ES2562789T3 - Supresión de la amplificación usando un oligonucleótido y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' - Google Patents

Abstract

Un método para detectar una secuencia diana en un polinucleótido en una muestra biológica, en el que la muestra puede contener también, o alternativamente, un segundo polinucleótido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por uno a 4 nucleótido(s), comprendiendo el método, i. Poner en contacto la muestra con un oligonucleótido bloqueador bajo condiciones de la reacción de extensión del cebador para permitir la hibridación del oligonucleótido bloqueador a la segunda secuencia y la secuencia diana, si está presente ii,. Poner en contacto la muestra en presencia del oligonucleótido bloqueador hibridado con al menos un cebador y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' en condiciones tales que se produce la extensión del cebador dependiente del molde, en el que el cebador se hibrida con los polinucleótidos, si está presente, corriente arriba de la secuencia que hibrida con el oligonucleótido bloqueador; en el que el oligonucleótido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificación de la segunda secuencia por la polimerasa, en el que el oligonucleótido bloqueador no comprende un nucleótido intercalante, en el que la hibridación del oligonucleótido bloqueador a la secuencia diana no afecta significativamente la amplificación de la secuencia diana por la polimerasa que carece de manera significativa de actividad nucleasa 5'-3' y además en la que el oligonucleótido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto para la posición de uno a 4 nucleótido(s).

Description

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DESCRIPCION

Supresion de la amplificacion usando un oligonucleotido y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'

Antecedentes de la invencion

Existen numerosos ejemplos de la necesidad de una clasificacion/identificacion rapida y fiable de acidos nucleicos, especialmente en campos como la medicina. Por ejemplo, muchas enfermedades incluyendo el cancer son el resultado de mutaciones raras. La deteccion de estas mutaciones puede ayudar en las determinaciones de diagnostico y pronostico.

Ademas, pueden ser utiles metodos rapidos y fiables de genotipado en la determinacion de la composicion de alelos dentro y entre individuos. Por ejemplo, la clasificacion fiable de los alelos espedficos en un individuo puede ayudar en el consejo genetico en seres humanos y puede incluso ayudar en la planificacion de un tratamiento profilactico en casos en los que se detectan alelos espedficos. La identificacion de alelos particulares tambien es extremadamente util en la realizacion de la seleccion asistida por marcadores, por ejemplo, programas de cna en cultivos o animales, la identificacion o la genotipificacion de patogenos y otros organismos.

Breve resumen de la invencion

Esta invencion proporciona metodos para detectar una secuencia diana en un polinucleotido en una muestra biologica, en el que la muestra puede, o alternativamente, contiene tambien un segundo polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en la que la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por uno a cuatro nucleotidos(s). Los metodos comprenden,

i. Poner en contacto la muestra con un oligonucleotido bloqueador bajo condiciones de la reaccion de extension del cebador para permitir la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a la segunda secuencia y la secuencia diana, si esta presente

ii, . Poner en contacto la muestra en presencia del oligonucleotido bloqueador hibridado con al menos un cebador y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' en condiciones tales que se produce la extension del cebador dependiente del molde, en el que el cebador se hibrida con los polinucleotidos, si esta presente, corriente arriba de la secuencia que hibrida con el oligonucleotido bloqueador;

en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la segunda secuencia por la polimerasa, en el que el oligonucleotido bloqueador no comprende un nucleotido intercalante, en el que la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a la secuencia diana no afecta significativamente la amplificacion de la secuencia diana por la polimerasa que carece de manera significativa de actividad nucleasa 5'-3' y ademas en la que el oligonucleotido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto para la posicion de uno a 4 nucleotido(s).

Tambien se describe en el presente documento las mezclas de reaccion. En algunas realizaciones, las mezclas de reaccion comprenden: una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'; un polinucleotido que comprende una secuencia diana; un polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por al menos un nucleotido; y un oligonucleotido bloqueador que se hibrida a la segunda secuencia y la secuencia diana; en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la segunda secuencia por la polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificacion en ausencia del oligonucleotido bloqueador, pero la hibridacion del oligonucleotido a la secuencia diana no impide significativamente la amplificacion de la secuencia diana por la polimerasa que carece significativamente de actividad nucleasa 5'-3'.

Tambien se describen en este documento los equipos. En algunas realizaciones, los equipos comprenden una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'; un polinucleotido que comprende una secuencia diana; un polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por al menos un nucleotido; y un oligonucleotido bloqueador que hibrida con la segunda secuencia y la secuencia diana, en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la segunda secuencia por la polimerasa bajo condiciones adecuadas para la amplificacion en ausencia del oligonucleotido bloqueador, pero la hibridacion del oligonucleotido a la secuencia diana no impide significativamente la amplificacion de la secuencia diana por la polimerasa que carece significativamente de actividad nucleasa 5'-3'.

De acuerdo con los metodos de la invencion, el oligonucleotido bloqueador no comprende un nucleotido de intercalacion.

En los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la

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segunda secuencia por la polimerasa que carece significativamente de actividad nucleasa 5'-3' pero no hibrida lo suficiente como para impedir la amplificacion de una polimerasa que posee actividad nucleasa 5'-3'.

En realizaciones preferidas de la invencion, la secuencia diana esta entre 5 -100 nucleotidos de largo.

En los metodos de la invencion, as^ como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, la muestra comprende la secuencia diana y la segunda secuencia. Preferiblemente, la segunda secuencia esta presente en la muestra a una concentracion de por lo menos diez veces mayor que la concentracion de la secuencia diana. La concentracion de la secuencia diana y la segunda secuencia de los metodos, equipos o mezclas descritos en este documento esta preferiblemente en una relacion de aproximadamente 1:1.

Los polinucleotidos de acuerdo con la invencion son, en particular, DNA genomico. Preferiblemente, los polinucleotidos son RNA.

El oligonucleotido bloqueador que se usa en los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en este documento esta por lo general marcado de forma detectable. Preferiblemente, se detecta el oligonucleotido bloqueador marcado de forma detectable en tiempo real de acuerdo con la invencion, detectando de este modo la amplificacion de la secuencia diana.

En los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en este documento, puede haber una sola diferencia de nucleotidos entre la segunda secuencia y la secuencia diana y el oligonucleotido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto en la posicion de un solo nucleotido. Segun la invencion, puede haber 2-4 diferencias de nucleotidos entre la segunda secuencia y la secuencia diana y el oligonucleotido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto en las posiciones de los nucleotidos 2-4.

En los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, la diferencia entre (1) la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador y la segunda secuencia; y (2) la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador y la secuencia diana, es de al menos 5 °C segun se mide en glicerol 2,5%, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM. En realizaciones preferidas de los metodos, equipos o mezclas descritas en el presente documento, la Tm del oligonucleotido bloqueador para la segunda secuencia es no mas de 20 °C mas alta que la Tm del oligonucleotido bloqueador para la secuencia diana como se mide en glicerol 2,5%, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM.

En los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, el oligonucleotido bloqueador comprende al menos un nucleotido no natural no intercalante, en el que el nucleotido no natural aumenta la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador en comparacion a un oligonucleotido de control que es por lo demas identico al oligonucleotido bloqueador excepto que tiene un nucleotido natural en el lugar del nucleotido no natural.

Los oligonucleotidos bloqueadores de acuerdo con la invencion pueden comprender al menos una porcion no nucleotidica, en donde la porcion no nucleotfdica aumenta la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador en comparacion con un oligonucleotido de control que es por lo demas identico al oligonucleotido bloqueador excepto que carece de la fraccion no nucleotidica. Se prefiere que los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, que la porcion no nucleotfdica se una a un surco menor del DNA.

En realizaciones preferidas, el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia con una temperatura de fusion de al menos 70 °C segun se mide en glicerol 2,5%, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM.

Los metodos conocidos en la tecnica para detectar mutaciones en un polinucleotido, en el que se utilizan bloqueadores de oligonucleotido no extensibles y polimerasas de DNA que carecen de exonucleasa 5'. Los oligonucleotidos bloqueadores solicitados no son, sin embargo, totalmente complementarios a la secuencia diana excepto por la formacion nucleotido(s) no coincidentes para inhibir la amplificacion de una secuencia (Pat. EE.UU. N° 5.849.497; WO 02/086155) o el nucleotido bloqueador no hibrida con la secuencia diana bajo condiciones de la reaccion de extension del cebador (Dominguez et al., Oncogene 24: 6830 6834 (2005)

Definiciones

Tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "un oligonucleotido" incluye una pluralidad de oligonucleotidos; la referencia a "una sonda" incluye mezclas de tales sondas, y similares.

Tal como se utiliza aqm, una "muestra biologica" se refiere a cualquier sustancia que contenga o presunta de contener acido nucleico (por ejemplo, a partir de una bacteria, virus, biopsia de tejido, etc.). La muestra se puede obtener por cualquier medio conocido por los expertos en la tecnica. Tal muestra puede ser una cantidad de tejido o

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fluido, o una fraccion purificada de la misma, aislado de un individuo o individuos, incluyendo, pero no limitado a, por ejemplo, la piel, plasma, suero, sangre completa, fluido espinal, saliva, fluido peritoneal , lfquido linfatico, el humor acuoso o vftreo, el Kquido sinovial, la orina, las lagrimas, las celulas de sangre, productos sangumeos, el semen, el lfquido seminal, fluidos vaginales, derrame pulmonar, Kquido seroso, organos, lavado bronco-alveolar, tumores, tejidos embebidos en parafina, etc. . Las muestras tambien pueden incluir constituyentes y componentes de cultivos celulares in vitro, incluyendo, pero sin limitarse a, medio acondicionado resultante del crecimiento de celulas en el medio de cultivo celular, celulas recombinantes, componentes celulares, etc. Un acido nucleico puede obtenerse a partir de una muestra biologica mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica.

Un "oligonucleotido bloqueador" tal como se utiliza aqrn, se refiere a un oligonucleotido que:

(1) forma un duplex con una secuencia diana a una temperatura de fusion suficientemente baja para permitir que una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' para desplazar el oligonucleotido bloqueador y replicar la secuencia diana; y

(2) forma un duplex con una segunda secuencia que es una variante de la secuencia diana a una temperatura suficientemente alta de fusion para impedir a una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' de la replicacion de la secuencia diana.

El oligonucleotido bloqueador puede, pero no necesita, incluir una modificacion en el extremo 3' para prevenir la extension 3' del oligonucleotido bloqueador por una polimerasa.

Una "secuencia diana" se refiere a una secuencia de polinucleotido a ser detectado en una muestra biologica y es la region (una subsecuencia o secuencia) de un acido nucleico que es total o parcialmente complementaria a la region de hibridacion de un oligonucleotido bloqueador. La "secuencia diana" puede ser de cualquier longitud de al menos 5 nucleotidos de longitud. La secuencia diana puede ser una porcion de una secuencia genica mas grande u otra secuencia a detectar.

La frase "impedir la amplificacion" se refiere a la eliminacion, la inhibicion o reduccion medible de la amplificacion de una secuencia. Como se describe aqrn, mediante la seleccion de un oligonucleotido bloqueador que tiene una temperatura de fusion mas alta para una variante de la diana que para la diana, es posible impedir la amplificacion de la variante de la diana, permitiendo de este modo mejorar la amplificacion y deteccion de la secuencia diana.

Los terminos "acido nucleico" y "polinucleotido" se utilizan indistintamente, y se refieren a un polfmero de monomeros de acidos nucleicos de ribosa (RNA) o polfmeros de acidos nucleicos de desoxirribosa (DNA) o analogos de los mismos. Esto incluye polfmeros de nucleotidos, tales como RNA y DNA, asf como formas modificadas de los mismos, acidos nucleicos peptfdicos (PNAS), acidos nucleicos bloqueados (LNA), y similares. En ciertas solicitudes, el acido nucleico puede ser un polfmero que incluye multiples tipos de monomeros, por ejemplo, ambas subunidades de RNA y DNA. Un acido nucleico puede ser o incluir, por ejemplo, un cromosoma o segmento de cromosoma, un vector (por ejemplo, un vector de expresion), un casete de expresion, un polfmero de DNA o RNA desnudo, un amplicon, un oligonucleotido, un cebador, una sonda, etc. Un acido nucleico puede ser, por ejemplo, de cadena sencilla o de doble hebra, o hubridos DNA: RNA, DNA y RNA estructuras quimericas. No hay distincion prevista en longitud entre el termino "acido nucleico", "polinucleotido" y "oligonucleotido", y los terminos se pueden utilizar indistintamente en el presente documento a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Tales terminos se refieren solo a la estructura primaria de la molecula.

La "extension de un cebador" se refiere a la capacidad de un biocatalizador de incorporar nucleotidos, tal como una polimerasa, para anadir nucleotidos al extremo 3' terminal de un cebador de una manera espedfica de molde. La extension no solo se refiere al primer nucleotido anadido al extremo 3' de un cebador, sino tambien incluye cualquier extension adicional de un polinucleotido formado por el cebador extendido.

Un acido nucleico es tfpicamente monocatenario o bicatenario y generalmente contendra enlaces fosfodiester, aun- que en algunos casos, como se indica en el presente documento, se incluyen analogos de acido nucleico que pueden tener cadenas principales alternativas, incluyendo, por ejemplo y sin limitacion, fosforamida (Beaucage et al. (1993) Tetrahedron 49 (10): 1925 y las referencias en el; Letsinger (1970) J. Org. Chem. 35: 3800; Sprinzl et al. (l977) Eur J. Biochem. 81: 579; Letsinger et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 3487; Sawai et al. (1984) Chem. Lett. 805; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; y Pauwels et al. (1986) Chemica Scripta 26: 1419), fosfo- rotioato (Mag et al. (1991). Nucleic Acids Res. 19: 1437 y la patente de EE.Uu. N° 5.644.048), fosforoditioato (Briu et al. (1989). J. Am. Chem. Soc. 111: 2321), los enlaces O-metilfosforoamidita (Eckstein, oligonucleotides and analogues: A practical Approach, Oxford University Press (1992)), y esqueletos peptfdicos de acidos nucleicos y enlaces (Egholm (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 1.895; Meier et al. (1992) Chem. Int. Ed. Engl. 31: 1008; Nielsen (1993) Nature 365: 566; y Carlsson et al. (1996) Nature 380: 207). Otros acidos nucleicos analogos incluyen aquellos con cadenas principales cargadas positivamente; (Denpcy et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097); esqueletos no ionicos (patentes estadounidenses numeros 5.386.023, 5.637.684, 5.602.240, 5.216.141 y 4.469.863; Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English 30: 423; Letsinger et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 110: 4470; Letsinger et al. (1994) Nucleoside & Nucleotide 13: 1597; capftulos 2 y 3, ASC Symposium Series 580, " Carbohydrate Modifications in

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Antisense Research", Ed. Y.S. Sanghvi y P. Dan Cook; Mesmaeker et al. (1994) Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4: 395; Jeffs et al. (1994) J. Biomolecular NMR 34:17; Tetrahedron Lett. 37:743 (1996)) y esqueletos no-ribosa, in- cluyendo los descritos en las patentes de EE.UU. N° 5.235.033 y 5.034.506, y los capftulos 6 y 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Ed. Y. S. Sanghvi y P. Dan Cook. Los acidos nuclei- cos que contienen uno o mas azucares carbodclicos tambien se incluyen dentro de la definicion de los acidos nu- cleicos (Jenkins et al. (1995) Chem. Soc. Rev. pp 169-176). Varios analogos de acidos nucleicos tambien se descri- ben en, por ejemplo, Rawls, C & E News 2 de junio 1997 pagina 35. Estas modificaciones del esqueleto de fosfato- ribosa se pueden hacer para facilitar la adicion de porciones adicionales tales como porciones de marcaje, o para alterar la estabilidad y vida media de tales moleculas en entornos fisiologicos.

Ademas de las bases heterodclicas de origen natural que se encuentran tfpicamente en los acidos nucleicos (por ejemplo, adenina, guanina, timina, citosina y uracilo), los analogos de acidos nucleicos tambien incluyen aquellos que poseen bases heterodclicas no natural u otras bases modificadas, muchos de los cuales se describen, o se hace referencia de otro modo, en el presente documento. En particular, muchas bases no naturales se describen adicionalmente en, por ejemplo, Seela et al. (1991) Helv. Chim. Acta 74: 1790, Grein et al. (1994) Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 971-976, y Seela et al. (1999) Helv. Chim. Acta 82: 1640. Para ilustrar adicionalmente, se incluyen opcionalmente ciertas bases usadas en nucleotidos que actuan como modificadores de la temperatura de fusion (Tm). Por ejemplo, algunos de estos incluyen 7-deazapurinas (por ejemplo, 7-desazaguanina, 7-desazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo, propinil-dU, propinil-dC, etc.), y similares. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.990.303, titulada "Smtesis de nucleotidos 7-deaza-2'-desoxiguanosina", que se deposito el 23 de noviembre 1999 por Seela. Otras bases heterodclicas representativas incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina; derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; derivados de 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina; 6-azacitosina; 5-fluorocitosina; 5-clorocitosina; 5-yodocitosina; 5-bromocitosina; 5- metilcitosina; 5-propinilcitosina; 5-bromoviniluracilo; 5-fluorouracilo; 5-clorouracilo; 5-yodouracilo; 5-bromouracilo; 5-trifluorometiluracilo; 5-metoximetiluracilo; 5-etiniluracilo; 5-propiniluracilo, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboxmetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 7- desazaadenina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 7- desazaguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D manosilqueosina, 5'-

metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-6-N-isopenteniladenina, acido uracil-5-oxiacetico (v),

wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina, y similares.

Ejemplos adicionales de bases y nucleotidos modificados tambien se describen en, por ejemplo, la Patente de EE.UU.. N° 5.484.908, titulada "oligonucleotidos que contienen 5-propinil pirimidinas," depositada el 16 de enero de 1996 por Froehler et al., Pat. EE.UU. N° 5.645.985, titulada "formacion mejorada de la triple helice y doble helice con oligomeros que contienen pirimidinas modificadas," depositada el 8 de julio de 1997 por Froehler et al., Patente de EE.UU. N° 5.830.653, titulada "Metodos de utilizacion de oligomeros que contienen pirimidinas modificadas", depositada el 3 de noviembre 1998 por Froehler et al., Patente de EE.UU. N° 6.639.059, titulado "Smtesis de [2.2.1] biciclo nucleosidos" depositada el 28 de octubre de 2003 por Kochkine et al., Patente de EE.UU. N° 6.303.315, titulada "Preparacion de muestras en un paso y deteccion de acidos nucleicos en muestras biologicas complejas", depositada el 16 de octubre de 2001 por Skouv, y Sol. de Publicacion de Pat. de EE.UU. N° 2003/0092905, titulada "Smtesis de [2.2.1] biciclo nucleosidos," por Kochkine et al. que se publico el 15 de mayo 2003.

No se pretende que la presente invencion este limitada por la fuente de un acido nucleico, polinucleotido o oligonucleotido. Tal acido nucleico puede ser de una lmea celular humana o marnffero no humano, o cualquier otro organismo (por ejemplo, planta, anfibio, bacteria, virus, micoplasmas, etc.), tejido, o, derivar de cualquier fuente recombinante, sintetizada in vitro o mediante smtesis qrnmica. Una vez mas, el acido nucleico puede ser DNA, RNA, DNAc, DNA-RNA, acido nucleico bloqueado (LNA), acido nucleico peptfdico (PNA), un hfbrido o cualquier mezcla de los anteriores. El acido nucleico puede existir en una forma de doble cadena, de cadena simple o parcialmente bicatenario. Los acidos nucleicos de la invencion incluyen tanto acidos nucleicos y fragmentos de los mismos, en formas purificadas o no purificadas, incluyendo genes, cromosomas, plasmidos, los genomas de material biologico tal como microorganismos, por ejemplo, bacterias, levaduras, virus, viroides, mohos, hongos, plantas, animales, seres humanos, micoplasmas, y similares.

Las "condiciones de extension de la reaccion nen cadena de la polimerasa" se refieren a condiciones bajo las cuales los cebadores que hibridan con un molde de acido nucleico se prolonga por una polimerasa durante un paso de reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Los expertos en la tecnica apreciaran que tales condiciones pueden variar, y generalmente estan influenciadas por la fuerza ionica y la temperatura. Varias condiciones de hibridacion de la PCR se describen en, por ejemplo, pCr Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y eds, 1,995, Academic Press, San Diego, cA). En el capftulo 14; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky y T. J. White eds., Academic Press, Nueva York, 1990).

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Un acido nucleico es "complementario" en relacion con otro acido nucleico cuando al menos un segmento de acido nucleico (es decir, al menos dos bases contiguas) puede combinar en una asociacion antiparalela o hibridar con al menos una subsecuencia de otro acido nucleico para formar un duplex. La asociacion antiparalela puede ser intramolecular, por ejemplo, en la forma de un bucle de horquilla dentro de un acido nucleico, o intermolecular, como por ejemplo cuando dos o mas acidos nucleicos de cadena sencilla se hibridan entre st En el contexto de la presente invencion, para un oligonucleotido que es "totalmente complementario" a la secuencia en particular, cada base del oligonucleotido es complementario a las bases correspondientes en la secuencia particular de una manera anti-paralela. Ciertas bases que no se encuentran comunmente en acidos nucleicos naturales pueden ser incluidas en los acidos nucleicos de la presente invencion e incluyen, por ejemplo, inosina, 7-desazaguanina y los discutidos anteriormente. En algunas realizaciones, la complementariedad no es perfecta (es decir, los acidos nucleicos pueden ser "parcialmente complementarios" en lugar de "totalmente complementarios"). Los duplex estables, por ejemplo, pueden contener pares de bases no coincidentes o desemparejadas.

Un "cebador de acido nucleico" o "cebador" es un acido nucleico que puede hibridar con un acido nucleico diana o molde y permite la extension de la cadena o elongacion usando, por ejemplo, un biocatalizador que incorpora nucleotidos, tal como una polimerasa en condiciones de reaccion apropiadas. Tales condiciones incluyen normalmente la presencia de uno o mas desoxirribonucleosidos trifosfato y el biocatalizador que incorpora nucleotidos, en un tampon adecuado ("tampon" incluye sustituyentes que son cofactores, o que afectan el pH, la fuerza ionica, etc.), y a una temperatura adecuada. Un cebador de acido nucleico es tfpicamente un oligonucleotido natural o sintetico (por ejemplo, un oligodesoxirribonucleotido de cadena sencilla, etc.). Aunque otras longitudes de cebadores de acidos nucleicos se utilizan opcionalmente, que tfpicamente comprenden regiones de hibridacion que van desde aproximadamente 6 a aproximadamente 100 nucleotidos de longitud. Los cebadores de acidos nucleicos cortos generalmente requieren temperaturas mas bajas para formar complejos tubridos suficientemente estables con los acidos nucleicos molde. Un cebador de acido nucleico que es al menos parcialmente complementario a una subsecuencia de un acido nucleico molde es normalmente suficiente para hibridar con el molde para que se produzca la extension. El diseno de cebadores adecuados para, por ejemplo, la amplificacion de una secuencia diana dada es muy conocido en la tecnica y esta descrito en la literatura citada en este documento. Un cebador de acido nucleico puede marcarse, si se desea, mediante la incorporacion de un marcador detectable mediante, por ejemplo, metodos espectroscopicos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos, qrnmicos, u otras tecnicas. Para ilustrar, los marcajes utiles incluyen radioisotopos, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (como las comunmente utilizadas en ELISA), biotina, o haptenos y protemas para los que estan disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales. Muchas de estos y otros marcajes se describen adicionalmente en el presente documento conocido y / o de otra manera en la tecnica. Un experto en la tecnica reconocera que, en ciertas realizaciones, los cebadores de acidos nucleicos tambien se pueden utilizar como sondas de acidos nucleicos.

Tal como se utiliza aqrn, el termino "sonda" se refiere a un oligonucleotido (u otra secuencia de acido nucleico) que puede formar una estructura duplex con una region de un acido nucleico diana (o amplicon derivado del acido nucleico diana), debido a la complementariedad parcial o completa de al menos una secuencia en la sonda con una secuencia en el acido nucleico diana en condiciones adecuadas. Como se discute aqrn, la sonda puede estar marcada o no marcada. El extremo 3' de la sonda, opcionalmente, puede estar disenado para evitar la incorporacion de la sonda en un producto de extension del cebador. Esto se puede lograr mediante el uso de bases no complementarias o mediante la adicion de una porcion qmmica tal como biotina o un grupo fosfato al grupo 3'- hidroxilo del ultimo nucleotido, que puede, dependiendo de la porcion seleccionada, servir de un doble proposito tambien actuando como un marcador para la deteccion o captura del acido nucleico unido al posterior marcaje. La prohibicion de la extension tambien se puede lograr mediante la eliminacion del 3'-OH o mediante el uso de un nucleotido que carece de un 3'-OH tal como un didesoxinucleotido, o mediante la adicion de un grupo voluminoso que bloquea la extension por impedimento esterico. Como se discute adicionalmente en este documento, los oligonucleotidos bloqueadores de la invencion pueden, pero no necesariamente, funcionar como sondas.

El termino "region de hibridacion" se refiere a esa region de un acido nucleico que es exactamente o sustancialmente complementaria a, y por lo tanto se hibrida con, un polinucleotido y es al menos 5 nucleotidos contiguos de longitud. Aunque la region de hibridacion generalmente se refiere a una region de un acido nucleico que hibrida con la totalidad del oligonucleotido bloqueador, el nucleotido bloqueador puede en algunas realizaciones tambien incluir secuencias de nucleotidos adicionales que no se hibridan pero en su lugar funcionan, por ejemplo, como un enlazante, marcaje, aleta, o similar. En algunas realizaciones, la region de hibridacion del oligonucleotido bloqueador es completamente complementaria a la secuencia diana. Sin embargo, como se describe en el presente documento, la complementariedad completa no es necesaria (por ejemplo, generalmente hay al menos un desemparejamiento que resulta en solo una complementariedad parcial entre un oligonucleotido bloqueador y la secuencia diana).

Tal como se define en el presente documento, "actividad nucleasa 5' a 3'" se refiere a la actividad de una polimerasa de acido nucleico espedfica de molde que incluye una actividad exonucleasa 5' a 3' (tradicionalmente asociada con algunas polimerasas de DNA mediante las cuales se eliminan los nucleotidos desde el extremo 5' de un oligonucleotido de una manera secuencial, por ejemplo, la polimerasa I de DNA de E. coli tiene esta actividad mientras que el fragmento Klenow no la tiene (se discuten polimerasas adicionales en el parrafo siguiente).

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Una polimerasa que "carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'" se refiere a una polimerasa que posee el 50% o menos actividad (por ejemplo, <25%, <20, <15%, <10%) que la exonucleasa de la polimerasa de DNA Taq. Los metodos de medicion de exonucleasa 5'-3' y las condiciones de medicion son bien conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.466.591. Ejemplos de polimerasas de DNA que carecen sustancialmente de actividad nucleasa 5'-3' incluyen, por ejemplo, cualquier polimerasa de DNA que tiene actividad nucleasa 5'-3' indetectable bajo condiciones tfpicas de extension del cebador para esa polimerasa. Por ejemplo, las polimerasas que carecen o que tienen un dominio exonucleasa 5'-3' mutado; el fragmento Klenow de E. coli DNA polimerasa I; una polimerasa de DNA de Thermus aquaticus (Taq) que carecen de los 235 aminoacidos de N- terminal (por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.616.494 o como comunmente se conoce en la tecnica como el "fragmento Stoffel"). Otros ejemplos incluyen una DNA polimerasa termoestable que tiene deleciones suficientes (por ejemplo, deleciones en N-terminal), mutaciones o modificaciones a fin de eliminar o inactivar el dominio responsable de la actividad nucleasa 5' a 3'. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.795.762. Las polimerasas de DNA de ejemplo incluyen las de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05, Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, Hot Spring familia B/clon 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escherchia coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus. La secuencia de acido nucleico y aminoacidos completa para numerosas polimerasas de DNA termoestables estan disponibles. Las secuencias de cada una de las polimerasas de Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus especies Z05, Thermus especies sps17, Thermotoga maritima (Tma), y Thermosipho africanus (TAF) han sido publicadas en la publicacion PCT de patente internacional N° WO 92 / 06200. La secuencia para la polimerasa de DNA de Thermus flavus ha sido publicada en Akhmetzjanov y Vakhitov (Nucleic Acids Research 20: 5839, 1992). La secuencia de la DNA polimerasa termoestable de Thermus caldophilus se encuentra en EMBL/GenBank n° de acceso U62584. La secuencia de la DNA polimerasa termoestable de Thermus filiformis se puede recuperar del deposito de la ATCC N° 42380 usando, por ejemplo, los metodos proporcionados en la Patente de EE.UU. N° 4.889.818, asf como la informacion de secuencia proporcionada en la misma. La secuencia de la DNA polimerasa de Thermotoga neapolitana es de la base de datos de patentes de GeneSeq n° de acceso R98144 y PCT WO 97/09451. La secuencia de la DNA polimerasa termoestable de Bacillus caldotenax se describe en, por ejemplo, Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113 (3): 401-410, 1993; vease tambien, la base de datos Swiss-Prot N° de acceso Q04957 y GenBank numeros de acceso D12982 y BAA02361). La secuencia para la DNA polimerasa de Bacillus stearothermophilus ha sido publicada en la patente de EE.UU. N° 6.066.483. Ejemplos de formas no modificadas de DNA polimerasas que pueden ser modificadas para eliminar o mutar el "dominio de la exonucleasa 5'-3' incluyen, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 6.228.628; 6.346.379; 7.030.220; 6.881.559; 6.794.177; 6.468.775; y las solicitudes de patente de EE.UU. N° 20040005599; 20020012970; 20060078928; y 20040115639. Como se explica en la patente US n° 5.795.762, una mutacion dirigida al sitio de G en A en la segunda posicion del codon para Gly en el residuo 46 en la secuencia de aminoacidos de la polimerasa de DNA Taq (es decir, la mutacion de G (137) en A en la secuencia de DNA se ha encontrado que proporciona una reduccion de aproximadamente 1000 veces en la actividad exonucleasa de 5' a 3' sin un cambio aparente en la actividad de la polimerasa, la tasa de procesividad o extension. Esta mutacion dirigida al sitio de la secuencia de nucleotidos de la polimerasa de DNA Taq da como resultado un cambio de aminoacido de la Gly (46) a Asp. La glicina 46 de la polimerasa de DNA Taq se conserva en la polimerasa de DNA de Thermus especie sps17, pero se encuentra en el residuo 43, y la misma mutacion Gly a Asp tiene un efecto similar en la actividad exonucleasa 5' a 3' de la polimerasa de DNA Tsps17. Tal mutacion del Gly conservada de las polimerasas de DNA de Tth (Gly 46), TZ05 (Gly 46), Tma (Gly 37) y tAf (Gly 37) a Asp tambien tiene un efecto parecido atenuador en las actividades exonucleasa 5' a 3' de esas polimerasas.

Tal como se utiliza aqrn, el termino "Tm" se refiere a la "temperatura de fusion". La temperatura de fusion es la temperatura a la cual la mitad de una poblacion de polinucleotidos de doble cadena u oligomeros nucleobasicos (por ejemplo, complejos de hibridacion), en homoduplex o heteroduplex (es decir, duplex que son completamente o parcialmente complementarios), se disocian en cadenas simples (bajo fuerza ionica definida, pH y concentracion de acido nucleico). La prediccion de una Tm de un polinucleotido duplex tiene en cuenta la secuencia de bases, asf como otros factores que incluyen caractensticas estructurales y de secuencia y la naturaleza de los enlaces oligomericos. Los metodos para predecir y determinar experimentalmente la Tm son conocidos en la tecnica.

Por ejemplo, una Tm se determina tradicionalmente por una curva de fusion, en la que una molecula de acido nucleico duplex se calienta en un programa de temperatura controlada, y el estado de asociacion / disociacion de las dos hebras individuales en el duplex se monitoriza y se representa hasta alcanzar una temperatura en donde las dos cadenas estan completamente disociadas. La Tm se determina a partir de esta curva de fusion. Alternativamente, una Tm puede determinarse mediante una curva de hibridacion, en la que una molecula de acido nucleico duplex se calienta a una temperatura en la que las dos hebras estan completamente disociadas. La temperatura se baja entonces en un programa de temperatura controlada, y el estado de asociacion / disociacion de las dos hebras individuales en el duplex se monitoriza y se representa hasta alcanzar una temperatura donde las dos cadenas estan completamente hibridadas. La Tm se determina entonces a partir de esta curva de hibridacion.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 ilustra un ejemplo de supresion de la amplificacion de secuencias relacionadas a la vez que permite la amplificacion de una secuencia diana. La muestra mostrada contiene una copia de una secuencia diana (en la parte

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inferior) y dos copias de una secuencia relacionada (dos primeras lmeas horizontales). La parte izquierda de la figura ilustra la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a las secuencias. En este ejemplo, existe un desemparejamiento en la region del oligonucleotido bloqueador y la secuencia diana, mientras que no hay desemparejamientos para las secuencias principales relacionadas, resultando asf en una Tm mayor para las secuencias relacionadas en comparacion con el Tm para la secuencia diana. La parte derecha de la figura ilustra como la Tm mas alta para las secuencias relacionados resulta en la alteracion (en este caso bloqueo) de la amplificacion de las secuencias relacionadas por la polimerasa, mientras que la amplificacion no se ve afectada por la secuencia diana. Mientras que la figura muestra dos copias de la variante de diana y una copia de la diana, se apreciara que la invencion tambien es util cuando hay diferentes proporciones de la diana y de la variante, incluyendo, por ejemplo, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, etc.

La Figura 2 ilustra los datos de la fusion de la amplificacion de la polimerasa de DNA de ZO5 de Factor 5 de tipo salvaje y el DNA mutante en presencia de una sonda de deteccion no estabilizada que es totalmente complementaria a la secuencia de tipo salvaje y tiene una falta de coincidencia con la secuencia mutante, como se detalla en los Ejemplos.

La Figura 3 ilustra los datos de fusion a partir de la amplificacion de la polimerasa de DNA de ZO5 de Factor 5 de tipo salvaje y el DNA mutante en presencia de una sonda de deteccion estabilizada (bloqueador) que es totalmente complementaria a la secuencia de tipo salvaje y tiene una falta de coincidencia con la secuencia mutante, como se detalla en los ejemplos.

La Figura 4 ilustra los datos de fusion a partir de la amplificacion de la polimerasa de DNA de AZO5 (una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3' - vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.466.591) del Factor 5 de tipo salvaje y el DNA mutante en presencia de una sonda de deteccion no estabilizada que es totalmente complementaria a la secuencia de tipo salvaje y tiene una falta de coincidencia con la secuencia mutante, como se detalla en los Ejemplos.

La Figura 5 ilustra los datos de fusion a partir de la amplificacion de la polimerasa de DNA de AZO5 (que carece de actividad exonucleasa 5'-3') del Factor 5 de tipo salvaje y DNA mutante en presencia de una sonda de deteccion estabilizada (bloqueador) que es totalmente complementaria a la secuencia de tipo salvaje y tiene una falta de coincidencia con la secuencia mutante, como se detalla en los ejemplos.

La Figura 6 ilustra los datos de fusion a partir de la amplificacion de la polimerasa de DNA de AZO5 (que carece de actividad exonucleasa 5'-3') del Factor 5 de tipo salvaje y DNA mutante en presencia o ausencia de una sonda de deteccion estabilizada (bloqueador) que es totalmente complementaria a la secuencia de tipo salvaje y tiene un emparejamiento erroneo con la secuencia mutante, como se detalla en los Ejemplos. En esta figura, el bloqueador estaba o bien presente en el tubo de PCR desde el principio, o se anadio tras la PCR. Cuando la sonda no estuvo presente durante la PCR, se produjo la amplificacion normal de ambas dianas de tipo salvaje (azul) y mutante (rojo) - lmeas de puntos. Cuando la sonda estaba presente durante la PCR, la diana mutante todavfa se amplificaba y se fundfa bien, pero la de tipo salvaje no lo hizo.

Descripcion detallada

I. Introduccion

La presente invencion se basa en parte en el sorprendente hallazgo de que un oligonucleotido que forma un duplex con un polinucleotido a una temperatura de fusion suficientemente alta puede perjudicar la replicacion y amplificacion del molde por una polimerasa que carece significativamente de la actividad 5'-3'. Se ha encontrado que este fenomeno se puede aplicar a la deteccion de secuencias diana en presencia de variantes de secuencias diana (tambien denominado a veces aqrn como una "segunda secuencia") mediante el diseno del oligonucleotido (designado un "oligonucleotido bloqueador") de forma que el oligonucleotido bloqueador forma un duplex con la variante a una temperatura de fusion suficientemente alta para impedir la amplificacion de la variante mientras que la temperatura de fusion del duplex formado por el oligonucleotido bloqueador y la diana es inferior, y por lo tanto el oligonucleotido bloqueador no afecta significativamente la amplificacion de la diana. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los metodos de la invencion son utiles para detectar una secuencia diana particular en una mezcla de secuencias altamente relacionadas.

En un ejemplo sencillo que no pretende limitar el alcance de la invencion, un oligonucleotido esta disenado de tal manera que el oligonucleotido es totalmente complementario a una variante de secuencia diana, y por lo tanto forma un duplex con una Tm que impide que la polimerasa que carece de actividad 'exonucleasa 5'-3' amplifique significativamente la variante diana. En este ejemplo, la diana tiene una unica diferencia de nucleotidos de la variante y por lo tanto el oligonucleotido tambien forma un duplex con la diana, pero con al menos un par de bases no coincidentes. Los pares de bases no coincidentes da como resultado una Tm reducida del duplex formado por el oligonucleotido bloqueador con la diana en comparacion con el duplex formado con la secuencia variante, y la reduccion en la Tm es suficiente para permitir que la polimerasa amplifique la secuencia diana y no perjudique significativamente la polimerasa a partir de la replicacion del molde a la que se hibrida el oligonucleotido bloqueador.

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La presente invencion proporciona por lo tanto metodos de deteccion de secuencias diana incluso en presencia de otras secuencias diferentes pero muy relacionadas, e incluso si las secuencias relacionadas son en cantidad significativamente mas alta que la secuencia diana. Por consiguiente, los metodos de la invencion son utiles para numerosas aplicaciones incluyendo, por ejemplo, la deteccion de mutaciones indicativas de cancer o de cualquier otra enfermedad.

II. Vision general de los metodos de la invencion

La presente invencion se aprovecha de las diferencias en la afinidad de la hibridacion de un oligonucleotido bloqueador para una secuencia diana y una secuencia de variante de diana, en el que el oligonucleotido bloqueador forma un duplex con una Tm superior (es decir, una mayor afinidad) para una o mas secuencias variantes de diana en comparacion con la Tm para la secuencia diana. En algunas realizaciones, por ejemplo, la Tm mas baja entre el oligonucleotido bloqueador y la secuencia diana es el resultado de al menos una falta de coincidencia en la region de hibridacion. Por ejemplo, el oligonucleotido bloqueador puede ser disenado para ser totalmente complementario a la secuencia de variante de diana, pero solo parcialmente complementaria a la secuencia diana. Los desemparejamientos pueden ser el resultado de, por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones de nucleotidos, dando como resultado diferencias entre las secuencias diana y las variantes de diana.

En los metodos de la invencion, asf como en los equipos o mezclas descritas en el presente documento, una muestra que puede tener un acido nucleico con la secuencia diana y/o un acido nucleico con una variante de diana se pone en contacto con un oligonucleotido bloqueador bajo condiciones de la reaccion de extension del cebador para permitir la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a la secuencia diana (si esta presente) y la variante de secuencia diana (si esta presente). Una reaccion de extension del cebador se lleva a cabo a continuacion, donde un cebador se hibrida con los acidos nucleicos en una region corriente arriba de la region del acido nucleico en el que el oligonucleotido bloqueador se hibrida. Tal como se usa en el presente documento, una "reaccion de extension del cebador" se refiere a cualquier reaccion que resulta en la extension de uno o mas cebadores, y por lo tanto el termino abarca, por ejemplo, reacciones en cadena de la polimerasa. La posicion en el acido nucleico a la que el cebador se hibrida esta determinado de tal manera que la extension del cebador esta bloqueada por el oligonucleotido bloqueador si el oligonucleotido bloqueador hibrida con el acido nucleico con una afinidad suficiente (es decir, el oligonucleotido bloqueador tiene una Tm suficientemente alta). La reaccion de extension del cebador se realiza con una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'. Como se discute aqm, los inventores han encontrado que las polimerasas que carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' no pueden desplazar el oligonucleotido bloqueador si el oligonucleotido bloqueador hibrida con una afinidad suficientemente alta. Asf, la reaccion de extension del cebador generalmente solo se completa (es decir, se consigue una extension completa del cebador) cuando el acido nucleico contiene la secuencia diana (es decir, una secuencia a la que el oligonucleotido bloqueador no tiene suficiente afinidad) cuando se utiliza una polimerasa que carece de actividad nucleasa 5'-3'.

La Figura 1 ilustra el metodo anteriormente descrito. La parte izquierda de la Figura 1 representa una muestra en un tubo en el que hay dos copias de un acido nucleico que comprende una variante de diana y una copia de un acido nucleico que comprende la secuencia diana. El oligonucleotido bloqueador se pone en contacto con los acidos nucleicos y se hibrida a la secuencia diana y a la variante de secuencia diana. Debido a que la secuencia diana comprende al menos una diferencia de nucleotidos de la variante de diana, el oligonucleotido bloqueador no es totalmente complementario con la secuencia diana (que se muestra en la Figura 1 con una "X"). Por lo tanto, mientras que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la secuencia diana, lo hace con una Tm inferior a la Tm del oligonucleotido bloqueador y la variante de diana.

La parte derecha de la Figura 1 ilustra la reaccion de extension del cebador resultante. El cebador esta representado por una pequena flecha que hibrida hacia la izquierda de cada acido nucleico. Cuando el cebador se extiende por una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' en los acidos nucleicos que comprenden variantes de diana, la hibridacion de los oligonucleotidos bloqueadores impide (es decir, inhibe al menos algunos, y normalmente toda, o casi toda) la extension a traves de las secuencias variantes de diana, y por lo tanto resulta en una extension incompleta. En contraste, debido a que el oligonucleotido bloqueador hibrida con menor afinidad (es decir, una Tm inferior) para la secuencia diana, la polimerasa es capaz de extender el cebador a traves de la secuencia diana (presumiblemente mediante el desplazamiento del oligonucleotido bloqueador).

La secuencia diana y la secuencia variante de la diana difieren en al menos un nucleotido (por ejemplo, una insercion, delecion o cambio de nucleotido) en la region de hibridacion, es decir, la region en la que el oligonucleotido bloqueador hibrida con las secuencias. Generalmente, la variante de diana y la diana seran suficientemente iguales para que el oligonucleotido bloqueador pueda hibridar a la variante de diana y a la diana en las mismas condiciones, por ejemplo, las condiciones de una reaccion de extension del cebador, que incluye pero no se limita a una reaccion de amplificacion tales como una PCR u otra reaccion de amplificacion. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la variante de diana y la diana difieren en la region de hibridacion por 1, 2, 3 o 4 nucleotidos, por ejemplo, de 1-4, 1-3, 1-2, 2-3, 2-4 nucleotidos. En algunas realizaciones, la secuencia diana es menos de un 100% identica a la secuencia variante de diana, pero es superior al, por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%,

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o 99% de identidad. En numerosas realizaciones, la(s) diferencia(s) entre las secuencias diana y la variante de diana se producen en las partes internas de las secuencias mas que en los nucleotidos terminales 5' o 3'.

La secuencia diana puede ser de cualquier longitud. En algunas realizaciones, el nucleotido diana tiene al menos 5 nucleotidos de longitud, por ejemplo, al menos 10, 15, 20 o mas nucleotidos, por ejemplo, de 5-200, de 5-100, de 10200, de 10-100, de 10-50, 15-50, de 20-80 nucleotidos, etc.

Mientras que esta descripcion general, describe la invencion, como si hubiera una diana y una variante de diana, se apreciara que en algunas realizaciones hay multiples secuencias diana diferentes y/o variantes de secuencias diana dentro de una muestra. En algunas realizaciones, hay o posiblemente hay mas de una variante de la secuencia diana diferente en la muestra con la secuencia diana. Asf, por ejemplo, una muestra puede contener una secuencia diana, una variante de diana con una diferencia de nucleotidos de la secuencia diana y una segunda variante de la diana con una diferencia de nucleotidos diferente de la secuencia diana.

En realizaciones preferidas de los metodos, equipos o mezclas descritas en el presente documento, pueden realizarse reacciones "multiplex" en donde se detectan al menos dos secuencias diana diferentes. Estas formas de realizacion generalmente, pero no siempre, implican el uso de dos o mas oligonucleotidos bloqueadores diferentes (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, etc., dependiendo del numero de dianas a detectar), en el que cada oligonucleotido bloqueador impide la extension de variantes de diferentes secuencias diana.

La distancia entre la region del acido nucleico en el que el cebador se hibrida y el oligonucleotido bloqueador hibrida puede variar siempre y cuando la distancia no este tan lejos para que la reaccion de extension se haya completado antes de llegar a la region donde el oligonucleotido bloqueador se hibrida. En algunas realizaciones, la distancia entre el nucleotido en la que la mayor parte de la porcion 3' del cebador se hibrida y la mayor parte de la porcion 5' del nucleotido bloqueador esta entre aproximadamente 5-1000 nucleotidos, por ejemplo, 10-100 nucleotidos, pero puede ser tan pequena como cero (adyacente).

Los cebadores usados para la extension del cebador pueden ser identicos entre aquellos que hibridan con acidos nucleicos que tienen una variante de diana y los que tienen la secuencia diana, pero los cebadores tambien pueden ser diferentes. Por ejemplo, cuando se desea detectar una mutacion somatica rara en un organismo, el genoma del organismo sera generalmente identico, excepto por el cambio en el sitio de la mutacion. Por lo tanto, la secuencia diana comprendera el sitio de la mutacion, y se puede utilizar un cebador identico porque la region corriente arriba del sitio de mutacion, sin importar si el el sitio de la mutacion esta mutado, tendra la misma secuencia. No obstante, aunque posiblemente mas raras, existen situaciones en las que puede preverse que los cebadores utilizados para las reacciones de extension de los acidos nucleicos diana y variantes de diana son diferentes y por lo tanto este tipo de realizaciones no estan excluidas de la invencion.

Los productos de extension pueden ser detectados, y los productos de extension de variante de diana abortados se pueden distinguir de los productos de extension de diana, por numerosos metodos. En algunas realizaciones, se utiliza la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) u otro tipo de amplificacion de acido nucleico. Para las reacciones de PCR, se utilizan tfpicamente dos cebadores. Tal como se utiliza en los metodos de la invencion, un cebador de PCR es el cebador descrito en referencia a las reacciones de "extension del cebador" anterior, y el segundo cebador (por ejemplo, un cebador inverso) esta disenado para hibridar con el complementario de una secuencia en el acido nucleico que esta corriente abajo del oligonucleotido bloqueador. Tal como se utiliza en los metodos de las invenciones, la PCR es util porque se produce la amplificacion exponencial solo para aquellas reacciones en las que la polimerasa es capaz de desplazar el oligonucleotido bloqueador (es decir, los relacionados con la secuencia diana). Un numero de polimerasas termoestables que carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' se conocen y se describen en el presente documento. Los metodos de la invencion encuentran un uso particular en las reacciones de PCR asimetricas, es decir, las reacciones de PCR en las que un cebador esta en una concentracion limitante en comparacion con otros cebadores en la reaccion. Generalmente, el cebador (el cebador inverso en el ejemplo anterior) que genera la cadena a la que se hibrida el oligonucleotido bloqueador es el cebador en una concentracion limitante.

Independientemente del tipo de reaccion de extension del cebador realizada, pueden ser utilizados numerosos tipos diferentes de metodos para detectar los productos de extension. En algunas realizaciones, una sonda (por ejemplo, una sonda marcada de forma detectable) esta disenada para hibridarse con una region del producto de extension que corresponde a la secuencia diana o una secuencia adicional corriente abajo de la secuencia diana en el acido nucleico, o un complementario de tales secuencias. Dicha sonda solamente, o principalmente, detectana productos de extension que implican acidos nucleicos que comprenden la secuencia diana como productos de extension de acidos nucleicos que comprenden variantes de diana impedidos y por lo tanto no incluina generalmente, la secuencia diana, la secuencia variante diana, o secuencias corriente abajo.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, las sondas marcadas de forma detectable "en tiempo real" se utilizan y funcionan como un oligonucleotido bloqueador. Tales sondas pueden incluir, pero no se limitan a, sondas TaqMan® y balizas moleculares. En algunas realizaciones, las sondas marcadas de forma detectable "en tiempo real" (tambien funcionan como oligonucleotidos bloqueadores), se utilizan en reacciones de amplificacion en tiempo real tales como

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las reacciones de PCR en tiempo real. Los valores umbral de ciclo (Ct) se utilizan con frecuencia para monitorizar las cantidades de diana en amplificaciones en tiempo real. En algunas realizaciones, hay una diferencia de al menos 5, 10, 15 o mas Ct entre una diana y una variante de diana como se determina en una reaccion de amplificacion en tiempo real en presencia de cantidades iguales de las secuencias diana y de la variante de diana.

En algunas realizaciones, los metodos de deteccion basados en masa se puede utilizar para detectar los productos de extension. Como los productos de extension de acidos nucleicos que comprenden la secuencia diana generalmente seran significativamente mas largos que los generados a partir de acidos nucleicos que comprenden variantes de secuencias diana, se puede utilizar cualquier metodo que detecta diferencias en la longitud de acido nucleico o masa. Por ejemplo, pueden usarse varios metodos de espectrometna de masas para detectar, distinguir y cuantificar los productos de extension.

Preferiblemente, el analisis de temperatura de fusion se utiliza para detectar los productos de extension. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, el oligonucleotido bloqueador se marca y se realiza un analisis de curva de fusion para cuantificar la cantidad de molde a la que el oligonucleotido marcado se hibrida.

III. Oligonucleotidos que bloquean la extension de las polimerasas con actividad exonucleasa 5'-3' deteriorada

Los oligonucleotidos bloqueadores de la presente invencion estan disenados para hibridarse a una variante de secuencia diana con una temperatura de fusion mas alta (Tm) que la que el bloqueador hibrida con la secuencia diana en sf. El oligonucleotido bloqueador no necesita ser totalmente complementario a la variante de diana siempre que el oligonucleotido bloqueador hibride con la variante de diana con una Tm suficientemente alta que impida bajo condiciones designadas, que la polimerasa replique la porcion de un molde en la que los oligonucleotidos bloqueadores hibriden. El oligonucleotido bloqueador es en algunas realizaciones totalmente complementario a una variante de diana, pero forma al menos un desemparejamiento (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 desemparejamientos) cuando se hibrida con la secuencia diana, lo que resulta en una Tm inferior para la diana en comparacion con la variante de diana. El oligonucleotido bloqueador en algunas realizaciones no es totalmente complementario a cualquiera de las secuencias diana o variantes de diana. En algunas realizaciones, el oligonucleotido bloqueador forma al menos uno o mas desemparejamientos con la variante de diana, pero sin embargo, se hibrida a una Tm suficientemente alta para impedir a una polimerasa replicar la secuencia variante en presencia del oligonucleotido bloqueador, aunque no perjudica significativamente la replicacion de la secuencia diana. En algunas realizaciones, el oligonucleotido bloqueador o bien tiene un mayor numero de desemparejamientos con la secuencia diana que con la variante de diana o tiene diferentes desemparejamientos con la secuencia diana en comparacion con la variante diana de modo que la replicacion de la secuencia variante de diana en presencia del oligonucleotido bloqueador esta impedida mientras que la replicacion de la secuencia diana en presencia del oligonucleotido bloqueador no se vea afectada de manera significativa. En algunas realizaciones, el desemparejamiento entre la secuencia diana y la variante no se produce en el extremo 5' o 3' de las secuencias. En algunas realizaciones, el oligonucleotido bloqueador esta disenado de tal manera que se forman uno o mas desemparejamientos en el medio (no en los extremos) de la region de hibridacion formados por el duplex del oligonucleotido bloqueador y la variante de diana. En algunas realizaciones, el oligonucleotido bloqueador esta disenado de tal manera que se forman uno o mas desemparejamientos en uno o ambos extremos de la region de hibridacion formados por el duplex del oligonucleotido bloqueador y la variante de diana.

Como se discutio anteriormente, la Tm del oligonucleotido bloqueador y una variante de diana particular es suficientemente mayor que la Tm del oligonucleotido bloqueador para las secuencias diana de modo que la replicacion de la variante de diana se impide mientras que la replicacion de la diana en las mismas condiciones no se deteriora significativamente, permitiendo de este modo la deteccion de la secuencia diana en presencia de la variante de diana. Preferiblemente, la diferencia en Tm del oligonucleotido bloqueador para la variante de diana en comparacion con la secuencia diana es al menos aproximadamente 5 °C, 10 °C, 15 °C, 20°C, o mas. Se apreciara que la Tm se puede medir de diferentes maneras. La Tm se puede determinar usando cualquier tampon de amplificacion de otra mezcla que es, o emula, las condiciones en las que se analiza la replicacion con la polimerasa. Un ejemplo de tales condiciones es, por ejemplo, 2,5% de glicerol, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM con nucleotidos apropiados para la extension del cebador.

Los oligonucleotidos bloqueadores de la invencion pueden ser de cualquier longitud. Preferiblemente, los oligonucleotidos bloqueadores son entre 5-200 nucleotidos, por ejemplo, de 5-100, de 10-100, de 5-40, de 5-25, de 10-50, de 15-50 nucleotidos de longitud.

Los oligonucleotidos bloqueadores de la invencion pueden comprender, y a veces solo incluir, nucleotidos naturales (es decir, A, C, T, Gy U). Alternativamente, en algunas realizaciones, los oligonucleotidos bloqueadores comprenden al menos un (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, etc.) nucleotido artificial (es decir, distintos de los que se producen en el RNA o DNA de origen natural). Bases artificiales ejemplares que contribuyen al aumento de la Tm se describen en la tecnica, e incluyen pero no se limitan a, por ejemplo, Lebedev et al., Geneteic Analysis - Biomolecular Engineering 13: 15-21. (1996); Xodo, et al., Nucleic Acids Res. 19: 5625-5631 (1991); Froehler, et al., Tetrahedron Lett. 33:5307-5310 (1992); Kutyavin, et al., Biochemistry 35: 11170-11176 (1996); Nguyen, et al., Nucleic Acids Res. 25:30599-65 (1997). Por ejemplo, 2-Amino A aumenta la Tm en aproximadamente 3 °C sobre A,

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5-metil-C aumenta la Tm aproximadamente 1,3 °C sobre C, C-5 propinil-C mejora la Tm aproximadamente 2,8 °C sobre C y C-5 propinil-U aumenta la Tm aproximadamente 1,7 °Ca lo sobre T. De acuerdo con la invencion, el oligonucleotido bloqueador no comprende ningun nucleotido intercalante. Ademas, el oligonucleotido bloqueador de la invencion no comprende un pseudonucleotido intercalante interno, tal como los descritos en el documento WO 2006/026828.

En otras realizaciones preferidas, los oligonucleotidos bloqueadores de la invencion comprenden al menos una porcion no nucleotfdica (opcionalmente, distinta de un nucleotido intercalante) que aumenta la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador. Ejemplos de tales porciones no nucleotfdicas incluyen, por ejemplo, aglutinante de grupo menor, vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 6.486.308).

De acuerdo con la invencion, el oligonucleotido bloqueador esta marcado de manera detectable y por lo tanto es de mayor uso en la deteccion de la secuencia diana en una mezcla. El oligonucleotido bloqueador marcado de forma detectable, por ejemplo, se utiliza para detectar y cuantificar la secuencia diana en una reaccion de amplificacion, que incluye, pero no se limita a una reaccion de amplificacion en tiempo real. Se conocen una amplia variedad de marcadores detectables. Los marcajes ejemplares incluyen marcadores fluorescentes (incluyendo, por ejemplo, desactivadores o absorbedores), marcadores no fluorescentes, marcadores colorimetricos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores radiactivos, grupos modificadores de la masa, anticuerpos, antfgenos, biotina, haptenos, enzimas (incluyendo, por ejemplo, peroxidasa , fosfatasa), y similares. Los marcadores pueden proporcionar senales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetna, gravimetna, difraccion de rayos X o absorcion, magnetismo, actividad enzimatica, y similares. Los marcadores pueden ser utilizados para proporcionar una senal detectable (y opcionalmente cuantificable), y que se pueden unir a un acido nucleico o protema.

En ciertas realizaciones preferidas de la invencion, un marcador es un colorante fluorescente o fluoroforo. Normalmente, un fluoroforo particular puede emitir luz de una longitud de onda particular tras absorber luz de longitud de onda mas corta. La longitud de onda de la luz emitida por un fluoroforo particular es caractenstica de ese fluoroforo. Por lo tanto, un fluoroforo particular, se puede detectar mediante la deteccion de luz de una longitud de onda apropiada despues de la excitacion del fluoroforo con luz de longitud de onda mas corta. Los marcadores fluorescentes pueden incluir colorantes que estan cargados negativamente, tales como colorantes de la familia de la fluorescema, o los colorantes que son de carga neutra, tales como los colorantes de la familia carboxirodamina, o colorantes que estan cargados positivamente, tales como los colorantes de la familia de cianina o de la familia de la

rodamina. Otras familias de colorantes que se pueden utilizar en la invencion incluyen, por ejemplo, colorantes de la

familia de la polihalofluorescema, colorantes de la familia de la hexaclorofluorescema, colorantes de la familia de la

cumarina, colorantes de la familia de la oxazina, colorantes de la familia de la tiazina, colorantes de la familia de la

escuarama, colorantes de la familia de los lantanidos quelados, colorantes ALEXA FLUOR® y colorantes de la familia BODIPY®. Los colorantes de la familia de la fluorescema incluyen, por ejemplo, FAM, HEX, TET, JOE, NAN y ZOE. Los colorantes de la familia de la carboxirodamina incluyen Texas Red, rOx, R110, R6G, y TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G y TAMRA son comercializados por Perkin-Elmer (Foster City, Calif.), mientras que Texas Red es comercializado por Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon). Los colorantes de la familia de la cianina incluyen Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7 y son comercializados por Amersham GE Healthcare (Piscataway, N. J.).

IV. Polimerasas con actividad exonucleasa 5'-3' deteriorada

Un numero de polimerasas que carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' son conocidas en la tecnica. La region N-terminal de las polimerasas tfpicamente confieren actividad exonucleasa 5'-3'. Por lo tanto, se pueden utilizar la mutacion o delecion parcial o total del extremo N-terminal de una polimerasa para generar polimerasas que carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'. Los ejemplos de polimerasas que carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' incluyen el fragmento Klenow de la polimerasa de DNA I de E. coli; Taq de Thermus aquaticus que carece de los 235 aminoacidos N-terminales (por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N° 5.616.494.); y/o una polimerasa de DNA termoestable que tienen deleciones (por ejemplo, deleciones en N-terminal), mutaciones o modificaciones suficientes con el fin de eliminar o inactivar el dominio responsable de la actividad nucleasa 5' a 3'. Vease, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N° 5.795.762. Tales polimerasas son generalmente polimerasas aisladas o purificadas y pueden ser protemas recombinantes.

Las polimerasas que funcionan en reacciones de amplificacion, incluyendo reacciones de amplificacion de termociclado son particularmente utiles en la invencion. Las polimerasas utiles para los metodos de la invencion carecen significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' de forma que la polimerasa es incapaz de extender un cebador en una manera dependiente del molde a traves de la region de un molde de variante de diana a la que se hibrida el oligonucleotido bloqueador, pero es capaz de extender un cebador a traves de una region de un molde diana a la que se hibrida el oligonucleotido bloqueador, en el que la Tm del oligonucleotido bloqueador es mayor para el molde de la variante de diana que la Tm para el molde diana. Por lo tanto, los expertos en la tecnica apreciaran que el nivel preciso, si lo hay, de actividad exonucleasa 5'-3' de la polimerasa puede variar dependiendo de la Tm del oligonucleotido bloqueador para la diana y variante de diana.

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De acuerdo con los metodos de la invencion, la polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' esta suficientemente afectada por el oligonucleotido bloqueador para replicar la secuencia de la variante de diana en beneficio de la correspondiente amplificacion de la diana. Sin pretender limitar el alcance de la presente invencion, se cree que no puede haber una reaccion de competicion entre una secuencia diana y una variante de diana estrechamente relacionadas. En situaciones donde hay considerablemente mas copias de la variante de diana en comparacion con la diana, la amplificacion en ausencia del bloqueador resulta en la amplificacion de tal manera que la secuencia diana posee una detectabilidad reducida o no es detectable. Cuando es deseable detectar la diana en presencia de la variante de diana, la amplificacion de la variante se impide por hibridacion del oligonucleotido bloqueador, mientras que la amplificacion de la diana no se ve afectada o se deteriora en un grado menor para permitir la deteccion de la diana en presencia de la variante de diana. La amplificacion de la variante de diana se considera impedida significativamente cuando la presencia del oligonucleotido bloqueador reduce la cantidad de amplicon de la variante en al menos un 20%, y mas tfpicamente al menos un 50%, 75%, 90%, 95% o mas, en comparacion con una reaccion de control que carece del oligonucleotido bloqueador.

De acuerdo con la invencion, una reaccion de control se lleva a cabo tambien empleando una polimerasa que posee una actividad exonucleasa 5'-3' significativa en lugar de una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'. Tales reacciones de control pueden ser utiles para determinar la presencia o ausencia de variantes de diana si en tales reacciones de control se amplifican las variantes de diana. Tales reacciones de control tambien pueden ser utiles para confirmar que los reactivos de amplificacion son funcionales. Se apreciara que tambien pueden ser utilizados otros controles diferentes.

V. Usos de los metodos

La presente invencion es util para la deteccion de secuencias diana y los acidos nucleicos que comprenden estas secuencias diana. La invencion es particularmente util para detectar una secuencia diana en presencia de variantes de diana, especialmente cuando las variantes de diana estan en una concentracion en exceso en comparacion con la secuencia diana a detectar. Sin pretender limitar el alcance de la invencion, algunos ejemplos de tales situaciones son la deteccion de mutaciones somaticas o mutaciones relacionadas con el cancer. Por ejemplo, la presente invencion es util para la deteccion de cancer u otras mutaciones somaticas en una biopsia donde la mayona de las celulas probablemente tienen una version "normal" de una secuencia de genes (es decir, la variante de diana), pero por lo menos unas pocas celulas de pueden tener una mutacion, (es decir, la secuencia diana).

La presente invencion se puede utilizar para analizar y detectar acidos nucleicos en cualquier muestra, incluyendo muestras biologicas como se define aqrn. Las muestras utilizadas en los metodos de la invencion pueden tener ambas secuencias diana y variante de diana, solo la secuencia o la variante de diana o ninguna. En algunas realizaciones, se conoce la presencia de una variante de diana o de la diana, mientras que en otras realizaciones, no se sabe si esta presente una diana o variante de diana.

VI. Mezclas de reaccion

Tambien se describen las mezclas de reaccion implicadas en los metodos de la invencion. Cualquier mezcla de reaccion como las descritas anteriormente se pueden generar. Un ejemplo de mezcla de reaccion comprende, por ejemplo, una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'; un polinucleotido que comprende una secuencia diana; un polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana en al menos un nucleotido; y un oligonucleotido bloqueador, en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la segunda secuencia por la polimerasa, pero la hibridacion del oligonucleotido a la secuencia diana no perjudica significativamente la amplificacion de la secuencia diana. Las mezclas de reaccion pueden comprender ademas los nucleotidos (por ejemplo, dNTP tales como dATP, dCTP, dGTP, dTTP, y/o dUTP, o en cualquier combinacion de los mismos) a concentraciones utiles para la extension del cebador y/o reacciones de amplificacion. Ademas, las mezclas de reaccion comprenden uno o mas cebadores diferentes que se hibridan a la secuencia diana y/o segunda secuencia, por ejemplo, al menos un cebador que hibrida corriente arriba de la region en la que el oligonucleotido bloqueador hibrida y/o un par de cebadores que comprende el cebador sentido 5' y el correspondiente cebador antisentido 3'. En otras variaciones, no mutuamente exclusivas, la mezcla de reaccion incluye uno o mas contenedores que proporcionan nucleotidos libres (convencionales y/o no convencionales). Por ejemplo, la mezcla de reaccion puede incluir dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de colorantes de la fluorescema o de la cianina. El oligonucleotido bloqueador, polimerasa, cebadores, y otros reactivos espedficos descritos en este documento tambien pueden incluirse en las mezclas de reaccion como se detalla en los apartados anteriores. Las mezclas de reaccion descritas tambien pueden estar acompanadas por o utilizadas con un recipiente que proporciona un cebador sentido 5' hibridable, en condiciones de extension del cebador, a la secuencia diana y/o segunda secuencia.

VII. Equipos

Tambien se describen los equipos para utilizar en los metodos de la invencion. Tfpicamente, el equipo esta compartimentado para facilitar su uso y contiene al menos un recipiente que proporciona una polimerasa que carece

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significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'. Tambien pueden incluirse uno o mas contenedores adicionales que proporcionan reactivo(s) adicional(es). Tales recipientes adicionales pueden incluir cualquier reactivo u otros elementos reconocidos por el experto en la tecnica para su uso en procedimientos de extension del cebador de acuerdo con los metodos descritos anteriormente, incluyendo reactivos para su uso en, por ejemplo, procedimientos de amplificacion de acido nucleico (por ejemplo, PCR, RT-PCR), procedimientos de secuenciacion de DNA, o procedimientos de marcaje de DNA. El equipo puede comprender, por ejemplo, un polinucleotido que comprende una secuencia diana; un polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana en al menos un nucleotido; y un oligonucleotido bloqueador, tal como se describe en el presente documento. El equipo incluye ademas un recipiente que proporciona un cebador sentido 5' hibridable, bajo condiciones de extension del cebador, a la secuencia diana y/o segunda secuencia, y/o un par de cebadores que comprende el cebador sentido 5' y el correspondiente cebador antisentido 3'. En otras variaciones, no mutuamente exclusivas, el equipo incluye uno o mas contenedores que proporcionan nucleotidos libres (convencionales y/o no convencionales). En realizaciones espedficas, el equipo incluye dNTP alfa-fosforotioato, dUTP, dITP, y/o dNTP marcados tales como, por ejemplo, dNTP de la familia de colorantes de la fluorescema o de la cianina. En otras realizaciones adicionales, no mutuamente exclusivas, el equipo incluye uno o mas recipientes que proporcionan un tampon adecuado para una reaccion de extension del cebador.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Este ejemplo ilustra el uso de un oligonucleotido bloqueador para suprimir la amplificacion de un alelo de tipo salvaje de factor 5 utilizando el analisis de curva de fusion para detectar el alelo mutante.

En el ejemplo actual, la mezcla maestra de muestras de PCR asimetrica consistio en: glicerol 2,5%; Tricina 50 mM, pH 8,3; acetato de potasio 45 mM; dATP 200 |iM, dGTP 200 |iM, dCTP 200 |iM, dUTP 400 |iM; cebador (exceso) corriente arriba 0,7 |iM; cebador (limitante) corriente abajo 0,1 |iM; sonda de deteccion 0,4 |im; 4U uracilo-N- glicosilasa; polimerasa de DNA AZO5 o polimerasa de DNA ZO5 40 U; y acetato de magnesio 4 mM.

La mezcla maestra se utilizo para amplificar dianas de DNA plasmfdico de Factor 5 de tipo salvaje y mutante. El exceso de cebador estuvo presente en 7x la concentracion del cebador limitante para asegurar un exceso de amplificon de cadena sencilla de la sonda de deteccion para unirse. La amplificacion y la fusion se realizaron en el Roche LightCycler LC480.

El perfil de los ciclos termicos utilizados para el ejemplo fue: 50 °C durante 5 minutos (paso UNG); 94 °C durante 15 segundos - 59 °C durante 40 segundos x 2 ciclos; 9l °C durante 15 segundos - 59 °C durante 40 segundos x 48 ciclos, 94 °C durante 30 segundos, con la recogida de datos durante el paso de hibridacion de 59 °C; y un paso de fusion con recogida de datos constante entre 40 °C y 95 °C.

La secuencia del cebador corriente arriba fue TGAACCCACAGAAAATGATGCCCBz (Id. de Sec. N°: 1); la secuencia del cebador corriente abajo fue GGAAATGCCCCATTATTTAGCCAGGBz (Id. de Sec. N°: 2); Bz = t-butilo bencil dA. La secuencia de la sonda de deteccion estabilizada (bloqueador) fue EFFLLFLGLLFGFLLAGGGQ (Id. de Sec. N°: 3), donde E = cx-FAM, Q = BHQ2, F = propinil dU y L = propinil dC. La secuencia de una sonda de deteccion no estabilizada (no bloqueador) fue ECTGTATTCCTCGCCTGTCCAGQP (Id. de Sec. N°: 4), donde E = cx-FAM, Q = BHQ2, F = propinil dU, L = propinil dC, y P = fosfato 3'. Estos oligonucleotidos se adaptan perfectamente a la diana de tipo salvaje, y tienen un desemparejamientos con la diana mutante (desemparejamientos CA), que esta indicado en negrita y subrayado.

Los datos de fusion de este ejemplo mostraron que con la polimerasa de DNA ZO5, ambas sondas dieron curvas de fusion como se esperaba, el tipo salvaje proporciona la Tm mas alta, la diana mutante proporciona la Tm mas baja y el heterocigoto proporciona Tm tanto para el alelo de tipo salvaje como el mutante (Figura 2 y Figura 3). Debido a que ZO5 escinde la sonda, no se observo supresion de la amplificacion. Se puede observar que la Tm de la sonda estabilizada a los 2 alelos fue de aproximadamente 12 °C mas alta que la sonda no estabilizada. Ademas, tambien se observo un mayor pico de Tm no identificado, como un hombro en el lado derecho del pico principal de fusion.

Con AZO5, la sonda no estabilizada proporciono de nuevo las mismas curvas de fusion, pero con mas senal si la sonda no se degrada durante la PCR (Figura 4).

Cuando se utilizo AZO5 con la sonda estabilizada (Figura 5), el alelo de tipo salvaje en la muestra heterocigoto no dio como resultado una curva de fusion para el alelo de tipo salvaje; sin embargo dio como resultado una curva de fusion que era identica a la diana mutante, lo que indica que la amplificacion del alelo de tipo salvaje habfa sido suprimida. La diana pura de tipo salvaje dio lugar a una curva de fusion que era mucho mas baja y mas ancha que la diana de tipo salvaje con ZO5 (Figura 3).

Ejemplo 2:

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La evidencia adicional del efecto en la amplificacion usando una sonda estable y una enzima no escisora se muestra en la Figura 6. Utilizando las mismas condiciones de amplificacion descritas en el ejemplo 1 con AZO5, una sonda estabilizada estaba o bien presente en el tubo de PCR desde el principio, o se anadio despues de la PCR. A continuacion, se realizo una fusion, y los datos se muestran en la Figura 6. Cuando la sonda no estaba presente durante la PCR, aparecio la amplificacion normal de las dianas de tipo salvaje (azul) y mutante (rojo) - lmeas de puntos. Cuando la sonda estaba presente durante la PCR, la diana mutante todavfa amplifica y se funde bien, pero la de tipo salvaje no lo hizo.

Ejemplo 3:

La supresion tambien se observo en la PCR en tiempo real. Usando las mismas condiciones de PCR descritas en el Ejemplo 1, los datos de la curva de crecimiento desde el mismo experimento mostro un retardo de ciclo umbral (Ct) de unos 12 ciclos entre las dianas de tipo salvaje y la mutante utilizando AZO5, en comparacion con ningun retraso con ZO5. Ademas, para probar si el oligonucleotido de bloqueo funciona debido a las bases estabilizadoras presentes (propinil dU y propinil dC), se construyo y se utilizo una sonda larga no estabilizada (52-mero), que tema la misma Tm que la sonda corta estabilizada. La secuencia de esta sonda era: ECAAGGACAAAATACCTGTQATT- CCTCGCCTGTCCAGGGATCTGCTCTTACAGP (Id. de Sec. N°: 5 y 6), donde E = cx-FAM, Q = BHQ2, y P = fosfato 3'.

Se observo un retraso de 11 ciclos entre las dianas de tipo salvaje y la mutante utilizando AZO5, en comparacion con ningun retraso usando ZO5. Este resultado indico que la Tm fue el factor mas cntico en la determinacion de si una sonda puede actuar como un bloqueador.

Ejemplo 4:

Se realizo un experimento para imitar un ensayo de deteccion de mutaciones raras. Usando las condiciones de reaccion descritas en el ejemplo 1, se mezclaron DNA plasirndico de dianas de tipo salvaje y mutantes en diferentes proporciones para ver que nivel de dianas mutantes puede ser detectado en un contexto de dianas de tipo salvaje. Se prepararon proporciones de 100:1 (correspondiente a 10.000 copias de tipo salvaje + 100 copias de mutante), 500:1 (50.000 copias de tipo salvaje + 100 copias de mutante), 1000:1 (100.000 copias de tipo salvaje + 100 copias de mutante), 5000:1 (500.000 copias de tipo salvaje + 100 copias del mutante) y 10.000:1 (1.000.000 copias de tipo salvaje + 100 copias de mutante). Se observaron curvas de fusion claramente interpretables para la diana mutante hasta una proporcion de 1000:1. Por encima de esto, la curva de fusion de tipo salvaje comenzo a interferir con la curva de fusion mutante, lo que indica que el bloqueo eficaz de la amplificacion de la diana de tipo salvaje ya no estaba ocurriendo.

Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritas en este documento son solo para fines ilustrativos y que varias modificaciones o cambios en los mismos seran sugeridos por los expertos en la tecnica dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Roche Diagnostics GmbH, F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Supresion de la amplificacion usando un oligonucleotido y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3'

<130> 24312 WO <140> US sin asignacion <141> Todavfa no asignada <150> US 60/964.089 <151> 08/08/2007 <160> 6

<170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: cebador corriente arriba de amplificacion por PCR asimetrica del alelo de tipo salvaje del Factor 5 <220>

<221> base modificada <222> (24)

<223> a = t butil-bencilo dA <400> 1

tgaacccaca gaaaatgatg ccca 24

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<210>2 <211> 26 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: cebador corriente abajo de amplificacion por PCR asimetrica del alelo de tipo salvaje del Factor 5 <220>

<221> base modificada <222> (26)

<223> a = t-butil bencil dA <400>2

ggaaatgccc cattatttag ccagga 26 <210> 3 <211> 18 <212> DNA

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: sonda de deteccion estabilizada (bloqueador) de amplificacion por PCR

asimetrica del alelo de tipo salvaje del Factor 5

<220>

<221> base modificada <222> (1)

<223> n = propinilo modificado por fosforamidita cx-FAM abasica, donde cx-FAM = enlazador ciclohexano unido a 6- carboxifluorescema (FAM)

<220>

<221> base modificada <222> (2)

<223> u = propinil dU <220>

<221> base modificada <222> (3) .. (4)

<223> c = propinil dC <220>

<221> base modificada <222> (5)

<223> u = propinil dU <220>

<221> base modificada <222> (6)

<223> c = propinil dC <220>

<221> base modificada <222> (8) .. (9)

<223> c = propinil dC <220>

<221> base modificada <222> (10)

<223> u = propinil dU <220>

<221> base modificada <222> (12)

<223> u = propinil dU <220>

<221> base modificada <222> (13) .. (14)

<223> c = propinil dC <220>

<221> base modificada <222> (18)

<223> g modificada por apantallador Black Hole BHQ2 (Q)

<400> 3

guccaggg nuccucgccu 18 <210> 4 <211> 21 <212> DNA

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: sonda de deteccion no estabilizada (no bloqueador) de amplificacion por PCR asimetrica del alelo de tipo salvaje del Factor 5 <220>

<221 > base modificada <222> (1)

<223> c modificado por fosforamidita CX-FAM 5' abasica, donde cx-FAM = enlazador ciclohexano unido a 6- carboxifluorescema (FAM)

<220>

<221> base modificada <222> (21)

<223> g modificada por Apantallador Black Hole BHQ2 (Q) y fosfato 3' (P)

<400>4

ctgtattcct cgcctgtcca g 21 <210>5 <211> 18 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: sonda larga no estabilizada para PCR en tiempo real de alelo de tipo

salvaje de Factor 5

<220>

<221> base modificada <222> (1)

<223> c modificado por fosforamidita abasica conjugada con CX-FAM, donde cx-FAM = enlazador ciclohexano unido a 6-carboxifluorescema (FAM)

<220>

<221> base modificada <222> (18)

<223> t modificado por fosforamidita abasica conjugada con apantallador Black Hole BHQ2 (Q) en el esqueleto de azucar fosfato unido al extremo 5' de Id. de Sec. N°: 6 <400> 5

caaggacaaa atacctgt 18 <210> 6 <211> 33 <212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Descripcion de Secuencia Artificial: sonda larga no estabilizada para PCR en tiempo real de alelo de tipo

salvaje de Factor 5

<220>

<221> base modificada <222> (1)

<223> a modificado por fosforamidita abasica conjugada con apantallador Black Hole de BHQ2 (Q) en el esqueleto

de azucar fosfato unido al extremo 3' de Id. de Sec. N°: 5

<220>

<221> base modificada <222> (33)

<223> g modificada por 3 'fosfato <400> 6

attcctcgcc tgtccaggga tctgctctta cag 33

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para detectar una secuencia diana en un polinucleotido en una muestra biologica, en el que la muestra puede contener tambien, o alternativamente, un segundo polinucleotido que comprende una segunda secuencia, en donde la segunda secuencia difiere de la secuencia diana por uno a 4 nucleotido(s), comprendiendo el metodo,

   1. Poner en contacto la muestra con un oligonucleotido bloqueador bajo condiciones de la reaccion de extension del cebador para permitir la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a la segunda secuencia y la secuencia diana, si esta presente

   ii,. Poner en contacto la muestra en presencia del oligonucleotido bloqueador hibridado con al menos un cebador y una polimerasa que carece significativamente de actividad exonucleasa 5'-3' en condiciones tales que se produce la extension del cebador dependiente del molde, en el que el cebador se hibrida con los polinucleotidos, si esta presente, corriente arriba de la secuencia que hibrida con el oligonucleotido bloqueador;

   en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia lo suficiente como para impedir la amplificacion de la segunda secuencia por la polimerasa, en el que el oligonucleotido bloqueador no comprende un nucleotido intercalante, en el que la hibridacion del oligonucleotido bloqueador a la secuencia diana no afecta significativamente la amplificacion de la secuencia diana por la polimerasa que carece de manera significativa de actividad nucleasa 5'-3' y ademas en la que el oligonucleotido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto para la posicion de uno a 4 nucleotido(s).
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido bloqueador esta marcado de forma detectable.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en el que hay una sola diferencia de nucleotidos entre la secuencia diana y la segunda secuencia y el oligonucleotido bloqueador es totalmente complementario a la secuencia diana excepto para la posicion del nucleotido unico.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la diferencia entre:

   - la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador y la segunda secuencia; y

   - la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador y la secuencia diana

   es de al menos 5 °C segun se mide en glicerol 2,5%, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido bloqueador comprende al menos un nucleotido no natural, en el que el nucleotido no natural, no intercalante aumenta la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador en comparacion con un oligonucleotido de control que es por lo demas identico al oligonucleotido bloqueador excepto que tiene un nucleotido natural en el lugar del nucleotido no natural.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido bloqueador comprende al menos una porcion no nucleotidica, en donde la porcion no nucleotfdica aumenta la temperatura de fusion del oligonucleotido bloqueador en comparacion con un oligonucleotido de control que es por lo demas identico al oligonucleotido bloqueador excepto que carece de la porcion no nucleotidica.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en donde la porcion no nucleotfdica se une a un surco menor del DNA.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el oligonucleotido bloqueador hibrida con la segunda secuencia con una temperatura de fusion de al menos 70 °C segun se mide en glicerol 2,5%, Tricina 50 mM pH 8,3, acetato de potasio 45 mM.

   Figura 1

   Oligonucleotido bloqueador con mayor Tm impide la amplificacion

   Oligonucleotido bloqueador con mayor Tm

   imagen1

   urn

   Diana

   imagen2

   >

   Diana

   j.

   Oligonucleotido bloqueador con menor Tm

   Oligonucleotido bloqueador con menor Tm no impide la amplificacion

   -(d/dt) Fluorescencia (475-520)

   imagen3

   Fig.2

   -(d/dt) Fluorescencia (483-533)

   imagen4

   ------- Diana mutante

   --------Diana de tipo salvaje

   .........Diana heterozigoto

   Sonda estabilizada/ZO5

   Fig.3

   -(d/dt) Fluorescencia (475-520)

   Picos de fusion

   imagen5

   --------Diana mutante

   —-- Diana de tipo salvaje ........Diana heterozigoto

   Sonda no estabilizada/ZO5

   Fig.4

   Picos de fusion

   imagen6

   Diana mutante Diana de tipo salvaje Diana heterozigoto

   imagen7

   a

   a

   a

   Sonda estabilizada/ZO5

   Fig.5

   K)

   4^

   Fig.6

   imagen8

   O

   O

   (/>

   Q_

   CD

   C

   (J)

   O'

   3