JP2017518028A - 相異なる検出温度を利用したターゲット核酸配列の検出 - Google Patents

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Abstract

本発明は、相異なる検出温度を利用したターゲット核酸配列の検出に関する。相異なる検出温度を利用する本発明は、１つの反応容器で、単一類型の標識だけをもって、従来のリアルタイム方式で複数のターゲット核酸配列を検出することができる。従来技術は、ターゲット増幅後、メルティング分析を通じて複数のターゲット核酸配列を検出する。これに対し、本発明は、ターゲット増幅後、メルティング分析を必要としないため、分析時間が画期的に短縮される。【選択図】図１Ａ

Description

本発明は、相異なる検出温度を利用したターゲット核酸配列の検出に関する。
ターゲット核酸配列の検出のために、リアルタイム（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）方式でターゲット増幅をモニタリングしながらターゲット核酸配列が検出できるリアルタイム検出方法が広く利用されている。リアルタイム検出方法は、一般にターゲット核酸配列と特異的にハイブリダイズされる、標識されたプローブまたはプライマーを利用する。標識されたプローブ及びターゲット核酸配列間のハイブリダイゼーションを利用する方法の例は、ヘアピン構造を有する二重標識されたプローブを利用する分子ビーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ）方法（非特許文献１）、ＨｙＢｅａｃｏｎ方法（非特許文献２）、供与体（ｄｏｎｏｒ）及び受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）でそれぞれ標識された２つのプローブを利用したハイブリダイゼーションプローブ方法（非特許文献３）及び単一標識されたオリゴヌクレオチドを利用したＬｕｘ方法（特許文献１）を含む。二重標識されたプローブとＤＮＡ重合酵素の５’−ヌクレアーゼ活性による前記プローブの切断を利用したＴａｑＭａｎ方法（特許文献２及び３）が本技術分野で広く利用されている。
標識されたプライマーを利用する方法の例は、サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）プライマー方法（非特許文献４及び特許文献４）及びスコーピオン（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）プライマー方法（非特許文献５及び特許文献５）及びＴＳＧプライマー方法（特許文献６）を含む。
代替接近法として、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成されるデュープレックス（ｄｕｐｌｅｘ）を利用するリアルタイム検出方法が提案された：Ｉｎｖａｄｅｒ分析（特許文献７−９）、ＰＴＯ切断及び延長（ＰＴＯ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）方法（特許文献１０）、ＰＴＯ切断及び延長−依存的シグナリングオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ＰＣＥ−ＳＨ）方法（特許文献１１）、ＰＴＯ 切断及び延長依存的非ハイブリダイゼーション（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ； ＰＣＥ−ＮＨ）方法（特許文献１２）。
上述の従来リアルタイム検出技術は、ターゲット増幅と関係あるいは無関係のシグナル増幅過程において、一つの選択された検出温度で蛍光標識から発生したシグナルを検出する。従来リアルタイム検出技術によって、一つの反応チューブで、単一類型の標識を利用して複数のターゲット核酸配列を検出する場合、ターゲット核酸配列に対して発生されたシグナルは、互いに区別されない。したがって、従来リアルタイム検出技術は、一般に、複数のターゲット核酸配列を検出するために、相異なる類型の標識を利用する。Ｔｍ差を利用するメルティング分析は、単一類型の標識を利用する場合でも、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。しかし、メルティング分析は、リアルタイム技術より施行時間がさらに長く、ターゲット核酸配列が増加するほど、相異なるＴｍ値を有するプローブのデザインがだんだん難しくなるという点で、深刻な欠点を有している。
したがって、メルティング分析に依存しない、１つの反応容器で単一類型の標識及び単一類型の検出器を利用して複数のターゲット核酸配列を検出するための新規方法または接近法が開発される場合、非常に向上した便宜性、費用−効果及び効率性で複数のターゲット核酸配列を検出することができる。また、前記新規方法を他の検出方法（例えば、メルティング分析）と組み合わせれば、非常に向上した効率で、１つの反応容器で単一類型の標識を利用し、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。
本明細書全体にかけて多数の特許及び文献が参照され、その引用が表示されている。このような特許及び文献の公開は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第７，５３７，８８６号 米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第５，５３８，８４８号 米国特許第６，１１７，６３５号 米国特許第６，３２６，１４５号 国際公開第２０１１／０７８４４１号 米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第６，３５８，６９１号 米国特許第６，１９４，１４９号 国際公開第２０１２／０９６５２３号 国際公開第２０１３／１１５４４２号 ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２
Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１４ ＭＡＲＣＨ １９９６ Ｆｒｅｎｃｈ ＤＪら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ， １５（６）：３６３−３７４（２００１） Ｂｅｒｎａｄら， １４７−１４８ Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ２０００； ４６ Ｎａｚａｒｅｎｋｏら， ２５１６−２５２１ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９９７， ｖ．２５ ｎｏ．１２ Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら， ８０４−８０７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１７ ＡＵＧＵＳＴ １９９９
本発明者らは、１つの反応容器で単一類型の標識及び単一類型の検出器を利用し、複数のターゲット核酸配列を検出するための新規な方法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、調節された検出温度でターゲット核酸配列に対するシグナルを得た後、検出結果を適合に解析することにより、非常に向上した便宜性、費用−効果及び効率性で、１つの反応容器で単一類型の標識及び単一類型の検出器を利用し、複数のターゲット核酸配列を検出することができることを確認した。
したがって、本発明の目的は、相異なる検出温度を利用し、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法及びキットを提供することにある。
本発明の他の目的は、相異なる検出温度を利用し、試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析する方法及びキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、相異なる検出温度を利用し、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法及びキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用し、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法及びキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、検出温度分析及びメルティング分析を利用し、少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法及びキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、相異なる検出温度を利用して試料内のターゲット核酸配列を検出するための装置を提供することにある。
本発明のまた他の目的は、試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されるコンピュータープログラムを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
本発明の最も大きい特徴は、１つの反応容器で、単一類型の標識及び単一類型の検出器を利用して、複数のターゲット核酸配列を検出することである。相異なる検出温度を利用する本発明は、１つの反応容器で、単一類型の標識を利用する場合でも、複数のターゲット核酸配列を検出することができる。本発明の構成は、本発明の特徴に合わせて選択されて、ターゲット核酸配列を検出するための驚くべきプロセスになる。
従来のリアルタイムＰＣＲ方法は、１つの反応容器で２つのターゲット核酸配列を検出するために、２つの類型の蛍光標識またはメルティング分析が必要である。
本発明は、１つの反応容器で単一類型の蛍光標識を利用し、２つのターゲット核酸配列を検出するリアルタイムＰＣＲプロトコールを可能にする。択一的に、本発明は、２つのターゲット核酸配列の１つをリアルタイムＰＣＲを利用して検出し、他の１つをメルティング分析を利用して検出することにより、２つのターゲット核酸配列を検出することができる。
本発明は、ターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段によって、温度によってシグナルの検出を調節することができるという本発明者らの研究結果を利用する。
例えば、第１ターゲット核酸配列の検出のために、ターゲット核酸配列とプローブのハイブリダイゼーションによるシグナル発生手段を使用する場合、プローブが第１ターゲット核酸配列とハイブリダイズされる温度で、第１ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが発生し、検出できる。これと対照的に、プローブが第１ターゲット核酸配列とハイブリダイズされない温度では、シグナルが発生せず、検出されない。このような観点で、シグナル発生手段によって、シグナルが発生される温度とシグナルが発生されない温度があるということが分かる。
このようなシグナル発生手段において、プローブが第１ターゲット核酸配列とハイブリダイズされる温度が第１ターゲット核酸配列に対する検出温度として使用できる。プローブが第１ターゲット核酸配列とハイブリダイズされない温度は、検出温度として使用できない。
また、第２ターゲット核酸配列の検出のためにプローブハイブリダイゼーションが使用される場合、第２ターゲット核酸配列の検出温度は、シグナルが発生する温度範囲とシグナルが発生しない温度範囲があるということを考慮して決定できる。
第２ターゲット核酸配列の検出のために使用されるプローブのＴｍ値が第１ターゲット核酸配列の検出のためのプローブのＴｍ値より低い場合、第２ターゲット核酸配列に対するシグナルは発生されない相対的にさらに高い温度で、第１ターゲット核酸配列に対するシグナルを検出することができる。即ち、２つのターゲット核酸配列に対する２つのシグナル発生手段間には、シグナルが発生して検出される温度で相違がある。
試料内に前記２つのターゲット核酸配列が共存する場合、第１ターゲット核酸配列に対するシグナルは発生させて、第２ターゲット核酸配列に対するシグナルは発生させない温度範囲がある。一方、前記温度範囲より低い温度範囲では、前記２つのターゲット核酸配列に対するシグナルが発生される。
２つの温度範囲を考慮して、ターゲット核酸配列のそれぞれに対する検出温度が決定できる。相対的高温検出温度は、前者の温度範囲から選択されて、前記相対的高温検出温度は、第１ターゲット核酸配列に割り当てられる。相対的低温検出温度は、後者の温度範囲から選択されて、前記相対的低温検出温度は、第２ターゲット核酸配列に割り当てられる。
本発明によると、第１ターゲット核酸配列の存在を決定するために、相対的高温検出温度におけるシグナルを測定する。本発明によると、前記相対的高温検出温度における検出は、第１ターゲット核酸配列の存在を決定できる。
本発明の重要な技術的特徴は、相対的低温検出温度を有する第２ターゲット核酸配列の存在を決定するために、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナルを両方とも使用して、相対的低温検出温度で検出されたシグナルを確認することである。
択一的に、本発明者らは、相異なる検出温度を利用することにより、第１ターゲット核酸配列が相対的高温検出温度で検出できて、他のシグナル発生接近法であるメルティング分析を利用して、第２ターゲット核酸配列が検出できることを考慮した。メルティング分析のために使用されたシグナル発生手段は、リアルタイム検出過程の間、特定温度でシグナルを提供することができる。したがって、２つのターゲット核酸配列の１つがメルティング分析により検出される場合でも、２つのターゲット核酸配列は、互いに相異なる検出温度を有する必要がある。
本発明は、下記のように、多様な様態で具現できる：
（ａ）相異なる検出温度を利用した試料内の２つのターゲット核酸配列の検出；
（ｂ）相異なる検出温度を利用した試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型分析；
（ｃ） 相異なる検出温度を利用した試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出；
（ｄ）相異なる検出温度及びメルティング分析を利用した試料内の２つのターゲット核酸配列の検出；及び
（ｅ）検出温度分析及びメルティング分析を利用した試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出。
本発明の特徴及び利点を要約すると、以下のようである：
（ａ）相異なる検出温度を利用する本発明は、１つの反応容器で単一類型の標識だけでも、従来のリアルタイム方式で複数のターゲット核酸配列を検出することができる。従来技術は、ターゲット増幅後、メルティング分析により複数のターゲット核酸配列を検出する。これに対し、本発明は、ターゲット増幅後、メルティング分析を必要としないため、分析時間が画期的に短縮される。
（ｂ）興味深いことに、本発明者らは、シグナル発生手段を利用してターゲット核酸配列に対するシグナルが発生される場合、（ｉ）シグナル発生手段の類型によって、特定温度でシグナルの検出が調節可能であり、（ｉｉ）選択された２つの検出温度でシグナルを検出する場合、前記２つの検出温度で検出されたシグナルは、特定パターンによって変わるということを確認した。本発明者らは、これをターゲット核酸配列の検出に適用することにより、本発明を達成した。
（ｃ）相異なる検出温度を利用する本発明において、それぞれのターゲット核酸配列に対し、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを提供するシグナル発生手段の使用（例えば、ＰＴＯＣＥベースの方法）は、予期しない結果を誘導する。その一、ＰＴＯＣＥベースの方法のような媒介オリゴヌクレオチドを利用する方法は、形成されたデュープレックスのＴｍ値を容易に調節でき、検出温度の容易な選択を可能にする。その二、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたプローブから直接的にシグナルを提供する方法を、ターゲット増幅のための５’−ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素を利用する方法と共に利用する場合、前記プローブが前記５’−ヌクレアーゼ活性により切断される可能性があり、これは、シグナル解析に影響を与える。前記ＰＴＯＣＥベースの方法のような媒介オリゴヌクレオチドを利用する方法は、一般に、５’−ヌクレアーゼ活性による媒介オリゴヌクレオチドの切断を利用するため、結果シグナルの解析に係るこのような問題点が通常的に発生しない。最後に、ＰＴＯＣＥベースの方法のような媒介オリゴヌクレオチドを利用する方法において、前記デュープレックスは、ターゲット核酸配列と関係ない配列を有するため、特定Ｔｍ値を有するデュープレックスが形成できる。これに対し、ターゲット核酸配列に直接的にハイブリダイズされるプローブを利用する方法では、形成されたデュープレックスの少なくとも一本がターゲット核酸配列に相補的な配列を含んでいるため、ターゲット核酸配列上に変異が存在する場合、意図しないＴｍ値を有するデュープレックスが形成できる。
（ｄ）リアルタイム方式で相異なる検出温度を利用して複数のターゲット核酸配列を検出する本発明の一具現例において、（ｉ）１つのターゲット核酸配列に対して、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段（例えば、ＴａｑＭａｎ方法）及び（ｉｉ）他のターゲット核酸配列に対して、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを提供するシグナル発生手段（例えば、ＰＴＯＣＥ−ベースの方法）の組み合わせは、予期しない結果を誘導することができる。
前記検出オリゴヌクレオチドの切断を利用する方法は、前記検出オリゴヌクレオチドの切断のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）を一般に利用する。検出プローブの直接的なハイブリダイゼーションによりシグナルを発生させる従来方法（例えば、分子ビーコン方法、ハイブリダイゼーションプローブ方法またはＨｙｂｅａｃｏｎ方法）において、前記検出プローブは、５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）により切断される可能性が非常に高い。前記検出プローブの切断は、検出プローブの消耗による敏感度減少を引き起こす可能性があり（例えば、ハイブリダイゼーションプローブ方法）、または切断−依存的なシグナリングを利用する方法において、擬陽性シグナルを引き起こすことがある（例えば、分子ビーコン方法）。標識されたプライマー方法（例えば、サンライズ方法またはスコーピオン方法）は、前記プローブ方法のような切断に対する問題はないが、検出温度を調節するために、増幅産物自体のＴｍ値を調節しなければならない短所がある。これに対し、前記ＰＴＯＣＥ−ベースの方法は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断を利用するため、５’−ヌクレアーゼ活性を有する酵素（特に、Ｔａｑ重合酵素）による影響を受けない。また、前記ＰＴＯＣＥ−ベースの方法は、形成されたデュープレックスのＴｍ値を容易に調節することができ、検出温度の容易な選択を可能にする。
（ｅ）一部ターゲットに対してリアルタイム検出を利用して、その他のターゲットに対してメルティング分析を利用することにより、１つの反応容器で複数のターゲット核酸配列を検出する本発明の一具現例において、分析されるターゲット核酸配列の特性に好適なシグナル発生手段が選択されて適用でき、これは、より効率的な方式で複数のターゲット核酸配列を検出できるようにする。
（ｆ）リアルタイム検出及びメルティング分析を利用して、複数のターゲット核酸配列を検出する本発明の一具現例において、リアルタイム方式で検出されるターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段として、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナル発生させるシグナル発生手段（例えば、ＴａｑＭａｎ方法）は、非常に向上した便宜性及び効率で複数のターゲット核酸配列を検出できるようにする。ＴａｑＭａｎ方法のような検出オリゴヌクレオチドの切断を利用する方法は、検出プローブの切断が起こる。特定反応条件において、大部分の検出プローブを切断させることができる。このような場合、リアルタイム反応後、メルティング分析でシグナルを発生できるデュープレックスは存在せず、これにより、メルティング分析により検出される他のターゲット核酸配列に対するＴｍ値が容易に選択できる。
（ｇ）リアルタイム検出及びメルティング分析により複数のターゲット核酸配列を検出する本発明の一具現例において、（ｉ）１つのターゲット核酸配列に対して、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナル発生させるシグナル発生手段（例えば、ＴａｑＭａｎ方法）及び（ｉｉ）他のターゲット核酸配列に対して、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを提供するシグナル発生手段（例えば、ＰＴＯＣＥベースの方法）の組み合わせは、予期しない結果を誘導することができる。
ターゲット核酸配列及び検出オリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションを利用する従来技術によると、プローブ切断による敏感度減少（メルティング分析における敏感度減少も含む）及び切断による擬陽性発生のような深刻な問題点がある。本発明は、このような問題から完全に自由である。前記ＰＴＯＣＥベースの方法は、検出するために利用されるデュープレックスのＴｍ値を容易に調節することができ、これにより、リアルタイム検出のために使用される検出温度及びメルティング分析のために使用されるピークＴｍ値が容易に選択できる。
図１Ａは、相対的高温検出温度（７２℃）を有するターゲット核酸配列（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのゲノムＤＮＡ， ＣＴ）、相対的低温検出温度（６０℃）を有するターゲット核酸配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ， ＮＧ）及びこれらの組み合わせを検出するために、相異なる検出温度を利用した本発明の検出結果を示す。前記ＣＴ及びＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。 図１Ｂは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の比率により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示す。 図１Ｃは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の比率をプロッティングして、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示す。 図１Ｄは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示し、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、閾値に変形されて、前記相違を得るために使用される。 図１Ｅは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示し、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、閾値に変形されて、前記相違を得るために使用される。 図２Ａは、相対的高温検出温度（７２℃）を有するターゲット核酸配列（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのゲノムＤＮＡ， ＣＴ）、相対的低温検出温度（６０℃）を有するターゲット核酸配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ， ＮＧ）及びこれらの組み合わせを検出するために、相異なる検出温度を利用した本発明の検出結果を示す。前記ＣＴに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ方法により発生されて、前記ＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。 図２Ｂは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の比率により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示す。 図２Ｃは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の比率をプロッティングして、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示す。 図２Ｄは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示し、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、閾値に変形されて、前記相違を得るために使用される。 図２Ｅは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違により、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを示し、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、閾値に変形されて、前記相違を得るために使用される。 図３は、相異なる検出温度を利用するリアルタイムＰＣＲ及びメルティング分析による、相対的高温検出温度（７２℃）を有するターゲット核酸配列（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓのゲノムＤＮＡ， ＣＴ）、相対的低温検出温度（６０℃）を有するターゲット核酸配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡ， ＮＧ）及びこれらの組み合わせの検出結果を示す。前記ＣＴに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎリアルタイム方法により発生されて、前記ＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥ−メルティング方法により発生された。 図４Ａは、リアルタイム方式で相異なる検出温度を利用した本発明のＳＮＰ遺伝子型分析結果を示す。テンプレート（ターゲット配列）として、ＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡが使用された。野生型同型接合体（ＣＣ）、突然変異型同型接合体（ＴＴ）及び異型接合体（ＣＴ）が検出された。全てのシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。 図４Ｂは、相対的高温検出温度におけるシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の比率を利用したＳＮＰ遺伝子型分析を示す。 図５Ａは、３つのターゲット配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ）のゲノムＤＮＡ）を検出するために、相異なる検出温度を利用した本発明の検出結果を示す。前記ＭＧに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ方法により発生されて、前記ＣＴ及びＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。シグナル発生手段を考慮し、ＭＧに対するシグナル検出温度として‘９５℃’が選択されて、ＣＴに対するシグナル検出温度として‘７２℃’が選択されて、ＮＧに対するシグナル検出温度としては、‘６０℃’が選択された。 図５Ｂは、３つのターゲット配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ）のゲノムＤＮＡ）を検出するために、相異なる検出温度を利用した本発明の検出結果を示す。前記ＭＧに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ方法により発生されて、前記ＣＴ及びＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。シグナル発生手段を考慮し、ＭＧに対するシグナル検出温度として‘９５℃’が選択されて、ＣＴに対するシグナル検出温度として‘７２℃’が選択されて、ＮＧに対するシグナル検出温度としては、‘６０℃’が選択された。 図５Ｃは、３つのターゲット配列（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ）のゲノムＤＮＡ）を検出するために、相異なる検出温度を利用した本発明の検出結果を示す。前記ＭＧに対するシグナルは、ＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲ方法により発生されて、前記ＣＴ及びＮＧに対するシグナルは、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法により発生された。シグナル発生手段を考慮し、ＭＧに対するシグナル検出温度として‘９５℃’が選択されて、ＣＴに対するシグナル検出温度として‘７２℃’が選択されて、ＮＧに対するシグナル検出温度としては、‘６０℃’が選択された。 図５Ｄは、ＣＴゲノムＤＮＡの存在を決定するために、９５℃及び７２℃でエンド−ポイントのＲＦＵ値を利用して計算されたＥｎｄ−△ＲＦＵを示す。 図５Ｅは、ＮＧゲノムＤＮＡの存在を決定するために、７２℃及び６０℃でエンド−ポイントのＲＦＵ値を利用して計算されたＥｎｄ−△ＲＦＵを示す。
Ｉ．相異なる検出温度を利用した試料内の２つのターゲット核酸配列の検出
本発明の一様態において、本発明は、
（ａ）１つの反応容器で、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための２つのシグナル発生手段（ｓｉｇｎａｌ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｅａｎｓ）と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器（ｓｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を利用して検出する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度（Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と、
（ｂ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、
を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
増幅曲線を利用する従来のリアルタイムＰＣＲ方法によると、区別されない同一なシグナルを提供するシグナル発生手段を使用して、複数のターゲット核酸配列を区別して検出することができないということが、当業界の一般的な常識である。
本発明は、本技術分野の一般的常識と関連した限界を克服し、非常に向上した方式でターゲット核酸配列を検出する、期待もしなかった結果を提供する。
本発明をそれぞれの段階別に詳細に説明すると、以下のようである。
段階（ａ）：シグナル発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、１つの反応容器で、２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段と共に、分析される試料をインキュベーションした後、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する。前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
本発明は、ターゲット核酸配列に対するシグナルを発生するために、シグナル発生手段を利用する。それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出される。本明細書で使用される用語‘シグナル発生手段（Ｓｉｇｎａｌ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｅａｎｓ）’は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの発生で使用されるある物質（Ａｎｙ ｍａｔｅｒｉａｌ）を意味し、これは、例えば、オリゴヌクレオチド、標識及び酵素を含む。択一的に、本明細書で使用される用語‘シグナル発生手段’は、シグナル発生のための物質を利用するある方法（Ａｎｙ ｍｅｔｈｏｄ）を意味するために使用できる。
本発明の一具現例によると、インキュベーションは、前記シグナル発生手段によりシグナルが発生できる条件で実施される。このような条件は、溶液の温度、塩濃度及びｐＨを含む。
シグナル発生手段として使用されるオリゴヌクレオチドの例は、ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチド（例えば、プローブ及びプライマー）を含み；ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたプローブまたはプライマーが切断されて断片を放出する場合、前記シグナル発生手段として使用されるオリゴヌクレオチドは、前記断片に特異的にハイブリダイズされるキャプチャーオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含み；前記キャプチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた断片が延長されて延長鎖を形成する場合、前記シグナル発生手段として使用されるオリゴヌクレオチドは、前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを含み；前記シグナル発生手段として使用されるオリゴヌクレオチドは、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを含み；前記シグナル発生手段として使用されるオリゴヌクレオチドは、これらの組み合わせを含む。
シグナル発生原理は同一であるとしても、相異なる配列のオリゴヌクレオチドを含むシグナル発生手段は、互いに相異なるものと見なされる。
前記標識は、オリゴヌクレオチドに連結されるか、自由な形態（Ｆｒｅｅ ｆｏｒｍ）で存在できる。前記標識は、延長反応の間、延長産物（Ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）に挿入できる。
シグナル発生において、前記オリゴヌクレオチドの切断が使用される場合、前記酵素の例は、５’−ヌクレアーゼ及び３’−ヌクレアーゼ、特に５’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素、３’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼを含む。
本発明において、シグナルは、上述の多様な物質を利用して、多様な方式で発生できる。
一具現例によると、２つのシグナル発生手段の少なくとも１つは、デュープレックス形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックス形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記デュープレックスは、二本鎖ターゲット核酸配列を含む。
本明細書において、シグナル発生手段と共に使用される表現‘デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させる’とは、検出されるシグナルが２つの核酸分子の結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）または解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に依存的に提供されることを意味する。前記表現は、ターゲット核酸配列の存在に依存的に形成されたデュープレックス（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）によりシグナルが提供されることを含む。また、前記表現は、デュープレックス（例えば、標識を有する検出オリゴヌクレオチド及び核酸配列）のハイブリダイゼーションの抑制によりシグナルが提供されることを含み、前記抑制は、他のデュープレックスの形成により起こる。
特に、前記シグナルは、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる検出オリゴヌクレオチド間のデュープレックス形成により発生される。
本明細書で使用される用語‘検出オリゴヌクレオチド（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）’は、検出されるシグナルの発生に関与するオリゴヌクレオチドである。本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、実際シグナル発生に関与するオリゴヌクレオチドを含む。例えば、他のオリゴヌクレオチド（例えば、ターゲット核酸配列または検出オリゴヌクレオチドに相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド）と検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたは非−ハイブリダイゼーションがシグナル発生を決定する。
本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含む。
ターゲット核酸配列及び検出オリゴヌクレオチド間のデュープレックス形成によるシグナルは、スコーピオン方法（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７（１９９９））、サンライズ（またはＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）方法（Ｎａｚａｒｅｎｋｏら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２５（１２）：２５１６−２５２１（１９９７）及び米国特許第６，１１７，６３５号）， Ｌｕｘ方法（米国特許第７，５３７，８８６号）、Ｐｌｅｘｏｒ方法（Ｓｈｅｒｒｉｌｌ ＣＢら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １２６：４５５０−４５５６（２００４））、分子ビーコン方法（Ｔｙａｇｉら， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖ．１４ ＭＡＲＣＨ １９９６）、Ｈｙｂｅａｃｏｎ 方法（Ｆｒｅｎｃｈ ＤＪら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ， １５（６）：３６３−３７４（２００１））、隣接したハイブリダイゼーションプローブ方法（Ｂｅｒｎａｒｄ Ｐ．Ｓ． ら， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２７３：２２１（１９９９））及びＬＮＡ 方法（米国特許第６，９７７，２９５号）を含む、多様な方法により発生できる。
特に、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチド（Ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスにより発生される。
本明細書で使用される用語‘媒介オリゴヌクレオチド’は、ターゲット核酸配列を含まないデュープレックスの生成を媒介するオリゴヌクレオチドである。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドの切断そのものでは、シグナルが発生せず、媒介オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション及び切断後に前記切断により形成された断片がシグナル発生のための連続的な反応に関与する。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションまたは切断そのものでは、シグナルが発生しない。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされて切断され、断片を放出することにより、デュープレックスの生成を媒介するオリゴヌクレオチドを含む。特に、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチド上で前記断片の延長によるデュープレックスの生成を媒介する。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドは、（ｉ）ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドの切断は、断片を放出して、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされて、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド上で延長される。
本発明の一具現例によると、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドは、切断されて断片を放出し、前記断片は、キャプチャーオリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされて、前記断片は、延長されて延長鎖を形成し、これは、前記延長鎖及びキャプチャーオリゴヌクレオチド間の延長デュープレックスの形成を引き起こし、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
本発明の一具現例によると、前記延長鎖に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドが使用される場合、前記第３オリゴヌクレオチド及び延長鎖のハイブリダイゼーションは、他の類型のデュープレックスを形成し、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
本発明の一具現例によると、前記キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドが使用される場合、前記第３のオリゴヌクレオチド及び前記キャプチャーオリゴヌクレオチド間のデュープレックス形成は、前記延長鎖及び前記キャプチャーオリゴヌクレオチド間のデュープレックス形成により抑制されてターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。
本発明の一具現例によると、前記断片、前記延長鎖、前記キャプチャーオリゴヌクレオチド、前記第３のオリゴヌクレオチドまたはこれらの組み合わせは、検出オリゴヌクレオチドとして作用できる。
前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによるシグナルは、ＰＴＯＣＥ（ＰＴＯ ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）方法（ＷＯ ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＷＯ ２０１３／１１５４４２）及びＰＣＥ−ＮＨ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｎｏｎ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）を含む多様な方法により発生できる。
上述の参照文献に開示された用語と関連し、オリゴヌクレオチドの対応する例は、下記のようである：媒介オリゴヌクレオチドは、プロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＰＴＯ）に対応し、キャプチャーオリゴヌクレオチドは、キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＣＴＯ）に対応し、第３のオリゴヌクレオチドは、シグナリングオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＳＯ）またはハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＨＯ）にそれぞれ対応する。ＳＯ、ＨＯ、ＣＴＯ、延長鎖またはこれらの組み合わせは、検出オリゴヌクレオチドとして役割をする。
前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによるシグナルは、前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスにより他のデュープレックスの形成が抑制されることにより提供されたシグナル（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ）を含む。
例えば、前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによるシグナルがＰＴＯＣＥ方法により発生される場合、前記シグナル発生手段は、アップストリームオリゴヌクレオチド、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含むプロービング及びタギングオリゴヌクレオチド（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＰＴＯ）、キャプチャリング及びテンプレーティングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）（ＣＴＯ）、適切な標識及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素を含む。前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む。前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位及び（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
ＰＴＯＣＥ方法によるシグナル発生の特定実施例は、以下の段階を含む：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）；（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／または長さまたは（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有する）；前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片及び／または前記ＣＴＯに連結された少なくとも１つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識と前記断片及び／または前記ＣＴＯに連結された少なくとも１つの標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）によりターゲットシグナルを提供し；（ｅ）前記延長デュープレックスがその二本鎖形態を維持する指定された温度で前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記延長デュープレックスを検出する段階であって、前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。このような場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｅ）の全部または一部を繰り返すことを追加的に含む。
前記‘反復サイクルの間に変性’において、用語‘変性’は、二本鎖核酸分子を一本鎖核酸分子に分離することを意味する。
前記ＰＴＯＣＥ方法の段階（ａ）において、前記アップストリームオリゴヌクレオチドの代わりに、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使用できる。このような場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｅ）の全部または一部を繰り返すことを追加的に含む。
前記ＰＴＯＣＥ方法は、ＣＴＯにハイブリダイズされたＰＴＯ断片が延長されて延長鎖を形成した後、前記延長鎖が検出されるプロセスで分類される。前記ＰＴＯＣＥ方法は、前記延長鎖の形成を前記延長鎖及び前記ＣＴＯ間のデュープレックスを利用して検出することを特徴とする。
前記延長鎖の形成を検出する他の接近法も存在する。例えば、前記延長鎖の形成は、前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドを利用して検出できる（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）。このような方法において、シグナルは、（ｉ）前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ｉｉ）前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識及び前記ＰＴＯ断片に連結された標識、（ｉｉｉ）前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドに連結された標識及び前記延長反応の間に前記延長鎖内に挿入された標識、または（ｉｖ）前記延長鎖に特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドに連結された標識及びインターカレーティング染料から提供できる。択一的に、シグナルは、（ｉ）前記延長鎖に連結された標識または（ｉｉ）インターカレーティング染料から提供できる。
択一的に、前記延長鎖形成の検出は、前記ＣＴＯ及び前記ＣＴＯに特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの抑制を検出する他の方法（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）により実施される。このような抑制は、ターゲット核酸配列の存在を示すと見なされる。前記シグナルは、（ｉ）前記ＣＴＯにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識、（ｉｉ）前記ＣＴＯに連結された標識、（ｉｉｉ）前記ＣＴＯにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドに連結された標識及び前記ＣＴＯに連結された標識、または（ｉｖ）インターカレーティング標識から提供できる。
一具現例によると、前記ＣＴＯに特異的にハイブリダイズ可能な前記オリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯ断片と重なる配列（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。
一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、前記延長鎖に特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法）及び前記ＣＴＯに特異的にハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチド（例えば、ＰＣＥ−ＮＨ方法）を含む。本発明によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、反応の間に生成された延長鎖またはＣＴＯを含む。
ＰＴＯＣＥベースの方法は、一般にターゲット核酸配列の存在に依存的な延長鎖の形成を伴う。前記用語‘ＰＴＯＣＥベースの方法’は、ＰＴＯの切断及び延長による延長鎖の形成を含む、シグナルを提供するための多様な方法を包括するために本願で使用される。
ＰＴＯＣＥベースの方法によるシグナル発生の例は、以下の段階を含む：（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）；（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯをハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）；（ｄ）段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長鎖を形成する）、（ｅ）前記延長鎖の存在に依存的に発生されるシグナルを検出して、前記延長鎖の形成を検出する段階。前記段階（ａ）において、前記アップストリームオリゴヌクレオチドの代わりに、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使用できる。このような場合、前記方法は、反復サイクルの間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｅ）の全部または一部を繰り返すことを追加的に含む。
一具現例によると、デュープレックス形成により発生された前記シグナルは、前記デュープレックスのハイブリダイゼーション（例えば、デュープレックス自体のハイブリダイゼーション、または第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション）により誘導されたシグナルまたはデュープレックス形成による第３のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの抑制により誘導されたシグナルを含む。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることによるシグナル発生手段である。
一具現例によると、２つのシグナル発生手段の少なくとも１つは、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
特に、前記シグナルは、ターゲット核酸配列に前記検出オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーションされた後、前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。
ターゲット核酸配列に前記検出オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされた後、前記検出オリゴヌクレオチドの切断による前記シグナルは、ＴａｑＭａｎプローブ方法（米国特許第５，２１０，０１５号及び米国特許第５，５３８，８４８号）を含む多様な方法により発生される。
前記シグナルがＴａｑＭａｎプローブ方法により発生される場合、前記シグナル発生手段は、ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセット、適切な標識（例えば、相互作用的二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブ及び５’−ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を含む。前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＴａｑＭａｎプローブは、ターゲット増幅の間に切断されて、前記ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させる。
ＴａｑＭａｎプローブ方法によりシグナルを発生させる特定例は、以下の段階を含む：（ａ）前記ターゲット核酸配列をプライマーセット及び適切な標識（例えば、相互作用的二重標識）を有するＴａｑＭａｎプローブとハイブリダイズさせる段階；（ｂ）前記段階（ａ）の結果物及び５’ヌクレアーゼ活性を有する核酸重合酵素を利用してターゲット核酸配列を増幅する段階（前記ＴａｑＭａｎプローブは、切断されて前記標識を放出する）；（ｃ）前記放出された標識からシグナル発生を検出する段階。
特に、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で、検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。
本発明の一具現例によると、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドが切断されて断片を放出する場合、前記断片は、検出オリゴヌクレオチドに特異的にハイブリダイズされて、前記断片は、前記検出オリゴヌクレオチドの切断を誘導する。
本発明の一具現例によると、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドが切断されて断片を放出する場合、前記断片は、延長されて、キャプチャーオリゴヌクレオチドに相補的なハイブリダイジングヌクレオチド配列を含む検出オリゴヌクレオチドを切断する。
前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式の検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナルは、Ｉｎｖａｄｅｒ分析（米国特許第５，６９１，１４２号）、ＰＴＯ切断及び延長依存的切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｅａｖａｇｅ； ＰＣＥＣ）方法（ＷＯ ２０１２／１３４１９５）及び米国特許第７，３０９，５７３号に記載の方法を含む多様な方法により発生できる。特に、米国特許第７，３０９，５７３号に記載の方法は、切断によるシグナル発生を利用するＰＴＯＣＥベースの方法の１つと見なされ、前記方法において、前記延長鎖の形成による前記ＣＴＯに特異的にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの切断を検出することにより、前記延長鎖の形成が検出できる。Ｉｎｖａｄｅｒ分析は、媒介オリゴヌクレオチドの切断により断片を形成して、断片の延長無しに連続的な切断反応を誘導する。
本発明の一具現例によると、前記シグナルが検出オリゴヌクレオチド切断に依存的な方式で発生される場合、前記検出オリゴヌクレオチドの切断は、シグナル変化を誘導するかあるいは検出される標識された断片の放出を誘導する。
シグナル発生手段が検出オリゴヌクレオチドの切断により、そしてデュープレックスの形成によりシグナルを同時に発生させる場合、前記シグナル発生手段が、切断によりシグナルを発生させるに使用される限り、前記シグナル発生手段は、切断によりシグナルを提供するシグナル発生手段と見なされる。
本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式のシグナル発生は、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のために使用される。前記シグナルが前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される場合、切断により放出された標識は、どんな温度でも検出できる。したがって、前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生されたシグナルは、制限された検出温度を要する前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のために使用されない。
本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的なシグナル発生は、専ら１つのターゲット核酸配列のために使用される。前記検出オリゴヌクレオチド切断に依存的なシグナル発生が２つのターゲット核酸配列全部のために使用される場合、前記２つのターゲット核酸配列は、検出温度によって区別されて検出されない。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段である。
本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの標識を含む。
本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドで構成できる。本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドが複数のオリゴヌクレオチドで構成された場合、前記検出オリゴヌクレオチドは、多様な方式で標識を有することができる。例えば、複数のオリゴヌクレオチドの１つが少なくとも１つの標識を有するか、複数のオリゴヌクレオチド全部が少なくとも１つの標識を有して、またはオリゴヌクレオチドの一部位が少なくとも１つの標識を有して、他の部位は、標識を有しない。
前記２つのシグナル発生手段により発生されたシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。前記用語‘単一類型の検出器により区別されないシグナル’は、これらの同一あるいは実質的に同一なシグナル特性（例えば、光学的特性、発光波長及び電気的シグナル）により、シグナルが単一類型の検出器により互いに区別されないことを意味する。例えば、２つのターゲット核酸配列のために同一な標識（例えば、ＦＡＭ）が使用されて、ＦＡＭからの発光波長を検出するために単一類型の検出器が使用される場合、シグナルは区別して検出されない。
本明細書で使用される用語‘単一類型のシグナル（Ｓｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ）’は、同一あるいは実質的に同一なシグナル特性（例えば、光学的特性、発光波長及び電気的シグナル）を提供するシグナルを意味する。例えば、ＦＡＭ及びＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ ６１０は、相異なる類型のシグナルを提供する。
本明細書で使用される用語‘単一類型の検出器（Ｓｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）’は、単一類型のシグナルのための検出手段を意味する。幾つかの相異なる類型のシグナルのための幾つかのチャンネル（例えば、光ダイオード）を含む検出器において、それぞれのチャンネル（例えば、光ダイオード）が‘単一類型の検出器’に該当する。
本発明の一具現例によると、前記２つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、前記単一類型の検出器により区別されない。
本発明で有用な標識は、本技術分野で知られた多様な標識を含む。例えば、本発明において有用な標識は、単一標識、相互作用的二重標識、インターカレーティング染料及び挿入標識（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）を含む。
前記単一標識は、例えば、蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。一具現例によると、前記単一標識は、二本鎖に存在するかあるいは一本鎖に存在するかによって相異なるシグナル（例えば、相異なるシグナル強度）を提供する。一具現例によると、前記単一標識は、蛍光標識である。本発明で使用される単一蛍光標識の好ましい種類及び結合サイトは、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、その教示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。例えば、前記単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。前記単一標識は、多様な方法によりオリゴヌクレオチドに連結できる。例えば、前記標識は、炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサーまたは１２−カーボンスペーサー）を通じてプローブに連結される。
前記相互作用的標識システムの代表的例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴにおいてエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非−蛍光性である。相互作用的標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は、非−蛍光性、例えば、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は、発光性、例えば、生物発光性、化学発光性または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムは、‘接触媒介クエンチング（ｃｏｎｔａｃｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）’に基いた二重標識を含む（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００２ （３０） ｎｏ．２１ ｅ１２２ ａｎｄ Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． ＡＭ． ＣＨＥＭ． ＳＯＣ ２００２ （１２４） ｐｐ ６９５０−６９５６）。前記相互作用的標識システムは、少なくとも２つの分子（例えば、染料）間の相互作用によりシグナル変化を誘導する、あらゆる標識システムを含む。
本発明に有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られた如何なるものでも利用できる。その例は、下記のようである： Ｃｙ２ＴＭ（５０６）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１ （５０９）， ＹＯＹＯＴＭ−１ （５０９）， Ｃａｌｃｅｉｎ （５１７）， ＦＩＴＣ （５１８）， ＦｌｕｏｒＸＴＭ （５１９）， ＡｌｅｘａＴＭ （５２０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０ （５２０）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００ （５２２）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８ （５２４）， ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ （５２５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ （５２７）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ （５２９）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ （５３３）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１ （５３３）， ＴＯＴＯ１ （５３３）， ＪＯＥ （５４８）， ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ （５５０）， Ｄｉｌ （５６５）， ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ （５７０）， Ｃｙ３ＴＭ （５７０）， ＡｌｅｘａＴＭ ５４６ （５７０）， ＴＲＩＴＣ （５７２）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ （５７５）， Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ （５７５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ （５７５）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）， Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ （５８０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （５８０）， ＴＡＭＲＡ （５８２）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ （５９０）， Ｃｙ３．５ＴＭ （５９６）， ＲＯＸ （６０８）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ （６１５）， ＡｌｅｘａＴＭ ５９４ （６１５）， Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）， Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ （６２８）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３ （６３１）， ＹＯＹＯＴＭ−３ （６３１）， Ｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４２）， Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４８）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３ （６６０）， ＴＯＴＯ３ （６６０）， ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５） （６６５）， Ｃｙ５ＴＭ （６７０）， Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ （６７１）， Ｃｙ５．５ （６９４）， ＨＥＸ （５５６）， ＴＥＴ （５３６）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ （４４７）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０ （５４４）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０ （５５９）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０ （５９１）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０ （６１０）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５ （６３７）， ＦＡＭ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３ （５２０）， Ｐｕｌｓａｒ ６５０ （５６６）， Ｑｕａｓａｒ ５７０ （６６７）， Ｑｕａｓａｒ ６７０ （７０５）及びＱｕａｓａｒ ７０５ （６１０）。括弧の数字は、ナノメートル単位で表示した最大発光波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ， ＦＡＭ， ＴＡＭＲＡ， ＲＯＸ及びフルオレセインベースの標識を含む。
適した蛍光分子及び適したレポーター−クエンチャー対は、多様な文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅ ら， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅら， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６）； 米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
本発明において、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングできる非−蛍光クエンチャー分子（例えば、ブラッククエンチャーまたはダーククエンチャー分子が利用できるということは、注目すべきことである。
レポーター及びクエンチャー分子を含むシグナリングシステムにおいて、前記レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴのその他のパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーターとして利用されて、ロダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
前記相互作用的二重標識は、デュープレックスのある一本に連結できる。前記相互作用的二重標識を含む鎖が一本鎖状態に存在する場合、前記鎖は、ヘアピンまたはランダムコイル構造を形成し、相互作用的二重標識間のクエンチングを誘導する。前記鎖がデュープレックスを形成する場合、前記クエンチングは減るようになる。択一的に、前記相互作用的二重標識が鎖上に近接して位置したヌクレオチドに連結された場合、相互作用的二重標識間のクエンチングが起こる。前記鎖がデュープレックスを形成して切断される場合、前記クエンチングは減るようになる。
それぞれの相互作用的二重標識は、デュープレックスの二本の鎖のそれぞれに連結できる。前記デュープレックスの形成は、クエンチングを誘導し、前記デュープレックスの変性は、アンクエンチングを誘導する。択一的に、二本の鎖の１つが切断される場合、アンクエンチングが誘導されえる。
本発明で有用なインターカレーティング染料の例は、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＳＹＴＯＴＭ４３， ＳＹＴＯＴＭ４４， ＳＹＴＯＴＭ４５， ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ， ＰＯＰＯＴＭ−１， ＰＯＰＯＴＭ−３， ＢＯＢＯＴＭ−１， ＢＯＢＯＴＭ−３， ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＳＹＴＯＴＭ１１， ＳＹＴＯＴＭ１３， ＳＹＴＯＴＭ１５， ＳＹＴＯＴＭ１６， ＳＹＴＯＴＭ２０， ＳＹＴＯＴＭ２３， ＴＯＴＯＴＭ−３， ＹＯＹＯＴＭ３， ＧｅｌＳｔａｒＴＭ及びｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅを含む。前記インターカレーティング染料は、二本鎖核酸分子内に特異的に入り込んでシグナルを発生させる。
挿入標識は、プライマー延長の間に標識を挿入して、シグナルを発生させる過程で使用できる（例えば、Ｐｌｅｘｏｒ方法， Ｓｈｅｒｒｉｌｌ Ｃ Ｂら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ， １２６：４５５０−４５５６９ （２００４））。また、前記挿入標識は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによるシグナル発生でも使用できる。
前記挿入標識は、一般にヌクレオチドに結合できる。また、非−天然塩基を有するヌクレオチドも利用できる。
本明細書で使用される用語‘非天然塩基（Ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ）’は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）のような天然塩基の誘導体を意味し、これらは、水素結合塩基対を形成することができる。本明細書で使用される用語‘非天然塩基’は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として、天然塩基と相異なる塩基対パターンを有する塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非天然塩基間の塩基対は、天然塩基と同様に、２つまたは３つの水素結合を含む。また、非天然塩基間の塩基対は、特定な方式でも形成される。非天然塩基の特定な例は、塩基対の組み合わせにおいて下記のような塩基を含む：ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ， ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ， Ｋ／Ｘ， Ｈ／Ｊ及びＭ／Ｎ（参照：米国特許第７，４２２，８５０号）。
ＰＴＯＣＥ方法によりシグナルが発生する場合、前記延長反応の間に挿入されたヌクレオチドは、第１非天然塩基を有することができて、前記ＣＴＯは、第１非天然塩基に特異的結合親和性のある第２非天然塩基を有するヌクレオチドを有することができる。
本明細書で使用される用語‘ターゲット核酸’、‘ターゲット核酸配列’または‘ターゲット配列’は、検出または定量しようとする核酸配列を意味する。前記ターゲット核酸配列は、二本鎖だけではなく、一本鎖を含む。前記ターゲット核酸配列は、反応で新たに生成された配列だけではなく、核酸試料内に初期に存在する配列を含む。
前記ターゲット核酸配列は、あらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）、ＲＮＡ分子及びこれらのハイブリッド（キメラ核酸）を含む。前記配列は、二本鎖または一本鎖形態である。出発物質として前記核酸が二本鎖である場合、前記二本鎖を一本鎖または部分的一本鎖形態にすることが好ましい。鎖を分離するための知られた方法は、加熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリコサール処理、酵素的方法（例えば、ヘリカーゼ作用）、及び結合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、鎖の分離は、８０℃乃至１０５℃範囲の温度で熱処理して達成できる。上述の処理の一般的な方法は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）］により提供される。
ｍＲＮＡを出発物質として利用する場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、文献［Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）； 及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）］に開示されている。逆転写反応のために、ｍＲＮＡのポリＡテイルにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマー、ランダムプライマーまたはターゲット特異的プライマーが利用できる。
ターゲット核酸配列は、あらゆる天然（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、 Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸を含む。また、前記核酸分子は、組換えにより生産されたまたは生産できるような核酸分子、または化学的に合成されたまたは合成できるような核酸分子である。したがって、前記核酸配列は、自然から発見されるか、あるいは発見されない。前記ターゲット核酸配列は、知られたあるいは知られていない配列を含むことができる。
本明細書で使用される用語‘試料’は、生物学的供給源からの細胞、組織また流体、または本発明によって有益に評価できる他のミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）を意味し、ウイルス、細菌、組織、細胞、血液、血清、血漿、リンパ、牛乳、小便、糞便、眼球液、唾液、精液、脳抽出物、脊髄液、虫垂、脾臓及び扁桃組織抽出物、羊水、 腹水及び非生物学的試料（例えば、食品及び水）を含む。また、前記試料は、生物学的供給源から単離された自然（Ｎａｔｕｒａｌ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の核酸分子及び合成した核酸分子を含む。
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施される。
本発明において、シグナル発生手段により発生された前記シグナルは、ターゲット増幅と同時に増幅できる。択一的に、前記シグナルは、ターゲット増幅無しに増幅できる。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生は、ターゲット増幅と共にシグナル増幅を含む過程で実施される。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット増幅は、重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ＰＣＲ）によって実施される。ＰＣＲは、ターゲット増幅のために当業界で広く利用されて、ターゲット配列の変性、ターゲット配列及びプライマー間のアニーリング（ハイブリダイゼーション）及びプライマー延長のサイクルを含む（Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号； Ｓａｉｋｉら， （１９８５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０， １３５０−１３５４）。シグナルは、前記詳述のシグナル発生方法（例えば、ＴａｑＭａｎ方法及びＰＴＯＣＥベースの方法）をＰＣＲ過程に適用することにより増幅できる。一具現例によると、本発明は、リアルタイムＰＣＲ方法によりシグナルを提供する。一具現例によると、前記ターゲット核酸配列の増幅は、重合酵素連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； ＬＣＲ、参照Ｗｉｅｄｍａｎｎ Ｍら， “Ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ （ＬＣＲ）− ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．” ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９４ Ｆｅｂ；３（４）：Ｓ５１−６４）， ギャップフィリングＬＣＲ（ｇａｐ ｆｉｌｌｉｎｇ ＬＣＲ； ＧＬＣＲ， 参照 ＷＯ ９０／０１０６９， ヨーロッパ特許第４３９１８２号及びＷＯ ９３／００４４７）， Ｑ−ベータレプリカーゼ増幅（Ｑ−ｂｅｔａ ｒｅｐｌｉｃａｓｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； Ｑ−ｂｅｔａ， 参照Ｃａｈｉｌｌ Ｐ， ら， Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．， ３７（９）： １４８２−５（１９９１）， 米国特許第５５５６７５１号）， 鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ＳＤＡ， 参照 Ｇ Ｔ Ｗａｌｋｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０（７）：１６９１１６９６（１９９２）， ヨーロッパ特許第４９７２７２号）， 核酸配列ベースの増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ＮＡＳＢＡ， 参照 Ｃｏｍｐｔｏｎ， Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ ３５０（６３１３）：９１２（１９９１））， 転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ＴＭＡ， 参照 Ｈｏｆｍａｎｎ ＷＰら， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ． ３２（４）：２８９−９３（２００５）； 米国特許第５８８８７７９号）またはローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ＲＣＡ， 参照Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ Ｃ．Ａ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． １０２：１７３３２１７３３６（２００５））により実施される。
前記詳述の増幅方法は、温度を変化させるか変化させない一連の反応の反復を通じてターゲット配列を増幅することができる。前記一連の反応の反復を含む増幅の単位は、‘サイクル（ｃｙｃｌｅ）’で表現される。前記サイクルの単位は、増幅方法によって、反復回数または時間で表現できる。
例えば、シグナルの検出は、増幅の各サイクル、選択された一部サイクル、または反応のエンド−ポイントで実施できる。一具現例によると、少なくとも２つのサイクルでシグナルが検出される場合、それぞれのサイクルにおけるシグナルの検出は、全ての検出温度で実施されるか、または一部選択された検出温度で実施される。本発明の一具現例によると、前記検出は、奇数のサイクルでは、相対的高温検出温度で実施されて、偶数のサイクルでは、相対的高温検出温度で実施される。
本発明の一具現例によると、インキュベーションは、シグナル発生手段によるシグナル発生と共にターゲット増幅が可能な条件下で実施される。
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
シグナルがオリゴヌクレオチドの切断を含む方法により発生される場合、前記シグナルは、ターゲット増幅無しに増幅できる。例えば、ＣＰＴ方法（Ｄｕｃｋ Ｐら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ９：１４２−１４８ （１９９０））、Ｉｎｖａｄｅｒ分析（米国特許第６，３５８，６９１号及び第６，１９４，１４９号）、ＰＴＯＣＥ−ベースの方法（例えば、ＰＣＥ−ＳＨ方法、ＰＣＥ−ＮＨ方法及びＰＣＥＣ方法）またはＣＥＲ方法（ＷＯ ２０１１／０３７３０６）にしたがって、シグナルは増幅されるが、ターゲット核酸配列は増幅されずに前記段階（ａ）が実施される。
前記詳述の増幅方法は、温度を変化させるか変化させない一連の反応の反復を通じてターゲット配列を増幅することができる。前記一連の反応の反復を含む増幅の単位は、‘サイクル（ｃｙｃｌｅ）’で表現される。前記サイクルの単位は、増幅方法によって、反復回数または時間で表現できる。
例えば、シグナルの検出は、増幅の各サイクル、選択された一部サイクル、または反応の終了時点で実施できる。
前記ターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセット及び核酸重合酵素を含むターゲット増幅手段によって達成される。
本発明の一具現例によると、ヌクレアーゼ活性（例えば、５’ヌクレアーゼ活性または３’ヌクレアーゼ活性）を有する核酸重合酵素が使用できる。本発明の一具現例によると、ヌクレアーゼ活性を有しない核酸重合酵素が使用できる。
本発明で有用な核酸重合酵素は、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ （Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ （Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。特に、前記熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列の増幅は、非対称ＰＣＲ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ）により達成される。前記プライマーの比率は、ダウンストリームオリゴヌクレオチドの切断またはハイブリダイゼーションを考慮して選択できる。
シグナルを発生させるための２つのシグナル発生手段と共に試料のインキュベーション（反応）の間またはインキュベーションの後に、発生されたシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出される。
前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有して、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有する。
本明細書で使用される表現‘ターゲット核酸配列が前記対応するシグナル発生手段により決定される検出温度を有する’とは、ターゲット核酸配列が前記ターゲット核酸配列に予め割り当てられた（Ｐｒｅ−ａｓｓｉｇｎｅｄ）検出温度で検出できるということを意味し、前記検出温度は、前記検出温度でシグナルを発生させるようにデザインされたシグナル発生手段から発生されたシグナルを検出できるようにする。
本発明の一具現例によると、前記対応するシグナル発生手段により決定される１つの検出温度は、１つのターゲット核酸配列に割り当てられる。
前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である。
本発明の特徴の１つは、２つのターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを相異なる検出温度で検出することにより、２つのターゲット核酸配列の存在を区別して決定することである。
一具現例によると、前記ターゲット核酸配列に対する検出温度は、前記シグナル発生手段によりシグナル発生を可能にする温度範囲を考慮して予め決定される。
本発明は、シグナル発生手段に依存的な方式でシグナル発生を可能にする特定温度範囲が存在するという点を利用する。
例えば、シグナル発生手段が、２つの核酸分子のハイブリダイゼーション（または結合）時にはシグナルを発生させて、非ハイブリダイゼーション（または解離）時にはシグナルを発生させない場合、２つの核酸分子のハイブリダイゼーションが可能な温度ではシグナルが発生されるが、２つの核酸分子がハイブリダイズできない温度では、シグナルが発生しない。このように、シグナル発生（即ち、シグナル検出）が可能な特定温度範囲及びシグナルが発生しない、他の温度範囲が存在する。前記温度範囲は、前記シグナル発生手段で使用される２つの核酸分子のハイブリッドのＴｍ値により影響を受ける。
切断後に標識を有する、放出された断片を利用するシグナル発生方法が利用される場合、シグナルは、理論的にどんな温度（例えば、３０〜９９℃）でも検出できる。
検出温度は、前記シグナル発生手段によりシグナル発生が可能な温度範囲から選択される。
用語‘検出温度範囲’は、シグナル発生（即ち、シグナル検出）が可能な温度範囲を特に記述するために本願で使用される。
２つのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段によって相異なる検出温度範囲が存在する場合、重ならない検出温度範囲（ｎｏｎ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｎｇｅ）が相対的高温検出温度として選択できる。相対的高温検出温度を提供するシグナル発生手段により検出されたターゲット核酸配列は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列として決定される。重なる検出温度範囲（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒａｎｇｅ）が相対的低温検出温度として選択される。相対的低温検出温度を提供して、相対的高温検出温度は提供しないシグナル発生手段により検出されたターゲット核酸配列は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列として決定される。
一具現例によると、前記重ならない部位及び重なる部位は、互いに区分されるように区別されないことがある。例えば、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供されたシグナルは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のために選択された相対的高温検出温度で遥かに低い強度で発生する場合がある。このような場合、前記相対的高温検出温度で前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供されたシグナルによる誤ったシグナル（ｆａｌｓｅ ｓｉｇｎａｌ）問題は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルの有意性（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ）を決定するための基準値（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）を適切に選択することにより克服できる。
一具現例によると、前記検出温度は、検出温度の中で、重ならない検出温度範囲及び重なる検出温度範囲を考慮して予め決定できる。
一具現例によると、ターゲット核酸配列に対して割り当てられた前記検出温度は、互いに少なくとも２℃、３℃、４℃、５℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１５℃または２０℃相異なっている。
本発明によると、それぞれのターゲット核酸配列の存在を検出するための温度は、シグナル発生手段を考慮して割り当てられる。
本発明の一具現例によると、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、相対的高温検出温度に割り当てられて、他の１つは、相対的低温検出温度に割り当てられた後、前記検出温度に適したシグナル発生手段が構築されて、次いで前記段階（ａ）が実施される。
一具現例によると、検出が実施される前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度は、予め決定できる。例えば、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度は、それぞれ７２℃及び６０℃に予め決定された後、前記検出温度に適したシグナル発生手段が構築されて、次いで前記段階（ａ）が実施される。
一具現例によると、２つのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段が先に構築された後、前記２つのターゲット核酸配列に対する検出温度が割り当てられて、次いで前記段階（ａ）が実施される。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生手段がデュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、前記検出温度は、前記デュープレックスのＴｍ値に基づいて選択される。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生手段がデュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、前記検出温度は、前記デュープレックスのＴｍ値を調節することにより調節可能である。
例えば、前記シグナルが前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる検出オリゴヌクレオチド（例えば、Ｌｕｘプローブ、分子ビーコンプローブ、ＨｙＢｅｃｏｎプローブ及び隣接したハイブリダイゼーションプローブ）により発生される場合、前記シグナルの検出は、前記オリゴヌクレオチドのＴｍ値を調節することにより、予め決定された温度で成功的になされる。スコーピンプライマーが使用される場合、前記シグナルの検出は、延長鎖にハイブリダイズされる部位のＴｍ値を調節することにより、予め決定された温度で成功的になされる。
前記シグナルが前記ターゲット核酸配列の存在によって形成されたデュープレックスにより発生される場合、前記シグナルの検出は、前記デュープレックスのＴｍ値を調節することにより、予め決定された温度で成功的になされる。例えば、前記シグナルがＰＴＯＣＥ方法により発生される場合、前記シグナルの検出は、ＣＴＯ上でＰＴＯ断片の延長により形成された延長デュープレックスのＴｍ値を調節することにより、予め決定された温度で成功的になされる。
前記ＰＴＯＣＥベースの方法は、前記デュープレックスのＴｍ値または前記デュープレックスによりハイブリダイゼーションが影響を受ける第３のハイブリッドのＴｍ値を容易に調節できるという利点を有する。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生手段が検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、前記検出温度は、任意で選択される。即ち、検出オリゴヌクレオチドの切断により発生されたシグナルが検出できる限り、どんな温度でも選択できる。上述のように、前記シグナルが前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で発生される場合、前記切断により放出された標識は、多様な温度で検出できる。
一具現例によると、前記シグナルが前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で発生される場合、前記検出温度は、相対的最高検出温度になるように選択できる。
上述のように、前記検出温度は、シグナル発生手段に左右される検出温度範囲を考慮して決定される。したがって、特定検出温度における前記シグナル検出は、下記のように説明できる：前記相対的高温検出温度における検出は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列を検出するためのものであり、前記相対的低温検出温度における検出は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列を両方とも検出するためのものである。
例えば、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル全部がＰＴＯＣＥ方法により発生される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記相対的高温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスにより発生されて、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスにより発生される。前記相対的高温検出温度でシグナルが検出される場合、前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスは、一本鎖に解離されるため、シグナルが発生せず、これにより、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルだけが検出される。前記相対的低温検出温度でシグナルが検出される場合、前記相対的高温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックス及び前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスの両方ともデュープレックス形態を有して、これにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが両方とも検出される。
他の例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、ＴａｑＭａｎ方法により発生されて、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、ＰＴＯＣＥ方法により発生される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、放出された蛍光標識により提供されて、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスにより提供される。前記相対的高温検出温度でシグナルが検出される場合、前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスは、一本鎖に解離されるため、シグナルが発生せず、これにより、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する放出された蛍光標識からのシグナルだけが検出される。前記相対的低温検出温度でシグナルが検出される場合、前記相対的低温検出温度に適したＴｍ値を有する延長デュープレックスから提供されたシグナルだけではなく、放出された蛍光標識からのシグナルも検出されて、これにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが両方とも検出される。
本発明で使用される検出器は、シグナルを検出できるあらゆる手段を含む。例えば、蛍光シグナルが使用される場合、蛍光シグナルの検出に適した光ダイオードが検出器として使用できる。単一類型の検出器を利用する検出は、単一類型のシグナルが検出できる検出器または色んなチャンネル（即ち、光ダイオード）を含む検出器の各チャンネル（即ち、光ダイオード）を利用して検出が実施されることを意味する。
一具現例によると、前記シグナルの発生は、標識から‘シグナル発生または消滅’及び‘シグナル増加または減少’を含む。
段階（ｂ）：ターゲット核酸配列の存在決定
シグナルの検出後、前記段階（ａ）で検出されたシグナルにより２つのターゲット核酸配列の存在を決定する。
前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定される。前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される。
ターゲット存在の決定のために使用されるシグナルは、シグナル検出から得た多様なシグナル特性、例えば、シグナル強度［例えば、ＲＦＵ（相対的蛍光単位）値または増幅を実施する場合は、特定サイクル、選択されたサイクルまたはエンド−ポイントにおけるＲＦＵ値］、シグナル変化形態（またはパターン）またはＣｔ値、または前記特性を数学的に処理して得られた値を含む。
本発明の一具現例によると、増幅曲線がリアルタイムＰＣＲにより得られる場合、前記増幅曲線からの多様なシグナル値（または特性）がターゲット存在を決定するに使用するために選択される。
前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記相対的高温検出温度で得られたシグナルの特性自体が使用できる。
択一的に、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記シグナルの特性を数学的に処理して提供された、変形されたシグナルが使用できる。
前記相対的高温検出温度におけるシグナル特性自体及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル特性自体が、相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違を得るために使用できる。
択一的に、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルの１つまたは全部は、シグナルの特性を数学的に処理することにより変形できて、相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違を得るために使用できる。
一具現例によると、‘相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度で検出されたシグナル’と関連して使用された用語‘シグナル’は、検出温度で得られたシグナル自体だけではなく、前記シグナルを数学的に処理して提供された、変形されたシグナルを含む。
一具現例によると、前記数学的処理が実施される場合、前記シグナルの特性は、数学的処理が可能な特性でなければならない。特定具現例において、前記数学的処理は、シグナルを利用した計算（例えば、足し算、掛け算、引き算及び割り算）またはシグナル由来の他の値を得ることを含む。本発明でターゲット核酸配列の存在を決定するために使用されるシグナルは、一般に有意なシグナルである。即ち、前記シグナルは、ターゲット核酸配列の存在に依存的に発生されるシグナルである。一方、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違が計算される場合、背景シグナルのように有意性のないシグナルが前記相違を計算するために使用できる。これと関連し、ターゲット核酸配列の存在を決定するために使用されたシグナルは、相違を計算するために使用されるか、決定過程に関与できる限り、有意性を有するシグナルだけではなく、有意性のないシグナルも包括するとして理解できる。
一具現例によると、検出されたシグナルの有意性は、閾値を利用して決定できる。例えば、検出器の背景シグナル、敏感度または使用された標識を考慮し、陰性対照群から閾値が予め決定された後、試料からのシグナル有意性が決定できる。
シグナル（即ち、有意なシグナル）が相対的高温検出温度で検出される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定される。
また、有意性のないシグナルは、本願で‘シグナルの不在’または‘シグナルの未検出’で表現できる。
本明細書でターゲット核酸配列の存在の決定と関連して使用された用語‘シグナルによる’は、シグナルの数字値またはそれらの変形を利用すること、シグナルの存在／不在を利用すること及びシグナルを閾値と比較することを含み、シグナル発生手段から発生されたシグナルを直接的または間接的に利用するか変形することにより、ターゲット核酸配列の存在が決定されることを意味する。
本明細書で相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在の決定と関連して使用された用語‘シグナルによる決定’は、相対的高温検出温度で検出されたシグナルの有意性を考慮し、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することを含む。
本発明において、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルにより決定される。
シグナルが相対的低温検出温度で検出される場合、前記シグナル自体では相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することができない。その理由は、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが前記相対的低温検出温度で検出されることがあるからである。
本発明の特徴は、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを分析するために、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルを利用することである。
興味深いことに、本発明者らは、１つの反応容器で単一ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルが、予め決定された２つの検出温度で検出された場合、特定パターン（規則）でシグナル変化が存在することを確認した。
例えば、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対して相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナル間のシグナル変化は、特定パターン（規則）を示す。例えば、２つの検出温度で前記シグナルの強度は、互いに同一であるか実質的に同一であり、または、前記シグナルの強度は互いに相異なっているが、特定範囲内に存在する。
本発明の特徴は、前記結果をターゲット核酸配列の検出に適用することである。
１つの反応容器でターゲット核酸配列に対するシグナルは、ただ検出温度だけを異にして（例えば、ターゲット含量の変化無しに、またはバッファー条件の変化無しに）検出されるため、２つの検出温度間のシグナル変化には特定パターン（規則）が存在する。シグナル変化における特定パターン（規則）に基づいて、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルは、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを分析するために使用できる。
一具現例によると、本発明の方法は、ターゲット核酸配列に対する２つの検出温度間におけるシグナル変化に特定パターン（規則）がある条件下で実施される。
一具現例によると、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルが前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供されたシグナルを含んでいるかどうかを確認するために、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルを利用して前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを分析する方式で、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する。
前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルを利用した前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルの分析は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を得て、これを分析することにより実施できる。
本発明の一具現例によると、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルのうち、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルの大きさ（または部分）は、前記相対的高温検出温度におけるシグナルを利用する原理によって得られる。
一具現例によると、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される。
例えば、（ｉ）試料内に相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のみが存在する場合、シグナルは、相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度の両方で検出される。前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルは、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルとは相異なる可能性がある。このような相違は、検出温度を除いた全ての条件が共通するため、特定範囲内に属する可能性が非常に高い。試料に対して計算された前記相違が特定範囲内に属する場合、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルは、専ら前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列によるものである。即ち、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列は、試料内に不在すると決定できる。
（ｉｉ）試料内に相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列及び相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が両方とも存在する場合、シグナルは、相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度の両方で検出される。前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在するため、前記シグナル間の相違は、前記事例（ｉ）における相違より、さらによく区別できるようになる。前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相違を利用して決定できる。
（ｉｉｉ）試料内に相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のみが存在する場合、シグナルは、相対的低温検出温度では検出されるが、相対的高温検出温度では検出されない。相対的高温検出温度でシグナルが検出されないことは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の不在を示すため、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列によるものと認識されて、これにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在が決定できる。
択一的に、前記事例（ｉｉｉ）において、前記相対的高温検出温度で検出された有意性のない（例えば、背景シグナル）シグナルを利用して、前記相違が得られる。このような対案において、前記相違は、前記事例（ｉ）における相違とは確実に相異なる可能性が非常に高く、これにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在が決定できる。
前記検出温度で検出されたシグナル間の相違は、非常に多様な接近法によって得られる。
本明細書において、‘シグナル間の相違による（またはシグナル間の相違を利用した）’と関連して使用された用語‘相違（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）’は、シグナル自体または変形されたシグナルを数学的に処理して得られる相違だけではなく、シグナルの存在及び不在による相違も含む。例えば、前記相違は、相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の比率（ｒａｔｉｏ）または引き算（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）を計算して得られる。択一的に、前記相違は、１つの検出温度におけるシグナルを変形して、これを他の検出温度におけるシグナルと比較することにより得られる。相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違は、多様な側面（ａｓｐｅｃｔ）で表現できる。例えば、前記相違は、数値、シグナルの存在／不在またはシグナル特性を有するプロットで表現できる。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られた相違を含む。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されない場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルにより決定される。このような具現例は、２つの検出温度におけるシグナルの存在及び不在による相違を利用することが、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定できるようにするということを示す。
一具現例によると、前記相違を計算するために、相対的高温検出温度で検出された背景シグナルは、‘０’または‘１’で処理される。
一具現例によると、計算する間、陰数値が得られる場合、陰数値は、絶対値に変換されて、相違を得るために使用できる。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを分析するための演算パラメータ（ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒ）である。
前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するためのシグナルは、互いに相異なる次元（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）または単位（ｕｎｉｔｓ）を有することができ、または互いに同一な次元または単位を有することができる。
本明細書で使用された用語‘相違により決定される（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）’とは、相違の発生／非発生により決定されること、数値を有する相違の値または範囲により決定されること及び相違のプロッティング結果により決定されることを含む。さらに、‘相違により決定される’とは、前記相違に基づいて相対的低温検出温度を有するターゲット核酸に対する値（例えば、ＣＴ）を得ることを含む。
本明細書でターゲット核酸配列の存在の決定と共に使用された用語‘相違による（ｂｙ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）’とは、相違の数値またはその変形を利用すること、シグナルの存在／不在を利用すること及び閾値と相違を比較することを含み、直接的または間接的に相違を利用するか変形することにより、ターゲット核酸配列の存在が決定されることを意味する。用語‘相違により’と‘相違を利用することにより（ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ）’とは、混用して使用される。
前記シグナルの数学的処理は、多様な計算方法及びそれらの変形により実施できる。
本発明の一具現例によると、前記シグナル間の相違を得るためのシグナルの数学的処理は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルの比率の計算である。本発明の一具現例によると、前記シグナル間の相違を得るためのシグナルの数学的処理は、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルの比率の計算である。
本明細書で使用された用語‘比率（ｒａｔｉｏ）’は、２つの数字間の関係を意味する。比率を利用することにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在が決定できる。前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルの比率が有意な場合、これは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在に対する指示者（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ）になる。例えば、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルのエンド−ポイント強度に対する前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルのエンド−ポイント強度の比率が有意な場合（即ち、エンド−ポイント強度の増加）、これは、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示す。
前記数学的処理は、多様な方式で実施できる。
前記数学的処理は、機械を利用して実施できる。例えば、シグナルは、検出器またはリアルタイムＰＣＲ装備のプロセッサにより数学的に処理できる。択一的に、前記シグナルは、特に予め定められたアルゴリズムによって、手作業で（ｍａｎｕａｌｌｙ）数学的に処理できる。
本発明の一具現例によると、前記相違を得るための接近法によって、前記得られた相違が前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示すかを分析するために、閾値が使用できる。例えば、前記閾値は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸及び前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸を含む基準試料から得られた相違を考慮して予め決定される。陰性対照群、敏感度または使用された標識が、閾値を決定するために追加的に考慮できる。
本発明の一具現例によると、前記相違を得るための接近法によって、前記得られた相違そのものを利用して、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在が決定できる。例えば、前記相対的高温検出温度におけるシグナルに閾値を掛けた後、前記掛けたシグナル及び相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違を得ることができる。特に、前記閾値は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸及び前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸を含む基準試料から得られた相違を考慮して予め決定される。
本発明の一具現例によると、閾値は、実施者（ｕｓｅｒ）によりまたは自動的に（ａｕｔｏｍａｔｉｃａｌｌｙ）決定される。
一具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違がさらに大きくなる場合、前記閾値を利用して検出誤りを減らすことができる。
一具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供されたシグナルが、２つの検出温度間でほとんどまたは全く相違を示さないパターン（または規則）を有する場合、相違を計算するかあるいは相違を利用して前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するにおいて、追加的な変形無しに、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルが使用できる。
一具現例において、シグナルが特定範囲内で相違を示すパターン（または規則）を有する場合、前記ターゲット核酸配列の存在の決定において、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、前記相違を反映するように変形できる。
前記基準値は、相異なる検出温度におけるシグナル変化のパターン（規則）を反映する値である。
本発明の一具現例によると、前記基準値は、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する２つの相異なる検出温度におけるシグナル変化のパターン（規則）を反映する値である。
例えば、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルが同一であるか、または実質的に同一であり、２つの検出温度におけるシグナル間の相違の程度がシグナルの引き算により計算される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する２つの検出温度におけるシグナルに対して前記基準値は、‘０’である。他の例として、前記２つの検出温度におけるシグナル間の相違の程度が前記シグナルの割り算により計算される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する２つの検出温度におけるシグナルに対して前記基準値は、‘１’である。
一方、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルが互いに相異なっており、前記２つのシグナル間の相違の程度が前記シグナルの引き算により計算される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する２つの検出温度におけるシグナルに対して前記基準値は、‘０’以外の陽数値または陰数値である。他の例として、前記２つの検出温度におけるシグナル間の相違の程度が前記シグナルの割り算により計算される場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する２つの検出温度におけるシグナルに対して前記基準値は、‘１’以外の１超過または１未満である。
特定具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルが互いに相異なっている場合、前記２つのシグナル間の相違の程度は、特定範囲に属する。
特定具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供された前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違は、基準値を通じて表現できる。特定具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列により提供された前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルが互いに相異なっている場合に対する基準値は、２つのシグナルが同一な場合に対する基準値と比較し、０．５％， １％， １．５％， ２％， ２．５％， ３％， ３．５％， ４％， ４．５％， ５％， ５．５％， ６％， ６．５％， ７％， ７．５％， ８％， ８．５％， ９％， ９．５％， １０％， １２％， １５％， ２０％または３０％以上相異なっている。
一具現例において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違がさらに大きくなる場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する基準値を利用することにより、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在の決定において検出誤りを減少させることがさらに有利である。
特定具現例において、前記２つの検出温度におけるシグナルから計算された前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する基準値が前記２つのシグナルが同一な場合に対する基準値と比較し、０．５％， １％， １．５％， ２％， ２．５％， ３％， ３．５％， ４％， ４．５％， ５％， ５．５％， ６％， ６．５％， ７％， ７．５％， ８％， ８．５％， ９％， ９．５％， １０％， １２％， １５％， ２０％または３０％以上相異なっている場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在の決定に、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する基準値を使用することができる。
一具現例によると、基準値が使用されるかを決定するために、前記比較が実施される場合、前記基準値は、シグナルの割り算により計算される。一具現例によると、前記基準値が使用されるかを決定するための基準値を計算する方法は、前記ターゲット核酸配列を検出するための基準値を計算する方法と、互いに同一であるか相異なっている。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違により、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、基準値が使用される。特に、基準値は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列と関連がある。
本発明の一具現例によると、前記得られた相違が、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示すかどうかを分析するために、前記基準値が使用できる。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違を得るために、前記基準値が使用できる。例えば、前記相対的高温検出温度におけるシグナルは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値で掛けられるか割られて、次いで、前記掛けられたまたは割られたシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違が得られる。他の例として、前記相対的低温検出温度におけるシグナルは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値で掛けられるか割られて、次いで、前記掛けられたまたは割られたシグナル及び前記相対的高温検出温度におけるシグナル間の相違が得られる。
本発明の一具現例によると、基準値は、閾値を決定するために使用される。本発明の一具現例によると、基準値は、前記値を変形するかあるいは変形せずに閾値として使用される。シグナル間の相違を分析して、ターゲット核酸配列の存在を決定するために、本明細書で使用された用語‘閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）’及び‘基準値’は、同じ値または同じ意味を有し得る。
択一的に、前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違を得るために、前記基準値が使用される場合、前記相違の有意性を決定するために、即ち、前記相違が前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示すかを決定するために、追加的な閾値が使用できる。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、基準値が使用される。
前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示す有意なシグナルが検出される場合を含む。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在しない場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記基準値が選択的に使用される。
前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在しない場合は、背景シグナルと類似した強度を有するシグナルのみが検出される場合を含む。
本発明の一具現例によると、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、基準値を利用して、前記基準値は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の検出のためのシグナル発生手段と共に、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列をインキュベーションし、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得る。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違は、１つの値であり、前記値は、変形無しにまたは変形して、基準値として使用される。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の比率または引き算を計算することにより、基準値を得ることができる。本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルの比率を計算することにより、基準値を得る。本発明の一具現例によると、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルの比率を計算することにより、基準値を得る。
一具現例によると、試料からのシグナル相違に対する計算方法及び基準値を得るための相違に対する計算方法は、互いに同一であるか、相異なっている。例えば、試料からのシグナル相違は、２つのシグナルの引き算により実施できて、基準値を得るための相違は、２つのシグナルの割り算により実施できる。択一的に、前記試料からのシグナル相違及び前記基準値を得るための相違は、両方とも比率を得るための２つのシグナルの割り算により実施できる。
本発明の一具現例によると、前記基準値に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列の検出のためのシグナル発生手段と同一である。
ターゲット核酸配列に対して、基準値は、成分（例えば、ターゲット核酸配列、シグナル発生手段、酵素、またはｄＮＴＰｓ）の量、バッファーｐＨまたは反応時間を含む多様な反応条件下で得られる。本発明の一具現例によると、基準値は、反応完了時に飽和シグナル（ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ）を提供するに十分な反応条件下で得られる。本発明の一具現例によると、基準値計算中に得られたシグナル間の相違は、特定範囲を有して、基準値は、前記特定範囲内でまたは前記特定範囲を参照して選択される。本発明の一具現例によると、基準値は、前記特定範囲の最大値または最小値で選択されるが、前記特定範囲の最大値または最小値を参照して選択できる。特に、基準値は、多様な条件で得られた前記基準値の標準変化（Ｓｔａｎｄａｒｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）、許容誤差範囲（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｎｇｅｓ）、特異度または敏感度を考慮して変形できる。
本発明の一具現例によると、基準値は、成分（使用されたら、酵素または増幅プライマー）、バッファーｐＨ、反応過程を含む、試料で使用された同一な反応条件で得られる。本発明の一具現例によると、基準値は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程を利用して得られる。
本発明の一具現例によると、前記基準値及び前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために得られた相違間に有意な相違がある場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列は、存在すると決定される。前記基準値は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために得られた相違と同一な類型の値（例えば、シグナル強度のエンドポイント値の比率）で表現できる。
特定例において、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル強度のエンドポイント値に対する前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル強度のエンドポイント値の比率が１．８であり、前記基準値が１．１である場合、前記基準値及び前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために得られた相違間には、有意な相違があると決定できる。これは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示す。
一具現例によると、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための相違が、前記基準値と同一であるか大きい場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定される。
一具現例によると、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための相違が、前記基準値と同一であるか小さい場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定される。
択一的に、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を計算するために、前記基準値が使用できる。例えば、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル（例えば、ＲＦＵ）に前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値を掛けた後（または割った後）、前記掛け算（または割り算）結果から、相対的低温検出温度で検出されたシグナル（例えば、ＲＦＵ）を引く方式で計算される。相異が‘０’または予め決定された値より大きい（または小さい）場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定できる。
他の例として、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための相違は、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル（例えば、ＲＦＵ）に前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値を掛けた後（または割った後）、前記掛け算（または割り算）結果から、相対的高温検出温度で検出されたシグナル（例えば、ＲＦＵ）を引く方式で計算される。相異が‘０’または予め決定された値より大きい（または小さい）場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定できる。
一具現例によると、予め決定された値は、閾値としての役割をすることができる。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが検出される場合、または前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度におけるシグナル間の相違が数学的過程により得られる場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために前記基準値が使用される。
一具現例によると、シグナルがＰＣＲによるターゲット増幅に係るリアルタイム方式で発生する場合、前記シグナルの数学的処理は、毎増幅サイクルにおける前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル強度に対する前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル強度の比率計算を含む。前記計算結果は、サイクルに対してプロッティングされ、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために使用される。
一具現例によると、シグナルがＰＣＲによるターゲット増幅に係るリアルタイム方式で発生する場合、Ｃｔ値がターゲット検出のためのシグナルである。
前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを利用して決定でき、以下のような例で説明できる：まず、分析する使用に対してリアルタイムＰＣＲを実施し、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを得た後、前記２つの検出温度の増幅曲線を得る。
（ａ）前記相対的高温検出温度における検出において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値がない場合、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列は、存在しないと決定できる。その後、相対的低温検出温度で得られた増幅曲線から前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値を計算する。前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列も存在しない場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値もない。
（ｂ）前記相対的高温検出温度における検出において、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値が存在する場合、Ｃｔ値を示すサイクルにおいて、前記相対的高温検出温度で得られたＲＦＵ値に対する前記相対的低温検出温度で得られたＲＦＵ値の比率を計算する。また、前記Ｃｔ値を示すサイクル以後のサイクルで得たＲＦＵ値の比率も計算する。（ｉ）全てのＲＦＵ値の比率が基準値（例えば、上述のように、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のみを利用して得られた値）より小さい場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列は、存在しないと決定される。したがって、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値はない。（ｉｉ）全てのＲＦＵ値の比率が基準値より大きい場合、前記相対的低温検出温度で得られた増幅曲線から計算されたＣｔ値が、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値と決定される。（ｉｉｉ）前記Ｃｔ値を示すサイクルにおけるＲＦＵ値の比率が前記基準値より小さく、特定サイクル以後のＲＦＵ値の比率が前記基準値より大きい場合、前記特定サイクルが前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値と決定される。
計算された比率が前記基準値と同一な場合、前記決定は、任意的になされる。例えば、上述の例は、前記決定が、前記比率が基準値より未満か以上かを考慮してなされることを詳述する。また、前記決定は、前記比率が基準値より以下か超過かを考慮してなされる。
前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値は、択一的に以下のように計算できる：毎サイクルで前記相対的高温検出温度で得られたＲＦＵ値に対する前記相対的低温検出温度で得られたＲＦＵ値の比率を計算した後；閾値を考慮してＣｔ値を計算する。
前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のＣｔ値は、択一的に以下のように計算できる：毎サイクルの前記相対的高温検出温度で得られたＲＦＵ値をサイクルの基準値を利用して変形し；毎サイクルに対して、前記変形されたＲＦＵ値に対する前記相対的低温検出温度で得られたＲＦＵ値の比率を計算した後；Ｃｔ値を計算する。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルを利用することは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値（ｑｕａｌｉｆｙｉｎｇ ｖａｌｕｅ）を得ることを含み、前記相違を利用することは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含む。
本発明の一具現例によると、前記相違を利用することは、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含み、前記定性値は、（ｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理するか、または（ｉｉ）前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されない場合、前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを利用して得られる。
前記定性値は、変形された値を得るために、追加的に数学的に処理される。前記定性値は、試料内に２つのターゲット核酸配列の存在を決定するために使用される。
一具現例によると、前記１つの反応容器は、前記２つのターゲット核酸配列以外のターゲット核酸配列を検出するための追加的な２つのシグナル発生手段をそれぞれ含む、少なくとも１つの追加的なセットをさらに含み；前記容器において、２つのシグナル発生手段の各セットにより発生された前記シグナルは、互いに区別されて、前記シグナルは、相異なる類型の検出器によりそれぞれ検出される。例えば、前記段階（ａ）における２つのシグナル発生手段がＦＡＭで標識されて、追加的な２つのシグナル発生手段が Ｑｕａｓａｒ５７０で標識される場合、前記容器でＦＡＭ標識されたシグナル発生手段により発生されたシグナルは、Ｑｕａｓａｒ５７０−標識されたシグナル発生手段により発生されたシグナルと区別されるため、２つの相異なる放出光（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｌｉｇｈｔｓ）を検出するための二類型の検出器を必要とする。
本発明の一具現例によると、前記２つのターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含み、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、一類型のヌクレオチド変異を含み、他の１つは、他の類型のヌクレオチド変異を含む。
本明細書で使用される用語‘ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）’は、連続のＤＮＡ断片において、特定位置のＤＮＡ配列におけるある単一または複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡ断片は、１つの遺伝子または１つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形性対立遺伝子変異（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）でありえる。例えば、本発明で検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係わる変異及び癌発生−関連変異を含む。本発明で使用される用語ヌクレオチド変異は、核酸配列の特定位置におけるあらゆる変異を含む。即ち、用語ヌクレオチド変異は、核酸配列の特定位置における野性型及びその全ての突然変異型を含む。
本発明の一具現例によると、本発明により検出されたヌクレオチド変異は、単一ヌクレオチド多形性（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）である。
本発明の一具現例によると、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有して、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有する。
本発明の利点は、ＳＮＰ検出でさらに目立つ。
野生型対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）に対する検出温度は、相対的高温検出温度であり、突然変異対立遺伝子に対する検出温度は、相対的低温検出温度であって、試料が突然変異同型接合（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）である場合、シグナルは、前記相対的高温検出温度で検出されず、シグナルは、前記相対的高温検出温度で検出されず、シグナルは、前記相対的高温検出温度で検出される。前記試料は、野生型対立遺伝子は含まず、突然変異型対立遺伝子は含むと決定される。一方、突然変異同型接合試料に対して、前記相対的高温検出温度で誤ったシグナルが発生した場合でも、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子の存在を決定するための前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を計算した結果は、相対的高温検出温度で検出されたシグナルが擬陽性シグナルであるか否かを確認できるようにする。前記理由は、ＳＮＰに対する異型接合体（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）が、野生型対立遺伝子及び突然変異対立遺伝子を１：１比率で含んでいるからである。
ＩＩ．相異なる検出温度を利用したＳＮＰ遺伝子型分析（ＳＮＰ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）
本発明の他の様態において、本発明は、
（ａ）１つの反応容器で、ＳＮＰ対立遺伝子を検出するためのシグナル発生手段と共に、前記単一ヌクレオチド多形性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）サイトを含む核酸配列を含む試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記それぞれのＳＮＰ対立遺伝子は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と、
（ｂ）前記段階（ａ）で前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違によりＳＮＰ遺伝子型を決定する段階と、
を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析（ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）する方法を提供する。
本発明は、上述の本発明の第１様態の原理に従うため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。本様態を説明するために前記第１様態に対する説明を言及する場合、本様態の段階（ｂ）は、第１様態の段階（ｂ）と一部相異なっていることに注意しなければならない。したがって、本技術分野の当業者であれば、第１様態に対する一部説明が、本様態の段階（ｂ）に対する説明に直接的に適用でき、変形された他の説明が、本様態の段階（ｂ）に対する説明に適用できることを理解するだろう。
段階（ａ）：シグナル発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、１つの反応容器で、ＳＮＰ対立遺伝子の検出のためのシグナル発生手段と共に、ＳＮＰサイトを含む核酸配列を含む試料をインキュベーションした後、単一類型の検出器を利用し、発生したシグナルを検出する。前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
前記ＳＮＰサイトを含む核酸配列は、人間の染色体対を含むことができる。
前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを両方とも発生できる温度である。
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施される。
本発明の一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
段階（ｂ）：ＳＮＰ遺伝子型の決定
シグナルの検出に続いて、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違によりＳＮＰ遺伝子型を決定する。
本発明は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子存在に対する決定無しにも、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違のみを利用して、ＳＮＰ遺伝子型を分析することができる。
一具現例によると、前記相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理することにより得られる。
一具現例によると、前記相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の比率を計算することにより得られる。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度で検出された背景シグナルは、前記相違を計算するために使用される。
一具現例によると、相対的高温検出温度で検出された背景シグナルは、前記相違を計算するために、‘０’または‘１’で処理される。
一具現例によると、計算する間、陰数値が得られる場合、陰数値は、絶対値に変換されて、相違を得るために使用できる。
本発明の一具現例によると、ＳＮＰ遺伝子型を決定するための前記段階（ｂ）は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子存在の決定無しに実施できる。ＳＮＰ遺伝子型分析は、相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を利用して実施できる。
前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子存在の決定が要求されない理由は、３つのＳＮＰ遺伝子型が存在し、ＳＮＰに対する異型接合体が野生型対立遺伝子及び突然変異遺伝子型を１：１比率で含んでいるからである。本発明の原理と前記理由を組み合わせることにより、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子存在の決定無しにも、ＳＮＰ遺伝子型を分析することができる。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子を含む同型接合体試料は、特定範囲内の相違（例えば、比率）を示し、異型接合体試料は、他の特定範囲内の相違（例えば、比率）を示して、前記相対的低温検出温度を含むＳＮＰ対立遺伝子を含む同型接合体は、また他の特定範囲内の相違（例えば、比率）を示す。
本発明の一具現例によると、それぞれのＳＮＰ遺伝子型に対する特定範囲は、それぞれのＳＮＰ遺伝子型に対する基準値に係る。
本発明の一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び異型接合体に対する基準値のうち、少なくとも１つを利用する。
本発明の一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、前記３つの基準値を全部利用する。本発明の一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び異型接合体に対する少なくとも２つの基準値を利用する。
一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子の検出のためのシグナル発生手段と共に、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子から構成された同型接合体をインキュベーションし、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を利用する。
一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、対応するシグナル発生手段と共に、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子及び前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子から構成された異型接合体をインキュベーションし、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を利用する。
一具現例によると、前記方法は、ＳＮＰ遺伝子型を決定するために、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子の検出のためのシグナル発生手段と共に、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子から構成された同型接合体をインキュベーションし、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を利用する。
一具現例によると、試料のＳＮＰ遺伝子型を分析するために、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を計算し、それぞれのＳＮＰ遺伝子型の基準値と比較する。
本発明の一具現例によると、前記基準値は、反応完了時に飽和シグナルを提供するに十分な反応条件下で得られる。例えば、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子及び前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された異型接合体に対する基準値を得るために、それぞれのＳＮＰ対立遺伝子の含量のような反応条件は、反応完了時にそれぞれのＳＮＰ対立遺伝子に対する飽和シグナルが提供されるように選択される。本発明の一具現例によると、前記基準値の計算中に得られた前記シグナル間の相違は、特定範囲を有して、前記基準値は、前記特定範囲内でまたは前記特定範囲を参照して選択される。
前記野生型対立遺伝子に対する検出温度が前記相対的高温検出温度であり、前記突然変異対立遺伝子に対する検出温度が前記相対的低温検出温度であって、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の比率を計算して相違を得る場合、前記野生型同型接合体試料は、特定範囲内の比率を示し、異型接合体試料は、他の特定範囲内の比率を示す。
例えば、野生型同型接合体試料は、約１．０の比率を示し、ＳＮＰに対する異型接合体試料は、約２．０の比率を示す。
試料が突然変異同型接合体である場合、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の比率を計算するために、前記相対的高温検出温度で検出された背景シグナルが使用できる。このような場合、計算された比率は、２．０より遥かに大きい値を示すことがあり、これは、試料のＳＮＰ遺伝子型が突然変異同型接合体であることを示す。択一的に、計算された比率は、突然変異異型接合体により現れた特定範囲の比率（例えば、約９．０）に属する値を示すことがある。
さらに、突然変異同型接合体試料に対して、相対的高温検出温度で誤ったシグナルが発生された場合であっても、前記比率は、２．０より遥かに大きい値を示し、これは、試料のＳＮＰ遺伝子型が突然変異同型接合体であることを示す。
したがって、ＳＮＰ遺伝子型のための本発明は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違のみを利用して、ＳＮＰ遺伝子型を決定することができる。
一具現例によると、前記相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られた定性値を提供する。
一具現例によると、前記基準値は、野生型同型接合体、突然変異同型接合体または異型接合体を含む標準試料を利用して得られて、試験試料から得られた相違を分析するために使用される。
ＩＩＩ．相異なる検出温度を利用した、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）１つの反応容器で、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される）と、
（ｂ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、特定検出温度（ｃｅｒｔａｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度（Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である場合、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される ）と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
本発明は、上述の本発明の第１様態の原理に従うため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
段階（ａ）：シグナル発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、１つの反応容器で、少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に、分析する試料をインキュベーションした後、単一類型の検出器を利用し、発生されたシグナルを検出する。前記少なくとも３つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
本発明により検出される前記ターゲット核酸配列の数は、１つの反応容器で３，４，５，６，７，８，９及び１０個以上のターゲット核酸配列を含むが、これに限定されない。
前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出される。前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される、相異なる検出温度を有する。
一具現例によると、ターゲット核酸配列に対して割り当てられた前記検出温度は、互いに少なくとも２℃、３℃、４℃、５℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１５℃または２０℃相異なっている。
前記ターゲット核酸配列の１つは、相対的最高検出温度を有する。前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列を検出するために、前記相対的最高検出温度でシグナルを提供できるシグナル発生手段が使用される。
検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度である。前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によりシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた検出オリゴヌクレオチド間のデュープレックスの形成により、前記シグナルが発生される。一具現例によると、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスにより、前記シグナルが発生される。
本発明の一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることによるシグナル発生手段である。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、ターゲット核酸配列に前記検出オリゴヌクレオチドがハイブリダイズされた後、前記検出オリゴヌクレオチドの切断により前記シグナルが発生される。一具現例によると、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で、検出オリゴヌクレオチド切断により前記シグナルが発生される。
一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチド切断に依存的な方式のシグナル発生は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列のために使用される。
本発明の一具現例によると、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である。
本発明の一具現例によると、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることによるシグナル発生手段である。
本発明の一具現例によると、前記媒介オリゴヌクレオチドの切断は、断片を放出して、前記断片は、デュープレックスの形成を媒介するか、またはキャプチャーオリゴヌクレオチド上で前記断片の延長による検出オリゴヌクレオチドの切断を媒介する。
本発明の一具現例によると、前記少なくとも３つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、前記単一類型の検出器により区別されない。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生手段がデュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、前記検出温度は、前記デュープレックスのＴｍ値に基づいて選択される。
本発明の一具現例によると、前記シグナル発生手段が検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させる場合、前記検出温度は、任意的に選択される。本発明の一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段は、相対的最高検出温度を提供できる。
一具現例によると、ターゲット核酸配列に対する検出温度は、前記シグナル発生手段によりシグナル発生が可能な温度範囲を考慮し、予め決定される。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対する検出温度は、それぞれのターゲット核酸配列を検出するためのシグナル発生手段によりシグナル発生が可能な温度範囲を考慮し、予め決定される。前記検出温度は、検出温度のうち、重ならない検出温度範囲及び重なる温度範囲を考慮し、予め決定できる。
前記特定検出温度における検出は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを検出することである。前記相対的最高検出温度における検出は、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを検出することである。
例えば、前記ターゲット核酸配列が３つのターゲット配列を含み、７２℃、６０℃及び５０℃の検出温度がそれぞれ前記３つのターゲット配列に割り当てられた場合、前記５０℃における検出は、５０℃検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルだけではなく、それぞれ７０℃及び６０℃の検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルの検出も含む。
本発明の特徴の１つは、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを、相異なる検出温度で検出し、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を区別して決定することである。
段階（ｂ）：少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在の決定
シグナルの検出に続いて、前記段階（ａ）で検出されたシグナルにより、少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する。
一具現例によると、特定検出温度で検出されたシグナルが、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列により提供されたシグナルを含んいるかまたは含んでいないかを確認するために、前記特定検出温度より高い検出温度で検出されたシグナルを利用して、前記特定検出温度で検出されたシグナルを分析する方式で、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する。
少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される。前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される。
一具現例によると、前記相違は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られる相違を含む。
一具現例によると、前記特定検出温度より高い検出温度でシグナルが検出されない場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される。このような具現例は、シグナルの存在及び不在による相違を利用して、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定することができるということを示す。
例えば、ターゲット核酸配列が四つのターゲット配列を含むと仮定すると、７２℃、６０℃、５０℃及び４０℃の検出温度がそれぞれ前記ターゲット配列に割り当てられて、シグナルは、前記段階（ａ）で検出温度６０℃、５０℃及び４０℃で検出される。前記４０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定しようとする場合、前記特定検出温度（４０℃）を有するターゲット核酸配列は、前記特定検出温度（４０℃）より高い１つ以上の検出温度（６０℃または５０℃）で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を利用して決定される。さらに明確に、４０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、６０℃で検出されたシグナル及び４０℃で検出されたシグナル間の相違、５０℃で検出されたシグナル及び４０℃で検出されたシグナル間の相違、または前記２つの相違が両方とも使用できる。
他の検出温度（即ち、６０℃及び５０℃）を有するターゲット核酸配列の存在は、それぞれ上述のように決定できる。
前記用語‘特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違’は、２つの検出温度におけるシグナル間に得られる相違を含む。前記シグナルの１つは、前記特定検出温度より高い検出温度の１つで検出されたシグナルであり、他の１つは、前記特定検出温度で検出されたシグナルである。前記特定検出温度より高い検出温度が２つ以上である場合、２つ以上の相違が得られる。
前記用語‘１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び特定検出温度で検出されたシグナル間の相違’は、２つの検出温度で検出されたシグナル間の相違たけではなく、２つの検出温度間の相違及び他の検出温度で検出されたシグナルを利用して得られた相違も含む。
択一的に、一具現例によると、特定検出温度（４０℃）を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度（６０℃）より高い１つ以上の検出温度（７２℃）で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られた相違を利用することにより決定される。前記高い検出温度（７２℃）でシグナルが検出されない場合は、前記相違を計算するために、背景シグナルが使用できる。
一具現例によると、前記特定検出温度（６０℃）より高い検出温度（７２℃）でシグナルが検出されない場合、前記特定検出温度（６０℃）を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度（６０℃）より高い検出温度（７２℃）でシグナルが検出されないことを考慮し、前記特定検出温度（６０℃）で検出されたシグナルを利用して決定される。
もし、前記最高検出温度（７２℃）でシグナルが検出されると、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列が存在すると決定できる。
一具現例によると、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定しようとする場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より次に高い検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を利用して決定される。
一具現例によると、前記相違を利用することは、前記特定検出温度より次に高い検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られる相違を利用することを含む。
一具現例によると、前記特定検出温度より次に高い検出温度でシグナルが検出されない場合、前記相違を利用することは、前記特定検出温度より次に高い検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記特定検出温度で検出されたシグナルを利用することを含む。
例えば、前記４０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定しようとする場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度（４０℃）より次に高い検出温度（５０℃）で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を利用して決定される。
一具現例によると、前記５０℃及び４０℃検出温度で検出されたシグナルが、前記５０℃及び４０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示すかどうかを決定するために、基準値が必要である。
本発明の一具現例によると、前記相違を得るための方法により、前記得られた相違が、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示すかどうかを分析するために、閾値が使用できる。
本発明の一具現例によると、前記相違を得るための方法により、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記得られた相違そのものを利用して決定できる。例えば、相違自体の直接的な利用を具現するために、前記相違を得るにおいて、閾値が予め反映される。
本発明の一具現例によると、ターゲット核酸配列の存在を決定するために、基準値が使用される。
特定具現例において、特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列により提供された前記特定検出温度及び前記特定検出温度より高い検出温度におけるシグナルの相違は、基準値を通じて表現できる。
特定具現例において、特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列により提供された、前記特定検出温度及び前記特定検出温度より高い検出温度におけるシグナルが互いに相異なっている場合に対する基準値は、前記２つのシグナルが同一な場合に対する基準値と比較し、０．５％， １％， １．５％， ２％， ２．５％， ３％， ３．５％， ４％， ４．５％， ５％， ５．５％， ６％， ６．５％， ７％， ７．５％， ８％， ８．５％， ９％， ９．５％， １０％， １２％， １５％， ２０％または３０％以上相異なっている。
特定具現例において、２つの検出温度におけるシグナルから計算された前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対する基準値が、前記２つのシグナルが同一な場合に対する基準値と比較し、０．５％， １％， １．５％， ２％， ２．５％， ３％， ３．５％， ４％， ４．５％， ５％， ５．５％， ６％， ６．５％， ７％， ７．５％， ８％， ８．５％， ９％， ９．５％， １０％， １２％， １５％， ２０％または３０％以上相異なっている場合、特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対する基準値を、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在決定に使用できる。
一具現例によると、基準値の使用可否を決定するために、前記比較を実施する場合、前記基準値は、シグナルの割り算により計算される。一具現例によると、前記基準値の使用可否を決定するために基準値を計算する方法は、前記ターゲット核酸配列を検出するために基準値を計算する方法と、互いに同一であるか相異なっている。
一具現例によると、特定検出温度より高い検出温度で複数のターゲット核酸配列に対するシグナルが検出される場合、複数のターゲット核酸配列に対する変化された検出温度におけるシグナル変化のパターンを考慮し、複数のターゲット核酸配列に対する基準値を使用する。
一具現例によると、特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記基準値が使用される。
前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合は、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を示す有意なシグナルが、前記特定検出温度より高い検出温度で検出された場合を含む。
一具現例によると、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列が存在しない場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記基準値が選択的に使用される。
前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列が存在しない場合は、背景シグナルと類似した強度を有するシグナルのみが検出された場合を含む。
前記基準値は、前記ターゲット核酸配列の全ての組み合わせまたは一部選択された組み合わせに対して、予め準備できる。本発明の一具現例によると、前記基準値は、前記組み合わせから得られた検出温度におけるシグナル間の相違である。
本発明の一具現例によると、前記基準値は、反応完了時に飽和シグナルを提供するに十分な反応条件下で得られる。例えば、２つのターゲット核酸配列の組み合わせに対する基準値を得るために、前記それぞれのターゲット核酸配列の含量のような反応条件は、反応完了時にそれぞれのターゲット核酸配列に対する飽和シグナルが提供されるように選択される。本発明の一具現例によると、前記基準値の計算中に得られた前記シグナル間の相違は、特定範囲を有して、前記基準値は、前記特定範囲内でまたは前記特定範囲を参照して選択される。
相違を得るための方法及び実際検出結果を考慮し、前記試料から得られた相違の有意性を決定するために、前記基準値が使用できる。前記基準値は、試料で前記相違を得るために使用でき、これにより、ターゲット核酸配列の存在を決定することに関与する。
本発明の一具現例によると、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせを、対応するシグナル発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度だけではなく、前記特定検出温度でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた前記基準値のうち、少なくとも１つの基準値を利用する。
本発明により少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出しようとする場合、シグナル検出のために選択された２つの検出温度の多様な組み合わせと共に、ターゲット核酸配列の多様な組み合わせを考慮し、多様な基準値が得られる。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記最高検出温度を有するターゲット核酸配列から前記最低検出温度を有するターゲット核酸配列まで、これらの検出温度順に決定されて、基準値は、ターゲット存在を決定する方法によって適合に選択される。
前記例において、前記特定検出温度（４０℃）を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための基準値を得るために、前記特定検出温度（４０℃）より高い検出温度（６０℃及び５０℃）を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせ（即ち、前記６０℃検出温度を有するターゲット核酸配列、前記５０℃検出温度を有するターゲット核酸配列及び前記６０℃及び５０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の組み合わせ）を、シグナルを発生させるシグナル発生手段とインキュベーションし；前記特定検出温度（４０℃）より高い１つ以上の検出温度（６０℃及び５０℃）だけではなく、前記特定検出温度（４０℃）でシグナルを検出した後；前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを使用して、前記シグナル間の相違を得る。同一な方法により、前記他の検出温度（即ち、６０℃及び５０℃）を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための基準値を得る。
択一的に、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせを、対応するシグナル発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ）前記特定検出温度より次に高い検出温度及び前記特定検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記特定検出温度より次に高い検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値のうち、少なくとも１つの基準値を追加的に利用する。
前記例において、前記特定検出温度（４０℃）を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための基準値を得るために、前記特定検出温度（４０℃）より高い検出温度（６０℃及び５０℃）を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせ（即ち、前記６０℃検出温度を有するターゲット核酸配列、前記５０℃検出温度を有するターゲット核酸配列及び前記６０℃及び５０℃検出温度を有するターゲット核酸配列の組み合わせ）を、シグナルを発生させるシグナル発生手段とインキュベーションし；前記特定検出温度（４０℃）より次に高い検出温度（５０℃）及び前記特定検出温度（４０℃）の両方でシグナルを検出した後；前記特定検出温度より次に高い検出温度（５０℃）で検出されたシグナル及び前記特定検出温度（４０℃）で検出されたシグナルを使用して、前記シグナル間の相違を得る。同一な方法により、前記他の検出温度（即ち、６０℃及び５０℃）を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための基準値を得る。
本発明の一具現例によると、前記基準値は、前記特定検出温度より高い１つの検出温度及び前記検出温度で検出されたシグナル間の比率または相違を計算することにより得られる。本発明の一具現例によると、前記基準値は、前記特定検出温度より高い１つの検出温度で検出されたシグナルに対する前記特定検出温度で検出されたシグナルの比率を計算して得られる。本発明の一具現例によると、前記基準値は、前記特定検出温度で検出されたシグナルに対する前記特定検出温度より高い１つの検出温度で検出されたシグナルの比率を計算して得られる。
一具現例によると、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための基準値を利用して閾値が得られる場合、前記閾値は、多様な組み合わせのターゲット核酸配列から得られた基準値をうち、特定基準値または一部基準値を利用して得られる。例えば、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列の１つのターゲット核酸配列が存在しないと分析される場合、前記１つのターゲット核酸配列を含まないターゲット核酸配列の組み合わせから得られた基準値が前記閾値を決定するために使用される。
一具現例において、少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する場合、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を確認するために、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列を除いたターゲット核酸配列の組み合わせを含む標準試料を予め準備した後、基準値を得る。前記基準値を考慮し、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために閾値が得られる。
一具現例によると、前記特定検出温度で検出されたシグナルを利用することは、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含み、前記相違を利用することは、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含む。
本発明の一具現例によると、前記相違を利用することは、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含み、前記定性値は、（ｉ）前記特定検出温度より高い１つの検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理するか、または（ｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度でシグナルが検出されない場合、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記特定検出温度で検出されたシグナルを利用して得られる。
本発明の一具現例によると、前記段階（ｂ）は、相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を先に決定した後、降べきの順に相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を順次に決定して実施する。
一具現例によると、前記１つの反応容器は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列以外のターゲット核酸配列を検出するための追加的な少なくとも３つのシグナル発生手段をそれぞれ含む少なくとも１つの追加的なセットをさらに含み、前記容器において、少なくとも３つのシグナル発生手段の各セットにより発生された前記シグナルは、互いに区別されて、前記シグナルは、相異なる類型の検出器によりそれぞれ検出される。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（特に、ＳＮＰ）を含む。
ＩＶ．相異なる検出温度及びメルティング分析を利用した２つのターゲット核酸配列の検出
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）１つの反応容器で、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための２つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度で実施される）と、
（ｂ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で前記段階（ａ）のインキュベーション結果物（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ）のメルティング分析を実施する段階と、
（ｃ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定し、前記段階（ｂ）のメルティング分析の結果を利用して前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する段階と、を含む、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
段階（ａ）：シグナル発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、１つの反応容器で、２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段と共に、分析しようとする試料をインキュベーションした後、単一類型の検出器を利用して、発生したシグナルを検出する。前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出される。前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有して、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有する。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列は、相異なる検出温度を利用したリアルタイム検出方法により検出されて、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列は、メルティング分析により検出される。
前記段階（ａ）における検出は、前記相対的高温検出温度では実施されるが、前記相対的低温検出温度では実施されない。
メルティング分析の間、シグナルを発生できるシグナル発生手段が、相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列のために選択される。
一具現例によると、前記メルティング分析のためのシグナル発生手段は、デュープレックスのハイブリダイゼーション及び変性を利用するため、前記段階（ａ）の反応条件によってシグナルを発生できる。
一具現例によると、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生させるためのシグナル発生手段は、前記相対的高温検出温度ではシグナルを発生させないように構成しなければならない。
本発明の第４様態において、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生させるためのシグナル発生手段は、反応条件によって、前記段階（ａ）でシグナルを発生させるか、あるいは発生させない。特定反応条件下で、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが発生したとしても、前記段階（ａ）でシグナル検出が相対的高温検出温度で実施されるため、前記発生されたシグナルは、検出されない。
前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記段階（ｂ）で発生されて検出されえるため、前記シグナルが必ず前記段階（ａ）で発生する必要はない。
一具現例によると、前記メルティング分析のためのシグナル発生手段は、標識されたプローブまたは標識されたデュープレックスの切断によりシグナルを発生させる手段は含んでいない。前記メルティング分析は、ハイブリッドのＴｍ値を利用するため、前記検出されるハイブリッドの切断は排除する。切断時は、メルティングピークが生成されなかったり、検出敏感度が大きく減少される。また、切断によるシグナルは、リアルタイム検出方法において、擬陽性シグナルになる可能性がある。
前記段階（ａ）は、少なくとも前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルが発生できる条件下で実施される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、ターゲット核酸配列のそれぞれのためのシグナル発生手段は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記シグナルは、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた検出オリゴヌクレオチド間のデュープレックスの形成により発生される。本発明の一具現例によると、前記シグナルは、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスにより発生される。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナル発生させるシグナル発生手段である。一具現例によると、シグナルは、ターゲット核酸配列と検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。一具現例によると、シグナルは、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で、検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることによるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式のシグナル発生は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列のために使用される。
特に、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対する検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式のシグナル発生を利用することは、下記のような理由で非常に有利である：（ｉ）相対的に広い検出温度範囲で検出温度が選択でき；（ｉｉ）ハイブリダイゼーション接近法と比較し、さらに高い温度が選択できて；及び（ｉｉｉ）適したシグナル発生手段及び反応条件を選択することにより（例えば、切断無しにハイブリダイゼーションのみシグナルを発生できないシグナル発生手段の選択または大部分の検出オリゴヌクレオチドが切断されるようにする条件の選択）、メルティング分析でシグナルを提供しないことが可能である。
また、前記デュープレックスの形成（例えば、分子ビーコン）に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段は、反応条件に依存的な５’−ヌクレアーゼによる切断を通じてシグナルを提供できる。前記シグナル発生手段が、切断によるシグナルを発生させるために使用される限り、前記シグナル発生手段は、切断によるシグナルを提供できるシグナル発生手段と見なされる。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを発生させる。
一具現例によると、前記２つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
試料を、シグナルを発生させるための２つのシグナル発生手段と共にインキュベーション（反応）した後、前記発生されたシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出される。前記検出は、相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる相対的高温検出温度で実施される。
段階（ｂ）：メルティング分析
次いで、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で、前記段階（ａ）のインキュベーション結果物のメルティング分析を実施する。
本明細書は、ただ説明の便宜のために、前記段階（ａ）における検出以後、前記段階（ｂ）を実施することを記述する。本発明の根本的な原理を考慮すると、前記段階（ｂ）が前記段階（ａ）における検出前に実施できることが理解できるだろう。したがって、前記段階（ａ）の検出前に前記段階（ｂ）を実施する過程も、本発明の範囲に属する。
前記段階（ｂ）は、本技術分野の通常の技術者に知られた多様なメルティング分析過程により実施できる。本明細書で使用された用語‘メルティング分析’は、特に明示しない限り、狭い意味のメルティング分析だけではなく、ハイブリダイゼーション分析を包括する意味で使用される。狭い意味のメルティング分析は、温度調節により増加する厳格条件下でデュープレックスの解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を測定する方法を意味する。狭い意味のハイブリダイゼーション分析は、温度調節により減少する厳格条件下でデュープレックスの結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を測定する方法を意味する。本明細書に使用された用語‘メルティング曲線（Ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）’または‘メルティングピーク曲線（Ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｅａｋ ｃｕｒｖｅ）’は、特に明示しない限り、狭い意味のメルティング分析から得られたメルティング曲線やメルティングピーク曲線だけではなく、ハイブリダイゼーション分析から得られたハイブリダイゼーション曲線やハイブリダイゼーションピーク曲線を包括意味として使用される。メルティング曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、従来の技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖら， Ｇｅｎｅ １８８： ４５（１９９７））； Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）； Ｌｉｖｅｈｉｔｓら， Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ． １１：７８３（１９９４）； 及びＨｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）に記述された方法により得られる。例えば、メルティング曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメーターを利用したアウトプットシグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）またはディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成できる。アウトプットシグナルは、ハイブリダイゼーションパラメーター対して直接的プロッティングをすることができる。典型的に、メルティング曲線またはハイブリダイゼーション曲線は、Ｙ−軸にプロッティングされたデュープレックス構造の程度（即ち、ハイブリダイゼーション程度）を示すアウトプットシグナル、例えば蛍光、及びＸ−軸にプロッティングされたパラメーターを有する。
メルティング（ハイブリダイゼーション）曲線分析及びメルティング（ハイブリダイゼーション）ピーク分析は、米国特許第８，０３９，２１５号に開示されたものを参照して記述できる。
前記メルティング分析は、‘Ｔｍ’値を利用する。本明細書で使用される用語‘Ｔｍ’は、二本鎖核酸分子の集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖分子に解離されるメルティング温度を意味する。Ｔｍ値は、ハイブリダイズされるヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量により決定される。Ｔｍ値は、Ｗａｌｌａｃｅ ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ方法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ． Ｊｒ．ら， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：３５５５−３５６２（１９９６））； Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法により計算できる。
一具現例によると、前記段階（ｂ）は、温度を増加させつつ発生されたシグナルを検出（狭い意味のメルティング分析）して実施される。択一的に、前記段階（ｂ）は、温度を減少させつつ発生されたシグナルを検出（狭い意味のハイブリダイゼーション分析）して実施される。
一具現例によると、前記メルティング分析に使用されたシグナル発生手段は、一定範囲の温度でデュープレックス形成からシグナルを発生させるあらゆる手段を含む。また、リアルタイム検出方法のためのシグナル発生手段のうち、切断反応の代わりに検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによりシグナルを発生させる手段がメルティング分析のために使用される。
一具現例によると、前記段階（ｂ）は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段を利用して実施される。特に、前記段階（ｂ）は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを発生させるシグナル発生手段を利用して実施される。
前記媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによるシグナルは、ＰＴＯＣＥ−メルティング方法（ＷＯ ２０１２／０９６５２３）、ＰＣＥ−ＳＨ−メルティング方法（ＷＯ ２０１３／１１５４４２）及びＰＣＥ−ＮＨ−メルティング方法（ＰＣＴ／ＫＲ２０１３／０１２３１２）を含む多様な方法により発生できる。前記ＰＴＯＣＥ−メルティング方法、ＰＣＥ−ＳＨ−メルティング方法及びＰＣＥ−ＮＨ− ＰＴＯＣＥ−ベースの方法、ＰＣＥ−ＳＨ−メルティング方法及びメルティング分析を利用するＰＣＥ−ＮＨ−メルティング方法に該当する。前記ＰＴＯＣＥ−ベースの方法のうち、切断によってシグナルを発生しない方法が、前記段階（ｂ）におけるメルティング分析のために利用される。
前記ＰＴＯＣＥ−メルティング方法、ＰＣＥ−ＳＨ−メルティング方法及びＰＣＥ−ＮＨメルティング方法は、以前の特許文献にも記載されている。
前記ＰＴＯＣＥ−メルティング方法により実施される段階（ａ）−（ｂ）は、以下の段階を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階と
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長デュープレックスを形成して、前記延長デュープレックスは、（ｉ）前記断片の配列及び／または長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列及び／または長さまたは（ｉｉｉ）前記断片の配列及び／または長さと前記ＣＴＯの配列及び／または長さにより調節可能なＴｍ値を有する）と、
（ｅ）一定範囲の温度で前記延長デュープレックスをメルティングして、前記延長デュープレックスの存在を示すターゲットシグナルを提供する段階（前記ターゲットシグナルは、（ｉ）前記断片及び／または前記ＣＴＯに連結された少なくとも１つの標識、（ｉｉ）前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記延長反応の間に前記延長デュープレックス内に挿入された標識と前記断片及び／または前記ＣＴＯに連結された標識または（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ Ｌａｂｅｌ）により提供される）と、
（ｆ）前記ターゲットシグナルを測定することにより、前記延長デュープレックスを検出する段階（前記延長デュープレックスの存在は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す）。
このような場合、前記ＰＴＯＣＥメルティング方法は、反復サイクル間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部を繰り返すことを追加的に含む。前記ＰＴＯＣＥ−メルティング方法の段階（ａ）において、アップストリームオリゴヌクレオチドの代わりにターゲット核酸配列の増幅のためのプライマーセットが使用できる。このような場合、前記方法は、反復サイクル間に変性を含み、前記段階（ａ）−（ｆ）の全部または一部を繰り返すことを追加的に含む。
前記ＰＴＯＣＥ−ベースのメルティング方法により実施される段階（ａ）−（ｂ）は、以下の段階を含む：
（ａ）ターゲット核酸配列をアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階と、
（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階（前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する）と、
（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片をＣＴＯとハイブリダイズさせる段階（前記ＰＴＯから放出された断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる）と、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を利用して延長反応を行う段階（前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長鎖を形成する）と、
（ｅ）一定範囲の温度で前記延長鎖の存在に依存的に発生されるシグナルを検出し、メルティング分析を実施する段階。
段階（ｃ）：ターゲット核酸配列の存在決定
最後に、前記段階（ａ）で検出されたシグナルを利用して、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定し、前記段階（ｂ）におけるメルティング分析結果を利用して、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（特に、ＳＮＰ）を含む。
リアルタイム検出のための切断によりシグナルを発生させるシグナル発生手段と、メルティング分析のためのターゲット核酸配列とハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスによりシグナルを発生させるシグナル発生手段とを組み合わせる場合、本発明の予期しない結果が得られることがある。このような場合、メルティング分析のために、デュープレックスの形成に関与して、切断により直接的にシグナルを発生させるシグナル発生手段は、排除しなければならない。
本発明を、リアルタイム過程として、切断によりシグナルを発生させるシグナル発生手段（例えば、ＴａｑＭａｎ方法）、そしてメルティング分析として、ＰＴＯＣＥ−ベースのメルティング方法の組み合わせで実施することにより、非常に優れた結果を提供するという点は、注目すべきことである。
一具現例によると、前記段階（ａ）で検出されたシグナルを利用することは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための定性値を得ることを含む。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（特に、ＳＮＰ）を含む。
Ｖ．相異なる検出温度及びメルティング分析を利用した少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）１つの反応容器で、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の一部のターゲット核酸配列は、検出温度分析により検出されて、前記検出は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列の検出温度と前記検出温度より高い１つ以上の検出温度との両方で実施される）と、
（ｂ）前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で前記段階（ａ）のインキュベーション結果物のメルティング分析を実施する段階と、
（ｃ）（ｉ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記ターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列の存在を決定し、ここで前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記段階（ｂ）のメルティング分析の結果によって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定する段階と、を含む、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法を提供する。
本発明は、上述の本発明の第１様態乃至第４様態の原理に従うため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
段階（ａ）：シグナル発生手段とのインキュベーション及びシグナル検出
まず、１つの反応容器で、少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に、分析しようとする試料をインキュベーションした後、単一類型の検出器を利用して、発生したシグナルを検出する。少なくとも３つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、単一類型の検出器により区別されない。
前記ターゲット核酸配列の１つは、相対的最高検出温度を有する。相対的最高検出温度でシグナルを提供できるシグナル発生手段は、相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列を検出するために利用される。
本発明において、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列は、前記検出温度分析により検出されて、その他は、メルティング分析により検出される。
表現‘少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列’において、用語‘一部（ｓｏｍｅ）’は、１つ以上を含む。本明細書で使用された用語‘検出温度分析（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）’は、特に明示しない限り、ターゲット核酸配列を検出するための相異なる検出温度における検出を含むリアルタイム検出を意味する。
前記メルティング分析により分析されるターゲット核酸配列に対するシグナルを発生させるためのシグナル発生手段は、反応条件によって、前記段階（ａ）でシグナルを発生させるか、発生させない。前記メルティング分析により分析されるターゲット核酸配列に対するシグナルは、前記段階（ｂ）で発生されて検出できるため、前記シグナルが必ず前記段階（ａ）で発生する必要はない。
前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、互いに相異なる検出温度を有するシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記メルティング分析のためのシグナル発生手段は、デュープレックスのハイブリダイゼーション及び変性を利用するため、前記段階（ａ）における反応条件によってシグナルを発生させることができる。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、前記検出温度分析により検出されるターゲット核酸配列に対する少なくとも１つのシグナルを発生させるに適した条件下で実施される。
一具現例によると、前記検出温度分析により分析されるターゲット核酸配列は、検出温度を考慮して選択される。特に、前記最高検出温度を有するターゲット核酸配列が先に選択された後、検出温度順に一部配列が選択される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施される。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によりシグナルを発生させるシグナル発生手段である。
一具現例によると、前記シグナルは、ターゲット核酸配列及び前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた検出オリゴヌクレオチド間のデュープレックスの形成により発生される。一具現例によると、前記シグナルあ、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で形成されたデュープレックスにより発生される。
一具現例によると、前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることによるシグナル発生手段である。
一具現例によると、シグナル発生手段の少なくとも１つは、前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段である。一具現例によると、シグナルは、ターゲット核酸配列と前記検出オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション後、前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。一具現例によると、シグナルは、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式で前記検出オリゴヌクレオチドの切断により発生される。
一具現例によると、前記検出オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式のシグナル発生は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対してのみ使用される。
本発明の一具現例によると、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である。
本発明の一具現例によると、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、他の核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式のデュープレックスの形成によりシグナルを発生させる。
例えば、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルは、ＴａｑＭａｎ方法により発生されて、他のターゲット核酸配列に対するシグナルは、ＰＴＯＣＥ方法、ＰＣＥ−ＳＨ方法またはＰＣＥ−ＮＨ方法により発生される。
本発明の一具現例によると、前記少なくとも３つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、前記単一類型の検出器により区別されない。
本発明により検出される前記ターゲット核酸配列の数は、１つの反応容器で３，４，５，６，７，８，９及び１０個以上のターゲット核酸配列を含むが、これらに限定されない。
試料を、シグナルを発生させる少なくとも３つのシグナル発生手段と共にインキュベーション（反応）した後、前記発生されたシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する。一具現例によると、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列は、検出温度分析により検出されて、前記検出は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列の検出温度及び前記検出温度より高い１つ以上の検出温度の両方で実施される。
一具現例によると、前記検出温度分析を実施するために要求される全ての検出温度でシグナルが検出される。
前記発生されたシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出される。前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有する。検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度である。
一具現例によると、前記検出温度分析により検出されるターゲット核酸配列は、前記メルティング分析により検出されるターゲット核酸配列の検出温度より高い検出温度を有する。
段階（ｂ）：メルティング分析
前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で前記段階（ａ）のインキュベーション結果物のメルティング分析を実施する。
本明細書は、説明の便宜のために、前記段階（ａ）における検出以後、前記段階（ｂ）を実施することについてのみ記述する。本発明の根本的な原理を考慮してみると、前記段階（ｂ）が前記段階（ａ）における検出前に実施できることが理解できるだろう。したがって、前記段階（ａ）の検出前に前記段階（ｂ）を実施する過程も、本発明の範囲に属する。
一具現例によると、前記段階（ｂ）は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段を利用して実施される。特に、前記段階（ｂ）は、ＰＴＯＣＥベースのメルティング方法によって実施される。
段階（ｃ）：ターゲット核酸配列の存在決定
最後に、前記段階（ａ）におけるシグナル及び前記段階（ｂ）のメルティング分析の結果を利用して、試料内の前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する。
前記ターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列の存在は、前記段階（ａ）で検出されたシグナルを利用して決定される。前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される。前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される。
一具現例によると、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせを、シグナル発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度だけではなく、前記特定検出温度でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を追加的に使用する。
択一的に、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせを、シグナル発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ）前記特定検出温度より次に高い検出温度及び前記特定検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記特定検出温度より次に高い検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を追加的に利用する。
一具現例によると、前記検出温度分析により検出されるターゲット核酸配列に対するシグナルまたは基準値間の相違を得るために、前記メルティング分析により検出されるターゲット核酸配列に対する検出温度におけるシグナル検出が必要な場合、前記メルティング分析により検出されるターゲット核酸配列に対する検出温度でシグナルが収集できる。
前記検出温度分析により検出される前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列以外のターゲット核酸配列の存在は、前記段階（ｂ）におけるメルティング分析の結果により決定される。
一具現例によると、前記段階（ｄ）は、まず相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を先に決定した後、降べきの順に相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を順次に決定して実施される。
一具現例によると、前記メルティング分析によるターゲット核酸配列存在の決定は、前記検出温度分析によるターゲット核酸配列存在の決定で（例えば、基準値選択のために）利用できる。
前記少なくとも３つのターゲット核酸配列がリアルタイム方式で検出される場合、切断によるシグナル発生は、専ら１つのターゲット核酸配列だけのために使用される。他のターゲット核酸配列のためには、分析の効率及び準備度（ｒｅａｄｉｎｅｓｓ）を改善するために、ＰＴＯＣＥベースの方法が使用できる。
本発明の一具現例によると、前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（特に、ＳＮＰ）を含む。
ＶＩ．複数の検出温度を利用してターゲット核酸配列を検出するためのキット
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）試料内の２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と
（ｂ）相異なる検出温度を利用した試料内の２つのターゲット核酸配列の検出と命名される様態Ｉの本発明の方法を記載した説明書と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）ＳＮＰ対立遺伝子の検出のためのシグナル発生手段（前記それぞれのＳＮＰ対立遺伝子は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と、
（ｂ）相異なる検出温度を利用したＳＮＰ遺伝子型分析と命名される様態ＩＩの本発明の方法を記載した説明書と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析するためのキットを提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される）と
（ｂ）相異なる検出温度を利用した試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出と命名される様態ＩＩＩの本発明の方法を記載した説明書と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）試料内の２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度で実施されて、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である）と、
（ｂ）相異なる検出温度及びメルティング分析を利用した２つのターゲット核酸配列を検出と命名される様態ＩＶの本発明の方法を記載した説明書と、を含む、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の一部のターゲット核酸配列は、検出温度分析により検出されて、前記検出は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列の検出温度と前記検出温度より高い１つ以上の検出温度との両方で実施されて、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段である）と、
（ｂ）相異なる検出温度及びメルティング分析を利用した少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出と命名される様態Ｖの本発明の方法を記載した説明書と、を含む、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する。
本発明のキットは、本発明の方法を実施するために製造されるため、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
上述の本発明の全てのキットは、バッファー、ＤＮＡ重合酵素助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）に必要な試薬を選択的に含むことができる。選択的に、前記キットは、多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファー及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含むことができる。また、前記キットは、陽性対照群及び陰性対照群反応を実施するに必要な試薬を含むことができる。特定反応で使用される試薬の最適量は、本明細書の開示事項の利点を知っている当業者により容易に決定できる。前記キットの構成成分は、個別容器内に存在するか、複数の構成成分が１つの容器内に存在することができる。
本発明の方法を記述するか、実施するための説明書は、適した記録媒体に記録できる。例えば、説明書は、紙及びプラスチックのような基板に印刷できる。他の具現例において、説明書は、ＣＤ−ＲＯＭ及びディスケットのような、適したコンピューター読み取り可能な記録媒体上に存在する電子貯蔵データファイルとして存在できる。また他の具現例において、前記キット内に実質的な説明書は含まれておらず、ただ遠隔ソースから、例えば、インターネットを通じて、説明書を得る手段が提供される。前記具現例の一例は、説明書が見られるウェブアドレス及び／または説明書をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。
ＶＩＩ．複数の検出温度を利用してターゲット核酸配列を検出するための記録媒体及び装置。
下記に記述された本発明の記録媒体、装置及びコンピュータープログラムは、コンピューターで本発明を実行するためのもので、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
本発明の他の様態において、本発明は、（ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、発生したシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
（ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、
を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。
一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値が使用される。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値は、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵される。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、本発明を実行する間、前記基準値を入力する指示を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、前記基準値を得るための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を追加的に含む。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記発生したシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
（ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、を含む、試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵するためのコンピュータープログラムを提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、上述の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されたコンピュータープログラムを提供する。
本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の基準値を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、本発明を実行する間、前記基準値を入力する指示を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、前記基準値を得るための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を追加的に含む。
前記プロセッサーにより前記方法が実行される場合、前記プログラム指示が作動して、プロセッサーが上述の本発明の方法を実行するようにする。前記プログラム指示は、第１シグナル及び第２シグナルを受信する指示を含むことができ、前記受信されたシグナルを利用して、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定するための指示を含むことができる。
上述の本発明の方法は、プロセッサー、例えば、独立型コンピューター（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ ｃｏｍｐｕｔｅｒ）、ネットワークに連結されたコンピューター（ｎｅｔｗｏｒｋ ａｔｔａｃｈｅｄ ｃｏｍｐｕｔｅｒ）またはリアルタイムＰＣＲ機器のようなデータ収集装置（ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）にあるプロセッサーで実行される。
前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、ＣＤ−Ｒ、ＤＣ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、フラッシュメモリー、フロッピー（登録商標）ディスク、ハードドライブ、ポータブルＨＤＤ、磁気テープ、ＭＩＮＩＤＩＳＣ、非揮発性メモリーカード、ＥＥＰＲＯＭ、光学ディスク、光学記録媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、システムメモリー及びウェブサーバーのような多様な記録媒体を含む。
前記シグナルに係るデータ（例えば、強度、増幅サイクル数及び検出温度）は、種々の機器を通じて受信できる。例えば、前記データは、ＰＣＲデータ収集装置にあるプロセッサーにより収集できる。前記データは、データが収集されている間、リアルタイムで提供でき、またはメモリーユニットやバッファーに貯蔵できて、実験完了後、プロセッサーに提供できる。同様に、前記データセットは、前記収集装置とのネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット及びイントラネット）または直接連結（例えば、ＵＳＢまたは他の直接有線連結または無線連結）によりデスクトップコンピューターシステムのような別途のシステムに提供できて、またはＣＤ、ＤＶＤ、フロッピー（登録商標）ディスク、ポータブルＨＤＤまたは独立型コンピューターシステムのようなポータブル媒体上に提供できる。同様に、前記データセットは、ノートブックまたはデスクトップコンピューターシステムのようなクライアントにネットワーク連結（例えば、ＬＡＮ、ＶＰＮ、インターネット、イントラネット及び無線通信ネットワーク）を通じて、サーバーシステムに提供できる。前記相対的高温検出温度で前記シグナルが検出される場合、前記データが受信されるか収集された後、前記データ分析過程は、ターゲット核酸配列の存在決定のためのシグナル間の相違から得た加工シグナルを提供する。前記プロセッサーは、前記シグナルに係る受信されたデータを処理して、前記２つの検出温度におけるシグナル間の相違を反映する加工シグナルを提供する。例えば、前記プロセッサーは、前記受信されたデータを処理して、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルに対する前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルの比率を得る。
本発明を実行するプロセッサーを具現する指示は、ロジックシステムに含まれ得る。前記指示は、たとえポータブルＨＤＤ、ＵＳＢ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ及びＤＶＤのようなあらゆるソフトウェア記録媒体上に提供できるが、ダウンロード可能で、メモリーモジュール（例えば、ハードドライブまたはローカルまたは付着ＲＡＭやＲＯＭのような他のメモリー）に貯蔵できる。本発明を実行するためのコンピューターコードは、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、ＶＢＳｃｒｉｐｔ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、Ｐｅｒｌ及びＸＭＬのような多様なコーディング言語で実行できる。また、多様な言語及びプロトコールは、本発明によるデータと命令の外部及び内部貯蔵と伝送に利用できる。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）コンピュータープロセッサーと、（ｂ）前記コンピュータープロセッサーにカップリングされたコンピューター読み取り可能な記録媒体とを含む、相異なる検出温度を利用して試料内のターゲット核酸配列を検出するための装置を提供する。
一具現例によると、前記装置は、試料及びシグナル発生手段を収容できる反応容器、前記反応容器の温度を調節する温度調節手段及び／または前記シグナル発生手段により発生されるシグナルを検出できる単一類型の検出器を追加的に含む。
一具現例によると、前記コンピュータープロセッサーは、前記単一類型の検出器が前記相対的高温検出温度及び相対的低温検出温度におけるシグナル発生手段により発生されるシグナルを検出できるようにするだけではなく、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を計算できるようにする。前記プロセッサーは、１つのプロセッサーが２つの行為をするように構築できる：２つの検出温度における検出及び前記相違計算の命令。択一的に、プロセッサーユニットは、２つのプロセッサーが２つの行為をそれぞれするように構築できる。
前記装置の第１の必須的な特徴は、前記装置が前記２つの検出温度で発生されるシグナルを検出できるようにするプロセッサーを有していることである。一具現例によると、前記シグナルが前記ターゲット核酸配列の増幅と共に発生される場合、前記装置は、毎増幅サイクル毎に前記２つの検出温度で発生されるシグナルを検出できるようにするプロセッサーを含む。
前記装置の第２の必須的な特徴は、前記装置が前記２つの検出温度で検出されたシグナルを処理し、前記シグナル間の相違を得るプロセッサーを有していることである。一具現例によると、前記シグナル間の相違は、数学的な処理により、数字値で表現される。
一具現例によると、前記プロセッサーは、ターゲット核酸配列の検出のための従来の装置（例えば、リアルタイムＰＣＲ装置）にソフトウェアが設けられて具現できる。一具現例によると、前記装置は、少なくとも２つの検出温度でシグナルを検出できるようにして、少なくとも２つの検出結果を数学的に処理できるようにするプロセッサーを含む。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）少なくとも３つの検出温度で検出されたシグナルを受信する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される）と、
（ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される）と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。
本発明の一具現例によると、基準値は、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵される。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、前記方法を実行する間、前記基準値を入力する指示を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、前記基準値を得るための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を追加的に含む。
本発明のまた他の様態において、本発明は、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための上述の前記方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されたまたは貯蔵するためのコンピュータープログラムを提供する。
本発明の他の様態において、本発明は、（ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのＳＮＰ対立遺伝子は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
（ｂ）前記受信されたシグナル間の相違によりＳＮＰ遺伝子型を決定する段階と、を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。
本発明の一具現例によると、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び／または前記低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び／または異型接合体に対する基準値は、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵される。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、前記方法を実行する間、前記基準値を入力する指示を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピューター読み取り可能な記録媒体は、前記基準値を得るための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を追加的に含む。
本発明のまた他の様態において、本発明は、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析するための上述の方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されたまたは貯蔵するためのコンピュータープログラムを提供する。
本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び／または前記低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子で構成された同型接合体及び／または異型接合体に対する基準値を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、前記方法を実行する間、前記基準値を入力する指示を含む。本発明の一具現例によると、前記コンピュータープログラムは、前記基準値を得るための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を追加的に含む。
本発明のまた他の様態において、本発明は、（ａ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための前記相対的高温検出温度におけるシグナル及び前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するための一定範囲の温度におけるメルティング分析からのシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記一定範囲の温度でメルティング分析が実施される）と、
（ｂ）前記受信されたシグナルによって、２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度におけるシグナルにより決定されて、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記メルティング分析からのシグナルにより決定される）と、を含む、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための上述の方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されたまたは貯蔵するためのコンピュータープログラムを提供する。
本発明の他の様態において、本発明は、（ａ）（ｉ）前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列の検出温度及び前記検出温度より高い１つ以上の検出温度におけるシグナル及び（ｉｉ）前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度におけるメルティング分析からのシグナルを全て受信する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列は、検出温度分析により検出されて、前記検出は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列の検出温度及び前記検出温度より高い１つ以上の検出温度の両方で実施されて、前記一定範囲の温度におけるメルティング分析は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定するために実施される）と、
（ｂ）（ｉ）前記受信されたシグナルによって、前記ターゲット核酸配列のうち、一部のターゲット核酸配列の存在を決定して、ここで、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記メルティング分析からのシグナルにより、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定する段階と、を含む、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。
本発明のまた他の様態において、本発明は、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための上述の方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されたまたは貯蔵するためのコンピュータープログラムを提供する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
実施例１：相異なる温度におけるシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲによる２つのターゲット検出
本発明者らは、１つの検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用して、１つの反応容器で２つのターゲット核酸を検出できるかどうかを実験した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
ＣＴ及びＮＧを検出するためにＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを使用した。もしターゲットが存在する場合、ＰＴＯは切断されて、ＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされて、ＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長され、ＣＴＯと延長デュープレックス（デュープレックスＣＴＯ）を形成する。前記延長デュープレックスの形成は、シグナルを提供して、延長デュープレックス−形成温度でシグナルを測定することにより、増幅曲線が得られる。
本実施例において、シグナル発生手段を考慮し、ＣＴのためのシグナル検出温度として‘７２℃’を選択して、ＮＧのためのシグナル検出温度として‘６０℃’を選択した。前記ＣＴまたはＮＧの存在によって生成された延長デュープレックスは、その配列及び長さにより調節された調節可能なＴｍ値を有する。本実施例において、ＣＴに対する前記延長デュープレックスの配列及び長さは、７２℃で前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するようにデザインした。一方、ＮＧに対する前記延長デュープレックスの配列及び長さは、６０℃では前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するが、７２℃では、前記デュープレックスを形成せず、解離されて、シグナルを提供しないようにデザインした。７２℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルが発生されて検出される。６０℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルだけではなく、前記ＮＧに対するシグナルが発生されて検出される。
前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識されている（配列番号：４及び８）。
ＣＴ、ＮＧ、ＣＴ及びＮＧの混合物及びターゲットのない対照群のそれぞれを含む４つの反応チューブを用意した。
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、以下のようである：
ＮＧ＿Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （配列番号： １）
ＮＧ＿Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’ （配列番号： ２）
ＮＧ＿ＰＴＯ ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ３）
ＮＧ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ４）
ＣＴ＿Ｆ ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’ （配列番号： ５）
ＣＴ＿Ｒ ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’ （配列番号： ６）
ＣＴ＿ＰＴＯ ５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ７）
ＣＴ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ８）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
ターゲット核酸（ＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ， ＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇまたはＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー （配列番号： １） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー （配列番号： ２） ５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ３） ３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ４） １ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号： ５） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： ６） ５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ７） ３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ８） １ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス［最終的に２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素］ １０μｌ含有した２０μｌの最終容量でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応した後、９５℃で１５分間変性させて９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、サイクル毎に６０℃及び７２℃で実施した。
図１Ａに示されたように、ＣＴが存在する場合（チューブ１及び３）は、７２℃でシグナルが検出された。ＮＧのみが存在する場合（チューブ２）は、６０℃でシグナルが検出されたが、７２℃では、シグナルが検出されなかった。ターゲット核酸が存在しない場合（チューブ４）は、シグナルが検出されなかった。図１Ａの結果は、前記相対的高温検出温度である７２℃で、前記相対的高温検出温度を有するＣＴに対するシグナルは発生されるが、前記相対的低温検出温度を有するＮＧに対するシグナルは発生されないことを示す。したがって、前記相対的高温検出温度におけるシグナル検出により、少なくとも前記相対的高温検出温度を有するＣＴの存在を決定することができることが分かる。また、チューブ２において、前記相対的高温検出温度におけるシグナルの不在及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルの存在による相違を利用することは、前記相対的低温検出温度を有するＮＧの存在を決定できるようにした。
前記相対的高温検出温度を有するＣＴからのシグナルが存在する場合または存在しない場合にも前記相対的低温検出温度を有するＮＧの存在が検出できるかどうかを実験するために、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を、多様な接近法を利用して計算した（図１Ｂ〜１Ｅ）。
前記図１Ｂは、７２℃及び６０℃でエンドポイントのＲＦＵ値の比率を示す（全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン差し引かれた曲線フィット（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ）’分析データに由来してエクスポートされる）。ＣＴのみが存在する場合（チューブ１）の比率は、１．２であったが、ＣＴ及びＮＧが両方とも存在する場合（チューブ３）の比率は、２．１であった。また、ＮＧのみが存在する場合（チューブ２）の比率及び如何なるターゲット核酸もない場合（チューブ４）の比率は、それぞれ３６．７及び０．７であった。ＮＧの存在または不在を決定するために、閾値１．５を適用した。前記閾値によって、チューブ２及び３では、ＮＧの存在を確認して、チューブ１及び４には、ＮＧがないことを確認した。前記閾値は、ＣＴのみを含むチューブからのエンド−比率（Ｅｎｄ−Ｒａｉｏ）を考慮して決定した。チューブ２のように、相対的高温検出温度を有するＣＴが存在しないと決定できる場合、前記相対的低温検出温度におけるシグナルにおける閾値は、１．５を適用する代わりに、独立的に設定できる。
７２℃及び６０℃におけるシグナルを利用する他の接近法は、毎サイクルにおいて７２℃及び６０℃における蛍光シグナルの比率を計算し、前記比率をサイクルに対してプロッティングすることである（プロッティングのために処理された全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン未差し引き（ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）’分析データに由来してエクスポートされる）。 ＮＧの存在または不在を決定するために、閾値０．１を適用した。前記閾値は、ＣＴのみを含むチューブからの比率プロットを考慮して決定した。図１Ｃに示したように、チューブ２及び３でＮＧの存在を確認し、Ｃｔ値は、それぞれ３２．９０及び３３．１８であった。チューブ１及び４では、Ｃｔ値が得られなかった。比率を計算する代わりに、サイクル毎に７２℃における蛍光強度から６０℃における蛍光強度を差し引き、ターゲット検出のために、前記結果をサイクルに対してプロッティングすることができる。
相対的高温検出温度でＣＴの存在を示すシグナルを利用して、相対的低温検出温度を有するＮＧの存在を検出する他の方法は、それぞれのチューブにおいて、６０℃で得られたシグナルの分析のために個別閾値を適用することである。７２℃でシグナルが検出される場合、７２℃におけるそれぞれのＥｎｄ−ＲＦＵに閾値（１．５）を掛けて、前記チューブから６０℃におけるシグナルに対する個別閾値を計算した。前記閾値（１．５）は、ＣＴのみを含むチューブからのエンド−比率（参照：図１Ｂ）を考慮して決定した。７２℃でシグナルが検出されなかった場合、閾値の一般的な設定方法によって、背景シグナル、敏感度及びシグナル変化または装置の誤差範囲を考慮し、前記チューブから６０℃におけるシグナルに対する個別閾値を選択して利用した。本実施例において、６０℃におけるシグナルのための個別閾値は、‘２００’と決定した。
図１Ｄ及び１Ｅに示されたように、６０℃における個別閾値によって、チューブ２及びチューブ３で前記ＮＧの存在を確認し、さらに、Ｃｔ値は、それぞれ３１．３２及び３５．８３と得られた。チューブ１及びチューブ４では、ＮＧに対するＣｔ値を求めることができなかった。
このような結果は、２つの温度におけるシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイム方法において、（ｉ）前記相対的高温検出温度におけるシグナル検出は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列を検出できるようにして、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で得られたシグナルが、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列を検出するために利用できることを示す。
したがって、１つの検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用して、１つの反応容器で２つのターゲット核酸を検出できる。
実施例２：相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲによる２つのターゲット検出
本発明者らは、１つの検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用して、１つの反応容器で２つのターゲット核酸を検出できるかどうかを実験した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＴａｑＭａｎプローブの切断、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
ＣＴを検出するためにＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。ＣＴが存在すると、ＴａｑＭａｎプローブは切断されて、標識された断片が放出される。増幅曲線は、前記標識された断片からのシグナルを測定して得られる。ＮＧを検出するために、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲ方法を使用した。
本実施例において、シグナル発生手段を考慮し、ＣＴのためのシグナル検出温度として‘７２℃’を選択して、ＮＧのためのシグナル検出温度として‘６０℃’を選択した。前記ＮＧの存在によって生成された延長デュープレックスは、その配列及び長さにより調節された、調節可能なＴｍ値を有する。本実施例において、延長デュープレックスの配列及び長さは、６０℃では前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するが、７２℃では、前記デュープレックスを形成せず、解離されて、シグナルを提供しないようにデザインした。７２℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルが発生されて検出される。６０℃の検出温度では、前記ＣＴに対するシグナルだけではなく、前記ＮＧに対するシグナルが発生されて検出される。
ＴａｑＭａｎプローブは、その５’−末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）及びその３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）で標識されている（配列番号：９）。前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識されている（配列番号：４）。
ＣＴ、ＮＧ、ＣＴ及びＮＧの混合物及びターゲットのない対照群のそれぞれを含む４つの反応チューブを用意した。
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＴａｑＭａｎプローブの配列は、以下のようである：
ＮＧ＿Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （配列番号： １）
ＮＧ＿Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’ （配列番号： ２）
ＮＧ＿ＰＴＯ ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ３）
ＮＧ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ４）
ＣＴ＿Ｆ ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’ （配列番号： ５）
ＣＴ＿Ｒ ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’ （配列番号： ６）
ＣＴ＿Ｐ ５’−［Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［ＢＨＱ−２］−３’ （配列番号： ９）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す）
ターゲット核酸（ＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ， ＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇまたはＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー （配列番号： １） １０ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー （配列番号： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ４） １ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号： ５） １０ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： ６） １２ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号： ９） １ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス［最終的に２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素］ １０μｌを含有した２０μｌの最終容量でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応した後、９５℃で１５分間変性させて９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、サイクル毎に６０℃及び７２℃で実施した。
図２Ａに示されたように、ＣＴが存在する場合（チューブ１及び３）は、７２℃でシグナルが検出された。ＮＧのみが存在する場合（チューブ２）は、６０℃でシグナルが検出されたが、７２℃では、シグナルが検出されなかった。ターゲット核酸が存在しない場合（チューブ４）は、シグナルが検出されなかった。図２Ａの結果は、高温検出温度である７２℃で、相対的高温検出温度を有するＣＴに対するシグナルは発生されるが、相対的低温検出温度を有するＮＧに対するシグナルは発生されないことを示す。したがって、前記相対的高温検出温度におけるシグナル検出により、少なくとも前記相対的高温検出温度を有するＣＴの存在を決定することができることが分かる。また、チューブ２において、前記相対的高温検出温度におけるシグナルの不在及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルの存在による相違を利用することは、前記相対的低温検出温度を有するＮＧの存在を決定できるようにした。
前記相対的高温検出温度を有するＣＴからのシグナルが存在する場合または存在しない場合にも前記相対的低温検出温度を有するＮＧの存在が検出できるかどうかを実験するために、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を、多様な接近法を利用して計算した（図２Ｂ〜２Ｅ）。
前記図２Ｂは、７２℃及び６０℃でエンドポイントのＲＦＵ値の比率を示す（全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン差し引かれた曲線フィット’分析データに由来してエクスポートされる）。ＣＴのみが存在する場合（チューブ１）の比率は、１．１であったが、ＣＴ及びＮＧが両方とも存在する場合（チューブ３）の比率は、１．８であった。また、ＮＧのみが存在する場合（チューブ２）の比率及び如何なるターゲット核酸もない場合（チューブ４）の比率は、それぞれ１２７８．０及び１．０であった。ＮＧの存在または不在を決定するために、閾値１．２を適用した。前記閾値によって、チューブ２及び３では、ＮＧの存在を確認して、チューブ１及び４には、ＮＧがないことを確認した。前記閾値は、ＣＴのみを含むチューブからのエンド−比率（Ｅｎｄ−Ｒａｉｏ）を考慮して決定した。択一的に、チューブ２のように、相対的高温検出温度を有するＣＴが存在しないと決定できる場合、前記相対的低温検出温度におけるシグナルに対する閾値は、１．２を適用する代わりに、独立的に設定できる。
７２℃及び６０℃におけるシグナルを利用する他の接近法は、毎サイクルにおいて７２℃及び６０℃における蛍光シグナルの比率を計算し、前記比率をサイクルに対してプロッティングすることである（プロッティングのために処理された全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン未差し引き（ｎｏ Ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）’分析データに由来してエクスポートされる）。 ＮＧの存在または不在を決定するために、閾値０．１を適用した。前記閾値は、ＣＴのみを含むチューブからの比率プロットを考慮して決定した。図２Ｃに示したように、チューブ２及び３でＮＧの存在を確認し、Ｃｔ値は、それぞれ３７．８８及び３７．２０であった。チューブ１及び４では、Ｃｔ値が得られなかった。比率を計算する代わりに、サイクル毎に７２℃における蛍光強度から６０℃における蛍光強度を差し引き、ターゲット検出のために、前記結果をサイクルに対してプロッティングすることができる。
前記相対的高温検出温度におけるシグナルを利用して、前記相対的低温検出温度を有するＮＧの存在を検出する他の方法は、それぞれのチューブにおいて、６０℃で得られたシグナルの分析のために個別閾値を適用することである。７２℃でＣＴの存在を示すシグナルが検出される場合、７２℃におけるそれぞれのＥｎｄ−ＲＦＵに閾値（１．２）を掛けて、前記チューブから６０℃におけるシグナルに対する個別閾値を計算した。前記閾値（１．２）は、ＣＴのみを含むチューブからのエンド−比率（参照：図２Ｂ）を考慮して決定した。７２℃でシグナルが検出されなかった場合、閾値の一般的な設定方法によって、背景シグナル、敏感度及びシグナル変化または装置の誤差範囲を考慮し、前記チューブから６０℃におけるシグナルに対する個別閾値を選択して利用した。本実施例において、６０℃におけるシグナルのための個別閾値は、‘２００’と決定した。
図２Ｄ及び２Ｅに示されたように、６０℃における個別閾値によって、チューブ２及びチューブ３で前記ＮＧの存在を確認し、さらに、Ｃｔ値は、それぞれ３６．２１及び３７．０７と得られた。チューブ１及びチューブ４では、ＮＧに対するＣｔ値を求めることができなかった。
このような結果は、２つの温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイム方法において、（ｉ）前記相対的高温検出温度におけるシグナル検出は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列を検出できるようにして、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度で得られたシグナルが、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列を検出するために利用できることを示す。
したがって、１つの検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用して、１つの反応容器で２つのターゲット核酸を検出できる。
実施例３：リアルタイムＰＣＲ及びメルティング分析による２つのターゲット検出
本発明者らは、１つの検出チャンネル及びリアルタイムＰＣＲとメルティング分析の組み合わせを利用して、１つの反応容器で２つのターゲット核酸を検出できるかどうかを実験した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＴａｑＭａｎプローブの切断、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ及びＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
ＣＴを検出するためにＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用して、ＮＧを検出するためにＰＴＯＣＥメルティング分析を使用した。ＣＴが存在すると、ＴａｑＭａｎプローブは切断されて、標識された断片が放出される。ＮＧが存在すると、ＰＴＯは、切断されて、ＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされて、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長され、ＣＴＯと延長デュープレックス（デュープレックスＣＴＯ）を形成する。
リアルタイムＰＣＲ過程の間、ＴａｑＭａｎプローブの切断により発生される蛍光シグナルのみを検出するために、延長デュープレックスは、解離されてデュープレックスを形成しないため、ＰＴＯＣＥにより形成された前記延長デュープレックスから、シグナルが発生しない温度で前記蛍光シグナル検出を実施した。メルティング過程において、ＮＧの存在によって形成された延長デュープレックスの存在を示すメルティングピークを得るために、シグナルを測定した。
ＴａｑＭａｎプローブは、その５’−末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）及びその３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）で標識されている（配列番号：９）。前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識されている（配列番号：４）。
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＴａｑＭａｎプローブの配列は、以下のようである：
ＮＧ＿Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （配列番号： １）
ＮＧ＿Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’ （配列番号： ２）
ＮＧ＿ＰＴＯ ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ３）
ＮＧ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ４）
ＣＴ＿Ｆ ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’ （配列番号： ５）
ＣＴ＿Ｒ ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’ （配列番号： ６）
ＣＴ＿Ｐ ５’−［Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［ＢＨＱ−２］−３’ （配列番号： ９）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
ターゲット核酸（ＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ， ＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇまたはＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ及びＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー （配列番号： １） １０ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー （配列番号： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ４） １ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号： ５） １０ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： ６） １２ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号： ９） １ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス［最終的に２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素］ １０μｌを含有した２０μｌの最終容量でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応した後、９５℃で１５分間変性させて９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、サイクル毎に６０℃及び７２℃で実施した。前記反応後、前記チューブを５５℃で５分間反応した。５５℃から９５℃まで０．５℃間隔で温度を上げる間に蛍光シグナルを測定し、メルティング曲線分析を実施した。
図３に示されたように、ＣＴが存在する場合（チューブ１）は、リアルタイムＰＣＲの間、増幅曲線が得られたが、メルティング分析において、メルティングピークは観察されなかった。ＮＧが存在する場合（チューブ２）は、リアルタイムＰＣＲの間、増幅曲線が得られなかったが、メルティング分析において、ＮＧの存在によって形成された延長デュープレックスの予想されたＴｍ値（６６℃）を有するメルティングピークが観察された。ＣＴ及びＮＧが存在する場合（チューブ３）は、リアルタイムＰＣＲ過程及びメルティング分析過程、両方でシグナルが観察された。ターゲット核酸が存在しない場合（チューブ４）は、如何なるシグナルも観察されなかった。
このような結果は、リアルタイムＰＣＲ及びメルティング分析の組み合わせにより、１つの検出チャンネルだけでも複数のターゲット核酸を検出することができることを示す。
実施例４：相異なる温度におけるシグナル検出を含むリアルタイムＰＣＲによるＳＮＰ遺伝子型分析
本発明者らは、相異なる温度におけるシグナル検出を含むリアルタイムＰＣＲが、１つの反応容器で、１つの検出チャンネルを利用したＳＮＰ遺伝子型分析に適用可能であるかを実験した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した。ＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡの野生型（Ｃ）同型接合体、突然変異型（Ｔ）同型接合体、及び異型接合体をターゲット核酸配列として使用した。
ＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡの野生型（Ｃ）対立遺伝子及び突然変異型（Ｔ）対立遺伝子を検出するために、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを使用した。ターゲット対立遺伝子が存在する場合、ＰＴＯは切断されて、ＰＴＯ断片が生成される。前記ＰＴＯ断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にアニーリングされて、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位上で延長され、ＣＴＯと延長デュープレックス（デュープレックスＣＴＯ）を形成する。前記延長デュープレックスの形成は、シグナルを提供して、延長デュープレックス−形成温度におけるシグナルを測定し、増幅曲線を得ることができる。
本実施例において、シグナル発生手段を考慮し、野生型（Ｃ）対立遺伝子のためのシグナル検出温度として‘７２℃’を選択して、突然変異型（Ｔ）対立遺伝子のためのシグナル検出温度として‘５５℃’を選択した。野生型（Ｃ）対立遺伝子または突然変異型（Ｔ）対立遺伝子の存在によって生成された延長デュープレックスは、その配列及び長さにより調節された調節可能なＴｍ値を有する。本実施例において、前記野生型（Ｃ）対立遺伝子に対する延長デュープレックスの配列及び長さは、７２℃で前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するようにデザインした。一方、前記突然変異型（Ｔ）対立遺伝子に対する延長デュープレックスの配列及び長さは、５５℃では前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するが、７２℃では、前記デュープレックスを形成せず、解離されて、シグナルを提供しないようにデザインした。７２℃の検出温度では、前記野生型（Ｃ）対立遺伝子に対するシグナルが発生されて検出される。５５℃の検出温度では、前記野生型（Ｃ）対立遺伝子に対するシグナルだけではなく、前記突然変異型（Ｔ）対立遺伝子に対するシグナルが発生されて検出される。
前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識されている（配列番号：１３及び１５）。
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は、以下のようである：
Ｍ６７７＿Ｆ ５’−ＣＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＣＡＧＧＧＡＩＩＩＩＩＧＡＧＧＣＴＧＡＣＣ−３’ （配列番号： １０）
Ｍ６７７＿Ｒ ５’−ＣＡＡＧＴＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＴＣＧＧＩＩＩＩＩＧＣＣＴＴＣＡＣＡＡ−３’ （配列番号： １１）
Ｍ６７７＿Ｗ＿ＰＴＯ ５’−ＧＧＴＣＣＣＧＡＣＧＴＴＡＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： １２）
Ｍ６７７＿Ｗ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＣＣＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＣＣＡＴＣＧＧ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＴＣＴＴＣＴＡＡＣＧＴＣＧＧＧＡＣＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： １３）
Ｍ６７７＿Ｍ＿ＰＴＯ ５’−ＡＣＧＴＣＧＡＴＴＣＧＣＡＣＴＣＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： １４）
Ｍ６７７＿Ｍ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＴＴＣＴＧＣＧＡＡＴＣＧＡＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： １５）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
ターゲット核酸（ＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡの野生型（Ｃ）同型接合体 １ｎｇ、ＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡの突然変異型（Ｔ）同型接合体 １ｎｇまたはＭＴＨＦＲ（Ｃ６７７Ｔ）ヒトゲノムＤＮＡの異型接合体 １ｎｇ）、アップストリームプライマー （配列番号： １０） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー （配列番号： １１） ５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： １２及び１４） それぞれ３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： １３及び１５） それぞれ１ｐｍｏｌｅ、及び２Ｘマスターミックス［最終的に２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素］ １０μｌ含有した２０μｌの最終容量でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応した後、９５℃で１５分間変性させて９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、７２℃で３０秒過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、サイクル毎に５５℃及び７２℃で実施した。
図４Ａに示されたように、野生型（Ｃ）同型接合体が存在する場合（チューブ１）または異型接合体が存在する場合（チューブ３）は、７２℃及び５５℃でシグナルが検出された。突然変異型（Ｔ）同型接合体が存在する場合（チューブ２）は、５５℃で強いシグナルが検出されたが、７２℃では、非常に弱いシグナルが検出された。ターゲット核酸が存在しない場合（チューブ４）は、如何なるシグナルも検出されなかった。
図４Ｂは、７２℃及び５５℃でエンドポイントのＲＦＵ値の比率を示す（全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン差し引かれた曲線フィット（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ）’分析データに由来してエクスポートされる）。野生型（Ｃ）同型接合体が存在する場合（チューブ１）の比率は、１．２であったが、異型接合体が存在する場合（チューブ３）の比率は、１．９であった。このような前記２つの比率間の差異は、異型接合体を含むチューブにおいて、突然変異型（Ｔ）対立遺伝子が野生型（Ｃ）対立遺伝子と共に存在することを示す。一方、突然変異型（Ｔ）同型接合体の場合（チューブ２）、７２℃におけるＲＦＵ値が低いため、突然変異型（Ｔ）同型接合体から得られた比率は、相対的に非常に大きかった。異型接合体において、野生型対立遺伝子及び突然変異型対立遺伝子が１：１比率で存在するということを考慮すると、突然変異型同型接合体が存在する場合において、前記７２℃で検出された弱いシグナルは、擬陽性シグナルであることが分かる。ＳＮＰ遺伝子型分析のための本発明の方法によると、前記比率値は、前記相対的高温検出温度におけるシグナルが誤ったシグナルか否かを決定できるようにする。
このような結果は、相異なる温度でシグナル検出を含むリアルタイムＰＣＲが、１つの検出チャンネルを利用したＳＮＰ遺伝子型分析に適用できることを示し、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度におけるシグナルから得られた相違が、ＳＮＰ遺伝子型分析のために使用できることを示す。
実施例５：相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲによる複数のターゲット検出
本発明者らは、１つの検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用して、１つの反応容器で３つのターゲット核酸を検出できるかどうかを実験した。
アップストリームプライマーとダウンストリームプライマーの延長、ＴａｑＭａｎプローブの切断、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’−ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を使用した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）のゲノムＤＮＡ及びＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ（ＭＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸配列として使用した。
ＭＧを検出するためにＴａｑＭａｎリアルタイムＰＣＲを使用した。ＣＴ及びＮＧを検出するために、ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを使用した。
本実施例において、シグナル発生手段を考慮し、ＭＧのためのシグナル検出温度として‘９５℃’を選択して、ＣＴのためのシグナル検出温度として‘７２℃’を選択し、ＮＧのためのシグナル検出温度として‘６０℃’を選択した。本実施例において、前記ＣＴまたはＮＧの延長デュープレックスの配列及び長さは、７２℃または６０℃では前記デュープレックスを形成してシグナルを提供するが、９５℃では、前記デュープレックスを形成せず、解離されて、シグナルを提供しないようにデザインした。９５℃の検出温度では、前記ＭＧに対するシグナルが発生されて検出される。７２℃の検出温度では、前記ＭＧに対するシグナルだけではなく、前記ＣＴに対するシグナルが発生されて検出される。また、６０℃の検出温度では、前記ＭＧ及びＣＴに対するシグナルだけではなく、前記ＮＧに対するシグナルが発生されて検出される。
ＴａｑＭａｎプローブは、その５’−末端に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）及びその３’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）で標識されている（配列番号：１８）。前記ＰＴＯ及びＣＴＯは、その延長が防止されるように、その３’−末端がカーボンスペーサーでブロッキングされている。前記ＣＴＯは、その５’−末端にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及びそのテンプレーティング部位に蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識されている（配列番号：４及び８）。
ＮＧ、ＣＴ、ＭＧ、ＮＧ及びＣＴの混合物、ＮＧ及びＭＧの混合物、ＣＴ及びＭＧの混合物、ＮＧ、ＣＴ、及びＭＧの混合物及びターゲットのない対照群のそれぞれを含む８つの反応チューブを用意した。
本実施例で使用したアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びＴａｑＭａｎプローブの配列は、以下のようである：
ＮＧ＿Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴＩＩＩＩＩＧＴＡＡＴＣＡＧＡＴＧ−３’ （配列番号： １）
ＮＧ＿Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣＩＩＩＩＩＣＧＡＧＣＡＡＧＡＡＣ−３’ （配列番号： ２）
ＮＧ＿ＰＴＯ ５’−ＧＴＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ３）
ＮＧ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＣＴＧＣＣＣＧＴＡＴＣＧＣＧＴＡＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ４）
ＣＴ＿Ｆ ５’−ＧＡＧＴＴＴＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＣＴＧＧＴＩＩＩＩＩＴＴＴＧＴＡＴＡＡＣ−３’ （配列番号： ５）
ＣＴ＿Ｒ ５’−ＣＣＡＡＴＴＧＴＡＡＴＡＧＡＡＧＣＡＴＴＧＧＴＴＧＩＩＩＩＩＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡ−３’ （配列番号： ６）
ＣＴ＿ＰＴＯ ５’−ＧＡＴＴＡＣＧＣＧＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＴＧＧＣＴＧＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ７）
ＣＴ＿ＣＴＯ ５’−［ＢＨＱ−２］ＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＡＣＧＡ［Ｔ（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）］ＡＴＧＴＧＣＧＧＴＣＧＣＧＴＡＡＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （配列番号： ８）
ＭＧ−Ｆ ５’−ＡＡＡＡＣＣＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＩＩＩＩＩＡＴＴＧＧＴＴＣＴＡＣ−３’ （配列番号： １６）
ＭＧ−Ｒ ５’−ＣＴＣＧＴＴＡＡＴＴＴＡＣＣＴＡＴＴＣＣＡＴＴＴＴＧＩＩＩＩＩＣＴＧＡＴＡＡＡＡＧ−３’ （配列番号： １７）
ＭＧ−Ｐ ５’−［ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＧＡＧＴＴＣＴＴＴＣＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＡＧＡＧＧＴＧＴ［ＢＨＱ−２］−３’ （配列番号： １８）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
ターゲット核酸（ＮＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ、ＣＴゲノムＤＮＡ １０ｐｇ、ＭＧゲノムＤＮＡ １０ｐｇ、それぞれ１０ｐｇのＮＧ及びＣＴゲノムＤＮＡの混合物、それぞれ１０ｐｇのＮＧ及びＭＧゲノムＤＮＡの混合物、それぞれ１０ｐｇのＣＴ及びＭＧゲノムＤＮＡの混合物、それぞれ１０ｐｇのＮＧ、ＣＴ及びＭＧゲノムＤＮＡの混合物）、ＮＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー （配列番号： １） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： ２） ５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ３） ３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ４） １ｐｍｏｌｅ、ＣＴターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号： ５） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： ６） ５ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（配列番号： ７） ３ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（配列番号： ８） １ｐｍｏｌｅ、ＭＧターゲット増幅のためのアップストリームプライマー（配列番号： １６） ５ｐｍｏｌｅ及びダウンストリームプライマー（配列番号： １７） ５ｐｍｏｌｅ、ＴａｑＭａｎプローブ（配列番号：１８） １ｐｍｏｌｅ及び２Ｘマスターミックス［最終的に２００μＭ ｄＮＴＰｓ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び２Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素］ １０μｌ含有した２０μｌの最終容量でリアルタイムＰＣＲを実施した。前記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイム熱循環器（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させて、５０℃で５分間反応した後、９５℃で１５分間変性させて９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒過程を５０サイクル繰り返した。シグナルの検出は、サイクル毎に６０℃、７２℃及び９５℃で実施した。
図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃに示したように、９５℃で検出されたシグナルは、チューブ３、５、６及び７において、少なくとも相対的最高検出温度（９５℃）を有するＭＧの存在を決定できるようにした。
前記相対的最高検出温度（９５℃）におけるシグナルの不在及び前記相対的中間検出温度（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｍｉｄｄｌｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；７２℃）におけるシグナル存在による相違の利用は、チューブ２及び４において、前記相対的中間検出温度（７２℃）を有するＣＴの存在を決定できるようにした。
さらに、前記相対的中間検出温度（７２℃）におけるシグナルの不在及び前記相対的最低検出温度（６０℃）におけるシグナル存在による相違の利用は、チューブ１において、前記相対的最低検出温度（６０℃）を有するＮＧの存在を決定できるようにした。
他のターゲットと共に存在するＣＴまたはＮＧを、１つの反応容器で確認できるかどうかを調べるために、前記９５℃、７２℃及び６０℃で検出されたシグナル間の相違をＥｎｄ−ＲＦＵｓ（Ｅｎｄ−△ＲＦＵ）の引き算により計算した。
図５Ｄは、９５℃及び７２℃でエンドポイントのＲＦＵ値を利用して計算されたＥｎｄ−△ＲＦＵｓを示す（全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン差し引かれた曲線フィット（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃｕｒｖｅ ｆｉｔ）’分析データに由来してエクスポートされる）。ＣＴの存在を決定するために、閾値‘３００’を適用した。前記閾値は、ＣＴを含んでいないチューブ（チューブ１、３及び５）からのＥｎｄ−△ＲＦＵｓを考慮して決定した。前記閾値によって、チューブ２、４、６及び７でＣＴの存在を確認した。
図５Ｅは、７２℃及び６０℃でエンドポイントのＲＦＵ値を利用して計算されたＥｎｄ−△ＲＦＵｓを示す（全てのＲＦＵ値は、装置ソフトウェアで‘ベースライン差し引かれた曲線フィット’分析データに由来してエクスポートされる）。ＮＧの存在を決定するために、閾値‘８００’を適用した。前記閾値は、ＮＧを含んでいないチューブ（チューブ２、３及び６）からのＥｎｄ−△ＲＦＵｓを考慮して決定した。前記閾値によって、チューブ１、４、５及び７でＮＧの存在を確認した。
このような結果は、３つの温度でシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイム方法において、（ｉ）前記相対的最高検出温度におけるシグナル検出は、前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列を検出できるようにして、（ｉｉ）前記最高検出温度より低い検出温度を有するターゲット核酸配列を確認するために、前記相異なる検出温度におけるシグナルから得られた相違が使用できるということを示す。
したがって、１つ検出チャンネル及び相異なる温度におけるシグナル検出を含むＴａｑＭａｎ／ＰＴＯＣＥリアルタイムＰＣＲを利用し、１つの反応容器で複数のターゲット核酸を検出することができる。
以上、本発明の望ましい具現例を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (59)

  1. （ａ）１つの反応容器で、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための２つのシグナル発生手段（ｓｉｇｎａｌ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｍｅａｎｓ）と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器（ｓｉｎｇｌｅ ｔｙｐｅ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を利用して検出する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度（Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｌｏｗ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と、
    （ｂ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法。
  2. 前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. 前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  4. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  5. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチド（ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  6. 前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチド（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  7. 前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  8. 前記２つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器によって区別されないことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  9. 前記相違は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られる相違を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  10. 前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されない場合、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記相対的低温検出温度で検出されたシグナルにより決定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  11. 前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合、前記方法は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために基準値（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ）を利用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  12. 前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは異なる反応容器で、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の検出のためのシグナル発生手段と共に前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列をインキュベーションし、（ｉｉ）前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた基準値を利用することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記１つの反応容器は、前記２つのターゲット核酸配列以外のターゲット核酸配列を検出するための追加的な２つのシグナル発生手段をそれぞれ含む少なくとも１つの追加的なセット（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｓｅｔ）をさらに含み、前記容器において、２つのシグナル発生手段の各セットにより発生された前記シグナルは、互いに区別されて、前記シグナルは、相異なる類型の検出器によりそれぞれ検出されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  14. 前記２つのターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を含み、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記ヌクレオチド変異の一類型を含み、他の１つは、ヌクレオチド変異の他の類型を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  15. 前記ヌクレオチド変異は、単一ヌクレオチド多形性（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. （ａ）１つの反応容器で、ＳＮＰ対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅｓ）を検出するためのシグナル発生手段と共に、前記単一ヌクレオチド多形性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）サイトを含む核酸配列を含む試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記それぞれのＳＮＰ対立遺伝子は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルとを両方とも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度及び前記相対的低温検出温度の両方で実施される）と、
    （ｂ）前記段階（ａ）で前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違によりＳＮＰ遺伝子型を決定する段階と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析（ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）する方法。
  17. （ａ）１つの反応容器で、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される）と、
    （ｂ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、特定検出温度（ｃｅｒｔａｉｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度（Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｈｉｇｈｅｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）である場合、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される）と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法。
  18. 前記段階（ｂ）は、相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を先に決定した後、降べきの順に相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を順次に決定して実施することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  22. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  23. 前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  24. 前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  25. 前記少なくとも３つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器によって区別されないことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  26. 前記相違は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナルを数学的に処理して得られる相違を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  27. 前記特定検出温度より高い検出温度でシグナルが検出されない場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い検出温度でシグナルが検出されないことを考慮し、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  28. 前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列が存在する場合、前記方法は、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、少なくとも１つの基準値を利用することを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  29. 前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、前記方法は、（ｉ）前記段階（ａ）における反応容器とは別の反応容器で、前記特定検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列のあらゆる組み合わせを、対応するシグナル発生手段と共にインキュベーションし、（ｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度だけではなく、前記特定検出温度でシグナルを検出した後、（ｉｉｉ）前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違を求めて得られた前記基準値のうち、少なくとも１つの基準値を利用することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記１つの反応容器は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列以外のターゲット核酸配列を検出するための追加的な少なくとも３つのシグナル発生手段をそれぞれ含む少なくとも１つの追加的なセットをさらに含み、前記容器において、少なくとも３つのシグナル発生手段の各セットにより発生された前記シグナルは、互いに区別されて、前記シグナルは、相異なる類型の検出器によりそれぞれ検出されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  31. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
  32. （ａ）１つの反応容器で、試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するための２つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル及び前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを両方とも発生できる温度であって、前記２つのシグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、前記相対的高温検出温度で実施される）と、
    （ｂ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で前記段階（ａ）のインキュベーション結果物（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔａｎｔ）のメルティング分析を実施する段階と、
    （ｃ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定し、前記段階（ｂ）のメルティング分析の結果を利用して前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する段階と、
    を含む、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出する方法。
  33. 前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記２つのシグナル発生手段は、同一な標識を含み、前記標識からのシグナルは、単一類型の検出器によって区別されないことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
  41. （ａ）１つの反応容器で、試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するための少なくとも３つのシグナル発生手段と共に前記試料をインキュベーションし、発生したシグナルを単一類型の検出器を利用して検出する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の一部のターゲット核酸配列は、検出温度分析により検出されて、前記検出は、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列の検出温度と前記検出温度より高い１つ以上の検出温度との両方で実施される）と、
    （ｂ）前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定するために、一定範囲の温度で前記段階（ａ）のインキュベーション結果物のメルティング分析を実施する段階と、
    （ｃ）（ｉ）前記段階（ａ）で検出されたシグナルによって、前記ターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列の存在を決定し、ここで前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記段階（ｂ）のメルティング分析の結果によって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の前記一部のターゲット核酸配列以外の他のターゲット核酸配列の存在を決定する段階と、
    を含む、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出する方法。
  42. 前記段階（ｃ）は、相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を先に決定した後、降べきの順に相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を順次に決定して実施することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  43. 前記段階（ａ）は、核酸増幅を伴うシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記段階（ａ）は、核酸増幅のないシグナル増幅過程で実施されることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成に依存的な方式でシグナルを発生させるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  46. 前記それぞれのターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  47. 前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、デュープレックスの形成によるシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  48. 前記相対的最高検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、検出オリゴヌクレオチドの切断によるシグナル発生手段であり、前記その他のターゲット核酸配列に対するシグナル発生手段は、前記ターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされた媒介オリゴヌクレオチドの切断に依存的な方式でデュープレックスが形成されることを利用するシグナル発生手段であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  49. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含むことを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
  50. （ａ）試料内の２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段と、
    （ｂ）請求項１から１５のいずれかに記載の方法を記載した説明書と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するためのキット。
  51. （ａ）ＳＮＰ対立遺伝子の検出のためのシグナル発生手段と、
    （ｂ）請求項１６に記載の方法を記載した説明書と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析するためのキット。
  52. （ａ）試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段と、
    （ｂ）請求項１７から３１のいずれかに記載の方法を記載した説明書と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するためのキット。
  53. （ａ）試料内の２つのターゲット核酸配列の検出のための２つのシグナル発生手段と、
    （ｂ）請求項３２から４０のいずれかに記載の方法を記載した説明書と、
    を含む、相異なる検出温度及びメルティング分析を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列を検出するためのキット。
  54. （ａ）試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の検出のための少なくとも３つのシグナル発生手段と、
    （ｂ）請求項４１から４９のいずれかに記載の方法を記載した説明書と、
    を含む、検出温度分析及びメルティング分析を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列を検出するためのキット。
  55. （ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、発生したシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
    （ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
  56. （ａ）コンピュータープロセッサーと、（ｂ）前記コンピュータープロセッサーにカップリングされた請求項５５に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体とを含む、相異なる検出温度を利用して試料内のターゲット核酸配列を検出するための装置。
  57. （ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのターゲット核酸配列は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記発生したシグナルは、単一類型の検出器を利用して検出されて、前記２つのターゲット核酸配列の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される前記相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
    （ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記２つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（（ｉ）前記相対的高温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナルにより決定されて、（ｉｉ）前記相対的低温検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び前記相対的低温検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定される）と、
    を含む、試料内の２つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する、コンピューター読み取り可能な記録媒体に貯蔵されるコンピュータープログラム。
  58. （ａ）相対的高温検出温度で検出されたシグナル及び相対的低温検出温度で検出されたシグナルを両方とも受信する段階（前記それぞれのＳＮＰ対立遺伝子は、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記ＳＮＰ対立遺伝子の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的高温検出温度を有し、他の１つは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相対的低温検出温度を有して、前記相対的高温検出温度は、前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルを発生できる温度であり、前記相対的低温検出温度は、前記相対的低温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルと前記相対的高温検出温度を有するＳＮＰ対立遺伝子に対するシグナルとを両方とも発生できる温度である）と、
    （ｂ）前記受信されたシグナル間の相違によりＳＮＰ遺伝子型を決定する段階と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の核酸配列のＳＮＰ遺伝子型を分析する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
  59. （ａ）少なくとも３つの検出温度で検出されたシグナルを受信する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、対応するシグナル発生手段により検出されて、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のそれぞれは、前記対応するシグナル発生手段により決定される相異なる検出温度を有し、前記検出温度は、前記検出温度を有するターゲット核酸配列のシグナルだけではなく、前記検出温度より高い検出温度を有するターゲット核酸配列に対するシグナルも発生できる温度であって、前記シグナル発生手段により発生されるシグナルは、前記単一類型の検出器によって区別されず、前記検出は、それぞれの相異なる検出温度で実施される）と、
    （ｂ）前記受信されたシグナルによって、前記少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する段階（前記少なくとも３つのターゲット核酸配列のうち、特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在を決定する場合、前記特定検出温度を有するターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度より高い１つ以上の検出温度で検出されたシグナル及び前記特定検出温度で検出されたシグナル間の相違により決定されて、前記特定検出温度が前記検出温度の中で相対的最高検出温度である場合、前記ターゲット核酸配列の存在は、前記特定検出温度で検出されたシグナルにより決定される）と、
    を含む、相異なる検出温度を利用して試料内の少なくとも３つのターゲット核酸配列の存在を決定する方法を実行するためのプロセッサーを具現する指示を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
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