SA516371903B1 - الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف - Google Patents
الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف Download PDFInfo
- Publication number
- SA516371903B1 SA516371903B1 SA516371903A SA516371903A SA516371903B1 SA 516371903 B1 SA516371903 B1 SA 516371903B1 SA 516371903 A SA516371903 A SA 516371903A SA 516371903 A SA516371903 A SA 516371903A SA 516371903 B1 SA516371903 B1 SA 516371903B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- detection temperature
- signal
- detection
- target
- temperature
- Prior art date
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 1681
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 167
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 131
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 121
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 96
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims abstract description 31
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims abstract description 31
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 798
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 343
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 claims description 285
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 225
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 110
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 89
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 89
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 75
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 73
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 50
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 50
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 44
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 43
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 39
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 39
- 238000003860 storage Methods 0.000 claims description 34
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 33
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 32
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 27
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 26
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 26
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 23
- 238000011897 real-time detection Methods 0.000 claims description 17
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 10
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 7
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims description 3
- 241001136792 Alle Species 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 2
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 claims 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 132
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 96
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 62
- 206010015995 Eyelid ptosis Diseases 0.000 description 40
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 40
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 37
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 34
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 29
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 239000002585 base Substances 0.000 description 26
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 21
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 21
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 18
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 description 17
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 17
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 16
- 201000003004 ptosis Diseases 0.000 description 16
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 15
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 15
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 12
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 11
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 11
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 10
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 description 9
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 9
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 6
- 101100234002 Drosophila melanogaster Shal gene Proteins 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 101100113998 Mus musculus Cnbd2 gene Proteins 0.000 description 6
- 244000166071 Shorea robusta Species 0.000 description 6
- 235000015076 Shorea robusta Nutrition 0.000 description 6
- SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-{[2-(3,4-dimethoxyphenyl)ethyl](methyl)amino}-2-(propan-2-yl)pentanenitrile Chemical compound C1=C(OC)C(OC)=CC=C1CCN(C)CCCC(C#N)(C(C)C)C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 SGTNSNPWRIOYBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000589596 Thermus Species 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 5
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 5
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 4
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 3
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 241000207208 Aquifex Species 0.000 description 2
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 101150105088 Dele1 gene Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100029684 Methylenetetrahydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010053210 Phycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 241000239226 Scorpiones Species 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000205188 Thermococcus Species 0.000 description 2
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 description 2
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 2
- MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J ToTo-1 Chemical compound [I-].[I-].[I-].[I-].C12=CC=CC=C2C(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=CC=[N+]1CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C)(C)CCC[N+](C1=CC=CC=C11)=CC=C1C=C1N(C)C2=CC=CC=C2S1 MZZINWWGSYUHGU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=CC(=[NH2+])C=C2OC2=CC(N)=CC=C21 MYFATKRONKHHQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 2',7'-difluorofluorescein Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(F)C(=O)C=C2OC2=CC(O)=C(F)C=C21 VGIRNWJSIRVFRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XQDQRCRASHAZBA-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-1-thiocyanatobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(SC#N)C([N+]([O-])=O)=C1 XQDQRCRASHAZBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010037497 3'-nucleotidase Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000212384 Bifora Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102100038736 Histone H3.3C Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001031505 Homo sapiens Histone H3.3C Proteins 0.000 description 1
- 101000587058 Homo sapiens Methylenetetrahydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000508310 Meiothermus chliarophilus Species 0.000 description 1
- 241000589496 Meiothermus ruber Species 0.000 description 1
- 241000508289 Meiothermus silvanus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010030837 Methylenetetrahydrofolate Reductase (NADPH2) Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101000860173 Myxococcus xanthus C-factor Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100063424 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) dim-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100333320 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) end-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007256 Nevus Diseases 0.000 description 1
- 108010067035 Pancrelipase Proteins 0.000 description 1
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241001148023 Pyrococcus abyssi Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 241000205192 Pyrococcus woesei Species 0.000 description 1
- 241000204670 Pyrodictium occultum Species 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101150107869 Sarg gene Proteins 0.000 description 1
- 241001237851 Thermococcus gorgonarius Species 0.000 description 1
- 241000205180 Thermococcus litoralis Species 0.000 description 1
- 241000204652 Thermotoga Species 0.000 description 1
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 1
- 241000015345 Thermus antranikianii Species 0.000 description 1
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 1
- 241000015334 Thermus igniterrae Species 0.000 description 1
- 241000557726 Thermus oshimai Species 0.000 description 1
- 241001522143 Thermus scotoductus Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 210000003555 cloaca Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 229940092125 creon Drugs 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 1
- 238000013211 curve analysis Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- NGCVJRFIBJVSFI-UHFFFAOYSA-I magnesium green Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[K+].C1=C(N(CC([O-])=O)CC([O-])=O)C(OCC(=O)[O-])=CC(NC(=O)C=2C=C3C(C4(C5=CC(Cl)=C([O-])C=C5OC5=CC([O-])=C(Cl)C=C54)OC3=O)=CC=2)=C1 NGCVJRFIBJVSFI-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 1
- 108700038288 rhodamine-phalloidin Proteins 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002863 seminiferous tubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
- C12Q1/682—Signal amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N25/00—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means
- G01N25/02—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating changes of state or changes of phase; by investigating sintering
- G01N25/04—Investigating or analyzing materials by the use of thermal means by investigating changes of state or changes of phase; by investigating sintering of melting point; of freezing point; of softening point
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
يتعلق الاختراع الحالي بالكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. يستخدم الاختراع الحالي درجات حرارة مختلفة للكشف تتيح الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بطرق زمن حقيقي تقليدية حتى مع وجود نوع واحد من التسمية في وعاء تفاعل واحد. تكشف التقنيات التقليدية عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق تحليل الانصهار بعد تضخيم الهدف. ومن المستبعد، ألا يتطلب الاختراع الحالي تحليل انصهار بعد تضخيم الهدف، بحيث يتم تقليل زمن التحليل بشكل كبير الرسم الأكثر توضيحي هو الشكل 1 ايه
Description
الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES USING DIFFERENT DETECTION TEMPERATURES الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع الحالي بالكشف عن تتابعات حمض نووي 1071101616 مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة؛ يتم استخدام طرق كشف في الزمن الحقيقي على نطاق واسع للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة مع مراقبة تضخيم الهدف بطريقة الزمن الحقيقي. تستخدم طرق الكشف في الزمن الحقيقي diay عامة مجسات probes موسومة أو بادئات primers مهجنة hybridized على وجه التحديد بتتابعات حمض نووي مستهدفة. تتضمن الطرق التمثيلية باستخدام التهجين hybridization بين المجسات الموسومة وتتابعات الحمض النووي المستهدفة طريقة بياكون DEACON الجزيئية باستخدام مجسات مزدوجة التوسيم بهيكل على 0 شكل دبوس شعر (تياجي إت Jl التكنولوجيا الحيوية الطبيعة في. 14 مارس 1996 Tyagi et Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996 ,8)» طريقة هيبياكون HyBeacon (الفرنسية دج وآخرون؛ مول. تحقيقات الخلية» 15 )6(: 374-363 )2001(( French DJ) ¢(et al., Mol.
Cell Probes, 15(6):363-374(2001) طريقة مجس التهجين باستخدام مجسين أحدهم موسوم متبرع والآخر مستقبل (بيرناد إت آل» 148-147 كلين تشيم $2000 46( (Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 5 وطريقة لوكس Lux باستخدام أوليجونيوكليوتيدات Oligonucleotides موسومة مفردة (البراءة الأمريكية رقم 7,537,886( طريقة تاكمان TagMan (البراءات الأمريكية أرقام 5,210,015 و5,538,848) باستخدام مجسات موسومة مزدوجة وبتم وانشقاقها بواسطة نشاط 5'- نيوكلياز nuclease لبلمرة الحمض التووي دي ان ايه DNA على نطاق واسع في المجال.
الطرق التمثيلية تستخدام وصفت الاشعال تتضمن الطريقة التمهيدية شروق الشمس Sunrise (نازارينكو إت آل» 2521-2516 بحوث الأحماض النووية -2516 Nazarenko et al, alae «1997 «2521 Nucleic Acids Research 25؛ رقم 12( والبراءة الأمريكية رقم 6,117,635( الطريقة التمهيدية العقرب Scorpion (وبتكومب إت آل 807-804« التكنولوجيا الحيوية الطبيعة Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology مجلد 17 أغسطس 1999 والبراءة الأمريكية رقم 6,326,145) و الطريقة التمهيدية تي اس > sell) TSG الدولية 2011/078441). وكطرق بديلة؛ تم اقتراح طرق كشف في الزمن الحقيقي باستخدام مزدوجات متكونة اعتماداً على وجود تتابعات حمض نووي مستهدفة: التحليل الغاني Invader assay (البراءات الأمريكية أرقام 0 5.691.149 و 6.358.591 و 6.194.149)؛ طريقة بتوسي PTOCE (شطر cleavage بي تي او PTO وامتداد extension دي ان ايه (AND طريقة (البراءة الدولية 096523/2012( 2 سي اي - اس اتش 505-51 (شطر وامتداد بي تي او على أساس إرسال إشارات تهجين النيوكليوتيد) (PTO Cleavage and Extension—-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) وطريقة (البراءة الدولية 15442/2013)؛ 5 بي سي اي - ان اتش PCE-NH (شطر وامتداد بي تي او لا تعتمد على التهجين) (PTO Cleavage and Extension—-Dependent Non—Hybridization) وطريقة (بي سي تي/ كيه ار/ 012312/2013(. تكشف تقنيات الكشف في الزمن الحقيقي التقليدية الموصوفة سابقاً عن الإشارات المتولدة من الواسمات التألقية عند درجة حرارة كشف محددة في عملية تضخيم الإشارة المرتبطة أو غير 0 المرتبطة بتضخيم الهدف. عندما يتم الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام نوع واحد من الواسمات في أنبوبة تفاعل واحد وفقاً للتقنيات التقليدية للكشف في الزمن الحقيقي؛ لاتختلف الإشارات المتولدة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة عن بعضها البعض. لهذاء تستخدم التقنيات التقليدية للكشف في الزمن الحقيقي بصفة عامة أنواع مختلفة من الواسمات للكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. يسمح تحليل الانصهار باستخدام فرق تي ام TM بالكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة وحتى نوع واسم واحد. ومع
ذلك؛ فإن لتحليل الانصهار عيوب خطيرة حيث يكون زمن أدائه أطول من تقنيات الزمن الحقيقي pian تصميم المجسات بقيم تي ام مختلفة أكثر صعوية عند زيادة تتابعات الهدف. وعليه؛ حيث لا تعتمد الوسائل أو الطرق على تحليل الانصهار للكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة يتم تطوير نوع واسم واحد في وعاء تفاعل واحد ونوع واحد من الكواشف؛ يتيح هذا الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بزيادة كبيرة في
الملائمة؛ الفاعلية من حيث التكلفة والكفاءة. بالإضافة إلى ذلك؛ ستؤدي توليفة الطرق الجديدة مع طرق كشف أخرى Je) سبيل المثال؛ تحليل الانصهار إلى الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام نوع واسم واحد في وعاء تفاعل واحد بكفاءة معززة بشكل
0 وعلى مدى هذا الوصف؛ يشار إلى براءات ومنشورات مختلفة وترد استشهادات بين أقواس. يدخل وصف هذه البراءات والمنشورات بالكامل هنا على سبيل المرجعية فى هذا الطلب لمزيد من الوصف الكامل لهذا الاختراع وحالة التقنية الصناعية التي يتعلق بها الاختراع. الوصف العام للاختراع قام المخترعون الحاليون بأبحاث مكثفة لتطوير طرق جديدة للكشف عن العديد من تابعات الحمض
5 النووي المستهدفة باستخدام نوع واسم واحد في وعاء أحادي التفاعل ونوع واحد من الكواشف. ونتيجة لذلك؛ فقد وجدنا أنه يتم الحصول على الإشارات لتتابعات الحمض النووي المستهدفة في درجات حرارة كشف مضبوطة ثم يتم تفسير نتائج الكشف يشكل مناسب» مما يتيح بالتالي الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام نوع واسم واحد في وعاء أحادي التفاعل ونوع واحد من الكواشف بملائمة؛ فاعلية من حيث التكلفة وكفاءة معززة بشكل كبير.
0 وعليه؛ فإن هدف هذا الاختراع هو توفير طريقة ومجموعة للكشف عن تتابعي حمض نووي مستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. هدف HAT لهذا الاختراع هو توفير طريقة ومجموعة للتنميط الجيني genotyping اس ان بي SNP (تعدد أشكال نيوكليوتيد واحد (single nucleotide polymorphism لتتابع حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف.
هدف آخر أيضاً لهذا الاختراع هو توفير طريقة ومجموعة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل فى عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. هدف آخر لهذا الاختراع هو توفير طريقة ومجموعة للكشف عن اثنين من تتابعات حمض نووي مستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل انصهار.
هدف آخر Lad لهذا الاختراع هو توفير طريقة ومجموعة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام تحليل درجة حرارة الكشف وتحليل الانصهار. هدف آخر لهذا الاختراع هو توفير وسط تخزين مقروء عن طريق جهاز الكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لاداء طريقة لتعيين وجود اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف.
0 هدف آخر أيضاً لهذا الاختراع هو توفير جهاز للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. هدف آخر لهذا الاختراع هو توفير برنامج كمبيوتر للتخزين على وسط تخزين قابل للقراءة عن طريق الكمبيوتر لتكوين معالج لاداء طريقة لتعيين وجود اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة فى عينة.
5 هدف آخر أيضاً لهذا الاختراع هو توفير وسط تخزين مقروء عن طريق الكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لاداء طريقة لتعيين وجود ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. وستصبح أهداف ومزايا أخرى للاختراع الحالي واضحة من الوصف التفصيلي لمتابعة مأخوذة
شرح مختصر للرسومات شكل 11 Jie نتائج الكشف وفقاً للاختراع الحالي باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني genome لاجل الكلاميديا
التراخوماتية «Chlamydia trachomatis سي تي (CT والذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً )72 درجة مئوية)؛ تتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني لاجل النيسرية البنية (Neisseria gonorrhoeae ان جي (NG والذي له درجة حرارة CIS منخفضة نسبياً (60 درجة مئوية) وتوليفات منها. تم توليد الإشارات ل سي تي و ان جي بواسطة طريقة بي سي ار PCR (تفاعل سلسلة بوليمراز (polymerase chain reaction الزمن الحقيقي بتوسي. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوبة 1 (سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوية 2 (إن جي)؛ الصف الثالث Asal 3 (سي تي + ان جي)؛ والصف الرابع لأنبوبة 4 (ان تي سي :NTC بدون ضابط هدف (No Target Control المنحنيات في العمود الأيسر والعمود الأيمن في كل صف هي نتائج "درجة حرارة الكشف 72 درجة مثوية” و "درجة حرارة الكشف 60 درجة مثوية"؛ على التوالي. في المنحنيات؛ يمثل محور - ص لا ار اف يو RFU (وحدة الومضان النسبي) ويمثل محور - س X الدورات cycles شكل 1ب يمثل تعيين وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً عن طريق رسم مخطط للنسب ما بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. في هذا الشكل؛ يمثل محور - ص نسبة ار 5 اف يو عند 60 درجة مئوية إلى ار اف يو عند 72 درجة مئوية عند كل دورة ويمثل محور- س الدورات. يمثل الخط الأفقي المتواصل الحد الأدنى. تمثل المنحنيات المشار إليها بالرموز ”-0-“؛ XO fp FSA النتيجة من أنبوية 1 سي تي ؛ أنبوبة 2 ان جي ؛ Lgl 3 سي تي + ان جي وأنبوبة 4 ان تي سي (بدون ضابط هدف)؛ على التوالي. المنحنيات ملخصة في جدول 2 شكل 1ج يمثل تعيين وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً عن طريق الفرق بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياًء حيث يتم تعديل الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبيا إلى الحد الأدنى واستخدامها للحصول على الفرق. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوية 1 (سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوية 2 (ان جي)؛ الصف الثالث لأنبوية 3 (سي 5 تي + ان جي)؛ والصف الرابع لأنبوية 4 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). المنحنيات في العمود
الأيسر والعمود الأيمن في كل صف هي نتائج "درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية” و'درجة حرارة الكشف 60 درجة مئوية"؛ على التوالي. في المنحنيات؛ يمثل محور- ص ار اف يو ويمثل محور- س الدورات. يمثل الخط الأفقي المتواصل في منحنيات العمود الأيسر والعمود الأيمن "الحد الأدنى” و”الحد الأدنى الفردي”؛ على التوالي. المنحنيات ملخصة في جدول 3.
شكل 2 يمثل نتائج الكشف وفقاً للاختراع الحالي باستخدام درجات حرارة الكشف المختلفة للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية » سي تي) والذي له درجة حرارة RIS عالية نسبياً (72 درجة مئوية)؛ تتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية ؛ ان جي) والذي له درجة Bla كشف منخفضة نسبياً )60 درجة مئوية) وتوليفات منها. تم توليد الإشارة ل سي تي
0 بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي تاكمان؛ وتوليد الإشارة ل ان جي بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم Lal 1 (سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوبة 2 Of) جي)؛ الصف الثالث sald 3 (سي تي + ان جي)؛ والصف الرابع لأنبوبية 4 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). المنحنيات في العمود الأيسر والعمود الأيمن في كل صف هي نتائج "درجة حرارة الكشف 72 درجة مثوية” و "درجة حرارة الكشف 60 درجة
مئثوية"؛ على التوالي. في المنحنيات؛ يمثل محور- Ga اف يو ويمثل محور- س الدورات. شكل لب يمثل تعيين وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً عن طريق رسم مخطط للنسب ما بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. في هذا الشكل؛ يمثل محور- ص نسبة ار اف يو عند 60 درجة مئوية إلى ار اف يو عند 72 درجة مئوية عند كل دورة ويمثل محور - س
0 الدورات. يمثل الخط الأفقي المتواصل الحد الأدنى. تمثل المنحنيات المشار إليها بالرموز ”-0-“؛ XO fp FSA النتيجة من أنبوية 1 سي تي ؛ أنبوبة 2 ان جي ؛ Lgl 3 سي تي + ان جي وأنبوبة 4 ان تي سي (بدون ضابط هدف)؛ على التوالي. المنحنيات ملخصة في جدول 5 شكل 22 Sia تعيين وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجة حرارة كشف
5 منتخفضة نسبياً عن طريق الفرق بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند
درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً» حيث يتم تعديل الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً إلى الحد الأدنى واستخدامها للحصول على الفرق. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوية 1 (سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوية 2 (ان جي)؛ الصف الثالث لأنبوية 3 (سي تي + ان جي)؛ والصف الرابع لأنبوية 4 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). المنحنيات في العمود الأيسر والعمود الأيمن في كل صف هي نتائج "درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية” و”درجة حرارة الكشف 60 درجة مئوية"؛ على التوالي. في المنحنيات؛ يمثل محور- ص ار اف يو ويمثل محور - س الدورات. يمثل الخط الأفقي المتواصل في منحنيات العمود الأيسر والعمود الأيمن "الحد الأدنى” و”الحد الأدنى الفردي”؛ على التوالي. المنحنيات ملخصة في جدول 6. شكل 3 يمثل نتائج الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني 0 من الكلاميديا التراخوماتية ¢ سي تي) والذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً (72 درجة مئوية)؛ تتابع الحمض النووي المستهدف (الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية ¢ ان جي) والذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً (60 درجة مئوية) وتوليفات منها وفقاً لكل من بي سي ار الزمن الحقيقي باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل انصهار. تم توليد الإشارة ل سي تي بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي LSE وتوليد الإشارة ل ان جي بواسطة طريقة 5 الانصهار- بتوسي. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنى تضخيم (العمود الأيسر) ومنحنى قمة انصهار (العمود الأيمن) لأنبوبة 1 (سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوبة 2 (ان جي)؛ الصف الثالث لأنبوية 3 (سي تي + ان جي)؛ والصف الرابع لأنبوبة 4 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). منحنيات التضخيم هي نتائج "الكشف في الزمن الحقيقي عند 72 درجة مثوية'. في منحنيات التضخيم؛ يمثل محور- ص ار اف يو ويمثل محور - س الدورات. منحنيات قمة الانصهار هي تتائج ”الانصهار”. في منحنيات قمة الانصهار؛ يمثل محور - ص دي(ار اف يو)/دي تي d(RFU)/AT ويمثل محور - س درجة الحرارة (مئوية). شكل 4 يمثل نتائج التنميط الجيني اس ان بي للاختراع الحالي باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة بطريقة بي سي ار الزمن الحقيقي. تم استخدام الحمض النووي دي ان ايه الجيني بشري ميهر MTHFR (سي 677 تي) (66771) كقوالب (تتابعات مستهدفة). تم الكشف عن الزيجوت 5 المتماثل البري (سي سي «(CC الزيجوت المتماثل الطافر (تي تي (TT والزيجوت المتغاير (سي
تي). تم توليد جميع الإشارات بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي. في الشكل؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم LY 1 (ميهر بري (سي 677 تي))؛ الصف الثاني لأنبوية 2 (ميهر طافر (سي 677 تي))؛ الصف الثالث لأنبوية 3 (ميهر من نوع مغاير (سي 677 تي))؛ والصف الرابع لأنبوبة 4 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). المنحنيات في العمود الأيسر والعمود الأيمن في كل صف هي نتائج day حرارة الكشف 72 درجة مثئوية” و ”درجة حرارة الكشف 55 درجة مثئوية”؛ على التوالي. في المنحنيات؛ die محور - ص ار اف يو ويمثل محور - س الدورات. الأشكال 25-15 تمثل نتائج الكشف وفقاً للاختراع الحالي باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة للكشف عن ثلاث تتابعات مستهدفة (الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية Ol) 10 جي)؛ الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي)؛ و الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الميكويلازما التناسلية Mycoplasma genitalium (ام جي «(MG تم توليد الإشارة ل ام جي بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي ؛ وتوليد الإشارات ل سي تي و ان جي بواسطة طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي. تم اختيار "95 درجة ge كدرجة حرارة للكشف عن الإشارة ل ام (a تم اختيار "72 درجة مئوية" كدرجة حرارة للكشف عن 5 الإشارة ل سي تي ؛ وتم اختيار "60 درجة مئوية" كدرجة حرارة للكشف عن الإشارة ل ان جي بالنظر إلى وسائل توليد الإشارة. في الشكل of5 يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوية 1 (إن جي)؛ الصف الثاني لأنبوية 2 (سي تي)؛ والصف الثالث لأنبوية 3 (ام جي). في الشكل كب؛ يظهر الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوية 4 Of) جي + سي تي)؛ الصف الثاني لأنبوية 5 )0 جي +ام جي)؛ الصف الثالث لأنبوبة 6 (سي تي +ام جي). في الشكل 5ج؛ يظهر 0 الصف الأول منحنيات التضخيم لأنبوبة 7 (ان جي + سي تي +ام جي)؛ والصف الثاني لأنبوية 8 (ان تي سي: بدون ضابط هدف). المنحنيات في العمود الأيسر؛ العمود الأوسط والعمود الأيمن في كل صف هي day) Al حرارة الكشضف 95 درجة مئوية"» "درجة حرارة الكشف 72 درجة digi و day حرارة الكشف 60 درجة مئوية"؛ على التوالي. في المنحنيات؛ Jia محور -< ص ار اف يو ويمثل محور - س الدورات. 5 الوصف التفصيلي:
— 0 1 — الميزة الأبرز للاختراع الحالي هي الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام نوع واسم واحد ونوع واحد من الكواشف في وعاء أحادي التفاعل. يتيح الاختراع الحالي الذي يستخدم درجات حرارة مختلفة للكشف الكشف عن العديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة حتى مع نوع واحد من الواسمات في وعاء أحادي التفاعل. يتم اختيار عناصر الاختراع الحالي وفقاً لميزة الاختراع all وتصنيعها في عملية مدهشة للكشف عن تتابعات الحمض النووي المستهدفة. تتطلب طريقة بي سي ار الزمن الحقيقي التقليدية نوعين من الواسمات التألقية أو تحليل الانصهار للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة فى وعاء أحادي التفاعل. يسمح الاختراع الحالي ببروتوكولات بي سي ار الزمن الحقيقي للكشف عن اثنين من تتابعات 0 الحمض النووي المستهدفة باستخدام نوع واحد من الواسمات التألقية في وعاء أحادي التفاعل. eg نحو (any يتيح الاختراع الحالي الكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق الكشف عن واحد من تتابعي الحمض النووي المستهدفين عن طريق بي سي ار الزمن الحقيقي وعن الآخر بتحليل الانصهار. يستخدم الاختراع الحالي النتائج التي توصلنا إليه حيث يكون الكشف عن الإشارات قابل للضبط 5 عن طريق درجات الحرارة وفقاً لوسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة. على سبيل المثال؛ حيث يتم استخدام وسائل توليد إشارة عن طريق تهجين مجس بتتابع حمض نووي مستهدف للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الأول» تسمح درجة الحرارة التي يتم عندها تهجين المجس بتتابع الحمض النووي المستهدف الأول بتوليد والكشف عن إشارات تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الأول. وفي المقابل» لا تسمح درجة الحرارة التي لا يتم 0 تهجين المجس عندها مع تتابع الحمض النووي المستهدف الأول بتوليد والكشف عن الإشارة. في هذا الصددء سيكون من المدرك أن هناك درجات حرارة all يتم عندها توليد الإشارة ودرجات حرارة لا يتم عندها توليد slay) على أساس وسائل توليد الإشارة. في وسائل توليد الإشارة هذه؛ قد تعمل درجات الحرارة التي يتم عندها تهجين المجس بتتابع الحمض النووي المستهدف الأول بمثابة درجة حرارة كشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الأول.
— 1 1 —
ولا يمكن لدرجات الحرارة التي يتم عندها تهجين المجس بتتابع الحمض النووي المستهدف الأول أن تعمل كدرجة حرارة كشف. وحيث يتم استخدام تهجين مجس أيضاً للكشف عن تتابع حمض نووي مستهدف ثاني؛ يمكن تعيين درجة حرارة الكشف الخاص به بالنظر إلى حقيقة أن هناك مدى درجة حرارة لتوليد أو عدم توليد
الإشارات. وحيث تكون القيمة تي ام للمجس المستخدم للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الثاني أقل من تلك التي لمجس الكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الأول؛ يمكن الكشف عن الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الأول عند درجة حرارة أعلى نسبياً حيث لن يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الثاني. وبعبارة أخرى» هناك فرق في درجات الحرارة
0 لتوليد إشارات الكشف بين وسائل توليد الإشارة الثانية لتتابعى الحمض النووي المستهدفين. وحيث dag تتابعى الحمض النووي المستهدفان معاً فى die يكون هناك مدى درجة حرارة مواتى لتوليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الأول وليس لتوليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الثاني. وفي الوقت نفسه؛ عندما تتراوح درجة الحرارة أقل من مدى درجة الحرارة؛ يتم توليد إشارات لتتابعى الحمض النووي المستهدفان.
5 وبالنظر إلى نطاقي درجة (Sa Bilal تعيين درجة حرارة الكشف لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. يمكن اختيار درجة حرارة الكشف العالية نسبياً من مدى درجة الحرارة السابق؛ ويمكن تخصيص درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الأول. يمكن اختيار درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً من مدى درجة الحرارة ا لأخير ¢ ودتم تخصيص درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً للحمض النووي المستهدف الثاني.
0 وفقاً للاختراع الحالي؛ يتم قياس الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتعيين وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الأول. وفقاً للإختراع الحالي» يسمح الكشف عند درجة حرارة Cail العالية نسبياً بطريقة تقوم بتعيين وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الأول. الميزة التقنية الهامة للاختراع الحالي هي للكشف عن الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتعيين وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الثاني الذي له درجة حرارة
— 2 1 — كشف منخفضة Lid باستخدام كل من الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وبدلاً من ذلك؛ يتصور المخترعون الحاليون أن تتابع الحمض النووي المستهدف الأول يمكن الكشف die عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة ويمكن الكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الثاني عن طريق تحليل الانصهار كطريقة لتوليد
إشارة أخرى. قد توفر وسائل توليد الإشارة المستخدمة لتحليل الانصهار إشارة عند درجة حرارة معينة خلال عملية الكشف في الزمن الحقيقي. لهذاء حتى عندما يتم الكشف عن تتابع من تتابعي الحمض النووي المستهدفين بواسطة تحليل الانصهار؛ تتابعي الحمض النووي المستهدفين مطلوب أن يكون لهم درجات حرارة كشف مختلفة عن بعضها البعض.
0 يمكن تضمين الاختراع الحالي في جوانب مختلفة كما يلي: (أ) الكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين فى die درجات حرارة مختلفة للكشف؛ (ب) التنميط الجيني اس ان بي لتتابع حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ (ج) الكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام درجات حرارة
5 مختلفة للكشف؛ (د) الكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين فى عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل الانصهار؛ و (ه) الكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام تحليل درجة حرارة كشف وتحليل انصهار.
0 1. الكشف عن تتابعي حمض نووي مستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف في أحد جوانب هذا الاختراع؛ يتم توفير طريقة للكشف عن تتابعي حمض نووي مستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل على:
— 3 1 — )( تحضين العينة مع وسيلتي توليد إشارة للكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفة في slog أحادي التفاعل والكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لأحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون LAN درجة Sha 5 كشف منخفضة نسبياً يتم تعيينها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة Sha الكشف العالية نسبياً درجة حرارة قادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة عالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً؛ حيث تختلف 0 الإشارة المتولدة بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع الكاشف الواحد؛ حيث يتم اجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و (ب) تعيين وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين بواسطة الإشارات التي تم الكشف عنها في خطوة (أ)؛ حيث (1) يتم تعيين وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية Law عن طريق الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) يتم تعيين وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخضفة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لطرق بي سي ار تقليدية في الزمن الحقيقى باستخدام منتحنيات تضخيم؛ من المعروف sale في المجال أنه لا يمكن الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة بشكل مختلف باستخدام وسائل توليد إشارة توفر إشارات متطابقة يمكن التمييز بينها. يتغلب الاختراع الحالي على القيود المرتبطة بالمعرفة الشائعة في المجال ويؤدي إلى نتائج غير متوقعة للكشف عن تتابعات الحمض النووي المستهدفة بطريقة محسنة بشكل كبير. سيتم وصف الاختراع الحالي بمزيد من التفصيل كما يلي: خطوة (أ): التحضين مع وسائل توليد إشارة وكشف عن الإشارة
(Yl يتم تحضين العينة المراد تحليلها مع وسائل توليد إشارة للكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين في وعاء أحادي التفاعل ثم يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. لا يتم التمييز بين الإشارات المتولدة بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف.
يستخدم الاختراع الحالي وسائل توليد إشارة signal-generating لتوليد إشارات لتتابعات الحمض النووي المستهدفة. يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة. يشير المصطلح 'وسائل توليد الإشارة" إلى أي من المواد المستخدمة في توليد إشارات J على وجود تتابعات حمض نووي مستهدفة؛ تتضمن على سبيل المثال أوليجونيوكليوتيدات؛ واسمات وإنزيمات. وعلى نحو بديل؛ يمكن استخدام المصطلح المستخدم هنا "وسائل توليد الإشارة
0 للإشارة إلى أي طرق تستخدم المواد لتوليد إشارة. Tay لتجسيم هذا الاختراع؛ يتم اجراء التحضين في الظروف التي تسمح بتوليد إشارة عن Gob وسائل توليد الإشارة. تتضمن هذه الظروف درجات الحرارة؛ تركيزات الملح والأس الهيدروجيني (بي اتش (pH للمحاليل. تتضمن أمثلة الأوليجونيوكليوتيدات التي تعمل بمثابة وسائل لتوليد الإشارة الأوليجونيوكليوتيدات
5 التي يتم تهجينها على وجه التحديد بتتابعات الحمض النووي المستهدفة (على سبيل المثال؛ مجسات ويادئات)؛ حيث يتم شطر المجسات أو البادئات المهجنة بتتابعات الحمض النووي المستهدفة لتحرير قطعة؛ تتضمن الأوليجونيوكليوتيدات التي تعمل بمثابة وسائل لتوليد الإشارة أوليجونيوكليوتيدات الالتقاط المراد تهجينها على وجه التحديد بالقطعة؛ حيث يتم مد القطعة المهجنة بأوليجونيوكليوتيد الالتقاط لتكوين شريط ممتد؛ تتضمن الأوليجونيوكليوتيدات التي تعمل بمثابة
0 وسائل توليد إشارة أولي الأوليجونيوكليوتيدات المراد تهجينها على وجه التحديد بأوليجونيوكليوتيد الالتقاط؛ وتتضمن الأوليجونيوكليوتيدات التي تعمل بمثابة وسائل توليد إشارة توليفات منها. وفي حين يكون مبداً توليد الإشارة متماثل» (Ka اعتبار وسائل alg الإشارة التي تشتمل على تتابعات مختلفة من الأوليجونيوكليوتيدات المستخدمة مختلفة عن بعضها البعض.
— 1 5 —
قد يكون الواسم مرتبط بالأوليجونيوكليوتيدات أو قد تكون في الشكل الحر. يمكن إدخال الواسم في
منتجات ممتدة خلال تفاعل الامتداد.
وحيث يتم استخدام شطر الأوليجونيوكليوتيدات في alg إشارة؛ تتضمن أمثلة الإنزيم enzyme 5
يتضمن ”- نيوكلياز و3”- نيوكلياز» وبالأخص بوليمراز polymerase الحمض النووي الذي له
نشاط 5”- نيوكلياز» بوليمراز الحمض النووي الذي له نشاط 3”- نيوكلياز أو اف اي ان نيوكلياز
.FEN nuclease
في الاختراع (Kao Jal توليد الإشارات عن طريق استخدام مواد مختلفة موصوفة سابقاً بطرق
. مختلفة alia
وفقاً لأحد التجسيمات؛ تكون وسيلة واحدة على الأقل من وسيلتي توليد الإشارة وسيلة توليد إشارة 0 لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين المزدوج.
Tay لأحد التجسيمات؛ تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هى
وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين المزدوج.
وفقاً لأحد التجسيمات يتضمن المزدوج تتابع حمض نووي مستهدف مزدوج الشريط.
يشير التعبير المستخدم هنا 'توليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين مزدوج بالاقتران مع وسائل توليد 5 الإشارة إلى أن الإشارة المراد الكشف عنها يتم توفيرها على أساس ارتباط أو تفكك جزيئي الحمض
النووي. يتضمن التعبير توفير الإشارة بواسطة مزدوج (على سبيل المثال أوليجونيوكليوتيد كشف
بواسم وتتابع حمض نووي) متكون على أساس وجود تتابع الحمض النووي المستهدف. بالإضافة
إلى ذلك؛ يتضمن التعبير توفير الإشارة عن طريق تثبيط تهجين مزدوج (على سبيل المثال
أوليجونيوكليوتيد كشف بواسم وتتابع حمض نووي) حيث يحدث التثبيط عن طريق تكوين مزدوج 0 أآخر.
وعلى dag الخصوص 4 يتم توليد ا لإشارة بواسطة تكوين مزدوج بين تتابع aan نووي مستهدف
وأوليجونيوكليوتيد كشف مهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف.
المصطلح المستخدم هنا "أوليجونيوكليوتيد كشف" هو أوليجونيوكليوتيد والذي يكون متضمن في توليد الإشارة المراد الكشف عنها. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتضمن أوليجونيوكليوتيد الكشف أوليجونيوكليوتيد والذي يكون متضمن في توليد إشارة فعلية. على سبيل المثال؛ يحدد تهجين أو عدم تهجين أوليجونيوكليوتيد الكشف إلى أوليجونيوكليوتيد آخر (على سبيل المثال تتابع حمض نووي مستهدف أو أوليجونيوكليوتيد يشتمل على تتابع نيوكليوتيد مكمل لأوليجونيوكليوتيد الكشف) توليد الإشارة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يشتمل أوليجونيوكليوتيد الكشف على واسم واحد على الأقل. يمكن توليد الإشارة بواسطة تكوين مزدوج بين تتابع حمض نووي مستهدف وأوليجونيوكليوتيد الكشف بطرق مختلفة» تتضمن طريقة العقرب Casing) وآخرون, التكنولوجيا الحيوية الطبيعة Whitcombe et al, Nature Biotechnology 17:804-807 (1999) 807-17:804 0 )1999((¢ طريقة شروق الشمس of) امبليفلور (Amplifluor (نازارينكو إت آل» 2521-2516 بحوث الأحماض النووية 2521-2516:)12(25 (1997)؛ والبراءة الأمريكية رقم 6,117,635( طريقة لوكس (البراءة الأمريكية رقم 7,537,886(« طريقة ضفيرةٍ Plexor (شيريل سي بي» إت آل.؛ مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية؛ 45569-126:4550 )2004( Sherrill C 8, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550- 5 )2004( 45569( طريقة منارة الجزيئية Molecular Beacon (تياجي إت آل؛ التكنولوجيا الحيوية الطبيعة في. 14 مارس 1996)؛ طريقة هيبياكون (الفرنسية دج وآخرون؛ مول. تحقيقات «dal 15 (6): 374-363 (2001))؛ طريقة مجس التهجين المجاور (بيرنارد» PS وآخرون.؛ شرجي. الكيميائية الحيوية» 1999(273:221) Bernard, 0.5. et al., Anal. 0 )273:221(1999 ,.8:00080) وطريقة ال ان ايه LNA (البراءة الأمريكية رقم 9_5 dng log الخصوص» يتم توليد الإشارة بواسطة مزدوج متكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف.
— 7 1 — المصطلح المستخدم هنا "أوليجونيوكليوتيد التوسط" هو أوليجونيوكليوتيد والذي يتوسط إنتاج مزدوج لا يحتوي على تتابع الحمض النووي المستهدف. Ugg لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ لا يقوم شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط بحد ذاته بتوليد إشارة ويتم تضمين قطعة متكونة بواسطة الشطر في تفاعلات متتالية لتوليد إشارة بعد تهجين وشطر أوليجونيوكليوتيد التوسط.
ووفقاً لأحد التجسيمات؛ لا يقوم تهجين أو شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط بحد ذاته بتوليد إشارة. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتضمن أوليجونيوكليوتيد التوسط أوليجونيوكليوتيد والذي يتم تهجينه بتتابع حمض نووي مستهدف ig شطره لتحرير قطعة؛ مما يؤدي إلى توسط إنتاج مزدوج. وعلى dag الخصوص ¢ تتوسط القطعة إنتا z مزدوج عن طريق امتداد القطعة على أوليجونيوكليوتيد
0 الالتقاط. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يشتمل أوليجونيوكليوتيد التوسط على (1) gia استهداف- 3" يشتمل على تتابع نيوكليوتيد تهجين مكمل لتتابع الحمض النووي المستهدف و(2) جزءِ توسيم- 5 يشتمل على تتابع نيوكليوتيد غير مكمل لتتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحرر شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط قطعة ويتم تهجين
5 القطعة على وجه التحديد بأوليجونيوكليوتيد التقاط ويمتد على أوليجونيوكليوتيد الالتقاط. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن بتتابعات الحمض النووي المستهدفة لتحرير قطعة وبتم تهجين القطعة على وجه التحديد بأوليجونيوكليوتيد التقاط وتمتد القطعة لتكوين شريط ممتد؛ مما يؤدي إلى تكوين مزدوج ممتد بين الشريط الممتد وأوليجونيوكليوتيد الالتقاط لتوفير إشارة تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف.
0 وققاً لأحد تجسيمات الاختراع Cus Mall يتم استخدام أوليجونيوكليوتيد ثالث يشتمل على تتابع نيوكليوتيد تهجين مكمل للشريط الممتد؛ JS تهجين الأوليجونيوكليوتيد الثالث والشريط الممتد نوع آخر من مزدوج يوفر إشارة تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف.
— 8 1 — وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع Jad) ¢ حيث يتم استخدام أوليجونيوكليوتيد ثالث يشتمل على تتابع نيوكليوتيد تهجين مكمل لأوليجونيوكليوتيد الالتقاطء يتم تثبيط تكوين مزدوج بين الأوليجونيوكليوتيد الثالث وأوليجونيوكليوتيد الالتقاط عن طريق تكوين المزدوج بين الشربط الممتد وأوليجونيوكليوتيد الالتقاط» مما يؤدي إلى توفير إشارة تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ قد تعمل القطعة؛ Jas il الممتد؛ أوليجونيوكليوتيد الالتقاط
الأوليجونيوكليوتيد الثالث أو توليفة منها بمثابة أوليجونيوكليوتيد الكشف. يمكن توليد الإشارة بواسطة المزدوج المتكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط بطرق مختلفة؛ تتضمن طريقة بتوسي (شطر وامتداد بي تي او) (البراءة الدولية 2 ) طريقة بي سي اي - اس اتش (شطر وامتداد بي تي او يعتمد على تهجين
0 أوليجونيوكليوتيد الإشارة) (البراءة الدولية 15442/2013) وطريقة بي سي اي - ان اتش (شطر وامتداد بي تي او لا يعتمد على التهجين) (بي سي تي/ كيه ار/ 012312/2013). وبالإشارة إلى المصطلحات الموصوفة في المراجع السابقة؛ تكون الأمثلة المقابلة للأوليجونيوكليوتيدات كما يلي: يقابل أوليجونيوكليوتيد التوسط بي تي او (أوليجونيوكليوتيد السبر والتوسيم)» يقابل أوليجونيوكليوتيد الالتقاط سي تي او CTO (التقاط ونبض النوكليوتيد
«(Capturing and Templating Oligonucleotide 5 ويقابل أوليجونيوكليوتيد ثالث اس او SO (أوليجونيوكليوتيد الإشارات) أو او اتش HO (أوليجونيوكليوتيد التهجين)؛ على التوالي. قد يأخذ الشربط الممتد أو توليفات die دور كأوليجونيوكليوتيد كشف. تتضمن الإشارة بواسطة المزدوج المتكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط الإشارة المتوفرة بواسطة تثبيط تكوين مزدوج آخر بواسطة المزدوج المتكون بطريقة تعتمد على شطر
0 أوليجونيوكليوتيد التوسط (على سبيل المثال بي سي اي - ان اتش). على سبيل المثال» حيث يتم توليد الإشارة بواسطة المزدوج المتكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط بطريقة بتوسي ؛ تشتمل وسائل توليد الإشارة على أوليجونيوكليوتيد في الاتجاه 5 و بي تي او (أوليجونيوكليوتيد السبر والتوسيم) يشتمل على تتابع نيوكليوتيد تهجين مكمل لتتابع الحمض النووي المستهدف»؛ سي تي او (أوليجونيوكليوتيد التقاط وقولبة)؛ واسم مناسب
وبوليمراز حمض نووي يعتمد على القالب يحتوي على نشاط 5" نيوكلياز. يشتمل بي تي او على )1( جزء استهداف-3” يشتمل على تتابع نيوكليوتيد تهجين Jae لتتابع الحمض النووي المستهدف و(2) جزء "Susi يشتمل على تتابع نيوكليوتيد غير مكمل لتتابع الحمض النووي المستدف. يشتمل سي تي او في الاتجاه 3" إلى 5" على (1) ga التقاط يشتمل على تتابع نيوكليوتيد مكمل لجزء توسيم-5” أو جزءِ من x توسيم-5” من بي تي او و(2) جزء قولبة
يشتمل على تتابع نيوكليوتيد غير مكمل لجزء TS ang وجزء استهداف-3' من بي تي او. يشتمل المثال الخاص لتوليد الإشارة بطريقة بتوسي على الخطوات: )1( تهجين تتابع الحمض النووي المستهدف بأوليجونيوكليوتيد في اتجاه 5" و بي تي او ؛ (ب) اتصال الناتج من خطوة () بإنزيم له نشاط 5” نيوكلياز في ظروف شطر بي تي او ؛ حيث يحث
0 الأوليجونيوكليوتيد في الاتجاه 5" أو شريطه الممتد شطر بي تي او بواسطة الإنزيم الذي له نشاط 5 نيوكلياز بحيث يحرر الشطر قطعة تشتمل على جزءِ توسيم-5” أو جزء من جزءِ توسيم-5" من بي تي او ؛ (ج) تهجين القطعة المحررة من بي تي او ب سي تي او؛ حيث يتم تهجين القطعة المحررة من بي تي او بجزءٍ الالتقاط من سي تي او؛ و(د) تنفيذ تفاعل الامتداد باستخدام الناتج من الخطوة (ج) وبوليمراز حمض نووي يعتمد على قالب؛ حيث تمتد القطعة المهجنة gra
5 الالتقاط من سي تي او ويتم تكوين مزدوج ممتد؛ حيث يكون للمزدوج الممتد قيمة تي ام قابلة للضبط بواسطة (1) تتابع و/أو طول القطعة؛ (2) تتابع و/أو طول سي تي او أو (3) تتابع و/أو طول القطعة وتتابع و/أو طول سي تي او؛ حيث يوفر المزدوج الممتد إشارة هدف عن طريق (1) واسم واحد على الأقل مرتبط بالقطعة و/أو سي تي اوء )2( واسم مدمج في المزدوج الممتد أثناء تفاعل الامتداد؛ (3) واسم مدمج في المزدوج الممتد اثناء Jel الامتداد وواسم مرتبط بالقطعة
0 وإ/أو سي تي اوء أو )4( واسم إقحام؛ و(ه) الكشف عن المزدوج الممتد بواسطة قياس إشارة الهدف عند درجة حرارة محددة سابقاً حيث يحافظ المزدوج الممتد على شكل شريطه المزدوج؛ حيث يشير وجود المزدوج الممتد إلى وجود تتابع الحمض النووي المستهدف. في هذه الحالة؛ تشتمل الطريقة كذلك على تكرار كل أو بعض الخطوات (أ)-(ه) مع التمسخ بين دورات التكرار. في العبارة 'تمسخ بين دورات LS يعني المصطلح 'تمسخ" فصل جزئ الحمض النووي مزدوج
5 الشريط إلى جزئ حمض نووي أحادي الشريط.
— 0 2 — في خطوة )1( من الطريقة بتوسي ؛ يمكن استخدام البرايمر المحدد لتضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف بدلاً من الأوليجونيوكليوتيد فى الاتجاه 5”. فى هذه الحالة؛ تشتمل الطريقة كذلك على تكرار كل أو بعض الخطوات (أ)-(ه) مع التمسخ بين دورات التكرار. يمكن تصنيف الطريقة بتوسي كعملية والتي بها تمتد قطعة بي تي او المهجنة مع سي تي او لتكوين شربط ممتد ثم يتم الكشف عن الشريط الممتد. تتميز الطريقة بتوسي بأنه يتم الكشف عن daa pal) الممتد باستخدام المزدوج بين daa pal) الممتد وسى = او. هناك نهج AT للكشف عن تكوين الشريط الممتد. على سبيل المثال؛ يمكن الكشف عن تكوين الشريط الممتد باستخدام أوليجونيوكليوتيد مهجن على وجه التحديد بالشريط الممتد (على سبيل المثال» طريقة بي سي اي - اس اتش). في هذه الطريقة؛ يمكن توفير الإشارة من (1) واسم 0 مرتبط بالأوليجونيوكليوتيد المهجن على وجه التحديد بالشريط الممتد» (2) واسم مرتبط بالأوليجونيوكليوتيد المهجن على وجه التحديد بالشريط الممتد وواسم مرتبط بالقطعة بي تي او ؛ )3( واسم مرتبط بالأوليجونيوكليوتيد المهجن على وجه التحديد بالشريط الممتد وواسم مدمج في الشربط الممتد أثناء تفاعل الامتداد» أو )4( واسم مرتبط بالأوليجونيوكليوتيد المهجن على dag التحديد بالشريط الممتد وصبغة إقحام. وعلى نحو بديل؛ قد يتم توفير الإشارة من )1( واسم مرتبط dao yall 1 5 الممتد أو )2( صبغة إقحام . وعلى نحو بديل؛ يتم اجراء الكشف عن تكوين الشريط الممتد بطريقة أخرى والتي بها يتم الكشخف عن تثبيط التهجين ما بين سي تي او وأوليجونيوكليوتيد قابل للتهجين على وجه التحديد ب سي تي او (على سبيل المثال طريقة بي سي اي - ان اتش). يعتبر هذا التثبيط مؤشر على وجود تتابع حمض نووي مستهدف. يمكن توفير الإشارة من (1) واسم مرتبط بأوليجونيوكليوتيد قابل للتهجين ب 0 سي تي او» )2( واسم مرتبط ب سي تي او» )3( واسم مرتبط بالأوليجونيوكليوتيد القابل للتهجين ب سي تي او وواسم مرتبط ب سي تي esl أو (4) واسم إقحام. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يكون للأوليجونيوكليوتيد القابل للتهجين على وجه التحديد ب سي تي او تتابع متداخل مع القطعة بي تي او.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتضمن أوليجونيوكليوتيد الكشف الأوليجونيوكليوتيد القابل للتهجين على وجه التحديد بالشريط الممتد (على سبيل المثال» طريقة بي سي اي - اس اتش) وأوليجونيوكليوتيد قابل للتهجين على وجه التحديد ب سي تي او (على سبيل المثال طريقة بي سي اي - ان اتش). وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتضمن أوليجونيوكليد الكشف الشريط الممتد المنتج خلال تفاعل أو سي تي fd 5 تتضمن الطرق القائمة على بتوسي Bale تكوين الشريط الممتد على أساس وجود تتابع حمض نووي مستهدف. يستخدم المصطلح "طريقة قائمة على بتوسي" هنا ليقصد به أن يشتمل على طرق مختلفة لتوفير إشارات تشتمل على تكوين شريط ممتد من خلال شطر وامتداد بي تي او. يشتمل مثال توليد الإشارة بواسطة الطرق القائمة على بتوسي على الخطوات: (أ) تهجين تتابع 0 الحمض النووي المستهدف مع أوليجونيوكليوتيد الاتجاه 5" و بي تي او ؛ (ب) اتصال الناتج من خطوة (أ) بإنزيم له نشاط 5” نيوكلياز في ظروف شطر بي تي او ؛ حيث يحث الأوليجونيوكليوتيد في الاتجاه 5" أو شربطه الممتد شطر بي تي او بواسطة الإنزيم الذي له نشاط 75 نيوكلياز بحيث يحرر الشطر قطعة تشتمل على on توسيم-5” أو > من جزءِ توسيم-5” من بي تي او ؛ (ج) تهجين القطعة المحررة من بي تي او مع سي تي او؛ حيث يتم تهجين القطعة المحررة من بي تي او بجزء الالتقاط من سي تي او؛ (د) أداء تفاعل الامتداد باستخدام الناتج من خطوة (ج) وبوليمراز حمض نووي قائم على القالب؛ حيث يتم مد القطعة المهجنة gia الالتقاط من سي تي او لتكوين شريط ممتد؛ و(ه) الكشف عن تكوين الشريط الممتد عن طريق الكشف عن إشارة متولدة على أساس وجود الشريط الممتد. في خطوة of) يمكن استخدام البرايمر المحدد لتضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف بدلاً من الأوليجونيوكليوتيد في الاتجاه 5”. في هذه الحالة؛ تشتمل الطريقة كذلك 0 على تكرار كل أو بعض الخطوات (أ)-(ه) مع تمسخ بين دورات التكرار. وفقاً لأحد التجسيمات» تتضمن الإشارة المتولدة بواسطة تكوين مزدوج إشارات تنتج عن تهجين المزدوج (على سبيل (Jal تهجين المزدوج بحد ذاته؛ أو تهجين أوليجونيوكليوتيد ثالث) أو عن تثبيط تهجين أوليجونيوكليوتيد ثاث بسبب تكوين مزدوج.
— 2 2 — وفقاً لأحد التجسيمات؛ تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة وسائل توليد إشارة عن طريق تكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد توسط مهجن على dag التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ تكون وسيلة واحدة على الأقل من وسيلتي توليد الإشارة وسيلة توليد إشارة تتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف.
leg وجه الخصوص» يتم توليد الإشارة بواسطة تهجين أوليجونيوكليوتيد الكشف بتتابع حمض نووي مستهدف ثم شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف. يمكن توليد الإشارة بواسطة تهجين أوليجونيوكليوتيد الكشف بتتابع حمض نووي مستهدف ثم شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف بطرق مختلفة» تتضمن طريقة مجس تاكمان (البراءة الأمريكية رقم
0 5,210,015 والبراءة الأمريكية رقم 5,538,848). وحيث يتم توليد الإشارة بواسطة طريقة مجس تاكمان ؛ تتضمن وسائل توليد الإشارة برايمر محدد لتضمين تتابع حمض نووي مستهدف»؛ مجس تاكمان به واسم مناسب (على سبيل المثال؛ واسم مزدوج تفاعلي) وبوليمراز حمض نووي له نشاط 5”- نيوكلياز. يتم شطر المجس تاكمان المهجن بتتابع حمض نووي مستهدف أثناء تضخيم الهدف Alyy إشارة تدل على وجود تتابع الحمض
5 1 النووي ا لمستهدف . يشتمل المثال الخاص لتوليد الإشارة بواسطة طريقة المجس تاكمان على الخطوة (أ) تهجين البرايمر المحدد ومجس تاكمان الذي يحتوي على واسم مناسب (على سبيل المثال واسم مزدوج تفاعلي) بتتابع الحمض النووي المستهدف؛ (ب) تضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف باستخدام الناتج من خطوة (أ) ويوليمراز حمض نووي له نشاط 5”- نيوكلياز» حيث يتم شطر المجس تاكمان
0 لتحرير الواسم؛ و(ج) الكشف عن توليد الإشارة من الواسم المحرر. وبالأخص» يتم توليد الإشارة بواسطة شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف بطريقة تعتمد على sha أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ حيث يتم شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن بتتابع
الحمض النووي المستهدف لتحرير قطعة؛ يتم تهجين القطعة على وجه التحديد بأوليجونيوكليوتيد
كشف وتحث القطعة شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ حيث يتم شطر أوليجونيوكليوتد التوسط المهجن بتتابعات حمض نووي مستهدفة لتحرير قطعة؛ تمتد القطعة لشطر أوليجونيوكليوتيد الكشف المشتمل على
تتابع نيوكليوتيد تهجين مكمل لأوليجونيوكليوتيد الالتقاط.
shi شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف بطريقة تعتمد على Goh توليد الإشارة عن Sa
أوليجونيوكليوتيد التوسط بطرق مختلفة؛ تتضمن مقايسة Invader (البراءة الأمريكية رقم
2+ طريقة بي سي اي سي PCEC (شطر بي تي او وشطر قائم على الامتداد)
(WO 2012/134195) 0 وطريقة موصوفة في البراءة الأمريكية رقم 7,309,573. وبالأخص؛ يمكن اعتبار الطريقة الموصوفة في البراءة الأمريكية رقم 7,309,573 كأحد الطرق القائمة على بتوسي باستخدام توليد إشارة عن طريق الشطرء؛ وفي الطريقة؛ يمكن الكشف عن تكوين الشريط الممتد عن طريق الكشف عن شطر أوليجونيوكليوتيد Gage على وجه التحديد ب سي تي او عن طريق تكوين الشربط الممتد. تعمل مقايسة على تكوين قطعة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد
5 التوسط وتحث تفاعلات الشطر المتتابعة بدون امتداد القطعة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع Jal) حيث يتم توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف» يحث شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف تغيرات الإشارة أو تحرر قطعة موسومة للكشف عنها. حيث تولد وسائل توليد الإشارة إشارة في نفس الوقت عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف
0 وبواسطة تكوين مزدوج؛ يمكن اعتبار وسائل توليد الإشارة كوسائل توليد إشارة توفر إشارة عن طريق الشطرء طالما يتم استخدامها لتوليد إشارة عن طريق الشطر. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يكون توليد الإشارة طريقة قائمة على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف تستخدم لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. حيث يتم توليد الإشارة بواسطة شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف؛ يمكن الكشف عن الواسم المتحرر بواسطة الشطر عند أي
درجات حرارة. لهذاء لا يمكن استخدام الإشارة المتولدة بواسطة شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً والذي يتطلب درجات حرارة كشف مقيدة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام توليد الإشارة المعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف لتتابع حمض نووي مستهدف واحد فقط. حيث يتم استخدام توليد الإشارة المعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف لكل من تتابعي الحمض النووي المستهدفين؛ وقد لا يتم الكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين بشكل مختلف على أساس درجات حرارة الكشف. وفقاً لتجسيم هذا الاختراع» تكون وسيلة توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً هي وسيلة توليد إشارة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف؛ 0 وتكون وسيلة توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وسيلة توليد إشارة بواسطة تكوين مزدوج. Ud لتجسيم هذا الاختراع؛ تكون وسيلة توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وسيلة توليد إشارة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف؛ وتكون وسيلة توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف 5 المنخفضة نسبياً هي وسيلة توليد الإشارة عن طريق تكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف. Uy لأحد التجسيمات؛ يشتمل أوليجونيوكليوتيد الكشف على واسم واحد على الأقل. Uy لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ قد Cally أوليجونيوكليوتيد الكشف من أوليجونيوكليوتيد واحد على الأقل. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع Jal حيث يتألف أوليجونيوكليوتيد الكشف من العديد 0 .من الأوليجونيوكليوتيدات؛ قد يحتوي على واسم بطرق مختلفة. على سبيل المثال؛ قد يحتوي أحد الأوليجونيوكليوتيدات من بين مجموعة الأوليجونيوكليوتيدات على واسم واحد على الأقل؛ قد تحتوي مجموعة الأوليجونيوكليوتيدات جميعها على واسم واحد على الأقل؛ أو قد يحتوي جزءٍ واحد من الأوليجونيوكليوتيدات على واسم واحد على الأقل وقد لا يحتوي gall الآخر على candy
لا يتم التمييز بين الإشارات المتولدة بواسطة وسيلتي توليد الإشارة حسب نوع واحد من الكواشف.
يعني المصطلح "إشارات لا تتمايز حسب نوع واحد من "RN أن الإشارات لا تختلف عن
بعضها البعض بنوع واحد من الكواشف بسبب تطابقها أو خصائص الإشارة المتطابقة إلى حد كبير
(على سبيل المثال؛ الخصائص البصرية؛ الطول الموجي للانبعاث والإشارة الكهريائية). على سبيل المثال؛ حيث يتم استخدام نفس الواسم (على سبيل المثال؛ اف ايه ام (FAM لتتابعي حمض نووي
مستهدفين ويتم استخدام نوع واحد من الكواشف للكشف عن الطول الموجي للانبعاث من اف ايه
al لا يتم الكشف عن الإشارات بشكل مختلف.
يعني المصطلح المستخدم هنا "نوع واحد من الإشارات" إشارات توفر خصائص إشارة متطابقة أو
متطابقة إلى حد كبير Jo) سبيل المثال؛ الخصائص البصرية؛ الطول الموجي للانبعاث والإشارة
0 الكهربائية). على سبيل المثال» توفر اف ايه ام و كال فلور 610 610 CAL Fluor أنواع مختلفة من الإشارات. يعني المصطلح المستخدم هنا "نوع واحد من الكواشف" وسيلة كشف لنوع واحد من الإشارات. في الكاشف المشتمل على قنوات مختلفة le) سبيل (Jl) صمامات ضوئية) لأنواع عديدة مختلفة من الإشارات؛ تقابل كل قناة (على سبيل Jia) صمام ضوئي) "نوع واحد من الكواشف".
5 وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ تشتمل وسيلتي توليد الإشارة على واسم متطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بنوع واحد من الكواشف. يتضمن الواسم المفيد في الاختراع الحالي واسمات مختلفة معروفة في المجال. على سبيل المثال؛ يتضمن الواسم المفيد في الاختراع الحالي واسم واحد؛ واسم مزدوج (Jolie صبغة إقحام وواسم دمج .
0 يتضمن الواسم الواحد؛ على سبيل (JER واسم A ¢ واسم إنارة؛ واسم إنارة كيميائية؛ واسم كهروكيميائي وواسم معدني. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يوفر الواسم الواحد إشارة مختلفة (على سبيل المثال» قيم شدة مختلفة للإشارة) على أساس وجوده على شريط مزدوج أو شريط مفرد. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يكون الواسم الواحد واسم تألقي. الأنواع ومواقع الارتباط المفضلة للواسم التألقي الواحد المستخدم في هذا الاختراع موصوفة في البراءات الأمريكية أرقام 7,537,886 و 7,348,141
والتي يدخل تعليمها هنا بالكامل على سبيل المرجعية. على سبيل (Jal) يتضمن الواسم التألقي الواحد جيه او اي JOE و اف ايه ام و تامرا TAMRA و روكس 4076| و واسم يعتمد على التألقيسئين. قد يرتبط الواسم الواحد بأوليجونيوكليوتيدات بطرق مختلفة. على سبيل المثال» يرتبط الواسم بمجسات من خلال مفساح يحتوي على ذرات كربون (على سبيل المثال» فاصل 3- كربون؛ فاصل 6- كربون أو فاصل 12- كربون). وكممثل لنظام الواسم المتفاعل» يتضمن نظام واسم اف ار اي تي Ja) FRET الطاقة بالرنين التألقي (fluorescence resonance energy transfer جزئ مخبر تألقي (جزئ مانح) وجزئ مُخمد (جزئ مستقبل). في اف ار اي تي؛ يكون مائح الطاقة تألقي؛ وقد يكون مستقبل الطاقة تألقي أو غير تألقي. في شكل مختلف من أنظمة الواسم المتفاعلة؛ يكون مانح الطاقة غير 0 تألقي؛ على سبيل المثال؛ حامل اللون؛ ويكون مستقبل الطاقة تألقي. في شكل AT بعد لأنظمة الواسم cle lina) يكون مانح الطاقة ols) على سبيل المثال إنارة حيوية؛ إنارة كيميائية؛ إنارة كهروكيميائية؛ ويكون المستقبل تألقي. يتضمن نظام الواسم المتفاعل واسم مزدوج يعتمد على sled متوسط باتصال" (سالفاتوري وآخرون؛ بحوث الأحماض النووية» 2002 (30) نو. 21 اي 2 و جوهانسون وآخرون؛ جيه ايه ام. تشيم. سوك 2002 )124( بي بي 6956-9650 Salvatore et al., Nucleic Acids Research, 2002 (30) 00.21 122 and 5 (Johansson et al., J.
AM.
CHEM.
SOC 2002 (124) pp 6950-6956 يتضمن نظام الواسم المتفاعل أي نظام واسم والذي به ينتج تغير الإشارة عن التفاعل بين جزيئين على الأقل (على سبيل المثال صبغة). قد يتضمن الجزئ المخبر والجزئ المُخمد المفيد في الاختراع الحالي أي جزيئات معروفة في 0 المجال. أمثلتها هي: YO-PRO™-1 )506( Cy2™ (509) 70707-1 )509(« Rhodamine )5320( Alexa™ )519( FluorX™ )518( FITC )517( Calcein Oregon Green™ 488 (522) Oregon Green™ 500¢(520) 110 Rhodamine 123 (527) Rhodamine Green™ (525) RiboGreen™ (524) TO-PRO™-1 (533) Calcium Green™ (531) Magnesium Green ™ (529) Dil ¢(550) BODIPY530/550 ¢(548) JOE((533) TOTO1 (533) 5
800107564570 )568( BODIPY558/568 (568) BODIPY TMR ر(ذوة) Magnesium (572) TRITC (570) Alexa™ 546 (570) Cy3™ (570)
Rhodamine Phalloidin )375( Phycoerythrin R&B ¢(575) Orange ™
Rhodamine B «(580) Pyronin Y (576) Calcium Orange ™ (575)
ROX (596) Cy3.5™ (590) Rhodamine Red™ (582) TAMRA (580) 5 «(615) Texas Red:(615) Alexa™ 594 (615) Calcium Crimson™ (608)
R- )631( YOYO™-3 (631) YO-PRO™-3 (628) Nile Red
TOTO3 (660) TO-PRO™-3 ((648) C-Phycocyanin (642) phycocyanin
Cy5.5 «(671) Thiadicarbocyanine (670) Cy5™ (665) DID DilC(5) «(660)
CAL Fluor Gold 540 (447) Biosearch Blue (536) TET (556) HEX (694) 0
CAL Fluor (591) CAL Fluor Red 590 (559) CAL Fluor Orange 560 «(544)
Fluorescein (520) (637)ءاف ايه ام CAL Fluor Red 635 (610) Red 610
Quasar 570 (566) Pulsar 650 (520) Fluorescein—-C3 (520) الأرقام بين القوسين تمثل الحد (610) Quasar 705 5 (705) Quasar 670 (667) الأقصى للطول الموجي للانبعاث بالنانومتر. وعلى نحو مفضل؛ يتضمن الجزئ المخبر والجزئ 5 المُخمد جيه او اي و اف ايه ام و تامرا و روكس و واسم يعتمد على الفلوريسئين. التألقي المناسب والأزواج المناسبة من المخبر- المُخمد في عديد من المنشورات gall Chay au كما يلي:
Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New
White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach ¢York, 1971) 0
Berlman, Handbook of Fluorescence ¢(Marcel Dekker, New York, 1970)
Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York,
Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic ¢ 1971)
Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Press, New York, 1976)
Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research ¢Oxford, 1972) 25
_— 8 2 _— Pringsheim, Fluorescence ¢Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992) and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, )1949 ؛ Haugland, R.
P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) والبراءات الأمريكية أرقام 3,996,345 5 4,351,760 ومن الجدير بالذكر أن الجزئ المُخمد غير التألقى (على سبيل المثال مُخمد أسود أو مُخمد داكن) قادر على إخماد ومضان مدى واسع من الأطوال الموجية أو يمكن استخدام طول موجي محدد في الاختراع الحالى. فى نظام الإشارات الذي يشتمل على cla المُخبر والمُخمد؛ يشتمل المُخبر على mile اف ار 0 1 اي تي ويشتمل المُخمد على الشريك ا AY (مستقبل) al ار اي تي . على سبيل المثال يتم استخد ام صبغة تألقيسئين AS وصبغة الرود امين VEGAS قد يكون الواسم المزدوج المتفاعل مرتبط بشريط واحد من المزدوج. حيث يترك الشريط المحتوي على الواسم المزدوج المتفاعل في حالة أحادية الشريط» يشكل هيكل على شكل دبوس شعر أو ملف عشوائى لحث ١ لإخماد بين الواسم المزدوج المتفاعل . وحيث يشكل daa pal) مزدوج؛ يخف 5 الإخماد. (eg نحو بديل» حيث يرتبط الواسم المزدوج المتفاعل بنيوكليوتيدات موضوعة بشكل متجاور على الشريط؛ء يحدث الإخماد بين الواسم المزدوج المتفاعل. وحيث يشكل الشريط مزدوج alg شطره ؛ يصبح ا لإخماد خفيف. قد يرتبط كل من الواسم المزدوج المتفاعل بكل من شريطي المزدوج. يحث تكوين المزدوج إخماد وبحث تمسخ المزدوج عدم ا لإخماد . وعلى نحو بديل ¢ Cua يتم شطر أحد الشربطين يمكن حث 0 حدم الإخماد. تتضمن أمثلة صبغات الإقحام التمثيلية المفيدة في هذا الاختراع (PO-PRO™-1 (SYBRTM Green ١ 4017-1م-0ق SYTOTM43 POPO™_3 (POPO™-1 (SYTOXTMBIue (<SYTOTM45 (SYTOTM44
0801-1ق «JO-PRO™-] (LO-PRO™-] .BOBO™-3 0-0011 SYTOTM15 SYTOTM13 (SYTOTM11 TO-PROTM1 011/16 ]لاق GelStarTM (YOYOTM3 0101-3 (SYTOTM23 SYTOTM20 وثيازول thiazole أورانج. تدخل صبغات الإقحام على وجه التحديد في جزيئات حمض نووي مزدوج الشريط لتوليد إشارات. يمكن استخدام واسم الدمج في عملية لتوليد إشارات عن طريق دمج واسم أثناء امتداد البرايمر le) سبيل المثال» طريقة ضغيرة؛ شيريل سي بي» إت آل.؛ مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية؛ 45569-0 (2004)). يمكن أيضاً استخدام واسم mad في توليد إشارة عن طريق مزدوج متكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط المهجن مع تتابع الحمض النووي 0 المستهدف. قد يرتبط واسم الدمج بصفة عامة بنيوكليوتيدات. يمكن أيضاً استخدام النيوكليوتيد الذي يحتوي على قاعدة غير طبيعية. يشير المصطلح المستخدم هنا sel غير طبيعية" إلى مشتقات من قواعد طبيعية Jie أدينين (ايه «(A جوانين (جي 6)؛ ثايمين (تي آ)؛ سيتوزين (سي (C ويوراسيل (يو لا)؛ والتي تكون قادرة 5 على تكوين أزواج قاعدة برابطة هيدروجين. يتضمن المصطلح المستخدم هنا 'قاعدة غير طبيعية" قواعد لها أنماط ازدواج قاعدة مختلفة من قواعد طبيعية مثل المركبات الأم؛ كما هو موصوف؛ على سبيل المثال» في البراءات الأمريكية أرقام 5,432,272» 5,965,364 6,001,983« و6,037,120. يتضمن ازدواج القاعدة بين القواعد غير الطبيعية اثنين أو ثلاثة روابط هيدروجين كقواعد طبيعية. يتم أيضاً تكوين ازدواج القاعدة بين قواعد غير طبيعية بطريقة خاصة. تتضمن 0 الأمثلة الخاصة للقواعد غير الطبيعية القواعد التالية في توليفات زوج قاعدة: 150-0/150-6؛ (K/X 150-06/50-6 ل/لاء 5 M/N (انظر البراءة الأمريكية رقم 1,422,850). وحيث يتم توليد الإشارة بواسطة الطريقة بتوسي ؛ فقد يحتوي للنيوكليوتيد المدمج خلال تفاعل الامتداد على قاعدة غير طبيعية أولى وقد يحتوي سي تي او على نيوكليوتيد يحتوي على قاعدة غير طبيعية ثانية بألفة ارتباط محددة للقاعدة غير الطبيعية الأولى.
يشير المصطلح المستخدم هنا "حمض نووي مستهدف"؛ تتابع حمض نووي مستهدف" أو 'تتابع مستهدف" إلى تتابع حمض نووي معني للكشف أو القياس. يشتمل تتابع الحمض النووي المستهدف تتابع في شريط أحادي وكذلك في شريط مزدوج. يشتمل تتابع الحمض النووي المستهدف على تتابع يوجد أصلاً في عينة حمض نووي بالإضافة إلى تتابع متولد حديثاً في تفاعلات. قد يتضمن تتابع الحمض النووي المستهدف أي الحمض النووي دي ان ايه (جي الحمض النووي دي ان ايه 908 و سي الحمض النووي دي ان ايه (CDNA جزيئات الحمض النووي ار ان ايه RNA ومهجنات منها (حمض نووي كيمري). قد يكون التتابع إما في شكل شريط مزدوج أو شريط مفرد. وحيث يكون الحمض النووي كمادة بداية مزدوج الشريط» من المفضل أن يجعل 0 الشريطين في شكل مفرد الشريط أو مفرد الشريط جزئياً. تتضمن الطرق المعروفة لفصل الشرائط» لكنها لا تقتصر علىء المعالجة بالتسخين» القلويات؛ الفورماميد» اليوريا والجليكوكسال» طرق daa) (على سبيل المثال؛ تأثير هيليكاز)؛ وبروتينات رابطة. على سبيل المثال؛ يمكن تحقيق فصل الشرائط عن طريق التسخين عند درجة حرارة تتراوح من 80 درجة مثوية إلى 150 درجة Agia الطرق العامة لإتمام هذه المعالجة متوفر من قبل Joseph Sambrook, et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 5 .Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) كمادة بداية؛ تكون خطوة النسخ العكسي ضرورية قبل MRNA وحيث يتم استخدام ام ار ان ايه
Joseph Sambrook, et al., Molecular أداء خطوة التلدين» التفاصيل موجودة في
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold .Spring Harbor, N.Y.(2001). 0 بالنسبة للنسخ onal) يمكن استخدام برايمر للأوليجونيوكليوتيد قابل للتهجين مع ذيل عديد ايه ل ام ار ان ايه؛ بادئات عشوائية أو بادئات محددة الهدف. يتضمن تتابع الحمض النووي المستهدف أي بدائيات النواة؛ حقيقيات النواة الموجودة في الطبيعة (على سبيل المثال؛ الأوليات والطفيليات»؛ الفطريات؛ الخميرة؛ النباتات العلياء الحيوانات الدنيا
والعلياء La فيها الثدييات والبشر)؛ الفيروسات (على سبيل المثال؛ فيروسات هريس؛ فيروس نقص
ede lial) فيروس الانفلونزاء فيروس ابشتاين- بارء فيروس التهاب الكبد؛ فيروس شلل الأطفال؛ وما
إلى ذلك)؛ أو حمض نووي فيروسي الشكل. قد يكون جزئ الحمض النووي Lad أي جزئ حمض
نووي والذي والذي تم إنتاجه أو يمكن إنتاجه على نحو معاد الاتحاد أو تركيبه كيميائياً. وبالتالي؛ قد يوجد تتابع الحمض النووي أو قد لا يوجد في الطبيعة. قد يتضمن تتابع الحمض النووي
المستهدف تتابعات معروفة أو غير معروفة.
يشير المصطلح المستخدم هنا due” إلى أي خلية؛ نسيج؛ أو مائع من مصدر بيولوجي؛ أو أي
وسط آخر والذي يمكن تقييمه على نحو مفيد وفقاً لهذا الاختراع؛ بما في ذلك فيروس؛ Ss
نسيج؛ خلية؛ cpa مصل؛ بلازماء chad لبن؛ Gln eds سائل العين؛ لعاب؛ سائل منوي؛
0 مستخلصات دماغ؛ سائل الحبل الشوكي (اس سي اف (SCF زائدة؛ مستخلصات أنسجة الطحال واللوز؛ ساتئل أمنيوتي؛ سائل الاستسقاء وعينات غير بيولوجية (على سبيل المثال؛ غذاء وماء). بالإضافة إلى ذلك؛ تتضمن العينة جزيئات حمض نووي موجودة في الطبيعة معزولة من مصادر بيولوجية وجزيئات حمض نووي تركيبية. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تنفيذ خطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة متزامنة مع تضخيم
5 الحمض النووي. في الاختراع الحالي؛ يمكن تضخيم الإشارة المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة في نفس الوقت مع تضخيم الهدف. وعلى نحو بديل؛ يمكن تضخيم الإشارة مع عدم تضخيم الهدف. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تنفيذ توليد الإشارة في عملية تتضمن تضخيم الإشارة مع تضخيم الهدف.
0 وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تنفيذ تضخيم الهدف وفقاً ل بي سي ار (تفاعل سلسلة بوليمراز). يتم استخدام بي سي ار على نطاق واسع لتضخيم الهدف في المجال؛ بما في ذلك دورات تمسخ تتابع الهدف» التلدين (التهجين) بين تتابع الهدف ويادئات وامتداد برايمر ) Mullis et al.
U.S.
Pat.
Nos. 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159; Saiki et al., Science 230, 1350-1354 )1985( يمكن تضخيم الإشارة عن طريق تطبيق طرق توليد
الإشارة الموصوفة سابقاً (على سبيل المثال» طريقة تاكمان والطرق القائمة على بتوسي) على العملية بي سي ار. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يوفر الاختراع الحالي إشارات بواسطة طريقة بي سي ار في الزمن الحقيقي. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تنفيذ تضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف بواسطة بي سي ار (تفاعل سلسلة بوليمراز)» ال سي ار LCR (تفاعل سلسلة ligase lad (chain reaction 5 انظر (Wiedmann M, et al.) 'تفاعل سلسلة ليجاز (ال سي ار) - نظرة dele وتطبيقات". بي سي ار Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64) « GLCR (ملء الفجوة ال سي ) « انظر 90/01069 EP 439182 (WO و WO Q-beta Wy - 5 (93/00447 (تضخيم ريبليكاز كيو - بيتاء انظر Cahill P, et al., «Clin Chem, 37(9):1482-5(1991) البراءة الأمريكية رقم 5556751( اس دي ايه SDA 0 (تضخيم إزاحة الشريط «strand displacement amplification انظر Walker et 1 NASBA «(al., Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), EP 497272 (التضخيم القائم على تتابع الحمض النووي» انظر Compton, J.
Nature (350)6313(:912)1991)؛ اي ام تي TMA (التضخيم المتوسط بالتنبيغ Transcription— (Mediated Amplification انظر -32)4(:289 Hofmann WP et al., J Clin Virol. )£93(2005 البراءة الأمريكية رقم 5888779).) أو ار سي ايه RCA (تضخيم الدائرة الدوار Hutchison C.A. et al., Proc.
Natl Acad. kil (Rolling Circle Amplification .(Sci.
USA. 102:1733217336(2005) قد تؤدي طرق التضخيم الموصوفة سابقاً إلى تضخيم التتابعات المستهدفة من خلال تكرار سلسلة من التفاعلات مع أو بدون تغيير درجات الحرارة. يتم التعبير عن وحدة التضخيم التي تشتمل على 0 تكرار سلسلة التفاعلات ب 'دورة”. يمكن التعبير عن وحدة الدورات بعدد التكرار أو الزمن المعتمد على طرق التضخيم. على سبيل المثال؛ يمكن تنفيذ الكشف عن الإشارات في كل دورة تضخيم؛ دورات متعددة مختارة أو نقطة نهاية التفاعلات. ووفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم الكشف عن الإشارات في دورتين على الأقل» يمكن تنفيذ الكشف عن الإشارة في دورة فردية عند جميع درجات حرارة الكشف أو بعض 5 من درجات حرارة الكشف المختارة. ووفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تنفيذ الكشف عند درجة
— 3 3 — حرارة كشف عالية نسبياً فى عدد دورات فردي وفي درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في عدد دورات زوجي. ووفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم اجراء التحضين في الظروف التي تسمح بتضخيم الهدف بالإضافة إلى توليد الإشارة عن طريق وسائل توليد الإشارة. ووفقاً لأحد تجسيمات هذا ١ لاختراع؛ يتم اجراء خطوة 0( في عملية تضخيم إشارة بدون تضخيم
الحمض النووي . حيث يتم توليد الإشارة بواسطة طرق تتضمن شطر الأوليجونيوكليوتيد. يمكن تضخيم الإشارة مع عدم تضخيم الهدف. على سبيل المثال» يمكن اجراء خطوة (أ) مع تضخيم الإشارات ولكن بدون تضخيم التتابعات المستهدفة وفقاً لطريقة سي بي تي Duck P, et al., ( CPT
¢(Biotechniques, 9:142-148 )1990( 0 مقايسة (البراءات الأمريكية أرقام 6,358,691 194,149 ,6(« طرق تعتمد على بتوسي (على سبيل المثال؛ طريقة بي سي اي - اس اتش ؛ طريقة بي سي اي - ان اتش وطريقة بي سي اي سي) أو طريقة سي اي ار WO ) CER 2011/037306(. قد تؤدي طرق تضخيم الإشارة الموصوفة سابقاً إلى تضخيم إشارات من خلال تكرار سلسلة
5 تفاعلات مع أو بدون تغيير درجات الحرارة. يمكن التعبير عن وحدة تضخيم الإشارة التي تشتمل على تكرار سلسلة التفاعلات ب 'دورة". يمكن التعبير عن وحدة الدورات بعدد التكرار أو الزمن القائم على طرق التضخيم. على سبيل المثال « يمكن تنفيذ توليد والكشف عن أ لإشارات عند كل دورة تضخيم » العديد من الدورات المختارة أو نقطة نهاية التفاعلات.
20 يتم إنجاز تضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف عن طريق وسائل تضخيم الهدف بما فيها مجموعة برايمر للتضخيم وبوليمراز حمض نووي.
ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يمكن استخدام بوليمراز الحمض النووي الذي له نشاط نيوكلياز (على سبيل المثال نشاط 5” نيوكلياز أو نشاط 3” نيوكلياز). gy لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يمكن استخدام بوليمراز الحمض النووي الذي ليس له نشاط نيوكلياز. بوليمراز الحمض النووي المفيد في الاختراع الحالي هو بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه الذي يتحمل الحرارة الذي يتم الحصول عليه من العديد من الأنواع البكتيرية؛ تتضمن Thermus (Taq) كناتا2نو8 Thermis «Thermus filiformis «Thermus thermophilus (Tth) Thermus (Thermus antranikianii <Thermococcus literalis «flavus «Thermus igniterrae (Thermus flavus (Thermus chliarophilus (caldophilus «Thermus rubens (Thermus ruber (Thermus oshimai «Thermus lacteus Thermus (Thermus species 205 (Thermus silvanus (Thermus scotoductus 10 «Thermotoga maritima (Thermus thermophilus (species sps 17 «Thermococcus litoralis «Thermosipho africanus (Thermotoga neapolitana «Thermotoga maritima (Thermococcus gorgonarius (Thermococcus barossi «Pyrococcus woesei (Thermosipho africanus (Thermotoga neapolitana Aquifex <Pyrodictium occultum (Pyrococcus abyssi (Pyrococcus horikoshii 5 5 ام0:لام و5نا©)ا860 Aquifex وبالأخص؛ يكون بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه الذي يتحمل الحرارة هو بوليمراز Taq ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم إنجاز تضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف عن Gob بي سي ار غير متماثل. يمكن اختيار نسبة البادئات بالنظر إلى شطر أو تهجين 0 الأوليجونيوكليوتيدات في نفس الاتجاه. أثناء أو بعد تحضين (تفاعل) العينة مع اثنين من وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة؛ يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. أحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين يكون له درجة حرارة كشف عالية نسبياً وللآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً يتم تعيينها عن طريق وسائل توليد الإشارة المقابلة.
— 5 3 — التعبير المستخدم هنا 'تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف يتم تحديدها بواسة وسائل توليد الإشارة المقابلة' يشير إلى أن تتابع الحمض النووي المستهدف يمكن الكشف die عند درجة حرارة كشف معينة مسبقاً لتتابع الحمض النووي المستهدف مما يسمح بالكشف عن الإشارة المتولدة من وسائل توليد الإشارة المصممة لتوليد الإشارة عند درجة حرارة الكشف. ووفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم تعيين درجة حرارة كشف واحدة محددة بواسطة توليد
الإشارة المقابل لتتابع حمض نووي مستهدف واحد. درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية lund وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة
0 كشف منخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية أحد مزايا الاختراع dad) هي تحديد بشكل تفاضلي وجود اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق الكشف عن إشارات درجات حرارة كشف مختلفة تدل على وجود اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة.
5 ووفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد درجات حرارة الكشف لتتابعات الحمض النووي المستهدفة مسبقاً بالنظر إلى مدى درجة الحرارة للسماح بتوليد إشارة عن طريق وسائل توليد الإشارة. استخدامات الاختراع الحالي تكون حيث يكون هناك مدى درجة حرارة معين للسماح بتوليد إشارة بطريقة تعتمد على وسائل توليد الإشارة. على سبيل (JE) عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة عند التهجين (أو الارتباط) بين اثنين من
0 جزيئات الحمض النووي ولا تولد إشارة عند عدم التهجين (أو الارتباط) ein يتم توليد إشارة عند درجات حرارة تسمح بالتهجين بين جزيئي حمض نووي؛ ومع ذلك؛ لا يتم توليد إشارة عند درجات الحرارة التى تفشل في التهجين بين اثنين من جزيئات الحمض النووي. وعلى هذا النحوء هناك مدى درجة حرارة معين للسماح بتوليد الإشارة (أي؛ الكشف عن الإشارة) ومدى درجة حرارة AT لا
— 6 3 — يسمح بتوليد الإشارة. يتم التأثير على نطاقات درجة الحرارة بواسطة القيمة تي ام لتهجين جزبئي الحمض النووي المستخدمين في وسائل توليد الإشارة. وحيث تستخدم طريقة توليد الإشارة قطعة محررة بواسطة واسم بعد استخدام الشطر؛ يمكن الكشف عن الإشارة نظرياً عند أي درجة حرارة (على سبيل المثال» 99-30 درجة مئوية). يتم اختيار درجة حرارة الكشف من مدى درجة الحرارة للسماح بتوليد إشارة عن طريق وسائل توليد الإشارة. يستخدم المصطلح "'مدى درجة حرارة الكشف" هنا ليصف على day الأخص مدى درجة الحرارة للسماح بتوليد الإشارة (أي؛ الكشف عن الإشارة). وحيث يكون هناك نطاقات مختلفة لدرجة حرارة الكشف على أساس وسائل توليد الإشارة لتتابعي 0 1 الحمض النووي المستهدفين » قد يتم اختيار نطاق درجة حرارة كشف غير متداخل كدرجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يتم تحديد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي يتم الكشف die بواسطة وسائل توليد الإشارة التي توفر درجة حرارة كشف عالية نسبياً كتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يمكن اختيار نطاق درجة حرارة الكشف المتداخل كدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يتم تحديد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي يتم الكشف عنه 5 بواسطة وسائل توليد الإشارة التي توفر درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً ولا توفر درجة حرارة الكشف العالية نسبياً كتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة Gag لأحد التجسيمات؛ قد تختلف المنطقة غير المتداخلة والمنطقة المتداخلية على نحو مميز عن بعضها البعض. على سبيل المثال؛ يمكن توليد الإشارة المتوفرة بواسطة تتابع الحمض النووي 0 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بشدة أقل بكثير عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً المختارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. في هذه الحالة» يمكن التغلبعلى مشكلة الإشارة الخاطئة بسبب الإشارة المقدمة بواسطة تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً عند درجة حرارة الكشف
— 7 3 — العالية نسبياً بواسطة الاختيار الملائم للقيمة المرجعية لتحديد أهمية الإشارات التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يمكن تحديد درجات حرارة الكشف مسبقاً بالنظر إلى نطاق درجة حرارة الكشف غير المتداخل ونطاق درجات حرارة الكشف المتداخل من بين درجات حرارة الكشف.
وفقاً لأحد التجسيمات»؛ تختلف درجات حرارة الكشف المخصصة لاستهداف تتابعات الحمض النووي بما لا يقل عن 2 درجة مئوية؛ 3 درجات مئوية؛ 4 درجات مئوية؛ 5 درجات مئوية؛ 7 درجات مثوية؛ 8 درجات مثوية؛ 9 درجات مثوية؛ 10 درجات مثوية؛ 1 1 درجة مثوية؛ 2 1 درجة dasha 15 درجة مئوية أو 20 درجة مئوية عن بعضها البعض. وفقاً للاختراع الحالي 4 لا يمكن تخصيص درجة حرارة للكشضف عن وجود كل من تتايعات الحمض
0 النووي المستهدفة بالنظر إلى وسائل توليد الإشارة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تخصيص أحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين بدرجة حرارة كشف عالية نسبياً dig تخصيص AY) بدرجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ ثم يتم إنشاء وسائل توليد إشارة مناسبة لدرجات حرارة الكشف؛ متبوعاً باجراء خطوة (أ). وفقاً لأحد التجسيمات» يمكن تحديد درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف 5 المنخفضة نسبياً التى يتم عندها اجراء الكشف مسبقاً. على سبيل المثال» يتم تحديد درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مسبقاً 72 درجة مئوية و60 درجة مئوية؛ على التوالي؛ ثم يتم إنشاء وسائل توليد إشارة مناسبة لدرجات حرارة الكشف؛ متبوعاً باجراء خطوة (أ). Tag لأحد التجسيمات؛ يتم أولاً إنشاء وسائل توليد إشارة antl الحمض النووي المستهدفين ثم يتم 0 تخصيص درجات حرارة كشف لتتابعي الحمض النووي المستهدفين» متبوعاً باجراء خطوة (أ). وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة بطريقة تعتمد على تكوين مزدوج؛ يتم اختيار درجة حرارة الكشف على أساس القيمة تي ام للمزدوج.
— 8 3 — وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة بطريقة تعتمد على تكوين المزدوج» تكون درجة حرارة الكشف ALE للتحكم عن طريق ضبط dail) تي ام للمزدوج. على سبيل (JE) حيث يتم توليد الإشارة بواسطة الكشف عن أوليجونيوكليوتيد مهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف (على سبيل المثال» مجس لوكس»؛ مجس منارة الجزيئية ‘ مجس هيبياكون ومجس تهجين مجاور)؛ يتم القيام بالكشف عن الإشارة بنجاح عند درجة الحرارة المحددة سابقاً عن طريق ضبط القيمة تي ام للأوليجونيوكليوتيد. وحيث يتم استخدام البرايمر العقرب ؛ يتم القيام بالكشف عن الإشارة بنجاح عند درجة الحرارة المحددة سابقاً عن طريق ضبط القيمة تي ام للجزء المراد تهجينه بشريط ممتد. وحيث يتم توليد الإشارة بواسطة المزدوج المتكون على أساس وجود تتابع الحمض النووي 0 المستهدف» يتم القيام بالكشف عن الإشارة بنجاح عند درجة الحرارة المحددة lle عن طريق ضبط القيمة تي ام للمزدوج. على سبيل المثال؛ حيث يتم توليد الإشارة بواسطة الطريقة بتوسي ؛ يتم القيام بالكشف عن الإشارة بنجاح عند درجة الحرارة المحددة سابقاً عن طريق ضبط القيمة تي ام للمزدوج الممتد المتكون بواسطة امتداد القطعة بي تي او على سي تي او. الطرق القائمة على بتوسي لها مزايا لضبط بسهولة القيم تي ام للمزدوج أو لهجين ثالث والذي يتأثر 5 تهجينه بالمزدوج. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف» يتم اختيار درجة حرارة الكشف اعتباطياً. بعبارة al يمكن اختيار أي درجة حرارة طالما يمكن الكشف عن الإشارة المتولدة بواسطة شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف. وكما هو موصوف ils حيث يتم توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف؛ 0 يمكن الكشف عن الواسم المحرر بواسطة الشطر عند درجات حرارة مختلفة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف؛ يتم اختيار درجة حرارة الكشف لتكون درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً. وكما هو مناقش ile يتم تحديد درجة حرارة الكشف بالنظر إلى نطاق درجة حرارة الكشف على أساس وسائل توليد الإشارة. لهذاء يمكن وصف الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة كشف معينة
كما يلي: الكشف عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً يكون للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية Lid ويكون الكشف عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً للكشف عن كل من تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً وتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
على سبيل (Jal حيث يتم توليد الإشارات لكل من تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail العالية نسبياً بواسطة الطريقة بتوسي ¢ يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة مزدوج ممتد له dad تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف العالية Las وبتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف
0 المنخفضة نسبياً بواسطة مزدوج ممتد له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. عندما يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ يتم فصل المزدوج الممتد الذي له dad تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً ليكون في شريط he ولهذا لا يتم توليد إشارة؛ وبالتالي الكشف عن الإشارة فقط لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. عندما يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة laws
5 يكون لكل من المزدوج الممتد الذي له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف العالية نسبياً والمزدوج الممتد الذي له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً شكل المزدوج الخاص بهاء وبالتالي الكشف عن كل من الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً والإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
0 في مثال آخرء حيث يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة طريقة تاكمان وبتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الطريقة بتوسي ؛ يتم توفير الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة واسم تألقي محرر ag توفير الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً
5 بواسطة مزدوج ممتد له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. عندما يتم
الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ يتم فصل المزدوج الممتد الذي له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً ليكون في شريط مفرد ولهذا لا يتم توليد إشارة؛ وبالتالي الكشف فقط عن الإشارة من الواسم التألقي المحرر لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. عندما يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف
المنخفضة نسبياً؛ لا يتم الكشف فقط عن الإشارة المقدمة من المزدوج الممتد الذي له قيمة تي ام مناسبة لدرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً ولكن أيضاً الإشارة المقدمة من الواسم التألقي المحرر» وبالتالي الكشف عن كل من الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً والإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
0 يتضمن الكاشف المستخدم في الاختراع الحالي أي وسائل قادرة على الكشف عن الإشارات. على سبيل (JE) حيث يتم استخدام إشارات تألقية؛ يمكن استخدام صمامات ثنائية ضوئية مناسبة في الكشف عن إشارات التألق ككواشف. يعني الكشف باستخدام نوع واحد من الكواشف أنه يتم اجراء الكشف باستخدام كشف قادر على نوع واحد من الإشارات أو باستخدام قناة واحدة (sf) صمام ثنائي ضوئي) لكاشف يحمل عدة قنوات (أي صمامات ثنائية ضوئية).
5 وققاً لأحد التجسيمات؛ يتضمن توليد الإشارات 'توليد أو إنهاء إشارة” و'زيادة أو نقصان "BE من واسمات. خطوة (ب): تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة بعد الكشف عن الإشارة؛ يتم تحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين عن طريق الإشارة التي يتم الكشف عنها في خطوة (أ).
0 يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة CRIS منخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
— 1 4 — تتضمن الإشارات المستخدمة لتحديد وجود الهدف خصائص إشارة مختلفة من الكشف عن الإشارة؛ على سبيل المثال؛ شدة الإشارة [على سبيل المثال » وحدة ار اف يو (وحدة الومضان النسبى (relative fluorescence unit أو في Als اجراء التضخيم؛ قيم ار اف يو في دورة معينة؛ عند دورات مختارة أو عند نقطة النهاية]؛ شكل (أو نمط) تغير الإشارة أو القيمة سي تيء أو القيم الناتجة بواسطة المعالجة الحسابية للخصائص. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ عندما يتم الحصول على منحنى التضخيم بواسطة بي سي ار في الزمن الحقيقي؛ يتم اختيار قيم (أو خصائص) إشارة مختلفة من منحنى التضخيم تستخدم لتحديد وجود الهدف (الشدة؛ قيمة سي تي أو بيانات منحنى التضخيم). يمكن استخدام خصائص الإشارة الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بحد ذاتها لتحديد 0 وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف lal) نسبياً. eg نحو بديل؛ يمكن استخدام إشارة معدلة مقدمة بواسطة المعالجة الحسابية لخصائص الإشارة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يمكن استخدام خصائص الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بحد ذاتها ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بحد ذاتها للحصول على فرق بين الإشارات عند درجة حرارة الكشف 5 العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وعلى نحو بديل؛ يمكن تعديل واحدة أو كل من الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة المعالجة الحسابية لخصائص الإشارة المستخدمة للحصول على الفرق بين الإشارات عند درجة حراراة حرارة عالية نسبياً ودرجة حرارة كشف منخفضة 0 وققاً لأحد التجسيمات» يتضمن المصطلح "SLE بالاقتران مع العبارة 'إشارات يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً ودرجة حرارة كشف منخفضة "lows ليس فقط الإشارة الناتجة عند درجة حرارة الكشف بحد ذاتها ولكن أيضاً إشارة معدلة مقدمة بواسطة المعالجة الحسابية للإشارة.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم القيام بالمعالجة الحسابية؛ يجب أن تكون خصائص الإشارة خصائص قابلة للمعالجة الحسابية. في تجسيم معين؛ تتضمن المعالجة الحسابية حساب (على سبيل cilia) (Jia) ضرب؛ طرح وقسمة) باستخدام إشارات أو الحصول على قيم أخرى مشتقة من الإشارات. الإشارات المستخدمة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة في الاختراع الحالي عموماً هي إشارة هامة. بعبارة أخرى؛ تكون الإشارات إشارة يتم توليدها على أساس وجود
تتابعات الحمض النووي المستهدفة. في غضون ذلك؛ حيث يتم حساب الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ يمكن استخدام إشارة بدون أهمية Jie الإشارات الأساسية لحساب الفرق. في هذا الصدد؛ سيكون من المفهوم أن الإشارات المستخدمة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي
0 المستهدفة لا تشتمل فقط على الإشارات ذات الأهمية ولكن الإشارات غير المهمة أيضاً طالما يمكن استخدامها لحساب الفرق أو التضمين في عملية التحديد. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يمكن تحديد أهمية الإشارات التي تم الكشف عنها باستخدام القيمة الأدنى. على سبيل المثال؛ يتم تحديد القيمة الأدنى مسبقاً من ضابط سلبي بالنظر إلى الأشارات الأساسية للكاشف؛ الحساسية أو الواسم المستخدم؛ ثم يمكن تحديد أهمية الإشارات من العينات.
5 وحيث يتم الكشف عن إشارة (gl) إشارة هامة) عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ يتم تحديد أن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً موجود. يمكن أيضاً التعبير عن الإشارة غير المهمة ب "غياب الإشارة" أو "عدم الكشف عن إشارة". المصطلح المستخدم هنا 'بواسطة إشارة" بالاقتران مع تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة يعني أنه يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الاستخدام أو
0 اتعديل المباشر أو غير Halal) للإشارات المتولدة من وسائل توليد الإشارة؛ بما في ذلك استخدام قيم رقمية للإشارات أو تعديلاتهاء باستخدام وجود/غياب الإشارات ومقارنة الإشارة بالحد الأدنى. ليس هناك أي تمييز مقصود بين المصطلحات dale! إشارة" و"باستخدام "Bll وسيتم استخدام هذه المصطلحات بالتبادل.
— 3 4 — المصطلح المستخدم هنا "تحديد بواسطة إشارة" بالإشارة إلى تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً قد يتضمن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بالنظر إلى أهمية الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
في هذا الاختراع؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً بواسطة الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وحيث يتم الكشف عن إشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسباً؛ لا تسمح الإشارة المذكورة بحد ذاتها بتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة
0 نسبياً. السبب في ذلك هو أن الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail العالية نسبياً يمكن الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. ميزة الاختراع الحالي هي توظيف الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتحليل الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. والمثير للاهتمام» أن المخترعون الحاليون اكتشفوا أنه عندما تدل الإشارات على وجود تتابع حمض 5 نووي مستهدف واحد يتم الكشف عنها في وعاء أحادي التفاعل عند درجتى حرارة كشف محددين مسبقاً؛ هناك تغيير إشارة بنمط معين (قاعدة). على سبيل المثال؛ تغيير الإشارة بين إشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وإشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً يعرض نمط معين (قاعدة). على سبيل المثال؛ قد تكون 0 قيم شدة الإشارات متطابقة أو متطابقة إلى حد كبير لبعضها البعض أو قد تكون الإشارات مختلفة عن بعضها البعض ولكن في نطاق معين عند درجتي حرارة الكشف. ميزة الاختراع all هي تكييف الاكتشافات للكشف عن تتابعات الحمض النووي المستهدفة.
ولأن إشارات تتابع الحمض النووي المستهدف في وعاء الكشف الواحد يتم الكشف عنها بواسطة
فرق درجات حرارة الكشف فقط (على سبيل المثال بدون تغيير كمية الهدف أو بدون اختلاف
ظروف المنظم)؛ هناك نمط معين (قاعدة) في تغيير الإشارة بين درجتي حرارة الكشف. وعلى
أساس النمط المعين (القاعدة) في تغيير الإشارة؛ يمكن استخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتحليل الإشارة التي يتم الكشف عنها في درجات حرارة الكشف
المنخفضة نسبياً.
ووفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم اجراء الطريقة الحالية في حالة والتي تسمح بنمط معين (قاعدة) في
تغيير الإشارة لتتابع حمض نووي مستهدف بين درجتي حرارة الكشف.
ووفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة
0 الكشف المنخفضة نسبياً بهذه الطريقة بحيث يتم تحليل الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتأكيد ما إذا كانت الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً تحتوي على إشارة مقدمة بواسطة تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
5 يمكن اجراء تحليل الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الحصول على الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية Las والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً ثم تحليلها. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يمكن الحصول على مدى (أو جزءِ) إشارة تتابع الحمض النووي
0 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً Lad بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة Lad وفقاً للمبداً باستخدام الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسباً. على سبيل المثال؛ (1) حيث يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail 5 العالية نسبياً في العينة؛ يتم الكشف عن الإشارة عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً
ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. من المرجح أن تكون الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مختلفة عن تلك التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. من المرجح جداً أن يكون هذا الفرق ضمن نطاق معين لأن كل الظروف باستثناء درجات حرارة الكشف تكون مشتركة. وحيث يتم حساب الفرق لعينة تقع ضمن نطاق
0 معين؛ ترجع الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً فقط إلى تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وبعبارة أخرى؛ يمكن تحديد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً غائب في العينة. (2) وحيث يوجد كل من تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً في عينة؛ يتم
الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يصبح الفرق بين الإشارات أكثر قابلية للتمييز عن الفرق في الحالة (1) بسبب وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الفرق. (3) وحيث يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً
0 فقط في العينة؛ يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وليس عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يدل عدم وجود كشف للإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً على غياب تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ بحيث يمكن التعرف على الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بسبب تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ وبذلك يمكن تحديد
5 وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
eg نحو (day في الحالة (3)؛ يمكن الحصول على الفرق باستخدام الإشارة غير المهمة (على سبيل المثال؛ الإشارة الأساسية) التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. في هذا الشكل cal) من المرجح جداً أن يكون الفرق مختلف بوضوح عن الفرق في الحالة (1)؛ وبذلك يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة dows 5 يمكن الحصول على الفرق بين الإشارات التي يتم الكشف عنها عند درجات حرارة الكشف وفقاً لمجموعة كبيرة من الطرق. لا يتضمن المصطلح المستخدم هنا 'فرق" بالاقتران مع 'بواسطة (أو باستخدام) الفرق بين الإشارات) ليس فقط الفرق الذي يتم الحصول عليه بواسطة المعالجة الحسابية للإشارات بحد ذاتها 0 أو إشارات معدلة ولكن الفرق بسبب وجود أو غياب إشارات. على سبيل المثال؛ يمكن الحصول على الفرق بواسطة حساب النسبة أو الطرح بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وعلى نحو بديل؛ يمكن إعطاء الفرق عن طريق تعديل الإشارة عند درجة حرارة كشف والمقارنة مع إشارة عند درجة حرارة كشف أخرى. يمكن التعبير عن الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً في جوانب مختلفة. على سبيل (Jl يمكن التعبير عن الفرق بقيم رقمية؛ غياب أو وجود الإشارة أو برسم مخطط لخصائص الإشارة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا ela) يشتمل الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً على الفرق الذي يتم الحصول عليه بواسطة المعالجة الحسابية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة 0 حرارة الكشف العالية Laws والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» عندما لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً» يتم اجراء تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً
— 4 7 —
بدون النظر إلى الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يتناول هذا التجسيم أن
استخدام الفرق بسبب وجود وغياب الإشارات في درجتي حرارة RASH يسمح بتحديد وجود تتابع
الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يمكن التعامل مع الأشارات الأساسية التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً على أنها eat أو "1" لحساب الفرق.
وفقاً لأحد التجسيمات» Cus يتم الحصول على قيمة ناقص خلال الحساب ؛ يتم تحويلها إلى قيمة
مطلقة واستخدامها للحصول على الفرق.
وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» تكون الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة
حرارة الكشف العالية نسبياً هي معيار الحساب لتحليل الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف
0 الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. قد يكون للإشارات لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والفرق بين الإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً أبعاد أو وحدات مختلفة عن بعضها البعض أو لها أبعاد أو حدات متماثلة لبعضها البعض.
5 1 يتضمن المصطلح المستخدم هنا "يحدد بواسطة فرق " التحديد بواسطة وجود عدم وجود فرق 4 التحديد بواسطة قيمة أو مدى فرق بقيمة رقمية والتحديد بواسطة رسم مخطط لنتيجة الفرق. علاوة على ذلك ¢ يتضمن "التحديد بواسطة فرق ! الحصول على قيمة (على سبيل المثال سي تي) للحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً على أساس الفرق. المصطلح المستخدم هنا 'بواسطة فرق" بالاقتران مع تحديد وجود تتابعات الحمض النووي
0 المستهدفة يعني أنه يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الاستخدام أو التعديل المباشر أو غير المباشر للفرق بين الإشارات؛ Le في ذلك استخدام قيم رقمية للفرق أو تعديلاتها» باستخدام وجود/غياب الإشارات ومقارنة الفرق مع الحد الأدنى. ليس هناك أي تمييز مقصود بين المصطلحات dase فرق ! و"باستخدام فرق ¢ وسيتم استخدام هذه المصطلحات بالتبادل.
يمكن اجراء المعالجة الحسابية للإشارات بواسطة طرق حساب مختلفة وتعديلاتها. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ تكون المعالجة الحسابية للإشارات للحصول على الفرق بين الإشارات هي حساب نسبة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً إلى الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ تكون المعالجة الحسابية للإشارات للحصول على الفرق بين الإشارات هي حساب نسبة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف lie عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يعني المصطلح المستخدم هنا 'نسبة" العلاقة بين رقمين. باستخدام النسبة؛ يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وحيث تكون نسبة الإشارة التي يتم 0 الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً إلى الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً كبيرة؛ تصبح معنونة كمؤشر لوجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. على سبيل المثال» حيث تكون نسبة شدة نقطة النهاية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً إلى شدة نقطة النهاية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً كبيرة (على سبيل (Jad) 5 زيادة في شدة نقطة النهاية)؛ تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يمكن اجراء المعالجة الحسابية بطرق مختلفة. يمكن اجراء المعالجة الحسابية باستخدام آلة. على سبيل (JU قد تخضع الإشارات للمعالجة الحسابية عن طريق معالج في كاشف أو جهاز بي سي ار بالزمن الحقيقي. وعلى نحو بديل؛ قد 0 تخضع الإشارات يدوياً إلى معالجة حسابية وبالأخص Wy لخوارزمية محددة سابقاً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» على أساس طرق الحصول على الفرق؛ يمكن استخدام الحد الأدنى سواء كان الفرق الناتج دليل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. على سبيل المثال؛ يتم تحديد الحد الأدنى مسبقاً بالنظر إلى الفرق الناتج من عينة قياسية تحتوي على الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية
— 9 4 — نسبياً والحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يمكن اعتبار الضابط السلبي؛ الحساسية أو الواسم المستخدم أيضاً لتحديد الحد الأدنى. lay لأحد تجسيمات هذا الاختراع» eg أساس طرق الحصول على الفرق؛ يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الفرق الناتج بحد ذاته. على سبيل JU قد تتضاعف الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مع الحد الأدنى ثم (Sa الحصول على الفرق بين الإشارة المضاعفة والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وبالأخص» يتم تحديد الحد الأدنى مسبقاً بالنظر إلى الفرق الناتج من عينة قياسية تحتوي على الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. 0 وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تحديد الحد الأدنى بواسطة مستخدم أو آلياً. في أحد التجسيمات؛ حيث يصبح الفرق بين الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً أكبر» من المرجح أكثر تقليل أخطاء الكشف باستخدام الحد الأدنى. في أحد التجسيمات؛ حيث يكون للإشارات المقدمة بواسطة تتابع الحمض النووي المستهدف الذي 5 له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً نمط (أو قاعدة) يظهر (تظهر) فرق قليل أو لا يظهر فرق بين درجتي حرارة الكشف؛ يمكن استخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بدون مزبد من التعديلات في أي حساب للفرق أو تحديد لوجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الفرق. في تجسيمات معينة؛ حيث يكون للإشارات نمط (أو قاعدة) يظهر (تظهر) فرق داخل مدى معين؛ يمكن تعريض الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً إلى تعديل يعكس الفرق في تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف . القيمة المرجعية هي القيمة التي تعكس النمط (القاعدة) لتغيير الإشارة في درجات الحرارة المختلفة.
وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛» تكون القيمة المرجعية هي قيمة تعكس نمط (أو قاعدة) التغيير في الإشارات عند اثنين من درجات حرارة كشف مختلفة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. على سبيل المثال» حيث تكون الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً
متطابقة أو متطابقة إلى حد كبير ويتم حساب مدى الفرق في الإشارات عند درجتي حرارة الكشف بواسطة طرح الإشارات؛ القيمة المرجعية "صفر” للإشارات عند درجتي حرارة الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وكعينة أخرى؛ حيث يتم حساب مدى الفرق في الإشارات عند درجتي حرارة الكشف بتقسيم الإشارات؛ القيمة المرجعية
0 تساوي 17" للإشارات عند درجتي حرارة الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. في غضون ذلك؛ حيث تكون الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مختلفة عن بعضها البعض Jig حساب مدى الفرق في الإشارتين عن طريق طرح الإشارات؛ القيمة
5 المرجعية تكون dad موجبة أو قيمة سالبة أخرى غير jin’ للإشارات عند درجتي حرارة الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً, وكمثال OAT حيث يتم حساب مدى الفرق في الإشارات عند درجتي حرارة الكشف بواسطة تقسيم الإشارات؛ القيمة المرجعية تكون أعلى من أو أقل من 1 غير ”1” للإشارات عند درجتي حرارة الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
0 في تجسيمات معينة؛ تكون الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مختلفة عن بعضها البعض» يقع مدى الفرق في الإشارتين ضمن نطاق معين. في تجسيم معين؛ يمكن التعبير عن الفرق في الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً المقدمة بواسطة تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له
درجة حرارة الكشف العالية نسبياً من خلال قيمة مرجعية. في تجسيم معين؛ قد تكون القيمة المرجعية للحالة التي تكون بها الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً المقدمة بواسطة تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail العالية نسبياً مختلفة عن بعضها البعض مختلفة بما يزيد عن 960.5 961 961.5 962؛
42.5 963 963.5 4مك %H4.5 ىك 5.5ك 6ك %6.5 7مك %T.5 %8 %8.5 %9 %9.5 9610 %12 %15 9620 أو %30 مقارنة بالقيمة المرجعية للحالة التي تكون بها الإشارتين متماثلتين. في أحد التجسيمات» حيث يصبح الفرق بين الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف
0 العالية نسبياً أكبرء من المفيد أكثر تقليل أخطاء الكشف في تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. في تجسيمات معينة؛ يمكن استخدام القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة
5 حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ حيث تكون القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف درجة حرارة الكشف العالية نسبياً محسوية من الإشارات عند درجتي حرارة الكشف مختلفة بما يزيد عن %0.5 لك 9461.5 %2 %2.5 %3 963.5 4ك %4.5 %5 %5.5 %6 %6.5 967 967.5 968 %8.5 969 69.5 %10 %12 %15 %20 أو %30 مقارنة بالقيمة المرجعية للحالة التي تكون بها الإشارتين متماثلتين.
0 وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم اجراء المقارنة لتحديد ما إذا كانت القيمة المرجعية تستخدم؛ يتم حساب القيمة المرجعية بتقسيم الإشارات. وفقاً لأحد التجسيمات؛ قد تكون طريقة حساب القيمة المرجعية لتحديد ما إذا كانت القيمة المرجعية تستخدم متماثلة أو مختلفة عن طريقة حساب القيمة المرجعية للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وبالأخص؛ تتعلق ail) المرجعية بتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة Sha 5 الكشف العالية نسبياً.
وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يمكن توظيف القيمة المرجعية لتحليل ما إذا كان الفرق الناتج يدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يمكن توظيف القيمة المرجعية للحصول على الفرق بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. على
(Jl Jus 0 يمكن مضاعفة الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في أو تقسيمها مع القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ثم يمكن الحصول على الفرق بين الإشارة المضاعفة أو المقسمة والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. مثال AT يمكن مضاعفة الإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً أو تقسيمها مع القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية
5 نسبياً ثم يمكن الحصول على الفرق بين الإشارة المضاعفة أو المقسمة والإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم استخدام قيمة مرجعية لتحديد الحد الأدني. وفقاً لتجسيم هذا الاختراع؛ يتم استخدام قيمة مرجعية كحد أدنى مع أو بدون تعديل القيمة. قد يكون للمصطلحات المستخدمة هنا "حد أدنى" و'قيمة مرجعية” لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن
0 طريق تحليل الفرق بين الإشارات نفس القيمة أو المعنى. وعلى نحو بديل؛ عندما يتم توظيف القيمة المرجعية للحصول على الفرق بين الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة cls يمكن استخدام حد أدنى آخر لتحديد أهمية الفرق؛ أي لتحديد ما إذا كان الفرق يدل على وجود الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
— 3 5 — وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ يتم استخدام القيمة المرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. تتضمن الحالة التي يوجد بها تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية Las 5 حالة ally يتم فيها الكشف عن إشارة هامة تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف
الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث لا يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الشكف العالية نسبياًء يتم استخدام القيمة المرجعية اختيارياً لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
0 تتضمن الحالة التي يغيب فيها تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً الحالة Al يتم فيها الكشف فقط عن الإشارة بشدة مماثلة للإشارة الأساسية. la لأحد تجسيمات هذا الاختراع» تستخدم الطريقة قيمة مرجعية؛ لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ يتم الحصول عليها بواسطة )1( تحضين تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مع وسائل توليد
إشارة للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وعاء تفاعل AT غير وعاء التفاعل في خطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
0 وفقاً لأحد التجسيمات؛ Jie الفرق بين الإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً الناتجة في خطوة (3) قيمة ويتم استخدام القيمة كقيمة مرجعية مع تعديل أو بدون تعديل. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يمكن الحصول على قيمة مرجعية بواسطة حساب النسبة أو الطرح بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة Al يتم الكشف عنها
عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم الحصول على القيمة المرجعية بواسطة حساب النسبة للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً إلى الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم الحصول على القيمة المرجعية بواسطة حساب النسبة للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً إلى الإشارة التي يتم الكشف عنها عند
درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ قد تكون طرق حساب فرق الإشارات من عينة والفرق للحصول على قيمة مرجعية مماثلة لبعضها البعض أو مختلفة عن بعضها البعض. على سبيل المثال» shal (Sa الأول بواسطة طرح الإشارتين والأخير بقسمة الإشارتين. وعلى نحو shal (Sar ean الأول
0 والأخير بقسمة الإشارتين للحصول على نسبة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ قد تكون وسائل توليد الإشارة للقيمة المرجعية مماثلة لتلك التي للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف. لتتابع الحمض النووي المستهدف؛ يمكن الحصول على القيم المرجعية في ظروف تفاعل مختلفة تتضمن كمية المكون (على سبيل المثال تتابع الحمض النووي المستهدف؛ وسائل توليد الإشارة؛
5 الإنزيمات؛ أو دي ان تي بي اس (NTPs الأس الهيدروجيني للمنظم أو زمن التفاعل. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يمكن الحصول على القيمة المرجعية في ظروف تفاعل كافية لتوفير إشارة مشبعة عند اكتمال التفاعل. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يكون للفرق بين الإشارات الناتجة في حساب القيمة المرجعية مدى معين وبتم اختيار القيمة المرجعية داخل النطاق المعين أو بالإشارة إلى النطاق المعين. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يمكن اختيار القيمة المرجعية مع
0 الحد الأقصى أو الأدنى للنطاق المعين أو بالإشارة إلى الحد الأقصى أو الأدنى للنطاق المعين. وبالأخص» يمكن تعديل القيمة المرجعية بالنظر إلى الانحراف المعياري للقيم المرجعية الناتجة في ظروف مختلفة؛ نطاقات الخطاً المقبولة؛. الخصوصية أو الحساسية. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يمكن الحصول على القيم المرجعية في ظروف تفاعل مطابقة تستخدم للعينة بما في ذلك المكونات (إذا تم استخدام إنزيمات أو بادئات تضخيم)؛ الأس
الهيدروجيني للمنظم؛ عملية التفاعل. وفقاً لأحد تجسيمات هذا ghia) يمكن الحصول على القيم
المرجعية بواسطة عملية تضخيم إشارة بالتزامن مع أو بدون تضخيم الحمض النووي.
Uy لأحد تجسيمات هذا الاختراع» حيث يكون هناك فرق كبير بين القيمة المرجعية والفرق الناتج
لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ ثم يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يمكن
التعبير عن القيمة المرجعية بنفس نوع القيمة حيث يكون للفرق الناتج لتحديد وجود تتابع الحمض
النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً (على سبيل المثال؛ نسبة قيم نقطة
النهاية لقيم شدة الإشارة).
في تجسيم محدد؛ حيث تكون نسبة dad نقطة النهاية لشدة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند
0 درجة حرارة الكشف العالية نسبياً إلى قيمة نقطة النهاية لشدة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً تساوي 1.8 والقيمة المرجعية تساوي 1.1؛ يمكن تحديدها بحيث يكون هناك فرق كبير بين القيمة المرجعية والفرق الناتج لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يشير هذا إلى وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يكون الفرق لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مماثل أو أكبر من القيمة المرجعية؛ ثم يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يكون الفرق لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مماثل أو أقل من القيمة المرجعية؛ ثم يتم تحديد وجود تتابع
0 الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وعلى نحو بديل؛ يمكن استخدام القيمة المرجعية لحساب الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. على سبيل المثال؛ يتم حساب الفرق لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بهذه الطريقة حيث يتم ضرب الإشارة
(على سبيل المثال ار اف يو) التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً (أو قسمتها) في (أو على) القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ثم يتم طرح نتيجة الضرب (أو القسمة) مع الإشارة (على سبيل المثال ار راف يو) التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. حيث يكون الفرق أكبر (أو أصغر) من "joa أو قيمة محددة سابقاً؛ يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي
له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. مثال آخرء يتم حساب الفرق لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بهذه الطريقة حيث يتم ضرب الإشارة (على سبيل المثال ار اف يو) التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً (أو قسمتها) في (أو على) القيمة
0 المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ثم يتم طرح نتيجة الضرب (أو القسمة) مع الإشارة (على سبيل المثال ار اف يو) التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. حيث يكون الفرق أكبر (أو أصغر) من أصفر” أو قيمة محددة cll يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ قد تتخذ القيمة المحددة سابقاً دوراً كحد أدنى. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام القيمة المرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ عندما يتم الكشف عن إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً أو عندما يتم الحصول على الفرق بين الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة Laws بواسطة
0 عملية حسابية. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم توليد الإشارات بطريقة الزمن الحقيقي المرتبطة بتضخيم الهدف بواسطة بي سي ارء تشتمل المعالجة الحسابية للإشارات على حسابات نسبة شدة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً إلى شدة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً عند كل دورة تضخيم. يتم رسم مخطط لنتائج الحساب مقابل
الدورات ويستخدم لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم توليد الإشارات بطريقة الزمن الحقيقي المرتبطة بتضخيم الهدف بواسطة بي سي ارء تكون القيمة سي تي إشارة للكشف عن الهدف.
يمكن تحديد القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الإشارات التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وعند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ ally يتم تمثيلها كما يلي: أولاً؛ يتم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي لعينة لتحليلها ويتم الحصول على الإشارات التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وعند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ متبوعاً بالحصول على
0 منتحنيات التضخيم لاثنين من درجات حرارة الكشف. (أ) في الكشف عن درجة حرارة الكشف العالية clas حيث لا يكون هناك القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية clas يمكن تحديد ان تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً غير موجود. ثم؛ يتم حساب القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً من
5 منحنى التضخيم الناتج في درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً. حيث يكون تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً غير موجود أيضاً؛ ليس هناك القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. (ب) في الكشف عند درجة Ba الكشف العالية bs حيث توجد القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ ثم يتم حساب نسبة القيمة ار اف يو
0 الناتجة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً إلى القيمة ار اف يو الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً عند الدورة التي تظهر القيمة سي تي. يتم أيضاً حساب نسب القيم ار اف يو في الدورات التالية للدورة التي تظهر القيمة سي تي. (1) حيث تكون جميع نسب القيم ار اف يو أقل من القيمة المرجعية (على سبيل المثال القيمة الناتجة باستخدام تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً فقط كما هو موصوف سابقاً)؛ يتم تحديد عدم
وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الشكف المنخفضة نسبياً. لهذاء ليس هناك القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. (2) حيث تكون جميع نسب القيم ار اف يو أعلى من القيمة المرجعية؛ يتم تحديد القيمة سي تي المحسوبة من منحنى التضخيم الناتج عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً كقيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. (3) حيث
تكون نسبة القيم ار اف يو في الدورة التي تظهر القيمة سي تي أقل من القيمة المرجعية وتكون نسبة القيم ار اف يو بعد دورة معينة أعلى من القيمة المرجعية؛ يتم تحديد الدورة المعينة كقيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. حيث تكون النسب المحسوية مماثلة للقيمة المرجعية؛ يمكن القيام بالتحديد اعتباطياً. على سبيل
0 المثال؛ تصف الأمثلة الموصوفة سابقاً أن التحديد يتم القيام به بالنظر إلى ما إذا كانت النسب أقل من أو ليست أقل من القيم المرجعية. بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن القيام بالتحديد بالنظر إلى ما إذا كانت النسب لا تزيد عن أو تزيد عن القيم المرجعية. يمكن على نحو بديل حساب القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً كما يلي: يتم حساب نسبة القيمة ار اف يو الناتجة عند درجة حرارة
5 الكشف المنخفضة نسبياً إلى القيمة ار اف يو الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لكل دورة؛ ثم يتم حساب القيمة سي تي بالنظر إلى قيمة الحد الأدنى. يمكن حساب القيمة سي تي لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً كما يلي: يتم تعديل القيمة ار اف يو الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في كل دورة بالقيمة المرجعية لكل دورة؛ يتم حساب نسبة القيمة ار اف يو الناتجة عند درجة حرارة
0 الكشف المنخفضة نسبياً إلى القيمة ار اف يو المعدلة لكل دورة؛ ثم يتم حساب القيمة سي تي. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يشتمل استخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً على الحصول على قيمة مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ويشتمل الاستخدام المذكور للفرق على الحصول على
قيمة مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يشتمل استخدام الفرق على الحصول على dad مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ ويتم الحصول على القيمة المؤهلة بواسطة )1( المعالجة الحسابية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند
درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً أو (2) استخدام الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مع اعتبار عدم الكشف عن الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً عندما لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
0 يمكن معالجة القيم المؤهلة حسابياً أكثر للحصول على قيم معدلة. يتم استخدام القيم المؤهلة لتحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين في العينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل وعاء التفاعل الواحد Load على مجموعة إضافية واحدة على الأقل يحتوي كل منها على وسيلتي توليد إشارة إضافيين للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة أخرى غير تتابعي الحمض النووي المستهدفين؛ حيث تكون الإشارات المتولدة بواسطة كل مجموعة
oe 5 وسيلتي توليد الإشارة في الوعاء متباينة عن بعضه البعض وبتم الكشف عن الإشارات بواسطة أنواع مختلفة من الكواشف؛ على التوالي. على سبيل المثال» حيث يتم توسيم وسيلتي توليد الإشارة في الخطوة (أ) ب اف ايه ام ويتم توسيم وسيلتي توليد الإشارة الإضافيتين ب 570 «Quasar تتمايز الإشارات المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة الموسومة ب اف ايه ام في الوعاء عن الإشارات المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة الموسومة ب 570 Quasar ولهذا يكون نوعين من
0 الكواشف مطلوبين للكشف عن اثنين من أضواء الانبعاث المختلفة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يشتمل تتابعي الحمض النووي المستهدفين على اختلاف نيوكليوتيد ويشتمل أحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين على نوع واحد من اختلاف النيوكليوتيد ويشتمل الآخر على النوع الآخر من اختلاف النيوكليوتيد.
يشير المصطلح "اختلاف نيوكليوتيد" المستخدم هنا إلى أي واحد أو العديد من استبدالات؛ حذوفات أو إدراجات نيوكليوتيد في تتابع الحمض النووي دي ان ايه في موقع معين من بين قطع الحمض النووي دي ان ايه المتجاورة lly تكون على خلاف ذلك متماثلة في التتابع. تتضمن قطع الحمض النووي دي ان ايه المتجاورة هذه جين أو أي sha آخر من الكروموسوم. قد تكون اختلافات النيوكليوتيد هذه طافرة أو اختلافات أليل متعددة الأشكال. على سبيل (JE يتضمن
اختلاف النيوكليوتيد الذي يتم الكشف عنه في الاختراع الحالي اس ان بي (تعدد أشكال نيوكليوتيد (aly طفرة؛ (da إدراج؛ استبدال وإزفاء. يتضمن اختلاف النيوكليوتيد التمثيلي اختلافات عديدة في الجينوم البشري (على سبيل (JE اختلافات في جين ميهر (ربداكتاز ميثيلين رابع هيدروفولات))؛ الاختلافات المتضمنة في مقاومة العقار لمسببات الأمراض والاختلافات المسببة
لتكون الأورام. يتضمن المصطلح اختلاف النيوكليوتيد المستخدم هنا أي اختلاف في موقع معين في تتابع حمض نووي. وبعبارة أخرى؛ يتضمن المصطلح اختلاف نيوكليوتيد النوع البري وأي نوع طافر له في موقع معين في تتابع حمض نووي. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يكون اختلاف النيوكليوتيد الذي يتم الكشف die بواسطة الاختراع الحالي اس ان بي (تعدد اشكال نيوكليوتيد واحد).
5 وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يكون لواحد من ألائل alleles اس ان بي درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة. تصبح مزايا الاختراع الحالي أكثر وضوحاً للكشف عن اس ان بي. وحيث تكون درجة حرارة الكشف لأليل النوع البري هي درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ تكون
0 درجة حرارة الكشف للأليل الطافر هي درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وتكون العينة زيجوت متماثل طافرء لن يتم الكشف عن إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وسيتم الكشف عن إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. سيتم تحديد أن العينة لا تحتوي على أليل من النوع البري وتحتوي على أليل من النوع الطافر. في غضون ذلك؛ حتى Laie يتم توليد إشارة زائفة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لعينة الزيجوت المتمائل الطافرء يسمح حساب نتيجة Gol بين
الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة glia الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف lie عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لتحديد وجود أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بتأكيد ما إذا كانت الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي إشارة موجبة زائفة أو لا. السبب هو أن الزيجوت المتماثل ل اس ان بي يشتمل على أليل النوع البري والأليل الطافر بنسبة 1:1. 2- التنميط الجيني اس ان بي باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة في جانب AT لهذا الاختراع؛ يتم توفير طريقة للتنميط الجيني اس ان بي لتتابع حمض نووي في die باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: )( تحضين العينة التي تشتمل على تتابع الحمض النووي الذي يحتوي على موقع اس ان بي 0 (تعدد أشكال أحادي النيوكليوتيد) ووسائل توليد إشارة للكشف عن أليلات اس ان بي في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن إشارة متولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن أي من أليلات اس ان بي بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لأحد أليلات اس ان بي درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة حرارة قادرة على 5 توليد إشارة لأليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد كل من إشارة لأليل اس ان بي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً وإشارة لأليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً؛ حيث لا تتمايز الإشارات المطلوب توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة حسب نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ 0 و (ب) تحديد النمط الجيني اس ان بي عن طريق الاختلاف بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً في الخطوة (أ).
— 6 2 —
وحيث أن الاختراع الحالي يتبع من حيث المبداً الجانب الأول لهذا الاختراع الموصوف سابقاً؛ فإنه
يتم حذف الأوصاف المشتركة بينهم من أجل تجنب التكرار غير الضروري الذي يؤدي إلى تعقيد
هذا الوصف. عند الإشارة إلى أوصاف الجانب الأول من أجل وصف هذا الجانب» تجدر الإشارة
إلى أن الخطوة (ب) بهذا الجانب»؛ lia تختلف عن الخطوة (ب) بالجانب الأول. وبالتالي؛ يفهم
أولئك الخبراء في المجال أن بعض أوصاف الجانب الأول قد يتم تطبيقها بشكل مباشر على
أوصاف الخطوة (ب) بهذا الجانب وأن الأوصاف الأخرى مع التعديلات قد يتم تطبيقها على
أوصاف الخطوة (ب) بهذا الجانب.
خطوة (أ): التحضين مع وسائل توليد الإشارة والكشف عن الإشارة
أولاً؛ يتم تحضين العينة التي تشتمل على تتابع الحمض النووي الذي يحتوي على موقع اس ان بي 0 (تعدد أشكال نيوكليوتيد واحد) مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليلات اس ان بي في وعاء
تفاعل واحد ثم يتم الكشف عن إشارة متولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. لا تتمايز الإشارات
المطلوب توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة حسب نوع واحد من الكواشف.
قد يتضمن تتابع الحمض النووي الذي يحتوي على موقع اس ان بي زوج كروموسوم بشري.
أحد أليلات اس ان بى له درجة حرارة كشف عالية نسبياً والآخر له درجة حرارة كشف منخفضة Las 5 تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ Cus درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي
درجة حرارة قادرة على توليد إشارة لأليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً ودرجة حرارة
الكشف المنخفضة نسبياً هى درجة حرارة قادرة على توليد كل من إشارة لأليل اس ان بى له درجة
حرارة كشف منخفضة نسبياً وإشارة لأليل اس ان بى له درجة حرارة كشف عالية نسبياً.
وفقاً لأحد تجسيمات «gay ١ يتم إجراء الخطوة 0( فى عملية تضخيم إشارة مصاحبة لتضخيم 0 حمض نووي.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة مصاحبة لتضخيم
حمض نووي .
— 3 6 — وفقاً لأحد تجسيمات «gay ١ يتم إجراء الخطوة 0( في عملية تضخيم إشارة بدون تضخيم حمض نووي. خطوة (ب): تحديد النمط الجيني اس ان بي بعد الكشف عن الإشارة؛ يتم تحديد التنميط الجيني اس ان بي عن طريق الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة
كشف منخفضة نسبياً في الخطوة (أ). يسمح الاختراع الحالي للتنميط الجيني اس ان بي فقط باستخدام الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً مع عدم تحديد وجود أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً.
Wy 0 لأحد التجسيمات؛ يتم الحصول على الفرق عن طريق معالجة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً رياضياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم الحصول على الفرق عن طريق حساب النسبة بين الإشارات التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة
a Yes + KL 1 5 نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام إشارة خلفية تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً لحساب الفرق. Tad لأحد التجسيمات؛ قد تعامل إشارة خلفية تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً على أنها "aa أو ١ 1 ١ لحساب الفرق .
20 وفقاً لأحد التجسيمات ¢ حيث يتم الحصول على قيمة سالبة أثناء الحساب يتم تحويلها إلى قيمة مطلقة واستخدامها للحصول على الفرق.
— 4 6 — وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يتم إجراء الخطوة (ب) لتحديد النمط الجيني اس ان بي مع عدم تحديد وجود أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً. يتم إجراء التنميط الجيني اس ان بي باستخدام الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف Alle نسبياً والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً.
السبب في عدم وجود أي شرط لتحديد وجود أليل اس ان بي له درجة حرارة RIS عالية نسبياً هو أن هناك ثلاثة أنماط جينية اس ان بي ؛ وشتمل زيجوت متغاير ل اس ان بى على أليل من النمط البري وأليل طافر بنسبة 1:1. من خلال الجمع بين السبب مع مبداً الاختراع الحالي؛ يمكن shal التنميط الجيني اس ان بي مع عدم تحديد وجود أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تظهر عينة الزيجوت المتماثل التي تحتوي على أليل اس ان بي له
0 درجة حرارة كشف عالية نسبياً فرق (على سبيل المثال نسبة) ضمن نطاق معين؛ تظهر عينة الزيجوت المتغاير فرق (على سبيل المثال نسبة) ضمن نطاق آخر معين وتظهر عينة الزيجوت المتماثل التي تحتوي على أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً فرق (على سبيل المثال نسبة) ضمن النطاق الآخر المعين. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ قد يرتبط النطاق المعين لكل نمط جيني اس ان بي بقيمة مرجعية
لكل نمط جيني اس ان بي. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تستخدم الطريقة واحدة على الأقل من القيم المرجعية للزيجوت المتماثل الذي يتألف من أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية cls الزيجوت المتمائل الذي يتألف من أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً والزيجوت المتغاير لتحديد النمط الجيني اس ان بي.
0 وققاً لأحد تجسيمات الاختراع» تستخدم الطريقة جميع القيم المرجعية الثلاثة لتحديد النمط الجيني اس ان بي. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تستخدم الطريقة اثنين على الأقل من القيم المرجعية للزيجوت المتمائل الذي يتألف من أليل اس ان بي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً والزيجوت المتغاير لتحديد النمط الجينى اس ان بى.
Uy لأحد التجسيمات؛ تستخدم الطريقة قيمة مرجعية؛ لتحديد التنميط الجيني اس ان بي ؛ تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين زيجوت متماثل يتألف من أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف عالية Tow في وعاء تفاعل AT غير وعاء التفاعل في الخطوة of) (2) الكشف عن
5 الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً. Ud لأحد التجسيمات؛ تستخدم الطريقة قيمة مرجعية؛ لتحديد التنميط الجيني اس ان بي؛ تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين زيجوت متغاير يتألف من كل من أليل اس ان بي الذي له
0 درجة حرارة كشف Ale نسبياً وأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً مع وسائل توليد الإشارة المقابلة في وعاء تفاعل AT غير وعاء التفاعل في الخطوة oT) (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة Los و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ تستخدم الطريقة قيمة مرجعية؛ لتحديد التنميط الجيني اس ان بي؛ تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين زيجوت متماثل يتألف من أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً في slog تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً
0 «ؤ(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ للتنميط الجيني اس ان بي لعينة؛ يتم حساب الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة CRIS عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة Sha كشف منخفضة نسبياً ومقارنتها بالقيم المرجعية لكل نمط جيني اس ان بي.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ قد يتم الحصول على قيمة مرجعية عن طريق حساب النسبة بين الإشارات التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة RIS عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ قد يتم الحصول على dail) المرجعية في ظل ظروف تفاعل كافية تتوفير إشارة مشبعة عند اكتمال التفاعل. على سبيل المثال» من أجل الحصول على dad مرجعية لزيجوت متغاير يتألف من كل من أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً dally اس ان بي الذي له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ يتم اختيار ظروف التفاعل مثل محتوى كل أليل اس ان بي بحيث يتم توفير إشارة مشبعة لكل أليل اس ان بي عند اكتمال التفاعل. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يكون للفرق بين الإشارات التي تم الحصول عليها في حساب القيمة المرجعية 0 نطاق معين ويتم اختيار القيمة المرجعية ضمن النطاق المعين أو بالإشارة إلى النطاق المعين. حيث أن درجة حرارة الكشف لأليل من النمط البري هي درجة حرارة الكشف العالية نسبياً» درجة حرارة الكشف للأليل الطافر هي درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ ويتم حساب النسبة بين الإشارات التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً للحصول على الفرق؛ تظهر عينة الزيجوت المتماثل البري نسبة ضمن Gai 5 معين وتظهر عينة الزيجوت المتغاير نسبة ضمن نطاق معين آخر. على سبيل المثال؛ تظهر عينة الزيجوت المتماثل البري نسبة حوالي 1.0 وتظهر عينة الزيجوت المتغاير ل اس ان بي نسبة حوالي 2.0. dual) Cua هي زيجوت متماثل الألائل طافرء قد يتم استخدام إشارة خلفية تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً لحساب النسبة بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة 0 كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً. في هذه الحالة؛ قد تظهر النسبة المحسوية قيمة أعلى بكثير من 2.0؛ والتي تشير إلى أن النمط الجيني اس ان بي للعينة هو زيجوت متماثل الألائل طافر. على نحو بديل؛ قد تظهر النسبة المحسوية قيمة تنتمي إلى النطاق المعين للنسبة (على سبيل المثال حوالي 9.0) التي تظهرها عينة الزيجوت المتماثل الطافر.
— 7 6 — علاوة على ذلك؛ حتى عندما يتم توليد إشارة خاطئة عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً لعينة الزيجوت المتماثل الطافرء تظهر النسبة قيمة ed بكثير من 2.0؛ والتى تشير إلى أن النمط الجيني اس ان بي للعينة هو زيجوت متماثل طافر. وبالتالي؛ يتبح الاختراع الحالي للنمط الجيني اس ان بي تحديد النمط الجيني اس ان بي باستخدام فقط الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم
2.58 عنها Ale درجة حرارة كشة امك EE نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يوفر الفرق قيمة مؤهلة تم الحصول عليها عن طريق المعالجة الحسابية للإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً.
0 1 وفقاً لأحد التجسيمات ¢ يتم الحصول على قيمة مرجعية بواسطة عينة معيارية تحتوي على زيجوت متماثل بري؛ زيجوت متماثل طافر أو زيجوت متغاير وتستخدم لتحليل الفرق الذي تم الحصول عليه من عينات الاختبار. 3- الكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة
5 للايزال في جانب آخر لهذا الاختراع» يتم توفير طريقة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) تحضين العينة مع ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن إشارة متولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن كل من الثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض
0 النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من الثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة كشف مختلفة تم تحديدها بواسطة وساتل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث درجة حرارة الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب
— 8 6 — توليدها بواسطة وساتل توليد الإشارة حسب نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء الكشف عند كل من درجات حرارة الكشف المختلفة؛ و (ب) تحديد وجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الإشارات التي تم الكشف عنها في الخطوة (أ)؛ حيث عندما يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة بين ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ فإنه يتم تحديد
وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف معينة عن طريق الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة Al تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ حيث عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة هى درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً بين درجات حرارة الكشف؛ فإنه
يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وحيث أن الاختراع الحالي يتبع من حيث المبداً الجانب الأول لهذا الاختراع الموصوف lila يتم حذف الوصف المشترك بينها من أجل تجنب التكرار غير الضروري الذي يؤدي إلى تعقيد هذا الوصف.
5 خطوة (أ): التحضين مع وسائل توليد الإشارة والكشف عن الإشارة (Yl يتم تحضين العينة المطلوب تحليلها مع ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل ثم يتم RASH عن إشارة متولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. ولا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف.
0 عد تتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة الاختراع الحالي غير محدود؛ ويتضمن أكثر من 43 5 987TH و0 1 تتابعات حمض نووي مستهدفة في الوعاء أحادي التفاعل.
— 6 9 —
يتم الكشف عن كل من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل
توليد إشارة مقابلة. ويكون لكل من الثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة
حرارة كشف مختلفة تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة.
Ta لأحد التجسيمات؛ تختلف درجات حرارة الكشف المعينة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة ب
5 2 درجة مثوية؛ 3 درجات مثوية؛ 4 درجات مثوية؛ 5 درجات مثوية؛ 7 درجات مثوية؛ 8 درجات
مثوية؛ 9 درجات مثوية؛ 0 1 درجات مثوية؛ 1 1 درجة مثوية؛ 2 1 درجة مثوية؛ 5 1 درجة مثوية
أو 20 درجة مئوية على الأقل عن بعضها البعض.
أحد تتابعات الحمض النووي المستهدفة يكون له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً. يتم استخدام
وسائل توليد إشارة قادرة على توفير lal عند درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً للكشف عن تتابع 0 الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً.
درجة حرارة الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف
له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف Sel
من درجة حرارة الكشف. يتم إجراء الكشف عند كل من درجات حرارة الكشف المختلفة.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة مصاحبة لتضخيم الحمض 1 النووي .
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم BLE) بدون تضخيم حمض نووي.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هي وسيلة توليد إشارة لتوليد إشارة
بطريقة تعتمد على تن تشكيل مزدوج.
Tay لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هي وسائل 0 توليد إشارة لتوليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوج.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق تشكيل مزدوج بين تتابع حمض نووي مستهدف
وقليل نيوكليوتيد كشف مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد
— 0 7 — التجسيمات؛ يتم توليد HLIY بواسطة مزدوج مُشكل بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوج بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن
على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هي وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد كشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق تهجين قليل نيوكليوتيد الكشف مع تتابع حمض نووي مستهدف ثم شطر قليل نيوكليوتيد الكشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن
0 طريق شطر قليل نيوكليوتيد الكشف بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً بين ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة.
5 وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد الإشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد كشف؛ ووسائل توليد الإشارة لتتابعات (mead) النووي المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوج. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة
0 حرارة الكشف الأعلى Laws هي وسائل وليد إشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد «dS ووسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد Hla) عن طريق تشكيل مزدوج بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف .
— 7 1 —
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يطلق شطر قليل نيوكليوتيد توسط قطعة وتتوسط القطعة في تشكيل مزدوج أو شق قليل نيوكليوتيد كشف عن طريق تمديد القطعة على قليل نيوكليوتيد احتجاز. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تشتمل ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة على واسم Gildas ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بواسطة نوع واحد من الكواشف.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوج؛ يتم اختيار درجة حرارة الكشضف dl على قيمة تي ام للمزدوج. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ عندما تولد وسائل توليد الإشارة إشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد كشف؛ يتم اختيار درجة حرارة الكشف بشكل عشوائي. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ قد توفر وسائل توليد الإشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد كشف درجة حرارة CRIS أعلى نسبياً.
0 وققاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد درجات حرارة الكشف لتتابعات الحمض النووي المستهدفة مسبقاً بالنظر إلى نطاق درجة حرارة يسمح بتوليد الإشارة بواسطة وسائل توليد الإشارة. وفقاً لأحد التجسيمات ؛ يتم تحديد درجة حرارة الكشف لكل تتابع حمض نووي مستهدف مسبقاً بالنظر إلى نطاق درجة حرارة يسمح بتوليد الإشارة بواسطة وسائل توليد الإشارة للكشف عن أي تتابع حمض نووي مستهدف. قد يتم تحديد درجات حرارة الكشف مسبقاً بالنظر إلى نطاق درجة
5 حرارة الكشضف غير المتراكب ونطاق درجة حرارة الكشف المتراكب بين درجات حرارة الكشف. ويكون الكشف عند درجة حرارة CRIS معينة للكشف عن إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف. ويكون الكشف عند درجة حرارة كشف أعلى نسبياً للكشف عن إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً.
0 على سبيل المثال؛ حيث تشتمل تتابعات الحمض النووي المستهدفة على ثلاثة تتابعات مستهدفة ودتم تعيين درجات حرارة كشف 72 درجة ٠» Lge 0 درجة مثئوية و50 درجة مثوية للثلاثة تتابعات المستهدفة؛ على التوالي؛ يتضمن الكشف عند 50 درجة مئوية ليس فقط الكشف عن الإشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف 50 درجة مئوية ولكن أيضاً الكشف عن
— 2 7 — إشارات لتتابعات الحمض النووي المستهدفة التى لها درجة حرارة كشف 70 درجة مئوية و60 day مئوية؛ على التوالى. أحد سمات الاختراع الحالي هي التحديد التفاضلي لوجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق الكشف عند درجات حرارة كشف مختلفة عن الإشارات الدالة على وجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. خطوة (ب): تحديد وجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بعد الكشف عن الإشارة؛ يتم تحديد وجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها في خطوة (أ). وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف 0 معينة بطريقة يتم فيها تحليل الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف معينة باستخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة من أجل التحقق مما إذا كانت الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف معينة تحتوي على إشارة يوفرها تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة أم لا. عندما يكون من المطلوب تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة 5 بين ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة عن طريق الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. Cus تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً بين درجات حرارة الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي 0 مستهدف بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل الفرق على فرق يتم الحصول عليهعن طريق المعالجة الحسابية للإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ عندما لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة؛ فإنه يتم إجراء تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة مع اعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة.
وبتناول هذا التجسيم أن استخدام الفرق بسبب وجود وعدم وجود إشارات يسمح بتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة. على سبيل المثال» بافتراض أن تتابعات الحمض النووي المستهدفة تشتمل على أريع تتابعات مستهدفة»؛ يتم تعيين درجات حرارة كشف 72 درجة مئوية» 60 درجة مئوية» 50 درجة مئوية و40 درجة مئوية للأربع تتابعات المستهدفة؛ على التوالي؛ ويتم الكشف عن الإشارات عند درجات حرارة
0 كشف 60 درجة مثوية؛ 50 درجة مئوية و40 درجة مئوية في خطوة (أ). عندما يكون المطلوب هو تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف 40 درجة مئوية؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة (40 درجة مئوية) باستخدام الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة RES )60 درجة مئوية و50 درجة مئوية) lof من درجة حرارة الكشف المعينة (40 درجة مئوية)
5 والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وبشكل أكثر وضوحاً قد يتم استخدام الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند 60 درجة مئوية والإشارة التي تم الكشف عنها عند 40 درجة متوية؛ الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند 50 درجة Augie والإشارة التي تم الكشف عنها عند 40 درجة مئوية أو كلا الفرقين لتحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف 40 درجة مئوية.
0 يمكن تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أخرى (أي؛ 0 درجة مئوية و50 درجة مئوية) على التوالي كما تم وصفه سابقاً. يتضمن المصطلح "الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات Sha الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة" أنه يتم الحصول على الفرق بين الإشارات عند اثنين من درجات حرارة الكشف.
5 أحد الإشارات هي الإشارة التي تم الكشف عنها عند أحد درجات الكشف الأعلى من درجة حرارة
الكشف المعينة والأخرى هي الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وحيث
تكون درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة أكثر من اثنين؛ فإنه قد يتم
الحصول على فروق أكثر من اثنين.
يتضمن المصطلح "الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات Sha 5 الكشف والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة" ليس فقط الفرق بين
الإشارات التي تم الكشف عنها عند اثنين من درجات حرارة الكشف ولكن أيضاً الفرق الذي تم
الحصول عليه باستخدام الفرق بين اثنين من درجات حرارة الكشف والإشارة التي تم الكشف ie
عند درجة حرارة الكشف الأخرى.
على نحو بديل؛ وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له
0 درجة حرارة الكشف المعينة )60 درجة مئوية) باستخدام الفرق الذي يتم الحصول عليه عن طريق المعالجة الحسابية للإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف (72 درجة مئوية) الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة (60 درجة مئوية) والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وحيث لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى (72 درجة (Lise فإنه قد يتم استخدام إشارة الخلفية لحساب الفرق.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف (72 درجة (sie أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة (60 درجة مئوية)؛ فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة )60 درجة مئوية) باستخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة (60 درجة متوية) مع اعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف (72 درجة (Liste الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة )60
0 درجة (sie في حالة الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى (72 درجة مئوية)؛ فإنه يمكن تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ عندما يكون المطلوب هو تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة بين ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ يتم تحديد وجود
— 5 7 — تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة باستخدام الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف ef مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل استخدام الفرق على استخدام فرق يتم الحصول عليه عن طريق المعالجة الحسابية للإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف أعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة وإشارة تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ Laie لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى مباشرة من درجة حرارة الكشف المعينة؛ فإن استخدام الفرق يشتمل على استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة مع اعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف 0 الأعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة. على سبيل المثال؛ عندما يكون المطلوب هو تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف 40 درجة مئوية؛ فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة باستخدام الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف )50 درجة مئوية) الأعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة مثوية) والإشارة التي 5 .تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يكون هناك حاجة إلى قيمة مرجعية لتحديد ما إذا كانت الإشارات التي تم الكشضف عنها عند درجات حرارة كشف 50 درجة مثوية و40 درجة Lge تدل على وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف 50 درجة مئوية و40 درجة مثوية. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ بالاعتماد على نهوج ا لحصول على الفرق؛ قد يتم استخدام حد أدنى 0 لتحليل ما إذا كان الفرق الذي تم الحصول عليه يدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ بالاعتماد على نهوج الحصول على (Guill قد يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة باستخدام الفرق الذي تم الحصول
عليه في حد ذاته. على سبيل المثال؛ يتم عكس قيمة الحد الأدنى مسبقاً في الحصول على الفرق لتجسيم هذا الاستخدام المباشر للفرق في حد ذاته. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يتم استخدام قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة.
في تجسيم معين؛ قد يتم التعبير عن الفرق في الإشارات عند درجة حرارة الكشف المعينة ودرجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة التي يوفرها تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة من خلال قيمة مرجعية. في تجسيم معين» القيمة المرجعية للحالة التي فيها الإشارات عند درجة حرارة الكشف المعينة ودرجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة التي يوفرها تتابع الحمض النووي
0 المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة تختلف عن بعضها البعض وقد تختلف SL من %0.5 961 961.5 962 962.5 963 963.5 64 %4.5 كاك %5.5 6ك %6.5 7ك %7T.5 %8 %8.5 969 969.5 9610 %12 9615؛ 9620 أو 9630 بالمقارنة مع القيمة المرجعية للحالة التي فيها تكون الإشارتين متماثلتين.
5 في تجسيم معين؛ قد يتم استخدام القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف lel من درجة حرارة الكشف المعينة في تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة المعينة؛ حيث قد تكون القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة المحسوبة من الإشارات عند اثنين من درجات حرارة الكشف مختلفة بأكثر من 960.5 961 961.5 962
%H3.5 %3 42.5 0 4مك 4.5ك ىك %H5.5 6ك %6.5 7مك %T.5 968 %8.5 %9 969.5؛ %10 %12 %15 9620 أو 9630 بالمقارنة مع القيمة المرجعية للحالة التي فيها تكون الإشارتين متماثلتين. وفقاً لأحد التجسيمات» حيث يتم إجراء المقارنة لتحديد ما إذا تم استخدام قيمة مرجعية؛ يتم حساب القيمة المرجعية عن طريق تقسيم الإشارات. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام الطريقة لحساب
— 7 7 —
القيمة المرجعية لتحديد ما إذا كانت القيمة المرجعية المستخدمة هى نفسها أو مختلفة عن طريقة حساب القيمة المرجعية للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم الكشف عن الإشارات للعديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عند درجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة؛ يتم استخدام قيمة
مرجعية للعديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة فى اعتبار نمط تغيير الإشارة عند درجات حرارة كشف متغيرة للعديد من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة؛ يتم استخدام القيمة المرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة.
0 تتضمن الحالة التي فيها يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة حالة يتم فيها الكشف عن إشارة هامة تدل على وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة عند درجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث لا يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف
5 الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة؛ يتم استخدام القيمة المرجعية اختيارياً لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة. تتضمن الحالة التي فيها يكون تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة غير موجود حالة يتم فيها الكشف فقط عن إشارة لها شدة able لإشارة الخلفية.
قد يتم تحضير القيم المرجعية مسبقاً لجميع التوليفات أو لبعض التوليفات المختارة من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ تمثل القيمة المرجعية الفرق بين الإشارات عند درجات حرارة الكشف التي تم الحصول عليها من التوليفات السابقة.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ قد يتم الحصول على dail) المرجعية في ظل ظروف تفاعل كافية
لتوفير إشارة مشبعة عند اكتمال التفاعل. على سبيل (JE من أجل الحصول على dad مرجعية
لتوليفة من اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ يتم اختيار ظروف التفاعل Jie محتوى
كل تتابع حمض نووي مستهدف بحيث يتم توفير إشارة مشبعة لكل تتابع حمض نووي مستهدف عند اكتمال التفاعل. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يكون للفرق بين الإشارات التي تم الحصول
عليها في حساب القيمة المرجعية نطاق معين وبتم اختيار القيمة المرجعية ضمن هذا النطاق
المعين أو بالإشارة إلى النطاق المعين.
قد يتم استخدام القيم المرجعية لتحديد أهمية الفرق الذي تم الحصول عليه في العينة؛ بالنظر إلى
الطريقة للحصول على الفرق ونتائج الكشف العملية. قد يتم استخدام القيم المرجعية للحصول على
0 الفرق في dial) حيث يشارك في تحديد وجود الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد تجسيمات pla] لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة» تستخدم الطريقة قيمة مرجعية واحدة على الأقل بين القيم المرجعية التي تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين جميع توليفات تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة مع وسائل توليد الإشارة المقابلة في وعاء
5 تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في خطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات ليس فقط عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة Bla الكشف المعينة ولكن أيضاً درجة Sha الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.
0 وحيث الهدف هو الكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الاختراع الحالي؛ قد يتم الحصول على قيم مرجعية مختلفة بالنظر إلى التوليفات المختلفة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة مع توليفة مختلفة من اثنين من درجات حرارة الكشف المختارة للكشف عن الإشارة.
وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة بترتيب درجات حرارة الكشف الخاصة بها من تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى إلى تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأقل؛ وبتم اختيار القيم المرجعية بشكل مناسب بالاعتماد على طرق تحديد الوجود المستهدف واستخدامها.
في المثال السابق؛ للحصول على قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة (Liste يتم تحضين جميع التوليفات (أي؛ تتابع الحمض التووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف 60 درجة مئوية؛ تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف 50 درجة متوية؛ وتوليفة تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف 60 درجة مئوية و50 درجة مئوية) من تتابعات الحمض النووي المستهدفة
0 التي لها درجات حرارة كشف )60 درجة مئوية و50 درجة مئوية) أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة مئوية) مع وسائل توليد الإشارة لتوليد الإشارات؛ يتم الكشف عن الإشارات ليس فقط عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف )60 درجة مئوية و50 درجة مئوية) أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة (40 درجة مئوية) ولكن أيضاً درجة حرارة الكشف المعينة (40 درجة مئوية)؛ ثم يتم استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف
5 الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة للحصول على الفرق بين الإشارات. وفقاً لنفس الطريقة؛ يتم الحصول على القيم المرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجات حرارة الكشف الأخرى (أي؛ 60 درجة مئوية و50 درجة مئوية). على نحو بديل؛ لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف
0 المعينة؛ تستخدم الطريقة أيضاً قيمة مرجعية واحدة على الأقل بين القيم المرجعية التي تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين جميع توليفات تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة مع وسائل توليد الإشارة المقابلة في وعاء تفاعل A غير وعاء التفاعل في خطوة of) (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة RES الأعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة ودرجة حرارة الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول
5 على BA بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف الأعلى مباشرةً من درجة
حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة للحصول على الفرق بين الإشارات. في المثال السابق؛ للحصول على قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة (Liste يتم تحضين جميع التوليفات (أي؛ تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف 60 درجة مئوية؛ تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف SO درجة (Augie وتوليفة من تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف 60 درجة Liste و50 درجة مئوية) من تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة الكشف (60 درجة مئوية و50 درجة مئوية) الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة مئوية) مع وسائل توليد الإشارة لتوليد الإشارات؛ يتم الكشف عن الإشارات عند 0 كل من درجة حرارة الكشف )50 درجة (Lge الأعلى Ble من درجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة مثوية) ودرجة حرارة الكشف المعينة )40 درجة مئوية)؛ ثم يتم استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة RES )50 درجة مئوية) أعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة (40 درجة مئوية) للحصول على الفرق بين الإشارات. وفقاً لنفس الطريقة؛ يتم الحصول على القيم المرجعية لتحديد وجود تتابع 5 الحمض النووي المستهدف الذي له درجات حرارة كشف أخرى (أي؛ 60 درجة مئوية و50 درجة مئوية). وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم الحصول على القيمة المرجعية عن طريق حساب النسبة أو الطرح بين الإشارات التي تم الكشف عنها عند أحد درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة ودرجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ يتم الحصول على 0 القيمة المرجعية عن طريق حساب نسبة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة إلى الإشارة التي تم الكشف عنها عند أحد درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يتم الحصول على القيمة المرجعية عن Gob حساب نسبة الإشارة التي تم الكشف عنها عند أحد درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة إلى الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يتم الحصول على الحد الأدنى باستخدام القيمة المرجعية لتحديد وجود
تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة؛ فقد يتم الحصول عليها
باستخدام قيمة مرجعية معينة أو بعض القيم المرجعية من بين القيم المرجعية التي تم الحصول
عليها من التوليفات المختلفة من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. على سبيل المثال؛ حيث يتم تحليل واحد من بين تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة
حرارة الكشف المعينة لعدم وجوده؛ يتم استخدام القيم المرجعية التي تم الحصول عليها من توليفة
من تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لا تحتوي على تتابع حمض نووي مستهدف واحد
لتحديد الحد الأدنى.
في أحد التجسيمات؛ حيث يتم الكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي
0 المستهدفة؛ للتحقق من وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة؛ يتم التحضير المسبق لعينة معيارية تشتمل على توليفات من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستثناء تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة ثم يتم الحصول على القيم المرجعية. بالنظر إلى القيم المرجعية؛ يتم الحصول على حد أدنى لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة على الحصول على قيمة مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً ويشتمل استخدام الفرق على الحصول على dad مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ يشتمل استخدام الفرق على الحصول على dad مؤهلة لتحديد وجود
0 تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة؛ وبتم الحصول على القيمة المؤهلة عن طريق (1) المعالجة الحسابية للإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة أو (2) استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة مع اعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى
— 2 8 — من درجة حرارة الكشف المعينة عندما لا يتم الكشف عن الإشارة عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» يتم إجراء الخطوة )2( عن طريق تحديد أولاً وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف أعلى نسبياً ثم بشكل متتابع تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة التى لها درجات حرارة كشف أقل نسبياً بترتيب تنازلى. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل الوعاء أحادي التفاعل Lad على مجموعة إضافية واحدة على الأقل يحتوي كل منها على ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة الإضافية للكشف عن تتتابعات الحمض النووي المستهدفة غير الثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ Cua يتم التمييز بين الإشارات التي تولدها كل مجموعة من ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة 0 في الوعاء عن بعضهم البعض وبتم الكشف عن الإشارات بواسطة أنواع مختلفة من الكواشف؛ على التوالي. وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع؛ تشتمل تتابعات الحمض النووي المستهدفة على بديل نيوكليوتيد (خاصة اس ان بي). 4- الكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة 5 1 وتحليل انصهار في جانب آخر لهذا الاختراع؛ يتم توفير طريقة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل انصهار؛ تشتمل على: )1( تحضين العينة مع اثنين من وسائل توليد الإشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن إشارة تم توليدها باستخدام نوع واحد من 0 الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لواحد من اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة Cail
— 8 3 —
المنخفضة نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف
الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له
درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة اثنين
من وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء الكشف عند درجة حرارة
الكشف العالية نسبياً؛
(ب) إجراء تحليل انصهار للتحضين الناتج من خطوة (أ) خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد
وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و
(ج) تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً
بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها في خطوة (أ) ووجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي 0 له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الناتج من تحليل الانصهار في خطوة (ب).
خطوة (أ): التحضين مع وسائل توليد الإشارة والكشف عن الإشارة
أولاً» يتم تحضين العينة المطلوب تحليلها مع اثنين من وسائل توليد الإشارة للكشف عن اثنين من
تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل ثم يتم الكشف عن الإشارة التي تم
توليدها باستخدام نوع واحد من الكواشف. لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة 5 اثنين من وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف.
يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة.
ويكون لواحد من اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة كشف عالية نسبياً
ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم الكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له 0 درجة حرارة كشف lle نسبياً بواسطة طريقة كشف في الزمن الحقيقى باستخدام درجة حرارة كشف
مختلفة؛ ويتم الكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة CRIS منخفضة
نسبياً عن طريق تحليل انصهار.
— 8 4 —
يتم إجراء الكشف في خطوة )1( عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وليس عند درجة حرارة 2.58 أل روغ واج نسبياً. يتم اختيار وسائل توليد الإشارة القادرة على توليد إشارة أثناء تحليل الانصهار لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ لأن وسائل توليد ١ لإشارة لتحليل الانصهار تستخدم تهجين وتمسخ مزدوج؛ وقد تولد إشارة بالاعتماد على ظروف التفاعل في خطوة (أ). وفقاً لأحد التجسيمات» يجب إنشاء وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً لعدم توليد إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً.
0 في الجانب الرابع لهذا الاختراع» قد تعمل وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً على توليد أو عدم توليد إشارة بالاعتماد على ظروف التفاعل في الخطوة (أ). حتى إذا كان من الممكن توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً فى ظروف تفاعل معينة؛ فإنه لا يتم الكشف عن الإشارة التي تم توليدها حيث يتم إجراء الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف
5 العالية نسبياً فى خطوة (أ). وحيث قد يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً والكشف عنها في خطوة (ب)؛ لا تخضع الإشارة للتوليد في خطوة (أ). وفقاً لأحد التجسيمات؛ لا تتضمن وسائل توليد الإشارة لتحليل الانصهار وسائل توليد إشارة عن طريق شطر مسابير موسومة أو مزدوجة موسومة. وحيث يستخدم تحليل الانصهار قيمة تي ام
0 - للهجائن؛ يجب استبعاد شطر الهجائن المطلوب CRASH عنها. عند الشطر؛ قد لا يتم إنتاج قمم الانصهار أو قد يتم تقليل حساسية الكشف بشكل كبير. بالإضافة إلى ذلك؛ من المرجح أن تكون الإشارة بواسطة الشطر إشارة إيجابية خاطئة فى طريقة الكشف فى الزمن الحقيقى.
— 5 8 — يتم إجراء الخطوة (أ) في ظل ظروف قادرة على توليد على الأقل الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة متزامنة مع تضخيم الحمض النووي .
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة بدون تضخيم الحمض
النووي . Uy لأحد التجسيمات؛ واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هى وسائل
0 توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق تشكيل مزدوجة بين تتابع حمض نووي مستهدف وقليل نيوكليوتيد كشف مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. Tg لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة بواسطة مزدوجة تم تشكيلها بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف.
5 وفثقاً لأحد التجسيمات» واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هى وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد كشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق تهجين قليل نيوكليوتيد الكشف مع تتابع حمض نووي مستهدف وشطر قليل نيوكليوتيد الكشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد الكشف بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي
المستهدف. Tay لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوجة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف.
— 8 6 —
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. على وجه الخصوص؛ من المفيد جداً استخدام توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد الكشف لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً
للأسباب التالية: (1) قد يتم اختيار درجة حرارة الكشف بنطاق درجات حرارة واسع نسبياً؛ (2) قد يتم اختيار درجة حرارة أعلى بكثير بالمقارنة مع نهوج التهجين؛ و(3) من الممكن عدم توفير أي إشارة في تحليل الانصهار عن طريق اختيار وسائل توليد إشارة وظروف تفاعل مناسبة (على سبيل المثال؛ اختيار وسائل توليد إشارة غير قادرة على توفير إشارات بواسطة التهجين فقط بدون شطر أو اختيار ظروف تسمح بشطر معظم المركبات قليلة النيوكليوتيد للكشف).
0 .قد تعمل وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة (على سبيل المثال؛ إشارة لاسلكية جزيئية) على توفير إشارة من خلال الشطر بواسطة 5'— نيوكلياز بالاعتماد على ظروف التفاعل. ويمكن اعتبار أن وسائل توليد الإشارة قادرة على توفير الإشارة عن ball Goh طالما يتم استخدامها لتوليد إشارة عن طريق الشطر. وفقاً لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة
5 الكشف العالية نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد «dS ووسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوجة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد كشف؛ ووسائل توليد
0 الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً تولد إشارة بواسطة مزدوجة تم تشكيلها بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ تشتمل اثنين من وسائل توليد الإشارة على واسم مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بواسطة نوع واحد من الكواشف.
بعد تحضين (dol) العينة مع اثنين من وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة؛ يتم الكشف عن الإشارة التي تم توليدها باستخدام نوع واحد من الكواشف. يتم إجراء الكشف عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية خطوة (ب): تحليل الانصهار بعد ذلك» يتم إجراء تحليل الانصهار للتحضين الناتج من خطوة (أ) خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يصف الوصف الحالي إجراء الخطوة (ب) بعد الكشف في الخطوة (أ) فقط لدواعي الملائمة في الوصف. وبالنظر إلى المبداً الذي يقوم عليه الاختراع» يجب فهم أنه يمكن sha) الخطوة (ب) قبل 0 الكشف في الخطوة (أ). وبالتالي؛ فإن العملية التي تشتمل على الخطوة (ب) قبل الكشف في الخطوة (أ) يشملها أيضاً نطاق الاختراع الحالي. قد يتم إجراء الخطوة (ب) بواسطة عمليات تحليل انصهار مختلفة معروفة لأحد الخبراء في المجال. ويقصد من المصطلح 'تحليل الانصهار" المستخدم هنا أن يشمل ليس فقط تحليل الانصهار بالمعنى الضيق ولكن أيضاً تحليل تهجين؛ مالم يذكر خلاف ذلك. يشير تحليل 5 الانصهار بالمعنى الضيق إلى طريقة يتم فيها قياس SSE المزدوجات في ظل زيادة ظروف الشدة عن طريق ضبط درجات الحرارة. يشير تحليل التهجين بالمعنى الضيق إلى طريقة يتم فيها قياس ارتباط المزدوجات في ظل انخفاض ظروف الشدة عن طريق ضبط درجات الحرارة. ويقصد من المصطلح aid الانصهار” أو 'منحنى قمة الانصهار” المستخدم هنا أن يشمل ليس فقط منحنى انصهار أو منحنى قمة انصهار من تحليل انصهار بالمعنى الضيق ولكن أيضاً منحنى تهجين أو منحنى قمة تهجين من تحليل تهجين؛ مالم يذكر خلاف ذلك. قد يتم الحصول على منحنى الانصهار أو منحنى التهجين بواسطة تقنيات تقليدية؛ على سبيل المثال؛ كما هو موصوف في U.S.
Pat Nos. 6,174,670 and 5,789,167, Drobyshev et al, Gene 188: Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); ;)45(1997 Livehits et al J.
Biomol.
Structure Dynam. 11:783(1994); and Howell et al
— 8 8 — Nature Biotechnology 17:87(1999) على سبيل المثال؛ قد يتألف منحنى الانصهار أو منحنى التهجين من رسم أو عرض بياني لتباين إشارة الخروج مع معامل شدة التهجين. قد يتم رسم إشارة الخروج مباشرة مقابل معامل التهجين. Bale سيكون لمنحنى الانصهار أو منحنى التهجين إشارة خروج؛ على سبيل المثال تألق؛ مما يشير إلى درجة تركيب المزدوجة (أي مدى التهجين)؛ مرسوم على المحور- ص ومعامل التهجين على المحور س.
سيتم وصف تحليل منحنى الانصهار (التهجين) وتحليل قمة الانصهار (التهجين) بالإشارة إلى الوصف في البراءة الامريكية رقم 8,039,215. يستخدم تحليل الانصهار قيم “تي ام”. يشير المصطلح المستخدم هنا “تي ام” إلى درجة حرارة انصهار يتم عندها فصل نصف سكان جزيئات الحمض النووي مزدوجة الشريط عن الجزيئات
0 أحادية الشربط. يتم تحديد dad تى ام بواسطة الطول ومحتوىق جي/سي G/C للنيوكليوتيدات المهجنة. قد يتم حساب قيمة تي ام بواسطة طرق تقليدية مثل قاعدة والاس ( R.B.
Wallace, et (al., Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979) وطريقة الجار القريب Santalucia J.
Jr., et al., Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto ) .(N., et al., Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996)
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم chal الخطوة (ب) عن طريق الكشف عن الإشارات التى تم توليدها بواسطة sab درجات الحرارة (تحليل الانصهار بالمعنى الضيق). على نحو بديل؛ يتم shal الخطوة (ب) عن طريق الكشف عن الإشارات التى تم توليدها بواسطة تقليل درجات الحرارة (تحليل التهجين بالمعنى الضيق) : وفقاً لأحد التجسيمات؛ تتضمن وسائل توليد الإشارة المستخدمة لتحليل الانصهار أي وسائل توليد
0 شارة من تشكيل مزدوجة خلال مدى من درجات الحرارة. من بين وسائل توليد الإشارة لطرق الكشف في الزمن الحقيقي؛ يتم أيضاً استخدام الوسائل Al تولد الإشارة عن طريق تهجين قليل نيوكليوتيد كشف بدلاً من تفاعل الشطر لتحليل الانصهار. Tay لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (ب) باستخدام وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة. على day الخصوص» يتم إجراء الخطوة (ب) باستخدام وسائل توليد
إشارة لإشارة متولدة بواسطة مزدوجة تم تشكيلها بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط
مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف.
قد يتم توليد الإشارة بواسطة المزدوجة المشكلة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد التوسط
بواسطة طرق مختلفة» تتضمن طريقة انصهار - بتوسي (البراءة الدولية 096523/2012(¢ طريقة انصهار - بي سي اي - اس اتش (البراءة الدولية 15442/2013) وطريقة انصهار - بي سي اي
- ان اتش (بي سي تي/ كيه ار/ 012312/2013). طريقة انصهار - بتوسي ؛ طريقة انصهار -
بي سي اي - اس اتش وطريقة انصهار - بي سي اي - ان اتش تتوافق مع طريقة تعتمد على -
بتوسي مع تحليل الانصهار؛ طريقة انصهار- بي سي اي - اس اتش مع تحليل الانصهار
وطريقة انصهار- بي سي اي - ان اتش مع تحليل الانصهار؛ على التوالي. من بين الطرق التي
0 تعتمد على- بتوسي ؛ يتم استخدام طرق لا تولد أي إشارة عن طريق الشطر لتحليل الانصهار في الخطوة (ب). يتم أيضاً وصف طريقة انصهار - بتوسي ؛ طريقة انصهار - بي سي اي - اس اتش وطريقة انصهار - بي سي اي - ان اتش في وثائق البراءة السابقة. تشتمل الخطوات (أ)-(ب) التي أجريت بواسطة طريقة انصهار - بتوسي على الخطوات التالية:
5 () تهجين تتابع الحمض النووي المستهدف مع قليل النيوكليوتيد الأولي و بي تي او ؛ (ب) اتصال الناتج من خطوة (أ) بإنزيم له نشاط نيوكلياز 5“ في ظل ظروف لشطر بي تي او ؛ حيث يحث قليل النيوكليوتيد الأولي أو الشريط الممتد له على شطر بي تي او بواسطة الإنزيم الذي له نشاط نيوكلياز 5“ بحيث يطلق الشطر قطعة تشتمل على جزء Sarg أو a من جزء التوسيم-5' ل بي تي او ؛ (ج) تهجين القطعة التي تم إطلاقها من بي تي او مع سي تي او؛
0 حيث يتم تهجين القطعة التي تم إطلاقها من بي تي او مع جزءٍ الالتقاط ل سي تي او؛ (د) shal تفاعل امتداد باستخدام الناتج من خطوة (ج) وبوليميراز حمض نووي يعتمد على قالب؛ حيث يتم تمديد القطعة المهجنة مع gia الالتقاط ل سي تي او ويتم تشكيل المزدوجة الممتدة؛ حيث يكون للمزدوجة الممتدة قيمة تي ام يمكن ضبطها بواسطة (1) تتابع و/أو طول القطعة؛ (2) تتابع و/أو طول سي تي او أو (3) تتابع و/أو طول القطعة وتتابع و/أو طول سي تي او؛ (ه) انصهار
— 0 9 — المزدوجة الممتدة خلال مدى من درجات الحرارة لتعطى إشارة مستهدفة تشير إلى وجود المزدوجة الممتدة؛ حيث يتم توفير الإشارة المستهدفة بواسطة (1) واسم واحد على الأقل مرتبط بالقطعة و/أو سي تي او )2( واسم مدمج في المزدوجة الممتدة أثناء alate Je la ¢ )3( واسم مدمج في المزدوج الممتد أثناء تفاعل الامتداد وواسم مرتبط بالقطعة و/أو سي تي col أو )4( واسم إقحام؛ وز(و) الكشف عن المزدوجة الممتدة عن طريق قياس الإشارة المستهدفة؛ حيث يشير وجود
المزدوجة الممتدة إلى وجود تتابع الحمض النووي المستهدف. في هذه الحالة؛ تشتمل طريقة انصهار بتوسي أيضاً على تكرار كل أو بعض الخطوات (أ)-(و) مع حدوث تمسخ بين دورات التكرار. في الخطوة (أ) من طريقة انصهار- بتوسي ؛ قد يتم استخدام مجموعة تمهيدية لتضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف بدلاً من قليل النيوكليوتيد الأولي. في
0 هذه الحالة؛ تشتمل الطريقة Lad على تكرار كل أو بعض الخطوات (أ)-(و) مع حدوث تمسخ بين دورات التكرار. dass الخطوات (أ)-(ب) وفقاً للإختراع Mall والتي أجريت بواسطة طرق الانصهار التي تعتمد على- بتوسى على الخطوات التالية: (أ) تهجين تتابع الحمض النووي المستهدف مع قليل النيوكليوتيد الأولي و بي تي او ؛ (ب)
5 اتصال الناتج من الخطوة (أ) بإنزيم له نشاط نيوكلياز 5“ في ظل ظروف شطر بي تي او ؛ حيث يحث قليل النيوكليوتيد الأولي أو الشربط الممتد له على شطر بي تي او بواسطة الإنزيم الذي له نشاط نيوكلياز 5“ بحيث يطلق الشطر قطعة تشتمل على ein توسيم-5' أو جزءِ من جزءٍ توسيم.- 5 بي تي او ؛ (ج) تهجين القطعة المطلقة من بي تي او مع سي تي او؛ حيث يتم تهجين القطعة المطلقة من بي تي او مع gia الالتقاط ل سي تي او؛ (د) إجراء تفاعل امتداد باستخدام
0 الناتج من خطوة (ج) وبوليميراز حمض نووي يعتمد على قالب؛ حيث يتم تمديد القطعة المهجنة مع جزءٍ الالتقاط ل سي تي او لتشكيل شربط ممتد؛ و(ه) إجراء تحليل انصهار خلال مدى من درجات الحرارة عن طريق الكشف عن الإشارة التي تم توليدها بالاعتماد على وجود الشربط الممتد. خطوة (ج): تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة
— 9 1 —
أخيراً؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً باستخدام الإشارة التي تم الكشف عنها في خطوة (أ) ويتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام نتيجة تحليل الانتصهار في خطوة (ب).
وفقاً لأحد تجسيمات هذا الاختراع» تشتمل تتابعات الحمض النووي المستهدفة على تغير نيوكليوتيد (على dag الخصوص اس ان بي) . قد تنتج النتائج غير المتوقعة للاختراع الحالي عندما يتم اتحاد وسائل توليد إشارة لتوليد الإشارة عن طريق الشطر للكشف في الزمن الحقيقي مع وسائل توليد إشارة لتوليد الإشارة بواسطة مزدوجة تم تشكيلها بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن مع تتابع الحمض النووي المستهدف
0 -لتحليل الانصهار. فى هذه (lal) يجب استبعاد وسائل توليد الإشارة التى تشمل تشكيل مزدوجة وتوليد الإشارة مباشرةً عن طريق الشطر لتحليل الانصهار. ومن الجدير بالذكر أنه يتم إجراء الاختراع الحالي في توليفة مع وسائل توليد الإشارة لتوليد الإشارة عن طريق الشطر (على سبيل المثال طريقة تاكمان) كعملية في الزمن الحقيقي وطريقة الانصهار التي تعتمد على- بتوسي كتحليل انصهار؛ مما يوفر النتائج الأبرز.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل استخدام الإشارة التي تم الكشف عنها في خطوة (أ) على الحصول على قيمة مؤهلة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تشتمل تتابعات الحمض النووي المستهدفة على تغير نيوكليوتيد (على dag الخصوص اس ان بي) .
0 5- الكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدم درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل الانصهار
Lady في جانب AT للاختراع؛ يتم توفير طريقة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في die باستخدام تحليل درجة حرارة الكشف وتحليل الانصهار؛ تشتمل على: () تحضين العينة مع ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن إشارة متولدة باستخدام
نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن كل من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة كشف مختلفة تحددها وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث درجة حرارة الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع حمض نووي
0 مستهدف له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف Jel من درجة حرارة الكشف؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف وبتم إجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف لبعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة
5 المذكورة وواحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجات حرارة الكشف؛ (ب) shal تحليل انصهار لناتج التحضين من خطوة (أ) خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة؛ و (ج) تحديد (1) وجود بعض من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة من خلال الإشارة
0 التي تم اكتشافها في خطوة (أ)؛ حيث عندما يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة من بين بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة؛ فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة عن طريق الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة
5 الكشف المعينة؛ حيث عندمام تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى
— 3 9 — نسبياً من بين درجات حرارة (CRASH فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف بواسطة الإشارة التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(2) يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة من خلال نتيجة تحليل الانصهار في الخطوة (ب). وحيث يتبع الاختراع الحالي من حيث المبداًء الجانب الأول إلى الجانب الرابع للاختراع الموصوفين سابقاً؛ يتم حذف الوصف المشترك بينهم وذلك لتجنب التكرار غير الضروري الذي يؤدي إلى تعقيد هذا الوصف. خطوة (أ): التحضين مع وسائل توليد الإشارة والكشف عن الإشارة (Yl يتم تحضين العينة المطلوب تحليلها مع ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة للكشف عن 0 ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل ثم يتم الكشف عن إشارة متولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف. أحد تتابعات الحمض النووي المستهدفة له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً. يتم استخدام وسائل ad إشارة قادرة على توفير إشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً للكشف عن تتابع الحمض 5 النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً. في الاختراع الحالي؛ يتم RASH عن بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة عن طريق تحليل درجة حرارة الكشف وبتم الكشف عن الأخرى بواسطة تحليل الانصهار. يتضمن المصطلح "بعض” في التعبير 'بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي 0 المستهدفة" واحد أو أكثر. يشير المصطلح المستخدم هنا dala درجة حرارة الكشف" إلى طريقة الكشف في الزمن الحقيقي التي تشتمل على الكشف عند درجات حرارة مختلفة للكشف عن تتابع حمض نووي مستهدف؛ مالم يذكر خلاف ذلك.
— 4 9 — قد تولد وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف المطلوب تحليله بواسطة تحليل الانصهار أو قد لا تولد الإشارة تبعاً لظروف التفاعل في الخطوة (أ). وحيث قد يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف المطلوب تحليله بواسطة تحليل الانصهار والكشف عنها في الخطوة (ب)؛ لا يكون من اللازم توليد الإشارة في الخطوة (أ). يجب أن يستخدم كل من ثلاثة على JAY) من تتابعات الحمض النووي المستهدفة وسائل توليد
إشارة لها درجة حرارة كشف مختلفة عن بعضها البعض. وفقاً لأحد التجسيمات؛ لأن وسائل توليد ١ لإشارة لتحليل الانصهار تستخدم تهجين وتمسخ مزدوجة فإنها قد تولد إشارة تبعاً لظروف التفاعل في الخطوة (أ). وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) فى ظل ظروف مناسبة في توليد إشارة واحدة على
0 الأقل لتتابع الحمض النووي المستهدف المطلوب تحليله بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم اختيار تتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب تحليلها بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف باعتبار درجات حرارة الكشف. على dag الخصوص» يتم أولاً اختيار تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف الأعلى ثم يتم اختيار بعض التتابعات بترتيب درجة حرارة الكشف.
5 وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة مصاحبة لتضخيم حمض نووي. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (أ) في عملية تضخيم إشارة بدون تضخيم حمض نووي. Uy لأحد التجسيمات؛ واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة.
0 وفقاً لأحد التجسيمات؛ وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوجة.
— 5 9 — وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق تشكيل مزدوجة بين تتابع حمض نووي مستهدف وقليل نيوكليوتيد كشف مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. Tig لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة بواسطة مزدوجة تم تشكيلها بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل مزدوجة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ واحدة على الأقل من وسائل توليد الإشارة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد كشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن 0 طريق تهجين قليل نيوكليوتيد الكشف مع تتابع حمض نووي مستهدف وشطر قليل نيوكليوتيد الكشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم توليد الإشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد الكشف بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم استخدام توليد الإشارة بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد الكشف 5 فقط لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً من بين ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد كشف؛ ووسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد إشارة عن طريق تشكيل 0 مزدوجة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع؛ وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر قليل نيوكليوتيد كشف؛ ووسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى تولد إشارات عن طريق تشكيل مزدوجة
— 6 9 — بطريقة تعتمد على شطر قليل نيوكليوتيد توسط مهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي المستهدف. على سبيل المثال؛ يتم توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail الأعلى نسبياً بواسطة طريقة تاكمان وبتم توليد الإشارات لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى بواسطة طريقة بتوسي © طريقة بي سي اي - اس اتش أو طريقة بي سي اي - ان اتش.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تشتمل ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة على واسم مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بواسطة نوع واحد من الكواشف. عدد تتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة الاختراع الحالي غير محدود؛ ويتضمن أكثر من 43 5 987TH و0 1 تتابعات حمض نووي مستهدفة في
0 الوعاء أحادي التفاعل. بعد تحضين (تفاعل) العينة مع ثلاثة على الأقل من وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة؛ يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم الكشف عن بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف وبتم إجراء الكشف عند كل من درجات حرارة الكشف لبعض من ثلاثة على الأقل من
5 تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة وواحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجات حرارة الكشف. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم الكشف عن الإشارات عند جميع درجات حرارة الكشف المطلوية لإجراء تحليل درجة حرارة الكشف. يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف. كل من ثلاثة على الأقل من
0 تتابعات الحمض النووي المستهدفة له درجة حرارة كشف مختلفة تحددها وسائل توليد الإشارة المقابلة. درجة Bla الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف.
— 7 9 — وفقاً لأحد التجسيمات؛ يكون لتتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف درجات حرارة كشف lef من تلك التي يتم الكشف عنها بواسطة تحليل الانصهار. خطوة (ب): تحليل الانصهار يتم إجراء تحليل الانصهار لناتج التحضين من خطوة (أ) خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة. يصف الوصف الحالى إجراء الخطوة (ب) بعد الكشف في الخطوة (أ) فقط للتوافق في الوصف. بالنظر إلى المبداً الذي يقوم عليه الاختراع الحالي؛ يكون مفهوماً أنه قد يتم إجراء الخطوة (ب) قبل 0 الكشف في الخطوة (أ). وبالتالى؛ فإن العملية التى تشتمل على الخطوة (ب) قبل الكشف في الخطوة (أ) يشملها أيضاً نطاق الاختراع الحالي. Tay لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (ب) باستخدام وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تشكيل مزدوجة . على dag الخصوص 4 يتم إجراء الخطوة )= وفقاً لطريقة ا لانتصهار التي تعتمد على بتوسي. 5 خطوة (ج): تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة أخيراً؛ يتم تحديد وجود ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في العينة باستخدام الإشارة في الخطوة (أ) ونتيجة تحليل الانصهار في الخطوة (ب). يتم تحديد وجود بعض تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام الإشارة التي تم الكشف عنها فى خطوة )0( . عندما يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة بين 0 بعض من ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة المذكورة؛ فإنه يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة باستخدام الفرق بين الإشارة التى تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. عندما تكون درجة حرارة
الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً بين درجات حرارة الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف باستخدام الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ Ta لأحد التجسيمات؛ تستخدم الطريقة أيضاً قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي
المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة؛ تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين جميع التوليفات من تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة مع وسائل توليد إشارة في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)» (2) الكشف عن الإشارات ليس فقط عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة ولكن أيضاً درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول على فرق
0 بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو AST من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. على نحو بديل» تستخدم الطريقة أيضاً قيمة مرجعية لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة؛ تم الحصول عليها عن طريق (1) تحضين جميع توليفات تتابعات الحمض النووي المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف
5 المعينة مع وسائل توليد إشارة في AT deli clog غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف الأعلى Bile من درجة حرارة الكشف المعينة ودرجة حرارة الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف الأعلى مباشرةً من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.
0 وفققاً لأحد التجسيمات» حيث يكون الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة الكشف لتتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة تحليل الانصهار مطلوياً للحصول على الفرق بين الإشارات أو القيم المرجعية لتتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف؛ قد يتم تجميع الإشارات عند درجات حرارة الكشف لتتابعات الحمض النووي المستهدفة المطلوب الكشف عنها بواسطة تحليل الانصهار واستخدامها.
— 9 9 —
يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير بعض من ثلاثة على الأقل من
تتابعات الحمض النووي المستهدفة التى يتم تحديدها بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف بواسطة
نتيجة تحليل الانصهار في الخطوة (ب).
وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم إجراء الخطوة (د) عن طريق تحديد أولاً وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً ثم بالتتابع تحديد وجود تتابعات الحمض
النووي المستهدفة التى لها درجات حرارة الكشف الأقل نسبياً بترتيب تنازلى.
وفقاً لأحد التجسيمات؛ قد يتم استخدام تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف بواسطة تحليل
J لانصهار في تحديد وجود تتابع aan نووي مستهدف بواسطة تحليل درجة حرارة الكشضف (على
سبيل المثال؛ لاختيار القيم المرجعية).
0 حيث يتم الكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بطريقة الزمن الحقيقي؛ يتم استخدام توليد إشارة عن طريق الشطر فقط لتتابع حمض نووي مستهدف واحد. وبالنسبة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى؛ قد يتم استخدام الطرق القائمة على- بتوسي لتحسين كفاءة واستعداد التحليل. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع» تشتمل تتابعات الحمض النووي المستهدفة على تغير نيوكليوتيد
5 1 (على dag الخصوص اس ان بي) .
6- أدوات للكشف عن تتابعات الحمض النووي المستهدفة باستخدام العديد من درجات حرارة الك +
في جانب آخر لهذا الاختراع؛ يتم توفير أداة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على:
0 () اثنين من وسائل توليد الإشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ Cua يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لأحد الاثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً تم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث
درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات المطلوب توليدها بواسطة اثنين من وسائل توليد
الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و (ب) تعليمات تصف الطريقة الحالية للجانب | بعنوان الكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة.
0 وايزال في جانب AT للاختراع؛ يتم توفير أداة للتنميط الجيني اس ان بي لتتابع حمض نووي في die باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) وسائل توليد إشارة للكشف عن ألائل اس ان بي؛ حيث يتم الكشف عن كل من IT اس ان بي بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث يكون لأحد IVT اس ان بي درجة حرارة RES عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد
5 الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة حرارة قادرة على توليد إشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد
0 .من الكواشف؛ Cus يتم اجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و (ب) تعليمات Ally تصف الطريقة الحالية للجانب اا المعنون بالتنميط الجيني اس ان بي باستخدام درجات حرارة كشف Adds
في جانب AT لهذا الاختراع؛ يتم توفير أداة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي على الأقل في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) ثلاث وسائل توليد إشارة على الأقل للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على
الأقل درجة حرارة كشف مختلفة يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة الحرارة القادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف؛ Cus لا يتم التمييز بين الإشارات المتولدة
0 بواسطة وساتل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ Cus يتم اجراء الكشف عند كل من درجات حرارة الكشف المختلفة؛ و (ب) تعليمات والتي تصف الطريقة الحالية لجانب !لا المعنون الكشف عن تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل في due باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة. في جانب آخر بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير أداة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي
5 المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل انصهار؛ تشتمل على: (أ) وسيلتي توليد إشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة؛ حيث يتم CRASH عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لأحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف
0 العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة Shall القادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع واحد
من الكواشف؛ حيث يتم اجراء الكشف عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وسائل توليد إشارة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد كشف؛ وتكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد إشارة بواسطة
تكوين مزدوج؛ و (ب) تعليمات والتي تصف الطريقة الحالية للجانب ا المعنون الكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل انصهار. في جانب آخر لهذا الاختراع؛ يتم توفير أداة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفين على الأقل في عينة باستخدام تحليل درجة حرارة كشف وتحليل انصهار؛ تشتمل على:
0 () ثلاث وسائل توليد إشارة على الأقل للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل درجة حرارة كشف مختلفة يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة الحرارة القادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع الحمض النووي
5 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة el RIS من درجة حرارة الكشف؛ حيث لا يتم التمييز بين الإشارات المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم الكشف عن بعض من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف وبتم اجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف للبعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة
0 الثلاثة على الأقل ودرجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجات حرارة الكشف؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف»؛ وتكون وسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد إشارة بواسطة تكوين مزدوج؛ و
(ب) تعليمات والتي تصف الطريقة الحالية لجانب المعنون الكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل انصهار. وحيث يتم تحضير أدوات هذا الاختراع لاجراء الطرق الحالية؛ يتم حذف الأوصاف المشتركة فيما بينها لتجنب التكرار غير المبرر مما يؤدي إلى تعقيد هذا الوصف.
قد تتضمن جميع الأدوات الحالية الموصوفة هنا سابقاً اختيارياً الكواشف المطلوية لأداء تفاعلات بي سي ار لتضخيم الهدف (على سبيل المثال؛ تفاعلات بي سي ار) مثل منظمات»؛ عوامل مساعدة لبوليمراز الحمض النووي دي ان ايه ؛ ومركبات دي أوكسي رببونيوكليوتيد-5- تراي فوسفات. اختيارياً؛ قد تتضمن الأدوات جزيئات بولي نيوكليوتيد مختلفة؛ ترانسكريبتاز عكسي؛ منظمات مختلفة وكواشف؛ وأجسام مضادة والتي تثبط نشاط بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه.
0 قد تتضمن الأدوات Load كواشف ضرورية لأداء تفاعلات الضابط الإيجابي والسلبي. يمكن تحديد الكميات المُثلى من الكواشف المستخدمة في تفاعل معين بسهولة من قبل الشخص الخبير في المجال المنتفع من الكشف الحالي. قد توجد مكونات الأداة في حاويات منفصلة؛ أو قد توجد مكونات عديدة في حاوية واحدة. يمكن تسجيل التعليمات لوصف أو ممارسة طرق الاختراع الحالي على وسط تسجيل مناسب. على
سيل المثال؛ يمكن طباعة التعليمات على ركيزة؛ Jie ورقة أو بلاستيك. في تجسيمات أخرى؛ قد توجد التعليمات كملف بيانات تخزين الكتروني يوجد على وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر مناسب مثل CD-ROM وقرص مرن. في تجسيمات أخرى بعد؛ قد لا توجد التعليمات الفعلية في الأداة؛ ولكن وسائل للحصول على التعليمات من مصدر بعيد؛ على سبيل المثال؛ يتم توفيرها عبر الإنترنت. مثال لهذا التجسيم هو lg al تتضمن عنوان ويب حيث يمكن رؤية التعليمات و/أو
0 الذي يمكن تحميل التعليمات منه.
7- وسط تخزين وجهاز للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة
وحيث يهدف وسط التخزين؛ الجهاز وبرنامج الكمبيوتر للاختراع الحالي الموصوف هنا أدناه إلى أداء الطرق الحالية في كمبيوتر؛ يتم حذف الأوصاف المشتركة بينها لتجنب التكرار غير المبرر والذي يؤدي إلى تعقيد هذا الوصف. في جانب AT لهذا الاختراع؛ يتم توفير وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لأداء طريقة لتحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي كل من إشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً وإشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع 0 واحد من الكواشف؛ حيث يكون لأحد تتابعي الحمض النووي المستهدفة درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة الكشف المنخفضة النسبياً المحددة من قبل وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة Sha الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي 5 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ و (ب) تحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين بواسطة الإشارة المتلقاة؛ حيث (1) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ و(2) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 0 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد التجسيمات؛ حيث يوجد تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياًء يتم استخدام القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة
الكشف العالية نسبياً لتحديد النسبة المئوية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم تخزين القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر على تعليمات لإدخال القيمة
المرجعية في تنفيذ الطريقة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر كذلك على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للحصول على القيمة المرجعية. في جانب آخر لهذا الاختراع؛ يتم توفير برنامج كمبيوتر للتخزين على وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر لتكوين معالج لأداء طريقة لتحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين في عينة؛
0 تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي كل من إشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً وإشارة يتم الكشف عند درجة حرارة منخفضة نسبياً؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يكون لأحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين درجة حرارة الكشف العالية نسبياً
5 وللأخرى درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له
0 درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ و (ب) تحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين بواسطة الإشارة المتلقاة؛ حيث (1) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم
الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة 2.58 أل روغ واج نسبياً. في جانب آخر بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير برنامج كمبيوتر مخزن على وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر لتكوين معالج لتنفيذ طريقة موصوفة سابقاً للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض
النووي المستهدفة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي برنامج الكمبيوتر على القيمة المرجعية لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالى؛ يحتوي برنامج الكمبيوتر على تعليمات لإدخال القيمة المرجعية في تنفيذ الطريقة. وفقاً لأحد تجسيمات ١ لاختراع الحالى ؛» يحتوي برنامج الكمبيوتر كذلك على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة
0 للحصول على القيمة المرجعية. تعليمات البرنامج تكون فعالة؛ عند تنفيذها بواسطة المعالج؛ لجعل المعالج يقوم بتنفيذ الطريقة الحالية الموصوفة سابقاً. قد تشتمل تعليمات البرنامج على تعليمات لتلقي الإشارة الأولى والإشارة الثانية؛ وتعليمات لتحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين باستخدام الإشارات المتلقاة. يتم تنفيذ الطريقة الحالية الموصوفة سابقاً في معالج؛ مثل معالج في كمبيوتر قائم بذاته؛ كمبيوتر
5 متصل بشبكة أو جهاز جمع بيانات مثل آلة بي سي ار في الزمن الحقيقي. تتضمن أنواع وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر وسط تخزين مختلف all Jia المضغوط و أقراص الفيديو الرقمية وذاكرة فلاش» أقراص مرنة؛ أقراص صلبة؛ أقراص صلبة محمولة؛ يو اس بي days USB مغناطيسى القرص المتوسط بطاقة ذاكرة غير طيارة أقراص بصرية؛ وسط تخزين بصري»؛ الذاكرة العشوائية؛ ذاكرة للقراءة Jagd ¢ ذاكرة نظام وخادم ولب.
0 يمكن تلقي البيانات (على سبيل المثال» الشدة؛ رقم دورة التضخيم ودرجة حرارة الكشف) المرتبطة بالإشارات من خلال آليات عديدة. على سبيل المثال؛ يمكن جمع البيانات بواسطة معالج مستقر في جهاز جمع بيانات بي سي ار. يمكن تزويد البيانات للمعالج في الزمن الحقيقي حيث يتم التحكم بالبيانات» أو يمكن تخزينها في وحدة ذاكرة أو مخزن مؤقت وتزويدها للمعالج بعد انتهاء
خلال اتصال شبكة le) سبيل (Jha) الشبكة الداخلية؛ الشبكة المحلية ؛ إنترانت وإنترنت) أو اتصال مباشر (على سبيل «Ba يو اس بي أو اتصال مباشر (Sha AT أو لا سلكي) لجهاز الجمع؛ أو يتم توفيرها على وسط محمول Jie القرص المضغوط ؛ أقراص الفيديو الرقمية ؛ قرص ce قرص صلب محمول أو ما شابه ذلك لنظام كمبيوتر قائم بذاته. وبالمثل؛ يمكن توفير مجموعة البيانات لنظام خادم من خلال اتصال شبكة Jo) سبيل المثال؛ الشبكة الداخلية؛ الشبكة
المحلية؛ إنترانت وإنترنت) أو اتصال مباشر (على سبيل المثال» يو اس بي أو اتصال مباشر آخر سلكي أو لا سلكي) لجهاز rend) أو توفيرها على وسط محمول Jie القرص المضغوط ؛ أقراص الفيديو الرقمية قرص مرن؛ محمول أو ما شابه ذلك لنظام كمبيوتر قائم بذاته. cially يمكن توفير de gens البيانات إلى نظام خادم عبر اتصال شبكة Jo) سبيل المثال؛ الشبكة الداخلية؛ الشبكة
0 المحلية ؛ إنترانت؛ إنترنت وشبكة اتصال لاسلكي) إلى عميل Jie شبكة أو نظام كمبيوتر مكتبي. بعد تلقي أو جمع البيانات؛ ويتم مواصلة عملية تحليل البيانات لإعطاء إشارة معالجة تنتج من الفرق بين الإشارات لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة عندما يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يعالج المعالج البيانات المتلقاة المرتبطة بالإشارات لإعطاء الإشارة dalled) التي تعكس الفرق بين الإشارات في درجتي حرارة الكشف. على سبيل (Ja
5 يعالج المعالج البيانات المتلقاة للحصول على نسبة الإشارة المتلقاة عند درجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً إلى الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. يمكن تضمين التعليمات لتكوين المعالج لتنفيذ الاختراع الحالي في نظام منطقي. يمكن تحميل التعليمات وتخزينها في وحدة ذاكرة (على سبيل المثال» قرص صلب أو ذاكرة أخرى Jie الذاكرة العشوائية أو ذاكرة للقراءة فقط محلي أو مرفق)؛ على الرغم من أنه يمكن توفير التعليمات على أي
0 وسط تخزين برنامج مثل اتس دي دي HDD محمول؛ يو اس بي؛ قرص مرن؛ القرص المضغوط و أقراص الفيديو الرقمية. يمكن تنفيذ كود الكمبيوتر لتنفيذ الاختراع الحالي في مجموعة متنوعة من لغات الترميز مثل سي ©؛ سي بلس بلس Cott جافاء فيجوال بيسك؛ فبسكريبت VBScript جافاسكريبت؛ بيرل XML بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن استخدام مجموعة متنوعة من اللغات والبروتوكولات في تخزين خارجي وداخلي ونقل البيانات والأوامر وفقاً للاختراع الحالي.
في جانب AT بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير جهاز للكشف عن تتابع حمض نووي مستهدف في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ يشتمل على (أ) معالج كمبيوتر و(ب) وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر الموصوف سابقاً مقترن بمعالج الكمبيوتر. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل الجهاز كذلك على وعاء تفاعل لاستيعاب العينة ووسائل توليد إشارة؛ وسائل للتحكم في درجة الحرارة للتحكم في درجات حرارة وعاء التفاعل و/أو كاشف أحادي النوع للكشف عن الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يسمح معالج الكمبيوتر ليس فقط بالكشف عن نوع الكاشف الواحد للكشف عن الإشارات المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً ودرجة حرارة كشف منخفضة نسبياً ولكن أيضاً بحساب الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة 0 الكشف العالية Lows والإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. يمكن تحضير المعالج بهذه الطريقة حيث يمكن لمعالج واحد القيام باثنين من الإنجازات: توجيه الكشف عن اثنين من درجات حرارة الكشف وحساب الفرق. على نحو ha يمكن تحضير وحدة المعالجة بهذه الطريقة بحيث يقوم المعالجين بأداء الإنجازين؛ على التوالى. تحمل الميزة الأساسية الأولى للجهاز المعالج للسماح للجهاز بالكشف عن الإشارات التي يتم 5 توليدها عند درجتي حرارة الكشف. وفقاً لأحدالتجسيمات؛ حيث يتم توليد الإشارة مع تضخيم تتابع الحمض النووي المستهدف؛ يشتمل الجهاز على معالج للسماح للجهاز بالكشف عن الإشارات التي يتم توليدها عند درجتي حرارة الكشف عند كل دورة تضخيم. الميزة الأساسية الثانية للجهاز هي لحمل المعالج لمعالجة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجتي حرارة الكشف للحصول على الفرق بين الإشارات. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يتم التعبير عن 0 الفرق بين الإشارات بقيم رقمية بواسطة معالجة حسابية. وفقاً لأحد التجسيمات؛ يمكن تضمين المعالج من خلال تثبيت برامج في الأجهزة التقليدية للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة lo) سبيل المثال جهاز بي سي ار في الزمن الحقيقي). ووفقاً لأحد التجسيمات؛ يشتمل الجهاز على معالج للسماح للجهاز بالكشف عن إشارات عند درجتي حرارة كشف على الأقل والمعالجة الحسابية عند نتيجتي كشف على الأقل.
في جانب AT بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لأداء طريقة لتحديد وجود ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في de باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي الإشارات التي يتم الكشف عنها في ثلاث درجات حرارة كشف على الأقل؛ حيث يتم
الكشف عن كل من ثلاث تتابعات الحمض النووي المستهدفة على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل درجة حرارة كشف مختلفة يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى
0 من درجة حرارة الكشف؛ Cus لا يتم تمييز الإشارات المتولدة بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم اجراء الكشف عند كل من درجات حرارة الكشف المختلفة؛ و (ب) تحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة الإشارة المتلقاة؛ حيث يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة كشف معينة من بين تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي
5 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي يتم RIS عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ Cua عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي أعلى درجة RIS Bla نسبياً من بين درجات حرارة الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.
0 وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم تخزين القيم المرجعية في وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر على تعليمات لإدخال القيمة المرجعية في تنفيذ الطريقة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع (gringo Jad) وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر كذلك على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للحصول على القيم المرجعية.
في جانب آخر أيضاً لهذا الاختراع؛ يتم توفير برنامج كمبيوتر مخزن ليتم تخزينه على وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر لتكوين معالج لتنفيذ الطريقة الموصوفة سابقاً للكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة ثلاثة على الأقل في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف. في جانب AT لهذا الاختراع؛ يتم توفير وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للتنميط الجيني اس ان بي لتتابع حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة
مختلفة للكشف؛ تشتمل الطريقة على: (أ) تلقى كل من الإشارة التى يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية Las وإاشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ حيث يتم الكشف عن كل من ألائل اس ان بي بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لأحد ألائل اس ان بي درجة حرارة كشف le
Law 0 وللآخر درجة حرارة كشف منخفضة Lad يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هى درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لأليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛
5 (ب) تحديد النمط Seal اس ان بي بواسطة الفرق بين الإشارات المتلقاة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يتم تخزين القيم المرجعية للزيجوت المتماثل الذي يتألف من أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و/أو الزيجوت المتغاير الذي يتألف من أليل اس ان بى الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً في وسط تخزين gg jhe بالكمبيوتر. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ (ging وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر على تعليمات
0 لإدخال القيمة المرجعية في تنفيذ الطريقة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي وسط التخزين المقروء بالكمبيوتر كذلك على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للحصول على القيم المرجعية.
في جانب آخر Lad لهذا الاختراع؛ يتم توفير برنامج كمبيوتر مخزن ليتم تخزينه على وسط تخزين
مقروء بالكمبيوتر لتكوين معالج لتنفيذ الطريقة الموصوفة سابقاً للتنميط الجيني اس ان بي لتتابع
حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف.
وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي» يحتوي برنامج الكمبيوتر على قيم مرجعية لزيجوت متماثل يتألف من all اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف العالية Las و/أو زيجوت متغاير و/أو
زيجوت متماثل يتألف من أليل اس ان بي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. وفقاً أحد
تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي برنامج الكمبيوتر على تعليمات لإدخال القيمة المرجعية في
تنفيذ الطريقة. وفقاً لأحد تجسيمات الاختراع الحالي؛ يحتوي برنامج الكمبيوتر كذلك على تعليمات
لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للحصول على القيم المرجعية.
0 في جانب AT لهذا الاختراع؛ يتم توفير وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للكشف عن اثنين من تتابعات حمض نووي مستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل انصهار» تشتمل الطريقة على:
(أ) تلقي كل من إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وإشارة من تحليل انصهار خلال مدى درجات
5 حرارة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث يكون لأحد تتابعي الحمض النووي المستهدفين درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويكون للآخر درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة hall القادرة على توليد إشارة لتتابع الحمض النووي
0 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة حرارة قادر على توليد كل من إشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة لتتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث يتم اجراء تحليل الانصهار خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و
(ب) تحديد وجود تتابعي الحمض النووي المستهدفين بواسطة الإشارات المتلقاة؛ حيث يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الإشارة من تحليل الانصهار.
في جانب AT بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير برنامج كمبيوتر مخزن ليتم تخزينه على وسط تخزين og sia بالكمبيوتر لتكوين معالج لتنفيذ الطريقة الموصوفة سابقاً للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل انصهار. في جانب آخر لهذا الاختراع؛ يتم توفير وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام
0 تحليل درجة حرارة RAS وتحليل انصهار» تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي كل من (1) إشارة عند درحة Bla كشف بعض من تتابعات حمض نووي مستهدفة ثلاثة على الأقل ودرجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجات حرارة الكشف لتحديد وجود بعض من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل و(2) إشارة من تحليل انصهار خلال مدى درجات حرارة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير البعض المذكور
5 .من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة مقابلة؛ حيث يكون لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل درجة حرارة كشف مختلفة يتم تحديدها بواسطة وسائل توليد الإشارة المقابلة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة الحرارة القادرة على توليد ليس فقط إشارة لتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة لتتابع
0 حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف؛ حيث يتم الكشف عن البعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف وبتم تنفيذ الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف للبعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل ودرجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجات حرارة الكشف؛ حيث يتم تنفيذ تحليل الانصهار خلال مدى درجات حرارة لتحديد وجود تتابعات
الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير البعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة
aul على الأقل؛ و
(ب) تحديد (1) وجود البعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة الإشارة
المتلقاة؛ حيث عندما يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي المستهدف درجة حرارة كشف معينة من
5 بين البعض المذكور من تتابعات الحمض النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل؛ يتم تحديد وجود
تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الفرق بين الإشارة
التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة
والإشارة المتلقاة عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ حيث عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة
هي أعلى درجة حرارة كشف نسبياً من بين درجات حرارة الشكف؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض 0 النووي المستهدف بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(2)
وجود تتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى غير البعض المذكور من تتابعات الحمض
النووي المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة الإشارة من تحليل الانصهار.
في جانب AT بعد لهذا الاختراع؛ يتم توفير malin كمبيوتر مخزن للتخزين على وسط تخزين
مقروء بالكمبيوتر لتكوين معالج لتنفيذ الطريقة الموصوفة سابقاً للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في due باستخدام تحليل درجة حرارة الكشف وتحليل الانصهار.
وسيتم إيجاز مزايا وفوائد هذا الاختراع كما يلي:
(أ) يتيح الاختراع الحالي الذي يستخدم درجات حرارة مختلفة للكشف الكشف عن مجموعة تتابعات
حمض نووي مستهدفة بطرق زمن حقيقي تقليدية حتى مع نوع واحد من الواسمات في وعاء أحادي
التفاعل. تكشف التقنيات التقليدية عن مجموعة تتابعات الحمض النووي المستهدفة بواسطة تحليل 0 الانصهار بعد تضخيم الهدف. ومن غير المرجح؛ ألا يتطلب الاختراع الحالي تحليل انصهار بعد
تضخيم الهدف؛ بحيث يتم تقليل زمن التحليل بدرجة كبيرة.
(ب) ومن المثير للاهتمام؛ ang المخترعون الحاليون أنه عندما يتم توليد إشارة لتتابع حمض نووي
مستهدف باستخدام وسائل توليد إشارة؛ (1) يصبح الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة معينة قابل
للضبط على أساس نوع وسائل توليد الإشارة؛ و(2) في Ala الكشف عن إشارة عند اثنين من
درجات حرارة الكشف المختارة؛ يتم تغيير الإشارات التي يتم الكشف عنها عند درجتي حرارة الكشف
المختلفة وفقاً لنمط معين. اعتمد المخترعون الحاليون الاستنتاجات للكشف عن تتابعات حمض
نووي مستهدف؛ وبالتالي إنجاز الاختراع الحالي.
(ج) في الاختراع الحالي باستخدام درجات حرارة الكشف المختلفة؛ لكل من تتابعات الحمض النووي المستهدف؛ قد يحث استخدام وسائل توليد الإشارة لتوفير إشارة بواسطة المزدوج المتكون بطريقة
قائمة على شطر أوليجونيوكليوتيد توسط مهجن على dag التحديد بتتابع حمض نووي مستهدف
(على سبيل Jia) طرق تعتمد على بتوسي) النتائج غير المتوقعة. أولاً؛ قد تضبط الطرق
باستخدام أوليجونيوكليوتيد التوسط مثل الطرق المعتمدة على بتوسي بسهولة القيمة تي ام للمزدوج
المتكون لضمان اختيار مناسب لدرجات حرارة الكشف. ثانياً» حيث يتم استخدام طريقة مع توفير
HL) 0 مباشرة من مجس (age بتتابع حمض نووي مستهدف مع استخدام بوليمراز له نشاط 5:- بوليمراز لتضخيم الهدف» من المرجح أن يتم شطر المجس بواسطة نشاط 5”- نيوكلياز والذي قد يؤثر على تفسير الإشارات. لأن الطرق التي تستخدم أوليجونيوكليوتيد التوسط مثل الطرق القائمة على تستخدم بصفة dale شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط بواسطة النشاط 5”- نيوكلياز» لا تتولد هذه المشكلة المرتبطة بتفسير الإشارة الناتجة عادة. Tal في الطرق التي تستخدم أوليجونيوكليوتيد
5 التوسط Jie الطرق القائمة على بتوسي ؛ يمكن تكوين مزدوج له قيمة تي ام معينة لأن المزدوج له als بصرف النظر تتابع الحمض النووي المستهدف. ومن غير المحتمل؛ في الطرق التي تستخدم مجسات للتهجين المباشر مع تتابع حمض نووي مستهدف» OY شريط واحد على الأقل من المزدوج المتكون يشتمل على تتابع مكمل لتتابع الحمض النووي المستهدف؛ قد يتكون مزدوج له قيمة تي ام ليست مقصودة عندما يوجد اختلاف في تتابع الحمض النووي المستهدف.
0 (د) في أحد تجسيمات هذا الاختراع للكشف عن مجموعة تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة بطريقة في الزمن الحقيقي؛ التوليفة من (1) لتتابع الحمض النووي المستهدف؛ وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف (على سبيل (JU) طريقة تاكمان) و(2) لتتابع حمض نووي مستهدف AT قد تحث وسائل توليد الإشارة لتوفير إشارة بواسطة مزدوج متكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد التوسط
المهجن على dag التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف (على سبيل (Jul طرق قائمة على بتوسي) النتائج غير المتوقعة. تستخدم الطريقة التي تستخدم شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف بصفة dele إنزيم له نشاط 5" نيوكلياز (وبالأخص؛ تاك بوليمراز (Taq polymerase لشطر أوليجونيوكليوتيد الكشف. في الطرق التقليدية لتوليد إشارة بواسطة التهجين المباشر لمجسات الكشف (على سبيل (Jaa) طريقة
بياكون الجزيئية؛ طريقة مجس التهجين أو طريقة هايبياكون)؛ مجسات الكشف مرجحة جداً للشطر بواسطة إنزيم له نشاط 5” نيوكلياز (gaily) تاك بوليمراز). قد يسبب شطر مجسات الكشف انخفاض في الحساسية بسبب استهلاك مجسات الكشف lo) سبيل (JE) طريق مجس التهجين) أو إشارة إيجابية زائفة في الطرق التي يتم بها إرسال الإشارات على أساس الشطر (على سبيل
0 المثال» طريقة بياكون الجزيئية). على الرغم من أن طرق البرايمر الموسوم (على سبيل المثال؛ طريقة شروق الشمس أو طريقة العقرب) لا تعاني من الشطر مثل طرق المجس؛ لها أوجه قصور حيث يجب التحكم في القيمة تي ام للأمبليكون بحد ذاته لضبط درجات حرارة الكشف. وفي المقابل؛ لأن الطرق القائمة على بتوسي تستخدم شطر أوليجونيوكليد التوسط المهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف؛ فهي لا تتأثر بالإنزيم الذي له نشاط 5” نيوكلياز
5 (بالأخص؛ تاك بوليمراز). وبالإضافة إلى ذلك؛ يمكن للطرق القائمة على بتوسي ضبط القيمة تي ام بسهولة للمزدوج المتكون لضمان الاختيار الملائم لدرجات حرارة الكشف. (أ) في أحد تجسيمات هذا الاختراع للكشف عن مجموعة تتابعات حمض نووي مستهدفة في slog أحادي التفاعل باستخدام كشف في الزمن الحقيقي لبعض الأهداف وتحليل الانصهار لأهداف أخرى؛ يمكن اختيار وتطبيق وسائل توليد الإشارة المناسبة لخصائص تتابع الحمض النووي
0 المستهدف المراد تحليله؛ مما يتيح الكشف عن مجموعة تتابعات الحمض النووي المستهدفة بطريقة أكثر كفاءة بكثير. (ب) في أحد تجسيمات هذا الاختراع للكشف عن مجموعة تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام كشف في الزمن الحقيقي وتحليل انصهار؛ تسمح وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد كشف (على سبيل المثال؛ طريقة تاكمان) لتتابع حمض نووي مستهدف يتم
5 الكشف عنه بطريقة الزمن الحقيقي بالكشف عن مجموعة من تتابعات حمض نووي مستهدفة
بملائمة وكفاء ة محسنة بشكل كبير . تخضع الطريقة التي تستخدم شطر أوليجونيوكليوتيد الكشضف مثل طريقة تاكمان لشطر Ade الكشف. فى هذه الحالة؛ ليس هناك مزدوج قادر على توليد إشارة في تحليل الانصهار بعد تفاعل الزمن الحقيقي؛ وبالتالي يمكن اختيار القيمة تي ام لتتابعات الحمض النووي المستهدفة الأخرى المراد الكشف عنها عن طريق تحليل الانصهار بسهولة.
(ج) في أحد تجسيمات هذا الاختراع للكشف عن مجموعة تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام كشف في الزمن الحقيقي وتحليل انصهار؛ قد تحث التوليفة من (1) لتتابع الحمض النووي المستهدف» وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة قائمة على شطر أوليجونيوكليوتيد الكشف (على سبيل المثال» طريقة تاكمان) و(2) لتتابع حمض نووي مستهدف آخرء وسائل توليد إشارة لتوفير إشارة بواسطة مزدوج متكون بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد توسط مهجن على وجه
0 التحديد بتتابع الحمض النووي المستهدف (على سبيل المثال» طرق تعتمد على بتوسي) النتائج غير المتوقعة. وفقاً لتقنيات تقليدية باستخدام التهجين بين تتابعات الحمض النووي المستهدفة وأوليجونيوكليوتيدات الكشف؛ هناك مجموعة مشاكل Jie انخفاض الحساسية Le) في ذلك انخفاض الحساسية في تحليل الانصهار) بسبب شطر المجس وتوليد إشارة زائفة بسبب الشطر. الاختراع الحالي خالي 5 بالكامل من هذه المشاكل. يمكن للطرق القائمة على بتوسي ضبط بسهولة القيمة تي ام للمزدوج المستخدم للكشف؛ بحيث يمكن اختيار درجات حرارة الكشف المستخدمة للكشف في الزمن الحقيقي والقيمة تي ام للقمة المستخدمة لتحليل الانتصهار بسهولة. سيتم الآن وصف الاختراع الحالي بمزيد من التفاصيل من خلال الأمثلة. سيكون من الواضح من قبل هؤلاء الخبراء في المجال أن هذه الأمثلة تهدف لتكون توضيحية أكثر بشكل ملموس ونطاق 0 الاختراع الحالي كما هو مبين في عناصر الحماية الملحقة غير محدود بالأمثلة. مثال 1 : كشف ثنائي الهدف بواسطة بي سي ار الزمن ا id بتوسي تشتما ( على الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة مختلفة.
قمنا أيضاً بفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن اثنين من الأحماض النووية المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف وبي سي ار زمن حقيقي بتوسي يشتمل على كشف واحد عند درجات حرارة مختلفة. تم استخدام بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه له نشاط 5" نيوكلياز لمد البادئات في عكس الاتجاه والبادئات في نفس الاتجاه؛ شطر بي تي او ؛ ومد القطعة بي تي او. تم استخدام الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية (ان جي) و الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) كتتابعات حمض نووي مستهدفة. تم استخدام بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي للكشف عن سي تي و ان جي. إذا كان الهدف موجود؛ يتم شطر بي تي او وإنتاج قطعة بي تي او. يتم تلدين القطعة بي تي او إلى gia الالتقاط 0 من سي تي او» مدها على جزء القولبة ل سي تي او وتكوين مزدوج ممتد مع سي تي او (سي تي او مزدوج). يوفر تكوين المزدوج الممتد إشارة ويمكن الحصول على منحنى تضخيم عن طريق قياس الإشارة عند درجة حرارة تكوين المزدوج الممتد. في هذا المثال» تم اختيار "72 درجة مئوية" كدرجة حرارة كشف للإشارة ل سي تي 5 "60 درجة مئوية" كدرجة حرارة كشف للإشارة ل ان جي باعتبار وسائل توليد الإشارة. للمزدوج الممتد المنتج 5 على أساس وجود سي تي أو ان جي قيمة تي ام قابلة للتحكم مضبوطة بواسطة تتابعه وطوله. في هذا المثال؛ يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد ل سي تي لتوفير إشارة حيث تكون المزدوج عند 2 درجة مئوية. في غضون ذلك؛ يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد ل ان جي لتوفير إشارة حيث تكون المزدوج عند 60 درجة مئوية؛ ولكن ليس لتوفير إشارة حيث يتم فصلها ليس لتكوين المزدوج عند 72 درجة مثوية. في درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل سي 0 تي والكشف عنها. في درجة حرارة الكشف 60 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل ان جي والكشف عنها بالإضافة إلى الإشارة ل سي تي. يتم إعاقة بي تي او وسي تي او بواسطة فاصل كريون عند نهاياتها-3” لمنع امتدادها. يتم توسيم سي تي او بجزئ مخمد (بي اتش كيو -2 (BHQ-2 وجزئ مخبر تألقي JIS) فلور احمر 610 (CAL Fluor Red 610 في جزء قولبته (اس اي كيو اي دي ١0 580 رقم 4 و 8).
تم تحضير al أنابيب تفاعل تحتوي على سي تي ؛ ان جي ؛ خليط من سي تي و ان جي Jong ضابط هدف على التوالى . تتايعات البرايمر فى عكس الاتجاه 6 البرايمر فى نفس الاتجاد؛ بي = او ¢ وسى = او المستخدمة فى هذا المثال هى: NG-F 5 -TACGCCTGCTACTTTCACGCTIINIGTAATCAGATG-3" (SEQ 5
ID NO: 1)
NG-R 5 -CAATGGATCGGTATCACTCGCIINCGAGCAAGAAC-3’ (SEQ ID NO: 2)
NG-PTO 5 -GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTITCGIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 3) 0
NG-CTO 5°-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)JACTGCCCGTATCGCGTACIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4)
CT-F 5 -GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIINTTTGTATAAC-3’ (SEQ ID NO: 5)
CT-R 5 -CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIINTTATTGGAGA-3> 15 (SEQ ID NO: 6)
CT-PTO 5'-
GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]- 3 (SEQ ID NO: 7)
CT-CTO 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fluor Red 0 610)JATGTGCGGTCGCGTAATCIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 8) (Deoxyinosine (اي: دي أوكسي إينوزين
(تشير الحروف التي تحتها خط إلى جزء التوسيم-5” ل بي تي او) تم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي في الحجم النهائي 20 ميكرولتر الذي يحتوي على حمض نووي مستهدف )10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي ؛ 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي أو خليط من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي و10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي)؛ 5 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 1) و5 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 2) لتضخيم هدف ان جي ؛ 3 بيكومول من بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم LB بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 4)؛ 5 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 5) و5 بيكومول من برايمر في نفس 0 الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 6) لتضخيم هدف سي تي ؛ 3 بيكومول من بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 7)؛ 1 بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 8)؛ و10 ميكرومول من 2> الخليط الرئيسي [النهائي» 200 ميكرومولار دي ان تي بي اس؛ 2 مل مولار كلوريد ماغنسيوم؛ 2 وحدة من بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه]. تم وضع الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل في مدور حراري في الزمن الحقيقي (سي اف اكس 96 بيو راد سي اف اكس 96؛ 5 بيو راد) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة متوية؛ التمسخ لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مثوية والتعربض إلى 50 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة متوية؛ 60 ثانية عند 60 درجة مثوية؛ 30 ثانية عند 72 درجة مئوية. تم اجراء الكشف عن الإشارة عند 60 درجة مئوية و72 درجة مئوية لكل دورة. وكما هو مبين في شكل 1أ؛ تم الكشف عن الإشارات عند 72 درجة مئوية في وجود سي تي cull) 0 1 و3). في الوجود الوحيد ل ان جي ؛ تم الكشف عن BLE) عند 60 درجة مئوية ولكن ليس عند 72 درجة dish (أنبوية 2). لم يتم الكشف عن إشارة في غياب الأحماض النووية المستهدفة (أنبوية 4). تظهر نتائج شكل 1 توليد الإشارة ل سي تي والذي له درجة حرارة الكشخف العالية نسبياً؛ ولكن لم يتم توليد الإشارة ل ان جي والذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ 72 درجة مئوية. لهذاء سيكون من المدرك أن الكشف عن 5 الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً سمح بتحديد وجود سي تي الذي له درجة Sha
الكشف العالية نسبياً على الأقل. أيضاً؛ في أنبوبة 2؛ سمح استخدام الفرق بسبب غياب إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ووجود إشاة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بتحديد وجود سي تي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً على الأقل. أيضاً؛ في أنبوية 2؛ سمح استخدام الفرق بسبب غياب إشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ووجود إشارة عند درجة Sha
الكشف المنخفضة نسبياً بتحديد وجود ان جى له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. تم حساب الفرق بين الإشارات التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بطرق مختلفة لفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن وجود ان جى الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً حتى في وجود أو غياب الإشارة من سي تي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً (شكل 1ب - ol والجداول 1 - 3).
0 1 يوضح الجدول 1 نسبة القيم ار al يو لنقاط النهاية عند 72 درجة Lge و60 درجة مثوية (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو وتصديرها من بيانات تحليل "نسبة المنحنى مطروحة من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي). الجدول 1
ا ا الس اوس النسبة Threshold ان 72 درجة 60١ درجة w= Ratio مئوية أمئوية 5 ' ’ | ا 3 سي تي + | 1454 3062 2.1 + أن جي م"
في هذا الجدول 1؛ الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية Of) جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ نهاية-ار اف يو يمثل وحدات ومضان النسبية في الدورة 50؛ وتمثل نهاية-النسبة نسبة نهاية-ار اف يو عند 60 درجة مئوية إلى نهاية-ار اف يو عند 72 درجة مئوية؛ العتبة هي قيمة عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي. نسبة الوجود الوحيد ل سي تي (أنبوية 1) كانت 1.2 ولكن؛ الذي في وجود كل من سي تي و ان a (أنبوية 3) كان 2.1. Lad كانت النسبة في الوجود الوحيد ل ان جي (أنبوية 2) وفي غياب أي حمض نووي مستهدف (أنبوبة 4) 36.7 و0.7؛ على التوالي. تم تطبيق الحد «aN 1.5 لتحديد وجود أو غياب ان جى. ووفقاً aad لأدنى؛ تم تأكيد وجود ان جى فى الأنابيب 2 3 0 وليس هناك ان جي في الأنابيب 1 و4. تم تحديد الحد الأدنى باعتبار نقطة النهاية من الأنبوية التى تحتوي على سي تي فقط. وبالنسبة لأنبوية 2؛ يمكن تحديد غياب سي تي الذي له درجة حرارة الكشف العالية lias يمكن ضبط الحد الأدنى للإشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة Lu على نحو مستقل بدلاً من تطبيق 1.5. طريقة أخرى باستخدام الإشارات عند 72 درجة مئوية و60 درجة مئوية لحساب نسبة الإشارات 5 التألقية عند 72 درجة Liha و60 درجة مئوية في كل من الدورات ورسم مخطط للنسبة مقابل الدورة (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو المعالجة لرسم المخطط وتصديرها من بيانات تحليل 'بدون طرح من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي). تم تطبيق الحد الأدنى» 0.1؛ لتحديد وجود أو غياب ان جي. تم تحديد الحد الأدنى باعتبار مخطط النسبة من الأنبوية التى تحتوي على سي تي فقط. 0 الجدول 2 الأنبوب ١ الهدف العتبة سى تى؛ قمية لاجل ان جي 9 7777
’ : | ’ 7 | : ’ ’ | ’ ’ في هذا الجدول 2( الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه all من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية (ان جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ العتبة هي dad عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي. LS هو مبين في شكل 1ب والجدول 2؛ تم التأكيد على وجود ان جي في الأنابيب 2 و3 وكانت قيمة سي تي له 32.90 و33.18؛ على التوالي. ليس هناك قيمة سي تي ناتجة في الأنابيب 1
و4. بدلاً من حساب النسب؛ يمكن طرح الشدة التألقية عند 60 درجة مئوية من تلك التي عند 72 درجة Lge فى كل الدورات ورسم مخطط للنتائج مقابل دورة كشف الهدف . تطبيق قيم الحد الأدنى الفردية لتحليل الإشارات الناتجة عند 60 درجة مئوية في كل أنبوية هي طريقة أخرى للكشف عن وجود ان جي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام
0 الإشارة التى Ju على وجود سى تى عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. فى حالة الكشف عن الإشارة عند 72 درجة مئوية؛ تم حساب الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مئوية من الأنابيب بضرب كل dad نهاية-ار اف يو عند 72 درجة مئوية في الحد الأدنى )4 1 ( ٠ تم تحديد الحد الأدنى (1.5) باعتبار النسبة النهائية من الأنبوبة التي تحتوي على سي تي فقط (بالإشارة إلى الجدول 1). في الحالة التي لم يتم فيها الكشف عن الإشارة عند 72 درجة مئوية؛ تم اختيار
5 الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مئوية من الأنابيب واستخدامه باعتبار الإشارة الأساسية؛ الحساسية؛ واختلاف الإشارة أو مدى خطأً الجهازء وفقاً لالضبط العام للحد الأدنى. في هذا (Jal تم تحديد "200" على أنها الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مئوية. الجدول 3
eel الجسم : ’ | ’ 3 سيتي + | 2181 35.83 ان جي نه نس ااا 5 في هذا الجدول 3؛ الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه all من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية (ان جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ العتبة الفرد لإشارة عند 60 درجة مئوية هي قيمة عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي في كل انبوب. وكما هو مبين في شكل 1ج و الجدول 3 وفقاً للحد الأدنى الفردي عند 60 درجة مثوية؛ تم تأكيد وجود ان جي في Lgl 2 وأنبوية 3 وعلاوة على ذلك؛ تم الحصول على القيمة سي تي له 2 و35.83؛ على التوالي؛ لم تتوفر قيمة سي تي ل ان جي في الأنابيب 1 و4. تشير هذه النتائج إلى أنه في طريقة الزمن الحقيقي بتوسي التي تشتمل على الكشف عن الإشارة عند اثنين من درجات pall )1( يسمح الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بالكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2)
0 يمكن استخدام الإشارات الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً. لهذاء يمكن الكشف عن تتابعي الحمض النووي المستهدفين في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف وبي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي الذي يشتمل على الكشف عن الإشارة عند
5 1 درجات حرارة مختلفة.
مثال 2: كشف ثنائي الهدف بواسطة تاكمان /بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي تشتمل على الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة مختلفة. قمنا بفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن اثنين من الأحماض النووية المستهدفة فى وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف و تاكمان of سي ار زمن حقيقي بتوسي يشتمل على كشف واحد عند درجات حرارة مختلفة. تم استخدام بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه له نشاط 5" نيوكلياز لمد البادئات في عكس الاتجاه والبادئات في نفس الاتجاه؛ شطر مجس تاكمان شطر بي تي او وامتداد القطعة بي تي او. تم استخدام الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية Of) جي) و الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) كتتابعات حمض نووي مستهدفة. قياس الإشارة من القطعة الموسومة. تم استخدام بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي للكشف عن ان فى هذا المثال ¢ تم اختيار 72 درجة "die كدرجة حرارة كشف عن ا لإشارة J سى = و60 درجة 5 مثوية" كدرجة حرارة كشف عن الإشارة ل ان جي باعتبار وسائل توليد الإشارة. للمزدوج الممتد المنتج على أساس وجود ان جي قيمة تي ام قابلة للتحكم مضبوطة بواسطة تتابعه وطوله. في هذا المثال» يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد لتوفير إشارة حيث تُكون المزدوج عند 60 درجة مئوية؛ ولكن ليس لتوفير إشارة حيث يتم فصلها ليس لتكوين المزدوج عند 72 درجة مئوية. في درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل سي تي والكشف عنها. في درجة حرارة 0 الكشف 60 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل ان جي والكشف عنها بالإضافة إلى الإشارة ل سي يتم توسيم مجس تاكمان Gan مخبر تألقي (كال فلور احمر 10 6( عند طرفه-5 ’ [Shag مخمد عند طرفه-3 ’ (بي اتش كيو -2) wl) اي كيو اي دي رقم 9( ٠ يتم إعاقة بي تي او وسي تي او
بواسطة فاصل كربون عند نهاياتها-3” لمنع امتدادها. يتم توسيم سي تي او بجزئ مخمد (بي اتش كيو -2) وجزئ مخبر تألقي (كال فلور احمر 610) في ea قولبته (اس اي كيو اي دي رقم 4). تم تحضير أريع أنابيب تفاعل تحتوي على سي تي ؛ ان جي ؛ خليط من سي تي و ان جي Jong ضابط هدف على التوالى . تتابعات البرايمر فى عكس الاتجاه؛ البرايمر فى نفس الاتجاد؛ بي تى او ؛ سى تى او ومجس تاكمان المستخدمة فى هذا المثال هى: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIGTAATCAGATG-3" (SEQ ID NO: 1) NG-R 5 -CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIICGAGCAAGAAC-3’ (SEQ ID NO: 2) 0 NG-PTO 5’ -GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG|C3 spacer]-3" (SEQ ID NO: 3) NG-CTO 5’ -[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)JACTGCCCGTATCGCGTAC|C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4) CT-F 5 -GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIINTTTGTATAAC-3> 15 (SEQ ID NO: 5) CT-R 5 -CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGHIITTATTGGAGA-3’ (SEQ ID NO: 6) CT-P 5’-[CAL Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3* (SEQ ID NO: 0 )9 (اي: دي أوكسي إينوزين)
(تشير الحروف التي تحتها خط إلى جزء التوسيم-5” ل بي تي او) تم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي في الحجم النهائي 20 ميكرولتر الذي يحتوي على حمض نووي مستهدف )10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي ؛ 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي أو خليط من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي و10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي)؛ 10 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 1) و10 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رفم 2) لتضخيم هدف ان جي ؛ 5 بيكومول من بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 3)؛ 1 بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 4)؛ 10 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 5) و12 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 6) لتضخيم هدف سي تي ؛ 1 بيكومول من مجس تاكمان Ll) اي كيو اي دي رقم 99)؛ و10 ميكرومول من 2* الخليط الرئيسي [النهائي. 200 ميكرومولار دي ان تي بي cl 2 مل مولار كلوريد ماغنسيوم؛ 2 وحدة من تاك بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه]. تم وضع الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل في مدور حراري في الزمن الحقيقي (سي اف اكس 96 بيو راد) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مئوية؛ التمسخ لمدة 15 دقيقة 5 عند 95 درجة مئوية والتعريض إلى 50 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية؛ 60 ثانية عند 0 درجة مئوية؛ 30 ثانية عند 72 درجة مثوية. تم اجراء الكشف عن الإشارة عند 60 درجة مثوية و72 درجة مئوية لكل دورة. وكما هو مبين في شكل 2أ,؛ تم الكشف عن الإشارات عند 72 درجة مئوية في وجود سي تي (الأنابيب 1 و3). في الوجود الوحيد ل ان جي ؛ تم الكشف عن إشارة عند 60 درجة مئوية ولكن ليس عند 72 درجة مثوية (أنبوية 2). لم يتم الكشف عن إشارة في غياب الأحماض النووية المستهدفة (أنبوية 4). تظهر نتائج شكل 12 توليد الإشارة ل سي تي والذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً» ولكن لم يتم توليد الإشارة ل ان جي والذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ 72 درجة مئوية. لهذاء سيكون من المدرك أن الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً سمح بتحديد وجود سي تي الذي له درجة حرارة 5 الكشف العالية نسبياً على الأقل. أيضاً؛ في أنبوبة 2 سمح استخدام Guill بسبب غياب إشارة عند
درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ووجود إشارة عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بتحديد وجود ان a له درجة حرارة الكشف المنخفضة Lis
تم حساب الفرق بين الإشارات التى تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بطرق مختلفة لفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن وجود ان
جي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً حتى فى وجود أو غياب الإشارة من سي تي
الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً (شكل 2ب - 2د والجداول 4 - 6).
يوضح الجدول 4 نسبة القيم ار اف يو لنقاط النهاية عند 72 درجة مئوية و60 درجة متئوية (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو وتصديرها من بيانات تحليل "نسبة المنحنى مطروحة من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي).
0 الجدول 4 2 دراجة 601 دراجة حي dase أمئوية ’ 7 ’ 7 ° | ا 3 سى تى + | 2030 3572 1.8 ي لي 1 ان جي م" في هذا الجدول 4؛ الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية Of) جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ نهاية-ار اف يو يمثل وحدات ومضان النسبية فى الدورة 50؛ وتمثل نهاية-النسبة نسبة نهاية-ار اف يو عند 60 درجة
مئوية إلى نهاية-ار اف يو عند 72 درجة متوية؛ العتبة هي قيمة عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي. نسبة الوجود الوحيد ل سي تي (أنبوية 1) كانت 1.1 ولكن؛ الذي في وجود كل من سي تي و ان a (أنبوية 3) كان 1.8. Lad كانت النسبة في الوجود الوحيد ل ان جي (أنبوية 2) وفي غياب أي حمض نووي مستهدف (أنبوية 4) 1278.0 و1.0؛ على التوالي. تم تطبيق الحد الأدنى؛ 1.2 لتحديد وجود أو غياب ان جى. ووفقاً aad لأدنى؛ تم تأكيد وجود ان جى فى الأنابيب 2 3 وليس هناك ان جي في الأنابيب 1 و4. تم تحديد الحد الأدنى باعتبار نقطة النهاية من الأنبوية التي تحتوي على سي تي فقط. وعلى نحو بديل؛ بالنسبة لأنبوية 2؛ حيث يمكن تحديد غياب سي تي الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ء يمكن ضبط الحد الأدنى للإشارة عند درجة حرارة 0 الكشف المنخفضة نسبياً على نحو مستقل بدلاً من تطبيق 1.2. طريقة أخرى باستخدام الإشارات عند 72 درجة مئوية و60 درجة مئوية لحساب نسبة الإشارات التألقية عند 72 درجة Augie و60 درجة مئوية في كل من الدورات ورسم مخطط للنسبة مقابل الدورة (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو المعالجة لرسم المخطط وتصديرها من بيانات تحليل 'بدون طرح من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي). تم تطبيق الحد الأدنى» 0.1؛ لتحديد وجود أو 5 غياب ان a تم تحديد الحد الأدنى باعتبار مخطط النسبة من الأنبوية التى تحتوي على سي تي فقط. الجدول 5 الأنبوب الهدف العتبة سى تىء قمية لاجل أن جي
ee فى هذا الجدول 5؛ النسبة تمثل نسبة ار اف يو عند 60 درجة مثوية إلى ار اف يو عند 72 درجة مئوية عند كل دورة. الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية OF) جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف. العتبة هي قيمة عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي.
وكما هو مبين في شكل 2ب و الجدول 5 تم التأكيد على وجود ان جي في الأنابيب 2 و3 وكانت قيمة سي تي له 37.88 37.205( على التوالي. ليس هناك قيمة سي تي ناتجة في الأنابيب 1 و4. بدلاً من حساب النسب؛ يمكن طرح الشدة التألقية عند 60 درجة مئوية من تلك التي عند 72 درجة مئوية في كل الدورات ورسم مخطط للنتائج مقابل دورة كشف الهدف. تطبيق قيم الحد الأدنى الفردية لتحليل الإشارات الناتجة عند 60 درجة مئوية في كل أنبوية هي
0 طريقة أخرى للكشف عن وجود ان جي الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام الإشارة التى تدل على وجود سى تى عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. فى حالة الكشف عن الإشارة التي تدل على وجود سي تي عند 72 درجة مئوية؛ تم حساب الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مئوية من الأنابيب بضرب كل قيمة نهاية-ار اف يو عند 72 درجة مئوية في الحد الأدنى (1.2). تم تحديد الحد الأدنى (1.2) باعتبار النسبة النهائية من الأنبوية التي تحتوي على
سي تي فقط (بالإشارة إلى الجدول 4). في الحالة التي لم يتم فيها الكشف عن الإشارة عند 72 درجة مئوية؛ تم اختيار الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مئوية من الأنابيب واستخدامه باعتبار الإشارة الأساسية؛ الحساسية؛ واختلاف الإشارة أو مدى خطاً الجهازء وفقاً للضبط العام للحد الأدنى. في هذا المثال؛ تم تحديد "200" على أنها الحد الأدنى الفردي للإشارة عند 60 درجة مثوية.
0 الجدول 6
الأنبوب الهدف ان جي )60 درجة مثوية)
: | ° ’ " 0 | 7 لطا Lm] في هذا الجدول 6؛ الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية (ان جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ العتبة الفرد لإشارة عند 60 درجة مئوية هي قيمة العتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود ان جي في كل انبوب. وكما هو مبين في شكل 2ب - 2د والجداول 4 - 6؛ وفقاً للحد الأدنى الفردي عند 60 درجة منوية؛ تم تأكيد وجود ان جي في أنبوية 2 وأنبوية 3 و» علاوة على ذلك؛ تم الحصول على القيمة سي تي له 536.21 37.07 على التوالي؛ لم تتوفر قيمة سي تي ل ان جي في الأنابيب 1 و4. تشير هذه النتائج إلى أنه في الطريقة تاكمان /الزمن الحقيقي بتوسي التي تشتمل على الكشف عن الإشارة عند اثنين من درجات Ball )1( يسمح RASH عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بالكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية Las 0 و(2) يمكن استخدام الإشارات الناتجة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً للكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً. لهذاء يمكن الكشف عن الحمضين النوويين المستهدفين في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف و تاكمان /بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي والتي تشتمل على الكشف عن الإشارة 5 1 عند درجات حرارة مختلفة. مثال 3: كشف ثنائي الهدف بواسطة بي سي ار الزمن الحقيقي وتحليل الانصهار
قمنا بفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن اثنين من الأحماض النووية المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف وتوليفة من بي سي ار الزمن الحقيقي وتحليل الانصهار. تم استخدام بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه له نشاط 5” نيوكلياز لمد البادئات في عكس الاتجاه والبادئات في نفس الاتجاه؛ شطر مجس تاكمان ؛ شطر بي تي او ؛ وامتداد القطعة بي تي او. تم استخدام الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية Of) جي) و الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) كتتابعات حمض نووي مستهدفة. تم استخدام بي سي ار الزمن الحقيقي تاكمان للكشف عن سي تي وتحليل الانصهار بتوسي للكشف عن ان جي. إذا كان سي تي موجود؛ يتم شطر مجس تاكمان وتحرير القطعة الموسومة. 0 إذا كان ان جي موجود؛ يتم شطر بي تي او وإنتاج قطعة بي تي او. يتم تلدين القطعة بي تي او إلى جزء الالتقاط ل سي تي او؛ مدها على جزء القولبة ل سي تي أو وتكوين مزدوج ممتد مع سي تي او (سي تي او مزدوج). للكشف فقط عن الإشارة التألقية المتولدة بواسطة شطر مجس تاكمان خلال عملية بي سي ار في الزمن الحقيقي» يتم تنفيذ الكشف عن الإشارة التألقية. عند درجة الحرارة حيث يتم فصل المزدوج 5 الممتد ليس لتكوين المزدوج ولا يتم توليد الإشارة من المزدوج الممتد المتكون بواسطة بتوسي. في عملية الانصهار؛ يتم قياس الإشارة للحصول على قمة انصهار تدل على وجود المزدوج الممتد المتكون على أساس وجود ان جي. يتم توسيم مسبار تاكمان بجزئ مخبر تألقي JIS) فلور احمر 610( عند طرفه-5” وجزئ مخمد عند طرفه-3” (بي اتش كيو -2) (اس اي كيو اي دي رقم 9). يتم إعاقة بي تي او وسي تي او 0 بواسطة فاصل كربون عند نهاياتها-3” لمنع امتدادها. يتم توسيم سي تي او بجزئ مخمد (بي اتش كيو -2) وجزئ مخبر تألقي (كال فلور احمر 610) في ea قولبته (اس اي كيو اي دي رقم 4). تتابعات البرايمر في عكس الاتجاه؛ البرايمر في نفس الاتجاه؛ بي تي او سي تي او؛ ومسبار تاكمان المستخدمة في هذا المثال هي:
NG-F 5 -TACGCCTGCTACTTTCACGCTIINIGTAATCAGATG-3" (SEQ ID NO: 1) NG-R 5 -CAATGGATCGGTATCACTCGCIINCGAGCAAGAAC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO 5 -GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTITCGI[C3 5 spacer]-3" (SEQ ID NO: 3) NG-CTO 5°-[BHQ-2]JTTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)JACTGCCCGTATCGCGTACIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 4) CT-F 5 -GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIINTTTGTATAAC-3’ (SEQ ID NO: 5) 0 CT-R 5 -CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIITTATTGGAGA-3’ (SEQ ID NO: 6) CT-P 5’-[CAL Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3" (SEQ ID NO: )9 (اي: دي أوكسي إينوزين) (تشير الحروف التي تحتها خط إلى جزء التوسيم —5 ’ ل بي تي او) تم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي في الحجم النهائي 20 ميكرولتر الذي يحتوي على حمض نووي مستهدف )10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي ؛ 10 بيكوجرام من 0 الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي أو خليط من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي و10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي)؛ 10 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 1) و10 بيكومول من برايمر في
نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 2) لتضخيم هدف ان جي ؛ 5 بيكومول من بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 3)؛ 1 بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 4( 10 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 5) و12 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 6) لتضخيم هدف سي تي ؛ 1 بيكومول من مسبار تاكمان (اس اي كيو اي دي رقم 9(¢ و10 ميكرومول من X2 الخليط الرئيسي [النهائي» 200 ميكرومولار دي ان تي بي اسء 2 مل مولار كلوريد ماغنسيوم» 2 Bang من تاك بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه]. تم وضع الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل في مدور حراري في الزمن الحقيقي (سي اف اكس 96 بيو راد) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مئوية؛ التمسخ لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة Lia والتعربض إلى 50 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية؛ 60 ثانية عند 60 درجة مئوية؛ 0 30 ثانية عند 72 درجة مئوية. تم اجراء الكشف عن الإشارة عند 72 درجة Augie لكل دورة. بعد Jo lil) تم وضع الأنبوية لمدة 5 دقائق عند 55 درجة مئوية. تم تنفيذ تحليل منحنى الانصهار بواسطة قياس الإشارة التألقية خلال ارتفاع درجة الحرارة من 55 درجة مئوية إلى 95 درجة منوية في الفترة الفاصلة 0.5 درجة مئوية. وكما هو مبين في شكل 3؛ في وجود سي تي ؛ تم الحصول على منحنى تضخيم خلال بي سي 5 ار الزمن الحقيقي؛ ولكن لم يتم ملاحظة قمة انصهار في تحليل الانصهار (أنبوبة 1). في وجود ان جي ؛ لم يتم الحصول على منحنى تضخيم خلال بي سي ار الزمن الحقيقي؛ ولكن تم ملاحظة dad انصهار لها قيمة تي ام المتوقعة (66 درجة متوية) للمزدوج الممتد المتكون على أساس وجود ان جي في تحليل الانصهار (أنبوية 2). في وجود سي تي و ان جي ؛ تم ملاحظة الإشارات خلال كل من عملية بي سي ار الزمن الحقيقي وعملية تحليل الانصهار ل(أنبوية 3). لم يتم الكشف 0 عن إشارة في غياب الأحماض النووية المستهدفة (أنبوية 4). تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن CRASH عن مجموعة الأحماض النووية المستهدفة بواسطة قنائة أحادية الكشف عن طريق توليفة من بي سي ار الزمن الحقيقي وتحليل الانصهار. مثال 4: التنميط الجيني اس ان بي بواسطة بي سي ار الزمن الحقيقي الذي يشتمل على الكشف عن إشارة عند درجات حرارة مختلفة.
قمنا بفحص ما إذا كان من الممكن تطبيق بي سي ار الزمن الحقيقي الذي يشتمل على الكشف عن إشارة عند درجة حرارة مختلفة على التنميط الجيني اس ان بي في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف. تم استخدام بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه له نشاط 5” نيوكلياز لمد البادئات في عكس S الاتجاه والبادئات في نفس الاتجاه؛ شطر بي تي او ؛ وامتداد قطعة بي تي او. تم استخدام زيجوت
متماثل بري (سي ©)؛ زيجوت متماثل (TJ) من النوع الطافرء» وزيجوت مغاير من الحمض النووي دي ان ايه الجيني بشري (سي 677 تي) ميهر كتتابعات حمض نووي مستهدفة. تم استخدام بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي للكشف عن أليل (سي) البري وأليل من النوع الطافر (تي) ل الحمض النووي دي ان ايه الجيني بشري (سي 677 تي) ميهر. إذا وجد الأليل
0 المستهدف؛ يتم شطر بي تي او وإنتاج قطعة بي تي او. يتم تلدين القطعة بي تي او إلى جز Talal) سي تي اوء مدها على جزء القولبة ل سي تي او وتكوين مزدوج ممتد مع سي تي أو (سي تي او مزدوج). يوفر تكوين المزدوج الممتد إشارة ويمكن الحصول على منحنى تضخيم عن طريق قياس الإشارة عند درجة حرارة تكوين المزدوج الممتد. في هذا المثال» تم اختيار (72 درجة (Augie كدرجة حرارة للكشف عن الإشارة للأليل البري )=(
واختيار "55 درجة مئوية" كدرجة حرارة للكشف عن الإشارة للأليل من النوع الطافر (تي) باعتبار وسائل توليد الإشارة. للمزدوج الممتد المنتج على أساس وجود الأليل البري (سي) أو الأليل من النوع البري (تي) قيمة تي ام قابلة للتحكم يتم ضبطها بواسطة تتابعه وطوله. في هذا المثال؛ يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد للأليل البري (سي) لتوفير إشارة حيث يُكون المزدوج عند 72 درجة مئوية. Ag غضون ذلك؛ يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد للأليل من النوع الطافر
0 (تي) لتوفير إشارة حيث يُكون المزدوج عند 55 درجة مئوية؛ ولكن ليس لتوفير إشارة حيث ينفصل ليس لتكوين المزدوج عند 72 درجة مثئوية. في درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة للأليل البري (سي) والكشف عنها. في درجة حرارة الكشف 55 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة للأليل من النوع الطافر (تي) والكشف عنها بالإضافة إلى الإشارة للأليل من النوع البري (ee)
يتم إعاقة بي تي او وسي تي او بواسطة فاصل كربون عند نهاياتها -3 ’ لمنع امتداد ها . يتم توسيم جزءٍ قولبته wl) اي كيو اي دي رقم 513 15 ( . تتابعات البرايمر فى عكس الاتجاه؛ البرايمر فى نفس الاتجاد؛ بي = او ¢ وسى = او المستخدمة فى هذا Jil هى: M677-F 5: -CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIGAGGCTGACC-3’ (SEQ ID NO: 10) M677-R 5 -CAAGTGATGCCCATGTCGGIINGCCTTCACAA-3’ (SEQ ID NO: 11) M677-W-PTO 5°- 10 GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[C3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 12) M6T77-W-CTO 5’ -[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(CAL Fluor Red 610)]TCTTCTAACGTCGGGACCIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 13) M677-M-PTO 5- 5 ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 14) M677-M-CTO 5 —[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red 610)JATTCTGCGAATCGACGT[C3 spacer] -3° (SEQ ID NO: 15) (اي : دي أوكسي إينوزين) (تشير الحروف التي تحتها خط إلى جزء التوسيم —5 ’ ل بي تي او)
تم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي في الحجم النهائي 20 ميكرولتر الذي يحتوي على
حمض نووي مستهدف (1 نانوجم من الحمض النووي دي ان ايه الجيني بشري ميهر متماثل زيجوت من النوع البري (سي) (سي 677 تي)؛ 1 نانوجم من الحمض النووي دي ان ايه الجيني بشري ميهر متماثل زيجوت من النوع الطافر (تي) (سي 677 تي)؛ أو 1 نانوجم من الحمض
النووي دي ان ايه الجيني بشري ميهر متماثل الزيجوت (سي 677 تي))؛ 5 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 10) و5 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 11)؛ 3 بيكومول من كل بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 12 و 14)؛ 1 بيكومول من كل سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 13 و 15)؛ و10 ميكرومول من X2 الخليط الرئيسي [النهائي» 200 ميكرومولار دي ان تي بي اسء؛ 2 مل مولار كلوريد ماغنسيوم» 2
0 وحدة من بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه]. تم وضع الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل في مدور حراري في الزمن الحقيقي (سي اف اكس 96 بيو راد) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مثوية؛ التمسخ لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مثوية والتعربيض إلى 50 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مثوية؛ 60 ثانية عند 55 درجة متوية؛ 30 ثانية عند 72 درجة مثوية. تم اجراء الكشف عن الإشارة عند 55 درجة مثوية و72 درجة مثوية لكل دورة.
5 وكما هو مبين في شكل 4؛ تم الكشف عن إشارات عند 72 درجة مئوية و55 درجة مئوية في وجود الزيجوت المتماثل من النوع البري (سي) (أنبوية 1) أو في وجود الزيجوت المتماثل (أنبوية 3). في وجود الزيجوت المتماثل الطافر (تي)؛ تم الكشف عن إشارة مكثفة عند 55 درجة منوية ولكن إشارة ضعيفة جداً عند 72 درجة مثوية (أنبوية 2). لم يتم الكشف عن إشارة في غياب الأحماض النووية المستهدفة (أنبوية 4).
0 ريبين الجدول 7 نسبة القيم ار اف يو لنقاط النهاية عند 72 درجة مئوية و55 درجة مئوية (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو وتصديرها من بيانات تحليل dud المنحنى مطروحة من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي). الجدول 7
في هذا الجدول 7( الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني البشري من نوع بري و نوع متحول و نوع مغاير بشري ميهر (سي 677 تي)؛ ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ نهاية- ار اف يو يمثل وحدات ومضان النسبية فى الدورة 50؛ وتمثل نهاية-النسبة نسبة نهاية-ار اف يو عند 55 درجة مئوية إلى نهاية-ار اف يو عند 72 درجة مئوية نسبة وجود الزيجوت المتماثل من النوع البري (سي) (أنبوبة 1) كانت 1.2 ولكن؛ تلك التي في وجود الزيجوت المتماثل (أنبوية 3) كانت 1.9. يشير هذا الفرق بين النسبتين إلى أن الأليل الطافر (تي) يوجد مع الأليل البري (سي) في الأنبوية التي تشتمل على الزيجوت المتماثل. في غضون ذلك؛ كانت النسبة الناتجة من الزيجوت المتماثل الطافر (تي) كبيرة جداً نسبياً؛» حيث كانت القيمة ار اف يو في 72 درجة مئوية منخفضة Asal) 2). باعتبار حقيقة أن الأليل البري والأليل 0 الطافر موجودين بنسبة 1:1 في الزيجوت المتغاير» يمكن إدراك أن الإشارة الضعيفة التي تم الكشف عنها عند 72 درجة مئوية في وجود الزيجوت المتماثل من النوع الطافر هي إشارة Linge زائفة. وفقاً للطريقة الحالية للتنميط الجينى اس ان بى؛ تعمل قيمة النسبة لتحديد ما إذا كانت الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية Las إشارة زائفة أم لا. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن تطبيق بي سي ار الزمن الحقيقي الذي يشتمل على الكشف عن 5 الإشارة عند درجة حرارة مختلفة للتنميط الجيني اس ان بي مع قناة أحادية الكشف وأنه يمكن استخدام الفرق الناتج من الإشارات عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة Cail المنخفضة نسبياً للتنميط الجينى اس ان بى.
مثال 5: الكشف متعدد الأهداف بواسطة تاكمان /بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي يشتمل على الكشف عن إشارة في درجات حرارة مختلفة. قمنا بفحص ما إذا كان من الممكن الكشف عن ثلاثة أحماض نووية مستهدفة في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف و تاكمان /يي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي يشتمل على الكشف عن إشارة في درجات حرارة مختلفة.
تم استخدام بوليمراز الحمض النووي دي ان ايه له Lalas 5” نيوكلياز لمد البادئات في عكس الاتجاه والبادئات في نفس الاتجاه؛ شطر مسبار تاكمان شطر بي تي او ؛ وامتداد القطعة بي تي او. تم استخدام الحمض النووي دي ان ايه الجيني من النيسرية البنية Of) جي)؛ الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (تي سي)؛ و الحمض النووي دي ان ايه الجيني من
0 الميكويلازما التناسلية (ام جي) كتتابعات حمض نووي مستهدفة. تم توظيف بي سي ار الزمن الحقيقي تاكمان للكشف عن ام جي. تم استخدام بي سي ار الزمن الحقيقي بتوسي للكشف عن سي تي و أن جي. في هذا المثال» تم اختيار "95 درجة مئوية" كدرجة حرارة للكشف عن الإشارة ل ام جي؛ "72 درجة مئوية" كدرجة حرارة CRIS للإشارة ل سي تي » و60 درجة "Augie كدرجة حرارة للكشف عن
5 الإشارة ل ان جي باعتبار وسائل توليد الإشارة. في هذا المثال؛ يتم تصميم تتابع وطول المزدوج الممتد من سي تي أو ان جي لتوفير إشارة حيث ثكون المزدوج عند 72 درجة مئوية أو 60 درجة مئوية؛ على التوالي؛ ولكن ليس لتوفير إشارة حيث تنفصل ليس لتكوين المزدوج عند 95 درجة مثوية. في درجة حرارة الكشف 95 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل ام جي والكشف عنها. في درجة حرارة الكشف 72 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل سي تي والكشف عنها بالإضافة إلى
0 الإشارة ل ام جي. clad في درجة حرارة الكشف 60 درجة مئوية؛ سيتم توليد الإشارة ل ان جي والكشف عنها بالإضافة إلى الإشارة ل ام جي و سي تي. يتم توسيم مسبار تاكمان بجزئ مخبر تألقي JIS) فلور احمر 610) عند "Sales وجزئ مخمد عند نهايته-3” (بي اتش كيو -2) (اس اي كيو اي دي رقم 18). يتم إعاقة بي تي او سي تي او بواسطة فاصل كربون عند نهاياتها-3” لمنع امتدادها. يتم توسيم سي تي او بجزئ مخمد (بي اتش
كيو -2) وجزئ مخبر تألقي JIS) فلور eal 610) في جزء قولبته Ld) اي كيو اي دي رقم 4 و 8 تم تحضير ثمان أنابيب تفاعل تحتوي على ان جي ؛ سي تي ؛ ام جي؛ خليط من ان جي وسي تي؛ خليط من ان جي وام جي؛ خليط من سي تي وام جي؛ خليط من ان جي ؛ سي تي وام جي؛ وبدون ضابط هدف على التوالى. تتابعات البرايمر في عكس الاتجاه؛ البرايمر في نفس الاتجاد؛ بي تي او ‘ سي تي او ومسبار تاكمان المستخدمة فى هذا المثال هى: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIGTAATCAGATG-3" (SEQ ID NO: 1) NG-R 5 -CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3" 10 (SEQ ID NO: 2) NG-PTO 5’ -GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG|C3 spacer]-3" (SEQ ID NO: 3) NG-CTO 5’ -[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluor Red 610)JACTGCCCGTATCGCGTACIC3 spacer]-3° (SEQ ID NO: 4) 5 CT-F 5 -GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIINTTTGTATAAC-3’ (SEQ ID NO: 5) CT-R 5 -CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGHIITTATTGGAGA-3’ (SEQ ID NO: 6) CT-PTO 5- 20 GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCGIC3 spacer]- (SEQ ID NO: 7) 35
01-010 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fluor Red 610)JATGTGCGGTCGCGTAATCIC3 spacer]-3’ (SEQ ID NO: 8)
MG-F 5 -AAAACCCACGGAAATGATGAGAIIIIATTGGTTCTAC-3’ (SEQ ID NO: 16)
MG-R 5 -CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTGIIIICTGATAAAAG-3" 5 (SEQ ID NO: 17)
MG-P 5’-[CAL Fluor Red 610]GAGTTCTTTCAAGAACAGCAAGAGGTGT[BHQ-2]-3" (SEQ ID
NO: 18) 10 (اي : دي أوكسي إينوزين) (تشير الحروف التي تحتها خط إلى جزء التوسيم —5 ’ ل بي تي او) تم اجراء بي سي ار في الزمن الحقيقي في الحجم النهائي 20 ميكرولتر الذي يحتوي على حمض نووي مستهدف (10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ان جي ؛ 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي ؛ 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ام جي؛ خليط من كل من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ان جي و سي تي ؛ خليط من كل من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل ان جي وام جي؛ خليط من كل من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ل سي تي وام جي؛ أو خليط من كل من 10 بيكوجرام من الحمض النووي دي ان ايه الجيني ان جي ؛ سي تي وام جي)؛ 5 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 1) و5 بيكومول من 0 برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 2) لتضخيم هدف ان جي ؛ 3 بيكومول من بي تي او wl) اي كيو اي دي رقم 3(« 1 بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 4(« 5 بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 5) و5 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه wl) اي كيو اي دي رقم 6( لتضخيم الهدف سي تي 3 بيكومول من بي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 7)؛ 1 بيكومول من سي تي او (اس اي كيو اي دي رقم 8« 5
بيكومول من برايمر في عكس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 16) و5 بيكومول من برايمر في نفس الاتجاه (اس اي كيو اي دي رقم 17( لتضخيم الهدف ام جي؛ 1 بيكومول من مسبار تاكمان Ll) اي كيو اي دي رقم 18)؛ و10 ميكرولتر من 2* الخليط الرئيسي Sell] « 200 ميكرومولار دي ان تي بي اس؛ 2 مل مولار كلوريد ماغنسيوم؛ 2 وحدة من بوليمراز الحمض
النووي دي ان ايه]. تم وضع الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل في مدور حراري في الزمن الحقيقى )= اف اكس 26 بيو راد) لمدة 5 دقائق عند 50 درجة مثوية؛ التمسخ لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية والتعريض إلى 50 دورة من 30 ثانية عند 95 درجة مئوية؛ 60 ثانية عند 0 درجة مثئوية؛ 30 ثانية عند 72 درجة مثوية. تم اجراء الكشف عن الإشارة عند 60 درجة مثوية؛ 2,095,472 Lge لكل دورة.
0 وكما هو مبين في الأشكال 5أ؛ 5ب؛ و5ج؛ أتاحت الإشارات التي تم الكشف عنها عند 95 درجة Lge لذا تحديد وجود ام جي له درجة حرارة الكشف ١ لأعلى نسبياً على | لأقل (95 درجة مئوية) في أنابيب 3 5؛ 6 و7. Wis الفرق بسبب غياب الإشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً )95 درجة مئوية) ووجود إشارة عند درجة حرارة الكشف المتوسطة نسبياً (72 درجة مئوية) من تحديد وجود سي تي له درجة
5 حرارة الكشف المتوسطة نسبياً (72 درجة (Augie في أنابيب 2 و4. علاوة على ذلك؛ سمح لنا استخدام الفرق بسبب غياب الإشارة عند درجة حرارة الكشف المتوسطة نسبياً (72 درجة (Logie ووجود إشارة عند درجة حرارة الكشف ١ لأقل نسبياً )60 درجة مثوية) بتحديد وجود ان جى له درجة حرارة الكشف الأقل نسبياً )60 درجة (dase في أنبوبة 1. تم حساب الفرق بين الإشارات التي تم الكشف عنها عند 95 درجة مئوية؛ 72 درجة مثوية و60
درجة Lge بواسطة طرح نهاية- متوسط ار اف يبو (End-ARFU) لفحص ما إذا كان سي تي أو ان جي يوجدا معاً مع أهداف أخرى (Ka تحديدها في وعاء أحادي التفاعل. الجدول 8
دراجة |72 daha ار اف يبو سي تي Rs |مثوية م" 4 نجي + |56 . 1457 1401 + “ي أي 300 5 أانجى +م | 1721 . 1918 197 > سي تى +ام | 1714 CT 3457 1743 + > 7 نجي + 1792 سي تي +ام 5 | 1743 + جحي في هذا الجدول 8( الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية Of) جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ نهاية-ار اف يو يمثل وحدات ومضان النسبية في الدورة 50؛ وتمثل نهاية- متوسط ار اف يو قمية التي ثم الحصول عليها بطرح نهاية-ار اف يو عند 95 درجة مئوية من ذلك عند 72 درجة مئوية؛ العتبة هي قيمة 5 عتبة للتمييز بين وجود أو عدم وجود سي تي. الجدول 9
أر أو ا 2دراجة |60دراجة FI ل جي ds |مثوية 4 ان جي + ; 1457 3226 1769 + e أي 800 ان جي + ; 1918 4023 2105 + pl جي سي تي + 3457 4121 664 pl جي 7 ان جي + 2361١ 5896| 3535| + i om + pl جي في هذا الجدول 9؛ الهدف هو الحمض النووي دي ان ايه الجيني من الكلاميديا التراخوماتية (سي تي) و النيسرية البنية Of) جي). ان تي سي يمثل لا تحكم في الهدف؛ نهاية-ار اف يو تمثل وحدات ومضان النسبية في الدورة 50؛ وتمثل نهاية- متوسط ار اف يو قمية التي ثم الحصول عليها بطرح ار اف يو عند 72 درجة مثئوية من ذلك عند 60 درجة مئوية؛ العتبة هي قيمة عتبة wall 5 بين وجود أو عدم وجود ان جي.
درجة Lge و72 درجة مثوية (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو وتصديرها من بيانات تحليل 'نسبة المنحنى مطروحة من القيمة الأساسية" في البرنامج الأساسي). تم تطبيق الحد الأدنى "300" لتحديد وجود سي تي. تم تحديد الحد الأدنى باعتبار نهاية- متوسط ار اف يو من الأنابيب التي Y 5 تحتوي على سي تي (أنابيب 3.1 55( . وفقاً للحد ١ لأدنى 6 ثم تأكيد وجود سي تي في | لأنابيب T5642 2 درجة مئوية و60 درجة مئوية (تم اشتقاق جميع قيم ار اف يو وتصديرها من بيانات تحليل dud المنحنى مطروحة من القيمة الأساسية” في البرنامج الأساسي). تم تطبيق الحد الأدنى 0 800" لتحديد وجود ان جي. تم تحديد الحد الأدنى باعتبار نهاية- متوسط ار اف يو من الأنابيب التي لا تحتوي على ان جي (أنابيب 2؛ 3 و6). وفقاً للحد الأدنى؛ تم تأكيد وجود ان جي في الأنابيب 1 5و7. تشير هذه النتائج إلى أنه في طريقة الزمن الحقيقي تاكمان / بتوسي التي تشتمل على الكشف عن الإشارة عند ثلاث درجات حرارة؛ )1( يسمح الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف الأعلى bas 5 بالكشف عن تتابع الحمض النووي المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً و(2) يمكن استخدام الفرق الناتج من الإشارات عند درجارت حرارة الكشف المختلفة لتحديد تتابعات الحمض النووي المستهدفة التى لها درجات حرارة كشف أقل من أعلى درجة حرارة كشف. لهذاء يمكن الكشف عن مجموعة الأحماض النووية المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل باستخدام قناة أحادية الكشف وبي سي ار الزمن الحقيقي تاكمان / بتوسي الذي يشتمل على كشف 0 عن الإشارة عند درجات حرارة مختلفة. بعد وصف التجسيم المفضل للاختراع الحالي» من المفهوم أن بدائله وتعديلاته الواقعة ضمن روح J لاختراع قد تصبح واضحة لهؤلاء الخبراء في هذا المجال ؛ alg تحديد نطاق هذا ١ لاختراع بواسطة عناصر الحماية الملحقة ومكافئاتها.
Claims (1)
- عناصر الحماية1. طريقة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) تحضين العينة مع اثنين من وسائل توليد الإشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض nucleic (gy) المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن إشارة متولدة عند درجة حرارة الكشف العالية deg Gad درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء تحضين وكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة خاصة بالهدف؛ حيث يتم تصميم أحد تتابعي الحمض النووي 71101666 المستهدفين كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ويتم تصميم الآخر كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة 0 حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ حيث يتم تحديد درجتي Ba الكشف بواسطة وسيلتي توليد الإشارة؛ حيث (1) تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً قادرة على توليد إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) تكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة HME على توليد كل من إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 7100166 المستهدف 5 الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 7101866 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث تشتمل وسيلتي توليد الإشارة على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على واسم فلوري مقابل ولا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ 0 (ب) تحديد وجود تتابعي الحمض النووي 0101616 المستهدفين بواسطة الإشارات التي يتم الكشف عنها في خطوة (أ)؛ حيث (1) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 0001666 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف 5 العالية Las والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ باستخدامقيمة مرجعية؛ حيث يتم الحصول على القيمة المرجعية عن طريق (1) تحضين تتابع الحمض النووي 816ا00ا0 المستهدف الذي له درجة حرارة كشف عالية نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن تتابع الحمض النووي 71001666 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)» (2) الكشف عن الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة clus و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.2. الطريقة وفقاً لعنصر 1؛ حيث يتم اجراء خطوة (أ) في عملية تضخيم واحدة بالتزامن مع تضخيم الحمض النووي nucleic0 3. الطريقة وفقاً لعنصر 1 حيث يتم اجراء خطوة (أ) في عملية تضخيم واحدة بدون تضخيم الحمض النووي nucleic 4 الطريقة وفقاً لعنصر 1؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي 6 المستهدفة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين مزدوج.5. الطريقة Tg لعنصر 1 حيث تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي nucleic 5 المستهدفة هي وسائل توليد إشارة بواسطة تكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد Oligonucleotides توسط مهجن على dag التحديد بتتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف.6.. الطريقة وفقاً لعنصر 1؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي وسائل توليد إشارة بواسطة شطر 0 أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides كشف؛ وتكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي NUCleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد إشارة بواسطة تكوين مزدوج.7. الطريقة وفقاً لعنصر ١1 حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي وسائل توليد إشارة بواسطة شطر 5 أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides كشف؛ وتكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي NUCleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد إشارة بواسطةتكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides توسط مهجن على وجه التحديد بتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف.8. الطريقة وفقاً لعنصر ١1 حيث يشتمل الفرق على فرق يتم الحصول عليه بواسطة المعالجة الحسابية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.9. الطريقة وفقاً لعنصر 1؛ حيث لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً يتم القيام بتحديد وجود تتابع الحمض النووي 70101616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً. 0 10. الطريقة وفقاً لعنصر 1؛ حيث يشتمل تتابعي الحمض النووي nucleic المستهدفين على اختلاف نيوكليوتيد Nucleotide وبشتمل تتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الواحد من الاثنين على نوع واحد من اختلاف النيوكليوتيد nucleotide ويشتمل الآخر على النوع AY من اختلاف النيوكليوتيد .nucleotide1. طريقة لتنميط اس ان بي 5800 لتتابع حمض نووي في die باستخدام درجات حرارة كشف 5 مختلفة؛ تشتمل على: (أ) تحضين العينة التي تشتمل على تتابع الحمض النووي nucleic الذي يحتوي على موقع اس ان بي 5010 (تعدد أشكال نيوكليوتيد واحد (single nucleotide polymorphism ووسائل توليد la) للكشف عن ألائل alleles اس ان بي SNP في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن الإشارة المتولدة عند درجة حرارة الكشف العالية Gund وعند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا 0 باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم إجراء التحضين والكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من ألائل alleles اس ان بي 5800 بواسطة وسائل توليد الإشارة الخاصة بالأليل؛ حيث يتم تصميم واحد من alleles JY) اس ان بي 5810 كأليل اس ان بي SNP له درجة حرارة كشف عالية نسبياً wg تصميم الآخر كأليل اس ان بي 5810 له درجة حرارة كشف منخفضة thas حيث يتم تحديد درجتي الحرارة للكشف بواسطة وسيلتي توليد 5 الإشارة؛ Cus (1) تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً Sle عن درجة حرارة قادرة على توليد إشارة خاصة بالأليل من وسائل توليد الإشارة لأليل اس ان بي SNP الذي له درجة حرارة الكشفالعالية نسبياً و(2) تكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً قادرة على توليد كل من إشارة خاصة بالأليل من وسائل توليد الإشارة لأليل اس ان بي 5800 الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالأليل من وسائل توليد الإشارة لأليل اس ان بي 8006 الذي له درجة Sha الكشف العالية نسبياً؛ حيث تشتمل وسيلتي توليد الإشارة على واسم فلوري مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛(ب) تحديد النمط الجيني اس ان بي 5800 بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً في خطوة off) باستخدام واحد على الأقل من القيم المرجعية؛ حيث يتم الحصول على قيمة مرجعية واحدة بواسطة (1) تحضين زيجوت متماثلة الألائل alleles تتكون من أليل اس ان بيSNP 0 له درجة حرارة كشف Alle نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي 5110 الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة clas و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ يتم5 الحصول على قيمة مرجعية أخرى بواسطة )1( تحضين زبجوت غير متماثلة الألائل alleles لكل من الأليل اس ان بي 5800 الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبيًا والأليل اس ان بي SNP الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا مع وسائل توليد الإشارة الخاصة بالأليل في slog تفاعل AT غير وعاء التفاعل في خطوة ol) (2) الكشف عن إشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبيًا ودرجة حرارة الكشف المنخفضة Lows و(3) ثم الحصول على فرق بين0 الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبيًا والإشارة التي تم الكشف lie عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا؛ وبتم الحصول على القيمة المرجعية الأخرى بواسطة )1( تحضين زيجوت متماثلة الألائل alleles تتكون من أليل اس ان بي 5800 له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي 5800 الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً في deli slog آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة (أ)؛ (2) الكشف عن5 الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة class و(3)ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.2. طريقة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف»؛ تشتمل على: () تحضين العينة مع ثلاث وسائل توليد إشارة على الأقل للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف في ثلاثة درجات حرارة للكشف على الأقل؛ حيث يتم التحضين والكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الفعلي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة خاصة بالهدف؛ حيث يتم تصميم كل من 0 تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل كحمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف مختلفة؛ حيث يتم تحديد درجات حرارة الكشف الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة الحرارة القادرة على توليد ليس فقط إشارة خاصة بالهدف من وساتل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن أيضاً إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع 5 الحمض النووي 000166 المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف؛ حيث تشتمل وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على واسم فلوري مطابق وبتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة عن طريق نواع واحد من الكواشف؛ و (ب) تحديد وجود تتابعات الحمض النووي 0001656 المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة 0 الإشارات التي يتم الكشف عنها في خطوة (أ)؛ Cua عندما يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة كشف معينة من بين تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 616ا000 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة 5 الكشف المعينة؛ باستخدام قيمة مرجعية واحدة على الأقل من بين القيم المرجعية؛ حيث يتم الحصول على القيم المرجعية عن طريق (1) تحضين جميع توليفات تتابعات الحمض النوويnucleic المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة مع وسائل توليد الإشارة المقابلة في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في خطوة of) (2) الكشف عن الإشارات ليس فقط عند واحدة أو أكثتر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة ولكن Load درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو JST من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ حيث عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً من بين درجات حرارة الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 0001666 المستهدف بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. 0 13. الطريقة وفقاً لعنصر 12؛ حيث يتم اجراء الخطوة (ب) بواسطة تحديد أولاً وجود تتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً ثم بعد ذلك تحديد وجود تتابعات الحمض النووي 70001610 المستهدفة التي لها درجة حرارة الكشف الأقل نسبياً بترتيب تنازلي.4. الطريقة وفقاً لعنصر 12؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي nucleic 5 المستهدفة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين المزدوج.5. الطريقة وفقاً لعنصر 12؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن uh شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides كشف»؛ ووسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد إشارة عن طريق تكوين المزدوج. 0 16. الطريقة وفقاً لعنصر 12؛ حيث تشتمل وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل على واسم مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بواسطة نوع واحد من الكواشف.7. الطريقة وفقاً لعنصر 12؛ حيث يشتمل الفرق على فرق يتم الحصول عليه بواسطة المعالجة الحسابية للإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة. 5 18. الطريقة وفقاً لعنصر 12 والتي بها عندما لا يتم الكشف عن الإشارة عند درجات Sha كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة؛ فإنه يتم القيام بتحديد وجود تتابع الحمض النووي56 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة باعتبار عدم الكشف عن الإشارة عند درجات حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة.9. طريقة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة في die باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة وتحليل انصهار؛ تشتمل على: (أ) تحضين العينة مع وسيلتي توليد إشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة في وعاء أحادي التفاعل والكشف عن الإشارة المتولدة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبيًا وعند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ Cus يتم sha] التحضين والكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الفعلي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات 0 الحمض النووي nucleic المستهدفة بواسطة وسائل توليد الإشارة خاصة بالإشارة؛ حيث يتم تصميم أحد تتابعي الحمض النووي 71101616 المستهدفين كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف عالية نسبياً ding تصميم الآخر كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ حيث يتم تحديد درجتي الحرارة للكشف بواسطة وسيلتي توليد الإشارة؛ حيث )1( تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة خاصة بالهدف 5 من وسائل توليد لإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) تكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة HME على توليد كل من إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 7100166 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 7101866 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث تشتمل 0 وسيلتي توليد الإشارة على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على واسم فلوري مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات المتولدة بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ (ب) تنفيذ تحليل الانصهار لناتج التحضين من خطوة (أ) خلال مدى من درجات الحرارة لتحديد وجود تتابع الحمض النووي 01001656 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و (ج) تحديد وجود تتابع الحمض النووي 01101616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية Laws 5 عن طريق الإشارة التي يتم الكشف عنها في خطوة (أ) ووجود تتابع الحمض النوويNucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً باستخدام نتيجة تحليل الانصهار في خطوة (ب).0. الطريقة وفقاً لعنصر 19؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي 6 المستهدفة هي وسائل توليد إشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين مزدوج.21. الطريقة وفقاً لعنصر 19؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد «iS oligonucleotides ووسائل توليد إشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد الإشارة عن طريق تكوين المزدوج. 0 22. الطريقة وفقاً لعنصر 19؛ Cus تشتمل وسيلتي توليد الإشارة على واسم مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات من الواسم بواسطة نوع واحد من الكواشف.3. طريقة للكشف عن ثلاثة من تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في die باستخدام تحليل درجة حرارة الكشف وتحليل الانصهار؛ والتي تشتمل على: (أ) تحضين العينة مع وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل للكشف عن تتابعات الحمض النووي nucleic 5 المستهدفة الثلاثة على الأقل في وعاء تفاعل واحد والكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف في درجات حرارة الكشف الثلاثة على الأقل؛ حيث يتم إجراء التحضينوالكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي 7001656 المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد الإشارة الخاصة بالهدف؛ حيث يتم تصميم كل من تتابعات الحمض النووي 01001666 المستهدفة الثلاثة على الأقل 0 كحمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف مختلفة؛ حيث يتم تحديد درجات حرارة الكشف الثلاثة على الأقل بواسطة وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة الحرارة القادرة على توليد ليس فقط إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 0100166 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن Load إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الهدف لتتابع الحمض النووي 7001666 المستهدف الذي له درجة حرارة كشف 5 أعلى من درجة حرارة الكشف؛ حيث تشتمل وسائل alg الإشارة الثلاثة على الأقل على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على واسم فلوري مطابق ولا يتم التمييز بين الإشاراتالتي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ Cus يتم الكشف عن بعض من تتابعات الحمض النووي 7001616 المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة تحليل درجة حرارة الكشف وبتم اجراء الكشف عند كل من درجة حرارة الكشف لبعض تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل المذكورين ودرجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجات حرارة الكشف؛ (ب) اجراء تحليل الانصهار لناتج التحضين لخطوة )1( خلال مدى درجات الحرارة لتحديد وجود تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة أخرى غير بعض تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل المذكورة؛ و (ج) تحديد (1) وجود بعض من تتابعات الحمض النووي 0001666 المستهدفة المذكورة بواسطة 0 الإشارة التي يتم الكشف عنها في خطوة (أ)؛ حيث عندما يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة lad بين بعض من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل المذكورين» يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي يتم 5 الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ حيث عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً من بين درجات Bla الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 01101666 المستهدف بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(2) يتم تحديد وجود تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الأخرى غير البعض المذكور من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل بواسطة نتيجة تحليل 0 الانصهار في خطوة (ب).4. الطريقة وفقاً لعنصر 23( Cus يتم اجراء الخطوة (ج) بواسطة تحديد أولاً وجود تتابع الحمض النووي 0001616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً ثم تحديد على التوالي وجود تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة التي لها درجات حرارة كشف أقل نسبياً بترتيب تنازلي. 5 25. الطريقة وفقاً لعنصر 23؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لكل من تتابعات الحمض النووي 56 المستهدفة هي وسائل توليد الإشارة لتوليد إشارة بطريقة تعتمد على تكوين المزدوج.6. الطريقة وفقاً لعنصر 23؛ حيث تكون وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً هي وسائل توليد الإشارة بواسطة شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides كشف؛ وتكون وسائل توليد الإشارة لتتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الأخرى هي وسائل توليد إشارة بواسطة تكوين المزدوج.27. طريقة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) تحضين العينة مع وسيلتي توليد الإشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي 6 المستهدفة في وعاء تفاعل واحد والكشف عن إشارة متولدة عند درجة حرارة الكشف العالية نسبيًا وعند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ Cus يتم 0 إجراء التحضين والكشف بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي Nucleic المستهدفة بواسطة وسائل توليد الإشارة الخاصة بالإشارة؛ Cua يتم تصميم أحد تتابعي الحمض النووي 71101666 المستهدفين كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف lle نسبياً fing تصميم AY) كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً؛ حيث يتم تحديد درجتي حرارة الكشف بواسطة وسيلتي توليد الإشارة؛ Cus 5 (1) تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع 0 الحمض النووي 0001666 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ حيث تشتمل وسيلتي توليد الإشارة على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على واسم فلوري مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسيلتي توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ حيث وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 70101616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف 5 العالية نسبياً هي وسائل توليد HLA) عن طريق شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides كشف أو عن طريق تكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides توسطمهجن على وجه التحديد مع تتابع الحمض النووي 0110166 المستهدف؛ ووسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 71001616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي وسائل توليد إشارة عن طريق تكوين مزدوج بطريقة تعتمد على شطر أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides توسط مهجن على dag التحديد مع تتابع الحمض النووي nucleic 5 المستهدف؛ و (ب) تحديد وجود اثنين من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة بواسطة الإشارات التي تم الكشف عنها في خطوة (أ)؛ Cus (1) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 71101666 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 0001666 المستهدف الذي له 0 درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً عن طريق الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.8. مجموعة للكشف عن تتابعي الحمض النووي nucleic المستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة كشف مختلفة؛ تشتمل على: (أ) وسيلتي توليد إشارة للكشف عن تتابعي الحمض النووي 01001616 المستهدفين؛ و (ب) تعليمات والتي تصف طريقة أي من العناصر 11-1.9. مجموعة للتنميط الجيني اس ان بي 5800 لتتابع حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل على: (أ) وسائل توليد إشارة للكشف عن ألائل alleles اس ان بي SNP و (ب) تعليمات والتي تصف الطريقة وفقاً لعنصر 12. 0 30. مجموعة للكشف عن ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف»؛ تشتمل على: (أ) ثلاث وسائل توليد إشارة على الأقل للكشف عن تتابعات الحمض النووي NUCIEIC المستهدفة aul على الأقل؛ و (ب) تعليمات lly تصف الطريقة وفقاً لأي من العناصر 19-13. 5 31. مجموعة للكشف عن اثنين من تتابعات حمض نووي مستهدفة في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف وتحليل انصهار؛ تشتمل على:(أ) وسيلتي توليد إشارة للكشف عن اثنين من تتابعات الحمض النووي 01001616 المستهدفة؛ و (ب) تعليمات والتي تصف الطريقة وفقاً لأي من العناصر 23-20.2. مجموعة للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات حمض نووي مستهدفة في عينة باستخدام تحليل درجة حرارة الكشف وتحليل الانصهار؛ تشتمل على: () ثلاث وسائل توليد إشارة على BY) للكشف عن ثلاثة على الأقل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة؛ و (ب) تعليمات والتي تصف الطريقة وفقاً لأي من العناصر 27-24.3. وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة لتحديد وجود تتابعي الحمض النووي nucleic المستهدفين في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة lll 0 تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي كل من إشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً وإشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة بواسطة وسائل توليد إشارة خاصة بالهدف؛ حيث يتم الكشف عن الإشارة المتولدة باستخدام نوع واحد من الكواشف؛ حيث يتم تصميم 5 واحد من تتابعي الحمض النووي 70001666 المستهدفين كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً وتم تصميم AY) كتتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ حيث يتم تحديد درجتي حرارة الكشف بواسطة وسيلتي توليد الإشارة حيث (1) تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف 0 العالية نسبياً و(2) تكون درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 7100166 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي 010001666 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ و (ب) تحديد وجود تتابعي الحمض النووي NUCIEIC المستهدفين بواسطة الإشارة المتلقاة؛ حيث (1) 5 يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي 70101616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) يتم تحديدوجود تتابع الحمض النووي 71001616 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ باستخدام dad مرجعية؛ حيث يتم الحصول على القيمة المرجعية عن طريق (1) تحضين تتابع الحمض النووي Nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن تتابع الحمض النووي 00060 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في خطوة of) (2) الكشف عن الإشارات عند كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف 0 المنخفضة نسبياً.4. جهاز للكشف عن تتابع حمض نووي مستهدف في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل على (أ) معالج كمبيوتر و(ب) وسط التخزين og ial) بالكمبيوتر وفقاً لعنصر 33 مقترن بمعالج الكمبيوتر.5. وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة التنميط 5 الجيني اس ان بي 5800 لتتابع حمض نووي في عينة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل الطريقة على: (أ) تلقي كل من إشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف عالية نسبياً وإشارة يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف منخفضة نسبياً بواسطة كشف تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من ألائل alleles اس ان بي 5800 بواسطة وسائل توليد إشارة خاصة بالأليل؛ حيث يتم 0 تصميم أحد ألائل alleles اس ان بي 5810 كأليل اس ان بي SNP له درجة حرارة كشف عالية نسبياً ويتم تصميم الآخر كأليل اس ان بي SNP له درجة Bm كشف منخفضة نسبياً؛ حيث يتم تحديد درجتي حرارة الكشف بواسطة وسيلتي توليد الإشارة؛ حيث (1) تكون درجة حرارة الكشف العالية نسبياً هي درجة Bla قادرة على توليد إشارة خاصة بالأليل من وسائل توليد الإشارة للأليل اس ان بي 5000 الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً و(2) تكون درجة حرارة الكشف 5 المنخفضة نسبياً هي درجة الحرارة القادرة على توليد كل من إشارة خاصة بالأليل من وسائل توليدالإشارة للأليل اس ان بي SNP الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً وإشارة خاصة بالأليل من وسائل توليد الإشارة للأليل اس ان بي SNP الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً؛ (ب) تحديد النمط الجيني اس ان SNP بواسطة الفرق بين الإشارات الواردة؛ باستخدام قيمة واحدة على الأقل من القيم المرجعية؛ حيث يتم الحصول على قيمة مرجعية واحدة عن Gob )1( تحضين زيجوت متماثلة الألائل alleles تتكون من أليل اس ان بي SNP له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي 580 الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة of) (2) الكشف عن الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة lows و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً 0 والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ يتم الحصول على قيمة مرجعية أخرى بواسطة (1) Guan زيجوت غير متماثلة الألائل alleles تتكون من كل من الأليل اس ان بي 5800 الذي له درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والأليل اس ان بي 5810 الذي له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبيًا مع وسائل توليد إشارة خاصة بالأليل في وعاء تفاعل آخر غير وعاء التفاعل في الخطوة of) (2) الكشف عن الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف 5 العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند day حرارة الكشف المنخفضة نسبياً؛ ويتم الحصول على القيمة المرجعية (AY) بواسطة (1) تحضين زيجوت متماثلة الألائل alleles تتكون من أليل اس ان بي SNP له درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً مع وسائل توليد إشارة للكشف عن أليل اس ان بي 5800 الذي له درجة حرارة 0 الكشف المنخفضة نسبياً في وعاء تفاعل AT غير وعاء التفاعل في الخطوة of) (2) الكشف عن الإشارات في كل من درجة حرارة الكشف العالية نسبياً ودرجة حرارة الكشف المنخفضة clos و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف العالية نسبياً والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المنخفضة نسبياً.6. وسط تخزين مقروء بالكمبيوتر يحتوي على تعليمات لتكوين معالج لتنفيذ طريقة لتحديد وجود 5 ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل في due باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف؛ تشتمل الطريقة على:(أ) تلقي إشارات يتم الكشف عنها عند ثلاث درجات حرارة كشف على الأقل بواسطة تفاعل تضخيم في الوقت الحقيقي؛ حيث يتم الكشف عن كل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة DUN على الأقل بواسطة وسائل توليد إشارة خاصة بالهدف؛ حيث يتم تصميم كل من تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة الثلاثة على الأقل كحمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف مختلفة؛ حيث تكون درجة حرارة الكشف هي درجة حرارة قادرة على توليد ليس فقط إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف ولكن إشارة خاصة بالهدف من وسائل توليد الإشارة Load لتتابع الحمض النووي nucleic المستهدف الذي له درجة حرارة كشف أعلى من درجة حرارة الكشف؛ حيث تشتمل وسائل توليد الإشارة الثلاثة على الأقل على أوليجونيوكليوتيد oligonucleotides يحتوي على 0 واسم فلوري مطابق ولا يتم التمييز بين الإشارات التي يتم توليدها بواسطة وسائل توليد الإشارة بواسطة نوع واحد من الكواشف؛ و (ب) تحديد وجود ثلاث تتابعات حمض نووي مستهدفة على الأقل بواسطة الإشارة الواردة؛ Cus عندما يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف له درجة حرارة كشف معينة من بين تتابعات الحمض النووي NUCleiC المستهدفة الثلاثة على الأقل؛ يتم تحديد وجود تتابع الحمض النووي nucleic 5 المستهدف الذي له درجة حرارة الكشف المعينة بواسطة الفرق بين الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة كشف واحدة أو أكثر أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ باستخدام قيمة مرجعية واحدة على الأقل من بين القيم المرجعية؛ حيث يتم الحصول على القيم المرجعية عن طريق )1( تحضين جميع توليفات تتابعات الحمض النووي nucleic المستهدفة التي لها درجات حرارة RES أعلى من درجة حرارة الكشف المعينة مع وسائل توليد الإشارة المقابلة في وعاء تفاعل AT غير وعاء التفاعل في خطوة (أ)؛ (2) الكشف عن الإشارات ليس فقط عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة ولكن أيضاً درجة حرارة الكشف المعينة؛ و(3) ثم الحصول على الفرق بين الإشارة التي تم الكشف عنها عند واحدة أو أكثر من درجات حرارة الكشف الأعلى من درجة حرارة الكشف المعينة والإشارة التي تم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة؛ 5 حيث عندما تكون درجة حرارة الكشف المعينة هي درجة حرارة الكشف الأعلى نسبياً من بيندرجات حرارة الكشف؛ يتم تحديد وجود تتابع حمض نووي مستهدف بواسطة الإشارة التي يتم الكشف عنها عند درجة حرارة الكشف المعينة.عا اناب ب١ شكل yo, Ee 1 deh «2 | aE i HE Er x حر‘ . ا ٍ Se EEE] va Ye # oh i oH Foe ¥ & & م ا iF Ra ¥ 5 ’ ig 6: : ب ا ا % = bd ص wa ba - rg : 4 دجمو مدي آم اله jo ABR 8 ا a . ماع ممويه عضاو ا En EERE ERTS Deo ل ل TEL : ¥ 3 + ا * £ ¥ ¥ مج= عا _الشكل آب 8 Pe E Arad 1 . ب EN ¥ & £ i = A 2 2,2 0 12 dH fs LE 4d ¥ 3% 2 2 محم كيم حيبت رصي هي 0 تاي + hE S HEE 3 ; 3 eT XE م 0 Ce art HE cl . . سق ES ES Te SE i يع rp ro prs ا الع جتن CO RR مجم =a, و _" : * You ¥ Ys ا مجمالا با __ لاا عع تماما _ساLIL =LILIالحاضهة الهيلة السعودية الملضية الفكرية Swed Authority for intallentual Property pW RE .¥ + \ ا 0 § ام 5 + < Ne ge ”بن اج > عي كي الج دا لي ايام TEE ببح ةا Nase eg + Ed - 2 - 3 .++ .* وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها of سقوطها لمخالفتها ع لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف ع النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية. »> صادرة عن + ب ب ٠. ب الهيئة السعودية للملكية الفكرية > > > ”+ ص ب 101١ .| لريا 1*١ uo ؛ المملكة | لعربية | لسعودية SAIP@SAIP.GOV.SA
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20140037310 | 2014-03-28 | ||
| US201461979545P | 2014-04-15 | 2014-04-15 | |
| PCT/KR2014/004173 WO2015147370A1 (en) | 2014-03-28 | 2014-05-09 | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
| PCT/KR2014/006714 WO2015147382A1 (en) | 2014-03-28 | 2014-07-23 | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA516371903B1 true SA516371903B1 (ar) | 2022-10-02 |
Family
ID=54195861
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA516371903A SA516371903B1 (ar) | 2014-03-28 | 2016-09-26 | الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US10752938B2 (ar) |
| EP (3) | EP3122896B1 (ar) |
| JP (1) | JP6620110B2 (ar) |
| KR (6) | KR102016748B1 (ar) |
| CN (3) | CN110452962A (ar) |
| AU (2) | AU2014387732B2 (ar) |
| BR (1) | BR112016021782B1 (ar) |
| CA (1) | CA2941880C (ar) |
| DK (1) | DK3122897T3 (ar) |
| ES (1) | ES2964624T3 (ar) |
| FI (1) | FI3122897T3 (ar) |
| IL (1) | IL248034B (ar) |
| MX (1) | MX2016012508A (ar) |
| MY (1) | MY181022A (ar) |
| NZ (1) | NZ725593A (ar) |
| PL (1) | PL3122897T3 (ar) |
| PT (1) | PT3122897T (ar) |
| RU (1) | RU2678403C2 (ar) |
| SA (1) | SA516371903B1 (ar) |
| SG (1) | SG11201607510QA (ar) |
| WO (4) | WO2015147370A1 (ar) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3544015B1 (en) | 2012-02-03 | 2024-10-23 | California Institute of Technology | Signal encoding and decoding in multiplexed biochemical assays |
| EP3901243A1 (en) | 2012-08-03 | 2021-10-27 | California Institute of Technology | Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements |
| WO2015147370A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
| JP6734851B2 (ja) | 2014-12-09 | 2020-08-05 | シージーン アイエヌシー | ターゲット核酸配列に対するシグナルの区別 |
| KR102016747B1 (ko) * | 2014-12-09 | 2019-09-02 | 주식회사 씨젠 | 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 타겟 핵산 서열의 검출 |
| US11485998B2 (en) | 2015-12-15 | 2022-11-01 | Seegene, Inc. | Signal extraction for a target nucleic acid sequence |
| KR102110999B1 (ko) * | 2016-01-26 | 2020-05-14 | 주식회사 씨젠 | 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제공하는 방법 |
| CN109601008B (zh) * | 2016-04-01 | 2023-02-28 | 克罗玛科德公司 | 用于工程化信号产生的竞争性探针 |
| EP3512959B1 (en) | 2016-09-15 | 2021-08-11 | Roche Diagnostics GmbH | Methods for performing multiplexed pcr |
| KR102408564B1 (ko) * | 2017-03-28 | 2022-06-14 | 주식회사 씨젠 | 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널 |
| WO2019045532A2 (en) * | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Seegene, Inc. | EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS |
| WO2019135567A1 (en) | 2018-01-05 | 2019-07-11 | Seegene, Inc. . | Method for determining the presence or absence of m. tuberculosis, m. bovis and m. bovis bcg in a sample |
| KR20200115552A (ko) * | 2018-01-22 | 2020-10-07 | 루미넥스 코포레이션 | 별개의 용융 분석을 위한 방법 및 조성물 |
| BR112020019755A2 (pt) * | 2018-04-20 | 2021-01-26 | Seegene, Inc. | método e aparelho para detectar uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos alvo na amostra |
| JP7221491B2 (ja) * | 2018-09-18 | 2023-02-14 | 株式会社ミズホメディー | 複数の標的核酸を検出するキットを用いる検出方法 |
| JP7477183B2 (ja) * | 2019-04-22 | 2024-05-01 | ポステック・リサーチ・アンド・ビジネス・ディベロップメント・ファウンデーション | 新規な等温単一反応用プローブセット及びその用途 |
| JP7353396B2 (ja) | 2019-06-14 | 2023-09-29 | シージーン アイエヌシー | ターゲット核酸検出用試薬の協業開発のためのコンピュータ処理方法 |
| KR102107589B1 (ko) | 2019-11-20 | 2020-05-07 | 주식회사 유진셀 | 단일 신호 형광 물질을 이용한 실시간 타겟 핵산 검출 및 정량 방법 |
| KR20220108959A (ko) | 2021-01-28 | 2022-08-04 | 주식회사 엘지에너지솔루션 | 리튬-황 전지용 전해액 및 이를 포함하는 리튬-황 전지 |
| CA3224348A1 (en) * | 2021-06-17 | 2022-12-22 | Seegene, Inc. | Detection of multiple target nucleic acid using multiple detection temperatures |
| US20230068047A1 (en) * | 2021-08-19 | 2023-03-02 | Luminex Corporation | Digital amplification assay analysis method |
| KR20240093623A (ko) | 2021-10-21 | 2024-06-24 | 주식회사 씨젠 | 시료 내 표적 분석물질에 대한 양음성 판독 장치 및 방법 |
| KR20240141247A (ko) | 2022-01-26 | 2024-09-26 | 주식회사 씨젠 | 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법 |
| AU2023250083A1 (en) * | 2022-04-08 | 2024-10-17 | Seegene, Inc. | Method for detecting three target nucleic acids in sample |
| WO2024010351A1 (ko) * | 2022-07-05 | 2024-01-11 | 주식회사 씨젠 | 복수의 표적 분석물 각각에 대한 근사 신호의 획득 방법 및 이를 수행하는 컴퓨터 장치 |
| WO2024015875A2 (en) | 2022-07-12 | 2024-01-18 | Abrus Bio, Inc. | Determination of protein information by recoding amino acid polymers into dna polymers |
| WO2024080818A1 (ko) * | 2022-10-14 | 2024-04-18 | 주식회사 씨젠 | 상이한 tm 값을 가지는 2개의 프로브를 이용하여 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법 |
Family Cites Families (57)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4351760A (en) | 1979-09-07 | 1982-09-28 | Syva Company | Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates |
| US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
| DE68926504T2 (de) | 1988-07-20 | 1996-09-12 | David Segev | Verfahren zur amplifizierung und zum nachweis von nukleinsäuresequenzen |
| CA2020958C (en) | 1989-07-11 | 2005-01-11 | Daniel L. Kacian | Nucleic acid sequence amplification methods |
| US5427930A (en) | 1990-01-26 | 1995-06-27 | Abbott Laboratories | Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction |
| AU635105B2 (en) | 1990-01-26 | 1993-03-11 | Abbott Laboratories | Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions |
| US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
| US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
| US5965364A (en) | 1990-10-09 | 1999-10-12 | Benner; Steven Albert | Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives |
| US6037120A (en) | 1995-10-12 | 2000-03-14 | Benner; Steven Albert | Recognition of oligonucleotides containing non-standard base pairs |
| US5455166A (en) | 1991-01-31 | 1995-10-03 | Becton, Dickinson And Company | Strand displacement amplification |
| US5556751A (en) | 1991-04-25 | 1996-09-17 | Amoco Corporation | Selective amplification system using Q-β replicase |
| JPH06153997A (ja) * | 1992-11-27 | 1994-06-03 | Canon Inc | 検出信号増幅による標的核酸の検出方法 |
| US5541311A (en) | 1992-12-07 | 1996-07-30 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase |
| EP0730662A4 (en) | 1993-09-10 | 1999-11-24 | Genevue Inc | OPTICAL DETECTION OF THE POSITION OF OLIGONUCLEOTIDES ON LARGE DNA MOLECULES |
| US5538848A (en) | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
| CA2255774C (en) * | 1996-05-29 | 2008-03-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid sequence differences using coupled ligase detection and polymerase chain reactions |
| AU726501B2 (en) | 1996-06-04 | 2000-11-09 | University Of Utah Research Foundation | Monitoring hybridization during PCR |
| US6117635A (en) | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6194149B1 (en) | 1998-03-03 | 2001-02-27 | Third Wave Technologies, Inc. | Target-dependent reactions using structure-bridging oligonucleotides |
| US6031098A (en) * | 1997-08-11 | 2000-02-29 | California Institute Of Technology | Detection and treatment of duplex polynucleotide damage |
| GB9812768D0 (en) | 1998-06-13 | 1998-08-12 | Zeneca Ltd | Methods |
| WO2000063365A1 (en) | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Pangene Corporation | Locked nucleic acid hybrids and methods of use |
| EP1190097A2 (en) | 1999-06-22 | 2002-03-27 | Invitrogen Corporation | Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids |
| DK1715063T3 (da) | 2000-03-29 | 2011-05-16 | Lgc Ltd | Hydridiseringsbeacon og fremgangsmåde til hurtig sekvensdetektion og distinktion |
| EP1313879A2 (en) * | 2000-04-10 | 2003-05-28 | Matthew Ashby | Methods for the survey and genetic analysis of populations |
| AU7125401A (en) | 2000-05-19 | 2001-12-03 | David J Marshall | Materials and methods for detection of nucleic acids |
| US6350580B1 (en) * | 2000-10-11 | 2002-02-26 | Stratagene | Methods for detection of a target nucleic acid using a probe comprising secondary structure |
| US7309573B2 (en) | 2000-11-21 | 2007-12-18 | Stratagene California | Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification |
| AU2002329063A1 (en) * | 2002-09-30 | 2004-04-23 | F.Hoffmann-La Roche Ag | Oligonucleotides for genotyping thymidylate synthase gene |
| DE60300339T2 (de) * | 2003-08-25 | 2006-04-13 | Mtm Laboratories Ag | Verfahren zum Nachweis von Karzinomen in solubilisierten zervikalen Körperproben |
| US20050053950A1 (en) | 2003-09-08 | 2005-03-10 | Enrique Zudaire Ubani | Protocol and software for multiplex real-time PCR quantification based on the different melting temperatures of amplicons |
| WO2005047521A2 (en) * | 2003-11-10 | 2005-05-26 | Investigen, Inc. | Methods of preparing nucleic acid for detection |
| US8407013B2 (en) * | 2005-06-07 | 2013-03-26 | Peter K. Rogan | AB initio generation of single copy genomic probes |
| EP3168766B1 (en) * | 2005-09-20 | 2023-08-16 | University of Utah Research Foundation | Genotyping method for a plurality of samples |
| US9234232B2 (en) * | 2008-07-31 | 2016-01-12 | Oxitec Limited | Multiplex amplification and detection |
| AU2009279457A1 (en) * | 2008-08-08 | 2010-02-11 | Smiths Detection Inc. | Detection algorithm for PCR assay |
| JP5509075B2 (ja) * | 2008-12-16 | 2014-06-04 | アークレイ株式会社 | 核酸増幅のコントロールの検出方法およびその用途 |
| US8039215B2 (en) * | 2009-03-10 | 2011-10-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay |
| WO2011037306A1 (en) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences by cyclic exonucleolytic reactions |
| KR101569476B1 (ko) | 2009-12-21 | 2015-11-16 | 주식회사 씨젠 | Ｔｓｇ프라이머 타겟 검출 |
| JP5901046B2 (ja) * | 2010-02-19 | 2016-04-06 | 国立大学法人 千葉大学 | ＯＡＴＰ１Ｂ３ｍＲＮＡの新規な選択的スプライシングバリアント |
| US20130295570A1 (en) | 2010-10-07 | 2013-11-07 | Brandeis University | Compositions and methods for nucleic acid based diagnostic assays |
| GB201017978D0 (en) * | 2010-10-25 | 2010-12-08 | Oxitec Ltd | Multiplex amplification and detection |
| MX2017015093A (es) | 2011-01-11 | 2023-03-10 | Seegene Inc | Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto. |
| US20140057263A1 (en) * | 2011-03-24 | 2014-02-27 | Qiagen Gmbh | Modified hybridization probes |
| KR101569479B1 (ko) * | 2011-03-29 | 2015-11-16 | 주식회사 씨젠 | Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 절단에 의한 타겟 핵산서열의 검출 |
| KR20130101952A (ko) | 2012-02-02 | 2013-09-16 | 주식회사 씨젠 | Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출 |
| JP5976849B2 (ja) * | 2012-03-05 | 2016-08-24 | シージーン アイエヌシー | ＰＴＯ切断及び伸長アッセイによるターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異検出｛ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＶａｒｉａｔｉｏｎｏｎＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎＡｓｓａｙ｝ |
| EP3901243A1 (en) * | 2012-08-03 | 2021-10-27 | California Institute of Technology | Multiplexing and quantification in pcr with reduced hardware and requirements |
| WO2015147370A1 (en) * | 2014-03-28 | 2015-10-01 | Seegene, Inc. | Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures |
| DE102014105129B3 (de) * | 2014-04-10 | 2015-07-02 | Kist Europe-Korea Institute of Science and Technologie Europe Forschungsgesellschaft mbh | Verfahren und Master-Mix für die quantitative Echtzeit-PCR für Multiplex-Ziel-Nukleinsäuremoleküle |
| JP6734851B2 (ja) * | 2014-12-09 | 2020-08-05 | シージーン アイエヌシー | ターゲット核酸配列に対するシグナルの区別 |
| WO2018044831A1 (en) * | 2016-08-30 | 2018-03-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Cleavable hairpin primers |
-
2014
- 2014-05-09 WO PCT/KR2014/004173 patent/WO2015147370A1/en active Application Filing
- 2014-06-17 US US15/124,700 patent/US10752938B2/en active Active
- 2014-06-17 WO PCT/KR2014/005309 patent/WO2015147377A1/en active Application Filing
- 2014-06-17 EP EP14886915.9A patent/EP3122896B1/en active Active
- 2014-07-23 WO PCT/KR2014/006714 patent/WO2015147382A1/en active Application Filing
- 2014-12-09 WO PCT/KR2014/012074 patent/WO2015147412A1/en active Application Filing
- 2014-12-09 CN CN201910807436.4A patent/CN110452962A/zh active Pending
- 2014-12-09 NZ NZ725593A patent/NZ725593A/en unknown
- 2014-12-09 MX MX2016012508A patent/MX2016012508A/es unknown
- 2014-12-09 SG SG11201607510QA patent/SG11201607510QA/en unknown
- 2014-12-09 JP JP2016556868A patent/JP6620110B2/ja active Active
- 2014-12-09 KR KR1020187007421A patent/KR102016748B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 RU RU2016139287A patent/RU2678403C2/ru active
- 2014-12-09 FI FIEP14887573.5T patent/FI3122897T3/fi active
- 2014-12-09 US US15/124,977 patent/US20170247750A1/en active Pending
- 2014-12-09 ES ES14887573T patent/ES2964624T3/es active Active
- 2014-12-09 DK DK14887573.5T patent/DK3122897T3/da active
- 2014-12-09 CN CN201480077317.3A patent/CN106103740A/zh active Pending
- 2014-12-09 CA CA2941880A patent/CA2941880C/en active Active
- 2014-12-09 KR KR1020197034833A patent/KR102210548B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 KR KR1020227034325A patent/KR102604951B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 PL PL14887573.5T patent/PL3122897T3/pl unknown
- 2014-12-09 PT PT148875735T patent/PT3122897T/pt unknown
- 2014-12-09 BR BR112016021782-9A patent/BR112016021782B1/pt active IP Right Grant
- 2014-12-09 EP EP23190117.4A patent/EP4269607A3/en active Pending
- 2014-12-09 MY MYPI2016703229A patent/MY181022A/en unknown
- 2014-12-09 AU AU2014387732A patent/AU2014387732B2/en active Active
- 2014-12-09 KR KR1020167029473A patent/KR102050601B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 KR KR1020217002697A patent/KR102358734B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 KR KR1020227003377A patent/KR102509130B1/ko active IP Right Grant
- 2014-12-09 EP EP14887573.5A patent/EP3122897B1/en active Active
- 2014-12-09 CN CN202010806475.5A patent/CN111893171A/zh active Pending
-
2016
- 2016-09-26 IL IL248034A patent/IL248034B/en unknown
- 2016-09-26 SA SA516371903A patent/SA516371903B1/ar unknown
-
2018
- 2018-06-27 AU AU2018204665A patent/AU2018204665B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-17 US US16/931,545 patent/US20200340043A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SA516371903B1 (ar) | الكشف عن تتابعات حمض نووي مستهدفة باستخدام درجات حرارة مختلفة للكشف | |
| ES2475190T3 (es) | Método para discriminar polimorfismos mononucleot�dicos (SNP) | |
| KR102016747B1 (ko) | 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용한 타겟 핵산 서열의 검출 | |
| US11859243B2 (en) | Differentiation of signals for target nucleic acid sequences | |
| JP4937106B2 (ja) | 遺伝子検知方法 | |
| RU2780587C2 (ru) | Детекция нуклеотидных последовательностей-мишеней с использованием разных температур детекции | |
| Smith et al. | Detection of Genetic Variations in Coagulopathy‐Related Genes Using Ramified Rolling Circle Amplification |