ES2964624T3 - Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana usando diferentes temperaturas de detección - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana usando diferentes temperaturas de detección. La presente invención que emplea diferentes temperaturas de detección permite detectar una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana de maneras convencionales en tiempo real incluso con un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción. Las tecnologías convencionales detectan una pluralidad de secuencias de ácido nucleico diana mediante un análisis de fusión después de la amplificación diana. Es poco probable que la presente invención no requiera un análisis de fusión después de la amplificación del objetivo, de modo que el tiempo de análisis se reduce considerablemente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de secuencias de ácidos nucleicos diana usando diferentes temperaturas de detección
Antecedentes de la invención
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana usando diferentes temperaturas de detección.
Descripción de la técnica relacionada
Para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana, se usan métodos de detección en tiempo real ampliamente para detectar secuencias de ácidos nucleicos diana con amplificación de la diana de control en tiempo real. Los métodos de detección en tiempo real generalmente usan sondas o cebadores marcados hibridados específicamente con secuencias de ácidos nucleicos diana. Los métodos ejemplificados mediante el uso de hibridación entre sondas marcadas y secuencias de ácidos nucleicos diana incluyen el método de baliza molecular que usa sondas doblemente marcadas con estructura de horquilla (Tyagiet al., Nature Biotechnologyv.14 de marzo de 1996), el método HyBeacon (French DJet al., Mol. Cell Probes,15(6): 363-374(2001)), el método de Sonda de hibridación que usa dos sondas marcadas cada una de donante y aceptor (Bernadet al.,147-148Clin Chem2000; 46) y el método Lux que usa oligonucleótidos con un único marcador (Patente de los EE.UU. N.° 7.537.886). El método TaqMan (Patentes de los EE.UU. N.° 5.210.015 y 5.538.848) que usa sondas doblemente marcadas y su escisión mediante la actividad nucleasa-5' de la ADN polimerasa también se emplea ampliamente en la técnica.
Los métodos ejemplificados que usan cebadores marcados incluyen el método de cebador Sunrise (Nazarenkoet al.,2516-2521Nucleic Acids Research,1997, v. 25 n.°12, y la patente de los EE.UU. N.° 6.117.635), el método de cebador Scorpion (Whitcombeet al.,804-807,Nature Biotechnologyv. 17 de agosto de 1999 y Patente de los EE.UU. N.° 6.326.145) y el método de cebador TSG (documento WO 2011/078441).
Como enfoque alternativo, se han propuesto métodos de detección en tiempo real que usan dúplex formados dependiendo de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana: ensayo Invader (documentos US 5.691.142, US 6.358.691 y US 6.194.149), método de PTOCE (escisión Y extensión de PTO, por sus siglas en inglés) (documento WO 2012/096523), método de PCE-SH (Hibridación de oligonucleótidos de señalización dependiente de extensión y escisión de PTO, por sus siglas en inglés) (documento WO 2013/115442), método de PCE-NH (No hibridación dependiente de la escisión y extensión de PTO, por sus siglas en inglés) (documento PCT/KR2013/012312).
Las tecnologías de detección en tiempo real convencionales descritas anteriormente detectan señales generadas a partir de marcadores fluorescentes a una temperatura de detección seleccionada en un proceso de amplificación de señales asociado a o sin amplificación de la diana. Cuando se detecta una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador en un único tubo de reacción de acuerdo con las tecnologías de detección en tiempo real convencionales, las señales generadas para las secuencias de ácidos nucleicos diana no se diferencian entre sí. Por consiguiente, las tecnologías de detección en tiempo real convencionales generalmente emplean diferentes tipos de marcadores para detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana. El análisis de fusión usando la diferencia de Tf permite detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana incluso con un único tipo de marcador. No obstante, el análisis de fusión tiene serias deficiencias ya que su tiempo de desempeño es mayor que el de las tecnologías en tiempo real y el diseño de sondas con diferentes valores de Tf se vuelven más difíciles tras aumentar las secuencias diana.
En consecuencia, cuando se desarrollan nuevos métodos o enfoques que no dependen del análisis de fusión para detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción y un único tipo de detector, permiten detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana con una comodidad, una rentabilidad y una eficiencia drásticamente potenciadas. Además, la combinación de los métodos novedosos con otros métodos de detección (por ejemplo, análisis de fusión) daría como resultado la detección de una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción con una eficiencia drásticamente potenciada.
Guoliang Fuet al.(en:"Multiplex Detection and SNP Genotyping in a Single Fluorescence Channel', PLOS ONE,vol.
7, n.° 1, 1 de enero de 2012 (01-01-2012), páginas e30340-1, XP002742282, ISSN: 1932-6203, DOI: 10.1371/JOURNAL.PONE.0030340) enseña una amplificación de sonda múltiple que permite la detección de hasta cuatro dianas en un único canal de detección. En primer lugar, las sondas marcadas con los mismos colorantes fluorescentes (de nuevo un único marcador) se pueden distinguir si las propias sondas, independiente de la hibridación con la secuencia diana, tienen temperaturas de fusión diferentes. Dicho de otro modo, la detección de canal único se combina con el análisis de la curva de fusión. El diseño de la sonda que conduce a la curva de fusión diferencial se basa en el principio de desactivación/FRET. Mediante diseño, cada sonda tiene propiedades de fusión únicas que se caracterizan por su temperatura de fusión (Tf). No obstante, el método de la presente invención es diferente de un análisis de fusión.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han realizado investigaciones intensivas para desarrollar métodos novedosos para detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción y un único tipo de detector. Como resultado, los inventores han descubierto que las señales para las secuencias de ácidos nucleicos diana se obtienen a temperaturas de detección ajustadas y después los resultados de la detección se interpretan adecuadamente, permitiendo de este modo detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción y un único tipo de detector con una comodidad, una rentabilidad y una eficiencia drásticamente potenciadas.
En consecuencia, un objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para el genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un método para detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para determinar la presencia de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Otro objeto más de la presente invención es proporcionar un dispositivo para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para determinar la presencia de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
Otros objetos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada a continuación, tomada en conjunto con las reivindicaciones y los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1a representa los resultados de detección de la presente invención usando diferentes temperaturas de detección para detectar una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deChlamydia trachomatis,CT) que tiene una temperatura de detección relativamente alta (72 °C), una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deNeisseria gonorrhoeae,NG) que tienen una temperatura de detección relativamente baja (60 °C) y su combinación. Las señales para CT y NG se generaron mediante el método de PCR en tiempo real de PTOCE.
La Fig. 1b representa la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja mediante una relación entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
La Fig. 1c representa la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja trazando las relaciones entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
Las Fig. 1d y 1e representan la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja por una diferencia entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja, en donde la señal a la temperatura de detección relativamente alta se modifica a un valor umbral y se usa para obtener la diferencia.
La Fig. 2a representa los resultados de detección de la presente invención usando diferentes temperaturas de detección para detectar una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deChlamydia trachomatis,CT) que tiene una temperatura de detección relativamente alta (72 °C), una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deNeisseria gonorrhoeae,NG) que tienen una temperatura de detección relativamente baja (60 °C) y su combinación. La señal para CT se generó mediante el método de PCR en tiempo real TaqMan y la señal para n G se generó mediante el método de PCR en tiempo real de PTOCE.
La Fig. 2b representa la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja mediante una relación entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
La Fig. 2c representa la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja trazando las relaciones entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
Las Fig. 2d y 2e representan la determinación de la presencia de las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección relativamente baja por una diferencia entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja, en donde la señal a la temperatura de detección relativamente alta se modifica a un valor umbral y se usa para obtener la diferencia.
La Fig. 3 representa los resultados de detección de una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deChlamydia trachomatis,CT) que tiene una temperatura de detección relativamente alta (72 °C), una secuencia de ácido nucleico diana (ADN de genoma deNeisseria gonorrhoeae,NG) que tienen una temperatura de detección relativamente baja (60 °C) y su combinación de acuerdo tanto con una PCR en tiempo real usando diferentes temperaturas de detección como con un análisis de fusión. La señal para CT se generó mediante el método de PCR en tiempo real TaqMan y la señal para NG se generó mediante el método de fusión de PTOCE.
La Fig. 4a representa los resultados del genotipado de SNP de la presente invención usando diferentes temperaturas de detección en forma de PCR en tiempo real. Se usó ADN genómico humano de MTHFR (C677T) como moldes (secuencias diana). Se detectaron el homocigoto silvestre (CC), el homocigoto mutante (TT) y el heterocigoto (CT). Todas las señales se generaron mediante el método de PCR en tiempo real de PTOCE.
La Fig. 4b representa el genotipado de SNP usando una relación entre la señal a la temperatura de detección relativamente alta y la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
Las Fig. 5a-5c representan los resultados de detección de la presente invención usando diferentes temperaturas de detección para detectar tres secuencias diana (ADN genómico deNeisseria gonorrhoeae(NG), ADN genómico deChlamydia trachomatis(CT) y ADN genómico deMycoplasma genitalium(MG)). La señal para MG se generó mediante el método de PCR en tiempo real TaqMan, y las señales para CT y NG se generaron mediante el método de PCR en tiempo real de PTOCE. Se seleccionó "95 °C" como temperatura de detección de señales para MG, se seleccionó "72 °C" como temperatura de detección de señales para CT y "60 °C" como temperatura de detección de señales para NG teniendo en cuenta los medios de generación de señales.
La Fig. 5d representa las AUFR finales calculadas usando los valores de UFR de los puntos finales a 95 °C y 72 °C para la determinación de la presencia de ADN genómico de CT.
La Fig. 5e representa las AUFR finales calculadas usando los valores de UFR de los puntos finales a 72 °C y 60 °C para la determinación de la presencia de ADN genómico de NG.
Descripción detallada de la presente invención
La característica más destacada de la presente invención es detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana usando un único tipo de marcador y un único tipo de detector en un recipiente de reacción de señales. La presente invención que emplea diferentes temperaturas de detección permite detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana incluso con un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción. Los elementos de la presente invención se seleccionan de acuerdo con la característica de la presente invención y se fabrican en un proceso sorprendente para detectar secuencias de ácidos nucleicos diana.
Los métodos convencionales de PCR en tiempo real requieren dos tipos de marcadores fluorescentes o análisis de fusión para la detección de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción.
La presente invención permite protocolos de PCR en tiempo real para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante el uso de un único tipo de marcador fluorescente en un único recipiente de reacción.
La presente invención emplea los hallazgos de los presentes inventores de que la detección de señales es ajustable por temperaturas de acuerdo con los medios de generación de señales para secuencias de ácidos nucleicos diana.
Por ejemplo, cuando se usan medios de generación de señales mediante hibridación de una sonda con una secuencia de ácido nucleico diana para la detección de una primera secuencia de ácido nucleico diana, una temperatura a la que la sonda se hibrida con la primera secuencia de ácido nucleico diana permite generar y detectar señales indicativas de la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana. Por el contrario, una temperatura a la que la sonda no se hibrida con la primera secuencia de ácido nucleico diana no permite generar ni detectar ninguna señal. A este respecto, se reconocería que hay temperaturas a las que se genera la señal y temperaturas a las que no se genera la señal, dependiendo de los medios de generación de señales.
En dichos medios de generación de señales, las temperaturas a las que la sonda se hibrida con la primera secuencia de ácido nucleico diana pueden servir como temperatura de detección para la primera secuencia de ácido nucleico diana. Las temperaturas a las que la sonda no se híbrida con la primera secuencia de ácido nucleico diana no pueden servir como temperatura de detección.
Cuando la hibridación de sondas también se usa para la detección de una segunda secuencia de ácido nucleico diana, su temperatura de detección se puede determinar considerando que existe un intervalo de temperatura para generar o no señales.
Cuando el valor de Tf de la sonda utilizada para la detección de la segunda secuencia de ácido nucleico diana es inferior al de la sonda para la detección de la primera secuencia de ácido nucleico diana, la señal para la primera secuencia de ácido nucleico diana se puede detectar a una temperatura relativamente más alta en donde no se generará la señal para la segunda secuencia de ácido nucleico diana. Dicho de otro modo, existe una diferencia de temperaturas para generar y detectar señales entre los dos medios de generación de señales para las dos secuencias de ácidos nucleicos diana.
Cuando las dos secuencias de ácidos nucleicos diana coexisten en una muestra, existe un intervalo de temperatura que permite generar una señal para la primera secuencia de ácido nucleico diana y no generar una señal para la segunda secuencia de ácido nucleico diana. Al mismo tiempo, en un intervalo de temperatura inferior al intervalo de temperatura, se generan señales para las dos secuencias de ácidos nucleicos diana.
Teniendo en cuenta los dos intervalos de temperatura, se puede determinar una temperatura de detección para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana. Del intervalo de temperatura anterior se puede seleccionar una temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente alta se asigna a la primera secuencia de ácido nucleico diana. Del último intervalo de temperatura se puede seleccionar una temperatura de detección relativamente baja y la temperatura de detección relativamente baja se asigna al segundo ácido nucleico diana.
De acuerdo con la presente invención, la señal a la temperatura de detección relativamente alta se mide para determinar la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana. De acuerdo con la presente invención, la detección a la temperatura de detección relativamente alta permite un método que determina la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana.
La característica técnica importante de la presente invención es revelar la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja para determinar la presencia de la segunda secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, usando tanto la señal a la temperatura de detección relativamente alta como la señal a la temperatura de detección relativamente baja.
La presente invención se puede realizar en diversos aspectos de la siguiente manera:
(a) Detección de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección;
(b) Genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección;
(c) Detección de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección;
I. Detección de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección
En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja usando un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, usando un valor de referencia, en donde el valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con los métodos de PCR en tiempo real convencionales que usan curvas de amplificación, es de conocimiento común en la técnica que una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana no pueden detectarse de manera diferencial mediante el uso de medios de generación de señales que proporcionen señales idénticas indistinguibles.
La presente invención supera las limitaciones asociadas al conocimiento común en la técnica y conduce a resultados inesperados para detectar secuencias de ácidos nucleicos diana de una manera muy mejorada.
La presente invención se describirá en más detalle de la siguiente manera:
Etapa (a): Incubación con medios de generación de señales y detección de señales
En primer lugar, la muestra que se ha de analizar se incuba con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y después se detecta una señal generada usando un único tipo de detector. El único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales.
La presente invención utiliza medios de generación de señales fluorescentes para generar señales para secuencias de ácidos nucleicos diana. Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales correspondiente.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la incubación se realiza en las condiciones que permiten una generación de señales por los medios de generación de señales. Dichas condiciones incluyen temperaturas, concentraciones de sal y pH de las soluciones.
Los ejemplos de los oligonucleótidos que sirven como medios de generación de señales incluyen oligonucleótidos que se han de hibridar específicamente con secuencias de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, sondas y cebadores); cuando las sondas o cebadores hibridados con secuencias de ácidos nucleicos diana se escinden para liberar un fragmento, los oligonucleótidos que sirven como medios de generación de señales incluyen oligonucleótidos de captura que se han de hibridar específicamente con el fragmento; cuando el fragmento hibridado con el oligonucleótido de captura se extiende para formar una cadena extendida, los oligonucleótidos que sirven como medios de generación de señales incluyen oligonucleótidos que se han de hibridar específicamente con la cadena extendida; los oligonucleótidos que sirven como medios de generación de señales incluyen oligonucleótidos que se han de hibridar específicamente con el oligonucleótido de captura; y los oligonucleótidos que sirven como medios de generación de señales incluyen combinaciones de los mismos.
Aunque el principio de generación de señales es el mismo, los medios de generación de señales que comprenden diferentes secuencias de oligonucleótidos utilizados se pueden considerar diferentes entre sí.
El marcador puede estar unido a oligonucleótidos o puede estar en forma libre. El marcador se puede incorporar en productos extendidos durante una reacción de extensión.
Cuando se usa la escisión de oligonucleótidos en la generación de señales, los ejemplos de la enzima incluyen nucleasa-5' y nucleasa-3', particularmente una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa-5', una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa-3' o FEN nucleasa.
En la presente invención, las señales se pueden generar usando diversos materiales descritos anteriormente de diversas maneras.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los dos medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son medios de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, el dúplex incluye una secuencia de ácido nucleico diana bicatenaria.
La expresión utilizada en el presente documento "generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex" junto con medios de generación de señales se refiere a que la señal que se ha de detectar se proporciona dependiendo de la asociación o disociación de dos moléculas de ácido nucleico. La expresión incluye que una señal es proporcionada por un dúplex (por ejemplo, un oligonucleótido de detección con un marcador y una secuencia de ácido nucleico) formado dependiendo de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana. Además, la expresión incluye que se proporciona una señal mediante la inhibición de la hibridación de un dúplex (por ejemplo, un oligonucleótido de detección con un marcador y una secuencia de ácido nucleico) en donde la inhibición es provocada por la formación de otro dúplex.
Particularmente, la señal se genera mediante la formación de un dúplex entre una secuencia de ácido nucleico diana y un oligonucleótido de detección hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
La expresión utilizada en el presente documento "oligonucleótido de detección" es un oligonucleótido que está implicado en la generación de la señal que se ha de detectar. De acuerdo con una realización de la presente invención, el oligonucleótido de detección incluye un oligonucleótido que está implicado en una generación de señales real. Por ejemplo, la hibridación o no hibridación de un oligonucleótido de detección con otro oligonucleótido (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico diana o un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria al oligonucleótido de detección) determina la generación de señales.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el oligonucleótido de detección comprende al menos un marcador.
La señal por la formación de un dúplex entre una secuencia de ácido nucleico diana y el oligonucleótido de detección se puede generar mediante diversos métodos, incluyendo el método Scorpion (Whitcombeetal., Nature Biotechnology17: 804-807 (1999)), el método Sunrise (o Amplifluor) (Nazarenkoet al., Nucleic Acids Research,25(12): 2516-2521 (1997) y Patente de los EE.UU. N.° 6.117.635), el método Lux (Patente de los EE.UU. N.° 7.537.886), el método Plexor (sherrill C B,et al., Journal o f the American Chemical Society,126: 4550-45569 (2004)), el método Baliza Molecular (Tyagiet al., Nature Biotechnologyv. 14 de marzo de 1996), el método HyBeacon (French DJet al., Mol. Cell Probes,15(6): 363-374(2001)), el método de sonda de hibridación adyacente (Bernard, P.S.et al., Anal. Biochem.,273: 221(1999)) y el método LNA (Patente de los EE.UU. N.° 6.977.295).
Particularmente, la señal se genera mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
La expresión utilizada en el presente documento "oligonucleótido de mediación" es un oligonucleótido que media en la producción de un dúplex que no contiene una secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la escisión del oligonucleótido de mediación en sí no genera señal y un fragmento formado por la escisión está implicado en reacciones sucesivas para la generación de señales después de la hibridación y la escisión del oligonucleótido de mediación.
De acuerdo con una realización, la hibridación o escisión del oligonucleótido de mediación en sí no genera señal.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el oligonucleótido de mediación incluye un oligonucleótido que se hibrida con una secuencia de ácido nucleico diana y se escinde para liberar un fragmento, conduciendo a mediar la producción de un dúplex. Particularmente, el fragmento media una producción de un dúplex mediante una extensión del fragmento sobre un oligonucleótido de captura.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el oligonucleótido de mediación comprende (i) una porción de direccionamiento 3' que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) una porción de marcaje 5' que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la escisión de un oligonucleótido de mediación libera un fragmento y el fragmento se hibrida específicamente con un oligonucleótido de captura y se extiende sobre el oligonucleótido de captura.
De acuerdo con una realización de la presente invención, un oligonucleótido de mediación hibridado con secuencias de ácidos nucleicos diana se escinde para liberar un fragmento y el fragmento se hibrida específicamente con un oligonucleótido de captura y el fragmento se extiende para formar una cadena extendida, dando como resultado la formación de un dúplex extendido entre la cadena extendida y el oligonucleótido de captura que proporciona una señal que indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando se usa un tercer oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la cadena extendida, la hibridación del tercer oligonucleótido y la cadena extendida forma otro tipo de dúplex que proporciona una señal que indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando se usa un tercer oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria al oligonucleótido de captura, la formación de un dúplex entre el tercer oligonucleótido y el oligonucleótido de captura se inhibe mediante la formación del dúplex entre la cadena extendida y el oligonucleótido de captura, conduciendo a proporcionar una señal que indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el fragmento, la cadena extendida, el oligonucleótido de captura, el tercer oligonucleótido o una combinación de ellos pueden funcionar como oligonucleótido de detección.
La señal del dúplex formado de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de mediación se puede generar mediante diversos métodos, incluyendo el método de PTOCE (escisión y extensión de PTO, por sus siglas en inglés) (documento WO 2012/096523), el método de PCE-SH (Hibridación de oligonucleótidos de señalización dependiente de extensión y escisión de PTO) (documento WO 2013/115442) y el método de PCE-NH (No hibridación dependiente de la escisión y extensión de Pt O) (documento PCT/KR2013/012312).
Con referencia a los términos desvelados en las referencias anteriores, los ejemplos correspondientes de los oligonucleótidos son los siguientes: un oligonucleótido de mediación corresponde a un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje, por sus siglas en inglés), un oligonucleótido de captura a un CTO (Oligonucleótido de captura y molde, por sus siglas en inglés) y un tercer oligonucleótido a SO (Oligonucleótido de señalización, por sus siglas en inglés) u HO (Oligonucleótido de hibridación, por sus siglas en inglés), respectivamente. SO, HO, CTO, la cadena extendida o su combinación pueden desempeñar una función como oligonucleótido de detección.
La señal del dúplex formado de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de mediación incluye la señal proporcionada por la inhibición de la formación de otro dúplex por el dúplex formado de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de mediación (por ejemplo, PCE-NH).
Por ejemplo, cuando la señal del dúplex formado de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de mediación se genera mediante el método de PTOCE, el medio de generación de señales comprende un oligonucleótido en dirección 5' y un PTO (Oligonucleótido de sondeo y marcaje) que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, un CTO (Oligonucleótido de captura y molde), un marcador adecuado y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde que tiene actividad nucleasa 5'. El PTO comprende (i) una porción de direccionamiento 3' que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y (ii) una porción de marcaje 5' que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana. El CTO comprende en una dirección de 3' a 5' (i) una porción de captura que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a la porción de marcaje 5' o una parte de la porción de marcaje 5' del PTO y (ii) una porción de molde que comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la porción de marcaje 5' y la porción de direccionamiento 3' del PTO.
El ejemplo particular de la generación de señales mediante un método de PTOCE comprende las etapas de:
(a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el oligonucleótido en dirección 5' y el PTO; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene actividad nucleasa 5' en condiciones para la escisión del PTO; en donde el oligonucleótido en dirección 5' o su cadena extendida induce la escisión del PTO por la enzima que tiene actividad nucleasa 5' de manera que la escisión libera un fragmento que comprende la porción marcada en 5' o una parte de la porción marcada en 5' del PTO; (c) hibridar el fragmento liberado del PTO con el CTO; en donde el fragmento liberado del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO; y (d) realizar una reacción de extensión usando el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde; en donde el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende y se forma un dúplex extendido; en donde el dúplex extendido tiene un valor de Tf ajustable por (i) una secuencia y/o longitud del fragmento, (ii) una secuencia y/o longitud del CTO o (iii) la secuencia y/o longitud del fragmento y la secuencia y/o longitud del CTO; en donde el dúplex extendido proporciona una señal diana mediante (i) al menos un marcador unido al fragmento y/o al CTO, (ii) un marcador incorporado al dúplex extendido durante la reacción de extensión, (iii) un marcador incorporado en el dúplex extendido durante la reacción de extensión y un marcador unido al fragmento y/o al CTO, o (iv) un marcador intercalante; y (e) detectar el dúplex extendido midiendo la señal diana a una temperatura predeterminada para que el dúplex extendido mantenga su forma bicatenaria, por lo que la presencia del dúplex extendido indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana. En este caso, el método comprende además repetir todas o algunas de las etapas (a)-(e) con desnaturalización entre ciclos repetidos.
En la expresión "desnaturalización entre ciclos repetidos", el término "desnaturalización" significa separar una molécula de ácido nucleico bicatenario en una molécula de ácido nucleico monocatenario.
En la etapa (a) del método de PTOCE, se puede usar un conjunto de cebadores para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana en lugar del oligonucleótido en dirección 5'. En este caso, el método comprende además repetir todas o algunas de las etapas (a)-(e) con desnaturalización entre ciclos repetidos.
El método de PTOCE se puede clasificar como un proceso en el que el fragmento de PTO hibridado con el CTO se extiende para formar una cadena extendida y después se detecta la cadena extendida. El método de PTOCE se caracteriza porque la formación de la cadena extendida se detecta usando el dúplex entre la cadena extendida y el CTO.
Existe otro método para detectar la formación de la cadena extendida. Por ejemplo, la formación de la cadena extendida se puede detectar usando un oligonucleótido hibridado específicamente con la cadena extendida (por ejemplo, método de PCE-SH). En este método, la señal puede provenir de (i) un marcador unido al oligonucleótido hibridado específicamente con la cadena extendida, (ii) un marcador unido al oligonucleótido hibridado específicamente con la cadena extendida y un marcador unido al fragmento de PTO, (iii) un marcador unido al oligonucleótido hibridado específicamente con la cadena extendida y un marcador incorporado en la cadena extendida durante la reacción de extensión, o (iv) un marcador unido al oligonucleótido hibridado específicamente con la cadena extendida y un colorante intercalante. Como alternativa, la señal puede provenir de (i) un marcador unido a la cadena extendida o (ii) un colorante intercalante.
Como alternativa, la detección de la formación de la cadena extendida se realiza mediante otro método en el que se detecta la inhibición de la hibridación entre el CTO y un oligonucleótido que se puede hibridar específicamente con el CTO (por ejemplo, método de PCE-NH). Se considera que dicha inhibición es indicativa de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana. La señal puede provenir de (i) un marcador unido al oligonucleótido que se puede hibridar con el CTO, (ii) un marcador unido al CTO, (iii) un marcador unido al oligonucleótido que se puede hibridar con el CTO y un marcador unido al CTO, o (iv) un marcador intercalante.
De acuerdo con una realización, el oligonucleótido que se puede hibridar específicamente con el CTO tiene una secuencia superpuesta con el fragmento de PTO.
De acuerdo con una realización, el oligonucleótido de detección incluye el oligonucleótido que se puede hibridar específicamente con la cadena extendida (por ejemplo, método de PCE-SH) y el oligonucleótido que se puede hibridar específicamente con el CTO (por ejemplo, método de PCE-NH). De acuerdo con una realización, el oligonucleótido de detección incluye la cadena extendida producida durante una reacción o CTO.
Los métodos basados en PTOCE habitualmente implican la formación de la cadena extendida dependiendo de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana. La expresión "método basado en PTOCE" se usa en el presente documento con la intención de abarcar diversos métodos para proporcionar señales que comprenden la formación de una cadena extendida a través de escisión y extensión de PTO.
El ejemplo de generación de señales mediante los métodos basados en PTOCE comprende las etapas de: (a) hibridar la secuencia de ácido nucleico diana con el oligonucleótido en dirección 5' y el PTO; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene actividad nucleasa 5' en condiciones para la escisión del PTO; en donde el oligonucleótido en dirección 5' o su cadena extendida induce la escisión del PTO por la enzima que tiene actividad nucleasa 5' de manera que la escisión libera un fragmento que comprende la porción marcada en 5' o una parte de la porción marcada en 5' del PTO; (c) hibridar el fragmento liberado del PTO con el CTO; en donde el fragmento liberado del PTO se hibrida con la porción de captura del CTO; (d) realizar una reacción de extensión usando el resultado de la etapa (c) y una polimerasa de ácido nucleico dependiente de molde; en donde el fragmento hibridado con la porción de captura del CTO se extiende para formar una cadena extendida; y (e) detectar la formación de la cadena extendida mediante la detección de la señal generada dependiendo de la presencia de la cadena extendida. En la etapa (a), se puede usar un conjunto de cebadores para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana en lugar del oligonucleótido en dirección 5'. En este caso, el método comprende además repetir todas o algunas de las etapas (a)-(e) con desnaturalización entre ciclos repetidos.
De acuerdo con una realización, la señal generada por la formación de un dúplex incluye señales inducidas por la hibridación del dúplex (por ejemplo, hibridación del dúplex en sí o hibridación de un tercer oligonucleótido) o por la inhibición de la hibridación de un tercer oligonucleótido debido a la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los dos medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección.
Particularmente, la señal se genera por hibridación del oligonucleótido de detección con una secuencia de ácido nucleico diana y después escisión del oligonucleótido de detección.
La señal por hibridación del oligonucleótido de detección con una secuencia de ácido nucleico diana y después escisión del oligonucleótido de detección se puede generar mediante diversos métodos, incluyendo el método de sonda TaqMan (Patente de los EE.UU. N.° 5.210.015 y Patente de los EE.UU. N.° 5.538.848).
Cuando la señal se genera mediante el método de sonda TaqMan, el medio de generación de señales incluye un conjunto de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana, teniendo la sonda TaqMan un marcador adecuado (por ejemplo, un marcador dual interactivo) y una polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa-5'. La sonda TaqMan hibridada con una secuencia de ácido nucleico diana se escinde durante la amplificación de la diana y genera una señal que indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
El ejemplo particular de generación de señal mediante el método de sonda TaqMan comprende la etapa de: (a) hibridar el conjunto de cebadores y la sonda TaqMan que tiene un marcador adecuado (por ejemplo, un marcador dual interactivo) con la secuencia de ácido nucleico diana; (b) amplificar la secuencia de ácido nucleico diana usando el resultado de la etapa (a) y la polimerasa de ácido nucleico que tiene actividad nucleasa-5', en donde la sonda TaqMan se escinde para liberar el marcador; y (c) detectar una generación de señales a partir del marcador liberado.
Particularmente, la señal se genera mediante escisión del oligonucleótido de detección de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando un oligonucleótido de mediación hibridado con secuencias de ácidos nucleicos diana se escinde para liberar un fragmento, el fragmento se hibrida específicamente con un oligonucleótido de detección y el fragmento induce la escisión del oligonucleótido de detección.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando un oligonucleótido de mediación hibridado con secuencias de ácidos nucleicos diana se escinde para liberar un fragmento, el fragmento se extiende para escindir un oligonucleótido de detección que comprende una secuencia de nucleótidos de hibridación complementaria al oligonucleótido de captura.
La señal por escisión del oligonucleótido de detección de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de mediación se puede generar mediante diversos métodos, incluyendo el ensayo Invader (Patente de los EE.UU. N.° 5.691.142), el método de PCEC (Escisión dependiente de la escisión y extensión de PTO, por sus siglas en inglés) (documento WO 2012/134195) y un método descrito en la Patente de los EE.UU. N.° 7.309.573. En particular, el método descrito en la Patente de los EE.UU. N.° 7.309.573 puede considerarse como uno de los métodos basados en PTOCE que usan la generación de señales mediante escisión, y en el método, la formación de la cadena extendida puede detectarse detectando la escisión de un oligonucleótido hibridado específicamente con el CTO mediante la formación de la cadena extendida. El ensayo Invader forma un fragmento mediante la escisión de un oligonucleótido de mediación e induce reacciones de escisión sucesivas sin extensión del fragmento.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando la señal se genera de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección, la escisión del oligonucleótido de detección induce cambios de señal o libera un fragmento marcado que se ha de detectar.
Cuando un medio de generación de señales genera una señal simultáneamente mediante escisión de un oligonucleótido de detección y mediante la formación de un dúplex, el medio de generación de señales se puede considerarse como un medio de generación de señales que proporciona señal por escisión, siempre y cuando se use para generar señal mediante escisión.
De acuerdo con una realización, la generación de señales que es de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección se usa para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Cuando la señal se genera por escisión del oligonucleótido de detección, un marcador liberado por la escisión se puede detectar a cualesquier temperaturas. Por consiguiente, la señal generada por escisión del oligonucleótido de detección no se puede emplear para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja que requiere temperaturas de detección restringidas.
De acuerdo con una realización, la generación de señales que es dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección se usa únicamente para una secuencia de ácido nucleico diana. Cuando la generación de señales que es dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección se usa para ambas de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana, es posible que las dos secuencias de ácidos nucleicos diana no se detecten de manera diferencial dependiendo de las temperaturas de detección.
De acuerdo con la realización de la presente invención, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex.
De acuerdo con la realización de la presente invención, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, el oligonucleótido de detección comprende al menos un marcador.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el oligonucleótido de detección puede estar compuesto por al menos un oligonucleótido. De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando el oligonucleótido de detección está compuesto por una pluralidad de oligonucleótidos, puede tener un marcador de diversas maneras. Por ejemplo, un oligonucleótido entre una pluralidad de oligonucleótidos puede tener al menos un marcador, una pluralidad de oligonucleótidos pueden tener todos al menos un marcador, o una porción de oligonucleótidos puede tener al menos un marcador y la otra porción puede no tener un marcador.
Las señales generadas por los dos medios de generación de señales no se diferencian por un único tipo de detector. La expresión "señales no diferenciadas por un único tipo de detector" significa que un único tipo de detector no diferencia las señales entre sí debido a sus propiedades de señal idénticas o sustancialmente idénticas (por ejemplo, propiedades ópticas, longitud de onda de emisión y señal eléctrica). Por ejemplo, cuando se usa el mismo marcador (por ejemplo, FAM) para dos secuencias de ácidos nucleicos diana y se usa un único tipo de detector para la detección de la longitud de onda de emisión de FAM, las señales no se detectan de manera diferencial.
La expresión utilizada en el presente documento "un único tipo de señal" significa señales que proporcionan propiedades de señal idénticas o sustancialmente idénticas (por ejemplo, propiedades ópticas, longitud de onda de emisión y señal eléctrica). Por ejemplo, FAM y CAL Fluor 610 proporcionan diferentes tipos de señales.
La expresión utilizada en el presente documento "un único tipo de detector" significa un medio de detección para un único tipo de señal. En un detector que comprende varios canales (por ejemplo, fotodiodos) para varios tipos diferentes de señales, cada canal (por ejemplo, un fotodiodo) corresponde a "un único tipo de detector".
De acuerdo con la presente invención, los dos medios de generación de señales comprenden un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales del marcador.
El único marcador es un marcador fluorescente. Los tipos y sitios de unión preferibles de los únicos marcadores fluorescentes utilizados en la presente invención se describen en las Patentes de los EE.UU. N.° 7.537.886 y 7.348.141. Por ejemplo, el único marcador fluorescente incluye JOE, FAM, TAMRA, ROX y marcador a base de fluoresceína. El único marcador puede unirse a oligonucleótidos mediante diversos métodos. Por ejemplo, el marcador se une a las sondas a través de un espaciador que contiene átomos de carbono (por ejemplo, espaciador de 3 carbonos, espaciador de 6 carbonos o espaciador de 12 carbonos).
Como representante del sistema de marcador interactivo, el sistema de marcadores FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) incluye una molécula indicadora fluorescente (molécula donante) y una molécula desactivadora (molécula aceptora). En FRET, el donante de energía es fluorescente, pero el aceptor de energía puede ser fluorescente o no fluorescente. En otra forma de sistemas de marcadores interactivos, el donante de energía no es fluorescente, por ejemplo, un cromóforo, y el aceptor de energía es fluorescente. En otra forma más de sistemas de marcadores interactivos, el donante de energía es luminiscente, por ejemplo, bioluminiscente, quimioluminiscente, electroquimioluminiscente y el aceptor es fluorescente. El sistema de marcador interactivo incluye un marcador dual basado en "desactivación mediada por contacto" (Salvatoreet al., Nucleic Acids Research,2002 (30) n.° 21 e122 y Johanssonet al., J. AM. CHEM. SOC2002 (124) págs. 6950-6956).
La molécula indicadora y la molécula desactivadora útiles en la presente invención pueden incluir cualquier molécula conocida en la técnica.
Preferentemente, la molécula indicadora y la molécula desactivadora incluyen JOE, FAM, TAMRA, ROX y marcador a base de fluoresceína.
Se desvelan una molécula de fluorescencia adecuada y pares de indicador-desactivador adecuados en una diversidad de publicaciones como las que siguen: Pesceet al.,editores,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker, Nueva York, 1971); Whiteet al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach(Marcel Dekker, Nueva York, 1970); Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2a Edición (Academic Press, Nueva York, 1971); Griffiths,Color AND Constitution of Organic Molecules(Academic Press, Nueva York, 1976); Bishop, editor,Indicators(Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim,Fluorescence and Phosphorescence(Interscience Publishers, Nueva York, 1949); Haugland, R. P.,Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals,6a Edición (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996), Patentes de los EE.UU. N.° 3.996.345 y 4.351.760.
Cabe destacar que en la presente invención se puede usar una molécula desactivadora no fluorescente (por ejemplo, desactivador negro o desactivador oscuro) capaz de extinguir una fluorescencia de una amplia gama de longitudes de onda o una longitud de onda específica.
En el sistema de señalización que comprende las moléculas indicadora y desactivadora, el indicador abarca un donante de FRET y el desactivador abarca al otro compañero (aceptor) de FRET. Por ejemplo, se usa un colorante de fluoresceína como indicador y un colorante de rodamina como desactivador.
El marcador dual interactivo puede estar unido a una cadena de un dúplex. Cuando la cadena que contiene el marcador dual interactivo sale en un estado monocatenario, forma una estructura de horquilla o de enrollamiento aleatorio para inducir la desactivación entre el marcador dual interactivo. Cuando la cadena forma un dúplex, se alivia la desactivación. Como alternativa, cuando el marcador dual interactivo está unido a nucleótidos ubicados adyacentemente en la cadena, se produce la desactivación entre el marcador dual interactivo. Cuando la cadena forma un dúplex y después se escinde, la desactivación se alivia.
Cada uno de los marcadores duales interactivos puede estar unido a cada una de las dos cadenas del dúplex. La formación del dúplex induce la desactivación y la desnaturalización del dúplex induce la desdesactivación. Como alternativa, cuando se escinde una de las dos cadenas, se puede inducir la desactivación.
El marcador de incorporación puede usarse en un proceso para generar señales incorporando un marcador durante la extensión del cebador (por ejemplo, método Plexor, Sherrill C B,et al., Journal of the American Chemical Society,126: 4550-45569(2004)). El marcador de incorporación también puede usarse en una generación de señales mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado con la secuencia de ácido nucleico diana.
El marcador de incorporación puede estar generalmente unido a nucleótidos. También se puede usar el nucleótido que tiene una base no natural.
La expresión utilizada en el presente documento "base no natural" se refiere a derivados de bases naturales tales como adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) y uracilo (U), que son capaces de formar pares de bases por enlaces de hidrógeno. La expresión utilizada en el presente documento "base no natural" incluye bases que tienen diferentes patrones de emparejamiento de bases con respecto a las bases naturales como compuestos madre, como se describe, por ejemplo, en las Patentes de los EE.UU. N.° 5.432.272, 5.965.364, 6.001.983 y 6.037.120. El emparejamiento de bases entre bases no naturales implica dos o tres enlaces de hidrógeno como bases naturales. El emparejamiento de bases entre bases no naturales también se forma de manera específica. Los ejemplos específicos de bases no naturales incluyen las siguientes bases en combinaciones de pares de bases: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J y M/N (véase la Patente de los EE.UU. N.° 7.422.850).
Cuando la señal se genera mediante el método de PTOCE, un nucleótido incorporado durante la reacción de extensión puede tener una primera base no natural y el CTO puede tener un nucleótido que tenga una segunda base no natural con una afinidad de unión específica a la primera base no natural.
La expresión utilizada en el presente documento "ácido nucleico diana", "secuencia de ácido nucleico diana" o "secuencia diana" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de interés para detección o cuantificación. La secuencia de ácido nucleico diana comprende una secuencia en una cadena sencilla así como en una doble cadena. La secuencia de ácido nucleico diana comprende una secuencia inicialmente presente en una muestra de ácido nucleico, así como una secuencia recién generada en reacciones.
La secuencia de ácido nucleico diana puede incluir cualesquier moléculas de ADN (ADNg y ADNc), ARN sus híbridos (ácido nucleico quimera). La secuencia puede estar en forma bicatenaria o monocatenaria. Cuando el ácido nucleico como material de partida es bicatenario, se prefiere convertir las dos cadenas en una forma monocatenaria o parcialmente monocatenaria. Los métodos conocidos para separar cadenas incluyen, pero sin limitación, tratamiento con calentamiento, álcali, formamida, urea y glicoxal, métodos enzimáticos (por ejemplo, acción de helicasa) y proteínas de unión. Por ejemplo, la separación de cadenas se puede lograr calentando a una temperatura que varía de 80 °C a 105 °C. Joseph Sambrook,et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) proporciona métodos generales para lograr este tratamiento.
Cuando se emplea un ARNm como material de partida, es necesaria una etapa de transcripción inversa antes de realizar la etapa de hibridación, cuyos detalles se encuentran en Joseph Sambrook,et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); y Noonan, K. F.et al., Nucleic Acids Res.16: 10366 (1988)). Para la transcripción inversa, se puede usar un cebador oligonucleotídico dT hibridable con la cola poli A del ARNm, cebadores aleatorios o cebadores específicos de diana.
La secuencia de ácido nucleico diana incluye cualquier ácido nucleico de origen natural procariota, eucariota (por ejemplo, de protozoos y parásitos, hongos, levaduras, plantas superiores, animales inferiores y superiores, incluyendo mamíferos y seres humanos), vírico (por ejemplo, virus del herpes, VIH, virus de la gripe, virus de Epstein-Barr, virus de la hepatitis, virus de la polio, etc.) o viroide. La molécula de ácido nucleico también puede ser cualquier molécula de ácido nucleico que se haya producido o se pueda producir de forma recombinante o sintetizar químicamente. Por lo tanto, la secuencia de ácido nucleico puede encontrarse o no en la naturaleza. La secuencia de ácido nucleico diana puede incluir secuencias conocidas o desconocidas.
El término utilizado en el presente documento "muestra" se refiere a cualquier célula, tejido o fluido de una fuente biológica, o cualquier otro medio que pueda evaluarse ventajosamente de acuerdo con la presente invención, incluyendo virus, bacterias, tejido, célula, sangre, suero, plasma, linfa, leche, orina, heces, líquido ocular, saliva, semen, extractos de cerebro, fluido de la médula espinal (FME), apéndice, extractos de tejido de bazo y amígdala, líquido amniótico, líquido ascítico y muestras no biológicas (por ejemplo, alimentos y agua). Además, la muestra incluye moléculas de ácido nucleico naturales aisladas de fuentes biológicas y moléculas de ácido nucleico sintéticas.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal simultáneamente con una amplificación de ácido nucleico.
En la presente invención, la señal generada por medios de generación de señales puede amplificarse simultáneamente con la amplificación de la diana. Como alternativa, la señal puede amplificarse sin amplificación de la diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la generación de señales se realiza en un proceso que implica la amplificación de la señal junto con la amplificación de la diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la amplificación de la diana se realiza de acuerdo con la PCR (reacción en cadena de la polimerasa). La PCR se emplea ampliamente para la amplificación de la diana en la técnica, incluyendo ciclos de desnaturalización de una secuencia diana, hibridado (hibridación) entre la secuencia diana y los cebadores y la extensión de cebador (Mulliset al.Patentes de los EE.UU. N.° 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159; Saikiet al.,(1985)Science230, 1350-1354). La señal se puede amplificar aplicando los métodos de generación de señales descritos anteriormente (por ejemplo, el método TaqMan y los métodos basados en PTOCE) al proceso de PCR. De acuerdo con una realización, la presente invención proporciona señales mediante el método de PCR en tiempo real. De acuerdo con una realización, la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana se realiza mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), lCr (reacción en cadena de la ligasa), véase Wiedmann M,et al., "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications". PCR Methods and Applications,febrero de 1994; 3 (4): S51-64), GLCR (LCR de relleno de huecos, véanse los documentos WO 90/01069, EP 439182 y WO 93/00447), Q-beta (amplificación de Q-beta replicasa, véase Cahill P,et al., Clin Chem.,37(9): 1482-5 (1991), Patente de los EE.UU. N.° 5556751), SDA (amplificación por desplazamiento de cadena, véase G T Walkeret al., Nucleic Acids Res.
20(7): 16911696 (1992), documento EP 497272), NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, véase Compton,J. Nature350(6313): 912(1991)), TMA (amplificación mediada por transcripción, véase Hofmann WPet al., J Clin Virol.32(4): 289-93(2005); Patente de los EE.UU. N.° 5888779)) o Rc A (amplificación de círculo rodante, véase Hutchison C.A.et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA.102: 1733217336(2005)).
Los métodos de amplificación descritos anteriormente pueden amplificar secuencias diana mediante la repetición de una serie de reacciones con o sin cambios de temperatura. La unidad de amplificación que comprende la repetición de una serie de reacciones se expresa como "ciclo". La unidad de ciclos se puede expresar como el número de repeticiones o el tiempo, dependiendo de los métodos de amplificación.
Por ejemplo, la detección de señales se puede realizar en cada ciclo de amplificación, varios ciclos selectos o puntos finales de reacciones. De acuerdo con una realización, cuando las señales se detectan en al menos dos ciclos, la detección de señales en un ciclo individual se puede realizar a todas las temperaturas de detección o en algunas temperaturas de detección seleccionadas. De acuerdo con una realización de la presente invención, la detección se realiza a la temperatura de detección relativamente alta en ciclos con números impares y a la temperatura de detección relativamente alta en ciclos con números pares.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la incubación se realiza en condiciones que permiten la amplificación de la diana así como la generación de señales por los medios de generación de señales.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal sin amplificación de ácido nucleico.
Cuando la señal se genera mediante métodos que incluyen la escisión de un oligonucleótido, la señal puede amplificarse sin amplificación de la diana. Por ejemplo, la etapa (a) se puede realizar con amplificación de señales pero sin amplificación de secuencias diana de acuerdo con el método<c>P<t>(Duck P,et al., Biotechniques,9: 142-148 (1990)), ensayo Invader (Patentes de los EE.UU. N.° 6.358.691 y 6.194.149), métodos basados en PTOCE (por ejemplo, método de PCE-SH, método de PCE-NH y método de PCEC) o método de CER (documento WO 2011/037306).
Los métodos de amplificación de señales descritos anteriormente pueden amplificar señales a través de la repetición de una serie de reacciones con o sin cambios de temperatura. La unidad de amplificación de señal que comprende la repetición de una serie de reacciones se expresa como "ciclo". La unidad de ciclos se puede expresar como el número de repeticiones o el tiempo, dependiendo de los métodos de amplificación.
Por ejemplo, la generación y detección de señales se puede realizar en cada ciclo de amplificación, varios ciclos selectos o puntos finales de reacciones.
La amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana se logra por medios de amplificación de la diana que incluyen un conjunto de cebadores para la amplificación y una polimerasa de ácido nucleico.
De acuerdo con una realización de la presente invención, se puede usar una polimerasa de ácido nucleico que tenga actividad nucleasa (por ejemplo, actividad nucleasa 5' o actividad nucleasa 3'). De acuerdo con una realización de la presente invención, se puede usar una polimerasa de ácido nucleico que no tenga actividad nucleasa.
La polimerasa de ácido nucleico útil en la presente invención es una ADN polimerasa termoestable obtenida de una diversidad de especies bacterianas, incluyendoThermus aquaticus(Taq),Thermus thermophilus(Tth),Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, especie de Thermus Z05, Especie de Thermus sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pirophilusyAquifex aeolieus.Particularmente, la ADN polimerasa termoestable es la polimerasa Taq.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana se logra mediante una PCR asimétrica. La relación de cebadores se puede seleccionar teniendo en cuenta la escisión o hibridación de oligonucleótidos en dirección 3'.
Durante o después de la incubación (reacción) de la muestra con dos medios de generación de señales para generar señal, la señal generada se detecta mediante el uso de un único tipo de detector.
Una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana tiene una temperatura de detección relativamente alta y la otra tiene una temperatura de detección relativamente baja determinadas por los medios de generación de señales correspondientes.
La expresión utilizada en el presente documento "una secuencia de ácido nucleico diana tiene una temperatura de detección determinada por los medios de generación de señales correspondientes" se refiere a que una secuencia de ácido nucleico diana es detectable a una temperatura de detección preasignada a la secuencia de ácido nucleico diana que permite detectar una señal generada a partir de un medio de generación de señales diseñado para generar la señal a la temperatura de detección.
De acuerdo con una realización de la presente invención, a una secuencia de ácido nucleico diana se le asigna una temperatura de detección determinada por la correspondiente generación de señales.
La temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, y la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
Una de las características de la presente invención es determinar de manera diferencial la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana detectando a diferentes temperaturas de detección señales indicativas de la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana.
De acuerdo con una realización, las temperaturas de detección para secuencias de ácidos nucleicos diana están predeterminadas al considerar que un intervalo de temperatura permite la generación de señales por los medios de generación de señales.
La presente invención utiliza que existe un intervalo determinado de temperatura para permitir la generación de señales de manera dependiente de los medios de generación de señales.
Por ejemplo, cuando un medio de generación de señales genera una señal tras la hibridación (o asociación) entre dos moléculas de ácido nucleico y no genera una señal tras la no hibridación (o disociación) entre ellas, se genera una señal a temperaturas que permiten la hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico, no obstante, no se genera ninguna señal a temperaturas que no logran hibridar entre dos moléculas de ácido nucleico. Como tal, existe un intervalo determinado de temperatura para permitir la generación de señales (es decir, detección de señales) y otros intervalos de temperatura que no permiten la generación de señales. Los intervalos de temperatura se ven afectados por el valor de Tf del híbrido de las dos moléculas de ácido nucleico empleadas en los medios de generación de señales.
Cuando se emplea el método de generación de señales usando un fragmento liberado con un marcador después de la escisión, en teoría, la señal puede detectarse a cualquier temperatura (por ejemplo, 30-99 °C).
Se selecciona una temperatura de detección del intervalo de temperatura para permitir la generación de señales por el medio de generación de señales.
La expresión "el intervalo de temperatura de detección" se usa en el presente documento para describir particularmente el intervalo de temperatura para permitir la generación de señales (es decir, detección de señales).
Cuando existen diferentes intervalos de temperatura de detección dependiendo de los medios de generación de señales para las dos secuencias de ácidos nucleicos diana, se puede seleccionar un intervalo de temperatura de detección no superpuesto como la temperatura de detección relativamente alta. Una secuencia de ácido nucleico diana detectada los medios de generación de señales que proporciona la temperatura de detección relativamente alta se determina como la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Se puede seleccionar un intervalo de temperatura de detección superpuesto como la temperatura de detección relativamente baja. Una secuencia de ácido nucleico diana detectada por los medios de generación de señales que proporciona la temperatura de detección relativamente baja y que no proporciona la temperatura de detección relativamente alta se determina como la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, la región sin superposición y la región de superposición pueden no diferenciarse claramente entre sí. Por ejemplo, una señal proporcionada por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se puede generar con una intensidad mucho menor a la temperatura de detección relativamente alta seleccionada para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. En tal caso, un problema de señal falsa debido a una señal proporcionada por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja a la temperatura de detección relativamente alta se puede superar seleccionando adecuadamente un valor de referencia para determinar la importancia de las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta.
De acuerdo con una realización, las temperaturas de detección se pueden predeterminar considerando el intervalo de temperatura de detección no superpuesto y el intervalo de temperatura de detección superpuesto entre las temperaturas de detección.
De acuerdo con una realización, las temperaturas de detección asignadas a las secuencias de ácidos nucleicos diana difieren en al menos 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 15 °C o 20 °C entre sí.
De acuerdo con la presente invención, se puede asignar una temperatura para detectar la presencia de cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana considerando los medios de generación de señales.
De acuerdo con una realización de la presente invención, a una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se le asigna una temperatura de detección relativamente alta y a la otra se le asigna una temperatura de detección relativamente baja, y después se construyen medios de generación de señales adecuados para las temperaturas de detección, seguido de la realización de la etapa (a).
De acuerdo con una realización, la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja a las que se realiza la detección pueden estar predeterminadas. Por ejemplo, la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja están predeterminadas como 72 °C y 60 °C, respectivamente, y después se construyen medios de generación de señales adecuados para las temperaturas de detección, seguido de la realización de la etapa (a).
De acuerdo con una realización, en primer lugar se construyen medios de generación de señales para las dos secuencias de ácidos nucleicos diana y después se asignan temperaturas de detección para las dos secuencias de ácidos nucleicos diana, seguido de la realización de la etapa (a).
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando los medios de generación de señales generan una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex, la temperatura de detección se selecciona basándose en un valor de Tf del dúplex.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando los medios de generación de señales generan una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex, la temperatura de detección es controlable ajustando un valor de Tf del dúplex.
Por ejemplo, cuando la señal se genera mediante un oligonucleótido de detección hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, sonda Lux, sonda de Baliza molecular, sonda HyBeacon y sonda de hibridación adyacente), la detección de la señal se realiza satisfactoriamente a la temperatura predeterminada ajustando el valor de Tf del oligonucleótido. Cuando se usa el cebador Scorpion, la detección de la señal se realiza satisfactoriamente a la temperatura predeterminada ajustando el valor de Tf de una porción que se va a hibridar con la cadena extendida.
Cuando la señal es generada por el dúplex formado dependiendo de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana, la detección de la señal se realiza satisfactoriamente a la temperatura predeterminada ajustando el valor de Tf del dúplex. Por ejemplo, cuando la señal se genera mediante el método de PTOCE, la detección de la señal se realiza satisfactoriamente a la temperatura predeterminada ajustando el valor de Tf del dúplex extendido formado por la extensión del fragmento de PTO en el CTO.
Los métodos basados en PTOCE tienen ventajas para ajustar fácilmente los valores de Tf del dúplex o de un tercer híbrido cuya hibridación se ve afectada por el dúplex.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando el medio de generación de señales genera una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección, la temperatura de detección se selecciona arbitrariamente. Dicho de otro modo, se puede seleccionar cualquier temperatura siempre que pueda detectarse la señal generada por la escisión de un oligonucleótido de detección. Como se ha descrito anteriormente, cuando la señal se genera dependiendo de la escisión del oligonucleótido de detección, el marcador liberado por la escisión puede detectarse a diversas temperaturas.
De acuerdo con una realización, cuando la señal se genera dependiendo de la escisión del oligonucleótido de detección, la temperatura de detección se selecciona para que sea una temperatura de detección relativamente más alta.
Como se ha analizado anteriormente, la temperatura de detección se determina considerando un intervalo de temperatura de detección que depende de los medios de generación de señales. Por consiguiente, la detección de señales a una temperatura de detección determinada se puede describir de la siguiente manera: la detección a la temperatura de detección relativamente alta es para detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, y la detección a la temperatura de detección relativamente baja es para detectar tanto la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
Por ejemplo, cuando tanto las señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se generan mediante el método de PTOCE, la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se genera mediante un dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente alta, y la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se genera mediante un dúplex extendido que tiene un valor de Tf valor adecuado para la temperatura de detección relativamente baja. Cuando la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente alta, el dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente baja se disocia para estar en una única cadena y, por lo tanto, no se genera ninguna señal, detectando de este modo sólo la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Cuando la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente baja, todo el dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente alta y el dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente baja tienen su forma de dúplex, detectando de este modo tanto la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como para la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
En otro ejemplo, cuando la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se genera mediante el método TaqMan y la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se genera mediante el método de PTOCE, la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es proporcionada por un marcador fluorescente liberado y la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es proporcionada por un dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente baja. Cuando la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente alta, el dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente baja se disocia para estar en una única cadena y, por lo tanto, no se genera ninguna señal, detectando de este modo sólo la señal del marcador fluorescente liberado para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Cuando la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente baja, no sólo se detecta la señal proporcionada desde el dúplex extendido que tiene un valor de Tf adecuado para la temperatura de detección relativamente baja sino que también se detecta la señal del marcador fluorescente liberado, detectando de este modo tanto la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como para la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
El detector utilizado en la presente invención incluye cualquier medio capaz de detectar señales fluorescentes. Se pueden emplear como detectores fotodiodos adecuados para la detección de señales fluorescentes. La detección usando un único tipo de detector significa que la detección se realiza usando un detector capaz de detectar un único tipo de señal o usando cada canal (es decir, fotodiodo) de un detector que lleva varios canales (es decir, fotodiodos).
De acuerdo con una realización, la generación de señales incluye "generación o extinción de señales" y "aumento o disminución de señales" a partir de marcadores.
Etapa (b): Determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana
Después de la detección de la señal, la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se determina mediante la señal detectada en la etapa (a).
La presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta. La presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
Las señales utilizadas para determinar la presencia de la diana incluyen diversas características de la señal de la detección de la señal, por ejemplo, intensidad de señal [por ejemplo, valor de UFR (unidad relativa de fluorescencia) o en el caso de realizar amplificación, valores de UFR en un ciclo determinado, en ciclos seleccionados o en el punto final], la señal cambia de forma (o patrón) o valor de Ct, o valores obtenidos procesando matemáticamente las características.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando se obtiene una curva de amplificación mediante PCR en tiempo real, se pueden seleccionar diversos valores (o características) de señal de la curva de amplificación para la determinación de la presencia de la diana (intensidad, valor de Ct o datos de la curva de amplificación).
Las características de la señal obtenida a la temperatura de detección relativamente alta en sí se pueden usar para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
Como alternativa, se puede usar una señal modificada proporcionada mediante el procesamiento matemático de las características de la señal para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
Como alternativa, una o ambas señales a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja se pueden modificar procesando matemáticamente las características de la señal y usar para obtener la diferencia entre las señales a una temperatura de detección relativamente alta y una temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, el término "señal" junto con la expresión "señales detectadas a una temperatura de detección relativamente alta y una temperatura de detección relativamente baja" incluye no sólo la señal obtenida a la temperatura de detección en sí, sino también una señal modificada proporcionada mediante el procesamiento matemático de la señal.
De acuerdo con una realización, cuando se realiza el procesamiento matemático, las características de la señal deben ser características vulnerables al procesamiento matemático. En determinada realización, el procesamiento matemático incluye cálculo (por ejemplo, adición, multiplicación, resta y división) usando señales u obteniendo otros valores derivados de señales. Las señales utilizadas para la determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana en la presente invención generalmente son una señal significativa. Dicho de otro modo, las señales son señales que han de generarse dependiendo de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana. Al mismo tiempo, cuando se calcula la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, se pueden usar señales sin significación, tales como señales de fondo, para calcular la diferencia. A este respecto, se entendería que las señales utilizadas para la determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana abarcan no sólo señales con significación, sino también señales sin significación siempre que se puedan usar para calcular la diferencia o participar en un proceso de determinación.
La importancia de las señales detectadas se determina usando un valor umbral. Por ejemplo, un valor umbral está predeterminado a partir de un control negativo considerando las señales de fondo del detector, la sensibilidad o el marcador utilizado, y después se puede determinar la importancia de las señales de las muestras.
Cuando una señal (es decir, una señal significativa) se detecta a la temperatura de detección relativamente alta, se determina que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
La señal sin significación también se puede expresar en el presente documento como "ausencia de señal" o "no detección de señal".
La expresión utilizada en el presente documento "mediante una señal" junto con la determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana significa que la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana se determina usando la presencia/ausencia de señales y comparando la señal con un umbral. No se pretende distinguir entre las expresiones "mediante una señal" y "mediante el uso de una señal", y estas expresiones se usarán indistintamente.
La expresión utilizada en el presente documento "determinación mediante una señal" con referencia a la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta puede incluir determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta considerando la significación de la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta.
En la presente invención, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, usando un valor de referencia, en donde el valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
Cuando se detecta una señal a la temperatura de detección relativamente baja, dicha señal en sí no permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. La razón de esto es que la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se puede detectar a la temperatura de detección relativamente baja.
La característica de la presente invención es emplear la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta para analizar la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
Curiosamente, los presentes inventores han descubierto que cuando se detectan señales que indican la presencia de una única secuencia de ácido nucleico diana en un único recipiente de reacción a dos temperaturas de detección predeterminadas, hay un cambio de señal en un determinado patrón (regla).
Por ejemplo, un cambio de señal entre una señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y una señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta muestra un determinado patrón (regla). Por ejemplo, las intensidades de las señales pueden ser idénticas o sustancialmente idénticas entre sí o las intensidades de las señales pueden ser diferentes entre sí pero en un intervalo determinado a las dos temperaturas de detección.
La característica de la presente invención es adoptar los hallazgos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana.
Debido a que las señales para una secuencia de ácido nucleico diana en un único recipiente de reacción se detectan únicamente con diferentes temperaturas de detección (por ejemplo, sin cambio de cantidad de la diana o sin variación de las condiciones del tampón), existe un determinado patrón (regla) en el cambio de señal entre las dos temperaturas de detección. De acuerdo con un determinado patrón (regla) en el cambio de señal, la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta se puede utilizar para analizar la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, el presente método se realiza en una condición que permite un determinado patrón (regla) en un cambio de señal para una secuencia de ácido nucleico diana entre las dos temperaturas de detección.
La presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina de manera que la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja se analiza usando la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta con el fin de verificar si la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja contiene una señal proporcionada por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
El análisis de la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja usando la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta se realiza obteniendo una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y después analizándolo.
La presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
Por ejemplo, (i) cuando en la muestra solo está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, la señal se detecta tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja. Es probable que la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta sea diferente de la detectada a la temperatura de detección relativamente baja. Es muy probable que dicha diferencia esté dentro de un intervalo determinado porque todas las condiciones, excepto las temperaturas de detección, son comunes. Cuando la diferencia calculada para una muestra cae dentro de un intervalo determinado, la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja se debe solamente a la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Dicho de otro modo, se puede determinar que la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja está ausente en la muestra.
(ii) Cuando tanto la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta como la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja están presentes en una muestra, las señales se detectan tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja. La diferencia entre las señales se vuelve más distinguible que la diferencia en el caso (i) porque está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. La presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se puede determinar usando la diferencia.
(iii) Cuando en una muestra sólo está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente baja y no a la temperatura de detección relativamente alta. La ausencia de detección de señales a la temperatura de detección relativamente alta indica la ausencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, de manera que se puede reconocer que la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja se debe a la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, por lo que se puede determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Como alternativa, en el caso (iii), la diferencia se puede obtener usando una señal sin significación (por ejemplo, una señal de fondo) detectada a la temperatura de detección relativamente alta. En esta alternativa, es muy probable que la diferencia sea claramente diferente de la diferencia en el caso (i), por lo que se puede determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
La diferencia entre las señales detectadas a las temperaturas de detección se puede obtener de acuerdo con una amplia diversidad de enfoques.
El término utilizado en el presente documento "diferencia" junto con "mediante (o usando) la diferencia entre las señales" incluye no sólo una diferencia que se obtendrá procesando matemáticamente señales en sí o señales modificadas, sino también una diferencia debida a la presencia y ausencia de señales. Por ejemplo, la diferencia se puede obtener calculando la relación o resta entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja. Como alternativa, la diferencia se puede obtener modificando una señal a una temperatura de detección y comparándola con una señal a otra temperatura de detección. La diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja se puede expresar en diversos aspectos. Por ejemplo, la diferencia se puede expresar como valores numéricos, la presencia/ausencia de señal o gráfico con características de señal.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja comprende una diferencia que se obtiene procesando matemáticamente la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando la señal no se detecta a la temperatura de detección relativamente alta, la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se realiza mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja sin considerar ninguna detección de la señal a la temperatura de detección relativamente alta. Esta realización aborda que el uso de una diferencia debida a la presencia y ausencia de señales en las dos temperaturas de detección permite la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, una señal de fondo detectada a la temperatura de detección relativamente alta puede tratarse como "0" o "1" para calcular la diferencia.
De acuerdo con una realización, cuando se obtiene un valor negativo durante el cálculo, se convierte a valor absoluto y se usa para obtener la diferencia.
La señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un parámetro de cálculo para analizar la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Las señales para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja pueden tener diferentes dimensiones o unidades entre sí o tener las mismas dimensiones o unidades entre sí.
La expresión utilizada en el presente documento "determinada por una diferencia" incluye determinada por la ocurrencia/no ocurrencia de una diferencia, determinada por el valor o intervalo de una diferencia con un valor numérico y determinada por un resultado gráfico de la diferencia. Adicionalmente, "determinada por una diferencia" incluye la obtención de un valor (por ejemplo, Ct) para el ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente baja sobre la base de la diferencia.
La expresión utilizada en el presente documento "por una diferencia" junto con la determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana significa que la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana se determina usando o modificando directa o indirectamente la diferencia entre señales, incluyendo el uso de valores numéricos de una diferencia o sus modificaciones, usando la presencia/ausencia de señales y comparando una diferencia con un umbral. No existe ninguna distinción prevista entre las expresiones "por una diferencia" y "mediante el uso de una diferencia", y estas expresiones se usarán indistintamente.
El procesamiento matemático de las señales puede realizarse mediante diversos métodos de cálculo y sus modificaciones.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el procesamiento matemático de las señales para obtener la diferencia entre las señales es un cálculo de una relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta. De acuerdo con una realización de la presente invención, el procesamiento matemático de las señales para obtener la diferencia entre las señales es un cálculo de una relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
El término "relación" utilizado en el presente documento significa una relación entre dos números. Usando la relación, se puede determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Cuando la relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta es significativa, pasa a ser un indicador de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Por ejemplo, cuando la relación entre la intensidad del punto final de la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y la intensidad del punto final de la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta es significativa (por ejemplo, aumento en la intensidad del punto final), indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
El procesamiento matemático se puede realizar de diversas maneras.
El procesamiento matemático se puede realizar mediante el uso de una máquina. Por ejemplo, las señales pueden experimentar un procesamiento matemático mediante un procesador en un detector o dispositivo de PCR en tiempo real. Como alternativa, las señales pueden ser sometidas manualmente a un procesamiento matemático, particularmente de acuerdo con un algoritmo predeterminado.
Se emplea un umbral para analizar si la diferencia obtenida es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Por ejemplo, se predetermina un umbral considerando la diferencia obtenida a partir de una muestra patrón que contiene el ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y el ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Un control negativo, la sensibilidad o el marcador utilizados pueden considerarse adicionalmente para determinar el umbral.
De acuerdo con una realización de la presente invención, un umbral lo determina el usuario o se determina automáticamente.
En determinada realización, cuando las señales tienen un patrón (o regla) que muestra la diferencia dentro de un intervalo determinado, la señal a la temperatura de detección relativamente alta puede estar sujeta a modificación que refleje la diferencia en la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana.
El valor de referencia es un valor que refleja un patrón (regla) de un cambio de señal en las diferencias de temperatura.
El valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a).
Cuando la diferencia entre señales a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se vuelve mayor, es más ventajoso reducir los errores de detección en la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja usando el valor de referencia para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
El valor de referencia para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se usa en la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, cuando el valor de referencia para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta calculado a partir de las señales a las dos temperaturas de detección sea diferente en más del 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 2,5 %, el 3 %, el 3,5 %, el 4 %, el 4,5 %, el 5 %, el 5,5 %, el 6 %, el 6,5 %, el 7 %, el 7,5 %, el 8 %, el 8,5 %, el 9 %, el 9,5 %, el 10 %, el 12 %, el 15 %, el 20 % o el 30 % en comparación con el valor de referencia para el caso en que las dos señales sean iguales.
Se usa un valor de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja. El valor de referencia está relacionado con la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
El valor de referencia se emplea para analizar si la diferencia obtenida es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con la presente invención, se usa un valor de referencia como umbral con o sin modificación del valor. Las expresiones utilizadas en el presente documento "umbral" y "valor de referencia" para determinar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante el análisis de la diferencia entre señales pueden tener el mismo valor o significado.
Cuando el valor de referencia se emplea para obtener la diferencia entre una señal a la temperatura de detección relativamente alta y una señal a la temperatura de detección relativamente baja, se usa un umbral adicional para determinar la significación de la diferencia, es decir, para determinar si la diferencia indica la presencia del ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Cuando está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, el valor de referencia se usa para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
El caso en el que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta incluye un caso en el que se detecta una señal significativa indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
De acuerdo con una realización, cuando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta está ausente, el valor de referencia se usa opcionalmente para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
El caso en el que la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta está ausente incluye un caso en el que sólo se detecta una señal con intensidad similar a una señal de fondo.
El método usa un valor de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, obtenido (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja obtenida en (iii) anterior es un valor y el valor se usa como valor de referencia con modificación o sin modificación.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se obtiene calculando la relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, los métodos de cálculo para la diferencia de señales de una muestra y la diferencia para obtener un valor de referencia pueden ser iguales o diferentes entre sí. Por ejemplo, el primero puede realizarse mediante resta de las dos señales y el segundo mediante división de las dos señales. Como alternativa, el primero y el segundo se pueden realizar dividiendo las dos señales para obtener una relación.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los medios de generación de señales para el valor de referencia pueden ser los mismos que para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana.
Para una secuencia de ácido nucleico diana, los valores de referencia se pueden obtener en diversas condiciones de reacción, incluyendo la cantidad de componente (por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico diana, medios de generación de señales, enzimas o dNTP), pH del tampón o tiempo de reacción. De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se puede obtener en condiciones de reacción suficientes para proporcionar una señal saturada al finalizar la reacción. De acuerdo con una realización de la presente invención, la diferencia entre las señales obtenidas al calcular el valor de referencia tiene un intervalo determinado y el valor de referencia se selecciona dentro del intervalo determinado o con referencia al intervalo determinado. De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se puede seleccionar con el valor máximo o mínimo del intervalo determinado o con referencia al valor máximo o mínimo del intervalo determinado. Particularmente, el valor de referencia podrá modificarse considerando la variación estándar de los valores de referencia obtenidos en diversas condiciones, intervalos de error aceptables, especificidad o sensibilidad.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los valores de referencia se pueden obtener en condiciones de reacción idénticas a las utilizadas para la muestra, incluyendo los componentes (enzimas o cebadores de amplificación, si se usan), pH del tampón, proceso de reacción. De acuerdo con una realización de la presente invención, los valores de referencia se pueden obtener con un proceso de amplificación de señal simultáneamente con o sin una amplificación de ácido nucleico.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando hay una diferencia significativa entre el valor de referencia y la diferencia obtenida para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, entonces se determina que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. El valor de referencia se puede expresar con el mismo tipo de valor que la diferencia obtenida para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja (por ejemplo, relación de valores de punto final de intensidades de señal).
En un ejemplo particular, cuando la relación entre el valor del punto final de la intensidad de señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y el valor del punto final de la intensidad de señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja es de 1,8 y el valor de referencia es de 1,1, se puede determinar que existe una diferencia significativa entre el valor de referencia y la diferencia obtenida para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, cuando la diferencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es igual o mayor al valor de referencia, entonces se determina que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, cuando la diferencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es igual o inferior al valor de referencia, entonces se determina que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Como alternativa, el valor de referencia se puede usar para calcular la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja. Por ejemplo, la diferencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se calcula de manera que la señal (por ejemplo, UFR) detectada a la temperatura de detección relativamente alta se multiplica (o divide) por el valor de referencia de la secuencia de ácido nucleico diana, que tiene la temperatura de detección relativamente alta y después el resultado de la multiplicación (o división) se resta con la señal (por ejemplo, UFR) detectada a la temperatura de detección relativamente baja. Cuando una diferencia es superior (o inferior) a"0" oun valor predeterminado, se puede determinar que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Otro ejemplo, la diferencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se calcula de manera que la señal (por ejemplo, UFR) detectada a la temperatura de detección relativamente baja se multiplica (o divide) por el valor de referencia de la secuencia de ácido nucleico diana, que tiene la temperatura de detección relativamente alta y después el resultado de la multiplicación (o división) se resta con la señal (por ejemplo, UFR) detectada a la temperatura de detección relativamente alta. Cuando una diferencia es superior (o inferior) a "0" o un valor predeterminado, se puede determinar que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, el valor predeterminado puede desempeñar una función como umbral.
De acuerdo con una realización, el valor de referencia se usa para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, cuando se detecta una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta o cuando se obtiene mediante un proceso matemático una diferencia entre las señales a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, cuando las señales se generan en tiempo real asociadas a la amplificación de la diana mediante PCR, el procesamiento matemático de las señales comprende cálculos de la relación entre una intensidad de señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y una intensidad de señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en cada ciclo de amplificación. Los resultados del cálculo se representan frente a ciclos y se usan para la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, cuando las señales se generan en tiempo real asociadas a la amplificación de la diana mediante PCR, el valor de Ct es una señal para la diana de detección.
El valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se puede determinar usando las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja, que se ejemplifica de la siguiente manera: En primer lugar, se realiza una PCR en tiempo real para una muestra que se ha de analizar y se obtienen las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja, seguido de la obtención de curvas de amplificación de las dos temperaturas de detección.
(a) En la detección a la temperatura de detección relativamente alta, cuando no hay valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, se puede determinar que no está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta. Entonces, el valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se calcula a partir de la curva de amplificación obtenida a una temperatura de detección relativamente baja. Cuando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja también está ausente, no hay valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
(b) En la detección a la temperatura de detección relativamente alta, cuando hay valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, entonces se calcula una relación entre el valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente baja y el valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente alta en el ciclo que muestra el valor de Ct. También se calculan relaciones de valores de UFR obtenidos en los ciclos siguientes al ciclo que muestra el valor de Ct. (i) Cuando todas las relaciones de los valores de UFR son inferiores a un valor de referencia (por ejemplo, un valor obtenido usando únicamente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta como se ha descrito anteriormente), se determina que está ausente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. Por consiguiente, no hay valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. (ii) Cuando todas las relaciones de los valores de UFR son superiores al valor de referencia, el valor de Ct calculado a partir de la curva de amplificación obtenida a una temperatura de detección relativamente baja se determina como valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja. (iii) Cuando la relación de los valores de UFR en el ciclo que muestra el valor de Ct es inferior al valor de referencia y la relación de los valores de UFR después de un determinado ciclo es superior al valor de referencia, el determinado ciclo se determina como valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Cuando las relaciones calculadas sean las mismas que el valor de referencia, la determinación puede hacerse arbitrariamente. Por ejemplo, los ejemplos descritos anteriormente describen que la determinación se realiza considerando si las relaciones son inferiores o no inferiores a los valores de referencia. Además, la determinación se puede realizar considerando si las relaciones no son superiores o son superiores a los valores de referencia.
El valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se puede calcular como alternativa de la siguiente manera: la relación entre el valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente baja y el valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente alta se calcula para cada ciclo; y entonces se calcula el valor de Ct teniendo en cuenta un valor umbral.
El valor de Ct de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se puede calcular como alternativa de la siguiente manera: El valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente alta en cada ciclo se modifica con un valor de referencia de cada ciclo; la relación entre el valor de UFR obtenido a la temperatura de detección relativamente baja y el valor de UFR modificado se calcula para cada ciclo; y entonces se calcula el valor de Ct.
De acuerdo con una realización de la presente invención, usar la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y dicho uso de la diferencia comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, usar la diferencia comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja, y el valor de calificación se obtiene (i) procesando matemáticamente la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja o (ii) usando la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja sin considerar ninguna detección de la señal a la temperatura de detección relativamente alta cuando la señal no se detecta a la temperatura de detección relativamente alta.
Los valores de calificación se pueden procesar matemáticamente para obtener valores modificados. Los valores de calificación se usan para determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en la muestra.
De acuerdo con una realización, el recipiente de reacción único comprende además al menos un conjunto adicional, cada uno de los cuales contiene dos medios de generación de señales adicionales para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana distintas de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana; en donde las señales generadas por cada conjunto de dos medios de generación de señales en el recipiente se diferencian entre sí y las señales se detectan mediante diferentes tipos de detectores, respectivamente. Por ejemplo, cuando los dos medios de generación de señales en la etapa (a) están marcados con FAM y los dos medios de generación de señales adicionales están marcados con Quasar 570, las señales generadas por medios de generación de señales marcados con FAM en el recipiente se diferencian de las señales generadas por medios de generación de señales marcados con Quasar 570 y, por lo tanto, se requieren dos tipos de detectores para detectar dos luces de emisión diferentes.
De acuerdo con una realización de la presente invención, las dos secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden una variación de nucleótidos y una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana comprende un tipo de la variación de nucleótidos y la otra comprende el otro tipo de variación de nucleótidos.
La expresión "variación de nucleótidos" utilizada en el presente documento se refiere a cualesquier sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótidos únicas o múltiples en una secuencia de ADN en una ubicación particular entre segmentos de ADN contiguos que por lo demás son similares en secuencia. Dichos segmentos de ADN contiguos incluyen un gen o cualquier otra porción de un cromosoma. Estas variaciones de nucleótidos pueden ser variaciones de alelos mutantes o polimórficos. Por ejemplo, la variación de nucleótidos detectada en la presente invención incluye SNP (polimorfismo de un solo nucleótido, por sus siglas en inglés), mutación, supresión, inserción, sustitución y translocación. La variación de nucleótidos ejemplificada incluye numerosas variaciones en un genoma humano (por ejemplo, variaciones en el gen de MTHFR (metilenetetrahidrofolato reductasa)), variaciones implicadas en la resistencia a los fármacos por parte de los patógenos y variaciones que provocan tumorigénesis. La expresión variación de nucleótidos utilizada en el presente documento incluye cualquier variación en una ubicación particular en una secuencia de ácido nucleico. Dicho de otro modo, el término variación de nucleótidos incluye un tipo silvestre y cualquier tipo mutante en una ubicación particular en una secuencia de ácido nucleico.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la variación de nucleótidos detectada por la presente invención es un SNP (polimorfismo de un solo nucleótido).
De acuerdo con una realización de la presente invención, uno de los alelos de SNP tiene una temperatura de detección relativamente alta y el otro tiene una temperatura de detección relativamente baja determinadas por los medios de generación de señales correspondientes.
Las ventajas de la presente invención se vuelven más destacadas para la detección de SNP.
Cuando una temperatura de detección para el alelo de tipo silvestre es la temperatura de detección relativamente alta, una temperatura de detección para el alelo mutante es la temperatura de detección relativamente baja y la muestra es homocigótica mutante, no se detectará una señal a la temperatura de detección relativamente alta y se detectará una señal a la temperatura de detección relativamente alta. Se determinará que la muestra no contiene ningún alelo de tipo silvestre y contiene un alelo mutante. Al mismo tiempo, incluso cuando se genera una señal falsa a la temperatura de detección relativamente alta para la muestra de homocigoto mutante, calcular el resultado de la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja para determinar la presencia del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja permite verificar si la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta es una señal falsa positiva o no. La razón es que un heterocigoto para SNP comprende el alelo de tipo silvestre y el alelo mutante en una relación 1:1.
II. Genotipado de SNP usando temperaturas de detección diferentes
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para el genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra que comprende la secuencia de ácido nucleico que contiene un sitio de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) y un medio de generación de señales para la detección de alelos de SNP en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja mediante el uso de un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada uno de los alelos de SNP es detectado por un medio de generación de señales específico de alelo; en donde uno de los alelos de SNP se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y el otro se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales;
(b) determinar un genotipo de SNP por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en la etapa (a), usando al menos uno de los valores de referencia, en donde un valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta con medios de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con los medios de generación de señales específicos de alelo en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; y el otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja
Puesto que la presente invención sigue en principio el primer aspecto de la presente invención descrito anteriormente, las descripciones comunes entre ellos se omiten con el fin de evitar una redundancia indebida que conduzca a la complejidad de la presente memoria descriptiva. Cuando se hace referencia a las descripciones para el primer aspecto con el fin de describir este aspecto, cabe señalar que la etapa (b) de este aspecto es, en parte, diferente de la etapa (b) del primer aspecto. Por consiguiente, los expertos en la materia entenderán que algunas descripciones para el primer aspecto se pueden aplicar directamente a las descripciones para la etapa (b) de este aspecto y se pueden aplicar otras descripciones con modificaciones a las descripciones para la etapa (b) de este aspecto.
Etapa (a): Incubación con medios de generación de señales y detección de señales
En primer lugar, la muestra que comprende la secuencia de ácido nucleico que contiene un sitio de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) se incuba con un medio de generación de señales para la detección de alelos de SNP en un único recipiente de reacción y después se detecta una señal generada usando un único tipo de detector. El único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales. La incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada uno de los alelos de SNP es detectado por un medio de generación de señales específico de alelo.
La secuencia de ácido nucleico que contiene un sitio de SNP puede incluir un par de cromosomas de ser humano.
Uno de los alelos de SNP tiene una temperatura de detección relativamente alta y el otro tiene una temperatura de detección relativamente baja determinadas por los medios de generación de señales correspondientes; en donde la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
La etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal simultáneamente con una amplificación de ácido nucleico.
Etapa (b): Determinación de un genotipo de SNP
Después de la detección de la señal, el genotipado de SNP se determina por la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en la etapa (a) usando al menos uno de los valores de referencia, en donde un valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta con medios de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con los medios de generación de señales específicos de alelo en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; y el otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, la diferencia se obtiene procesando matemáticamente la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
El genotipado de SNP se realiza usando la diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la muestra de homocigoto que contiene el alelo de SNP que tiene una temperatura de detección relativamente alta muestra una diferencia (por ejemplo, una relación) dentro de un intervalo determinado, la muestra de heterocigoto muestra una diferencia (por ejemplo, una relación) dentro de otro intervalo determinado y la muestra de homocigoto que contiene el alelo de SNP que tiene una temperatura de detección relativamente baja muestra una diferencia (por ejemplo, una relación) dentro de otro intervalo determinado.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el intervalo determinado para cada genotipo de SNP puede estar relacionado con un valor de referencia para cada genotipo de SNP.
El método usa un valor de referencia, para determinar el genotipado de SNP, obtenido (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, para el genotipado de SNP de una muestra, se calcula una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y se compara con los valores de referencia de cada genotipo de SNP.
De acuerdo con una realización, se puede obtener un valor de referencia calculando la relación entre las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se puede obtener en condiciones de reacción suficientes para proporcionar una señal saturada al finalizar la reacción. Por ejemplo, con el fin de obtener un valor de referencia para un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja, las condiciones de reacción, tales como el contenido de cada alelo de SNP, se seleccionan de manera que se proporcione una señal saturada para cada alelo de SNP al finalizar la reacción. De acuerdo con una realización de la presente invención, la diferencia entre las señales obtenidas al calcular el valor de referencia tiene un intervalo determinado y el valor de referencia se selecciona dentro del intervalo determinado o con referencia al intervalo determinado.
Cuando una temperatura de detección para el alelo de tipo silvestre es la temperatura de detección relativamente alta, una temperatura de detección para el alelo mutante es la temperatura de detección relativamente baja, y se calcula la relación entre las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja para obtener una diferencia, la muestra de homocigoto silvestre muestra una relación dentro de un intervalo determinado y la muestra de heterocigoto muestra una relación dentro de otro intervalo determinado.
Por ejemplo, la muestra de homocigoto silvestre muestra una relación de aproximadamente 1,0 y la muestra de heterocigoto para SNP muestra una relación de aproximadamente 2,0.
Cuando la muestra es homocigota mutante, se puede usar una señal de fondo detectada a la temperatura de detección relativamente alta para el cálculo de la relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja. En tal caso, la relación calculada puede mostrar un valor muy superior a 2,0, lo que indica que el genotipo de SNP de la muestra es homocigoto mutante. Como alternativa, la relación calculada puede mostrar un valor que pertenece al intervalo determinado de relación (por ejemplo, aproximadamente 9,0) mostrado por la muestra de homocigoto mutante.
Adicionalmente, incluso cuando se genera la señal falsa a la temperatura de detección relativamente alta para la muestra de homocigoto mutante, la relación mostrará un valor muy superior a 2,0, lo que indica que el genotipo de SNP de la muestra es homocigoto mutante.
De acuerdo con una realización, la diferencia proporciona un valor de calificación obtenido procesando matemáticamente la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
MI. Detección de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección
En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un método para detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con al menos tres medios de generación de señales para la detección de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada usando un único tipo de detector a al menos tres temperaturas de detección; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como un ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección diferente; en donde los al menos tres medios de generación de señales determinan las al menos tres temperaturas de detección; en donde una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección; en donde los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales; y
(b) determinar la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
Puesto que la presente invención sigue en principio el primer aspecto de la presente invención descrito anteriormente, las descripciones comunes entre ellos se omiten con el fin de evitar una redundancia indebida que conduzca a la complejidad de la presente memoria descriptiva.
Etapa (a): Incubación con medios de generación de señales y detección de señales
En primer lugar, la muestra que se ha de analizar se incuba con al menos tres medios de generación de señales para la detección de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y después se detecta una señal generada usando un único tipo de detector, a al menos tres temperaturas de detección; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real. El único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los al menos tres medios de generación de señales.
El número de las secuencias de ácidos nucleicos diana que se han de detectar mediante la presente invención no se limita, incluyendo más de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción.
Cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales correspondiente. Cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana tiene una temperatura de detección diferente determinada por los medios de generación de señales correspondientes.
De acuerdo con una realización, las temperaturas de detección asignadas a las secuencias de ácidos nucleicos diana difieren en al menos 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C, 10 °C, 11 °C, 12 °C, 15 °C o 20 °C entre sí.
Una de las secuencias de ácidos nucleicos diana tiene una temperatura de detección relativamente más alta. Se usa un medio de generación de señales capaz de proporcionar una señal a una temperatura de detección relativamente más alta para detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente más alta.
Una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección. La detección se realiza a cada una de las diferentes temperaturas de detección. Los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales.
La etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal simultáneamente con una amplificación de ácido nucleico.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son medios de generación de señales para generar una señal mediante la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante la formación de un dúplex entre una secuencia de ácido nucleico diana y un oligonucleótido de detección hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana. De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son medios de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección.
De acuerdo con una realización, la señal se genera por hibridación del oligonucleótido de detección con una secuencia de ácido nucleico diana y después escisión del oligonucleótido de detección. De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante escisión del oligonucleótido de detección de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, la generación de señales que es de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección se usa para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y los medios de generación de señales para las otras secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para las otras secuencias de ácido nucleico diana son un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la escisión de un oligonucleótido de mediación libera un fragmento y el fragmento media en la formación de un dúplex o una escisión de un oligonucleótido de detección mediante una extensión del fragmento sobre un oligonucleótido de captura.
Los al menos tres medios de generación de señales comprenden un marcador idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales del marcador.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando los medios de generación de señales generan una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex, la temperatura de detección se selecciona basándose en un valor de Tf del dúplex.
De acuerdo con una realización de la presente invención, cuando el medio de generación de señales genera una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección, la temperatura de detección se selecciona arbitrariamente. De acuerdo con una realización de la presente invención, los medios de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección pueden proporcionar una temperatura de detección relativamente más alta.
De acuerdo con una realización, las temperaturas de detección para secuencias de ácidos nucleicos diana están predeterminadas al considerar que un intervalo de temperatura permite la generación de señales por los medios de generación de señales.
De acuerdo con una realización, la temperatura de detección para cada secuencia de ácido nucleico diana está predeterminada al considerar que un intervalo de temperatura permite la generación de señales por los medios de generación de señales para la detección de cada secuencia de ácido nucleico diana. Las temperaturas de detección se pueden predeterminar considerando el intervalo de temperatura de detección no superpuesto y el intervalo de temperatura de detección superpuesto entre las temperaturas de detección.
La detección a una temperatura de detección determinada tiene como objetivo detectar una señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección. La detección a una temperatura de detección relativamente más alta tiene como objetivo detectar una señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta.
Por ejemplo, cuando las secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden tres secuencias diana y se asignan temperaturas de detección de 72 °C, 60 °C y 50 °C a las tres secuencias diana, respectivamente, la detección a 50 °C incluye no sólo la detección de la señal para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección de 50 °C, sino también la detección de señales para secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección de 70 °C y 60 °C, respectivamente.
Una de las características de la presente invención es determinar de manera diferencial la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana detectando a diferentes temperaturas de detección señales indicativas de la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana.
Etapa (b): Determinación de la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana
Después de la detección de la señal, la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se determina mediante las señales detectadas en la etapa (a), en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
Cuando se ha de determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada. Cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, la diferencia comprende una diferencia que se ha de obtener procesando matemáticamente la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y una señal detectada a la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, cuando la señal no se detecta a temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada, la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se realiza mediante la señal detectada a la temperatura de detección determinada sin considerar ninguna detección de la señal a las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada. Esta realización aborda que el uso de una diferencia debida a la presencia y ausencia de señales permite la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada.
Por ejemplo, suponiendo que las secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden cuatro secuencias diana, se asignan temperaturas de detección de 72 °C, 60 °C, 50 °C y 40 °C a las cuatro secuencias diana, respectivamente, y se detectan señales a temperaturas de detección de 60 °C, 50 °C y 40 °C en la etapa (a). Cuando se ha de determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección de 40 °C, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada (40 °C) se determina usando una diferencia entre la señal detectada en una o más temperaturas de detección (60 °C y 50 °C) superiores a la temperatura de detección determinada (40 °C) y la señal detectada a la temperatura de detección determinada. De manera más clara, se puede usar una diferencia entre la señal detectada a 60 °C y la señal detectada a 40 °C, una diferencia entre la señal detectada a 50 °C y la señal detectada a 40 °C o ambas diferencias, para la determinación de la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección de 40 °C.
La presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen las otras temperaturas de detección (es decir, 60 °C y 50 °C) se puede determinar respectivamente como se ha descrito anteriormente.
La expresión "una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada" incluye que la diferencia se obtiene entre las señales a dos temperaturas de detección. Una de las señales es la señal detectada a una de las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la otra es la señal detectada a la temperatura de detección determinada. Cuando las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada son más de dos, se pueden obtener diferencias de más de dos.
La expresión "una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección y la señal detectada a una temperatura de detección determinada" incluye no sólo la diferencia entre las señales detectadas a dos temperaturas de detección, sino también la diferencia obtenida usando la diferencia entre las dos temperaturas de detección y una señal detectada a la otra temperatura de detección.
Como alternativa, de acuerdo con una realización, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada (60 °C) se determina usando una diferencia que se ha de obtener procesando matemáticamente entre la señal detectada en una o más temperaturas de detección (72 °C) superiores a la temperatura de detección determinada (60 °C) y la señal detectada a la temperatura de detección determinada. Como la señal no se detecta a la temperatura de detección más alta (72 °C), se puede usar la señal de fondo para calcular la diferencia.
De acuerdo con una realización, como la señal no se detecta a una temperatura de detección (72 °C) superior a la temperatura de detección determinada (60 °C), la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada (60 °C) se determina usando la señal detectada a la temperatura de detección determinada (60 °C) sin considerar ninguna detección de la señal a la temperatura de detección (72 °C) superior a la temperatura de detección determinada (60 °C).
Si se detecta una señal a la temperatura de detección más alta (72 °C), se puede determinar que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta.
De acuerdo con una realización, cuando se ha de determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina usando una diferencia entre la señal detectada a una temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, usar la diferencia comprende usar una diferencia que se ha de obtener procesando matemáticamente la señal detectada a una temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada y una señal detectada a la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, cuando la señal no se detecta a la temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada, usar la diferencia comprende usar la señal detectada a la temperatura de detección determinada sin considerar ninguna detección de la señal a la temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada.
Por ejemplo, cuando se ha de determinar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección de 40 °C, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina usando una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección (50 °C) inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada (40 °C) y la señal detectada a la temperatura de detección determinada.
Se requiere un valor de referencia para determinar si las señales detectadas a las temperaturas de detección de 50 °C y 40 °C son indicativas de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección de 50 °C y 40 °C.
De acuerdo con una realización de la presente invención, dependiendo de los enfoques para obtener la diferencia, se puede emplear un umbral para analizar si la diferencia obtenida es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada.
Se usa un valor de referencia para determinar la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana.
La diferencia en las señales a la temperatura de detección determinada y la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada proporcionada por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada se expresa a través de un valor de referencia.
En determinada realización, el valor de referencia para el caso en el que las señales a la temperatura de detección determinada y la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada proporcionadas por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada son diferentes entre sí puede ser diferente en más del 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 2,5 %, el 3 %, el 3,5 %, el 4 %, el 4,5 %, el 5 %, el 5,5 %, el 6 %, el 6,5 %, el 7 %, el 7,5 %, el 8 %, el 8,5 %, el 9 %, el 9,5 %, el 10 %, el 12 %, el 15 %, el 20 % o el 30 %, en comparación con el valor de referencia para el caso en que las dos señales son iguales.
En determinada realización, el valor de referencia para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada se puede usar en la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada baja, cuando el valor de referencia para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada calculada a partir de las señales a dos temperaturas de detección puede ser diferente en más del 0,5 %, el 1 %, el 1,5 %, el 2 %, el 2,5 %, el 3 %, el 3,5 %, el 4 %, el 4,5 %, el 5 %, el 5,5 %, el 6 %, el 6,5 %, el 7 %, el 7,5 %, el 8 %, el 8,5 %, el 9 %, el 9,5 %, el 10 %, el 12 %, el 15 %, el 20 % o el 30 % en comparación con el valor de referencia para el caso en que las dos señales sean iguales.
De acuerdo con una realización, cuando se detectan señales para una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana a la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada, se usa un valor de referencia para una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana al considerar un patrón de cambio de señal a temperaturas de detección cambiadas para una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana.
De acuerdo con una realización, cuando está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada, el valor de referencia se usa para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada.
El caso en el que está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada incluye un caso en el que se detecta una señal significativa indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada a la temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada.
Los valores de referencia pueden pre-prepararse para todas las combinaciones o para algunas combinaciones seleccionadas de las secuencias de ácidos nucleicos diana. De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia es una diferencia entre señales a temperaturas de detección obtenidas de las combinaciones anteriores.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se puede obtener en condiciones de reacción suficientes para proporcionar una señal saturada al finalizar la reacción. Por ejemplo, con el fin de obtener un valor de referencia para una combinación de dos secuencias de ácidos nucleicos diana, las condiciones de reacción, tales como el contenido de cada secuencia de ácido nucleico diana, se seleccionan de manera que se proporcione una señal saturada para cada secuencia de ácido nucleico diana al finalizar la reacción. De acuerdo con una realización de la presente invención, la diferencia entre las señales obtenidas al calcular el valor de referencia tiene un intervalo determinado y el valor de referencia se selecciona dentro del intervalo determinado o con referencia al intervalo determinado.
Los valores de referencia se pueden usar para determinar la significación de la diferencia obtenida en la muestra, al considerar un método para obtener diferencias y resultados de detección prácticos. Los valores de referencia se pueden usar para obtener la diferencia en la muestra, por lo que están implicados en la determinación de la presencia de ácido nucleico diana.
Para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada, el método usa al menos un valor de referencia entre los valores de referencia obtenidos (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales correspondientes en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada.
Cuando se pretende detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante la presente invención, se pueden obtener diversos valores de referencia al considerar diversas combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana con diversas combinaciones de las dos temperaturas de detección seleccionadas para la detección de señales.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana se determina en orden de sus temperaturas de detección desde la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección más alta hasta la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección más baja, y los valores de referencia se seleccionan adecuadamente dependiendo de los métodos para la determinación de la presencia y uso de la diana.
En el ejemplo anterior, para obtener un valor de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada (40 °C), todas las combinaciones (es decir, una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección de 60 °C, una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección de 50 °C, y una combinación de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen las temperaturas de detección de 60 °C y 50 °C) de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección (60 °C y 50 °C) superiores a la temperatura de detección determinada (40 °C) se incuban con medios de generación de señales para generar señales; las señales se detectan no solo a una o más temperaturas de detección (60 °C y 50 °C) superiores a la temperatura de detección determinada (40 °C), sino también a la temperatura de detección determinada (40 °C); y entonces la señal detectada a la una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada se usan para obtener la diferencia entre las señales. De acuerdo con el mismo método, se obtienen valores de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene las otras temperaturas de detección (es decir, 60 °C y 50 °C).
Como alternativa, para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada, el método usa además al menos un valor de referencia entre los valores de referencia obtenidos (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales correspondientes en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales a una temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada y la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada para obtener la diferencia entre las señales.
En el ejemplo anterior, para obtener un valor de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada (40 °C), todas las combinaciones (es decir, una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección de 60 °C, una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección de 50 °C, y una combinación de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen las temperaturas de detección de 60 °C y 50 °C) de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección (60 °C y 50 °C) superiores a la temperatura de detección determinada (40 °C) se incuban con medios de generación de señales para generar señales; las señales se detectan tanto a una temperatura de detección (50 °C) inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada (40 °C) como a la temperatura de detección determinada (40 °C); entonces la señal detectada a una temperatura de detección (50 °C) inmediatamente superior a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada (40 °C) se usan para obtener la diferencia entre las señales. De acuerdo con el mismo método, se obtienen valores de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene las otras temperaturas de detección (es decir, 60 °C y 50 °C).
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se obtiene calculando la relación o resta entre las señales detectadas a una de las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la temperatura de detección determinada. De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se obtiene calculando la relación entre la señal detectada a una temperatura de detección determinada y la señal detectada a una de las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada. De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia se obtiene calculando la relación entre la señal detectada a una de las temperaturas de detección superior a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, cuando el umbral se obtiene usando el valor de referencia para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada, se puede obtener usando un determinado valor de referencia o algunos valores de referencia entre los valores de referencia obtenidos a partir de diversas combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, cuando se analiza que una entre las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen una temperatura de detección superior a la temperatura de detección determinada no existe, se emplean valores de referencia obtenidos a partir de una combinación de secuencias de ácidos nucleicos diana que no contienen la secuencia de ácido nucleico diana para determinar el umbral.
En una realización, cuando se detectan al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, para verificar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada, se pre-prepara una muestra patrón que comprende combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana, excepto por la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada, y después se obtienen valores de referencia. Al considerar los valores de referencia, se obtiene un umbral para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización, usar la señal detectada a la temperatura de detección determinada comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta y usar la diferencia comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización de la presente invención, usar la diferencia comprende obtener un valor de calificación para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada, y el valor de calificación se obtiene (i) procesando matemáticamente la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada o (ii) usar la señal detectada a la temperatura de detección determinada sin considerar ninguna detección de la señal a la una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada cuando la señal no se detecta a la una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la etapa (b) se realiza determinando en primer lugar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente más alta y después determinando secuencialmente la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección relativamente más bajas en un orden descendente.
De acuerdo con una realización, el recipiente de reacción único comprende además al menos un conjunto adicional, cada uno de los cuales contiene al menos tres medios de generación de señales adicionales para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana distintas de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana; en donde las señales generadas por cada conjunto de al menos tres medios de generación de señales en el recipiente se diferencian entre sí y las señales se detectan mediante diferentes tipos de detectores, respectivamente.
De acuerdo con una realización de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden una variación de nucleótidos (particularmente SNP).
IV. Detección de dos secuencias de ácidos nucleicos diana usando diferentes temperaturas de detección
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja usando un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales; en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección o mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana; y
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
Etapa (a): Incubación con medios de generación de señales y detección de señales
En primer lugar, la muestra que se ha de analizar se incuba con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y después se detecta una señal generada usando un único tipo de detector. El único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales.
Cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales correspondiente. Una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana tiene una temperatura de detección relativamente alta y la otra tiene una temperatura de detección relativamente baja determinadas por los medios de generación de señales correspondientes.
De acuerdo con una realización de la presente invención, la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente alta se detecta mediante un método de detección en tiempo real usando una temperatura de detección diferente, y la secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente baja se detecta mediante análisis de fusión.
De acuerdo con una realización, el medio de generación de señales para generar una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja tiene que construirse para no generar ninguna señal a la temperatura de detección relativamente alta.
De acuerdo con una realización, el medio de generación de señales para el análisis de fusión no incluye un medio que genere señales mediante escisión de sondas marcadas o dúplex marcados.
La etapa (a) se realiza en condiciones capaces de generar al menos la señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
La etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal simultáneamente con una amplificación de ácido nucleico.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante la formación de un dúplex entre una secuencia de ácido nucleico diana y un oligonucleótido de detección hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana. De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, al menos uno de los medios de generación de señales es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección. De acuerdo con una realización, la señal se genera por hibridación del oligonucleótido de detección con una secuencia de ácido nucleico diana y después escisión del oligonucleótido de detección. De acuerdo con una realización, la señal se genera mediante escisión del oligonucleótido de detección de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
De acuerdo con una realización, la generación de señales que es de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección se usa para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
Particularmente, es muy ventajoso usar la generación de señales de manera dependiente de la escisión del oligonucleótido de detección para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta por las siguientes razones: (i) se puede seleccionar una temperatura de detección con un intervalo de temperatura relativamente amplio; (ii) se puede seleccionar una temperatura mucho más alta en comparación con los enfoques de hibridación; y (iii) es posible no proporcionar ninguna señal en el análisis de fusión seleccionando medios de generación de señales y condiciones de reacción adecuados (por ejemplo, selección de medios de generación de señales incapaces de proporcionar señales mediante hibridación solamente sin escisión o selección de condiciones que permitan la escisión de la mayoría de los oligonucleótidos de detección).
Los medios de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex (por ejemplo, baliza molecular) también pueden proporcionar señal a través de la escisión por nucleasa-5' dependiendo de las condiciones de reacción. Los medios de generación de señales se pueden considerar capaces de proporcionar señal por escisión, siempre y cuando se use para generar señal mediante escisión.
De acuerdo con una realización, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex.
De acuerdo con una realización, el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja genera una señal mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
Los dos medios de generación de señales comprenden un marcador idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales del marcador.
Después de la incubación (reacción) de la muestra con dos medios de generación de señales para generar señal, la señal generada se detecta mediante el uso de un único tipo de detector. La detección se realiza a la temperatura de detección relativamente alta capaz de generar una señal para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta.
V. Medio de almacenamiento y dispositivo para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante el uso de múltiples temperaturas de detección
Puesto que el medio de almacenamiento y el dispositivo descritos a continuación en el presente documento están destinados a realizar los presentes métodos en un ordenador, las descripciones comunes entre ellos se omiten con el fin de evitar una redundancia indebida que conduzca a la complejidad de la presente memoria descriptiva.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para determinar la presencia de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, comprendiendo el método:
(a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, usando un valor de referencia, en donde el valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización, cuando está presente la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, el valor de referencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se usa para determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, el valor de referencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se almacena en el medio de almacenamiento legible por ordenador. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene instrucciones para introducir el valor de referencia al realizar el método. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene además instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para obtener el valor de referencia.
Las instrucciones del programa están operativas, cuando las realiza el procesador, para hacer que el procesador realice el presente método descrito anteriormente. Las instrucciones del programa pueden comprender una instrucción para recibir la primera señal y la segunda señal, y una instrucción para determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana usando las señales recibidas.
El presente método descrito anteriormente se implementa en un procesador, tal como un procesador en un ordenador independiente, un ordenador conectado a la red o un dispositivo de adquisición de datos, tal como una máquina de PCR en tiempo real.
Los tipos de medios de almacenamiento legibles por ordenador incluyen diversos medios de almacenamiento tales como CD-R, CD-ROM, DVD, memoria flash, disquete, unidad de disco duro, HDD portátil, USB, cinta magnética, MINIDISC, tarjeta de memoria no volátil, EEPROM(Electrically Erasable Programmable Read-Only Memory,memoria de solo de lectura, programable y eléctricamente borrable), disco óptico, un medio de almacenamiento óptico, RAM, ROM, memoria del sistema y servidor web.
Los datos (por ejemplo, intensidad, número de ciclos de amplificación y temperatura de detección) asociados a las señales se pueden recibir a través de varios mecanismos. Por ejemplo, los datos se pueden adquirir mediante un procesador residente en un dispositivo de adquisición de datos de PCR. Los datos se pueden proporcionar al procesador en tiempo real a medida que se recopilan, o pueden almacenarse en una unidad de memoria o memoria intermedia y se pueden proporcionar al procesador después de que se haya completado el experimento. Análogamente, el conjunto de datos se puede proporcionar a un sistema separado, tal como un sistema informático de escritorio, a través de una conexión de red (por ejemplo, LAN, VPN, intranet e Internet) o conexión directa (por ejemplo, USB u otra conexión directa por cable o inalámbrica) al dispositivo de adquisición, o se puede proporcionar en un medio portátil tal como un CD, DVD, disquete, HDD portátil o similar a un sistema informático independiente. Análogamente, el conjunto de datos se puede proporcionar a un sistema servidor a través de una conexión de red (por ejemplo, LAN, VPN, intranet, Internet y red de comunicación inalámbrica) a un cliente tal como un ordenador portátil o un sistema de ordenador de escritorio. Una vez recibidos o adquiridos los datos, el proceso de análisis de datos procede para proporcionar una señal procesada obtenida a partir de una diferencia entre las señales para la determinación de la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana cuando la señal se detecta a la temperatura de detección relativamente alta. El procesador procesa los datos recibidos asociados a las señales para proporcionar la señal procesada que refleja la diferencia entre las señales en las dos temperaturas de detección. Por ejemplo, el procesador procesa los datos recibidos para obtener una relación entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta.
Las instrucciones para configurar el procesador para realizar la presente invención pueden incluirse en un sistema lógico. Las instrucciones se pueden descargar y almacenar en un módulo de memoria (por ejemplo, disco duro u otra memoria tal como una RAM o ROM local o adjunta), aunque las instrucciones se pueden proporcionar en cualquier medio de almacenamiento de software, tal como un HDD portátil, USB, disquete, CD y<d>V<d>. Un código informático para implementar la presente invención se puede implementar en una diversidad de lenguajes de codificación tales como C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl y XML. Además, se puede usar una diversidad de lenguajes y protocolos en el almacenamiento externo e interno y en la transmisión de datos y comandos de acuerdo con la presente invención.
En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un dispositivo para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende (a) un procesador informático y (b) el medio de almacenamiento legible por ordenador descrito anteriormente acoplado al procesador informático.
De acuerdo con una realización, el dispositivo comprende además un recipiente de reacción para acomodar la muestra y los medios de generación de señales, un medio de control de temperatura para controlar las temperaturas del recipiente de reacción y/o un detector de tipo único para detectar señales que serán generadas por los medios de generación de señales.
La primera característica esencial del dispositivo lleva el procesador a permitir que el dispositivo detecte señales que se generarán a las dos temperaturas de detección. De acuerdo con una realización, cuando la señal se genera junto con la amplificación de la secuencia de ácido nucleico diana, el dispositivo comprende un procesador para permitir que el dispositivo detecte señales que se generarán a las dos temperaturas de detección en cada ciclo de amplificación.
La segunda característica esencial del dispositivo es llevar el procesador a procesar la señal detectada a las dos temperaturas de detección para obtener la diferencia entre las señales. De acuerdo con una realización, la diferencia entre las señales se expresa como valores numéricos mediante un procesamiento matemático.
De acuerdo con una realización, el procesador puede realizarse instalando software en dispositivos convencionales para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, un dispositivo de PCR en tiempo real). De acuerdo con una realización, el dispositivo comprende un procesador para permitir que el dispositivo detecte señales a al menos dos temperaturas de detección y procese matemáticamente al menos dos resultados de detección.
En un aspecto adicional más de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para determinar la presencia de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, comprendiendo el método:
(a) recibir señales detectadas a al menos tres temperaturas de detección mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como un ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección diferente; en donde una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección; en donde los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales; y
(b) determinar la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los valores de referencia se almacenan en el medio de almacenamiento legible por ordenador. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene instrucciones para introducir el valor de referencia al realizar el método. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene además instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para obtener los valores de referencia.
En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un programa informático almacenado o que se ha de almacenar en un medio de almacenamiento legible por ordenador para configurar un procesador para realizar el método descrito anteriormente para la detección de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para el genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, comprendiendo el método: (a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada uno de los alelos de SNP es detectado por un medio de generación de señales específico de alelo; en donde uno de los alelos de SNP se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y el otro se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales;
(b) determinar un genotipo de SNP por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en la etapa (a), usando al menos uno de los valores de referencia, en donde un valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta con medios de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con los medios de generación de señales específicos de alelo en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; y el otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
De acuerdo con una realización de la presente invención, los valores de referencia para un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y/o un heterocigoto y/o un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja se almacenan en el medio de almacenamiento legible por ordenador. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene instrucciones para introducir el valor de referencia al realizar el método. De acuerdo con una realización de la presente invención, el medio de almacenamiento legible por ordenador contiene además instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para obtener los valores de referencia.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, comprendiendo el método:
(a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección o mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana; y
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando análisis de temperatura de detección, el método comprende usar diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) recibir señales detectadas a al menos tres temperaturas de detección mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como un ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección diferente; en donde una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección; en donde los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales; y
(b) determinar la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona un dispositivo para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende (a) un procesador informático y (b) el medio de almacenamiento legible por ordenador de acuerdo con la presente invención acoplado al procesador informático.
Las características y ventajas de la presente invención se resumirán de la siguiente manera:
(a) La presente invención que emplea diferentes temperaturas de detección permite detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana de maneras convencionales en tiempo real incluso con un único tipo de marcador en un único recipiente de reacción. Las tecnologías convencionales detectan una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante un análisis de fusión después de la amplificación de la diana. De forma improbable, la presente invención no requiere un análisis de fusión después de la amplificación de la diana, de manera que el tiempo de análisis se reduce considerablemente.
(b) Curiosamente, los presentes inventores han descubierto que cuando se genera una señal para una secuencia de ácido nucleico diana usando un medio de generación de señales, (i) una detección de señales a una temperatura determinada se vuelve ajustable dependiendo del tipo de medio de generación de señales, y (ii) en el caso de detectar una señal a dos temperaturas de detección seleccionadas, las señales detectadas a las dos temperaturas de detección diferentes cambian de acuerdo con un patrón determinado. Los presentes inventores adoptaron los hallazgos para la detección de secuencias de ácidos nucleicos diana, logrando de este modo la presente invención.
(c) En la presente invención, usando diferentes temperaturas de detección, para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana, el uso de un medio de generación de señales para proporcionar una señal mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, métodos basados en PTOCE) puede inducir resultados inesperados. En primer lugar, los métodos que usan el oligonucleótido de mediación, tales como los métodos basados en PTOCE, pueden ajustar fácilmente el valor de Tf del dúplex formado para garantizar una selección conveniente de las temperaturas de detección. En segundo lugar, cuando se emplea un método para proporcionar una señal directamente desde una sonda hibridada con una secuencia de ácido nucleico diana junto con el uso de polimerasa que tiene actividad nucleasa-5' para la amplificación de la diana, es probable que la sonda sea escindida por la actividad nucleasa-5', lo que puede afectar a la interpretación de las señales. Debido a que los métodos que usan el oligonucleótido de mediación tales como los métodos basados en PTOCE generalmente usan la escisión del oligonucleótido de mediación mediante la actividad nucleasa-5', normalmente, dicho problema asociado a la interpretación de una señal resultante no se genera. Por último, en los métodos que usan el oligonucleótido de mediación tales como los métodos basados en PTOCE, se puede formar un dúplex que tiene un valor de Tf determinado porque el dúplex tiene una secuencia independientemente de una secuencia de ácido nucleico diana. De forma improbable, en métodos que usan sondas que se han de hibridar directamente con una secuencia de ácido nucleico diana, porque al menos una cadena de un dúplex formado comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana, se puede formar un dúplex que tiene un valor de Tf no deseado cuando hay presente una variación en la secuencia de ácido nucleico diana.
(d) En una realización de la presente invención para detectar una pluralidad de secuencias de ácidos nucleicos diana mediante el uso de diferentes temperaturas de detección en tiempo real, la combinación de (i) para una secuencia de ácido nucleico diana, un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de detección (por ejemplo, método TaqMan) y (ii) para otra secuencia de ácido nucleico diana, un medio de generación de señales para proporcionar una señal mediante un dúplex formado de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, métodos basados en PTOCE) puede inducir resultados inesperados.
El método que usa la escisión del oligonucleótido de detección generalmente usa una enzima que tiene actividad nucleasa 5' (particularmente, polimerasa Taq) para la escisión del oligonucleótido de detección. En los métodos convencionales para generar señales mediante hibridación directa de sondas de detección (por ejemplo, método de baliza molecular, método de sonda de hibridación o método Hybeacon), es muy probable que las sondas de detección sean escindidas por la enzima que tiene actividad nucleasa 5' (particularmente, polimerasa Taq). La escisión de las sondas de detección puede provocar una disminución de la sensibilidad debido al consumo de las sondas de detección (por ejemplo, método de sonda de hibridación) o una señal falsa positiva en métodos con señalización dependiente de la escisión (por ejemplo, método de baliza molecular). Aunque los métodos de cebadores marcados (por ejemplo, método Sunrise o método Scorpion) no sufren la escisión como los métodos de sonda, tienen deficiencias en las que el valor de Tf del amplicón en sí debe controlarse para ajustar las temperaturas de detección. Por el contrario, debido a que los métodos basados en PTOCE emplean la escisión del oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana, no se ven afectados por enzimas que tienen actividad nucleasa 5' (en particular, polimerasa Taq). Además, los métodos basados en PTOCE, pueden ajustar fácilmente el valor de Tf del dúplex formado para garantizar una selección conveniente de las temperaturas de detección.
De acuerdo con tecnologías convencionales mediante el uso de hibridación entre secuencias de ácidos nucleicos diana y oligonucleótidos de detección, existen problemas graves tales como la disminución de la sensibilidad (incluyendo la disminución de la sensibilidad en el análisis de fusión) debido a la escisión de la sonda y la generación de señales falsas debido a la escisión. La presente invención está completamente exenta de dichos problemas. Los métodos basados en PTOCE pueden ajustar fácilmente el valor de Tf de dúplex utilizados para la detección, de manera que se puedan seleccionar fácilmente las temperaturas de detección utilizadas para la detección en tiempo real.
La presente invención se describirá ahora con mayor detalle mediante los ejemplos. Sería obvio para los expertos en la materia que estos ejemplos tienen por objeto ser más concretamente ilustrativos y que el alcance de la presente invención, tal como se expone en las reivindicaciones adjuntas, no se limita a los ejemplos ni a por ellos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Detección de dos dianas mediante PCR en tiempo real de PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Además, los presentes inventores examinaron si se pueden detectar dos ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Se usó ADN polimerasaTaqque tenía una actividad nucleasa 5' para la extensión de cebadores en dirección 5' y cebadores en dirección 3', la escisión de PTO y la extensión del fragmento de PTO. Se usaron ADN genómico deNeisseria gonorrhoeae(NG) y ADN genómico deChlamydia trachomatis(CT) como secuencias de ácidos nucleicos diana.
Se usó PCR en tiempo real de PTOCE para detectar CT y NG. Si hay una diana presente, se escinde un PTO y se produce un fragmento de PTO. El fragmento de PTO se hibrida con la porción de captura del CTO, extendido en la porción de molde del CTO y forma un dúplex extendido con CTO (CTO dúplex). La formación del dúplex extendido proporciona una señal y se puede obtener una curva de amplificación midiendo la señal a la temperatura de formación del dúplex extendido.
En este Ejemplo, se seleccionó "72 °C" como temperatura de detección de señales para CT y "60 °C" como temperatura de detección de señales para NG teniendo en cuenta los medios de generación de señales. El dúplex extendido producido dependiendo de la presencia de CT o NG tiene un valor de Tm controlable y ajustado por su secuencia y longitud. En este Ejemplo, la secuencia y longitud del dúplex extendido para CT se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 72 °C. Mientras tanto, la secuencia y longitud del dúplex extendido para NG se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 60 °C, pero no para proporcionar una señal ya que se disocia para no formar el dúplex a 72 °C. En la temperatura de detección de 72 °C, se generará y se detectará la señal para C<t>. En la temperatura de detección de 60 °C, se generará y se detectará la señal para NG así como la señal para CT.
El PTO y el CTO están bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos 3' para impedir su extensión. El CTO está marcado con una molécula desactivadora (BHQ-2) y una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su porción de molde (SEQ ID NO: 4 y 8).
Se prepararon cuatro tubos de reacción que contenían CT, NG, una mezcla de CT y NG y sin control de diana respectivamente.
Las secuencias de cebador en dirección 5', cebador en dirección 3', PTO y CTO utilizadas en este Ejemplo son:
NG-F 5-TACGCCTGCTACTTTCACGCTNINGTAATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5-CAATGGATCGGTATCACTCGCNINCGAGCAAGAAC-3' (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 3)
NG-CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTNMITTTGTATAAC-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (SEQ ID NO: 6)
CT-PTO 5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 7)
CT-CTO<5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fluor>Red610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 8)
(I: Desoxiinosina)
(Las letras subrayadas indican la porción de marcaje en 5' de PTO)
La PCR en tiempo real se realizó en el volumen final de 20 pl que contenía un ácido nucleico diana (10 pg de ADN genómico de<n>G, 10 pg de ADN genómico de CT o una mezcla de 10 pg de ADN genómico de NG y 10 pg de ADN genómico de CT), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 1) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 2) para la amplificación de la diana de NG, 3 pmoles de PTO (<s>EQ ID NO: 3), 1 pmol de CTO (SEQ ID NO: 4), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 5) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 6) para la amplificación de la diana de CT, 3 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 1 pmol de CTO (SEQ iD NO: 8) y 10 pl de 2X Master Mix [final, dNTP 200 uM, MgCh 2 mM, 2 U de ADN polimerasa Taq], Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 min a 50 °C, se desnaturalizaron durante 15 min a 95 °C y se sometieron a 50 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 60 °C, 30 s a 72 °C. La detección de una señal se realizó a 60 °C y 72 °C de cada ciclo,
Como se muestra en la Fig, 1A, se detectaron señales a 72 °C en presencia de CT (Tubos 1 y 3), En presencia exclusiva de NG, se detectó una señal a 60 °C pero no a 72 °C (Tubo 2), No se detectó ninguna señal en ausencia de los ácidos nucleicos diana (Tubo 4), Los resultados de la Fig, 1A muestran que se genera la señal para CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta, pero la señal para NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja no se generó a la temperatura de detección relativamente alta, 72 °C, Por lo tanto, se apreciaría que la detección de señales a la temperatura de detección relativamente alta permitiera determinar al menos la presencia de CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta, Además, en el Tubo 2, usar la diferencia debida a la ausencia de una señal a la temperatura de detección relativamente alta y la presencia de una señal a la temperatura de detección relativamente baja permitió determinar la presencia de NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja,
La diferencia entre las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja se calculó mediante diversos enfoques con el fin de examinar si la presencia de NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja se puede detectar incluso en presencia o ausencia de la señal de CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta (Fig, 1B ~ 1E),
La Fig, 1B muestra la relación de los valores de UFR de los puntos finales a 72 °C y 60 °C (todos los valores de UFR se derivaron y exportaron a partir de datos de análisis de "ajuste de curva restado del valor basal" en software instrumental), La relación en presencia exclusiva de CT (Tubo 1) fue de 1,2 pero, en presencia tanto de CT como de NG (Tubo 3) fue de 2,1, Además, la relación en presencia exclusiva de NG (Tubo 2) y en ausencia de cualquier ácido nucleico diana (Tubo 4) fue de 36,7 y 0,7, respectivamente, Un umbral, 1,5, se aplicó para determinar la presencia o ausencia de NG, De acuerdo con el umbral, se confirmó la presencia de NG en los Tubos 2 y 3, y no hay NG en los Tubos 1 y 4, El umbral se determinó considerando la relación final del tubo que contenía solamente CT, Como Tubo 2, donde se puede determinar que la CT que tiene la temperatura de detección relativamente alta está ausente, el umbral para la señal a la temperatura de detección relativamente baja se puede establecer de forma independiente en lugar de aplicar 1,5,
Otro enfoque que usa las señales a 72 °C y 60 °C es calcular la relación de las señales de fluorescencia a 72 °C y 60 °C en cada uno de los ciclos y representar gráficamente la relación frente al ciclo (todos los valores de All UFR procesados para el trazado fueron se derivaron y exportaron de datos de análisis "Sin resta de valor basal" en software instrumental), Se aplicó umbral, 0,1, para determinar la presencia o ausencia de NG, El umbral se determinó considerando el gráfico de relación del tubo que contenía solamente CT, Como se muestra en la Fig, 1C, se comprobó la presencia de NG en los Tubos 2 y 3 y sus valores de Ct fueron 32,90 y 33,18, respectivamente, No hay valor de Ct obtenido en los Tubos 1 y 4, En lugar de calcular las relaciones, la intensidad fluorescente a 60 °C se puede restar de la de 72 °C en cada uno de los ciclos y trazar los resultados frente al ciclo para la detección de la diana,
La aplicación de umbrales individuales para el análisis de las señales obtenidas a 60 °C en cada tubo es otro método para detectar la presencia de NG que tiene la temperatura de detección relativamente baja usando la señal que indica la presencia de CT a la temperatura de detección relativamente alta, En el caso de que la señal se detecte a 72 °C, el umbral individual para la señal a 60 °C de los tubos se calculó multiplicando cada valor de UFR finales a 72 °C por un umbral (1,5), El umbral (1,5) se determinó considerando la relación final del tubo que contenía solamente CT (consúltese la Fig, 1B), En el caso de que no se detecte la señal a 72 °C, el umbral individual para la señal a 60 °C de los tubos se eligió y usó considerando la señal de fondo, la sensibilidad y la variación de señal o intervalo de error del dispositivo, de acuerdo con el establecimiento general de un umbral, En este Ejemplo, se determinó "200" como umbral individual para la señal a 60 °C,
Como se muestra en la Fig. 1D y la Fig. 1E, de acuerdo con el umbral individual a 60 °C, la presencia de NG se confirmó en el Tubo 2 y el Tubo 3 y además, sus valores de Ct se obtuvieron como 31,32 y 35,83, respectivamente. Ningún valor de Ct para NG estaba disponible en los Tubos 1 y 4.
Estos resultados indican que en el método de PTOCE en tiempo real que comprende la detección de señales a dos temperaturas, (i) la detección de señales a la temperatura de detección relativamente alta permite detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) las señales obtenidas a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja se pueden usar para detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja.
Por consiguiente, se pueden detectar dos ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Ejemplo 2: Detección de dos dianas mediante PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Los presentes inventores examinaron adicionalmente si se pueden detectar dos ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Se usó ADN polimerasaTaqque tenía una actividad nucleasa 5' para la extensión de cebadores en dirección 5' y cebadores en dirección 3', la escisión de la sonda TaqMan, la escisión de PTO y la extensión del fragmento de PTO. Se usaron ADN genómico deNeisseria gonorrhoeae(NG) y ADN genómico deChlamydia trachomatis(CT) como secuencias de ácidos nucleicos diana.
Se empleó PCR en tiempo real TaqMan para detectar CT. Si hay TC presente, se escinde una sonda TaqMan y se libera un fragmento marcado. Se puede obtener una curva de amplificación midiendo una señal del fragmento marcado. Se usó PCR en tiempo real de PTOCE para detectar NG.
En este Ejemplo, se seleccionó "72 °C" como temperatura de detección de señales para CT y "60 °C" como temperatura de detección de señales para NG teniendo en cuenta los medios de generación de señales. El dúplex extendido producido dependiendo de la presencia de NG tiene un valor de Tm controlable y ajustado por su secuencia y longitud. En este Ejemplo, la secuencia y longitud del dúplex extendido se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 60 °C, pero no para proporcionar una señal ya que se disocia para no formar el dúplex a 72 °C. En la temperatura de detección de 72 °C, se generará y se detectará la señal para CT. En la temperatura de detección de 60 °C, se generará y se detectará la señal para NG así como la señal para CT.
La sonda TaqMan está marcada con una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su extremo 5' y una molécula desactivadora en su extremo 3' (BHQ-2) (SEQ ID NO: 9). El PTO y el CTO están bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos 3' para impedir su extensión. El CTO está marcado con una molécula desactivadora (BHQ-2) y una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su porción de molde (SEQ ID NO: 4).
Se prepararon cuatro tubos de reacción que contenían CT, NG, una mezcla de CT y NG y sin control de diana respectivamente.
Las secuencias de cebador en dirección 5', cebador en dirección 3', PTO, CTO y sonda TaqMan utilizadas en este Ejemplo son:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red NG-CTO 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-R 5-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTFGIIIIITTATTGGAGA-3' (SEQ ID NO: 6)
CT-P 5'-[CAL Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3' (SEQ ID NO: 9) (I: Desoxiinosina)
(Las letras subrayadas indican la porción de marcaje en 5' de PTO)
La PCR en tiempo real se realizó en el volumen final de 20 |jl que contenía un ácido nucleico diana (10 pg de ADN genómico de<n>G, 10 pg de ADN genómico de CT o una mezcla de 10 pg de ADN genómico de NG y 10 pg de ADN genómico de CT), 10 pmoles de cebador en dirección 10' (SEQ ID NO: 1) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 2) para la amplificación de la diana de NG, 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 1 pmol de CTO (SEQ ID n O: 4), 10 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 5) y 12 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 6) para la amplificación de la diana de CT, 1 pmol de sonda TaqMan (SEQ ID NO: 9) y 10 j l de 2X Master Mix [final, dNTP 200 uM, MgCl<2>2 mM, 2 U de ADN polimerasaTaq],Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 min a 50 °C, se desnaturalizaron durante 15 min a 95 °C y se sometieron a 50 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 60 °C, 30 s a 72 °C. La detección de una señal se realizó a 60 °C y 72 °C de cada ciclo,
Como se muestra en la Fig, 2A, se detectaron señales a 72 °C en presencia de CT (Tubos 1 y 3), En presencia exclusiva de NG, se detectó una señal a 60 °C pero no a 72 °C (Tubo 2), No se detectó ninguna señal en ausencia de los ácidos nucleicos diana (Tubo 4), Los resultados de la Fig, 2A muestran que se genera la señal para CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta, pero la señal para NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja no se generó a la temperatura de detección relativamente alta, 72 °C, Por lo tanto, se apreciaría que la detección de señales a la temperatura de detección relativamente alta permitiera determinar al menos la presencia de CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta, Además, en el Tubo 2, usar la diferencia debida a la ausencia de una señal a la temperatura de detección relativamente alta y la presencia de una señal a la temperatura de detección relativamente baja permitió determinar la presencia de NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja,
La diferencia entre las señales detectadas a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja se calculó mediante diversos enfoques con el fin de examinar si la presencia de NG que tenía la temperatura de detección relativamente baja se puede detectar incluso en presencia o ausencia de la señal de CT que tenía la temperatura de detección relativamente alta (Fig, 2B ~ 2E),
La Fig, 2B muestra la relación de los valores de UFR de los puntos finales a 72 °C y 60 °C (todos los valores de UFR se derivaron y exportaron a partir de datos de análisis de "ajuste de curva restado del valor basal" en software instrumental), La relación en presencia exclusiva de CT (Tubo 1) fue de 1,1 pero, en presencia tanto de CT como de NG (Tubo 3) fue de 1,8, Además, la relación en presencia exclusiva de NG (Tubo 2) y en ausencia de cualquier ácido nucleico diana (Tubo 4) fue de 1278,0 y 1,0, respectivamente, Un umbral, 1,2, se aplicó para determinar la presencia o ausencia de NG, De acuerdo con el umbral, se confirmó la presencia de NG en los Tubos 2 y 3, y no hay NG en los Tubos 1 y 4, El umbral se determinó considerando la relación final del tubo que contenía solamente CT, Como alternativa, como Tubo 2, donde se puede determinar que la CT que tiene la temperatura de detección relativamente alta está ausente, el umbral para la señal a la temperatura de detección relativamente baja se puede establecer de forma independiente en lugar de aplicar 1,2,
Otro enfoque que usa las señales a 72 °C y 60 °C es calcular la relación de las señales de fluorescencia a 72 °C y 60 °C en cada uno de los ciclos y representar gráficamente la relación frente al ciclo (todos los valores de All UFR procesados para el trazado fueron se derivaron y exportaron de datos de análisis "Sin resta de valor basal" en software instrumental), Se aplicó umbral, 0,1, para determinar la presencia o ausencia de NG, El umbral se determinó considerando el gráfico de relación del tubo que contenía solamente CT, Como se muestra en la Fig, 2C, se comprobó la presencia de NG en los Tubos 2 y 3 y sus valores de Ct fueron 37,88 y 37,20, respectivamente, No hay valor de Ct obtenido en los Tubos 1 y 4, En lugar de calcular las relaciones, la intensidad fluorescente a 60 °C se puede restar de la de 72 °C en cada uno de los ciclos y trazar los resultados frente al ciclo para la detección de la diana,
La aplicación de umbrales individuales para el análisis de las señales obtenidas a 60 °C en cada tubo es otro método para detectar la presencia de NG que tiene la temperatura de detección relativamente baja usando la señal a la temperatura de detección relativamente alta, En el caso de que la señal que indica la presencia de CT se detecte a 72 °C, el umbral individual para la señal a 60 °C de los tubos se calculó multiplicando cada valor de UFR finales a 72 °C por un umbral (1,2), El umbral (1,2) se determinó considerando la relación final del tubo que contenía solamente CT (consúltese la Fig, 2B), En el caso de que no se detecte la señal a 72 °C, el umbral individual para la señal a 60 °C de los tubos se eligió y usó considerando la señal de fondo, la sensibilidad y la variación de señal o intervalo de error del dispositivo, de acuerdo con el establecimiento general de un umbral, En este Ejemplo, se determinó "200" como umbral individual para la señal a 60 °C,
Como se muestra en la Fig, 2D y la Fig, 2E, de acuerdo con el umbral individual a 60 °C, se confirmó la presencia de NG en el Tubo 2 y el Tubo 3 y, adicionalmente, sus valores de Ct se obtuvieron como 36,21 y 37,07, respectivamente, Ningún valor de Ct para NG estaba disponible en los Tubos 1 y 4,
Estos resultados indican que en el método de TaqMan/PTOCE en tiempo real que comprende la detección de señales a dos temperaturas, (i) la detección de señales a la temperatura de detección relativamente alta permite detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) las señales obtenidas a la temperatura de detección relativamente alta y la temperatura de detección relativamente baja se pueden usar para detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja,
Por consiguiente, se pueden detectar dos ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Ejemplo 3: Detección de dos dianas mediante PCR en tiempo real y análisis de fusión
Los presentes inventores examinaron si se pueden detectar dos ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una combinación de PCR en tiempo real y análisis de fusión.
Se usó ADN polimerasaTaqque tenía una actividad nucleasa 5' para la extensión de cebadores en dirección 5' y cebadores en dirección 3', la escisión de la sonda TaqMan, la escisión de PTO y la extensión del fragmento de PTO. Se usaron ADN genómico deNeisseria gonorrhoeae(NG) y ADN genómico deChlamydia trachomatis(CT) como secuencias de ácidos nucleicos diana.
Se empleó la PCR en tiempo real TaqMan para detectar CT y el análisis de fusión de PTOCE para detectar NG. Si hay TC presente, se escinde una sonda TaqMan y se libera un fragmento marcado. Si hay NG presente, se escinde un PTO y se produce un fragmento de PTO. El fragmento de PTO se hibrida con la porción de captura del CTO, extendido en la porción de molde del CTO y forma un dúplex extendido con el CTO (CTO dúplex).
Con el fin de detectar únicamente la señal fluorescente generada por la escisión de la sonda TaqMan durante el proceso de PCR en tiempo real, se realiza la detección de la señal fluorescente, a la temperatura a la que el dúplex extendido se disocia para no formar el dúplex y no se genera la señal del dúplex extendido formado por PTOCE. En el proceso de fusión, se mide una señal para obtener un pico de fusión que indica la presencia del dúplex extendido formado dependiendo de la presencia de NG.
La sonda TaqMan está marcada con una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su extremo 5' y una molécula desactivadora en su extremo 3' (BHQ-2) (SEQ ID NO: 9). El PTO y el CTO están bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos 3' para impedir su extensión. El CTO está marcado con una molécula desactivadora (BHQ-2) y una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su porción de molde (SEQ ID NO: 4).
Las secuencias de cebador en dirección 5', cebador en dirección 3', PTO, CTO y sonda TaqMan utilizadas en este Ejemplo son:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red NG-CTO
610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGNINTTATTGGAGA-3' (SEQ ID NO: 6)
CT-P 5'-[CAL Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3' (SEQ ID NO: 9) (I: Desoxiinosina)
(Las letras subrayadas indican la porción de marcaje en 5' de PTO)
La PCR en tiempo real se realizó en el volumen final de 20 pl que contenía un ácido nucleico diana (10 pg de ADN genómico de<n>G, 10 pg de ADN genómico de CT o una mezcla de 10 pg de ADN genómico de NG y 10 pg de ADN genómico de CT), 10 pmoles de cebador en dirección 10' (SEQ ID NO: 1) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 2) para la amplificación de la diana de NG, 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 1 pmol de CTO (SEQ ID<n>O: 4), 10 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 5) y 12 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 6) para la amplificación de la diana de CT, 1 pmol de sonda TaqMan (SEQ ID NO: 9) y 10 pl de 2X Master Mix [final, dNTP 200 uM, MgCl<2>2 mM, 2 U de ADN polimerasa Taq]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 min a 50 °C, se desnaturalizaron durante 15 min a 95 °C y se sometieron a 50 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 60 °C, 30 s a 72 °C. La detección de una señal se realizó 72 °C de cada ciclo. Después de la reacción, el tubo se colocó durante 5 min a 55 °C. El análisis de la curva de fusión se realizó midiendo una señal fluorescente durante el aumento de temperatura de 55 °C a 95 °C en un intervalo de 0,5 °C.
Como se muestra en la Figura 3, en presencia de CT, se obtuvo una curva de amplificación durante la PCR en tiempo real, pero no se observó ningún pico de fusión en el análisis de fusión (Tubo 1). En presencia de NG, no se obtuvo una curva de amplificación durante la PCR en tiempo real, pero en el análisis de fusión se observó un pico de fusión que tenía el valor de Tf esperado (66 °C) del dúplex extendido formado dependiendo de la presencia de NG (Tubo 2). En presencia de CT y NG, se observaron señales durante el proceso de PCR en tiempo real y el proceso de análisis de fusión (Tubo 3). No se detectó ninguna señal en ausencia de los ácidos nucleicos diana (Tubo 4).
Estos resultados indican que se puede detectar una pluralidad de ácidos nucleicos diana con un único canal de detección mediante una combinación de PCR en tiempo real y análisis de fusión.
Ejemplo 4: Genotipado de SNP mediante PCR en tiempo real que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Los presentes inventores examinaron si se puede aplicar una PCR en tiempo real que comprende detección de señales a una temperatura diferente al genotipado de SNP en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección.
Se usó ADN polimerasaTaqque tenía una actividad nucleasa 5' para la extensión de cebador en dirección 5' y cebador en dirección 3', la escisión de PTO y la extensión del fragmento de PTO. Se usaron homocigoto silvestre (C), homocigoto de tipo mutante (T) y heterocigoto de ADN genómico humano de MTHFR (C677T) como secuencias de ácidos nucleicos diana.
Se usó PCR en tiempo real de PTOCE para detectar el alelo silvestre (C) y el alelo de tipo mutante (T) del ADN genómico humano de MTHFR (C677T). Si hay preseente un alelo diana, se escinde un PTO y se produce un fragmento de PTO. El fragmento de PTO se hibrida con la porción de captura del CTO, extendido en la porción de molde del CTO y forma un dúplex extendido con CTO (CTO dúplex). La formación del dúplex extendido proporciona una señal y se puede obtener una curva de amplificación midiendo la señal a la temperatura de formación del dúplex extendido.
En este Ejemplo, se seleccionó "72 °C" como temperatura de detección de señales para el alelo silvestre (C) y "55 °C" como temperatura de detección de señales para el alelo de tipo mutante (T) teniendo en cuenta los medios de generación de señales. El dúplex extendido producido dependiendo de la presencia del alelo silvestre (C) o del alelo de tipo mutante (T) tiene un valor de Tf controlable y ajustado por su secuencia y longitud. En este Ejemplo, la secuencia y longitud del dúplex extendido para el alelo silvestre (C) se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 72 °C. Mientras tanto, la secuencia y longitud del dúplex extendido para el alelo de tipo mutante (T) se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 55 °C tanto, pero no para proporcionar una señal ya que se disocia para no formar el dúplex a 72 °C. En la temperatura de detección de 72 °C, se generará y detectará la señal para el alelo silvestre (C). En la temperatura de detección de 55 °C, se generará y detectará la señal para el alelo de tipo mutante (T), así como la señal para el alelo de tipo silvestre (C).
El PTO y el CTO están bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos 3' para impedir su extensión. El CTO está marcado con una molécula desactivadora (BHQ-2) y una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su porción de molde (SEQ ID NO: 13 y 15).
Las secuencias de cebador en dirección 5', cebador en dirección 3', PTO y CTO utilizadas en este Ejemplo son:
M677-F 5'-CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIIGAGGCTGACC-3' (SEQ ID NO: 10)
M677-R 5'-CAAGTGATGCCCATGTCGGIIIIIGCCTTCACAA-3' (SEQ ID NO: 11)
M677-W-PTO 5'-GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 12)
M677-W-CTO 5'-[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(CAL Fluor Red
610)]TCTTCTAACGTCGGGACC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 13) 5'-ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA[espaciador C3]-3' (SEQ ID M677-M-PTO NO: 14)
5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red M677-M-CTO 610)]ATTCTGCGAATCGACGT[espaciador C3] -3' (SEQ ID NO: 15)
(I: Desoxiinosina)
(Las letras subrayadas indican la porción de marcaje en 5' de PTO)
La PCR en tiempo real se realizó en el volumen final de 20 pl que contenía un ácido nucleico diana (1 ng de ADN genómico humano de MTHFR (C677T) homocigoto silvestre (C), 1 ng de ADN genómico humano de MTHFR (C677T) homocigoto mutante (T) o 1 ng de ADN genómico humano de MTHFR (C677T) heterocigoto), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 10) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 11), 3 pmol de cada PTO (SEQ ID NO: 12 y 14), 1 pmol de cada CTO (SEQ ID NO: 13 y 15) y 10 pl de 2X Master Mix [final, dNTP 200 uM, MgCh 2 mM, 2 U de ADN polimerasa Taq]. Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 min a 50 °C, se desnaturalizaron durante 15 min a 95 °C y se sometieron a 50 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 55 °C, 30 s a 72 °C. La detección de una señal se realizó a 55 °C y 72 °C de cada ciclo.
Como se muestra en la Fig. 4A, las señales se detectaron a 72 °C y 55 °C en presencia del homocigoto silvestre (C) (Tubo 1) o en presencia del heterocigoto (Tubo 3). En presencia del homocigoto mutante (T), se detectó una señal intensa a 55 °C pero una señal muy débil a 72 °C (Tubo 2). No se detectó ninguna señal en ausencia de los ácidos nucleicos diana (Tubo 4).
La Fig. 4B muestra la relación de los valores de UFR de los puntos finales a 72 °C y 55 °C (todos los valores de UFR se derivaron y exportaron a partir de datos de análisis de "ajuste de curva restado del valor basal" en software instrumental). La relación en presencia del homocigoto silvestre (C) (Tubo 1) fue de 1,2 pero, en presencia del heterocigoto (Tubo 3) fue de 1,9. Dicha diferencia entre las dos relaciones indica que el alelo mutante (T) existe con el alelo silvestre (C) en el tubo que comprende el heterocigoto. Al mismo tiempo, la relación obtenida del homocigoto mutante (T) fue relativamente muy grande, ya que el valor de UFR a 72 °C era bajo (Tubo 2). Considerando el hecho de que un alelo silvestre y un alelo mutante están presentes en una relación de 1:1 en un heterocigoto, se puede apreciar que la señal débil detectada a 72 °C en presencia de homocigoto de tipo mutante es una señal falsa positiva. De acuerdo con el presente método para el genotipado de SNP, el valor de relación sirve para determinar si la señal a la temperatura de detección relativamente alta es una señal falsa o no.
Estos resultados indican que se puede aplicar una PCR en tiempo real que comprende la detección de señales a una temperatura diferente al genotipado de SNP con un único canal de detección y que la diferencia obtenida de las señales a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja se puede usar para el genotipado de SNP.
Ejemplo 5: Detección de múltiples dianas mediante PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Los presentes inventores examinaron adicionalmente si se pueden detectar ácidos nucleicos diana triples en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas.
Se usó ADN polimerasaTaqque tenía una actividad nucleasa 5' para la extensión de cebadores en dirección 5' y cebadores en dirección 3', la escisión de la sonda TaqMan, la escisión de PTO y la extensión del fragmento de PTO. Se usaron ADN genómico deNeisseria gonorrhoeae(NG), ADN genómico deChlamydia trachomatis(CT) y ADN genómico deMycoplasma genitalium(MG) como secuencias de ácidos nucleicos diana.
Se empleó PCR en tiempo real TaqMan para detectar MG. Se usó PCR en tiempo real de PTOCE para detectar CT y NG.
En este Ejemplo, se seleccionó "95 °C" como temperatura de detección de señales para MG, se seleccionó "72 °C" como temperatura de detección de señales para Ct y "60 °C" como temperatura de detección de señales para NG teniendo en cuenta los medios de generación de señales. En este Ejemplo, la secuencia y longitud del dúplex extendido de CT o NG se diseña para proporcionar una señal a medida que forma el dúplex a 72 °C o 60 °C, respectivamente, pero no para proporcionar una señal ya que se disocia para no formar el dúplex a 95 °C. En la temperatura de detección de 95 °C, se generará y se detectará la señal para MG. En la temperatura de detección de 72 °C, se generará y se detectará la señal para CT así como la señal para MG. Además, en la temperatura de detección de 60 °C, se generará y detectará la señal para NG, así como la señal para MG y CT.
La sonda TaqMan está marcada con una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su extremo 5' y una molécula desactivadora en su extremo 3' (BHQ-2) (SEQ ID NO: 18). El PTO y el CTO están bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos 3' para impedir su extensión. CTO está marcado con una molécula desactivadora (BHQ-2) y una molécula indicadora fluorescente (CAL Fluor Red 610) en su porción de molde (SEQ ID NO: 4 y 8).
Se prepararon ocho tubos de reacción que contenían NG, CT, MG, una mezcla de NG y CT, una mezcla de NG y MG, una mezcla de CT y MG, una mezcla de NG, CT y MG, y sin control de diana respectivamente.
Las secuencias de cebador en dirección 5', cebador en dirección 3', PTO, CTO y sonda TaqMan utilizadas en este Ejemplo son:
NG-F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIINGTAATCAGATG-3' (SEQ ID NO: 1)
NG-R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIINCGAGCAAGAAC-3' (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5'-GTAGGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 3) NG-CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 4)
CT-F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIINITTTGTATAAC-3' (SEQ ID NO: 5)
CT-R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGNINTTATTGGAGA-3' (SEQ ID NO: 6)
(continuación)
5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: CT-PTO
7)
CT-CTO 5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[espaciador C3]-3' (SEQ ID NO: 8)
MG-F 5'-AAAACCCACGGAAATGATGAGANNIATTGGTTCTAC-3' (SEQ ID NO: 16)
MG-R 5'-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTGNINCTGATAAAAG-3' (SEQ ID NO: 17)
MG-P 5'-[CAL Fluor Red 610]GAGTTCTTTCAAGAACAGCAAGAGGTGT[BHQ-2]-3' (SEQ ID NO: 18) (I: Desoxiinosina)
(Las letras subrayadas indican la porción de marcaje en 5' de PTO)
La PCR en tiempo real se realizó en el volumen final de 20 pl que contenía un ácido nucleico diana (10 pg de ADN genómico de NG, 10 pg de ADN genómico de CT, 10 pg de ADN genómico de MG, una mezcla de cada 10 pg de ADN genómico de NG y CT, una mezcla de cada 10 pg de ADN genómico de NG y MG, una mezcla de cada 10 pg de ADN genómico de CT y MG; o una mezcla de cada 10 pg de ADN genómico de NG, CT y MG), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 1) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 2) para la amplificación de la diana de NG, 3 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 1 pmol de CTO (SEQ ID NO: 4), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 5) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 6) para la amplificación de la diana de CT, 3 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 1 pmol de CTO (SEQ ID NO: 8), 5 pmoles de cebador en dirección 5' (SEQ ID NO: 16) y 5 pmoles de cebador en dirección 3' (SEQ ID NO: 17) para la amplificación de la diana de MG, 1 pmol de sonda TaqMan (SEQ ID NO: 18) y 10 pl de 2X Master Mix [final, dNTP 200 uM, MgCh 2 mM, 2 U de ADN polimerasaTaq],Los tubos que contenían la mezcla de reacción se colocaron en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) durante 5 min a 50 °C, se desnaturalizaron durante 15 min a 95 °C y se sometieron a 50 ciclos de 30 s a 95 °C, 60 s a 60 °C, 30 segundos a 72 °C. La detección de una señal se realizó a 60 °C, 72 °C y 95 °C de cada ciclo,
Como se muestra en las Fig, 5A, 5B y 5C, las señales detectadas a 95 °C permitieron determinar al menos la presencia de MG que tiene la temperatura de detección relativamente más alta (95 °C) en los Tubos 3, 5, 6 y 7,
Usar la diferencia debida a la ausencia de una señal en la temperatura de detección relativamente más alta (95 °C) y la presencia de una señal en la temperatura de detección relativamente media (72 °C) permitió determinar la presencia de CT que tenía la temperatura de detección relativamente media (72 °C) en los Tubos 2 y 4, Adicionalmente,
Usar la diferencia debida a la ausencia de una señal a la temperatura de detección relativamente media (72 °C) y la presencia de una señal a la temperatura de detección relativamente más baja (60 °C) permitió determinar la presencia de NG que tenía la temperatura de detección relativamente más baja (60 °C) en el Tubo 1,
La diferencia entre las señales detectadas a 95 °C, 72 °C y 60 °C se calculó restando las UFR finales (AUFR finales) con el fin de examinar si CT o NG copresentes con otras dianas se pueden identificar en un único recipiente de reacción,
La Fig, 5D muestra AUFR finales calculados con los valores de UFR de los puntos finales a 95 °C y 72 °C (todos los valores de UFR se derivaron y exportaron a partir de datos de análisis de "ajuste de curva restado del valor basal" en software instrumental), Se aplicó el umbral "300" para determinar la presencia de CT, El umbral se determinó considerando los AUFR finales de los tubos que no contenían CT (Tubos 1, 3 y 5), De acuerdo con el umbral, se confirmó la presencia de TC en los Tubos 2, 4, 6 y 7,
La Fig, 5E muestra AUFR finales calculados con los valores de UFR de los puntos finales a 72 °C y 60 °C (todos los valores de UFR se derivaron y exportaron a partir de datos de análisis de "ajuste de curva restado del valor basal" en software instrumental), Se aplicó el umbral "800" para determinar la presencia de NG, El umbral se determinó considerando los AUFR finales de los tubos que no contenían NG (Tubos 2, 3 y 6), De acuerdo con el umbral, se confirmó la presencia de NG en los Tubos 1, 4, 5 y 7,
Estos resultados indican que en el método de TaqMan/PTOCE en tiempo real que comprende la detección de señales a tres temperaturas, (i) la detección de señales a la temperatura de detección relativamente más alta permite detectar la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta y (ii) la diferencia obtenida de las señales a diferentes temperaturas de detección se puede usar para identificar las secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen las temperaturas de detección inferiores a la temperatura de detección más alta,
Por consiguiente, se puede detectar una pluralidad de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción mediante el uso de un único canal de detección y una PCR en tiempo real de TaqMan/PTOCE que comprende detección de señales a diferentes temperaturas,
Habiéndose descrito una realización preferida de la presente invención, se ha de entender que las variantes y modificaciones de la misma que caen dentro del espíritu de la invención pueden resultar evidentes para los expertos en esta materia, y el alcance de la presente invención se ha de determinar mediante las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja usando un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta, y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, usando un valor de referencia, en donde el valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa (a) se realiza en un proceso de amplificación de señal simultáneamente con una amplificación de ácido nucleico o sin una amplificación de ácido nucleico.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex; o un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex; o un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la diferencia comprende una diferencia que se ha de obtener procesando matemáticamente la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando la señal no se detecta a la temperatura de detección relativamente alta, la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se realiza mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja sin considerar ninguna detección de la señal a la temperatura de detección relativamente alta.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las dos secuencias de ácidos nucleicos diana comprenden una variación de nucleótidos y una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana comprende un tipo de la variación de nucleótidos y la otra comprende otro tipo de variación de nucleótidos.
8. Un método para el genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra que comprende la secuencia de ácido nucleico que contiene un sitio de SNP (polimorfismo de un solo nucleótido) y un medio de generación de señales para la detección de alelos de SNP en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja mediante el uso de un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada uno de los alelos de SNP es detectado por un medio de generación de señales específico de alelo; en donde uno de los alelos de SNP se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y el otro se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales;
(b) determinar un genotipo de SNP por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en la etapa (a), usando al menos uno de los valores de referencia, en donde un valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta con medios de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con los medios de generación de señales específicos de alelo en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; y el otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
9. Un método para detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con al menos tres medios de generación de señales para la detección de al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada usando un único tipo de detector a al menos tres temperaturas de detección; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como un ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección diferente; en donde los al menos tres medios de generación de señales determinan las al menos tres temperaturas de detección; en donde una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección; en donde los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales; y
(b) determinar la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la etapa (b) se realiza determinando en primer lugar la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección relativamente más alta y después determinando secuencialmente la presencia de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección relativamente más bajas en un orden descendente.
11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la diferencia comprende una diferencia que se ha de obtener procesando matemáticamente la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada.
12. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde cuando la señal no se detecta a temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada, la determinación de la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se realiza mediante la señal detectada a la temperatura de detección determinada sin considerar ninguna detección de la señal a las temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1-12, en donde los medios de generación de señales para cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales para generar una señal de manera dependiente de la formación de un dúplex.
14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1-13, en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente más alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección, y los medios de generación de señales para las otras secuencias de ácidos nucleicos diana son un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex.
15. Un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) incubar la muestra con dos medios de generación de señales para la detección de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana en un único recipiente de reacción y detectar una señal generada a la temperatura de detección relativamente alta y a la temperatura de detección relativamente baja usando un único tipo de detector; en donde la incubación y la detección se realizan mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales; en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección o mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana; y
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
16. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que contenga instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para determinar la presencia de dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, comprendiendo el método:
(a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja, usando un valor de referencia, en donde el valor de referencia se obtiene (i) incubando la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta con un medio de generación de señales para la detección de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
17. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para el genotipado de SNP de una secuencia de ácido nucleico en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada uno de los alelos de SNP es detectado por un medio de generación de señales específico de alelo; en donde uno de los alelos de SNP se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y el otro se designa como un alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de alelo a partir de los medios de generación de señales para el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales;
(b) determinar un genotipo de SNP por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja en la etapa (a), usando al menos uno de los valores de referencia, en donde un valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta con medios de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un heterocigoto compuesto tanto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente alta como por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con los medios de generación de señales específicos de alelo en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja; y el otro valor de referencia se obtiene (i) incubando un homocigoto compuesto por el alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja con un medio de generación de señales para la detección del alelo de SNP que tiene la temperatura de detección relativamente baja en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales tanto a la temperatura de detección relativamente alta como a la temperatura de detección relativamente baja, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
18. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para detectar al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) recibir señales detectadas a al menos tres temperaturas de detección mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana es detectada por un medio de generación de señales específico de la diana; en donde cada una de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como un ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección diferente; en donde una temperatura de detección es una temperatura capaz de generar no sólo una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección, sino también una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección superior a la temperatura de detección; en donde los al menos tres medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los medios de generación de señales; y
(b) determinar la presencia de las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde cuando se determina la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana que tiene una temperatura de detección determinada entre las al menos tres secuencias de ácidos nucleicos diana, la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección determinada se determina por una diferencia entre la señal detectada a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada, usando al menos un valor de referencia entre los valores de referencia, en donde los valores de referencia se obtienen (i) incubando todas las combinaciones de secuencias de ácidos nucleicos diana que tienen temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada con medios de generación de señales específicos de la diana en un recipiente de reacción distinto del recipiente de reacción en la etapa (a), (ii) detectando señales no sólo a una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada sino también a la temperatura de detección determinada, y (iii) obteniendo después una diferencia entre la señal detectada a las una o más temperaturas de detección superiores a la temperatura de detección determinada y la señal detectada a la temperatura de detección determinada; en donde cuando la temperatura de detección determinada es una temperatura de detección relativamente más alta entre las temperaturas de detección, la presencia de una secuencia de ácido nucleico diana se determina mediante la señal detectada a una temperatura de detección determinada.
19. Un medio de almacenamiento legible por ordenador que contiene instrucciones para configurar un procesador para realizar un método para detectar dos secuencias de ácidos nucleicos diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende:
(a) recibir tanto una señal detectada a una temperatura de detección relativamente alta como una señal detectada a una temperatura de detección relativamente baja mediante una reacción de amplificación en tiempo real; en donde una de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y la otra se designa como una secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja; en donde los dos medios de generación de señales determinan las dos temperaturas de detección; en donde (i) la temperatura de detección relativamente alta es una temperatura capaz de generar una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la temperatura de detección relativamente baja es una temperatura capaz de generar tanto una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja como una señal específica de la diana a partir de los medios de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta; en donde los dos medios de generación de señales comprenden un oligonucleótido que contiene un marcador fluorescente idéntico y el único tipo de detector no diferencia las señales que han de generar los dos medios de generación de señales;
en donde el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta es un medio de generación de señales mediante escisión de un oligonucleótido de detección o mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana, y el medio de generación de señales para la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja es un medio de generación de señales mediante la formación de un dúplex de manera dependiente de la escisión de un oligonucleótido de mediación hibridado específicamente con la secuencia de ácido nucleico diana; y
(b) determinar la presencia de las dos secuencias de ácidos nucleicos diana mediante las señales detectadas en la etapa (a); en donde (i) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente alta se determina mediante la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y (ii) la presencia de la secuencia de ácido nucleico diana que tiene la temperatura de detección relativamente baja se determina por una diferencia entre la señal detectada a la temperatura de detección relativamente alta y la señal detectada a la temperatura de detección relativamente baja.
20. Un dispositivo para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra usando diferentes temperaturas de detección, que comprende (a) un procesador informático y (b) el medio de almacenamiento legible por ordenador de una cualquiera de las reivindicaciones 16-19 acoplado al procesador informático.
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