺入反应混合物内，并且在进行扩增反应前，使反应混合物在45-60℃下温育。引物延伸导致形成含尿嘧啶DNA，其在扩增前条件下由UNG降解。该方法的缺点是延伸产物的降解与延伸产物的形成竞争，并且非特异性引物延伸产物的消除可能是较不完全的。该方法的优点是作为来自先前反应的污染引入反应混合物内的含尿嘧啶DNA也被降解，并且因此该方法还降低PCR由来自先前反应的扩增核酸污染的问题。
在反应开始前降低引物延伸产物形成的另一种方法依赖于使用在3'端处或附近通过将基团加入环外胺(exocyclicamine)而修饰的引物，如美国专利号6,001,611中所述。
在本领域技术内的分子生物学和核酸化学的常规技术在文献中充分说明。参见例如，Sambrook等人，1989，MolecularCloning-ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork；OligonucleotideSynthesis（M.J.Gait，编辑，1984）；NucleicAcidHybridization（B.D.Hames和S.J.Higgins.编辑，1984）；PCRTechnology-principlesandapplicationsforDNAamplification，1989，（H.A.Erlich编辑）StocktonPress，NewYork；PCRProtocols:Aguidetomethodsandapplications，1990，（M.A.Innis等人编辑）AcademicPress，SanDiego；和PCRStrategies，1995，（M.A.Innis等人编辑）AcademicPress，SanDiego。
发明概述
本发明基于令人惊讶的发现：在某些扩增反应中，特别是在含有多条引物和探针用于扩增和检测多种靶核酸的反应（例如多重PCR反应）中，一条或多条探针可能充当可能导致非特异性扩增的模板，所述非特异性扩增依次又产生假阳性的信号。为了降低PCR中基于探针的非特异性扩增，可以使用干扰DNA聚合酶活性但仍能够与互补核苷酸碱基配对的小沟改性剂。一个小沟改性剂的此类实例是脱氧鸟苷类似物，N2-苄基鸟苷（N2-苄基-dG），其是如本文描述的本发明的主题。
因此，本发明的一个方面涉及在采用以模板依赖性方式的引物延伸的测定中，防止与模板核苷酸序列杂交的引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸的方法，其包括将小沟结合剂掺入模板核苷酸序列上，其中所述引物寡核苷酸不能被延伸超出小沟结合剂位置多于2个核苷酸。在一个实施方案中，小沟结合剂是经修饰的核苷。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是N2-苄基-脱氧鸟苷（N2-苄基-dG）。
本发明的另一个方面涉及降低或防止在扩增反应过程中核酸的非特异性扩增的方法，其包括提供能够扩增靶核酸序列的至少一对引物寡核苷酸；提供掺入小沟结合剂的探针寡核苷酸，当引物寡核苷酸与探针寡核苷酸杂交时，所述小沟结合剂阻断引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸超出小沟结合剂位置多于2个核苷酸。在一个实施方案中，小沟结合剂是经修饰的核苷。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是N2-苄基-脱氧鸟苷（N2-苄基-dG）。
本发明的第三个方面涉及用于核酸扩增的反应混合物，其包含至少一对引物寡核苷酸和至少一条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸。
本发明的第四个方面涉及用于核酸扩增的试剂盒，其包含至少一对引物寡核苷酸、至少一条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸、至少一种核苷酸掺入生物催化剂、核苷三磷酸、适合于通过所述核苷酸掺入生物催化剂的核酸扩增的缓冲液、和用于进行核酸扩增的一套说明书。
附图简述
图1显示（A）N2-苄基脱氧鸟苷（N2-苄基-dG）的结构和（B）N2-苄基脱氧鸟苷（N2-苄基-dG）和脱氧胞嘧啶(deoxycytosine)（dC）之间的碱基配对。
图2是使用含有N2-苄基-dG的模板核酸的引物延伸阻断的图示：（A）显示不含修饰的模板，（B）和（C）显示具有修饰的模板，其中X是N2-苄基-dG。
图3显示在0分钟（A）和5分钟（B）时间点，实施例1的引物延伸反应的结果。
图4显示针对三种测试寡核苷酸，一种未经修饰的对照寡核苷酸和具有与对照寡核苷酸相同的序列但在N-4或N-9位置处具有N2-苄基-dG修饰的两种寡核苷酸的互补寡核苷酸的熔解温度。
图5显示与具有相同序列的对照TaqMan?探针相比较，含有N2-苄基-dG残基的TaqMan?探针的切割效率。
发明详述
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。在描述和请求保护本发明中，将使用下述定义。
术语“核酸”指核苷酸（例如核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等）聚合物，并且包含脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸（PNA）、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，其包含以线性（linear）或分支（branched）方式共价连接在一起的核苷酸。核酸一般是单链或双链的，并且一般含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可以具有替代骨架的核酸类似物，包括例如磷酰胺（Beaucage等人（1993）Tetrahedron49（10）:1925）；硫代磷酸酯（Mag等人（1991）NucleicAcidsRes.19:1437；和美国专利号5,644,048）、二硫代磷酸酯（Briu等人（1989）J.Am.Chem.Soc.111:2321）、O-甲基亚磷酰胺(O-methylphophoroamidite)连接（参见Eckstein，OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach，OxfordUniversityPress（1992））、和肽核酸骨架和连接（参见Egholm（1992）J.Am.Chem.Soc.114:1895）。其他类似物核酸包括具有带正电荷骨架的类似物核酸（Denpcy等人（1995）Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:6097）；非离子骨架的类似物核酸（美国专利号5,386,023，5,637,684，5,602,240，5,216,141和4,469,863）和非核糖骨架的类似物核酸，包括在美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的类似物核酸。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内（参见Jenkins等人（1995）Chem.Soc.Rev.第169-176页），并且类似物还在例如Rawls，C&ENews1997年6月2日，第35页中描述。可以完成磷酸核糖骨架的这些修饰，以促进另外部分例如标记的添加，或以改变此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了一般在核酸中发现的天然存在的杂环碱基（例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶）外，核苷酸类似物也可以包括非天然存在的杂环碱基，例如在如Seela等人（1999）Helv.Chim.Acta82:1640中所述的那些。在核苷酸类似物中使用的某些碱基充当熔解温度（Tm）改性剂。例如，这些中的一些包括7-脱氮嘌呤（例如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等）、吡唑并[3,4-d]嘧啶、丙炔基-dN（例如丙炔基-dU、丙炔基-dC等）等，参见例如美国专利号5,990,303。其他代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；以下碱基的8-氮杂衍生物：2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；以下碱基的7-脱氮-8-氮杂衍生物：腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤；6-氮杂胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
“核苷”指包含与糖部分（核糖或脱氧核糖）、糖部分的衍生物、或糖部分的功能等同物（例如碳环）共价连接的碱基或碱性基团（包含至少一个同素环、至少一个杂环、至少一个芳基，等等（and/orthelike））的核酸组分。例如，当核苷包括糖部分时，碱基一般连接至该糖部分的1'-位置。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。
“核苷酸”指核苷的酯，例如核苷的磷酸酯，其具有共价连接至核苷糖部分的5'位置的一个、两个、三个或更多个磷酸基。
“嘌呤核苷酸”指包含嘌呤碱基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”指包含嘧啶碱基的核苷酸。
“经修饰的核苷酸”指罕见或较少的核酸碱基、核苷酸和常规碱基或核苷酸的修饰、衍生或类似物，并且包括具有经修饰的碱基部分和/或经修饰的糖部分的合成核苷酸（参见ProtocolsforOligonucleotideConjugates，MethodsinMolecularBiology，第26卷（SuhierAgrawal，编辑，HumanaPress，Totowa，N.J.，（1994））；和OligonucleotidesandAnalogues，APracticalApproach（FritzEckstein，编辑，IRLPress，OxfordUniversityPress，Oxford）。
“寡核苷酸”指包括至少两个，但一般为5-50个核苷酸且更一般为15-35个核苷酸的核酸聚合物。寡核苷酸的确切大小通常取决于多种因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以通过本领域已知的任何合适方法进行制备，包括例如合适序列的克隆和限制性消化，或通过诸如下述方法的直接化学合成：Narang等人（1979）Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown等人（1979）Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等人（1981）TetrahedronLett.22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；Matteucci等人（1981）J.Am.Chem.Soc.103:3185-3191的三酯法；自动合成法；美国专利号4,458,066的固体载体法或本领域已知的任何其他化学方法。
“Watson-Crick碱基配对”或简写的“碱基配对”指在双链核酸分子内的“常规的”氢键成键。Watson-Crick碱基配对是腺嘌呤和胸腺嘧啶之间、鸟嘌呤和胞嘧啶之间、腺嘌呤和尿嘧啶之间、以及这些碱基的类似物之间的氢键成键。
如本文使用的，术语“杂交”和“退火”等等可互换使用，并且指一种多核苷酸与另一种多核苷酸（通常为反向平行的多核苷酸）的碱基配对相互作用，其导致通常称为杂交复合物的双链体或其他更高级结构的形成。反向平行的多核苷酸分子之间的一级相互作用通常为碱基特异性的，例如A/T和G/C，通过Watson/Crick和/或Hoogsteen型氢键成键。不需要两种多核苷酸在其全长上具有100%互补性以实现杂交。在一些方面，杂交复合物可以由分子间相互作用形成，或者，可以由分子内相互作用形成。
如本文使用的，术语“扩增（amplification）”、“扩增（amplifying）”等等一般指导致分子或相关分子组的拷贝数中的增加的任何过程。当它应用于多核苷酸分子时，扩增意指通常从少量多核苷酸（例如病毒基因组）开始产生多核苷酸分子或多核苷酸分子的部分的多个拷贝，其中扩增材料（例如病毒PCR扩增子）通常是可检测的。多核苷酸的扩增包含多个化学和酶促过程。在聚合酶链反应（PCR）、链置换扩增（SDA）反应、转录介导的扩增（TMA）反应、基于核酸序列的扩增（NASBA）反应或连接酶链反应（LCR）过程中，由一个或少数拷贝的模板DNA分子生成多个DNA拷贝是扩增形式。扩增并不限于起始分子的严格复制。例如，使用RT-PCR由样品中有限量的病毒RNA生成多重cDNA分子是扩增形式。此外，在转录过程期间由单一DNA分子生成多重RNA分子也是扩增形式。
在一些实施方案中，扩增任选随后为另外的步骤，例如但不限于标记、测序、纯化、分离、杂交、大小分辨、表达、检测和/或克隆。
如本文使用的，术语“聚合酶链反应”（PCR）指本领域众所周知的用于增加样品中的靶多核苷酸区段的浓度的扩增方法，其中该样品可以是单一多核苷酸种类，或多种多核苷酸。一般地，PCR过程由下述组成：将摩尔过量的两种或更多种可延伸的寡核苷酸引物引入包含一种或多种所需靶序列的反应混合物内，其中该引物与双链靶序列的相反链互补。对反应混合物实施在DNA聚合酶的存在下的热循环程序，导致侧翼为DNA引物的所需靶序列的扩增。逆转录酶PCR（RT-PCR）是使用RNA模板和逆转录酶、或具有逆转录酶活性的酶的PCR反应，以首先在DNA依赖性DNA聚合酶引物延长的多个循环之前生成单链DNA分子。多重PCR指通常通过在单一反应中包括多于两条引物，在单一反应中产生多于一种扩增产物的PCR反应。广泛多样的PCR应用的方法是本领域广泛已知的，并且在许多来源例如Ausubel等人（编辑），CurrentProtocolsinMolecularBiology，Section15，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork（1994）中描述。
“引物核酸”或“引物”是可以与模板核酸杂交且允许使用核苷酸掺入生物催化剂的链延伸或延长的寡核苷酸。尽管有时利用其他引物长度，但引物一般范围为15-35个核苷酸。短引物核酸一般利用更冷的温度，以与模板核酸形成足够稳定的杂交复合物。与模板核酸的子序列至少部分互补的引物核酸一般足以与模板核酸杂交以发生延伸。然而，延伸的成功通常需要在引物的3'端处更大的互补性（即与模板的更少错配）。需要时，引物核酸可以通过掺入标记进行标记，所述标记可通过放射学、光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学技术检测。
“延伸的引物”指一个或多个另外的核苷酸已加入其中的引物。“引物延伸”是另外的核苷酸通过其加入引物中的酶的作用。
“模板核酸”、“模板”或“靶”指引物核酸在合适条件下可以与之杂交且延伸的核酸。在核酸扩增的背景下，“靶”优选是双链核酸的区域，由与至少两条引物序列至少部分互补的序列及间插序列组成。靶还可以是单链核酸，由与一条引物至少部分互补的序列和与第二条引物部分相同的序列组成。模板核酸可以作为分离的核酸片段存在或可以是大核酸片段的部分。靶核酸可以衍生自或分离自基本上任何来源，例如培养的微生物、未培养的微生物、复杂的生物混合物、组织、血清、古老的或保存的组织或样品、环境分离物等。进一步地，模板核酸任选包括或来源于cDNA、RNA、基因组DNA、克隆的基因组DNA、基因组DNA文库、酶促断裂的DNA或RNA、化学断裂的DNA或RNA、物理断裂的DNA或RNA等。模板核酸还可以使用本领域已知的技术化学合成。
如本文使用的，术语“探针”通常指能够与目的靶核酸杂交的多核苷酸。通常但非唯一地，探针与合适标记或报道分子部分结合，使得探针（和因此其靶）可以得到检测、显现、测量和/或定量。标记探针的检测系统包括但不限于荧光检测、荧光猝灭（例如当使用FRET对检测系统时）、酶促活性、吸光度、分子质量、放射性、发光或允许报道分子（例如当报道分子是抗体时）的特异性结合的结合特性。在一些实施方案中，探针可以是抗体而不是多核苷酸，其对于目的核酸核苷酸序列具有结合特异性。不旨在本发明限制于任何具体标记探针或探针检测系统。在探针中使用的多核苷酸来源不受限制，并且可以在非酶促系统中合成产生，或可以是使用生物（例如酶促）系统（例如在细菌细胞中）产生的多核苷酸（或多核苷酸的部分）。
通常，探针与核酸中含有的特定靶序列充分互补，以在所选杂交条件例如但不限于严格杂交条件下与靶序列形成稳定的杂交复合物。在充分严格的杂交条件下使用探针进行的杂交测定允许选择性检测特定靶序列。
如本文使用的，如果在引物序列和靶序列之间存在的错配数目小于引物序列和样品中可能存在的非靶序列之间存在的错配数目，则引物对于模板序列是“特异性的”。杂交条件可以选择为仅在存在的错配数目不多于引物序列和靶序列之间存在的错配数目时，在其下形成稳定双链体的条件。在此类条件下，引物可以仅与靶序列形成稳定双链体。因此，在含有靶引物结合位点的那些靶序列的适当严格扩增下使用靶特异性引物。序列特异性扩增条件的使用使得能够特异性扩增含有确切互补的引物结合位点的那些靶序列。
术语“非特异性扩增”指除靶序列外的核酸序列的扩增，其产生于引物与除靶序列外的序列杂交并且随后充当引物延伸的底物。引物与非靶序列的杂交被称为“非特异性杂交”，并且可以在较低温度、降低的严格性、预扩增条件过程中发生。
如本文使用的，术语“扩增子”指在特定靶核酸扩增后产生的多核苷酸分子（或共同地多种分子）。用于生成扩增子的扩增方法可以是任何合适方法，最通常地，例如通过使用PCR方法。扩增子通常但非唯一地是DNA扩增子。扩增子可以是单链或双链的，或在其以任何浓度比的混合物中。
如本文使用的，表达“扩增子累积的实时检测”指当一种或多种扩增子产生（通常通过PCR）时，一种或多种特定扩增子的检测和通常的其定量，而无需在扩增完成后的检测或定量步骤。术语“实时PCR”或“动态PCR”指在PCR中生成的扩增子的实时检测和/或定量。
扩增子累积的实时检测的常见方法是通过5'-核酸酶测定，也称为荧光5'-核酸酶测定，例如TaqMan分析；参见，Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:7276-7280（1991）；和Heid等人，GenomeResearch6:986-994（1996）。在TaqManPCR程序中，两种寡核苷酸引物用于生成对PCR反应特异性的扩增子。设计第三寡核苷酸（TaqMan探针）与位于两种PCR引物之间的扩增子中的核苷酸序列杂交。该探针可以具有无法通过PCR反应中使用的DNA聚合酶延伸的结构，并且通常（但不一定）由彼此紧密接近的荧光报道染料和猝灭剂部分共标记。当荧光剂和猝灭剂紧密接近时，如它们在探针上时，来自报道染料的发射由猝灭部分猝灭。在一些情况下，该探针可以仅由荧光报道染料或另一种可检测部分标记。
TaqManPCR反应使用热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，其具有5'-3'核酸酶活性。在PCR扩增反应过程中，DNA聚合酶的5'-3'核酸酶活性切割以模板依赖性方式与扩增子杂交的标记探针。所得的探针片段从引物/模板复合物中解离，并且报道染料随后免于猝灭剂部分的猝灭效应。对于合成的每个新扩增子分子释放大约一分子的报道染料，并且未猝灭的报道染料的检测提供数据定量解释的基础，使得释放的荧光报道染料的量与扩增子模板的量直接成比例。
TaqMan测定数据的一个量度通常表示为阈值循环（CT）。荧光水平在每个PCR循环过程中进行记录，并且与扩增反应中的那个点扩增的产物量成比例。当荧光信号首先记录为统计学上显著的时，或其中荧光信号超过一些其他任意水平（例如任意荧光水平，或AFL）的PCR循环是阈值循环（CT）。
5'-核酸酶测定的方案和试剂是本领域技术人员众所周知的，并且在多个来源中描述。例如，5'-核酸酶反应和探针在下述中描述：于2001年4月10日授予Gelfand等人，名称为“HOMOGENEOUSASSAYSYSTEM”的美国专利号6,214,979；于1998年9月8日授予Gelfand等人，名称为“REACTIONMIXTURESFORDETECTIONOFTARGETNUCLEICACIDS”的美国专利号5,804,375；于1996年1月30日授予Gelfand等人，名称为“NUCLEICACIDDETECTIONBYTHE5’-3’EXONUCLEASEACTIVITYOFPOLYMERASESACTINGONADJACENTLYHYBRIDIZEDOLIGONUCLEOTIDES”的美国专利号5,487,972；和于1993年5月11日授予Gelfand等人，名称为“HOMOGENEOUSASSAYSYSTEMUSINGTHENUCLEASEACTIVITYOFANUCLEICACIDPOLYMERASE”的美国专利号5,210,015。
实时扩增子检测的方法中的变化也是已知的，并且特别地，当5'-核酸酶探针替换为双链DNA嵌入染料时，导致依赖扩增反应中存在的双链扩增子量的荧光，参见例如于2001年1月9日授予Higuchi，名称为“METHODSANDDEVICESFORHEMOGENEOUSNUCLEICACIDAMPLIFICATIONANDDETECTOR”的美国专利号6,171,785；和于1999年11月30日授予Higuchi，名称为“HOMOGENEOUSMETHODSFORNUCLEICACIDAMPLIFICATIONANDDETECTION”的美国专利号5,994,056。
TaqMan?PCR可以使用商购可得的试剂盒和设备进行，所述设备例如ABIPRISM?7700SequenceDetectionSystem（AppliedBiosystems，FosterCity，Calif.）、或LightCycler?（RocheAppliedSciences，Mannheim，德国）。在优选实施方案中，5'核酸酶测定程序在实时定量PCR装置例如ABIPRISM?7700SequenceDetectionSystem上运行。该系统由热循环仪、激光器、电荷耦合器件（CCD）、照相机和计算机组成。该系统扩增在热循环仪上的96孔微量滴定板形式中的样品。在扩增过程中，激光诱导的荧光信号对于所有96孔通过光纤电缆实时收集，并且在CCD照相机上检测。该系统包括用于运行仪器和分析数据的软件。
如本文使用的，“基因”指与生物功能相关的DNA的任何区段。因此，基因包括编码序列并任选包括编码序列表达所需的调节序列。
当另外的核苷酸例如通过核苷酸掺入生物催化剂在核酸的3'端处掺入核酸内时，核酸被“延伸”或“延长”。
“部分(moiety)”或“基团(group)”指某些事物例如分子分裂成的部分之一（例如官能团、取代基等）。例如，核苷酸一般包含碱基基团（例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或类似物）、糖部分、和一个或多个磷酸基。
“苄基”指具有式C6H5CH2-的单价芳香族基团，并且可与术语“苯基甲基”互换使用。
“基因型”指细胞或个体或者细胞或个体的组的全部或部分遗传组成。例如，基因型包括存在于给定基因座上或分布在基因组中的特定突变和/或等位基因（例如多态性，例如单核苷酸多态性（SNP）等）。“基因分型”指测定细胞或个体的基因型的测定。
“核苷酸掺入生物催化剂”或“核苷酸掺入酶”指催化核苷酸掺入核酸内的催化剂（或酶）。示例性核苷酸掺入酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒末端转移酶等。
“热稳定酶”指当将其置于高温下所选的时间段时是稳定的（即抵抗断裂或变性）且保留足够催化活性的酶。例如，当将其置于高温下双链核酸变性所需的时间时，热稳定聚合酶保留实现随后的引物延伸反应的足够活性。核酸变性所需的加热条件是本领域众所周知的且在美国专利号4,683,202和4,683,195中例示。如本文使用的，热稳定聚合酶一般适合于在温度循环反应例如聚合酶链反应（“PCR”）中使用。热稳定核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌（Thermusaquaticus）TaqDNA聚合酶、栖热菌属物种（Thermussp.）Z05聚合酶、黄栖热菌（Thermusflavus）聚合酶、海栖热袍菌（Thermotogamaritima）聚合酶例如TMA-25和TMA-30聚合酶、TthDNA聚合酶等。
“经修饰的”酶指包含氨基酸聚合物的酶，其中至少一个单体不同于参考序列，例如酶的天然或野生型形式或酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。经修饰的酶还包括具有来源于两个或更多个亲本的可鉴定组分序列（例如结构或功能结构域等）的嵌合酶。在经修饰的酶的定义内还包括的是包含参考序列的化学修饰的那些。经修饰的聚合酶的实例包括G46EE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AE678GCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640GS671FCS5DNA聚合酶、G46EL329AD640GS671FE678GCS5DNA聚合酶、G46EE678GCS6DNA聚合酶、ΔZ05聚合酶、ΔZ05-Gold聚合酶、ΔZ05R聚合酶、E615GTaqDNA聚合酶、E678GTMA-25聚合酶、E678GTMA-30聚合酶等。
术语“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”指一般与核酸链合成相关的核酸聚合酶的活性，由此核苷酸从核酸链的5'端去除，例如大肠杆菌（E.coli）DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow片段则没有。
“基本上缺乏5'-3'核酸酶活性”的聚合酶指具有TaqDNA聚合酶的50%或更低的（例如<25%、<20%、<15%、<10%）5'-3'核酸酶活性的聚合酶。测量5'-3'核酸酶活性的方法和用于测量的条件是本领域众所周知的，参见例如美国专利号5,466,591。基本上缺乏5'到3'核酸酶活性的DNA聚合酶的实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段；缺乏N末端235个氨基酸的水生栖热菌DNA聚合酶（Taq）（例如如美国专利号5,616,494中描述的且在本领域中通常被称为“Stoffel片段”）。其他实例包括具有足够缺失（例如N末端缺失）、突变或修饰，以消除或失活负责5'-3'核酸酶活性的结构域的热稳定DNA聚合酶，参见例如美国专利号5,795,762。
“标记”指（共价或非共价）连接至分子且能够提供关于分子的信息的部分。示例性标记包括荧光标记、比色法标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记、质量修饰基团、抗体、抗原、生物素、半抗原和酶（包括过氧化物酶、磷酸酶等）。
在核酸扩增反应的背景下，“热启动”指其中至少一种关键试剂从反应混合物中被扣留（或如果存在于反应混合物中，则试剂保持无活性），直至温度足够升高以提供一条或多条引物的必需杂交特异性的方案。“热启动酶”是能够在热启动方案中充当“扣留”或无活性试剂的酶，一般为核酸聚合酶。
术语“反应混合物”指含有进行给定反应所需的试剂的溶液。“扩增反应混合物”指含有进行扩增反应所需的试剂的溶液，通常含有在合适缓冲液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或连接酶。“PCR反应混合物”通常含有在合适缓冲液中的寡核苷酸引物、热稳定的DNA聚合酶、dNTP’s和二价金属阳离子。如果反应混合物含有实现反应所需的所有试剂，则它被称为完全的，并且如果反应混合物仅含有必需试剂子集，则它被称为不完全的。本领域技术人员应当理解反应组分照常规作为各自含有全部组分的子集的分离的溶液贮存，为了方便、贮存、稳定性、或以允许组分浓度的应用依赖性调整的原因，并且反应组分在反应前组合以产生完全反应混合物。
如本文使用的，术语“试剂盒”用于提及物品组合，所述物品组合促进样品的处理、方法、测定、分析或操作。试剂盒可以含有描述如何使用试剂盒的书面说明书（例如描述本发明的方法的说明书）、方法所需的化学试剂或酶、引物和探针、以及任何其他组分。
本发明基于下述发现：当存在于模板核酸上时，某些经修饰的核苷酸能够防止或抑制引物寡核苷酸通过DNA聚合酶的延伸，但仍可以维持与其在引物上的互补碱基的Watson-Crick碱基配对。一种此类经修饰的核苷酸是脱氧鸟苷类似物，N2-苄基-脱氧鸟苷（N2-苄基-dG），其如图1A中所示，含有在环外氨基的C-2氮上的苄基。具有环外氨基的共价修饰的核苷酸已在美国专利号6,001,611中描述。此类核苷酸的合成和掺入此类核苷酸的寡核苷酸也在‘611专利中描述。
虽然不受理论束缚，但认为N2-苄基-dG能够通过占据双链DNA的小沟而防止引物延伸，由此表现为“小沟结合剂”，并且干扰DNA聚合酶的活性位点。然而，与互补脱氧胞嘧啶（dC）核苷酸的碱基配对仍可以发生，因为三个氢键不受苄基部分存在的影响（图1B）。
因此，在一个方面，本发明涉及防止与模板核苷酸序列杂交的引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸的方法，其包括将小沟结合剂掺入模板核苷酸序列上，其中小沟结合剂是经修饰的核苷酸，并且经修饰的核苷酸是N2-苄基-dG，并且其中引物不能延伸超出N2-苄基-dG核苷酸位置多于2个核苷酸。该方法可应用于进行PCR扩增、核酸测序、基因分型和采用以模板依赖性方式的引物延伸的其他应用。
N2-苄基-dG的独特特性也允许其用于降低或防止基于引物的扩增反应中的非特异性扩增。认为当不稳定的、瞬时杂交双链体在引物和非靶分子之间形成时，发生非特异性扩增，其中引物的3'端与其他分子中的互补碱基暂时配对。初始引物延伸导致形成互补序列，其稳定双链体且允许进一步延伸。美国专利号6,001,611公开了含有经修饰的核苷酸的引物用于防止非特异性扩增的用途，所述非特异性扩增产生于引物二聚体的形成，在所述引物二聚体中在引物和另一条引物之间形成瞬时杂交双链体。N2-苄基-dG将不用于引物中以防止非特异性扩增，因为它在引物延伸产物中的存在将引起引物延伸的终止，所述引物延伸产物用作后续扩增循环中的模板。然而，在利用探针（例如TaqmanPCR测定中的5'核酸酶探针）的扩增反应中，N2-苄基-dG的掺入已导致降低或防止产生于在引物和探针之间发生的杂交的非特异性扩增。
因此，在另一个方面，本发明涉及降低或防止在扩增反应过程中核酸的非特异性扩增的方法，其包括提供能够扩增靶核酸序列的至少一对引物寡核苷酸；提供掺入小沟结合剂的探针寡核苷酸，当引物与探针寡核苷酸杂交时，所述小沟结合剂阻断引物通过DNA聚合酶延伸超出小沟结合剂位置多于2个核苷酸。在一个实施方案中，小沟结合剂是经修饰的核苷酸。在另一个实施方案中，经修饰的核苷酸是N2-苄基-dG。
在另一个方面，本发明提供了用于核酸扩增的反应混合物，其包含至少一对引物寡核苷酸和至少一条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸。在一些实施方案中，反应混合物进一步包含核酸扩增一般所需的试剂和溶液，包括核苷酸掺入生物催化剂、核酸前体即核苷三磷酸、以及适合于支持核苷酸掺入生物催化剂活性的有机和无机离子。
在另一个方面，本发明提供了用于进行根据本发明的扩增反应的试剂盒。试剂盒一般包括测定特异性组分以及进行DNA扩增测定一般所需的组分。作为测定特异性组分，本发明的扩增试剂盒通常包括至少一对引物寡核苷酸、至少一条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸、和用于进行本发明的扩增反应的一套说明书。在一些实施方案中，试剂盒包括两对或更多对引物寡核苷酸和两条或更多条探针寡核苷酸，其中每条探针寡核苷酸掺入N2-苄基-dG核苷酸。作为核酸扩增一般所需的组分，本发明的试剂盒通常包括下述中的一种或多种：核苷酸掺入生物催化剂、核酸前体例如核苷三磷酸（脱氧核糖核苷三磷酸或核糖核苷三磷酸）、任选的用于使核酸的焦磷酸解降到最低的焦磷酸酶、用于保护不受扩增反应的携带污染（carry-overcontamination）的尿嘧啶N-糖基化酶（UNG）、以及扩增反应和检测所需的预制试剂和缓冲液。
提供下述实施例和附图以帮助本发明的理解，本发明的真实范围在附加的权利要求中阐述。
实施例
实施例1引物延伸
为了证实如图2中图解描述的，含有N2-苄基-dG的模板核酸能够阻断通过DNA聚合酶的引物延伸，使用FAM标记的引物寡核苷酸和三种互补模板寡核苷酸设置引物延伸实验，其序列显示于下文：
（E=N2-苄基-dG）。
每个引物延伸反应（50μl）含有50nM引物和75nM模板寡核苷酸，具有15单位（20nM）Z05DDNA聚合酶，各337.5μM的dATP、dCTP、dGTP、dUTP，50mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)（pH8.0），100mM乙酸钾（pH7.0），3mM乙酸锰，4%甘油，5%DMSO，0.01%Tween-20。使用Z05DDNA聚合酶的引物延伸在60℃下进行，并且反应通过在多个时间点添加EDTA而终止。将引物延伸产物稀释到含甲酰胺的上样缓冲液内，并且在标记的大小标准品的存在下，通过毛细管电泳（ABIPRISM?3100GeneticAnalyzer）进行分析。
结果显示于图3上。来自含有N2-苄基-dG的模板的延伸产物明确小于来自对照模板的延伸产物。这说明含有N2-苄基-dG残基的模板核酸可以停止或急剧降低通过DNA聚合酶的引物延伸率。
实施例2双链体稳定性
为了研究N2-苄基-dG对杂交的作用，使用未经修饰的互补寡核苷酸和三种测试寡核苷酸进行熔解温度实验。测定关于其的熔解温度的三种测试寡核苷酸代表（a）未经修饰的对照寡核苷酸，（b）在N-9位置处具有N2-苄基-dG的具有与（a）相同的序列的寡核苷酸，和（c）在N-4位置处具有N2-苄基-dG的具有与（a）相同的序列的寡核苷酸。这些寡核苷酸的核苷酸序列如下：
互补体
测试对照
测试N-9
测试N-4。
实验条件如下。每个反应在50μl体积中且以两次重复制备，并且在缓冲液中含有40pmol每种测试寡核苷酸和40pmol互补寡核苷酸，所述缓冲液含有90mM乙酸钾（pH7.0），50mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)（pH8.3），3mM乙酸锰，3%甘油，5%DMSO，各300μM的dATP、dCTP、dGTP和600μMdUTP。在下述条件下，使用LighCycler?480仪器测定在每种测试寡核苷酸和互补寡核苷酸之间形成的杂交双链体的熔解温度。每个反应孔首先加热至91℃且快速冷却至40℃，以允许退火发生。温度随后持续以0.06℃/秒的升温速率（ramprate）升高至90℃。DNA双链体解链的检测是经由通过双链DNA结合染料Syto-13（最终浓度100μM）的荧光中的改变。
实验结果显示于图4上，其中上图显示标绘为温度函数的绝对荧光，并且下图描述相同熔解曲线数据，但展示作为第一导数图（作为温度的函数）的数据。在对照寡核苷酸和含有N2-苄基-dG的寡核苷酸之间仅观察到小的熔解温度差异，具有0.3℃-0.5℃的Tm值。因此，N2-苄基-dG在寡核苷酸中的存在不导致在含N2-苄基-dG寡核苷酸和互补核酸序列之间形成的杂交双链体的显著失稳。该实验证实N2-苄基-dG可以掺入探针寡核苷酸（例如TaqMan?探针）内，而不会不利地影响探针的杂交特性。
实施例3切割效率
为了研究含有N2-苄基-dG的5'-核酸酶寡核苷酸探针是否可以在TaqMan?PCR测定中由DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性有效切割，进行下述实验。修饰靶向HIV-1、HIV-2、HBV和HCV中的特定病毒序列的TaqMan?探针，以含有一个N2-苄基-dG残基。随后在使用靶特异性引物和Z05DNA聚合酶的标准动态PCR测定中，就其扩增子检测能力比较经修饰的TaqMan?探针的每一种与其对应的未经修饰的TaqMan?探针，所述扩增子检测能力指示探针如何有效地由DNA聚合酶的5'至3'核酸酶活性切割。
结果在图5上显示，如由每个PCR反应的增长曲线(growthcurves)所示，其中荧光针对PCR循环数绘制。对于每种靶，在使用N2-苄基-dG修饰的TaqMan?探针生成的增长曲线和使用未经修饰的TaqMan?探针生成的增长曲线之间存在很少的差异或不存在差异。这证实含有N2-苄基-dG的TaqMan?探针通过DNA聚合酶的切割效率与不含N2-苄基-dG的TaqMan?探针的相同。
实施例4假阳性的降低
在多重PCR测定过程中，观察到由于在通道中出现的非特异性扩增的假阳性数据，所述通道含有由荧光JA270染料标记的HCV特异性TaqMan?探针。如表1中所示，N2-苄基-dG在HCVTaqMan?探针中的掺入能够消除JA270通道（通道3）中假阳性信号的存在。
表1
实施例5在多重PCR测定中的假阳性降低
为了显示TaqMan?探针的N2-苄基-dG修饰作为降低假阳性的方法的可能性，运行这样的实验，其中使用常规探针和在探针序列内的特定位置处具有N2-苄基-dG的探针测量假阳性率。因为假阳性在高度优化的扩增系统中相对不频繁，所以开发经修饰的PCR预混物（MasterMix），其有利于非特异性扩增产物的生成。在该模型系统中，可以诱导高水平的假阳性，使得统计学上显著的速率间差异从相对有限数目的输入样品中是显而易见的。
先前已证实为对于待检测的病毒是阴性的正常人血浆（NHP，各850μl，对于测试的每个条件N=388）的样品使用自动DNA制备和扩增系统（RochePilotSystem）进行处理，所述待检测的病毒是人免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）。收集来自已经历样品制备系统的每个样品的洗脱物，并且分配（每个孔中25μl）到使用TaqMan?探针的实时PCR检测的扩增板内。随后加入25μl活化的预混物（6.6mM乙酸锰pH6.1、0.036μM乙酸钠、10.8%DMSO、0.054μM乙酸钠pH7.0、240mM乙酸钾pH7.0、6%甘油、120mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)pH8.0、0.4U/μLUNG、800μMdGTP、800μMdATP、800μMdCTP、1600μMdUTP、1.8U/μLZO5-DDNA聚合酶），其含有正向和反向引物以及含和不含N2-苄基-dG的TaqMan?探针，以使最终反应体积达到50μl，并且将板密封且放入热循环仪内。热循环概况如下表2中所示进行。
表2
在实验中使用的正向和反向引物序列在最终浓度中范围为0.125μM-0.3μM，并且它们选自下述。SEQIDNO:9至24用于HIV1型（HIV-1）GAG；SEQIDNO:25至32用于HIV-1LTR；SEQIDNO:33至35用于HIV2型（HIV-2）；SEQIDNO:36和37用于HBV；SEQIDNO:38-59用于HCV。
在实验中使用的TaqMan?探针序列在最终浓度中范围为0.15μM-0.3μM，并且它们选自下述。SEQIDNO:60至64用于HIV-1GAG；SEQIDNO:65和66用于HIV-1LTR；SEQIDNO:67用于HIV-2；SEQIDNO:68用于HBV；SEQIDNO:69-76用于HCV。所有探针均在5'末端处由荧光染料标记：FAM用于HIV（HIV-1和HIV-2）探针，HEX用于HBV探针，并且JA270用于HCV探针，并且含有内部BHQ-2猝灭剂分子。
对于含有N2-苄基-dG修饰的核苷酸的TaqMan?探针，定位大约在探针中间的位置中的内部脱氧鸟苷残基从dG修饰为N2-苄基-dG。例如，在HIV-2探针（SEQIDNO:67）中，在从5'末端的位置12处的dG残基转变为N2-苄基-dG。类似地，对于HBV探针（SEQIDNO:68），N2-苄基-dG位于从5'末端的位置20处。
上文对于通过N2-苄基-dG的假阳性降低描述的实验结果如下。在使用常规探针（即不含N2-苄基-dG）的测定中，在388份样品中检测到无FAM信号（用于检测HIV-1和HIV-2）、一个HEX信号（用于检测HBV）和39个JA270信号（用于检测HCV）。这导致10.3%的假阳性率和348/388或89.7%的特异性。在使用N2-苄基-dG探针的测定中，检测到无FAM信号、一个HEX信号和19个JA270信号，导致5.15%的假阳性率和368/388或94.85%的特异性。因此，N2-苄基-dG在HCVTaqMan?探针中的掺入导致JA270通道中假阳性信号的50%降低。
虽然本发明已参考具体实施例详细描述，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以在本发明的范围内作出多种修饰。
序列表
<110>F.Hoffmann-LaRocheAG
RocheDiagnosticsGmbH
<120>用于降低非特异性扩增的方法和试剂
<130>26108WO-KOE
<150>61/579,317
<151>2011-12-22
<160>76
<170>PatentIn版本3.5
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物序列NJS01
<400>1
ccctcgcagccgtccaaccaactca25
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板序列NJS03
<400>2
gggagcgtcggcaggttggttgagtaggtcttgttt36
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板序列NJS339-1A
<220>
<221>经修饰的碱基
<222>(28)..(28)
<223>N2-苄基-dG
<400>3
cggagcgtcggcaggttggttgagtaggtcttgttt36
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>模板序列NJS339-2A
<220>
<221>经修饰的碱基
<222>(33)..(33)
<223>N2-苄基-dG
<400>4
cggagcgtcggcaggttggttgagtaggtcttgttt36
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>互补序列
<400>5
aaacaagacctactcaaccaacctgccgacgctccg36
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>测试序列对照
<400>6
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<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>测试序列N-9
<220>
<221>经修饰的碱基
<222>(9)..(9)
<223>N2-苄基-dG
<400>7
tttgttctggatgagttggttggacggctgcgaggc36
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>测试序列N-4
<220>
<221>经修饰的碱基
<222>(4)..(4)
<223>N2-苄基-dG
<400>8
tttgttctggatgagttggttggacggctgcgaggc36
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1引物
<400>9
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<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>10
agtggggggacatcaagcagccatgcaaat30
<210>11
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1引物
<400>11
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<210>12
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1引物
<400>12
ggacacatcaagcagccatgcaaat25
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1引物
<400>13
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<220>
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tactagtagttcctgctatgtcacttcc28
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<220>
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<212>DNA
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<220>
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<400>30
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<220>
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<220>
<223>HIV-1探针
<400>60
tctgcagcttcctcattgatggtatcttttaac33
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<212>DNA
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<220>
<223>HIV-1探针
<400>61
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<210>62
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1探针
<400>62
tctgcagcttcctcattgaggtatcttttaac32
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<212>DNA
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<220>
<223>HIV-1探针
<400>63
atcctgggattaaataaaatagtaagaatgtatagccctac41
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<220>
<223>HIV-1探针
<400>64
accatcaatgagggaagctgcagaatggg29
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<220>
<223>HIV-1探针
<400>65
tctctagcagtggcgcccgaacagggac28
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-1探针
<400>66
accagagtcacacaacagacgggcacacactact34
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HIV-2探针
<400>67
tcctagtcgccgcctggtcattcggtgttca31
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HBV探针
<400>68
ccaagctgtgccttgggtggctttggggcatgg33
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<212>DNA
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<220>
<223>HCV探针
<400>69
gggagagccatagtggtctgcggaaccggtgag33
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<212>DNA
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<220>
<223>HCV探针
<400>70
ccgggagagccatagtggtctgcggaaccggtg33
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<220>
<223>HCV探针
<400>71
caccggttccgcagaccactatggctctcccgg33
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<213>人工序列
<220>
<223>HCV探针
<400>72
caccggttccgcagaccactatggctctcccgg33
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCV探针
<400>73
cagaattcattgccatagaggggccaaggat31
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCV探针
<400>74
tctctcgcccatctcctaccgcattggc28
<210>75
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>HCV探针
<400>75
cggtgtactcaccgttccgcagaccactatg31
<210>76
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<213>人工序列
<220>
<223>HCV探针
<400>76
tgggcgtgcccccgcaagactgctagccgagtag34

Claims (6)

1.降低或防止在多重扩增反应过程中核酸的非特异性扩增的方法，其包括提供能够扩增多个靶核酸序列的多于一对引物寡核苷酸；并提供多条探针寡核苷酸，每条探针寡核苷酸掺入N2-苄基-dG核苷酸，当所述引物寡核苷酸与所述探针寡核苷酸杂交时，所述N2-苄基-dG核苷酸阻断所述引物寡核苷酸通过DNA聚合酶延伸超出所述N2-苄基-dG核苷酸位置多于2个核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述扩增反应是TaqmanPCR测定，并且所述探针寡核苷酸是5'核酸酶探针。
3.用于核酸扩增的反应混合物，其包含多于一对引物寡核苷酸和多条探针寡核苷酸，每条探针寡核苷酸掺入N2-苄基-dG核苷酸。
4.权利要求3的反应混合物，其进一步包含核苷酸掺入生物催化剂、核苷三磷酸、和适合于通过所述核苷酸掺入生物催化剂的核酸扩增的缓冲液。
5.用于核酸扩增的试剂盒，其包含多于一对引物寡核苷酸、多条其中每条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸、至少一种核苷酸掺入生物催化剂、核苷三磷酸、适合于通过所述至少一种核苷酸掺入生物催化剂的核酸扩增的缓冲液、和用于进行核酸扩增的一套说明书。
6.权利要求5的试剂盒，其进一步包含多对引物寡核苷酸和多条其中每条掺入N2-苄基-dG核苷酸的探针寡核苷酸。
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