CN103975076B - 用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于降低非目标核酸序列的扩增的抑制寡核苷酸；设计和使用此类寡核苷酸的方法，以及试剂盒和反应混合物。

Description

用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增
发明背景
聚合酶链式反应(PCR)扩增核酸在生物医学研究、诊断和生物技术中有许多应用。PCR的独特特异性能够实现在压倒性数量的其它序列存在的情况下选择性扩增特定核酸序列。此外，PCR可以将目标序列与差异在于一个单一碱基对的另一个序列区分开。例如，等位基因特异性PCR(AS-PCR)能够检测DNA中的小改变，甚至在野生型、非突变型DNA存在的情况下的单一核苷酸突变(美国专利号6,627,402)。在等位基因特异性PCR测定中，至少一条引物是等位基因特异性的，即设计成优先匹配目标序列(该序列的特异性变体)，但含有与非目标序列(该序列的其它变体)的识别性错配。理想地，只有当等位基因特异性引物杂交至目标序列时才发生引物延伸。在成功的等位基因特异性PCR中，核酸的目标变体得到扩增，而其它非目标变体未进行扩增，至少不会扩增到可检测到的水平。不幸的是，在许多目标的情况下，这种理想是无法实现的。常见的是，在PCR的后面循环中，序列的非目标变体的扩增也变得可检测。该现象被称为“突破扩增”。即使AS-PCR引物与目标序列完美互补(或至少，共享更大程度的互补性)且与非目标序列错配(或者具有更多个错配)，非目标序列的扩增经常不能完全避免。
突破扩增在其中样品含有少量目标序列和大量非目标序列的测定中特别受关注。例如，在靶向肿瘤中的体细胞突变的测定，来自患者样品的细胞中只有一部分是肿瘤细胞。肿瘤细胞的一部分可以含有指示对特定抗肿瘤药物的易感性的突变(参见例如，美国专利号7,294,468和7,960,118中描述的突变)。在此类样品中，少数目标(突变)序列与大量非目标(非突变)序列混合。非突变序列的突破扩增可以产生假阳性结果，假性地指示突变的存在且误导患者的治疗。如果测定的特异性受突破扩增限制，则测定的临床实用性也是如此。
已经提出了防止或降低非特异性扩增的各种方法(例如，影响扩增引物的特异性的化学修饰，参见美国专利号6,011,611；使用阻断剂寡核苷酸，参见美国申请公开号200953720)。然而，这些方法在完全消除突破扩增中并不总是成功的。因此，存在对于防止或尽量减少核酸扩增反应中的突破扩增的替代方法的需求。
发明概述
在一个实施方案中，本发明是用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸，其具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列。
在另一个实施方案中，本发明是设计用于在核酸扩增反应中使用的抑制寡核苷酸的方法，其包括使用序列比对算法来选择具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的寡核苷酸。
在又另一个实施方案中，本发明是降低核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸存在的情况下进行扩增反应。
在又另一个实施方案中，本发明是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的试剂盒，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。
在又另一个实施方案中，本发明是用于在降低扩增非目标序列的情况下进行扩增反应的反应混合物，其包含具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸。
在又另一个实施方案中，本发明是具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列的抑制寡核苷酸在核酸扩增反应中以降低非特异性扩增的用途。
附图概述
图1显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2(包括密码子12), 其中通过也用作引物之一的抑制寡核苷酸抑制突破。图1A显示未抑制的突破扩增(虚线)，且图1B显示了非目标序列扩增的抑制。
图2显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子3(包括密码子61)，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图2A显示在没有抑制寡核苷酸的情况下没有抑制突破扩增，图2B显示当抑制寡核苷酸以低浓度存在时没有抑制，并且图2C显示当抑制寡核苷酸以较高相对浓度存在时的抑制。
图3显示通过等位基因特异性PCR扩增人PI3KCA基因，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图3A显示在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图3B显示在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。
图4显示通过等位基因特异性PCR扩增人BRAF基因(包括密码子469和600)，其中通过不与目标序列互补的抑制寡核苷酸抑制突破。图4A显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图4B显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。图4C显示在密码子600反应中，在抑制寡核苷酸不存在的情况下的突破扩增，且图4D显示在密码子469反应中，在抑制寡核苷酸存在的情况下突破扩增的抑制。
图5显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2和3, 其中M13目标的同时线性扩增对于外显子3(密码子61)抑制突破，但对于外显子2(密码子12)没有抑制突破。
图6显示通过等位基因特异性PCR扩增人NRAS基因的外显子2，其中与目标序列具有不同同源性的抑制寡核苷酸抑制突破。图6A显示具有低同源性程度的抑制寡核苷酸没有抑制突破扩增；图6B显示具有中等同源性程度的寡核苷酸的部分抑制；并且图2C显示具有高同源性程度的寡核苷酸的完全抑制。
图7显示对于用于设计抑制寡核苷酸的人NRAS基因的外显子2的目标区域的BLAST的BLAST®搜索的结果。
图8显示从人NRAS基因的外显子2中目标区域选择抑制寡核苷酸的一个实例。
发明详述
为了便于理解本公开内容，提供了本文使用术语的以下定义。
术语“等位基因特异性引物”或“AS引物”指以下引物：所述引物可以与多于一个目标序列的变体杂交，但能够在目标序列的变体中区分，从而使得只有在所述引物杂交到一个特定变体时，核酸聚合酶在合适条件下对所述引物的有效延伸才会发生。对于目标序列的其它变体，延伸效率更低或是无效的。
术语“扩增子”是指作为聚合酶链式反应的产物形成的核酸。
术语“通用引物”是指包括等位基因特异性引物的引物对中的第二引物。通用引物不是等位基因特异性的，即无法在等位基因特异性引物可以区分的目标序列的变体之间进行区分。
术语“互补的”或“互补性”参考Watson-Crick碱基配对法则涉及的多核苷酸的反向平行链使用。互补核酸链在标准杂交条件下能够形成双链体。术语“完美互补的”或“100％互补的”指在反向平行链之间所有碱基都具有Watson-Crick配对的互补序列，即，在多核苷酸双链体中任何两个碱基之间不存在错配。术语“部分互补的”或“不完全互补的”是指在反向平行多核苷酸链之间少于100％完美的碱基的任何比对(例如，在多核苷酸双链体中存在至少一个错配或未配对的碱基)。较小核酸链(例如，寡核苷酸)可以与更大核酸(例如基因或基因组)中的区域(位点)是互补的。在标准杂交条件下，双链体会在反向平行链之间、甚至在缺少完美互补性的反向平行链之间形成。然而，部分互补链之间的双链体通常比完美互补链之间的双链体更不稳定。
核酸扩增分析背景中的“生长曲线”是一种函数图，其中自变量是扩增循环数，且因变量是在每个扩增循环测量的扩增依赖性可测量参数。通常地，扩增依赖性可测量参数是探针在杂交后或探针被核酸聚合酶的核酸酶活性水解后而发射的荧光量，参见Holland等人，(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280以及美国专利号5,210,015。在一个典型的聚合酶链式反应中，生长曲线包括指数生长段，随后为平台期。生长曲线通常以“到阈值的循环”值或“Ct”值来表征，其为可测量参数达到预定量级时的循环数。较低的或“较早的” Ct值代表更迅速的扩增，而较高的或“较晚的” Ct值代表较慢的扩增。
术语“同源性”和“同源性区域”是指其中两种核酸共享至少部分互补性的区域(位点)。同源性区域可以跨越序列的仅一部分。例如，寡核苷酸的仅一部分可以与基因组中的一个位点是同源的。寡核苷酸的不同部分可以与基因组中的几个不同位点是同源的，而完整寡核苷酸可以与基因组中的又另一个位点是同源的。正如任何部分互补核酸序列，当比对两个序列时，同源性区域可以含有一个或多个错配和缺口。较小核酸链(例如，寡核苷酸)可以与更大核酸(例如基因或基因组)中的区域(位点)是同源的。两个序列之间的术语“同源性程度”是指序列之间的同一性程度。同一性的程度通常表示为以百分比表示的同源区域中错配核苷酸与核苷酸的总数的比率。例如，与具有两个错配的目标基因组中的同源区域(位点)杂交的20个碱基寡核苷酸被称为与该区域具有90％同一性。术语“与目标基因组的同源性程度”是与目标基因组中存在的寡核苷酸的同源性区域的数量和百分比同一性的量度。具有高同源性程度的寡核苷酸具有许多同源性区域，在整个基因组中具有高百分比同一性，而具有低同源性区域程度的寡核苷酸具有较少同源性区域，在目标基因组中具有低百分比同一性。
术语“杂交的”和“杂交”是指在两条至少部分互补(如本文所定义)的核酸链之间导致形成双链体的碱基配对相互作用。不要求两条核酸在其全长上具有100％的互补性以实现杂交。较小核酸链(例如，寡核苷酸)可以与较大核酸(例如基因或基因组)中的区域(位点)杂交。
涉及与目标基因组的区域同源的抑制寡核苷酸的术语“多个同源性区域”被用来描述目标基因组中足以支持寡核苷酸的抑制特性的此类区域的数目。通常，“多个”是指多于一个，例如，2、3、20、30、200、300、2000、3000等，和两者之间的任何整数。然而，足够数目根据目标基因组中的复杂度而变化，即对于不太复杂的基因组，较小数目对于抑制现象发生可能是足够的，而对于较复杂的基因组，较大数目将是需要的。
术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可以互换使用，以描述脱氧核糖(或核糖)核酸的聚合物，包括引物、探针、或各种生物体的基因组DNA或RNA和基因组DNA或RNA的片段以及其它遗传元件，例如质粒、粘粒等。该术语不受长度限制，且是多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的任何其它N-糖苷的聚合物的统称。这些术语包括双链和单链核酸。核酸可包含天然存在的磷酸二酯键或修饰的键，包括但不限于硫代酯键。同样地，核酸可包含5个生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)或其它修饰的、非标准的或衍生化的碱基部分。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。“寡核苷酸”是有时用于描述更短的多核苷酸的术语。寡核苷酸可以由至少6个核苷酸，至多100个核苷酸构成。
术语“一级序列”是指多核苷酸或寡核苷酸中的核苷酸序列。核苷酸修饰诸如含氮碱基修饰、糖修饰或其它骨架修饰不是一级序列的一部分。标记，诸如与寡核苷酸缀合的生色团也不是一级序列的一部分。因此，两条寡核苷酸可以共有相同的一级序列但在修饰和标记上有所不同。
术语“引物”是指以下寡核苷酸，所述寡核苷酸与目标核酸中的序列杂交，并且能够在适合此类合成的条件下充当沿核酸互补链合成的起始点。对于引物延伸发生不需要完美互补性。然而，具有完美互补性(特别3'-末端附近)的引物将比具有错配、特别是3'-末端处或附近具有错配的引物更有效地延伸。
术语“探针”是指与目标核酸中的序列杂交并且可以被可检测地标记的寡核苷酸。探针可以具有修饰，诸如使探针无法被核酸聚合酶延伸的3'端修饰；和一种或多种生色团。具有相同序列的寡核苷酸可以在一个测定中充当引物而在另一个测定中充当探针。
术语“目标区域”是指由其设计抑制寡核苷酸的目标基因组的区域。
术语“样品”是指任何包含或假定包含核酸的组合物。这包括了从个体中分离出的组织或流体的样品。例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、血细胞、器官和肿瘤，以及从个体取出的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋的组织(FFPET)和从其中分离的核酸。
术语“抑制寡核苷酸”是指当存在于PCR混合物中时抑制或可检测地降低任何非目标序列的扩增的寡核苷酸。在一些情况下，抑制寡核苷酸可检测地降低等位基因特异性PCR中非目标序列的指数扩增。抑制寡核苷酸可任选地具有额外功能，包括充当用于扩增目标序列的引物。
“模板”或“目标”是指待扩增、检测或扩增并检测的核酸。目标或模板是引物或探针可杂交的序列。模板核酸基本上可衍生自任意来源，包括微生物、复杂的生物混合物、组织、体液、血清、保存的生物样品、环境分离物、体外制备物等等。模板或目标可构成核酸分子全长或一部分。
术语“目标生物体”是指其核酸样品进行分析的生物体。目标生物体的基因组被称为“目标基因组”。
术语“目标序列”是指其扩增是期望的目标生物体的序列。术语“非目标序列”是指其扩增是不期望且要避免的另一种序列。在等位基因特异性PCR的背景下，所关注的非目标序列通常是目标序列的非常相似的变体。尽管其不是期望的，但非目标序列有时连同目标序列被等位基因特异性PCR扩增，但具有较低效率。
聚合酶链式反应(PCR)能够特异性扩增在数目大得多的其它序列当中存在的目标核酸序列。等位基因特异PCR(AS-PCR)是能够在差异少如一个单一核苷酸的序列之间进行区分的方法。PCR和AS-PCR的灵敏度和特异性使得核酸的目标变体可以选择性扩增，甚至在量大得多的非目标变体和无关序列存在的情况下。理想地，非目标核酸从未被扩增至可检测水平。然而，PCR和AS-PCR测定的灵敏度受到被称为“突破扩增”的现象的挑战，所述现象是在PCR的较晚循环过程中非目标核酸序列的可检测扩增。
在进行等位基因特异性PCR中，本发明人发现，某些寡核苷酸(最初用作引物)当存在于AS-PCR测定中时显著降低突破扩增(实施例1，图1)。当进一步研究这些抑制寡核苷酸时，发现，最令人惊讶的是，寡核苷酸对无关目标，即与抑制寡核苷酸不具有任何互补性区域的目标施加相同的效果(实施例2、图2、实施例3、图3、和实施例4、图4)。因此，本发明人设计了设计和使用此类寡核苷酸以改善PCR和AS-PCR测定的方法。
尽管不希望被特定理论所束缚，但发明人假设，突破抑制的机制之一可以是在突破扩增通常发生时的较晚扩增循环中遮蔽PCR试剂。在PCR的较晚循环中，目标序列的扩增停止(达到平台)，部分是因为双链扩增子的重新退火在动力学上比引物与变性扩增子的单链的退火有利。在该阶段，过量引物变得可用于特异性较差(因而效率较低)的突破扩增，其涉及与非目标序列杂交的错配引物的延伸。然而，错配引物延伸的热力学参数是不利的。因此，错配引物延伸受到组分诸如核苷酸和核酸聚合酶的耗尽或遮蔽的很大影响。抑制寡核苷酸的特性允许在基因组中其它地方的线性引物延伸和(任选地)在基因组中其它地方的额外扩增子的指数生成。这些外来反应，尽管可争辩地本身不是非常有效，但遮蔽关键试剂且抑制需要这些试剂的突破扩增。
为了测试该假设，发明人进行了实施例5中描述的实验。在该实施例中，在能够引发多个线性延伸反应的工程改造的引物/目标组合存在的情况下进行对于其突破扩增已知的AS-PCR测定(图5A)。预测多个线性延伸反应生成一些耗尽效应且抑制突破扩增。的确，观察到突破扩增的一些抑制(图5B)。
在一个实施方案中，本发明是用于抑制在扩增反应，例如PCR或等位基因特异性PCR(AS-PCR)中非目标序列的扩增的抑制寡核苷酸。抑制寡核苷酸与目标生物体的基因组中的多个位点是同源的。目标基因组中的这些位点包含与抑制寡核苷酸具有同源性的区域。在一些实施方案中，抑制寡核苷酸与目标基因组之间的同源性区域具有至少75％同一性。在一些实施方案中，同源性区域是至少15个碱基对长。然而，可以理解，对于某些序列(例如，富含GC的序列)，较短的同源性区域或具有小于75％同一性的区域也可以提供令人满意的结果。通常，各同源性区域中的同一性越高，实施例6、图6中表明的抑制效果越好。在又其它实施方案中，同源性区域跨越抑制寡核苷酸的3'-末端。在又其它实施方案中，在寡核苷酸的3'-末端处的最后4个碱基对内，同源性区域含有不超过2个错配。在一些实施方案中，至少一个同源性区域是至少15个碱基对长或/和跨越抑制寡核苷酸的3'-末端或/和从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在某些实施方案中，除了在抑制寡核苷酸和目标基因组之间具有至少75％同一性的同源性之外，至少一个同源性区域具有以下特性中的一种或多种：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在其它某些实施方案中，抑制寡核苷酸包含具有SEQ ID NOs:1-5的核酸序列或由其组成(参见表1)。
期望的是，抑制寡核苷酸引起扩增的最小干扰和目标序列的检测。如果抑制寡核苷酸能够生成额外(非目标)扩增子，则这些额外扩增子可以被检测，从而干扰目标序列的检测。优选避免抑制寡核苷酸生成这些扩增子。在该实施方案的变体中，抑制寡核苷酸具有一个额外特性：其不能够生成额外扩增子。PCR扩增子只有当正向和反向引物存在时以指数方式生成。因此，如果寡核苷酸与能够与相同核酸的相对链上的序列杂交的另一种寡核苷酸(包括本身)配对，则该寡核苷酸能够引发扩增子的指数合成，所述序列位于距第一寡核苷酸的杂交位点不超过约1000个碱基对远。应当理解，在一些情况下，例如当使用高度进行性核酸聚合酶(例如，参见美国专利号7,855,055)时，比1000个碱基对更长的非目标扩增子也可生成，并干扰目标核酸的扩增和检测。因此，当使用高度进行性聚合酶时，可以基于高于1000个碱基对的上限排除潜在的抑制寡核苷酸。在该情况下，可以排除更多潜在抑制寡核苷酸。另一方面，在片段化的核酸(例如，从福尔马林固定的石蜡包埋组织FFPET分离的核酸)的情况下，较长扩增子是不可能的，且可以基于短于1000个碱基对的限值排除潜在抑制寡核苷酸。在该情况下，可以排除更少潜在抑制寡核苷酸。根据本发明，在一些实施方案中，如果寡核苷酸具有位于目标基因组的相对链上至少两个同源性区域，则该寡核苷酸不用作抑制寡核苷酸，所述区域在该寡核苷酸与目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。
抑制寡核苷酸可通过制备寡核苷酸的任何合适的方法制备，通常使用市售试剂和设备化学合成。或者，寡核苷酸可通过商业来源购买。合成寡核苷酸的方法在本领域众所周知(参见，Narang等人, Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979；Brown等人, Meth. Enzymol.68:109-151, 1979；Beaucage等人, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981；或美国专利号4,458,066)。
在该实施方案的变体中，本发明包含SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明是设计用于抑制在扩增反应，例如PCR或等位基因特异性PCR(AS-PCR)中非目标序列的扩增的抑制寡核苷酸的方法。设计本发明的抑制寡核苷酸的方法依赖于序列比对算法。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸设计方法使用序列比对软件。此类软件目前广泛可用，并在许多情况下，是向公众免费开放的。例如，国立卫生研究院已经通过其网站使BLAST®(基本局部比对搜索工具)软件包可免费获得。本发明并不限于使用BLAST®，而BLAST®仅仅是合适软件包的实例。成对序列比对软件的其它实例包括ACANA (Huang et al. (2006) Accurate anchoring alignment of divergent sequences. Bioinformatics 22:29-34)、Bioconductor (Fred Hutchinson CancerResearch Center免费发布的开源软件)、FEAST (the University of Waterloo, Canada免费发布的软件包)、FASTA (the University of Virginia免费发布的软件包)、REPuter(Kurtz et al. (2001) REPuter:The Manifold Applications of Repeat Analysis on a Genomic Scale, Nucleic Acids Res., 29(22):4633-4642)、SWIFT BALSAM (BAsicfiLter for Semigobal non-gapped AlignMent search) (Rasmussen et al. (2006)Efficient q-Gram Filters for Finding All epsilon-Matches over a Given Length,J. Comp. Biol. 13(2), 296-308)。因此，在一些实施方案中，在设计根据本发明的抑制寡核苷酸的方法中使用的序列比对算法选自Basic Local Alignment Search Tool、Smith-Waterman process、ACANA、Bioconductor、FEAST、FASTA、REPuter 和SWIFT BALSAM。
在一个实施方案中，本发明的方法包括使用序列比对算法来选择特征在于具有与目标基因组的同源性的多个区域的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述方法使用序列比对算法来选择抑制剂与目标基因组之间的同源性区域具有至少75％同一性的寡核苷酸。在一些实施方案中，所述方法使用序列比对算法来选择同源性区域是至少15个碱基对长的寡核苷酸。在又其它实施方案中，所述方法使用序列比对算法来选择其中同源性区域跨越寡核苷酸的3’-末端的寡核苷酸。在又其它实施方案中，所述方法使用序列比对算法来选择其中在寡核苷酸的3'-末端处的最后4个碱基对内同源性区域含有不超过2个错配的寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个同源性区域是至少15个碱基对长或/和跨越抑制寡核苷酸的3'-末端或/和从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在某些实施方案中，除了在抑制寡核苷酸和目标基因组之间具有至少75％同一性的同源性之外，至少一个同源性区域具有以下特性中的一种或多种：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在该实施方案的变体中，本发明的方法包括，如果寡核苷酸具有位于目标基因组的相对链上至少两个同源性区域，则使用序列比对算法来排除该寡核苷酸用作抑制寡核苷酸，所述区域在该寡核苷酸与目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。
在本发明的一些实施方案中，抑制寡核苷酸衍生自由用户选择的目标区域。目标区域可以含有或邻近于目标序列，或者可以是基因组的无关区域。对目标区域的大小没有限制，尽管通常较大区域可以生成用于设计抑制寡核苷酸的更多选择。通常，目标区域应当具有抑制寡核苷酸中期望的一些特征。在该方法的一些实施方案中，目标区域包含与目标基因组具有至少75％同一性且至少15个核苷酸长的多个同源性区域。
在一个实施方案中，本发明的方法包括用使用序列比对算法进行的以下步骤：
(a)鉴定一个或多个目标区域；
(b)使用目标区域作为查询进行目标基因组区域的搜索来鉴定目标区域和目标基因组之间的同源性区域；
(c)选择与目标基因组具有最多同源性区域的目标区域的区段；
(d)在步骤(c)中选择的区段中设计一个或多个寡核苷酸；
(e)用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行目标基因组的搜索，以鉴定符合以下标准中的一个或两个的与目标基因组具有最高同源性区域数目的寡核苷酸：至少75％同一性和寡核苷酸的3'-末端区域中存在的不超过2个错配；
(f)任选地，用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行目标基因组的搜索，以鉴定和排除具有被少于约1000个碱基对隔开的位于目标基因组序列的相对链上至少两个同源性区域的寡核苷酸。
通常，选择目标区域和具有步骤(e)中鉴定且任选被选为不能够生成非目标扩增子(f)的大部分同源性区域的寡核苷酸。然而，可以理解的是，过多数目的同源性区域可能对作为整体的测定是有害的。例如，与目标基因组中的高度重复元件同源的寡核苷酸将起始过多数目的引物延伸，这将压倒反应。例如参见Kazazian, H (2004) Mobile Elements: Drivers of Genome Evolution, Science 303 (5664):1626-1632 (Alu重复元件构成人基因组的11％，即在整个基因组发生约3x108次)。
实施例6展示了该方法的应用。图7是使用BLAST®进行的步骤(a)至(c)的说明。图8是使用BLAST®进行的步骤(d)至(e)的说明。
表 1
抑制寡核苷酸
对于引物的成功延伸，引物需要与目标序列具有至少部分互补性。通常，引物3'末端的互补性比引物5'末端的互补性更至关重要(Innis等人编辑, PCR Protocols, (1990)Academic Press, Chapter 1, pp. 9-11)。因此，本发明涵盖公开于表1中的寡核苷酸以及具有5'末端变化的这些寡核苷酸的变体。
在一个实施方案中，本发明是抑制或降低在扩增反应，例如PCR或等位基因特异性PCR(AS-PCR)中非目标序列的扩增的方法，包括在与目标生物体的基因组序列中的多个位点同源的抑制寡核苷酸存在的情况下进行扩增，诸如，例如，AS-PCR。在一些实施方案中，抑制寡核苷酸与目标基因组之间的同源性区域具有至少75％同一性。在一些实施方案中，同源性区域是至少15个碱基对长。在又其它实施方案中，同源性区域跨越抑制寡核苷酸的3'-末端。在又其它实施方案中，在寡核苷酸的3'-末端的最后4个碱基对内，同源性区域含有不超过2个错配。在一些实施方案中，至少一个同源性区域是至少15个碱基对长或/和跨越抑制寡核苷酸的3'-末端或/和从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在某些实施方案中，除了在抑制寡核苷酸和目标基因组之间具有至少75％同一性的同源性之外，至少一个同源性区域具有以下特性中的一种或多种：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在又其它实施方案中，如果寡核苷酸具有位于目标基因组的相对链上至少两个同源性区域，则该寡核苷酸不用作抑制寡核苷酸，所述同源性区域在该寡核苷酸与目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。在该实施方案的变体中，所述方法包括使用包含具有SEQ ID NOs:1-5的核酸序列或由其组成的抑制寡核苷酸。
本发明的方法适用于传统PCR以及等位基因特异性PCR。等位基因特异性PCR是其中引物被设计来扩增目标序列、但避免扩增另一个紧密相关序列的PCR的变体。等位基因特异性PCR已描述于，例如，美国专利号6,627,402。在等位基因特异性PCR中，至少一个引物是区分引物，所述区分引物具有与目标序列互补，但与非目标序列具有错配的序列。通常，引物中的区分核苷酸，即仅与目标序列匹配的核苷酸，是3'末端核苷酸。在其中引物与目标序列不完全互补的情况下，其仍然包含与非目标序列相比与目标序列更大程度的互补性。已经描述了用于核酸扩增的等位基因特异性引物的设计和优化引物的一般方法，例如PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications, Innis等人主编, (1990) AcademicPress。
通常引物为合成寡核苷酸，由A、C、G和T核苷酸构成。然而，也可使用不常见于核酸中的非常规碱基核苷酸。例如，已知某些修饰的碱基增加扩增特异性，参见美国专利号6,001,011。Innis等人(同上)还含有关于选择核酸聚合酶用于PCR中使用的指导。示例性的热稳定DNA聚合酶来自以下的那些：嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、栖热菌种Z05(参见例如，美国专利号5,674,738)、水生栖热菌(Thermus aquaticus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌种sps17、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neopolitana)和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)。
扩增产物的检测可通过本领域已知的任何方法完成。这些检测方法包括使用标记引物和探针以及各种核酸结合染料。检测方法可以特异性地针对目标序列的一种变体，或者通用于目标序列的所有变体，甚至通用于所有的双链DNA。可以在扩增已经结束后检测扩增产物，例如通过未标记产物的凝胶电泳和用核酸结合染料的凝胶染色。或者，通过利用合成过程中掺入或者利用标记的引物，扩增产物可携带放射性或化学标记。电泳后或电泳过程中，可用本领域已知的合适的放射学或化学工具检测标记的扩增产物。电泳后，也可通过本领域已知的任何一种方法标记的目标特异性的探针来检测产物。标记的探针也可以应用于目标序列而无需电泳，即用“斑点印迹”测定法等。
在一些实施方案中，扩增产物的存在可以用均相测定法检测，即其中新生产物在扩增循环过程中检测而不需要扩增后处理的测定法。使用核酸酶探针的均相扩增测定法描述于，例如，美国专利号5,210,015。使用嵌入核酸染料的均相扩增测定法描述于，例如，美国专利号5,871,908和6,569,627。均相测定法也可以采用一个或多个荧光探针，其中探针与延伸产物的杂交导致探针的酶消化和所得荧光的检测(TaqMan™探针方法, Holland等人 (1991), P.N.A.S. USA 88:7276-7280)。其它方法使用两种互相作用的荧光团标记的两个探针。此类探针的实例包括“分子信标”探针(Tyagi等人(1996) Nat. Biotechnol.,14:303-308)或荧光标记的核酸酶探针(Livak等人(1995) PCR Meth. Appl., 4:357-362)。
在均相测定法中，反应的特征在于显示探针的荧光随着PCR的每个循环增加的生长曲线(参见Holland等人(同上)和美国专利号5,210,015)。每条生长曲线的特征在于“到阈值的循环数”值或“Ct”值。较低的Ct值代表扩增的较快完成，而较高的Ct值表示代表扩增的较慢完成。较低的Ct值还可以代表目标核酸的较高初始投入，而较高的Ct值可以代表较小初始投入。然而，在等位基因特异性PCR的情况下，较低的Ct值代表有效扩增。在突破扩增过程中，非目标序列产生非常高的Ct值，尽管存在大量非目标序列。高Ct值反映非目标核酸的非常低效扩增。
在又另一个实施方案中，本发明是含有对于进行具有减少的非目标序列扩增的扩增反应，例如PCR或AS-PCR，所必需的试剂的试剂盒。所述试剂至少包含特征在于与目标基因组具有多个同源性区域的抑制寡核苷酸。在一些实施方案中，至少一个同源性区域是至少15个碱基对长或/和跨越抑制寡核苷酸的3'-末端或/和从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在某些实施方案中，除了在抑制寡核苷酸和目标基因组之间具有至少75％同一性的同源性之外，至少一个同源性区域还具有以下特性中的一种或多种：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在又其它实施方案中，如果寡核苷酸具有位于目标基因组的相对链上至少两个同源性区域，则该寡核苷酸不包括在试剂盒中作为抑制寡核苷酸，所述同源性区域在该寡核苷酸与目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。在这些实施方案的变型中，抑制寡核苷酸包含具有SEQ ID NOs:1-5的核酸序列或由其组成。
在一些实施方案中，除了抑制寡核苷酸，试剂盒包含至少一种选自以下的其它试剂：一条或多条等位基因特异性引物、一条或多条对应的通用引物和任选地，一个或多个探针。试剂盒可以进一步包含对扩增和检测测定的性能必需的试剂，诸如核苷三磷酸、至少一个核酸聚合酶或/和对聚合酶功能必需的缓冲液。在某些实施方案中，对探针进行可检测地标记。在此类实施方案中，试剂盒可以包含用于检测标记的试剂。任选地，试剂盒还可以含有增强PCR的性能的试剂，包括dUTP和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)以减少污染和甜菜碱以增强特异性。
在又另一个实施方案中，本发明是用于进行具有减少的非目标序列扩增的扩增反应，例如PCR或等位基因特异性PCR，的反应混合物。所述混合物至少包含特征在于与目标基因组具有多个同源性区域的抑制寡核苷酸。在一些实施方案中，所述同源性区域具有以下特性中的一种或多种：在抑制寡核苷酸和目标基因组序列之间至少75％同一性；至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；和寡核苷酸的3'-末端的最后四个碱基对内，同源性区域含有不超过2个错配。在一些实施方案中，至少一个同源性区域是至少15个碱基对长或/和跨越抑制寡核苷酸的3'-末端或/和从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在某些实施方案中，除了在抑制寡核苷酸和目标基因组之间具有至少75％同一性的同源性之外，至少一个同源性区域具有以下特性中的一种或多种：为至少15个碱基对长；跨越抑制寡核苷酸的3'-末端；从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。在一些实施方案中，除了抑制寡核苷酸，混合物包含一条或多条等位基因特异性引物、一条或多条对应的通用引物和任选地，一个或多个探针。在某些实施方案中，反应混合物可以进一步包含试剂，诸如核苷三磷酸、至少一个核酸聚合酶或/和对聚合酶功能必需的缓冲液。在又其它实施方案中，如果寡核苷酸具有位于目标基因组的相对链上至少两个同源性区域，则该寡核苷酸不包括在反应混合物中作为抑制寡核苷酸，所述同源性区域在该寡核苷酸与目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于约1000个碱基对隔开。在这些实施方案的变型中，抑制寡核苷酸包含具有SEQ ID NOs:1-5的核酸序列或由其组成。
实施例
实施例1
PC​​R引物抑制突破扩增
在本实施例中，在人NRAS基因的密码子12中的AS-PCR靶向突变中观察到突破扩增的抑制。实施例1中使用的引物和探针显示于表2中。将选自SEQ ID NOs:6-23的上游引物匹配至对应于人NRAS基因的外显子2中氨基酸改变G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、和G12V的突变35G>C、34G>T、35G>A、34G>C、34G>A、和35G>T之一，并与野生型序列错配。选自SEQ IDNOs:24-26的下游引物在人NRAS基因的外显子2的突变与野生型序列之间是通用的，检测探针选自SEQ ID NOs:27-29。
表 2
实施例1中使用的NRAS基因的外显子2的引物和探针。
标准PCR混合物包括三磷酸核苷(包括dUTP)、DNA聚合酶、各0.1 µM选择性引物、0.1-0.7 µM通用引物、检测探针、目标DNA(9900个拷贝的野生型K562细胞系与100个拷贝的突变型质粒，或10,000个拷贝的野生型细胞系DNA或10,000个拷贝的NRAS野生型外显子2或3质粒)和尿嘧啶-N-糖基化酶。使用Roche LightCycler® 480仪器(Roche AppliedScience, Indianapolis, Ind.)完成扩增和分析。使用以下温度概况：2个循环的95℃(10秒钟)至62℃ (30秒钟)，随后从93℃ (10 秒钟)至62℃ (30秒钟)循环55次。在55次循环程序中，在每一个62℃步骤开始时收集荧光数据。
结果显示于图1中。野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示；含有野生型序列的质粒的扩增通过粗实线显示，并且突变型DNA(目标序列)的扩增通过细实线显示。结果表明，当上游突变特异性引物与选自SEQ ID NOs:24-26的下游引物之一配对时，检测到非目标(野生型)序列的突破扩增。参见，图1A(虚线)。当相同的突变特异性引物与选自SEQ IDNOs:1-5的不同下游引物配对时，非目标(野生型)序列的突破扩增受到抑制，参见图1B。值得注意的是，质粒中存在的非目标序列的扩增不受影响，并且不受抑制(粗实线)。
实施例2
通过额外的抑制寡核苷酸的突破扩增抑制
在本实施例中，在人NRAS基因的密码子61中的AS-PCR靶向突变中观察到突破扩增的抑制。实施例2中使用的引物和探针显示于表3中。将选自SEQ ID NOs:30-47的上游引物匹配至对应于人NRAS基因的氨基酸改变Q61Ha、Q61Hb、Q61K、Q61L、Q61P、和Q61R的突变183A>T、183A>C、181C>A、182A>T、182A>C、182A>G之一，并与野生型序列错配。选自SEQ ID NOs:48-50的下游引物和选自SEQ ID NOs:51-53的检测探针在NRAS基因的外显子3的突变型和野生型序列之间是通用的。选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸不与本实施例中使用的引物对定义的任何扩增子杂交。
表 3
实施例2中使用的NRAS基因的外显子3的引物和探针。
在本实施例中，使用与实施例1中相同的反应条件，不同之处在于，除上游和下游引物之外，还以0.1或0.7 µM将选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸之一添加至反应。
结果显示于图2中。
野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示，并且突变型DNA(目标序列)的扩增通过细实线显示。结果表明，当使用由通用引物和Q61突变特异性引物构成的引物对时，检测到非目标序列的突破扩增。参见，图2A(虚线)。当抑制寡核苷酸也以0.1 µM存在于反应混合物中时，非目标序列的突破扩增不受抑制，参见图2B。但是，当抑制寡核苷酸也以0.7 µM存在于反应混合物中时，非目标序列的突破扩增受抑制，参见图2C。在本实施例中，所有引物都以0.1 µM存在，同时抑制寡核苷酸以0.1 µM或0.7 µM存在。
实施例3
通过抑制寡核苷酸的无关模板PI3KCA的突破扩增的抑制
在本实施例中，在人PI3KCA基因的密码子1049中的AS-PCR靶向突变中观察到突破扩增的抑制。实施例3中使用的引物和探针显示于表4中。将选自SEQ ID NOs:54-56的上游引物匹配至对应于人PI3KCA基因的氨基酸改变G1049R的突变3145G>C，并与野生型序列错配。选自SEQ ID NOs:57-59的下游引物和选自SEQ ID NOs:60 & 96和61 & 97的探针在突变型和野生型序列之间是通用的。选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸(对于人NRAS基因特异性)不与本实施例中使用的PI3KCA扩增子杂交。
表 4
实施例3中使用的PI3KCA基因的引物和探针。
在本实施例中，使用与实施例1中相同的反应条件，不同之处在于，除上游和下游引物之外，还以1.0 µM将选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸之一添加至反应。
结果显示于图3中。野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示；并且突变型DNA(目标序列)的扩增通过细实线显示。结果表明，当使用由G1049R特异性引物和通用引物构成的引物对时，检测到非目标(野生型)序列的突破扩增。参见，图3A(虚线)。当选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸也存在于反应混合物中时，非目标(野生型)序列的突破扩增受到抑制，对目标(突变的G1049R)序列的特异性扩增没有影响(实线)。参见图3B。还将选自SEQ ID NOs:1-5的相同的抑制寡核苷酸添加至设计以检测PI3KCA突变1258T>C、1635G>T、1634A>G、和1633G>A的等位基因特异性PCR。观察到相同的趋势：对目标(突变型)序列的特异性扩增没有影响，和非目标(野生型)序列的突破扩增的抑制(数据未显示)。
实施例4
通过抑制寡核苷酸的无关模板BRAF的突破扩增的抑制
在本实施例中，在人BRAF基因的密码子469和600中的AS-PCR靶向突变中观察到突破扩增的部分抑制。实施例4中使用的引物和探针显示于表5中。对于密码子469中的突变，上游引物选自SEQ ID NOs:62-70。这些引物匹配至外显子11的密码子469处的各种突变。对于密码子600中的突变，上游引物选自SEQ ID NOs:75-86。这些引物匹配至外显子15的密码子600处的各种突变。对于密码子469突变，通用下游引物选自SEQ ID NOs:71-72，并且探针选自SEQ ID NOs:73 & 98和74 & 99。对于密码子600突变，下游引物选自SEQ ID NOs:87-89，并且探针选自SEQ ID NOs:90-92。选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸(对于人NRAS基因特异性)不与本实施例中使用的任何引物对定义的BRAF扩增子杂交。
表 5
实施例4中使用的BRAF基因的引物和探针。
在本实施例中，使用与实施例3中相同的反应条件。
结果显示于图4中。野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示，并且BRAF密码子469和600目标的扩增通过实线显示。结果表明，当使用由与密码子469突变之一匹配的引物和通用引物组成的引物对时，检测到非目标(野生型)序列的突破扩增，参见图4A(虚线)。当选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸也存在于反应混合物中时，非目标(野生型)序列的突破扩增受到抑制(虚线)，对突变型序列的特异性扩增具有轻微影响(实线)。参见图4B。当使用由与密码子600突变之一匹配的引物和通用引物组成的引物对时，检测到非目标(野生型)序列的突破扩增。参见图4C(虚线)。当选自SEQ ID NOs:1-5的抑制寡核苷酸也存在于反应混合物中时，非目标(野生型)序列的突破扩增受到部分抑制，参见图4D。使用BRAF系统观察到的非目标扩增的不完全抑制和对目标扩增的轻微影响表明，抑制现象是序列依赖性的。
实施例5
通过线性引物延伸反应的突破扩增的抑制
在本实施例中，在M13模板和一系列M13特异性引物存在的情况下观察到NRAS模板的突破扩增的抑制。AS-PCR靶向人NRAS基因的密码子12和61处的突变。实施例5中使用的M13引物显示于表6中。对于NRAS目标，上游引物选自SEQ ID NOs:30-47。将这些引物匹配至对应于人NRAS基因的氨基酸改变Q61Ha、Q61Hb、Q61K、Q61L、Q61P、和Q61R的突变183A>T、183A>C、181C>A、182A>T、182A>C、182A>G之一，并与野生型序列错配。选自SEQ ID NOs:48-50的下游引物和选自SEQ ID NOs:51-53的探针在人NRAS基因的外显子3的突变型和野生型序列之间是通用的。将选自SEQ ID NOs:6-23的上游引物匹配至人NRAS基因的外显子2中突变35G>C、34G>T、35G>A、34G>C、34G>A、和35G>T之一，并与野生型序列错配。选自SEQ IDNOs:24-26的下游引物和选自SEQ ID NOs:27-29的检测探针在人NRAS基因的外显子2的突变型和野生型序列之间是通用的。反应混合物还含有噬菌体M13的单链环状DNA和以相同方向取向的三条引物(SEQ ID NOs:93-95，表6)，以确保病毒模板的线性扩增。
表 6
实施例5中使用的M13引物
在本实施例中，使用与实施例1中相同的反应条件，不同之处在于，以10,000个拷贝/每个反应添加M13单链噬菌体模板，并且对于0.1 µM的总浓度，以各0.033 µM的等摩尔浓度添加引物SEQ ID NOs:63-65。
结果显示于图5中。野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示，并且NRAS密码子12或密码子61突变型目标的扩增通过实线显示。结果表明，当使用由与密码子61中突变之一匹配的等位基因特异性引物和通用引物组成的引物对时，检测到非目标(野生型)NRAS序列的突破扩增。参见，图5A(虚线)。当M13 DNA和能够线性扩增M13 DNA的三条引物也存在于反应混合物中时，非目标(野生型)NRAS序列的突破扩增受到抑制。参见图5B。通过比较，当使用由与密码子12中突变之一匹配的等位基因特异性引物和通用引物组成的引物对时，检测到非目标(野生型)NRAS序列的突破扩增。参见图5C(虚线)。该突破扩增没有被M13 DNA和能够线性扩增M13 DNA的三条引物所抑制。参见图5D。
实施例6
与目标基因具有不同程度的同源性的抑制寡核苷酸的突破抑制
在本实施例中，在人NRAS基因的密码子12中的AS-PCR靶向突变中观察到几种抑制寡核苷酸对突破扩增的抑制。从SEQ ID NOs:6-23，即匹配至人NRAS基因中的密码子12突变(35G>C、34G>T、35G>A、34G>C、34G>A、和35G>T，对应于氨基酸改变G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、和G12V)之一并与野生型序列错配的引物选择上游引物。上游引物与不同下游引物配对，充当突破扩增的抑制剂。由SEQ ID NOs:1-5和24-26代表的这些下游引物与目标基因组具有不同程度的同源性，如根据本发明的方法确定，范围为低、中和高(参见实施例8和图8)。
在本实施例中，使用与实施例1中相同的反应条件。以0.1 µM使用具有低、中和高同源性的抑制寡核苷酸。
结果显示于图6中。野生型基因组DNA的扩增通过虚线显示；并且NRAS密码子12目标的扩增通过实线显示。结果表明，如本发明的方法确定与目标基因具有最高程度的同源性的下游引物(SEQ ID NO:1)产生最高水平的抑制(参见图6C)，而具有中等程度的同源性的下游引物(SEQ ID NOs:2-5)产生较低水平的抑制，参见图6B。具有最低程度的同源性的下游引物(SEQ ID NOs:24-26)对野生型突破没有任何影响，并且显示没有抑制，参见图6A。还值得注意的是，抑制寡核苷酸(SEQ ID NOs:1-5)具有不同程度的抑制，但如Ct所测量，对特异性扩增没有任何负面影响。
实施例7
目标区域内选择同源性区域
在本实施例中，选择人NRAS基因作为用于设计抑制寡核苷酸的目标区域。来自NRAS基因的外显子2的488碱基对区域被用作在宽松条件下与人基因组序列比较的查询序列，选择使用算法“blastn.”发现“有点相似序列”的选项。图7显示，搜索揭示了查询序列的核苷酸180-270和360-450定义的部分中多重同源性的区域。这些地区被选择为用于设计抑制寡核苷酸的目标区域。
实施例8
从目标区域选择抑制寡核苷酸
在本实施例中，设计来自目标区域的几个寡核苷酸并进行BLAST®分析，以确定人基因组中符合本发明所述标准的同源性区域。图8显示了对于每种寡核苷酸的参数和抑制反应中突破扩增的实际能力。所述参数包括在列“nMer”下的寡核苷酸长度。在列“总命中”下是所述寡核苷酸与用程序Blastn能够找到的目标基因组之间的“Blast命中”总数。在“有点相似序列”上设置程序严谨性。在列“具有标准的命中(Hits with Criteria)”下，这是满足75％同一性的标准且在3'末端少于两个错配的总命中数。列“同源性程度”含有如下指定的值：当只有一个符合本发明所述标准的命中时，与目标基因组的同源性程度被称为“低”，当有十个或更少符合该标准的命中时，同源性程度被称为“中等”，且当有多于10个符合该标准的命中时，同源性程度被称为“高”。最后，“突破”列表明在寡核苷酸存在的情况下是否观察到突破扩增。
序列表
<110> ROCHE DIAGNOSTICS GMBH
F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<120> 用高同源性寡核苷酸抑制非特异性扩增
<130> 30622 WO-HS
<150> 61/566,518
<151> 2011-12-02
<160> 99
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成寡核苷酸"
<400> 1
ctaccactgg gcctcacct 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成寡核苷酸"
<400> 2
caggatcagg tcagcgggct 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成寡核苷酸"
<400> 3
agacaggatc aggtcagcgg g 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成寡核苷酸"
<400> 4
caggtcagcg ggctaccact 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成寡核苷酸"
<400> 5
acaagtgaga gacaggatca ggtc 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 6
ctggtggtgg ttggagccgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (17)..(17)
<223> N4-甲基-dC
<400> 7
ctgctggtgg ttggagcagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (18)..(18)
<223> N6-甲基-dA
<400> 8
ctgctggtgg ttggagcagc 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 9
caaactggtg gtggttggag ctt 23
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 10
tacaaactgg tggtggttgg agctt 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 11
cagagtggtg gtggttggag cat 23
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (20)..(20)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 12
aagtggtggt ggttggagca ga 22
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> N6-甲基-dA
<400> 13
aacttggtgg tggttggagt aga 23
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 14
aactggtggt ggttggagct ga 22
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 15
aactggtggt ggttggaaca c 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 16
aactggtggt ggttggatca c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 17
atcgggtggt ggttggagca c 21
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 18
cagactggtg gtggttggag caa 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 19
agactggtgg tggttggagc aa 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (20)..(20)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 20
agactggtgg tggttggagc aa 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 21
aactggtggt ggttggagca at 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 22
aactggtggt ggttggagca tt 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (19)..(19)
<223> N4-甲基-dC
<400> 23
aactggtggt ggttggagca at 22
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 24
gaatatgggt aaagatgatc cgacaa 26
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 25
gtaaagatga tccgacaagt gagaga 26
<210> 26
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 26
gaatatgggt aaagatgatc cgacaagt 28
<210> 27
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-HEX"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 27
cactgaccaa tccagctaat ccagaaccac 30
<210> 28
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-HEX"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 28
cactgaccaa tccagctaat ccagaaccac 30
<210> 29
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-HEX"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 29
gtggttcctg gattagctgg attgtcagtg 30
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(24)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 30
ggatatactg gatacagctg gacat 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 31
ggacatactg gatacagctg gactt 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 32
ggacatactg gatacagctg gagat 25
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 33
acatactgga tacagctgga ctc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 34
atactggata cagctggact c 21
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 35
atactggata cagctggata c 21
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> 肌苷
<400> 36
tggatatact ggatacagct gnaa 24
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 37
gacatactgg atacagctgg aa 22
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-甲基-dA
<400> 38
tggatatact ggatacagct ggaa 24
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 39
gagatactgg atacagctgg act 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 40
gacatactgg atacagctgt act 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 41
gacatactgg atacagctga act 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 42
gacgtactgg atacagctgg acc 23
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (20)..(20)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 43
cgtactggat acagctggac c 21
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 44
gacatactgg atacagctga acc 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-甲基-dC
<400> 45
gacatactgg atacagctgg tcg 23
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 46
acgtactgga tacagctgga cg 22
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(22)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 47
gacacactgg atacagctgg acg 23
<210> 48
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 48
agagaaaata atgctcctag tacctgtag 29
<210> 49
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 49
tcctttcaga gaaaataatg ctcctagt 28
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 50
gttaatatcc gcaaatgact tgctattatt 30
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 51
ctgtccctca tgtattggtc tctcatggca ctg 33
<210> 52
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 52
ctcatgctat tggtctctca tggcactgta c 31
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (7)..(7)
<223> N4-甲基-dC
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 53
cttcgccctg tcctcatgta ttggtctctc 30
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 54
catgaaacaa atgaatgatg cacatcctc 29
<210> 55
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 55
catgaaacaa atgaatgatg cacatcgtc 29
<210> 56
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 56
catgaaacaa atgaatgatg cacattatc 29
<210> 57
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 57
caatgcatgc tgtttaattg tgtgga 26
<210> 58
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 58
ttcagttcaa tgcatgctgt ttaattgtg 29
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 59
gtggaatcca gagtgagctt tcat 24
<210> 60
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-JA270"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-BHQ-2"
<400> 60
tggctggaca a 11
<210> 61
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-JA270"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-BHQ-2"
<400> 61
atggattgga 10
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 62
aaagaattgg atctggatca ttagc 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 63
aaagaattgg atctggatca ttcgc 25
<210> 64
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 64
aaagaattgg atctggatca tgtgc 25
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 65
aaagaattgg atctggatca tata 24
<210> 66
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 66
acaaagaatt ggatctggat cattaa 26
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 67
agtgggacaa agaattggat cagt 24
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 68
agtgggacaa agaattggat ctat 24
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 69
acaaagaatt ggatctggat catttaa 27
<210> 70
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 70
gacaaagaat tggatctgga tcatttaa 28
<210> 71
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 71
gcgaacagtg aatatttcct ttgatg 26
<210> 72
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 72
gacttgtcac aatgtcacca cattacata 29
<210> 73
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM"
<220>
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<400> 73
agtctacaag 10
<210> 74
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-BHQ-2"
<400> 74
tggcatggta 10
<210> 75
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (31)..(31)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 75
agtaagaata ggtgattttg gtctagctac aa 32
<210> 76
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (30)..(30)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 76
agtaagaata ggtgattttg gtctagctac aa 32
<210> 77
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (30)..(30)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 77
agtaagaata ggtgattttg gtctagctcc aa 32
<210> 78
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (21)..(21)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (31)..(31)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 78
agtaagaata ggtgattttg ntctagctac at 32
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(26)
<223> 肌苷
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (31)..(31)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 79
agtaagaata ggtgattttg gtctanctac at 32
<210> 80
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (31)..(31)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 80
agtaagaata ggtgattttg gtctagctac at 32
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 81
aatgggtgat tttggtctag ctactgg 27
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(26)
<223> 肌苷
<400> 82
aatgggtgat tttggtctag ctatang 27
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (25)..(25)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<400> 83
agtaggtgat tttggtctag ctatagg 27
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (23)..(23)
<223> N6-叔丁基-苄基-dA
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(26)
<223> 肌苷
<400> 84
aatgggtgat tttggtctag ctatanc 27
<210> 85
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(26)
<223> 肌苷
<400> 85
aatgggtgat tttggtctag ctactnc 27
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(24)
<223> N4-叔丁基-苄基-dC
<400> 86
aatgggtgat tttggtctag ctactgc 27
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 87
gtggaaaaat agcctcaatt cttacca 27
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 88
tagcctcaat tcttaccatc cacaaaa 27
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 89
ctagtaactc agcagcatct cag 23
<210> 90
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 90
cagacaactg ttcaaactga tggg 24
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 91
cagtttgaac agttgtctgg atcca 25
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-FAM"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-BHQ-2 磷酸酯"
<400> 92
tctcgatgga gtgggtcc 18
<210> 93
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 93
acatgaaagt attaagaggc tgagactcct ca 32
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 94
gaagaaagcg aaaggagcgg gc 22
<210> 95
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成引物"
<400> 95
ggaacgaggg tagcaacggc taca 24
<210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 96
caaaaatgga ttggatc 17
<210> 97
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 97
tcttccacac aattaaacag catg 24
<210> 98
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 98
ggaaagtggc atggtaa 17
<210> 99
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注="人工序列表的说明：合成探针"
<220>
<221> 来源
<223> /注="5'-BHQ-2"
<220>
<221> 来源
<223> /注="3'-磷酸酯"
<400> 99
agtatgtaat gtggtgacat t 21

Claims (9)

1.设计用于在核酸扩增反应中使用以减少非特异性扩增的抑制寡核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)鉴定目标生物体的基因组中一个或多个目标区域；
(b)对于每个目标区域，使用所述目标区域作为查询进行所述目标基因组序列的搜索来鉴定所述目标区域和所述目标基因组之间的同源性区域；
(c)选择在所述目标基因组中具有最多同源性区域的目标区域的区段；
(d)在步骤(c)中选择的区段中设计一个或多个寡核苷酸；
(e)用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行目标基因组的搜索，以鉴定与所述目标基因组具有最高同源性区域数目的寡核苷酸，其中所述同源性区域为至少15个碱基对长，所述寡核苷酸与目标基因组之间的同源性区域具有至少75％同一性，且所述同源性区域跨越所述寡核苷酸的3’-末端，同时在所述寡核苷酸3'-末端的4个核苷酸内存在不超过2个错配，且所述寡核苷酸与要在扩增反应中扩增的目标序列不具有互补性区域；
(f)选择步骤(e)中鉴定的寡核苷酸作为抑制寡核苷酸。
2.权利要求1的方法，在步骤(e)和(f)之间进一步包括用步骤(d)中设计的寡核苷酸进行所述目标基因组的搜索，以鉴定和排除具有位于所述目标基因组的相对链上至少两个同源性区域的寡核苷酸，所述同源性区域在所述寡核苷酸和所述目标基因组序列之间具有至少75％同一性，其中所述同源性区域被少于1000个碱基对隔开。
3.降低目标生物体基因组中目标序列的核酸扩增反应中非目标核酸模板的扩增的方法，其包括在抑制寡核苷酸存在的情况下使用包含至少一条对目标序列的变体特异的等位基因特异性引物的引物组进行扩增反应，所述抑制寡核苷酸可通过线性引物延伸进行延伸，与目标序列不具有互补性区域；且具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列，其中所述至少一个同源性区域为至少15个碱基对长，跨越所述抑制寡核苷酸的3'-末端，并且从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。
4.权利要求3的方法，其中所述抑制寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:1-5的核酸序列。
5.用于进行目标生物体基因组中目标序列的具有减少的非目标序列扩增的扩增反应的试剂盒，其包括
- 包含至少一条对目标序列的变体特异的等位基因特异性引物的引物组；和
- 抑制寡核苷酸，所述抑制寡核苷酸可通过线性引物延伸进行延伸，与目标序列不具有互补性区域；且具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列，其中所述至少一个同源性区域为至少15个碱基对长，跨越所述抑制寡核苷酸的3'-末端，并且从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。
6.权利要求5的试剂盒，进一步包含以下中的一种或多种：至少一条通用引物、探针、三磷酸核苷、核酸聚合酶和对于聚合酶的功能所必需的缓冲剂。
7.用于进行目标生物体基因组中目标序列的具有减少的非目标序列扩增的扩增反应的反应混合物，其包括
- 包含至少一条对目标序列的变体特异的等位基因特异性引物的适合于目标序列扩增的引物组；和
- 抑制寡核苷酸，所述抑制寡核苷酸可通过线性引物延伸进行延伸，与目标序列不具有互补性区域；且具有包含与目标生物体的基因组中的多个位点具有至少75％同一性的至少一个同源性区域的序列，其中所述至少一个同源性区域为至少15个碱基对长，跨越所述抑制寡核苷酸的3'-末端，并且从3'-末端的4个核苷酸内含有不超过2个错配。
8.权利要求7的反应混合物，进一步包含以下中的一种或多种：一条或多条对应的通用引物、一个或多个探针、三磷酸核苷、至少一个核酸聚合酶和对于聚合酶的功能所必需的缓冲剂。
9.权利要求7或8任一项的反应混合物，其中所述抑制寡核苷酸包含选自SEQ ID NOs:1-5的核酸序列。
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