ES2634428T3 - Amplificación de ácido nucleico con supresión específica de alelo de variantes de secuencia - Google Patents

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ES2634428T3 ES10700205.7T ES10700205T ES2634428T3 ES 2634428 T3 ES2634428 T3 ES 2634428T3 ES 10700205 T ES10700205 T ES 10700205T ES 2634428 T3 ES2634428 T3 ES 2634428T3
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Abstract

Un procedimiento de amplificación selectiva de una variante deseada de una secuencia diana, cuya secuencia diana existe en forma de más de una variante, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) proporcionar una muestra que posiblemente comprende al menos una variante de la secuencia diana en una mezcla de reacción; b) proporcionar un primer oligonucleótido, capaz de hibridarse con más de una variante de la secuencia diana; c) proporcionar un segundo oligonucleótido, capaz de hibridarse con más de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fracción de dicho segundo oligonucleótido contiene una base modificada en uno o más nucleótidos en o cerca del extremo 3' y en el que dicha base modificada está modificada en el grupo amino exocíclico; d) proporcionar un tercer oligonucleótido capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana y diseñado para hibridarse con la misma cadena y entre 0 y 60 nucleótidos hacia el extremo 3' de dicho segundo oligonucleótido; e) proporcionar una polimerasa de ácido nucleico que carece sustancialmente de actividad nucleasa 5'- 3'; f) someter dicha mezcla de reacción a reacción en cadena de la polimerasa, en el que las cantidades de dichos oligonucleótidos primero y segundo son desiguales, de manera que el primer oligonucleótido está presente en exceso y dicho tercer oligonucleótido inhibe sustancialmente la extensión de dicho segundo oligonucleótido por dicha polimerasa de ácido nucleico cuando dicho tercer oligonucleótido se hibrida con la variante no deseada de la secuencia diana, pero no inhibe sustancialmente la extensión de dicho segundo oligonucleótido por dicha polimerasa de ácido nucleico cuando dicho tercer oligonucleótido se hibrida con la variante deseada de la secuencia diana.

Description

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DESCRIPCION
Amplificacion de acido nucleico con supresion especifica de alelo de variantes de secuencia Campo de la invencion
La invencion se refiere al campo de los diagnosticos moleculares basados en acidos nucleicos y, mas especificamente, a un procedimiento mejorado de amplificacion de secuencias de acidos nucleicos con supresion especifica de alelo de amplificacion de variantes de secuencia no deseadas.
Antecedentes de la invencion
Las pruebas de diagnostico basadas en acidos nucleicos se usan ampliamente en medicina, medicina forense y aplicaciones ambientales. La deteccion de variaciones en una secuencia de acido nucleico en particular proporciona informacion sobre polimorfismos y mutaciones, incluyendo mutaciones causantes de enfermedades. Por ejemplo, la deteccion del genotipo mutante de un individuo proporciona el estatus de portador de enfermedad para el asesoramiento genetico. Una tarea mas dificil es detectar las mutaciones somaticas que surgen en los tejidos y causan enfermedad o progresion de la enfermedad. Por ejemplo, muchos canceres son causados por una mutacion particular. Despues, en las celulas cancerosas se acumulan mutaciones adicionales durante la progresion tumoral. Vease Lea et al. (2007) Genetic pathways and mutation profiles of human cancers: site and exposure-specific patterns, Carcinogenesis, 28(9):1851 -1858. Downward, J. (2003) Targeting RAS signaling pathways in cancer therapy (2005), Nature Rev. Cancer, 3: 11 -22. Estas mutaciones son predictivas del resultado de la enfermedad y de la respuesta a la terapia. Vease Ikediobi et al. (2008) Somatic pharmacogenomics in cancer, Pharmacogenomics J., 8:305-314, Pao et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib and or erlotinib, PLoS Medicine, 2(1), e17. La capacidad de detectar dichas mutaciones es extremadamente util en el diagnostico y tratamiento del cancer. Sin embargo, la deteccion de las mutaciones, especialmente la deteccion precoz, se enfrenta a muchos desafios tecnicos.
Un desafio importante en la deteccion de una mutacion relacionada con el cancer es la naturaleza rara de la mutacion, especialmente cuando surge por primera vez en una sola celula durante la carcinogenesis. Inicialmente, solo una subpoblacion de celulas lleva la mutacion, mientras que las celulas circundantes todavia llevan la secuencia natural. Por lo tanto, en un aislado de acido nucleico, el acido nucleico recien mutado queda ocultado por el exceso de acido nucleico natural. Muchos procedimientos de deteccion especificos de alelos (tales como la PCR especifica de alelo) implican la amplificacion preferente de la secuencia de interes (secuencia mutante) sobre la secuencia indeseada (secuencia natural). Desafortunadamente, en la mayoria de los casos, la selectividad del ensayo no es perfecta, es decir, la secuencia indeseada tambien se amplifica, pero mucho menos eficientemente que la secuencia deseada. Debido a que la secuencia no deseada (natural) esta presente en gran exceso molar en relacion a la secuencia mutante, la desventaja se elimina y la secuencia natural se amplifica predominantemente, ocultando la presencia de la secuencia mutante.
En respuesta a este desafio se han desarrollado algunos procedimientos. Por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.849.497 y la publicacion de solicitud n.° 2009/0053720, presentada el 5 de agosto de 2008, ensenan el uso de un bloqueador de amplificacion que evitaria la amplificacion de la secuencia indeseada competidora. En esta estrategia, el bloqueador es un oligonucleotido no extensible que forma un hibrido estable con la secuencia indeseada (pero no con la secuencia deseada) hacia el extremo 3' de uno de los cebadores de amplificacion. Cuando el bloqueador se hibrida establemente, una ADN polimerasa deficiente en la actividad 5'-3'-nucleasa es incapaz de completar la extension del cebador. El exito de esta estrategia depende de la divergencia de secuencias entre las secuencias deseadas y las no deseadas. La estrategia funciona mejor cuando hay multiples diferencias entre las secuencias, asegurando que el hibrido entre el bloqueador y la secuencia que se desea suprimir es estable, mientras que el hibrido entre el bloqueador y la secuencia que se desea amplificar es inestable.
El documento US 2008/0176226, por ejemplo, usa dos oligonucleotidos que se unen a mas de una variante de la secuencia diana, una sonda que se une con una afinidad mas alta a una de las variantes e inhibe la amplificacion de la otra variante. La sonda contiene una base modificada en su extremo 3' como una marca detectable. Otro procedimiento de amplificacion selectiva de una variante deseada de una secuencia diana se describe por Yu et al. (1997), Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5’ to 3’ exonuclease-deficient DNA polymerase, BioTechniques, 23(4): 714-720. La secuencia diana existe en forma de mas de una variante, que comprende las etapas de proporcionar una muestra que comprende la secuencia diana y una variante, proporcionando dos oligonucleotidos que se unen a la molecula diana y variante y un tercer oligonucleotido que se une con una afinidad mas alta a la variante en una distancia de menos de 60 nucleotidos respecto al sitio de union de uno de los cebadores. El tercer oligonucleotido inhibe especificamente la amplificacion de la variante no deseada. La sonda de bloqueo (tercer oligonucleotido) tambien se utiliza como sonda de deteccion.
El procedimiento anterior tiene varias limitaciones tecnicas. Un oligonucleotido bloqueador mas largo es mas eficiente en el bloqueo, pero puede ser incapaz de discriminar, bloqueando asi la amplificacion de todas las variantes de la secuencia. Un bloqueador mas corto puede ser incapaz de bloquear cualquier amplificacion
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eficientemente. En algunos contextos de secuencia, puede haber tan pocas diferencias que un bloqueador tenga una capacidad de discriminacion muy debil. Por lo tanto, en algunos loci de interes clinico, el bloqueador por si solo es insuficiente para resolver los problemas tecnicos de la amplificacion especifica de alelo.
Sumario de la invencion
La presente invencion es un procedimiento mejorado de amplificacion selectiva de una variante deseada de una secuencia diana, para la cual dicha secuencia diana existe en forma de mas de una variante, comprendiendo el procedimiento las etapas de: proporcionar una muestra que comprende posiblemente al menos una variante de la secuencia diana en una mezcla de reaccion; proporcionar un primer oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana; proporcionar un segundo oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fraccion de dicho segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3'; dicha base modificada se modifica en el grupo amino exociclico; proporcionar un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana y disenado para hibridarse con la misma cadena y entre 0 y 60 nucleotidos hacia el extremo 3' de dicho segundo oligonucleotido; proporcionar una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad nucleasa 5 '-3' y que posee capacidad de inicio en caliente; someter dicha mezcla de reaccion a reaccion en cadena de la polimerasa, en la que las cantidades de dichos oligonucleotidos primero y segundo son desiguales, de manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso y dicho tercer oligonucleotido inhibe sustancialmente la extension de dicho segundo oligonucleotido por dicha polimerasa de acido nucleico cuando dicho tercer oligonucleotido se hibrida con la variante no deseada de la secuencia diana, pero no inhibe sustancialmente la extension de dicho segundo oligonucleotido por dicha polimerasa de acido nucleico cuando dicho tercer oligonucleotido se hibrida con la variante deseada de la secuencia diana.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es una representacion esquematica del procedimiento de la presente invencion.
La figura 2 muestra los resultados del analisis de amplificacion y fusion de una diana natural y mutante KRAS por separado, de acuerdo con el ejemplo 1 de la presente invencion.
Las figuras 3-8 muestran los resultados de la amplificacion especifica de alelo y la deteccion de mutaciones KRAS en una mezcla de muestras natural y mutantes, de acuerdo con el ejemplo 2 de la presente invencion.
La figura 9 muestra los resultados de la amplificacion especifica de alelo y la deteccion de mutaciones de KRAS en muestras de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina derivados de pacientes (FFPET), de acuerdo con el ejemplo 3 de la presente invencion.
La figura 10 muestra la secuencia de acido nucleico diana usada en los ejemplos de la presente invencion. Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion es un procedimiento mejorado de amplificacion selectiva de ciertas variantes de la secuencia diana, potenciado por supresion especifica de alelo de amplificacion de una o mas de las otras variantes de la secuencia diana.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados en el presente documento tienen el mismo significado segun se entiende comunmente por un experto en la tecnica a la que pertenece la presente invencion. Al describir y reivindicar la presente invencion, se usaran las siguientes definiciones.
Una "muestra biologica" o "muestra" se refiere a cualquier sustancia que contenga posiblemente un acido nucleico de interes. La muestra puede obtenerse por cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Dicha muestra puede ser una cantidad de tejido o fluido, o una fraccion purificada del mismo, aislada de un ser humano u otro animal, incluyendo, pero sin limitarse a: fluido corporal, tal como plasma, suero, fluido espinal, saliva, fluido peritoneal, fluido linfatico, humor acuoso o vitreo, liquido sinovial, orina, lagrimas, fluido seminal, fluidos vaginales, derrame pulmonar, liquido seroso; tejidos, incluyendo sangre, tejidos normales, tumores y tejidos embebidos en parafina. Las muestras tambien pueden ser (o derivarse de) cultivos celulares in vitro. Las muestras pueden incluir medio condicionado, celulas y componentes celulares. El acido nucleico puede obtenerse a partir de una muestra biologica mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica.
Un "oligonucleotido bloqueador" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un oligonucleotido que:
(1) forma un duplex con algunas variantes de la secuencia diana a una temperatura de fusion suficientemente baja para permitir que una polimerasa que carezca significativamente de actividad nucleasa 5 '- 3' desplace el
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oligonucleotido bloqueador y que replique las variantes de la secuencia diana; y
(2) forma un duplex con otras variantes de la secuencia diana, a una temperatura de fusion suficientemente alta para evitar que una polimerasa que carece significativamente de actividad nucleasa 5 '- 3' replique las variantes de la secuencia diana.
El oligonucleotido bloqueador incluye tipicamente una modificacion en el extremo 3 'para evitar la extension del oligonucleotido bloqueador por una polimerasa.
Una "secuencia diana" se refiere a una secuencia de nucleotidos que se ha de detectar en una muestra biologica. La secuencia diana puede ser una porcion de una secuencia mas grande o un acido nucleico aislado.
La frase "evitar la amplificacion" se refiere a la eliminacion o reduccion (detectable) de la amplificacion de una secuencia. Tal como se describe en el presente documento, un oligonucleotido bloqueador puede evitar la amplificacion de una o mas variantes de la secuencia diana, de modo que la amplificacion de tales variantes sea indetectable, o sea menos detectable, en comparacion con una reaccion de control que carece del oligonucleotido bloqueador.
Los terminos "acido nucleico" y "polinucleotido" se usan indistintamente, y se refieren a un polimero de ARN, ADN, asi como formas modificadas de los mismos, tales como acidos nucleicos peptidicos (PNA), acidos nucleicos bloqueados (LNA) y similares. No existe una diferencia de longitud entre el termino "acido nucleico" y "polinucleotido". Un "oligonucleotido" es un acido nucleico generalmente mas corto, que es comunmente monocatenario.
Un acido nucleico es monocatenario o bicatenario y generalmente contendra enlaces fosfodiester, aunque en algunos casos se incluyen analogos de acidos nucleicos que pueden tener cadenas principales alternativas, incluyendo, por ejemplo, fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35:3800; Sprinzl et al. (1977) Eur. J. Biochem. 81:579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26:1419), fosforoditioato (Mag et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:1437 y la patente de eE. UU. n.° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:2321), O-methylphosphoroamidite linkages (Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press (1992)), y cadenas principales y enlaces de acidos peptidonucleicos (Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114:1895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. Engl. 31:1008; Nielsen (1993) Nature 365:566; y Carlsson et al. 1996, Nature, 380:207). Otros acidos nucleicos analogos incluyen aquellos con cadenas principales cargadas positivamente (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097); cadenas principales no ionicas (patentes de EE. UU. n.° 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110:4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13:1597; capitulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research", Ed. YS Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994) Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 4:395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y cadenas principales sin ribosa, incluyendo las descritas en las patentes de EE. UU. n.° 5.235.033 y 5.034.506 y capitulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook. Los acidos nucleicos que contienen uno o mas azucares carbociclicos estan tambien incluidos dentro de la definicion de acidos nucleicos (vease Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pags. 169-176). Varios analogos de acidos nucleicos se describen tambien en, por ejemplo, Rawls, C & E News 2 de junio de 1997, pagina 35. Estas modificaciones de la cadena principal de ribosa-fosfato pueden hacerse para facilitar la adicion de restos adicionales tales como restos marcadores, o para alterar la estabilidad y la semivida de dichas moleculas en entornos fisiologicos.
Los acidos nucleicos contienen generalmente las bases nitrogenadas tipicas (adenina, guanina citosina, timina y uracilo). Sin embargo, los acidos nucleicos tambien pueden contener heterociclicos no naturales u otras bases modificadas. En particular, dichas bases se describen en Seela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74:1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:971-976, and Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640. Otras bases incluyen 7-deazapurinas (por ejemplo, 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo, propinil-dU, propinil-dC, etc.) y similares. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 5.990.303. Aun otras bases heterociclicas representativas incluyen, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2- aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitidina; 5-fluorocitidina; 5-clorocitidina; 5-yodocitidina; 5-bromocitidina; 5-metilcitidina; 5-propinilcitidina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5- propiniluracilo, 4-acetilcitidina, 5-(carboxi-hidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenosina, 1- metilguanosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 7-deazaadenosina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, 3- metilcitidina, 5-metilcitidina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 7-deazaguanosina, 5-metilaminometiluracilo, 5- metoxiaminometil-2-tiouracilo. beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N-6- isopenteniladenosina, acido uracil-5-oxiacetico (v), vibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitidina, 5-metil-2- tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido uracil-5-oxiacetico, 3-(3-amino-3-N-2-
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Ejemplos adicionales de bases y nucleotidos no naturales son las 5-propinil pirimidinas, descritas en la patente de EE. UU. n.° 5.484.908; y otras pirimidinas modificadas descritas en la patente de EE. UU. n.° 5.645.985 y 5.830.653. los [2.2.1] biciclonucleotidos se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.639.059. Otras purinas y pirimidinas modificadas utilizadas en cebadores para aumentar la especificidad de una reaccion de amplificacion se describieron en la patente de EE. UU. n.° 6.011.611.
Un termino "extension de cebador" se refiere a la capacidad de un biocatalizador que incorpora nucleotidos, tal como una polimerasa, de anadir uno o mas nucleotidos al extremo 3' de un cebador.
"Condiciones adecuadas para la extension del cebador" se refiere a las condiciones en las que los cebadores que se hibridan con un acido nucleico molde son extendidos por un biocatalizador que incorpora nucleotidos, tal como una polimerasa. Por ejemplo, dichas condiciones ocurren durante el paso de apareamiento y extension de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Los expertos en la tecnica apreciaran que dichas condiciones pueden variar y que generalmente estan influenciadas por la concentracion ionica de la solucion, la temperatura y la secuencia del acido nucleico molde particular y de los cebadores. Varias condiciones de PCR se describen en PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, Calif.) en el capitulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., 1990 Academic Press, N.Y.).
Un acido nucleico es "complementario" en relacion con otro acido nucleico cuando al menos una subsecuencia del acido nucleico puede combinarse en una asociacion antiparalela con al menos una subsecuencia del otro acido nucleico para formar un duplex. En el contexto de la presente invencion, en un oligonucleotido que es "totalmente complementario" respecto a una secuencia de acido nucleico particular, cada base del oligonucleotido es complementaria a la base correspondiente en la secuencia particular. Un oligonucleotido es "parcialmente complementario" respecto a una secuencia de acido nucleico particular cuando una o mas de las bases en el oligonucleotido no son complementarias ("emparejadas erroneamente") con las bases correspondientes en el otro acido nucleico. Las bases modificadas se consideran generalmente complementarias a la misma base que sus precursores no modificados. Por ejemplo, la 7-deazaguanina se considera complementaria a la citosina y se considera que la N6-bencil-adenina es complementaria a la timina.
Un "acido nucleico cebador" o "cebador" es un oligonucleotido que puede hibridarse con un acido nucleico diana (a veces llamado acido nucleico molde) y permitir la extension o elongacion de la cadena por un biocatalizador que incorpora nucleotidos, tal como una polimerasa, bajo condiciones de reaccion apropiadas. Un acido nucleico cebador es tipicamente un oligonucleotido natural o sintetico, que varia de aproximadamente 6 hasta aproximadamente 100 nucleotidos de longitud, aunque la mayoria de los cebadores tienen una longitud entre 15 y 35 nucleotidos. Los acidos nucleicos cebadores cortos generalmente requieren temperaturas mas bajas para formar complejos hibridos suficientemente estables con los acidos nucleicos molde. Un cebador que es al menos parcialmente complementario al acido nucleico molde es tipicamente suficiente para que se produzca la extension. El diseno de cebadores adecuados para la amplificacion de una secuencia diana dada es bien conocido en la tecnica y se describe en la bibliografia citada en el presente documento. Un cebador se puede marcar, si se desea, incorporando una marca detectable mediante tecnicas espectroscopicas, fotoquimicas, bioquimicas, inmunoquimicas, quimicas u otras tecnicas. Por ejemplo, los marcadores utiles incluyen radioisotopos, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (usadas comunmente en ensayos ELISA), haptenos y proteinas para los que estan disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchos de estos y otros marcadores se describen en el presente documento o son conocidos en la tecnica.
Tal como se utiliza en el presente documento, el termino "sonda" se refiere a un oligonucleotido (u otra secuencia de acido nucleico) que, en condiciones adecuadas, puede formar una estructura duplex con una region de un acido nucleico diana, debido a una complementariedad parcial o completa con al menos una subsecuencia en el acido nucleico diana. Como se discute en el presente documento, la sonda esta tipicamente marcada para permitir la deteccion del acido nucleico diana. El extremo 3' de la sonda esta tipicamente disenado para impedir la extension de la sonda por un biocatalizador que incorpora nucleotidos. Esto puede conseguirse utilizando bases no complementarias o anadiendo un resto quimico, tal como biotina o un grupo fosfato, al grupo 3'- hidroxilo del nucleotido 3' - terminal. Estos restos quimicos en el extremo 3' pueden servir con un doble proposito actuando tambien como un marcador para la subsiguiente deteccion o captura del acido nucleico con el que la sonda ha hibridado. La inhibicion de la extension tambien puede conseguirse eliminando el 3'-OH o utilizando un nucleotido que carezca de un 3'-OH tal como un didesoxinucleotido, o anadiendo un grupo voluminoso que bloquee la extension por impedimento esterico. Como se discute mas adelante en el presente documento, los oligonucleotidos bloqueadores de la invencion pueden funcionar opcionalmente como sondas.
El termino "actividad nucleasa 5' a 3' " o "actividad nucleasa 5'-3' " se refiere a una actividad de una polimerasa de acido nucleico, tipicamente asociada a la sintesis de las hebras de acido nucleico, por la que los nucleotidos se eliminan del extremo 5' de la hebra de acido nucleico; por ejemplo, la ADN polimerasa I aislada de E. coli tiene esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no la tiene.
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Los terminos "polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad 5'-3' nucleasa" o "enzima deficiente en actividad nucleasa 5'-3' ", o para simplificar, "enzima deficiente en actividad nucleasa" se refieren a una polimerasa que tiene un 50 % o menos de la actividad 5'-3' que la Taq ADN polimerasa. Los procedimientos de medicion de la actividad nucleasa 5'-3' y las condiciones para la medicion se han descrito en la patente de EE. UU. n.° 5.466.591. Los ejemplos de polimerasas que carecen de la actividad nucleasa 5'-3' incluyen el fragmento Stoffel de la Taq ADN polimerasa (patente de EE. UU. n.° 5.466.591), mutantes de ADN polimerasa de Thermus africanus (patente de EE. UU. n.° 5.968.799), mutantes de ADN polimerasa de Thermotoga maritima patentes de EE. UU. n.° 5.624.833 y 5.420.029), mutantes de Thermus species sps17 y ADN polimerasas Z05 de Thermus species (patentes de EE. UU. n.° 5.466.591 y 5.405.774). Las enzimas deficientes en actividad nucleasa 5'-3' tambien pueden ser quimeras, es decir, proteinas quimericas, compuestas por dominios derivados de mas de una especie y que tienen mutaciones que eliminan la actividad nucleasa 5 '- 3' (patentes de EE. UU. n.° 5.795.762 y 6.228.628).
Ejemplos de ADN polimerasas termoestables incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05 (vease, por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 5.674.738), Thermus aquatic, Thermus flavum, Thermus filiformis, Thermus sp. Sps17, Deinococcus radiopure, familia B / clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherichia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus. Las secuencias de aminoacidos y acidos nucleicos completas para numerosas ADN polimerasas termoestables estan disponibles en las bases de datos publicas.
Como se usa en el presente documento, el termino "Tm" se refiere a la «temperatura de fusion». La temperatura de fusion es la temperatura a la que la mitad de una poblacion de moleculas de acido nucleico bicatenario (es decir, duplex de acido nucleico que son completamente o parcialmente complementarios), se disocia en hebras individuales. La prediccion de una Tm de un polinucleotido duplex tiene en cuenta la secuencia de bases, asi como otros factores, incluyendo caracteristicas estructurales y de secuencia, el grado de complementariedad, la naturaleza de los enlaces oligomericos y la concentracion ionica de la solucion. Los procedimientos para predecir y determinar experimentalmente la Tf son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la Tm se determina tradicionalmente mediante un analisis de la curva de fusion, en el que una molecula de acido nucleico duplex se calienta gradualmente y se controla el estado de asociacion/disociacion del duplex midiendo un cambio en un parametro detectable que se correlaciona con la fusion del duplex. El cambio en el parametro se representa en funcion del cambio de temperatura. La Tm se determina a partir de esta curva de fusion.
Un termino "inicio en caliente", en el contexto de una reaccion de amplificacion de acido nucleico, es un protocolo en el que al menos un reactivo critico se retiene de la mezcla de reaccion (o, si esta presente en la mezcla de reaccion, el reactivo permanece inactivo) hasta que la temperatura se eleva suficientemente para proporcionar la especificidad de hibridacion necesaria del cebador o cebadores. Una "enzima de inicio en caliente" es una enzima, tipicamente una polimerasa de acido nucleico, capaz de actuar como reactivo "retenido" o inactivo en un protocolo de inicio en caliente.
La presente invencion es una mejora de la amplificacion selectiva de acidos nucleicos, que utiliza la supresion especifica de alelo de la amplificacion de las variantes no deseadas de la secuencia diana. En la figura 1 se muestra un diagrama esquematico del procedimiento de la presente invencion. El diagrama muestra una diana de acido nucleico bicatenario y un oligonucleotido bloqueador, capaz de aparear con la diana hacia el extremo 3' de uno de los cebadores (flechas). El extremo 3' del cebador situado hacia el extremo 5' del bloqueador se modifica quimicamente. F representa un resto indicador fluorescente y Q representa un extintor de fluorescencia, conjugado con el oligonucleotido bloqueador.
La mejora de la presente invencion se basa en el descubrimiento de que la proximidad relativa del cebador y el oligonucleotido bloqueador, asi como ciertas modificaciones quimicas del cebador y la polimerasa, mejoran en gran medida la amplificacion selectiva.
El procedimiento general de supresion de la amplificacion de las variantes no deseadas de la secuencia diana se describe en la publicacion de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2009/0053720, presentada el 5 de agosto de 2008.
El exito de la supresion especifica de alelo de la amplificacion por el oligonucleotido bloqueador depende de la estabilidad del hibrido entre el oligonucleotido bloqueador y la diana. Cuando el hibrido con el bloqueador es mas estable (como en el caso de las secuencias indeseables), la amplificacion es suprimida por el bloqueador. Cuando el hibrido con el bloqueador es menos estable (como en el caso de la secuencia que se desea amplificar), tiene lugar la amplificacion. Una forma tradicional de aumentar la estabilidad de un hibrido de acido nucleico es aumentar la longitud de los acidos nucleicos que se hibridan. Sin embargo, el aumento de la longitud del oligonucleotido bloqueador perjudicara la discriminacion. La amplificacion de todas las variantes de la secuencia diana se suprimira. Por lo tanto, para cualquier secuencia diana dada, la capacidad para optimizar el oligonucleotido bloqueador es limitada.
Como se describe en la publicacion de solicitud de EE. UU. n.° 2009/0053720, el oligonucleotido bloqueador esta tipicamente disenado para hibridarse en cualquier lugar entre los dos oligonucleotidos cebadores. El bloqueador o
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bloqueadores pueden hibridar con una o ambas cadenas del acido nucleico diana. El unico requisito conocido era que el bloqueador debfa hibridar hacia el extremo 3' y con la misma cadena que el cebador cuya extension se suprima. Sin embargo, en el contexto de la presente invencion, se descubrio que la distancia entre el extremo 3' del cebador y el extremo 5' del oligonucleotido bloqueador afecta a la eficacia del bloqueo. Generalmente, la distancia optima entre los extremos respectivos del cebador y del bloqueador esta entre 0 y 60 nucleotidos. Para cada secuencia diana particular, la distancia optima dentro de ese intervalo puede determinarse empfricamente, utilizando la directriz proporcionada en el presente documento.
De acuerdo con la presente invencion, el extremo 3' del cebador, situado hacia el extremo 5' del oligonucleotido bloqueador y que se hibrida con la misma hebra, se modifica qufmicamente para mejorar el grado de bloqueo. Tradicionalmente, las modificaciones qufmicas se encuentran en cebadores especfficos de alelos, es decir, cebadores que coinciden con una variante de secuencia deseada pero que tienen emparejamientos erroneos con las variantes de secuencia no deseadas. Los ejemplos de modificaciones qufmicas que afectan a la especificidad de los cebadores de amplificacion se describen en la patente de EE. UU. n.° 6.011.6l 1. Estas modificaciones incluyen uniones covalentes en los grupos amino exocfclicos de ciertas bases nitrogenadas. Las modificaciones, que se producen en uno o mas nucleotidos situados dentro de aproximadamente cinco nucleotidos 3' - terminales del cebador, se sabe que generalmente aumentan la especificidad de la amplificacion. Segun la tecnica anterior, la modificacion qufmica del cebador no es necesaria cuando el cebador es igualmente complementario a las variantes de secuencia deseadas y no deseadas.
Sorprendentemente, los autores de la presente invencion encontraron que la modificacion qufmica del cebador desempena un papel en el exito de la supresion especffica de alelo de la amplificacion por el oligonucleotido bloqueador. El efecto es especialmente sorprendente porque los propios cebadores no son especfficos de los alelos como requerirfa la tecnica anterior. Los cebadores son igualmente complementarios tanto para las variantes de secuencia deseadas como para las no deseadas.
En algunos modos de realizacion, la presente invencion es un ensayo de amplificacion selectiva con supresion especffica de alelo de la amplificacion de la variante de secuencia no deseada, que se realiza en presencia de una pequena cantidad de la variante de secuencia deseada y un exceso molar de la variante de secuencia no deseada. En algunos modos de realizacion, la proporcion de la variante de secuencia deseada frente a la de la secuencia no deseada es 1:1, 1:20, 1: 100, 1: 1000 o mas alta.
El oligonucleotido bloqueador de la presente invencion esta disenado para aparearse e hibridarse con la porcion de la secuencia diana localizada entre los sitios de union del cebador. El bloqueador o los bloqueadores pueden disenarse para hibridar con una o ambas cadenas del acido nucleico diana. El oligonucleotido bloqueador esta disenado para formar un hfbrido con una temperatura de fusion mas alta con las versiones no deseadas de la secuencia diana que con la version deseada. El diseno del oligonucleotido bloqueador para la supresion de la amplificacion de las variantes de secuencia no deseadas se ha descrito en la solicitud de patente de EE. UU. n.° 2009/0053720, presentada el 5 de agosto de 2008.
Generalmente, el bloqueador esta disenado para incorporar uno o mas emparejamientos erroneos con la variante deseada de la secuencia diana. Con las otras variantes de la secuencia diana, el bloqueador tiene menos emparejamientos erroneos o ninguno en absoluto. Debido a que el grado de complementariedad afecta a la temperatura de fusion del hfbrido de acido nucleico, la Tm del hfbrido formado entre el oligonucleotido bloqueador y la variante deseada de la secuencia diana serfa preferentemente la mas baja entre todos los hfbridos formados por el oligonucleotido bloqueador. Ademas del grado de complementariedad, la temperatura de fusion del oligonucleotido tambien se ve afectada por la presencia y numero de bases no convencionales, que pueden ser "estabilizantes" (por ejemplo 5-metilcitosina y propiniluridina) o "desestabilizantes" (por ejemplo, N 6- benciladenosina) como se conoce en la tecnica. Opcionalmente, dichas bases pueden incorporarse en el oligonucleotido bloqueador para modular adicionalmente su temperatura de fusion.
Generalmente, la tecnica anterior ensena que el oligonucleotido bloqueador debe estar situado entre los dos cebadores de amplificacion e hibridarse hacia el extremo 3' con la misma cadena que el cebador cuya extension ha de suprimirse. En el ambito de la presente invencion, se descubrio que la posicion relativa del bloqueador y los oligonucleotidos cebadores afecta en gran medida a la capacidad del bloqueador de suprimir la amplificacion. Por ejemplo, el bloqueador puede estar situado entre 0 y 60, por ejemplo 0, 1, 2, 3 o mas nucleotidos hacia el extremo 3' del extremo 3' de uno de los cebadores, e hibrida con la misma cadena que el cebador hacia el extremo 5'.
El oligonucleotido bloqueador puede disenarse "manualmente" o usando cualquiera de los programas de software de diseno de oligos conocidos por los profesionales de la tecnica, incluyendo Visual OMP (DNA Software, Inc., Ann Arbor, Mich.), Oligo 6 (Stratagene, La Jolla, Calif.), Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, Mich.) and DNAStar (DNAStar, Inc., Madison, Wis.). El objetivo del proceso de diseno es crear un oligonucleotido bloqueador con una estabilidad termodinamica diferente entre los hfbridos de las distintas variantes de la secuencia diana y el bloqueador bajo las temperaturas y condiciones de un ensayo de amplificacion particular.
En algunos modos de realizacion, el oligonucleotido bloqueador tiene una doble funcion, como sonda para la
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deteccion de la amplificacion de la secuencia diana. Para usarse como sonda, el oligonucleotido bloqueador puede marcarse con cualquier tipo de marcador detectable conocido en la tecnica. Por ejemplo, el marcador puede ser fluorescente, quimioluminiscente, radiactivo, enzimatico, etc. Dicho oligonucleotido sonda-bloqueador se puede usar en cualquier numero de procedimientos de deteccion, como la deteccion de amplificacion ("curva de crecimiento") asi como un ensayo de fusion posterior a la amplificicacion.
En una reaccion de amplificacion de acuerdo con la presente invencion, se pueden usar uno o mas oligonucleotidos bloqueadores. Los oligonucleotidos bloqueadores pueden disenarse para hibridarse con una cadena de acido nucleico que se desea amplificar, o pueden disenarse bloqueadores independientes para hibridar con ambas cadenas. En el caso de que se disene mas de un oligonucleotido para hibridarse con la misma cadena de acido nucleico, los oligonucleotidos pueden usarse en la misma o diferentes rondas de la reaccion de amplificacion. Por ejemplo, cuando la segunda ronda de amplificacion implica un cebador ubicado internamente respecto al cebador usado en la primera ronda, se puede usar un bloqueador ubicado internamente a dicho cebador de segunda ronda en la segunda o subsiguientes rondas de amplificacion. Todos o al menos uno de los oligonucleotidos bloqueadores debe disenarse de acuerdo con las directrices de la presente invencion.
Los cebadores de amplificacion de la presente invencion son oligonucleotidos al menos parcialmente complementarios con al menos una de las variantes existentes de la secuencia diana. La longitud del cebador puede oscilar entre 6 y 100 nucleotidos, aunque la mayoria de los cebadores varian tipicamente entre 15 y 35 nucleotidos. Se han descrito los procedimientos de optimizacion de los cebadores para la amplificacion de acidos nucleicos; por ejemplo en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990. Tipicamente, los cebadores son oligonucleotidos sinteticos, compuestos por nucleotidos A, C, G y T. Sin embargo, tambien pueden usarse nucleotidos de bases no convencionales, que no se encuentran normalmente en los acidos nucleicos. Por ejemplo, se sabe que ciertas bases modificadas aumentan la especificidad de la amplificacion, vease la patente de EE. UU.. n.° 6.001.011. Estas modificaciones incluyen grupos alquilo, arilo o alquilarilo unidos covalentemente a un grupo amino exociclico de la nucleobase. El uso tradicional de estas bases modificadas en cebadores de amplificacion es reducir la amplificacion no especifica. Sin embargo, en un aspecto de la presente invencion, se encontro que los nucleotidos con bases modificadas covalentemente en los grupos amino exociclicos tambien aumentan el grado de supresion de la amplificacion usando el oligonucleotido bloqueador.
Diversos biocatalizadores que incorporan nucleotidos, como ADN polimerasas, son conocidos en la tecnica. En la presente invencion se puede usar cualquier polimerasa termoestable que carezca de la actividad nucleasa 5 '- 3'. A veces es deseable usar una enzima sin la actividad correctora (3'-5'-exonucleasa).
Un ejemplo de una enzima adecuada es la polimerasa AZ05. A veces puede ser deseable tener una enzima con capacidad de" inicio en caliente", tal como las enzimas modificadas de forma reversible descritas en las patentes de EE. UU. n.° 5.677.152 y 5.773.528. Un ejemplo de una enzima de inicio en caliente es la polimerasa AZ05-Gold.
La deteccion de los productos de amplificacion de acuerdo con la presente invencion puede realizarse mediante cualquier procedimiento conocido en la tecnica. Estos procedimientos de deteccion incluyen el uso de cebadores y sondas marcados, asi como diversos colorantes de union a acidos nucleicos. Los medios de deteccion pueden ser especificos de una variante de la secuencia diana, o pueden ser genericos para todas las variantes de la secuencia diana o incluso para todos los ADN bicatenarios. Pueden usarse los procedimientos de deteccion inespecificos cuando la amplificacion de las variantes no deseadas de la diana sea minima y se espera que caiga por debajo del limite de deteccion del procedimiento.
Los productos de amplificacion pueden detectarse despues de haberse completado la amplificacion, por ejemplo, mediante electroforesis en gel de los productos no marcados y tincion del gel con un colorante de union a acido nucleico. De forma alternativa, los productos de amplificacion pueden llevar un marcador radioactivo o quimico, ya sea en virtud de incorporacion durante la sintesis o en virtud de tener un cebador marcado. Despues de la electroforesis o durante la misma, los productos de amplificacion marcados pueden detectarse con herramientas radiologicas o quimicas adecuadas conocidas en la tecnica. Despues de la electroforesis, el producto tambien puede detectarse con una sonda especifica de la diana marcada por cualquiera de los procedimientos conocidos en la tecnica. La sonda marcada tambien se puede aplicar a la diana sin electroforesis, es decir, en un ensayo de "transferencia puntiforme" o similar.
En otros modos de realizacion, la presencia del producto de amplificacion puede detectarse en un ensayo homogeneo, es decir, un ensayo en el que el producto naciente se detecta durante los ciclos de amplificacion, y no se requiere manipulacion posterior a la amplificacion. Un ensayo de amplificacion homogeneo usando una sonda nucleasa se ha descrito, por ejemplo, en la patente de eE. UU. n.° 5.210.015. El ensayo de amplificacion homogeneo usando colorantes intercalantes de acidos nucleicos se ha descrito, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.871.908 y 6.569.627. El ensayo homogeneo tambien puede emplear una sonda fluorescente o sondas marcadas con dos fluoroforos que interactuan. Los ejemplos de dichas sondas incluyen sondas tipo "baliza molecular" (Tyagi et al., (1996) Nat. Biotechnol., 14: 303-308) o sondas nucleasa marcadas fluorescentemente (Livak et al., (1995) PCR Meth. Appi, 4:357-362).
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Aun otro modo de realizacion de la presente invencion es un procedimiento en el que los productos de amplificacion se detectan e identifican determinando sus temperaturas de fusion unicas (Tm). En una variacion del ensayo de fusion, se controla la fusion de un amplicon entero usando un compuesto fluorescente que se une especificamente a acidos nucleicos duplex. Especificamente, la medicion del cambio de fluorescencia dependiente de la temperatura de los colorantes de intercalacion duplex se ha descrito en la patente de EE. UU.. n.° 5.871.908. La disminucion de la fluorescencia refleja la fusion del amplicon, permitiendo determinar la Tm del amplicon.
En otro modo de realizacion de la presente invencion, el hibrido se forma entre el ADN diana y una o mas sondas marcadas fluorescentemente. Tipicamente, las sondas estan marcadas con al menos dos restos fluoroforos, formando un par FRET. En algunos modos de realizacion, uno de los restos que forman el par FRET es un extintor no fluorescente. Los restos que forman el par FRET pueden conjugarse con las mismas moleculas de sonda o con moleculas de sonda independientes. El cambio de temperatura que da lugar a la fusion o a la formacion del hibrido molde-sonda se acompana de un cambio medible en la fluorescencia, debido al cambio en la distancia fisica entre los miembros del par FRET. La medicion del cambio dependiente de la temperatura en la fluorescencia de un colorante o colorantes conjugados con un par de sondas o con una sonda unica se ha descrito en la patente de EE. UU.. n.° 6.174.670. La identificacion de un genotipo particular por su unico Tm con un par de sondas marcadas se ha descrito en De Silva et al., (1998) “Rapid genotyping and quantification on the LightCycler™ with hybridization probes,” Biochemica, 2: 12-15.
La presente invencion implica una PCR asimetrica. En una mezcla de PCR asimetrica, uno de los cebadores de amplificacion esta presente en mayor cantidad que el otro cebador. Los cebadores se denominan "cebador en exceso" y "cebador limitante", respectivamente. Las cadenas de acido nucleico resultantes de la extension de estos cebadores se denominan "cadena en exceso" y "cadena limitante", respectivamente. La proporcion entre el cebador en exceso y el cebador limitante puede manipularse selectivamente y estar entre 200:1 y 2:1, pero tipicamente entre aproximadamente 9:1 y 5:1. Debido a un exceso del cebador, la hebra en exceso se acumula de forma lineal en forma de hebra monocatenaria. Este exceso de cadena simple es util para ciertos procedimientos de analisis post- PCR.
En algunos modos de realizacion, la presente invencion implica una PCR asimetrica, seguida de una caracterizacion post-PCR de los amplicones a traves del analisis de la temperatura de fusion. La PCR asimetrica seguida de un analisis de la Tm se ha descrito en la publicacion de solicitud de patente de EE. UU.. n.° 2007/0072211. En una reaccion tipica, la PCR asimetrica se lleva a cabo en presencia de una o mas sondas marcadas. La fusion y apareamiento de las sondas se asocia con un cambio medible en la fluorescencia, que es reflejo de la formacion o fusion del duplex de acido nucleico. Tipicamente, en el contexto de la PCR asimetrica, las sondas de fusion estan disenadas para hibridarse con la "cadena en exceso", es decir, la hebra de amplicon que resulta de la extension del cebador en exceso, y se acumula en una forma monocatenaria.
El diseno de sondas de hibridacion es conocido en la tecnica. Ya sea que la sonda sirva como una sonda nucleasa, una sola sonda de hibridacion o un miembro de un par de sondas de hibridacion, el diseno del oligonucleotido sonda se guia por los mismos principios, conocidos en la tecnica y descritos en el presente documento y aplicados manualmente o con la ayuda de un software.
En algunos modos de realizacion de la presente invencion, el oligonucleotido bloqueador, uniendose adyacentemente a uno de los cebadores con el fin de suprimir la amplificacion de la variante no deseada de la secuencia, tambien puede servir como sonda de hibridacion o una sonda de fusion o ambas. Un experto en la tecnica reconocera inmediatamente los criterios de diseno aplicables a dichos oligonucleotidos de doble funcion. Especificamente, el oligonucleotido debe tener una temperatura de fusion hibrida diferente con las diferentes variantes de la secuencia diana, pero cada una de las temperaturas de fusion debe caer dentro del intervalo detectable en un sistema particular. En la mayoria de los casos, esto implicaria temperaturas de fusion que son sensiblemente distintas, pero relativamente proximas. En otros modos de realizacion de la invencion, la sonda o sondas son oligonucleotidos independientes del oligonucleotido bloqueador.
Los oligonucleotidos sonda se pueden marcar mediante la incorporacion de restos detectables por diversos procedimientos, incluyendo radiologicos, espectroscopicos, fotoquimicos, bioquimicos, inmunoquimicos o quimicos. Para la deteccion basada en fluorescencia, los marcadores pueden incluir colorantes, por ejemplo de la familia de la fluoresceina (FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE), de la familia de la rodamina (Texas Red, ROX, R110, R6G y TAMRA), de la familia de la cianina Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7), de la familia de las oxazinas, de la familia de la tiazina, de la familia de la escargotina y otras familias de colorantes fluorescentes adecuadas para el marcaje y la deteccion de acidos nucleicos. Ademas, un colorante fluorescente puede emparejarse con un resto extintor no fluorescente, ejemplificado por Black Hole Quenchers™ (Biosearch Tech., Novato, CA), Eclipse Dark Quenchers™ (Epoch Biosciences, Bothell, Wash.) e Iowa Black (Integrated DNA Tech., Coralville, Iowa).
En algunos modos de realizacion, la presente invencion implica la deteccion de mutaciones relacionadas con la enfermedad, incluyendo mutaciones relacionadas con el cancer en presencia de las secuencias de acido nucleico natural, es decir, no mutadas. Se sabe generalmente que durante la progresion del cancer, las celulas tumorales acumulan mutaciones que confieren ventajas selectivas a las celulas mutantes, vease Downward, J. (2003)
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Targeting RAS signaling pathways in cancer therapy (2005), Nature Rev. Cancer, 3:11 -22. A menudo, las mutaciones confieren resistencia a agentes antitumorales utilizados en terapia, vease Pao et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib and or erlotinib, PLoS Medicine, 2(1), e17. La deteccion de dichas mutaciones evitara a los pacientes el problema y el riesgo innecesario asociado con tomar un medicamento ineficaz con efectos secundarios desagradables. Mas ampliamente, la deteccion de las mutaciones relacionadas con el cancer es informativo para el pronostico de la enfermedad existente, asi como para el diagnostico precoz del cancer.
En un modo de realizacion, la presente invencion puede aplicarse a la deteccion de mutaciones somaticas que surgen en una subpoblacion de celulas. Para amplificar y detectar con exito la secuencia de acido nucleico mutante, los cebadores de amplificacion pueden disenarse para hibridarse con las secuencias que flanquean el sitio de mutacion sospechado. Para suprimir la amplificacion de la secuencia natural, se puede disenar un oligonucleotido bloqueador para que sea perfectamente (o casi perfectamente) complementario a la secuencia natural pero que tenga uno o mas emparejamientos erroneos con la secuencia mutante. El diseno del oligonucleotido bloqueador debe asegurar que forma un hibrido estable con la secuencia natural pero que forma un hibrido inestable (o significativamente menos estable) con la secuencia mutante bajo las condiciones en las que se realizara el apareamiento y la extension de los cebadores especificos. Por ejemplo, utilizando las herramientas disponibles de diseno de oligonucleotidos, se podria disenar un oligonucleotido bloqueador, de tal manera que bajo las condiciones tipicas de una reaccion de amplificacion, la temperatura de fusion del hibrido formado por el bloqueador y la secuencia natural fuera mas alta a la temperatura de apareamiento utilizada durante el termociclado. Al mismo tiempo, la temperatura de fusion del hibrido formado por el bloqueador y la secuencia mutante seria menor que la temperatura de apareamiento utilizada durante el termociclado.
Los cebadores oligonucleotidicos, de acuerdo con la presente invencion, pueden disenarse para flanquear cualquier numero de sitios de mutacion sospechados de interes para una enfermedad o condicion particular, como por ejemplo, mutaciones enumeradas en Downward, J. (2003), supra. La muestra de acido nucleico, de acuerdo con la presente invencion, se puede obtener a partir de tejidos de pacientes, frescos o conservados, y tejidos de control no enfermos, incluyendo tejidos embebidos en parafina fijados en formalina (FFPET).
A modo de ilustracion solamente y no para limitar el alcance de la invencion, el procedimiento se aplico para detectar mutaciones en el gen KRAS, conocido por estar asociado con muchos tumores solidos humanos. Se han encontrado mutaciones KRAS en el 20-30 % de los canceres pulmonares no microciticos, en el 30-40 % de los canceres colorrectales y hasta en el 90 % de los canceres de pancreas, Yeang et al., (2008) Combinatorial pattern of somatic gene mutations in cancer, FASEB J, 22:2605-2622. Las mutaciones KRAS confieren resistencia a los farmacos dirigidos contra el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR). La resistencia parece aplicarse a los farmacos dirigidos contra el EGFR independientemente del mecanismo de accion: tanto los inhibidores de la tirosina cinasa como los anticuerpos anti-EGFR pierden su eficacia frente a las celulas mutantes KRAS.
El gen KRAS es un objetivo especialmente adecuado para un ensayo de deteccion de mutaciones: aproximadamente el 99 % de todas las mutaciones ocurren en solo tres codones: codon 12 (88 %), codon 13 (10 %) y codon 61 (1-3 %). Dicho agrupamiento de mutaciones permite el diseno de un pequeno numero de cebadores o sondas especificas de alelos que cubririan todo el espectro de mutaciones clinicamente relevantes.
En otro aspecto, la invencion proporciona una mezcla de reaccion para la amplificacion selectiva de acidos nucleicos con la supresion especifica de alelo de la amplificacion de las variantes de secuencia no deseadas. La mezcla de reaccion comprende un primer y un segundo oligonucleotidos, capaces de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en al que al menos una fraccion del segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3' ; en la que dicha base modificada se modifica en el grupo amino exociclico; un tercer oligonucleotido, capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana y disenado para hibridar entre 0 y 60 nucleotidos hacia el extremo 3' de dicho segundo oligonucleotido; una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad 5 '- 3' nucleasa y que tiene capacidad de inicio en caliente; y opcionalmente, un acido nucleico diana que se sabe que existe en mas de una variante de secuencia. En algunos modos de realizacion, la mezcla de reaccion comprende ademas los reactivos y soluciones generalmente necesarios para la amplificacion, y opcionalmente la deteccion, de acidos nucleicos, incluyendo precursores de acidos nucleicos, es decir, trifosfatos de nucleosidos, e iones organicos e inorganicos, adecuados para el soporte de la actividad de la polimerasa, y opcionalmente un marcador detectable. De acuerdo con la presente invencion, las cantidades del primer y segundo oligonucleotidos en la mezcla son desiguales, de manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso. En algunos modos de realizacion, dicho tercer oligonucleotido esta marcado. En algunos modos de realizacion de la invencion, el acido nucleico diana comprende toda o parte de la secuencia del gen KRAS. En algunos modos de realizacion, la secuencia diana incluye uno o mas de los codones KRAS 12, 13 y 61.
En otro aspecto, la invencion proporciona kits para llevar a cabo la amplificacion selectiva de acidos nucleicos con la supresion especifica de alelo de la amplificacion de las variantes de secuencia no deseadas. El kit generalmente incluye componentes especificos del ensayo, asi como componentes generalmente requeridos para realizar ensayos de amplificacion de acidos nucleicos. Como los componentes especificos del ensayo, el kit de la presente invencion
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incluye tfpicamente un primer y un segundo oligonucleotidos, capaces de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fraccion del segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3' ; En el que dicha base modificada se modifica en el grupo amino exociclico; un tercer oligonucleotido, capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana y disenado para hibridar entre 0 y 60 nucleotidos hacia el extremo 3' de dicho segundo oligonucleotido; una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de la actividad 5 '- 3' nucleasa y que tiene capacidad de inicio en caliente; y opcionalmente, una secuencia de acido nucleico de control que comprende una cantidad de al menos una version de la secuencia diana. De acuerdo con la presente invencion, las cantidades del primer y segundo oligonucleotidos contenidos en el kit son desiguales, de manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso. En algunos modos de realizacion, puede incluirse mas de una version de la secuencia de acidos nucleicos de control. En algunos modos de realizacion, dicho tercer oligonucleotido esta marcado. Como componentes generalmente requeridos para la amplificacion, y opcionalmente la deteccion, de acidos nucleicos, el kit de la presente invencion incluye tfpicamente uno o mas de precursores de acidos nucleicos tales como trifosfatos de nucleosidos (trifosfatos de desoxirribonucleosidos o trifosfatos de ribonucleosidos), opcionalmente, una pirofosfatasa, para minimizar la pirofosforolisis de acidos nucleicos, una uracilo N-glicosilasa (UNG) para la proteccion frente a la contaminacion por arrastre de las reacciones de amplificacion, reactivos y tampones previamente preparados necesarios para la reaccion de amplificacion, y opcionalmente la deteccion, y un conjunto de instrucciones para llevar a cabo la amplificacion especifica de alelo de la presente invencion.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes utilizan un fragmento del gen KRAS, exon 2 (SEQ ID NO: 1), figura 10, como la secuencia diana. Las secuencias mutantes contienen varias mutaciones de aminoacido tanto en el codon 12 como en el codon 13 del exon 2. Los codones 12 y 13 son las bases subrayadas en la SEQ ID NO: 1 que se muestra en la figura 10. La sonda (SEQ ID NO: 5) es totalmente complementaria con la secuencia natural. Las secuencias mutantes tienen uno o mas emparejamientos erroneos con la sonda. En los ejemplos siguientes, la misma sonda (SEQ. ID NO: 5) se utiliza como sonda de deteccion de amplificacion y como sonda de fusion. Ademas, la sonda sirve como supresor de la amplificacion de la secuencia natural. Las secuencias del exon 3 se coamplificaron en la misma reaccion con las secuencias del exon 2 de KRAS utilizando el cebador hacia el extremo 5' SEQ ID NO. 6, cebadores hacia el extremo 3' SEQ ID NO: 7 y la sonda de deteccion SEQ ID NO. 8. Por simplicidad, no se muestran los resultados de la amplificacion de las secuencias del exon 3, detectadas en un canal de longitud de onda independiente. Las secuencias de los cebadores y de la sonda se muestran en la tabla 1.
Tabla 1
Secuencias de los cebadores y de la sonda KRAS
Cebador en direccion 5' para exon 2
Secuencia (5'-3')
SEQ ID NO: 2
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT
Cebador en direccion 3’ para exon 2
Secuencia (5’-3’)
SEQ ID NO: 3
GAAUUAGEUGUAUEGUEAAGGEACTC
SEQ ID NO: 4
GAAUUAGEUGUAUEGUEAAGGEACTM
Sonda para exon 2
Secuencia (5’-3’)
SEQ ID NO: 5
FUGEEUAEIEEIEEAGEUEQp
Cebador en direccion 5’ para exon 3
Secuencia (5’-3’)
SEQ ID NO: 6
GAGAAAEEUGUEUEUEGGAUAUUCTC
Cebador en direccion 3’ para exon 3
Secuencia (5’-3’)
SEQ ID NO: 7
T CAT GT ACT GGTCCCTCATT GCAM
Sonda para exon 3
Secuencia (5’-3’)
(continuacion)
SEQ ID NO: 8
LAEUEEUCTTGACEUGEUQp
E = 5-metil dC U = 5-propinil dU
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
M = N4-bencil dC
1 = dl (desoxiinosina)
F = fluoroforo donador cx-FAM (fluoresceina)
Q = extintor BHQ-2 Black Hole™
L = fluoroforo donador cx- EX (colorante HEX)
P = 3'fosfato
Ejemplo 1
Analisis de amplificacion y fusion de una diana natural y un mutante KRAS por separado
Cada reaccion de 50 pl contenia 104 copias de la secuencia diana natural o mutante, 0,7 pM del cebador hacia el extremo 5' (exceso) del exon 2 (SEQ ID NO: 2), 0,025 pM del cebador (limitante) hacia el extremo 3' del primer exon
2 (SEQ ID NO: 3, sin la modificacion quimica) y 0,075pM del cebador hacia e extremo 3' (limitante) del segundo exon 2 (SEQ. ID NO: 4 con la modificacion quimica), 0,3 pM de la sonda de fusion del exon 2 (SEQ ID NO: 5), 0,7 pM del cebador (exceso) hacia el extremo 3' del exon (SEQ ID NO: 6), 0,1 pM del cebador hacia el extremo 3' (limitante) del exon 3 (SEQ ID NO: 7), 0,3 pM de la sonda de fusion del exon 3 (SEQ ID NO: 8), tricina 50 mM (pH 7,7), acetato de potasio 57 mM (pH 7,5), glicerol 8 %, DMSO 1 %, 200 pM de cada dATP, dCTP y dGTP, 400 pM de dUTP, dTTP 50 pM , Tween-20 0,01 %, 0,04 unidades/pl de uracil-N-glicosilasa (UNG), 0,6 unidades/pl de ADN polimerasa AZ05 GOLD y acetato de magnesio 3 mM. Se utilizo una mezcla de dos cebadores limitantes para el exon 2: % del primer cebador (SEQ ID NO: 3) con una citosina 3'-terminal no modificada, y % del segundo cebador (SEQ ID NO: 4) con una citosina 3'-terminal bencilada en N4. Esta proporcion de dos cebadores limitantes en la reaccion permitio un grado optimo de supresion del tipo natural (vease el ejemplo 2): cuando el ADN mutante estaba ausente, se amplifico el ADN natural. Sin embargo, cuando el ADN mutante tambien estaba presente, el ADN mutante se amplifico preferentemente sobre el natural (datos no mostrados).
La amplificacion y el analisis de fusion se realizaron usando el instrumento Roche LightCycler 480. Las reacciones se sometieron al siguiente perfil de temperatura: 50 °C durante 5 minutos (etapa UNG), 95 °C durante 10 minutos (activacion de la polimerasa), seguido de 50 ciclos de 95 °C durante 10 segundos y 61 °C durante 40 segundos. Los datos de fluorescencia se recogieron al final de cada etapa de 61 °C para generar las curvas de amplificacion (no mostradas). Las reacciones se sometieron a continuacion al analisis de fusion: despues del ultimo ciclo de amplificacion, la temperatura se elevo a 95 °C durante 1 segundo, se redujo a 40 °C durante 1 minuto, despues se aumento a 95 °C, mientras se media la fluorescencia para cada aumento de temperatura de 1,0°°C. Finalmente, la temperatura se redujo a 40 °C para terminar el ensayo de fusion.
Los resultados del ensayo de fusion se muestran en la figura 2. Los datos brutos ("curvas de fusion") se muestran como fluorescencia en el intervalo de longitud de onda de 450-500 nm en funcion del cambio de temperatura. Los datos derivados ("picos de fusion") se muestran como una derivada primera (dF/dT) de la fluorescencia en el mismo intervalo de temperatura. Las dianas mutantes se muestran como lineas continuas y el molde natural se muestra como una linea discontinua. En este ejemplo, la sonda de fusion (SEQ ID NO: 5) emite luz fluorescente de la longitud de onda deseada cuando esta unida al acido nucleico diana en un duplex. Con el aumento de la temperatura, se observa una disminucion de la fluorescencia cuando la sonda se disocia del duplex. En la forma disociada monocatenaria, la sonda asume una conformacion en la que el extintor (BHQ-2) apaga la fluorescencia del fluoroforo (FAM).
Los resultados de la fig. 2 muestran un perfil de fusion distinto para las secuencias mutantes (lineas continuas) y la secuencia natural (linea discontinua). Las muestras mutantes se identifican mediante un pico maximo del punto de fusion (T m) inferior al de la muestra natural. La T m inferior se debe a un menor grado de complementariedad entre la sonda y la secuencia mutante. Los picos mutantes muestran variacion en la T m porque las muestras contienen diferentes mutaciones en el codon 12 o codon 13.
Ejemplo 2
Amplificacion y deteccion especifica de alelo de mutaciones KRAS en una mezcla de muestras natural y mutantes
En este ejemplo, se realizo el analisis de amplificacion y fusion sobre una mezcla de diana natural y una diana mutante en el mismo tubo. Cada reaccion de 50 pl contenia 8.000 copias de ADN diana que comprende una mezcla de las secuencias silvestres y mutantes. La secuencia mutante comprendia 1 % o 5 % del numero total de copias en la reaccion, siendo el 99 % o 95 % restante la secuencia natural. El analisis de amplificacion y fusion se realizo usando las condiciones y el perfil de temperatura como se describe generalmente para el ejemplo 1, con la modificacion indicada para cada experimento particular. Los resultados se muestran en las figuras 3-8. Las dianas mutantes se identifican por un pico maximo de punto de fusion (Tm) mas bajo que el de las dianas natural. Las lineas continuas representan "condiciones supresoras", mientras que las lineas discontinuas representan las "condiciones de control" especificadas para cada experimento.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En la figura 3, las condiciones supresoras son: el cebador limitante es una mezcla de SEQ ID NO: 3 y 4 y la enzima tiene una capacidad de inicio en caliente (AZ05 GOLD). Las condiciones de control son: el cebador limitante es solo SEQ ID NO: 3 (sin la modificacion quimica 3'-terminal) y la enzima no tiene capacidad de inicio en caliente (AZ05). Para la enzima AZ05, el pH se ajusto a 8,3, y la etapa de activacion de la polimerasa se elimino del perfil de ciclo.
La figura 4 muestra los resultados de un experimento identico al de la figura 3, excepto que tanto las condiciones de supresion como las de control emplean el uso de la enzima de inicio en caliente AZ05 GOLD. La mezcla de SEQ ID NO: 3 y 4 para las condiciones supresoras, y SEQ ID NO: 3 (sin modificacion quimica) para las condiciones de control.
La figura 5 muestra los resultados de un experimento identico al de la figura 3, excepto que tanto las condiciones de supresion como las de control emplean el uso de la enzima de inicio en caliente AZ05 GOLD. La mezcla de SEQ ID NO: 3 y 4 para las condiciones supresoras y SEQ ID NO: 4 solo (con modificacion quimica) se utilizo para las condiciones de control. Los resultados demuestran que el uso de la combinacion de cebadores tempera la cantidad de supresion y asegura que las secuencias natural se amplifican en ausencia de las secuencias mutantes.
La figura 6 muestra los resultados de un experimento identico al de la figura 3, excepto que tanto las condiciones supresoras como las de control emplean el uso de la mezcla de SEQ NO: 3 y 4. Las condiciones supresoras usan una enzima de inicio en caliente AZ05 GOLD, mientras que las condiciones de control utilizan una enzima AZ05 sin actividad de inicio en caliente.
La figura 7 muestra los resultados de un experimento identico al de la figura 3, excepto que tanto las condiciones de supresion como las de control emplean el uso de la SEQ NO: 4 solo (con una modificacion quimica). Las condiciones supresoras usan una enzima de inicio en caliente AZ05 GOLD, mientras que las condiciones de control utilizan una enzima AZ05 sin actividad de inicio en caliente.
La figura 8 muestra los resultados de un experimento identico al de la figura 7, excepto que tanto las condiciones de supresion como las de control emplean el uso de la SEQ NO: 3 solo (sin modificacion quimica). Como en el ejemplo ilustrado en la figura 7, las condiciones supresoras usan una enzima de inicio en caliente AZ05 GOLD, mientras que las condiciones de control usan una enzima AZ05 sin actividad de inicio en caliente. En este experimento, las condiciones "supresoras" no produjeron ninguna supresion.
Los resultados demuestran que la supresion de la amplificacion natural mejora el rendimiento del amplicon mutante. Cuando la secuencia mutante constituye el 1 % de la secuencia diana total, la secuencia mutante no es detectable sin la supresion natural. A una concentracion mas alta de la secuencia mutante, el rendimiento de los amplicones mutantes tambien se mejora notablemente por la supresion natural.
Ejemplo 3
La amplificacion especifica de alelo y la deteccion de mutaciones KRAS en muestras de tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPET)
En este ejemplo, se realizaron analisis de amplificacion y fusion sobre ADN extraido de siete muestras de FFPET obtenidas comercialmente. Cada reaccion de 50 gl contenia 25 ng de ADN de FFPET, extraido de secciones de tejido de 3 x 10 gm y cuantificado en un espectrofotometro Nanodrop. Se utilizo una reaccion que contenia 5 % de la diana mutante mezclada con un 95 % de diana natural como control (linea discontinua). El analisis de amplificacion y fusion se realizo usando las condiciones y el perfil de temperatura descritos en el ejemplo 1, excepto que los cebadores 3 y la sonda del exon no estaban presentes en la mezcla de reaccion, la cantidad de polimerasa AZ05 GOLD se redujo a 0,3 unidades/gl y el acetato de magnesio se redujo a 2,5 mM. Los resultados se muestran en la figuras 9 como picos de fusion. Las dianas mutantes se identifican por un pico maximo de punto de fusion (Tm) mas bajo que el de las dianas natural. Las lineas discontinuas muestran secuencias natural mientras que las lineas continuas muestran muestras de pacientes en las que estan presentes las secuencias mutantes. Algunas muestras de pacientes contienen tanto las secuencias natural como las mutantes.
Se sabe que el ADN de FFPET esta altamente fragmentado y es dificil de amplificar y detectar. Sin embargo, los resultados de la figura 9 muestran claramente la amplificacion y deteccion exitosas del ADN mutante presente en el fondo del ADN natural de la muestra FFPET. La variacion entre las Tm de las dianas mutantes refleja diferentes mutaciones del codon 12 o 13 del gen KRAS como se verifica por secuenciacion (datos no presentados).
Aunque la invencion se ha descrito en detalle con referencia a ejemplos especificos, sera evidente para un experto en la tecnica que pueden realizarse diversas modificaciones dentro del alcance de esta invencion. Por lo tanto, el alcance de la invencion no deberia estar limitado por ninguno de los ejemplos descritos en el presente documento,
sino por las reivindicaciones presentadas a continuacion.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de amplificacion selectiva de una variante deseada de una secuencia diana, cuya secuencia diana existe en forma de mas de una variante, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    a) proporcionar una muestra que posiblemente comprende al menos una variante de la secuencia diana en una mezcla de reaccion;
    b) proporcionar un primer oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana;
    c) proporcionar un segundo oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fraccion de dicho segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3' y en el que dicha base modificada esta modificada en el grupo amino exociclico;
    d) proporcionar un tercer oligonucleotido capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana y disenado para hibridarse con la misma cadena y entre 0 y 60 nucleotidos hacia el extremo 3' de dicho segundo oligonucleotido;
    e) proporcionar una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad nucleasa 5'- 3';
    f) someter dicha mezcla de reaccion a reaccion en cadena de la polimerasa,
    en el que las cantidades de dichos oligonucleotidos primero y segundo son desiguales, de manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso y dicho tercer oligonucleotido inhibe sustancialmente la extension de dicho segundo oligonucleotido por dicha polimerasa de acido nucleico cuando dicho tercer oligonucleotido se hibrida con la variante no deseada de la secuencia diana, pero no inhibe sustancialmente la extension de dicho segundo oligonucleotido por dicha polimerasa de acido nucleico cuando dicho tercer oligonucleotido se hibrida con la variante deseada de la secuencia diana.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha base modificada en dicho segundo oligonucleotido es una N4-bencil-2'-desoxicitidina.
  3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que al menos uno de dichos oligonucleotidos primero, segundo y tercero esta marcado.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, que comprende ademas la deteccion de la secuencia de acido nucleico amplificada.
  5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el primer oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 2, el segundo oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 3 y/o el tercer oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 5.
  6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que dicha polimerasa de acido nucleico posee capacidad de inicio en caliente.
  7. 7. Una mezcla de reaccion para la amplificacion selectiva de una variante deseada de una secuencia diana, cuya secuencia diana existe en forma de mas de una variante, comprendiendo la mezcla:
    a) un primer oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana;
    b) un segundo oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fraccion de dicho segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3' y en el que dicha base modificada esta modificada en el grupo amino exociclico;
    c) un tercer oligonucleotido, capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad que con las variantes no deseadas de la secuencia diana;
    d) una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad nucleasa 5'- 3';
    en la que las cantidades de dichos oligonucleotidos primero y segundo son desiguales, de tal manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso y dicho tercer oligonucleotido es capaz de inhibir de manera detectable la amplificacion de dichas variantes no deseadas de la secuencia diana pero no la amplificacion de dicha variante deseada de la secuencia diana.
  8. 8. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7, en la que dicha base modificada en dicho segundo oligonucleotido es una N4-bencil-2'-desoxicitidina.
  9. 9. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7, en la que al menos uno de dichos oligonucleotidos primero, segundo y tercero esta marcado.
  10. 10. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7, que comprende ademas una cantidad de dicho acido nucleico diana.
  11. 11. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7, en la que el primer oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 2, el segundo oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 3 y/o el tercer oligonucleotido tiene la SEQ ID NO: 5.
  12. 12. La mezcla de reaccion de la reivindicacion 7, en la que dicha polimerasa de acido nucleico posee capacidad de
    inicio en caliente.
  13. 13. Un kit para la amplificacion selectiva de una variante deseada de una secuencia diana, cuya secuencia diana existe en forma de mas de una variante, comprendiendo el kit:
    5 a) un primer oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana;
    b) un segundo oligonucleotido, capaz de hibridarse con mas de una variante de la secuencia diana, en el que al menos una fraccion de dicho segundo oligonucleotido contiene una base modificada en uno o mas nucleotidos en o cerca del extremo 3' y en el que dicha base modificada esta modificada en el grupo amino exociclico;
    c) un tercer oligonucleotido, capaz de hibridarse con la variante deseada de la secuencia diana con menor afinidad 10 que con las variantes no deseadas de la secuencia diana;
    d) una polimerasa de acido nucleico que carece sustancialmente de actividad nucleasa 5'- 3';
    e) los reactivos y soluciones necesarios para la amplificacion de acidos nucleicos;
    en el que las cantidades de dichos oligonucleotidos primero y segundo son desiguales, de tal manera que el primer oligonucleotido esta presente en exceso y dicho tercer oligonucleotido es capaz de inhibir de manera detectable la 15 amplificacion de dichas variantes no deseadas de la secuencia diana pero no la amplificacion de dicha variante deseada de la secuencia diana.
  14. 14. El kit de la reivindicacion 13, en el que la base modificada en dicho segundo oligonucleotido es una N4-bencil-2'- desoxicitidina.
    20
  15. 15. El kit de las reivindicaciones 13 o 14, que comprende ademas uno o mas de un reactivo adecuado para minimizar la pirofosforolisis de acidos nucleicos y un reactivo adecuado para la proteccion contra la contaminacion cruzada de las reacciones de amplificacion por acidos nucleicos.
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