KR102604951B1 - 상이한 검출 온도를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 상이한 검출 온도를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다. 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지만으로도 종래의 실시간 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 종래 기술은 타겟 증폭 후 멜팅 분석을 통해 복수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 이와 달리, 본 발명은 타겟 증폭 후 멜팅 분석을 필요로 하지 않아, 분석 시간이 획기적으로 단축된다.
Description
본 발명은 상이한 검출 온도를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 실시간 검출 방법이 널리 이용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 이용한다. 표지된 프로브 및 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예는 헤어핀 구조를 갖는 이중-표지된 프로브를 이용하는 분자 비콘(Molecular beacon) 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ 등, Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체(donor) 및 수용체(acceptor)로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad 등, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일-표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 럭스(Lux) 방법(미국 특허 제7,537,886호)을 포함한다. 이중-표지된 프로브와 DNA 중합효소의 5’-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용하는 방법의 예는 선라이즈(Sunrise) 프라이머 방법(Nazarenko 등, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호) 및 스콜피온(Scorpion) 프라이머 방법(Whitcombe 등, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145호) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011-078441)을 포함한다.
대체 접근법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성되는 이합체를 이용하는 실시간 검출 방법이 제안되었다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 미국 특허 제6,358,691호 및 미국 특허 제6,194,149호), PTO 절단 및 연장(PTO cleavage and extension; PTOCE) 방법(WO 2012/096523), PTO 절단 및 연장-의존적 시그널링 올리고뉴클레오타이드 혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization; PCE-SH) 방법(WO 2013/115442), PTO 절단 및 연장-의존적 비-혼성화(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization; PCE-NH) 방법(PCT/KR2013/012312).
상기 기술된 종래 실시간 검출 기술들은 타겟 증폭과 관련되거나 무관한 시그널 증폭 과정에서 하나의 선택된 검출 온도에서 형광 표지로부터 발생된 시그널을 검출한다. 종래 실시간 검출 기술에 따라 하나의 반응 튜브에서 단일 유형의 표지를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 타겟 핵산 서열에 대해 발생된 시그널들은 서로 구별되지 않는다. 따라서, 종래 실시간 검출 기술들은 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 일반적으로 상이한 유형의 표지들을 이용한다. Tm 차이를 이용하는 멜팅 분석은 단일 유형의 표지를 이용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 하지만, 멜팅 분석은 실시간 기술보다 수행 시간이 더 길며 타겟 핵산 서열이 증가할수록 상이한 Tm 값을 갖는 프로브의 디자인이 점점 어려워진다는 점에서 심각한 결점을 가지고 있다.
따라서, 멜팅 분석에 의존하지 않는, 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규 방법 또는 접근법이 개발되는 경우, 매우 향상된 편의성, 비용-효과 및 효율성으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 또한, 상기 신규 방법을 다른 검출 방법(예컨대, 멜팅 분석)과 조합하면 매우 향상된 효율로 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있을 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명자들은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 신규한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 조절된 검출 온도에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 얻은 다음, 검출 결과를 적합하게 해석함으로써, 매우 향상된 편의성, 비용-효과 및 효율성으로 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법 및 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용하여 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법 및 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 장치를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 가장 큰 특징은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 것이다. 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 이용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 구성들은 본 발명의 특징에 맞추어 선택되고, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 놀라운 프로세스가 된다.
종래 실시간 PCR 방법은 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 2가지 유형의 형광 표지 또는 멜팅 분석이 필요하다.
본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 형광 표지를 이용하여 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 PCR 프로토콜을 가능하게 한다. 택일적으로, 본 발명은 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나를 실시간 PCR을 이용하여 검출하고, 다른 하나를 멜팅 분석을 이용하여 검출함으로써, 2개의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
본 발명은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단에 따라, 온도에 의해 시그널의 검출을 조절할 수 있다는 본 발명자들의 연구 결과를 이용한다.
예를 들어, 제1 타겟 핵산 서열의 검출을 위하여 타겟 핵산 서열과 프로브의 혼성화에 의한 시그널-발생 수단을 사용하는 경우, 프로브가 제1 타겟 핵산 서열과 혼성화되는 온도에서 제1 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 발생하고 검출될 수 있다. 이와 대조적으로, 프로브가 제1 타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않는 온도에서는 시그널이 발생하지 않고 검출되지 않는다. 이러한 관점에서, 시그널-발생 수단에 따라, 시그널이 발생되는 온도와 시그널이 발생되지 않는 온도가 있다는 것을 알 수 있을 것이다.
이러한 시그널-발생 수단에서, 프로브가 제1 타겟 핵산 서열과 혼성화되는 온도가 제1 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도로 사용될 수 있다. 프로브가 제1 타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않는 온도는 검출 온도로 사용될 수 없다.
또한, 제2 타겟 핵산 서열의 검출을 위하여 프로브 혼성화가 사용되는 경우, 제2 타겟 핵산 서열의 검출 온도는 시그널이 발생하는 온도 범위와 시그널이 발생하지 않는 온도 범위가 있다는 사실을 고려하여 결정될 수 있다.
제2 타겟 핵산 서열의 검출을 위해 사용되는 프로브의 Tm 값이 제1 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 프로브의 Tm 값보다 낮은 경우, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 발생되지 않는 상대적으로 더 높은 온도에서 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 검출할 수 있다. 즉, 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 시그널-발생 수단 간에는 시그널이 발생하고 검출되는 온도에서 차이가 있다.
시료 내에 상기 2개의 타겟 핵산 서열이 공존하는 경우, 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 발생시키되, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 발생시키지 않는 온도 범위가 있다. 한편, 상기 온도 범위보다 낮은 온도 범위에서는, 상기 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 발생된다.
2개의 온도 범위를 고려하여, 타겟 핵산 서열 각각에 대한 검출 온도가 결정될 수 있다. 상대적 고온 검출 온도는 전자의 온도 범위로부터 선택될 수 있고, 상기 상대적 고온 검출 온도는 제1 타겟 핵산 서열에 할당된다. 상대적 저온 검출 온도는 후자의 온도 범위로부터 선택될 수 있고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 제2 타겟 핵산에 할당된다.
본 발명에 따르면, 제1 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널을 측정한다. 본 발명에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 검출은 제1 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 있다.
본 발명의 중요한 기술적 특징은 상대적 저온 검출 온도를 갖는 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 모두를 이용하여 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 확인하는 것이다.
택일적으로, 본 발명자들은 상이한 검출 온도를 이용함으로써 제1 타겟 핵산 서열이 상대적 고온 검출 온도에서 검출될 수 있고, 다른 시그널 발생 접근법인 멜팅 분석을 이용하여 제2 타겟 핵산 서열이 검출될 수 있음을 고려하였다. 멜팅 분석을 위해 사용된 시그널-발생 수단은 실시간 검출 과정 동안 특정 온도에서 시그널을 제공할 수 있다. 따라서, 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나가 멜팅 분석에 의해 검출되는 경우에도, 2개의 타겟 핵산 서열은 서로 상이한 검출 온도를 가질 필요가 있다.
본 발명은 다음과 같이 다양한 양태로 구현될 수 있다:
(a) 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출;
(b) 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형 분석;
(c) 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출;
(d) 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용한 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출; 및
(e) 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용한 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출.
I. 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 2개의 시그널-발생 수단(signal-generating means)과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기(single type of detector)를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도(relatively high detection temperature)를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도(relatively low detection temperature)를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며;
(b) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; (i) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되고, (ii) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다.
증폭 곡선을 이용하는 종래 실시간 PCR 방법에 따르면, 구별되지 않는 동일한 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단을 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 구별하여 검출할 수 없다는 것이 당업계의 일반적인 상식이다.
본 발명은 본 기술분야의 일반적 상식과 관련된 한계를 극복하고, 매우 향상된 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출하는 기대하지 않았던 결과를 제공한다.
본 발명을 각각의 단계 별로 상세하세 설명하면 다음과 같다:
단계 (a):
시그널-발생 수단과의 인큐베이션 및 시그널 검출
먼저, 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단과 함께 분석될 시료를 인큐베이션한 다음, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출한다. 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생하기 위하여 시그널-발생 수단을 이용한다. 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “시그널-발생 수단(signal-generating means)”은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생에서 사용되는 어떠한 물질(any material)을 의미하며, 이는 예컨대, 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함한다. 택일적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 “시그널-발생 수단”은 시그널 발생을 위한 물질을 이용하는 어떠한 방법(any method)을 의미하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 상기 시그널-발생 수단에 의해 시그널이 발생할 수 있는 조건에서 실시된다. 이러한 조건은 용액의 온도, 염 농도 및 pH를 포함한다.
시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드의 예는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 프로브 및 프라이머)를 포함하고; 타겟 핵산 서열에 혼성화된 프로브 또는 프라이머가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 단편에 특이적으로 혼성화되는 캡처 올리고뉴클레오타이드(capture oligonucleotide)를 포함하며; 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성하는 경우, 상기 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 포함하며; 상기 시그널-발생 수단으로 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 이들의 조합을 포함한다.
시그널 발생 원리는 동일하더라도, 상이한 서열의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 시그널 발생 수단은 서로 상이한 것으로 간주될 수 있다.
상기 표지는 올리고뉴클레오타이드에 연결되거나, 자유로운 형태(free form)로 존재할 수 있다. 상기 표지는 연장 반응 동안 연장 산물(extended products)에 삽입될 수 있다.
시그널 발생에서 상기 올리고뉴클레오타이드의 절단이 사용되는 경우, 상기 효소의 예는 5’-뉴클레아제 및 3’-뉴클레아제, 특히 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소, 3’-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
본 발명에서, 시그널은 상술된 다양한 물질을 이용하여 다양한 방식으로 발생될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 이합체 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 이합체는 이중 가닥 타겟 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서 시그널-발생 수단과 함께 사용되는 표현 “이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시킨다”는 것은 검출되는 시그널이 2개의 핵산 분자의 결합(association) 또는 해리(dissociation)에 의존적으로 제공되는 것을 의미한다. 상기 표현은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 형성된 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함한다. 또한, 상기 표현은 이합체(예컨대, 표지를 갖는 검출 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열)의 혼성화의 억제에 의해 시그널이 제공되는 것을 포함하며, 상기 억제는 다른 이합체의 형성에 의해 일어난다.
특히, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성에 의해 발생된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “검출 올리고뉴클레오타이드(detection oligonucleotide)”는 검출되는 시그널의 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 실제 시그널 발생에 관여하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 다른 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 타겟 핵산 서열 또는 검출 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드)와 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 비-혼성화가 시그널 발생을 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 적어도 하나의 표지를 포함한다.
타겟 핵산 서열 및 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성에 의한 시그널은 스콜피온 방법(Whitcombe 등, Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), 선라이즈(또는 Amplifluor) 방법(Nazarenko 등, Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), 및 미국 특허 제6,117,635호), 럭스 방법(미국 특허 제7,537,886호), 플렉서(Plexor) 방법(Sherrill CB, 등, Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), 분자 비콘 방법(Tyagi 등, Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), Hybeacon 방법(French DJ 등, Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 인접한 혼성화 프로브 방법(Bernard P.S. 등, Anal. Biochem., 273:221(1999)) 및 LNA 방법(미국 특허 제6,977,295호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
특히, 상기 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드(mediation oligonucleotide)의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 발생된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “매개 올리고뉴클레오타이드”는 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 이합체의 생성을 매개하는 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단 자체로는 시그널이 발생하지 않고, 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 및 절단 후에 상기 절단에 의해 형성된 단편이 시그널 발생을 위한 연속적인 반응에 관여한다.
일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 또는 절단 자체로는 시그널이 발생하지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 절단되어 단편을 방출함으로써 이합체의 생성을 매개하는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 특히, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 상기 단편의 연장에 의한 이합체의 생성을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단은 단편을 방출하며, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 연장된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드는 절단되어 단편을 방출하고, 상기 단편은 캡처 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되며, 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하고, 이는 상기 연장 가닥 및 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 연장이합체의 형성을 야기하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 연장 가닥에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3 올리고뉴클레오타이드 및 연장 가닥의 혼성화는 다른 유형의 이합체를 형성하여 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 올리고뉴클레오타이드가 사용되는 경우, 상기 제3의 올리고뉴클레오타이드 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성은 상기 연장 가닥 및 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체 형성에 의해 억제되어 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단편, 상기 연장 가닥, 상기 캡처 올리고뉴클레오타이드, 상기 제3의 올리고뉴클레오타이드 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로 작용할 수 있다.
상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 2012/096523), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 2013/115442) 및 PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(PCT/KR2013/012312)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
상술한 참조문헌에 개시된 용어와 관련하여, 올리고뉴클레오타이드의 상응하는 예는 다음과 같다: 매개 올리고뉴클레오타이드는 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO)에 상응하고, 캡처 올리고뉴클레오타이드는 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)에 상응하며, 제3의 올리고뉴클레오타이드는 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO) 또는 혼성화 올리고뉴클레오타이드(Hybridization Oligonucleotide; HO)에 각각 상응한다. SO, HO, CTO, 연장 가닥 또는 이들의 조합은 검출 올리고뉴클레오타이드로서 역할을 할 수 있다.
상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 다른 이합체의 형성이 억제됨으로써 제공된 시그널(예컨대, PCE-NH)을 포함한다.
예를 들어, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널-발생 수단은 업스트림 올리고뉴클레오타이드, 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide; PTO), 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO), 적절한 표지 및 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소를 포함한다. 상기 PTO는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위 및 (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위를 포함한다. 상기 CTO는 3’→5’방향으로 (i) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
PTOCE 방법에 의한 시그널 발생의 특정 실시예는 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO를 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의하여 타겟 시그널을 제공하고; 그리고 (e) 상기 연장이합체가 그의 이중-가닥 형태를 유지하는 지정된 온도에서 상기 타겟 시그널을 측정함으로써 상기 연장이합체를 검출하는 단계로서, 상기 연장이합체의 존재는 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함한다.
문구 “반복 사이클 사이에 변성”에서, 용어 “변성(denaturation)”은 이중-가닥 핵산 분자를 단일-가닥 핵산 분자로 분리하는 것을 의미한다.
상기 PTOCE 방법의 단계 (a)에서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함한다.
상기 PTOCE 방법은 CTO에 혼성화된 PTO 단편이 연장되어 연장 가닥을 형성한 후, 상기 연장 가닥이 검출되는 프로세스로 분류될 수 있다. 상기 PTOCE 방법은 상기 연장 가닥의 형성을 상기 연장 가닥 및 상기 CTO 간의 이합체를 이용하여 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 연장 가닥의 형성을 검출하는 다른 접근법도 존재한다. 예를 들어, 상기 연장 가닥의 형성은 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 검출될 수 있다(예컨대, PCE-SH 방법). 이러한 방법에서, 시그널은 (i) 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 상기 PTO 단편에 연결된 표지, (iii) 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 상기 연장 반응 동안 상기 연장 가닥 내에 삽입된 표지, 또는 (iv) 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다. 택일적으로, 시그널은 (i) 상기 연장 가닥에 연결된 표지 또는 (ii) 인터컬레이팅 염료로부터 제공될 수 있다.
택일적으로, 상기 연장 가닥 형성의 검출은 상기 CTO 및 상기 CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화의 억제를 검출하는 다른 방법(예컨대, PCE-NH 방법)에 의해 실시된다. 이러한 억제는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 것으로 여겨진다. 상기 시그널은 (i) 상기 CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지, (ii) 상기 CTO에 연결된 표지, (iii) 상기 CTO에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드에 연결된 표지 및 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지로부터 제공될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 CTO에 특이적으로 혼성화가능한 상기 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO 단편과 겹치는 서열(overlapping sequence)을 갖는다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 상기 연장 가닥에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PCE-SH 방법) 및 상기 CTO에 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드(예컨대, PCE-NH 방법)를 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 반응 동안 생성된 연장 가닥 또는 CTO를 포함한다.
PTOCE-기반 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 연장 가닥의 형성을 수반한다. 상기 용어 “PTOCE-기반 방법”은 PTO의 절단 및 연장을 통한 연장 가닥의 형성을 포함하는, 시그널을 제공하기 위한 다양한 방법들을 포괄하기 위하여 본원에서 사용된다.
PTOCE-기반 방법에 의한 시그널 발생의 예는 다음의 단계를 포함한다: (a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장 가닥은 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 상기 절단은 상기 PTO의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편과 CTO를 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 상기 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 상기 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하며, 그리고 (e) 상기 연장 가닥의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널을 검출하여 상기 연장 가닥의 형성을 검출하는 단계. 상기 단계 (a)에서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 이합체 형성에 의해 발생된 상기 시그널은 상기 이합체의 혼성화(예컨대, 이합체 자체의 혼성화, 또는 제3의 올리고뉴클레오타이드의 혼성화)에 의해 유도된 시그널 또는 이합체 형성으로 인한 제3의 올리고뉴클레오타이드의 혼성화의 억제에 의해 유도된 시그널을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
특히, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열에 상기 검출 올리고뉴클레오타이드가 혼성화된 다음, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
타겟 핵산 서열에 상기 검출 올리고뉴클레오타이드가 혼성화된 다음, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 상기 시그널은 TaqMan 프로브 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 미국 특허 제5,538,848호)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다.
상기 시그널이 TaqMan 프로브 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널-발생 수단은 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트, 적절한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브 및 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 포함한다. 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화된 TaqMan 프로브는 타겟 증폭 동안 절단되고, 상기 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다.
TaqMan 프로브 방법에 의해 시그널을 발생시키는 특정 예는 다음의 단계를 포함한다: (a) 상기 타겟 핵산 서열을 프라이머 세트 및 적절한 표지(예컨대, 상호작용적 이중 표지)를 갖는 TaqMan 프로브와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 결과물 및 5’뉴클레아제 활성을 갖는 핵산 중합효소를 이용하여 타겟 핵산 서열을 증폭하는 단계로서; 상기 TaqMan 프로브는 절단되어 상기 표지를 방출하고; 및 (c) 상기 방출된 표지로부터 시그널 발생을 검출하는 단계.
특히, 상기 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 검출 올리고뉴클레오타이드에 특이적으로 혼성화되고, 상기 단편은 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드가 절단되어 단편을 방출하는 경우, 상기 단편은 연장되어 캡처 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 검출 올리고뉴클레오타이드를 절단한다.
상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널은 Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호), PTO 절단 및 연장-의존적 절단(PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage; PCEC) 방법(WO 2012/134195) 및 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다. 특히, 미국 특허 제7,309,573호에 기재된 방법은 절단에 의한 시그널 발생을 이용하는 PTOCE-기반 방법 중 하나로 여겨질 수 있고, 상기 방법에서, 상기 연장 가닥의 형성에 의한 상기 CTO에 특이적으로 혼성화된 올리고뉴클레오타이드의 절단을 검출함으로써, 상기 연장 가닥의 형성이 검출될 수 있다. Invader 분석은 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 단편을 형성하고, 단편의 연장 없이 연속적인 절단 반응을 유도한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널이 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의존적인 방식으로 발생되는 경우, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단은 시그널 변화를 유도하거나 또는 검출될 표지된 단편의 방출을 유도한다.
시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 그리고 이합체의 형성에 의해 시그널을 동시에 발생시키는 경우, 상기 시그널-발생 수단이 절단에 의해 시그널을 발생시키는데 사용되는 한, 상기 시그널-발생 수단은 절단에 의해 시그널을 제공하는 시그널 발생 수단으로 간주될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 시그널 발생은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 사용된다. 상기 시그널이 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생되는 경우, 절단에 의해 방출된 표지는 어떠한 온도에서도 검출될 수 있다. 따라서, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된 시그널은 제한된 검출 온도를 요하는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 사용되지 않을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 시그널 발생은 오로지 하나의 타겟 핵산 서열을 위해 사용된다. 상기 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의존적인 시그널 발생이 2개의 타겟 핵산 서열 모두를 위해 사용되는 경우, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 검출 온도에 따라 구별되게 검출되지 않을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 표지를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 최소 하나의 올리고뉴클레오타이드로 구성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드가 복수의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 경우, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드는 다양한 방식으로 표지를 가질 수 있다. 예를 들어, 복수의 올리고뉴클레오타이드 중 하나가 최소 하나의 표지를 가질 수 있고, 복수의 올리고뉴클레오타이드 모두가 최소 하나의 표지를 가질 수 있거나, 또는 올리고뉴클레오타이드의 한 부위가 최소 하나의 표지를 가질 수 있고 다른 부위는 표지를 갖지 않을 수 있다.
상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다. 상기 용어 “단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 시그널”은 이들의 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 발광 파장 및 전기적 시그널)으로 인하여, 시그널이 단일 유형의 검출기에 의해 서로 구별되지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 2개의 타겟 핵산 서열을 위해 동일한 표지(예컨대, FAM)가 사용되고 FAM으로부터의 발광 파장을 검출하기 위해 단일 유형의 검출기가 사용되는 경우, 시그널은 구별되게 검출되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “단일 유형의 시그널(single type of signal)”은 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 발광 파장 및 전기적 시그널)을 제공하는 시그널을 의미한다. 예를 들어, FAM 및 CAL Fluor 610은 상이한 유형의 시그널을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “단일 유형의 검출기(single type of detector)”는 단일 유형의 시그널을 위한 검출 수단을 의미한다. 몇 개의 상이한 유형의 시그널을 위한 몇 개의 채널(예컨대, 광다이오드)을 포함하는 검출기에서, 각각의 채널(예컨대, 광다이오드)이 “단일 유형의 검출기”에 해당한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명에서 유용한 표지는 본 기술 분야에서 알려진 다양한 표지를 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 유용한 표지는 단일 표지, 상호작용적 이중 표지, 인터컬레이팅 염료 및 삽입 표지(incorporating label)를 포함한다.
상기 단일 표지는 예를 들어, 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학 표지 및 금속 표지를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 이중 가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥에 존재하는지에 따라 상이한 시그널(예컨대, 상이한 시그널 강도)을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 단일 표지는 형광 표지이다. 본 발명에서 사용되는 단일 형광 표지의 바람직한 종류 및 결합 사이트는 미국 특허 제7,537,886호 및 제 7,348,141호에 개시되어 있으며, 그의 교시 사항은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함된다. 예를 들어, 상기 단일 형광 표지는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다. 상기 단일 표지는 다양한 방법에 의해 올리고뉴클레오타이드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 상기 표지는 탄소 원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 프로브에 연결된다.
상기 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성 또는 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템은 “접촉-매개 퀀칭(contact-mediated quenching)”에 기반한 이중 표지를 포함한다(Salvatore 등, Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 and Johansson 등, J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상기 상호작용적 표지 시스템은 최소 2개의 분자(예컨대, 염료) 간의 상호작용에 의해 시그널 변화를 유도하는 어떠한 표지 시스템도 포함한다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 최대 발광 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 형광 분자 및 적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
본 발명에서, 광범위 파장 또는 특정 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대, 블랙 퀀처 또는 다크 퀀처)가 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다.
리포터 및 퀀처 분자를 포함하는 시그널링 시스템에서, 상기 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되고 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
상기 상호작용적 이중 표지는 이합체 중 어느 한 가닥에 연결될 수 있다. 상기 상호작용적 이중 표지를 포함하는 가닥이 단일 가닥 상태로 존재하는 경우, 상기 가닥은 헤어핀 또는 랜덤 코일 구조를 형성하여 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭을 유도한다. 상기 가닥이 이합체를 형성하는 경우, 상기 퀀칭은 줄어든다. 택일적으로, 상기 상호작용적 이중 표지가 가닥 상에 근접하게 위치한 뉴클레오타이드에 연결된 경우, 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭이 일어난다. 상기 가닥이 이합체를 형성하고 절단되는 경우, 상기 퀀칭은 줄어든다.
각각의 상호작용적 이중 표지는 이합체의 두 가닥 각각에 연결될 수 있다. 상기 이합체의 형성은 퀀칭을 유도하고, 상기 이합체의 변성은 언퀀칭을 유도한다. 택일적으로, 두 가닥 중 하나가 절단되는 경우, 언퀀칭이 유도될 수 있다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 싸이아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함한다. 상기 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
삽입 표지는 프라이머 연장 동안 표지를 삽입하여 시그널을 발생시키는 과정에서 사용될 수 있다(예컨대, Plexor 방법, Sherrill C B, 등, Journal of the American Chemical Society, 126:4550-45569 (2004)). 또한, 상기 삽입 표지는 타겟 핵산 서열에 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널 발생에서도 사용될 수 있다.
상기 삽입 표지는 일반적으로 뉴클레오타이드에 결합될 수 있다. 또한, 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드가 이용될 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기(non-natural base)”는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미하며, 이들은 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기”는 모화합물(mother compound)로서 자연 염기와 상이한 염기 쌍 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 자연 염기와 같이 2개 또는 3개의 수소결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍은 특정한 방식으로도 형성된다. 비-자연 염기의 특정한 예는 염기 쌍 조합에서 다음과 같은 염기들을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (참조 미국특허 제7,422,850호).
PTOCE 방법에 의해 시그널이 발생하는 경우, 상기 연장 반응 동안 삽입된 뉴클레오타이드는 제1 비-자연 염기를 가질 수 있고, 상기 CTO는 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산 서열” 또는 “타겟 서열”은 검출 또는 정량하고자 하는 핵산 서열을 의미한다. 상기 타겟 핵산 서열은 이중 가닥뿐만 아니라 단일 가닥을 포함한다. 상기 타겟 핵산 서열은 반응에서 새롭게 생성된 서열뿐만 아니라 핵산 시료 내에 초기에 존재하는 서열을 포함한다.
상기 타겟 핵산 서열은 모든 DNA(gDNA 및 cDNA), RNA 분자 및 이들의 혼성체(키메라 핵산)를 포함한다. 상기 서열은 이중-가닥 또는 단일-가닥 형태일 수 있다. 출발 물질로서 상기 핵산이 이중-가닥인 경우, 상기 두 가닥을 단일-가닥 또는 부분적 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하기 위한 알려진 방법은 가열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃-105℃의 온도 범위에서 가열하여 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 의해 제공된다.
mRNA를 출발 물질로 이용하는 경우, 어닐링 단계 실시 이전에 역전사 단계가 필수적이며, 이의 상세한 내용은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 Noonan, K. F. 등, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)]에 개시되어 있다. 역전사 반응을 위해, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화가능한 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머, 랜덤 프라이머 또는 타겟-특이적 프라이머가 이용될 수 있다.
타겟 핵산 서열은 모든 자연(naturally occurring) 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한 상기 핵산 분자는 재조합에 의해 생산된 또는 생산될 수 있는 어떠한 핵산 분자 또는 화학적으로 합성된 또는 합성될 수 있는 어떠한 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 상기 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 또는 발견되지 않을 수 있다. 상기 타겟 핵산 서열은 알려진 또는 알려지지 않은 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “시료”는 생물학적 공급원으로부터의 세포, 조직 또는 유체, 또는 본 발명에 따라 유익하게 평가될 수 있는 어떠한 다른 미디엄(medium)을 의미하며, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 우유, 소변, 분변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 충수, 비장 및 편도 조직 추출물, 양수, 복수 및 비-생물학적 시료(예컨대, 식품 및 물)를 포함한다. 또한, 상기 시료는 생물학적 공급원으로부터 단리된 자연(natural-occurring)의 핵산 분자 및 합성한 핵산 분자를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
본 발명에서, 시그널-발생 수단에 의해 발생된 상기 시그널은 타겟 증폭과 동시에 증폭될 수 있다. 택일적으로, 상기 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 발생은 타겟 증폭과 함께 시그널 증폭을 포함하는 과정에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 증폭은 중합효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction; PCR)에 따라 실시된다. PCR은 타겟 증폭을 위해 당업계에서 널리 이용되며, 타겟 서열의 변성, 타겟 서열 및 프라이머 간의 어닐링(혼성화) 및 프라이머 연장의 사이클을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki 등, (1985) Science 230, 1350-1354). 시그널은 상기 상술한 시그널 발생 방법(예컨대, TaqMan 방법 및 PTOCE-기반 방법)을 PCR 과정에 적용함으로써 증폭될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 발명은 실시간 PCR 방법에 의해 시그널을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열의 증폭은 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR, 참조 Wiedmann M, 등, "Ligase chain reaction (LCR)- overview and applications." PCR Methods and Applications 1994 Feb;3(4):S51-64), 갭 필링 LCR(gap filling LCR; GLCR, 참조 WO 90/01069, 유럽 특허 제439182호 및 WO 93/00447), Q-베타 리플리카제 증폭(Q-beta replicase amplification; Q-beta, 참조 Cahill P, 등, Clin Chem., 37(9): 1482-5(1991), 미국 특허 제5556751호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification; SDA, 참조 G T Walker 등, Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), 유럽 특허 제497272호), 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification; NASBA, 참조 Compton, J. Nature 350(6313):912(1991)), 전사 매개 증폭(Transcription-Mediated Amplification; TMA, 참조 Hofmann WP 등, J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국 특허 제5888779호) 또는 롤링 서클 증폭(Rolling Circle Amplification; RCA, 참조 Hutchison C.A. 등, Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005))에 의해 실시된다.
상기 상술한 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 변화시키지 않는 일련의 반응들의 반복을 통하여 타겟 서열을 증폭할 수 있다. 상기 일련의 반응들의 반복을 포함하는 증폭의 단위는 “사이클(cycle)”로 표현된다. 상기 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 일부 사이클, 또는 반응의 엔드-포인트(end-point of reaction)에서 실시될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 최소 2개의 사이클에서 시그널이 검출되는 경우, 각각의 사이클에서의 시그널의 검출은 모든 검출 온도에서 실시되거나 또는 일부 선택된 검출 온도에서 실시될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출은 홀수의 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시되고, 짝수의 사이클에서는 상대적 고온 검출 온도에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 시그널-발생 수단에 의한 시그널 발생과 함께 타겟 증폭이 가능한 조건하에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
시그널이 올리고뉴클레오타이드의 절단을 포함하는 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널은 타겟 증폭 없이 증폭될 수 있다. 예를 들어, CPT 방법(Duck P, 등, Biotechniques, 9:142-148 (1990)), Invader 분석(미국 특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE-기반 방법(예컨대, PCE-SH 방법, PCE-NH 방법 및 PCEC 방법) 또는 CER 방법(WO 2011/037306)에 따라 시그널은 증폭되지만 타겟 핵산 서열은 증폭되지 않으면서 상기 단계 (a)가 실시된다.
상기 상술한 증폭 방법은 온도를 변화시키거나 변화시키지 않는 일련 반응들의 반복을 통하여 타겟 서열을 증폭할 수 있다. 상기 일련 반응들의 반복을 포함하는 시그널 증폭의 단위는 “사이클(cycle)”로 표현된다. 상기 사이클의 단위는 증폭 방법에 따라 반복 횟수 또는 시간으로 표현될 수 있다.
예를 들어, 시그널의 검출은 증폭의 각 사이클, 선택된 일부 사이클, 또는 반응의 종료 시점(end-point of reaction)에서 실시될 수 있다.
상기 타겟 핵산 서열의 증폭은 증폭을 위한 프라이머 세트 및 핵산 중합효소를 포함하는 타겟 증폭 수단에 의해 달성된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성(예컨대, 5’뉴클레아제 활성 또는 3’뉴클레아제 활성)을 갖는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 핵산 중합효소가 사용될 수 있다.
본 발명에서 유용한 핵산 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이다. 특히, 상기 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열의 증폭은 비대칭 PCR(asymmetric PCR)에 의해 달성된다. 상기 프라이머의 비율은 다운스트림 올리고뉴클레오타이드의 절단 또는 혼성화를 고려하여 선택될 수 있다.
시그널을 발생시키기 위한 2개의 시그널-발생 수단과 함께 시료의 인큐베이션(반응) 동안 또는 인큐베이션 후에, 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출된다.
상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 갖고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 표현 “타겟 핵산 서열이 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 검출 온도를 갖는다”는 것은 타겟 핵산 서열이 상기 타겟 핵산 서열에 미리-할당된(pre-assigned) 검출 온도에서 검출될 수 있다는 것을 의미하며, 상기 검출 온도는 상기 검출 온도에서 시그널을 발생시키도록 디자인된 시그널-발생 수단으로부터 발생된 시그널을 검출할 수 있게 해준다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 하나의 검출 온도는 하나의 타겟 핵산 서열에 할당된다.
상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이다.
본 발명의 특징 중 하나는 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 상이한 검출 온도에서 검출함으로써 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 구별하여 결정하는 것이다.
일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 상기 시그널-발생 수단에 의해 시그널 발생을 가능하게 하는 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다.
본 발명은 시그널-발생 수단에 의존적인 방식으로 시그널 발생을 가능하게 하는 특정 온도 범위가 존재한다는 점을 이용한다.
예를 들어, 시그널-발생 수단이 2개의 핵산 분자의 혼성화(또는 결합) 시에는 시그널을 발생시키고, 비-혼성화(또는 해리) 시에는 시그널을 발생시키지 않는 경우, 2개의 핵산 분자의 혼성화가 가능한 온도에서는 시그널이 발생되지만, 2개의 핵산 분자가 혼성화되지 못하는 온도에서는 시그널이 발생되지 않는다. 이와 같이, 시그널 발생(즉, 시그널 검출)이 가능한 특정 온도 범위 및 시그널이 발생되지 않는 다른 온도 범위가 존재한다. 상기 온도 범위는 상기 시그널-발생 수단에서 사용되는 2개의 핵산 분자의 혼성화물의 Tm 값에 의해 영향을 받는다.
절단 후에 표지를 갖는 방출된 단편을 이용하는 시그널 발생 방법이 이용되는 경우, 시그널은 이론적으로 어떠한 온도(예컨대, 30-99℃)에서도 검출될 수 있다.
검출 온도는 상기 시그널 발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위로부터 선택된다.
용어 “검출 온도 범위”는 시그널 발생(즉, 시그널 검출)이 가능한 온도 범위를 특히 기술하기 위해 본원에서 사용된다.
2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단에 따라 상이한 검출 온도 범위가 존재하는 경우, 겹치지 않는 검출 온도 범위(non-overlapped detection temperature range)가 상대적 고온 검출 온도로 선택될 수 있다. 상대적 고온 검출 온도를 제공하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된 타겟 핵산 서열은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열로 결정된다. 겹치는 검출 온도 범위(overlapped detection temperature range)가 상대적 저온 검출 온도로 선택될 수 있다. 상대적 저온 검출 온도를 제공하고 상대적 고온 검출 온도는 제공하지 않는 시그널-발생 수단에 의해 검출된 타겟 핵산 서열은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열로 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 겹치지 않는 부위 및 겹치는 부위는 서로 구분되게 구별되지 않을 수 있다. 예를 들어, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 선택된 상대적 고온 검출 온도에서 훨씬 더 낮은 강도로 발생할 수 있다. 이러한 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 시그널로 인한 잘못된 시그널(false signal) 문제는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 유의성(significance)을 결정하기 위한 기준값(reference value)을 적절하게 선택함으로써 극복될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 온도는 검출 온도 중에서 겹치지 않는 검출 온도 범위 및 겹치는 검출 온도 범위를 고려하여 미리 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대해 할당된 상기 검출 온도는 서로 최소 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 15℃ 또는 20℃ 상이하다.
본 발명에 따르면, 각각의 타겟 핵산 서열의 존재를 검출하기 위한 온도는 시그널-발생 수단을 고려하여 할당될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상대적 고온 검출 온도로 할당되고 다른 하나는 상대적 저온 검출 온도로 할당된 다음, 상기 검출 온도에 적합한 시그널-발생 수단이 구축되고, 이어 상기 단계 (a)가 실시된다.
일 구현예에 따르면, 검출이 실시되는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도는 미리 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도는 각각 72℃ 및 60℃로 미리 결정된 다음, 상기 검출 온도에 적합한 시그널-발생 수단이 구축되고, 이어 상기 단계 (a)가 실시된다.
일 구현예에 따르면, 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단이 먼저 구축된 다음, 상기 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도가 할당되고, 이어 상기 단계 (a)가 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 상기 검출 온도는 상기 이합체의 Tm 값에 기초하여 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 상기 검출 온도는 상기 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 조절가능하다.
예를 들어, 상기 시그널이 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 검출 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 럭스 프로브, 분자 비콘 프로브, HyBecon 프로브 및 인접한 혼성화 프로브)에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널의 검출은 상기 올리고뉴클레오타이드의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이루어진다. 스콜피온 프라이머가 사용되는 경우, 상기 시그널의 검출은 연장 가닥에 혼성화되는 부위의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이루어진다.
상기 시그널이 상기 타겟 핵산 서열의 존재에 따라 형성된 이합체에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널의 검출은 상기 이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이루어진다. 예를 들어, 상기 시그널이 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 시그널의 검출은 CTO 상에서 PTO 단편의 연장에 의해 형성된 연장이합체의 Tm 값을 조절함으로써 미리 결정된 온도에서 성공적으로 이루어진다.
상기 PTOCE-기반 방법은 상기 이합체의 Tm 값 또는 상기 이합체에 의해 혼성화가 영향을 받는 제3의 혼성화물의 Tm 값을 쉽게 조절할 수 있다는 이점을 가진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 상기 검출 온도는 임의로 선택된다. 즉, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된 시그널이 검출될 수 있는 한, 어떠한 온도도 선택될 수 있다. 상술한 바와 같이, 상기 시그널이 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 발생되는 경우, 상기 절단에 의해 방출된 표지는 다양한 온도에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널이 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 발생되는 경우, 상기 검출 온도는 상대적 최고 검출 온도가 되도록 선택될 수 있다.
상술한 바와 같이, 상기 검출 온도는 시그널-발생 수단에 좌우되는 검출 온도 범위를 고려하여 결정된다. 따라서, 특정 검출 온도에서의 상기 시그널 검출은 다음과 같이 설명될 수 있다: 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 것이고, 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 검출은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 모두를 검출하기 위한 것이다.
예를 들어, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두가 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체에 의해 발생되고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체에 의해 발생된다. 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체는 단일 가닥으로 해리되므로 시그널이 발생되지 않고, 이에 의해 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널만이 검출된다. 상기 상대적 저온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체 및 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체 모두가 이합체 형태를 가지며, 이에 의해 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두가 검출된다.
다른 예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 TaqMan 방법에 의해 발생되고 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 PTOCE 방법에 의해 발생되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 방출된 형광 표지에 의해 제공되고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체에 의해 제공된다. 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체는 단일 가닥으로 해리되므로 시그널이 발생되지 않고, 이에 의해 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 방출된 형광 표지로부터의 시그널만이 검출된다. 상기 상대적 저온 검출 온도에서 시그널이 검출되는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에 적합한 Tm 값을 갖는 연장이합체로부터 제공된 시그널뿐만 아니라 방출된 형광 표지로부터의 시그널도 검출되며, 이에 의해 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두가 검출된다.
본 발명에서 사용되는 검출기는 시그널을 검출할 수 있는 어떠한 수단도 포함한다. 예를 들어, 형광 시그널이 사용되는 경우, 형광 시그널의 검출에 적합한 광다이오드가 검출기로 사용될 수 있다. 단일 유형의 검출기를 이용하는 검출은 단일 유형의 시그널을 검출할 수 있는 검출기 또는 여러 채널(즉, 광다이오드)을 포함하는 검출기의 각 채널(즉, 광다이오드)을 이용하여 검출이 실시되는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 발생은 표지로부터 “시그널 발생 또는 소멸” 및 “시그널 증가 또는 감소”를 포함한다.
단계 (b):
타겟 핵산 서열의 존재 결정
시그널의 검출 후, 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다. 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다.
타겟 존재의 결정을 위해 사용되는 시그널은 시그널 검출로부터 얻은 다양한 시그널 특성, 예를 들어, 시그널 강도[예컨대, RFU(상대적 형광 단위) 값 또는 증폭을 실시하는 경우에는 특정 사이클, 선택된 사이클 또는 엔드-포인트에서의 RFU 값], 시그널 변화 모양(또는 패턴) 또는 Ct 값, 또는 상기 특성을 수학적으로 처리하여 얻어진 값을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 증폭 곡선이 실시간 PCR에 의해 얻어지는 경우, 상기 증폭 곡선으로부터의 다양한 시그널 값(또는 특성)이 타겟 존재를 결정하는데 사용하기 위해 선택될 수 있다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 상기 상대적 고온 검출 온도에서 얻어진 시그널의 특성 자체가 사용될 수 있다.
택일적으로, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 상기 시그널의 특성을 수학적으로 처리하여 제공된 변형된 시그널이 사용될 수 있다.
상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 특성 자체 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 특성 자체가 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 얻기 위해 사용될 수 있다.
택일적으로, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 중 하나 또는 모두는 시그널의 특성을 수학적으로 처리함으로써 변형될 수 있으며, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 얻기 위해 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 문구 “상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널”과 관련하여 사용된 용어 “시그널”은 검출 온도에서 얻어진 시그널 자체뿐만 아니라 상기 시그널을 수학적으로 처리하여 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 수학적 처리가 실시되는 경우, 상기 시그널의 특성은 수학적 처리가 가능한 특성이어야 한다. 특정 구현예에서, 상기 수학적 처리는 시그널을 이용한 계산(예컨대, 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈) 또는 시그널로부터 유래된 다른 값을 얻는 것을 포함한다. 본 발명에서 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 사용되는 시그널은 일반적으로 유의한 시그널(significant signal)이다. 즉, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널이다. 한편, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이가 계산되는 경우, 배경 시그널과 같이 유의성이 없는 시그널이 상기 차이를 계산하기 위해 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 사용된 시그널은 차이를 계산하기 위해 사용되거나 결정 과정에 관여할 수 있는 한, 유의성을 갖는 시그널뿐만 아니라 유의성이 없는 시그널도 포괄하는 것으로 이해될 것이다.
일 구현예에 따르면, 검출된 시그널의 유의성은 역치 값을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 검출기의 배경 시그널, 민감도 또는 사용된 표지를 고려하여 음성 대조군으로부터 역치 값이 미리 결정된 후, 시료로부터의 시그널 유의성이 결정될 수 있다.
시그널(즉, 유의한 시그널)이 상대적 고온 검출 온도에서 검출되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정된다.
유의성이 없는 시그널은 또한 본원에서 “시그널의 부재” 또는 “시그널의 미검출”로 표현될 수 있다.
본 명세서에서 타겟 핵산 서열의 존재의 결정과 관련하여 사용된 용어 “시그널에 의한(by a signal)”은 시그널의 숫자 값 또는 그들의 변형을 이용하는 것, 시그널의 존재/부재를 이용하는 것 및 시그널을 역치와 비교하는 것을 포함하여, 시그널-발생 수단으로부터 발생된 시그널을 직접적 또는 간접적으로 이용하거나 변형함으로써 타겟 핵산 서열의 존재가 결정되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재의 결정과 관련하여 사용된 용어 “시그널에 의한 결정(determination by a signal)”은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 유의성을 고려하여 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
시그널이 상대적 저온 검출 온도에서 검출되는 경우, 상기 시그널 자체로는 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 없다. 그 이유는 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출될 수 있기 때문이다.
본 발명의 특징은 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하기 위하여 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하는 것이다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 하나의 반응 용기에서 단일 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널이 미리 결정된 2개의 검출 온도에서 검출된 경우, 특정 패턴(규칙)으로 시그널 변화가 존재한다는 것을 확인하였다.
예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대하여 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 시그널 변화는 특정 패턴(규칙)을 나타낸다. 예를 들어, 2개의 검출 온도에서 상기 시그널의 강도는 서로 동일하거나 실질적으로 동일할 수 있고, 또는 상기 시그널의 강도는 서로 상이하지만 특정 범위 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 특징은 상기 결과를 타겟 핵산 서열의 검출에 적용하는 것이다.
하나의 반응 용기에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 단지 검출 온도만을 달리하여(예컨대, 타겟 함량의 변화 없이, 또는 버퍼 조건의 변화 없이) 검출되기 때문에, 2개의 검출 온도 간의 시그널 변화에는 특정 패턴(규칙)이 존재한다. 시그널 변화에서의 특정 패턴(규칙)에 기반하여, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하기 위하여 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 검출 온도 사이에서의 시그널 변화에 특정 패턴(규칙)이 있는 조건하에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 시그널을 포함하고 있는지를 확인하기 위하여, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하는 방식으로, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 분석은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 얻고, 이를 분석함으로써 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 중에서 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널의 크기(또는 부분)는 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널을 이용하는 원리에 따라 얻어질 수 있다.
*일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다.
예를 들어, (i) 시료 내에 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열만이 존재하는 경우, 시그널은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 검출된다. 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널과는 상이할 가능성이 있다. 이러한 차이는 검출 온도를 제외한 모든 조건들이 공통되기 때문에 특정 범위 내에 속할 가능성이 매우 높다. 시료에 대해 계산된 상기 차이가 특정 범위 내에 속하는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널은 오직 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의한 것이다. 즉, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 시료 내에 부존재하는 것으로 결정될 수 있다.
(ii) 시료 내에 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 및 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 모두가 존재하는 경우, 시그널은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 검출된다. 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하기 때문에, 상기 시그널 간의 차이는 상기 사례 (i)에서의 차이보다 더 잘 구별될 수 있게 된다. 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 차이를 이용하여 결정될 수 있다.
(iii) 시료 내에 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열만이 존재하는 경우, 시그널은 상대적 저온 검출 온도에서는 검출되지만 상대적 고온 검출 온도에서는 검출되지 않는다. 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타내므로, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의한 것으로 인식될 수 있고, 이에 의해 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재가 결정될 수 있다.
택일적으로, 상기 사례 (iii)에서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 유의성 없는(예컨대, 배경 시그널) 시그널을 이용하여 상기 차이가 얻어질 수 있다. 이러한 대안에서, 상기 차이는 상기 사례 (i)에서의 차이와는 확실하게 상이할 가능성이 매우 높고, 이에 의해 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재가 결정될 수 있다.
상기 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 매우 다양한 접근법에 따라 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 “시그널 간의 차이에 의한(또는 시그널 간의 차이를 이용한)”과 관련하여 사용된 용어 “차이(difference)”는 시그널 자체 또는 변형된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어지는 차이뿐만 아니라 시그널의 존재 및 부재에 의한 차이도 포함한다. 예를 들어, 상기 차이는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율(ratio) 또는 뺄셈(subtraction)을 계산하여 얻어질 수 있다. 택일적으로, 상기 차이는 하나의 검출 온도에서의 시그널을 변형하고 이를 다른 검출 온도에서의 시그널과 비교함으로써 얻어질 수 있다. 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 다양한 측면(aspect)에서 표현될 수 있다. 예를 들어, 상기 차이는 수치, 시그널의 존재/부재 또는 시그널 특성을 갖는 플롯으로 표현될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어진 차이를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다. 이러한 구현예는 2개의 검출 온도에서의 시그널의 존재 및 부재에 의한 차이를 이용하는 것이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 있게 한다는 것을 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이를 계산하기 위하여 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 배경 시그널은 “0” 또는 “1”로 처리될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 계산하는 동안 음수 값이 얻어지는 경우, 음수 값은 절대 값으로 변환되어 차이를 얻기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 분석하기 위한 연산 파라미터(calculation parameter)이다.
상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 시그널은 서로 상이한 차원(dimensions) 또는 단위(units)를 가질 수 있고, 또는 서로 같은 차원 또는 단위를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “차이에 의해 결정된다(determined by a difference)”는 것은 차이의 발생/비-발생에 의해 결정되는 것, 수치를 갖는 차이의 값 또는 범위에 의해 결정되는 것 및 차이의 플롯팅 결과에 의해 결정되는 것을 포함한다. 더욱이, “차이에 의해 결정된다”는 것은 상기 차이를 기반으로 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산에 대한 값(예컨대, CT)을 얻는 것을 포함한다.
본 명세서에서 타겟 핵산 서열의 존재의 결정과 함께 사용된 용어 “차이에 의한(by a difference)” 것은 차이의 수치 또는 그의 변형을 이용하는 것, 시그널의 존재/부재를 이용하는 것 및 역치와 차이를 비교하는 것을 포함하여, 직접적 또는 간접적으로 차이를 이용하거나 변형함으로써 타겟 핵산 서열의 존재가 결정되는 것을 의미한다. 용어 “차이에 의한”과 “차이를 이용함으로써(by using a difference)”은 차이가 없으며, 혼용되어 사용될 것이다.
상기 시그널의 수학적 처리는 다양한 계산 방법 및 그들의 변형에 의해 실시될 수 있다.
*본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 간의 차이를 얻기 위한 시그널의 수학적 처리는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널의 간의 차이를 얻기 위한 시그널의 수학적 처리는 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율의 계산이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “비율(ratio)”은 2개의 숫자 사이의 관계를 의미한다. 비율을 이용함으로써, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재가 결정될 수 있다. 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율이 유의한 경우, 이는 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재에 대한 지시자(indicator)가 된다. 예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트 강도에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 엔드-포인트 강도의 비율이 유의한 경우(즉, 엔드-포인트 강도의 증가), 이는 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
상기 수학적 처리는 다양한 방식으로 실시될 수 있다.
상기 수학적 처리는 기계를 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 시그널은 검출기 또는 실시간 PCR 장비의 프로세서에 의해 수학적으로 처리될 수 있다. 택일적으로, 상기 시그널은 특히 미리 정해진 알고리즘에 따라 수작업으로(manually) 수학적으로 처리될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 얻기 위한 접근법에 따라, 상기 얻어진 차이가 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지를 분석하기 위하여 역치가 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 역치는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산을 포함하는 기준 시료로부터 얻어진 차이를 고려하여 미리 결정된다. 음성 대조군, 민감도 또는 사용된 표지가 역치를 결정하기 위해 추가적으로 고려될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 얻기 위한 접근법에 따라, 상기 얻어진 차이 자체를 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재가 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널에 역치를 곱한 다음, 상기 곱한 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 얻을 수 있다. 특히, 상기 역치는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산을 포함하는 기준 시료로부터 얻어진 차이를 고려하여 미리 결정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 역치는 실시자(user)에 의해 또는 자동적으로(automatically) 결정된다.
일 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이가 더 커지는 경우, 상기 역치를 이용하여 검출 오류를 줄일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 시그널이 2개의 검출 온도 간에서 거의 또는 전혀 차이를 보이지 않는 패턴(또는 규칙)을 갖는 경우, 차이를 계산하거나 또는 차이를 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재의 결정하는데 있어, 추가적인 변형 없이 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 시그널이 특정 범위 내에서 차이를 나타내는 패턴(또는 규칙)을 갖는 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에서 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 상기 차이를 반영하도록 변형될 수 있다.
상기 기준값은 상이한 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴(규칙)을 반영하는 값이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 상이한 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴(또는 규칙)을 반영하는 값이다.
예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널이 동일하거나 또는 실질적으로 동일하고, 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이의 정도가 시그널의 뺄셈에 의해 계산되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 검출 온도에서의 시그널에 대하여 상기 기준값은 ‘0’이다. 다른 예로서, 상기 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이의 정도가 상기 시그널의 나눗셈에 의해 계산되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 검출 온도에서의 시그널에 대하여 상기 기준값은 ‘1’이다.
한편, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널이 서로 상이하고, 상기 2개의 시그널 간의 차이의 정도가 상기 시그널의 뺄셈에 의해 계산되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 검출 온도에서의 시그널에 대하여 상기 기준값은 ‘0’이외의 양수 값 또는 음수 값이다. 다른 예로서, 상기 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이의 정도가 상기 시그널의 나눗셈에 의해 계산되는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 2개의 검출 온도에서의 시그널에 대하여 상기 기준값은 ‘1’ 이외의 1 초과 또는 1 미만이다.
특정 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널이 서로 상이한 경우, 상기 2개의 시그널 간의 차이의 정도는 특정 범위에 속한다.
특정 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이는 기준값을 통해 표현될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널이 서로 상이한 경우에 대한 기준값은 2개의 시그널이 동일한 경우에 대한 기준값과 비교하여 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% 또는 30% 이상 상이할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이가 더 커지는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값을 이용함으로써 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에서 검출 오류를 감소시키는 것이 더욱 유리하다.
특정 구현예에서, 상기 2개의 검출 온도에서의 시그널로부터 계산된 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 상기 2개의 시그널이 동일한 경우에 대한 기준값과 비교하여 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% 또는 30% 이상 상이한 경우에. 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값을 사용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값이 사용되는지를 결정하기 위해 상기 비교가 실시되는 경우, 상기 기준값은 시그널의 나눗셈에 의해 계산된다. 일 구현예에 따르면, 상기 기준값이 사용되는지를 결정하기 위한 기준값을 계산하는 방법은 상기 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 기준값을 계산하는 방법과 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이에 의해 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 기준값이 사용된다. 특히, 기준값은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열과 관련이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 얻어진 차이가 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지를 분석하기 위하여 상기 기준값이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 얻기 위해 상기 기준값이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값으로 곱해지거나 나누어질 수 있고, 이어 상기 곱해진 또는 나누어진 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이가 얻어질 수 있다. 다른 예로서, 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값으로 곱해지거나 나누어질 수 있고, 이어 상기 곱해진 또는 나누어진 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이가 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 역치를 결정하기 위해 사용된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 값을 변형하거나 변형하지 않고 역치로 사용된다. 시그널 간의 차이를 분석하여 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 본 명세서에서 사용된 용어 “역치(threshold)” 및 “기준값”은 같은 값 또는 같은 의미를 가질 수 있다.
택일적으로, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 얻기 위해 상기 기준값이 사용되는 경우, 상기 차이의 유의성을 결정하기 위해, 즉, 상기 차이가 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지를 결정하기 위하여 추가적인 역치가 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 기준값이 사용된다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 유의한 시그널이 검출되는 경우를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 상기 기준값이 선택적으로 사용된다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우는 배경 시그널과 유사한 강도를 갖는 시그널만이 검출되는 경우를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 방법은 기준값을 이용하며, 상기 기준값은 (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 함께 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 인큐베이션하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻는다.
일 구현예에 따르면, 상기 (iii)에서 얻어진 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이는 하나의 값이고, 상기 값은 변형 없이 또는 변형하여 기준값으로 사용된다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율 또는 뺌셈을 계산함으로써 기준값을 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 계산함으로써 기준값을 얻는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 계산함으로써 기준값을 얻는다.
일 구현예에 따르면, 시료로부터의 시그널 차이에 대한 계산 방법 및 기준값을 얻기 위한 차이에 대한 계산 방법은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, 시료로부터의 시그널 차이는 2개의 시그널의 뺄셈에 의해 실시될 수 있고, 기준값을 얻기 위한 차이는 2개의 시그널의 나눗셈에 의해 실시될 수 있다. 택일적으로, 상기 시료로부터의 시그널 차이 및 상기 기준값을 얻기 위한 차이는 모두 비율을 얻기 위한 2개의 시그널의 나눗셈에 의해 실시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 동일할 수 있다.
타겟 핵산 서열에 대하여, 기준값은 성분(예컨대, 타겟 핵산 서열, 시그널-발생 수단, 효소, 또는 dNTPs)의 양, 버퍼 pH 또는 반응 시간을 포함하는 다양한 반응 조건하에서 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 반응 완료시에 포화 시그널(saturated signal)을 제공하기에 충분한 반응 조건하에서 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값 계산 중에 얻어진 시그널 간의 차이는 특정 범위를 갖고, 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 상기 특정 범위의 최댓값 또는 최솟값으로 선택되거나 상기 특정 범위의 최댓값 또는 최솟값을 참조하여 선택될 수 있다. 특히, 기준값은 다양한 조건에서 얻어진 상기 기준값의 표준 변화(standard variation), 허용 오차 범위(acceptable error ranges), 특이도 또는 민감도를 고려하여 변형될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 성분(사용된다면, 효소 또는 증폭 프라이머), 버퍼 pH, 반응 과정을 포함한 시료에서 사용된 동일한 반응 조건에서 얻을 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정 또는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정을 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 얻어진 차이 간에 유의한 차이가 있는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 존재하는 것으로 결정된다. 상기 기준값은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 얻어진 차이와 동일한 유형의 값(예컨대, 시그널 강도의 엔드-포인트 값의 비율)으로 표현될 수 있다.
특정 예에서, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 강도의 엔드-포인트 값에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 강도의 엔드-포인트 값의 비율이 1.8이고 상기 기준값이 1.1인 경우, 상기 기준값 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 얻어진 차이 간에는 유의한 차이가 있는 것으로 결정될 수 있다. 이는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 차이가 상기 기준값과 동일하거나 큰 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 차이가 상기 기준값과 동일하거나 작은 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정된다.
택일적으로, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산하기 위해 상기 기준값이 사용될 수 있다. 예를 들어, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 차이는, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널(예컨대, RFU)에 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값을 곱한 다음(또는 나눈 다음), 상기 곱셈(또는 나눗셈) 결과를 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널(예컨대, RFU)로 빼는 방식으로 계산된다. 차이가 “0” 또는 미리 결정된 값보다 큰(또는 작은) 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정될 수 있다.
다른 예로서, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 차이는, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널(예컨대, RFU)에 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값을 곱한 다음(또는 나눈 다음), 상기 곱셈(또는 나눗셈) 결과를 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널(예컨대, RFU)로 빼는 방식으로 계산된다. 차이가 “0” 또는 미리 결정된 값보다 큰(또는 낮은) 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 미리 결정된 값은 역치로서 역할을 할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 검출되는 경우 또는 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이가 수학적 과정에 의해 얻어지는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 상기 기준값이 사용된다.
일 구현예에 따르면, 시그널이 PCR에 의한 타겟 증폭과 관련된 실시간 방식으로 발생하는 경우, 상기 시그널의 수학적 처리는 매 증폭 사이클에서의 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 강도에 대한 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 강도의 비율 계산을 포함한다. 상기 계산 결과는 사이클에 대하여 플롯팅되고 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 사용된다.
일 구현예에 따르면, 시그널이 PCR에 의한 타겟 증폭과 관련된 실시간 방식으로 발생하는 경우, Ct 값이 타겟 검출을 위한 시그널이다.
상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 결정될 수 있고, 다음과 같은 예로 설명할 수 있다: 먼저, 분석할 시료에 대해 실시간 PCR을 실시하고, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 얻은 후 상기 2개의 검출 온도의 증폭 곡선을 얻는다.
(a) 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 검출에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값이 없는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 존재하지 않는 것으로 결정할 수 있다. 그 후, 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 증폭 곡선으로부터 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값을 계산한다. 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 역시 존재하지 않는 경우에는, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값도 없다.
(b) 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 검출에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값이 존재하는 경우, Ct 값을 나타내는 사이클에서 상기 상대적 고온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값의 비율을 계산한다. 또한, 상기 Ct 값을 나타내는 사이클 이후의 사이클에서 얻은 RFU 값의 비율도 계산한다. (i) 모든 RFU 값의 비율이 기준값(예컨대, 상술한 바와 같이, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열만을 이용하여 얻어진 값)보다 작은 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 존재하지 않는 것으로 결정된다. 따라서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 없다. (ii) 모든 RFU 값의 비율이 상기 기준값보다 큰 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 증폭 곡선으로부터 계산된 Ct 값이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값으로 결정된다. (iii) 상기 Ct 값을 나타내는 사이클에서의 RFU 값의 비율이 상기 기준값보다 작고, 특정 사이클 이후의 RFU 값의 비율이 상기 기준값보다 큰 경우, 상기 특정 사이클이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값으로 결정된다.
계산된 비율이 상기 기준값과 동일한 경우, 상기 결정은 임의적으로 이뤄질 수 있다. 예를 들어, 상술된 예는 상기 결정이 상기 비율이 기준값보다 미만인지 이상인지를 고려하여 이뤄지는 것을 상술한다. 또한, 상기 결정은 상기 비율이 기준값보다 이하인지 초과인지를 고려하여 이뤄질 수 있다.
상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 택일적으로 다음과 같이 계산될 수 있다: 매 사이클에서 상기 상대적 고온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값의 비율을 계산한 다음; 역치 값을 고려하여 Ct 값을 계산한다.
상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 Ct 값은 택일적으로 다음과 같이 계산될 수 있다: 매 사이클의 상기 상대적 고온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값을 매 사이클의 기준값을 이용하여 변형하고; 매 사이클에 대하여 상기 변형된 RFU 값에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 RFU 값의 비율을 계산한 다음; Ct 값을 계산한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하는 것은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값(qualifying value)을 얻는 것을 포함하고, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함하며, 상기 정성값은 (i) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하거나 또는 (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 얻어진다.
상기 정성값은 변형된 값을 얻기 위해 추가적으로 수학적으로 처리될 수 있다. 상기 정성값은 시료 내에 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 사용된다.
일 구현예에 따르면, 상기 하나의 반응 용기는 상기 2개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 추가적인 2개의 시그널-발생 수단을 각각 포함하는 최소 하나의 추가적인 세트(additional set)를 추가적으로 포함하고; 상기 용기에서 2개의 시그널-발생 수단의 각 세트에 의해 발생된 상기 시그널은 서로 구별되고, 상기 시그널은 상이한 유형의 검출기에 의해 각각 검출된다. 예를 들어, 상기 단계 (a)에서의 2개의 시그널-발생 수단이 FAM으로 표지되고, 추가적인 2개의 시그널-발생 수단이 Quasar 570으로 표지되는 경우, 상기 용기에서 FAM-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널은 Quasar 570-표지된 시그널-발생 수단에 의해 발생된 시그널과 구별되므로, 2개의 상이한 방출 광(emission lights)을 검출하기 위한 2가지 유형의 검출기를 필요로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)를 포함하고, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 한 가지 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하고, 다른 하나는 다른 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 연속의 DNA 세그먼트 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 어떤 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트들은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 어떤 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈 내의 다양한 변이(예컨대, 메틸렌사수소 엽산 환원효소(methylenetetrahydrofolate reductase; MTHFR) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 종양 형성-유발 변이를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 모든 변이를 포함한다. 즉, 용어 뉴클레오타이드 변이는 핵산 서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 모든 돌연변이형을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 의해 검출된 뉴클레오타이드 변이는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는다.
본 발명의 이점은 SNP 검출에서 더욱 부각된다.
야생형 대립유전자(allele)에 대한 검출 온도는 상대적 고온 검출 온도이고 돌연변이 대립유전자에 대한 검출 온도는 상대적 저온 검출 온도이며, 시료가 돌연변이 동형접합(homozygous)인 경우, 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출되지 않을 것이고 시그널은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출될 것이다. 상기 시료는 야생형 대립유전자는 포함하지 않고 돌연변이형 대립유전자는 포함하는 것으로 결정될 것이다. 한편, 돌연변이 동형접합 시료에 대해 상기 상대적 고온 검출 온도에서 잘못된 시그널이 발생된 경우일지라도, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자의 존재를 결정하기 위한 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산한 결과는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널이 위양성 시그널인지 아닌지를 확인할 수 있게 해준다. 상기 이유는, SNP에 대한 이형접합체(heterozygote)가 야생형 대립유전자 및 돌연변이 대립유전자를 1:1 비율로 포함하고 있기 때문이다.
II. 상이한 검출 온도를 이용한 SNP 유전자형 분석(SNP Genotyping)
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석(SNP genotyping)하는 방법을 제공한다:
(a) 하나의 반응 용기에서 SNP 대립유전자를 검출하기 위한 시그널-발생 수단과 함께 상기 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 사이트를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 각각의 SNP 대립유전자는 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며;
(b) 상기 단계 (a)에서 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명은 상술한 본 발명의 첫 번째 양태의 원리를 따르므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다. 본 양태를 설명하기 위하여 상기 첫 번째 양태에 대한 설명을 언급하는 경우, 본 양태의 단계 (b)는 첫 번째 양태의 단계 (b)와 일부 상이하다는 것을 유념해야 한다. 따라서, 본 기술분야의 당업자라면 첫 번째 양태에 대한 일부 설명이 본 양태의 단계 (b)에 대한 설명에 직접적으로 적용될 수 있고, 변형된 다른 설명이 본 양태의 단계 (b)에 대한 설명에 적용될 수 있음을 이해할 것이다.
단계 (a):
시그널-발생 수단과의 인큐베이션 및 시그널 검출
먼저, 하나의 반응 용기에서 SNP 대립유전자의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 함께 SNP 사이트를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 시료를 인큐베이션한 다음, 단일 유형의 검출기를 이용하여 발생된 시그널을 검출한다. 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
상기 SNP 사이트를 포함하는 핵산 서열은 인간의 염색체 쌍을 포함할 수 있다.
상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계(a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
단계 (b):
SNP 유전자형의 결정
시그널의 검출에 이어, 상기 단계 (a)에서의 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정한다.
본 발명은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 존재에 대한 결정 없이도 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이만을 이용하여 SNP 유전자형을 분석할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리함으로써 얻어진다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율을 계산함으로써 얻어진다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 배경 시그널은 상기 차이를 계산하기 위해 사용된다.
일 구현예에 따르면, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 배경 시그널은 상기 차이를 계산하기 위하여“0” 또는 “1”로 처리될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 계산하는 동안 음수 값이 얻어지는 경우, 음수 값은 절대 값으로 변환되어 차이를 얻기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, SNP 유전자형을 결정하기 위한 상기 단계 (b)는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 존재의 결정 없이 실시될 수 있다. SNP 유전자형 분석은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 이용하여 실시될 수 있다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 존재의 결정이 요구되지 않는 이유는 3개의 SNP 유전자형이 존재하며, SNP에 대한 이형접합체가 야생형 대립유전자 및 돌연변이 유전자형을 1:1 비율로 포함하고 있기 때문이다. 본 발명의 원리와 상기 이유를 조합함으로써, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 존재의 결정 없이도 SNP 유전자형을 분석할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자를 포함하는 동형접합체(homozygote) 시료는 특정 범위 내의 차이(예컨대, 비율)를 나타내고, 이형접합체 시료는 다른 특정 범위 내의 차이(예컨대, 비율)를 나타내며, 상기 상대적 저온 검출 온도를 포함하는 SNP 대립유전자를 포함하는 동형접합체는 또 다른 특정 범위 내의 차이(예컨대, 비율)를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 각각의 SNP 유전자형에 대한 특정 범위는 각각의 SNP 유전자형에 대한 기준값과 관련될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 SNP 유전자형을 결정하기 위하여 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및 이형접합체에 대한 기준값 중 최소 하나를 이용한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 SNP 유전자형을 결정하기 위하여 상기 3개의 기준값 모두를 이용한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 SNP 유전자형을 결정하기 위하여 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및 이형접합체에 대한 최소 2개의 기준값을 이용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은, SNP 유전자형을 결정하기 위하여, (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 함께 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 인큐베이션하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값을 이용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은, SNP 유전자형을 결정하기 위하여, (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상응하는 시그널-발생 수단과 함께 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체를 인큐베이션하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값을 이용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은, SNP 유전자형을 결정하기 위하여, (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자의 검출을 위한 시그널-발생 수단과 함께 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체를 인큐베이션하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값을 이용한다.
일 구현예에 따르면, 시료의 SNP 유전자형을 분석하기 위하여, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산하고, 각각의 SNP 유전자형의 기준값과 비교한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 반응 완료시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건하에서 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체에 대한 기준값을 얻기 위하여, 각각의 SNP 대립유전자의 함량과 같은 반응 조건들은 반응 완료시에 각각의 SNP 대립유전자에 대한 포화 시그널이 제공되도록 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값 계산 중에 얻어진 상기 시그널 간의 차이는 특정 범위를 갖고, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다.
상기 야생형 대립유전자에 대한 검출 온도가 상기 상대적 고온 검출 온도이고, 상기 돌연변이 대립유전자에 대한 검출 온도가 상기 상대적 저온 검출 온도이며, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율을 계산하여 차이를 얻은 경우, 상기 야생형 동형접합체 시료는 특정 범위 내의 비율을 나타내고, 이형접합체 시료는 다른 특정 범위 내의 비율을 나타낸다.
예를 들어, 야생형 동형접합체 시료는 약 1.0의 비율을 나타내며, SNP에 대한 이형접합체 시료는 약 2.0의 비율을 나타낸다.
시료가 돌연변이 동형접합체인 경우, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율을 계산하기 위해 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 배경 시그널이 사용될 수 있다. 이러한 경우, 계산된 비율은 2.0보다 훨씬 큰 값을 나타낼 수 있고, 이는 시료의 SNP 유전자형이 돌연변이 동형접합체인 것을 가리킨다. 택일적으로, 계산된 비율은 돌연변이 이형접합체에 의해 나타난 특정 범위의 비율(예컨대, 약 9.0)에 속하는 값을 나타낼 수 있다.
더욱이, 돌연변이 동형접합체 시료에 대해 상대적 고온 검출 온도에서 잘못된 시그널이 발생된 경우일지라도, 상기 비율은 2.0보다 훨씬 큰 값을 나타낼 것이고, 이는 시료의 SNP 유전자형이 돌연변이 동형접합체인 것을 가리킨다.
따라서, SNP 유전자형을 위한 본 발명은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이만을 이용하여 SNP 유전자형을 결정할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어진 정성값을 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 야생형 동형접합체, 돌연변이 동형접합체 또는 이형접합체를 포함하는 표준 시료를 이용하여 얻어지고, 시험 시료로부터 얻어진 차이를 분석하기 위해 사용된다.
III. 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 각각의 상이한 검출 온도에서 실시되며;
(b) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 특정 검출 온도(certain detection temperature)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정되고; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도(relatively highest detection temperature)인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
본 발명은 상술한 본 발명의 첫 번째 양태의 원리를 따르므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
단계 (a):
시그널-발생 수단과의 인큐베이션 및 시그널 검출
먼저, 하나의 반응 용기에서 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 분석할 시료를 인큐베이션한 다음, 단일 유형의 검출기를 이용하여 발생된 시그널을 검출한다. 상기 최소 3개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명에 의해 검출되는 상기 타겟 핵산 서열의 수는 하나의 반응 용기에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개 이상의 타겟 핵산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된다. 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 갖는다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대해 할당된 상기 검출 온도는 서로 최소 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 15℃ 또는 20℃ 상이하다.
상기 타겟 핵산 서열 중 하나는 상대적 최고 검출 온도를 갖는다. 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해, 상기 상대적 최고 검출 온도에서 시그널을 제공할 수 있는 시그널-발생 수단이 사용된다.
검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이다. 상기 검출은 가각의 상이한 검출 온도에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 상기 시그널이 발생된다. 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 상기 시그널이 발생된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 상기 검출 올리고뉴클레오타이드가 혼성화된 다음, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 상기 시그널이 발생된다. 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 상기 시그널이 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의존적인 방식의 시그널 발생은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 나머지 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 나머지 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단은 단편을 방출하고, 상기 단편은 이합체의 형성을 매개하거나 또는 캡처 올리고뉴클레오타이드 상에서 상기 단편의 연장에 의한 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 매개한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 최소 3개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널-발생 수단이 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 상기 검출 온도는 상기 이합체의 Tm 값에 기초하여 선택된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널-발생 수단이 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 경우, 상기 검출 온도는 임의적으로 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단은 상대적 최고 검출 온도를 제공할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 상기 시그널-발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 각각의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 시그널-발생 수단에 의해 시그널 발생이 가능한 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다. 상기 검출 온도는 검출 온도 중에서 겹치지 않는 검출 온도 범위 및 겹치는 검출 온도 범위를 고려하여 미리 결정될 수 있다.
상기 특정 검출 온도에서의 검출은 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 검출하는 것이다. 상기 상대적 최고 검출 온도에서의 검출은 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 검출하는 것이다.
예를 들어, 상기 타겟 핵산 서열이 3개의 타겟 서열을 포함하고, 72℃, 60℃ 및 50℃의 검출 온도가 각각 상기 3개의 타겟 서열에 할당된 경우, 상기 50℃에서의 검출은 50℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 검출 뿐만 아니라 각각 70℃ 및 60℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 검출도 포함한다.
본 발명의 특징 중 하나는 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 상이한 검출 온도에서 검출하여 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 구별하여 결정하는 것이다.
단계 (b):
최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재 결정
시그널의 검출에 이어, 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
일 구현예에 따르면, 특정 검출 온도에서 검출된 시그널이 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 시그널을 포함하는지 또는 포함하지 않는지를 확인하기 위하여, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 분석하는 방식으로 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
최소 3개의 타겟 핵산 서열 중에서 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다. 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어지는 차이를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다. 이러한 구현예는 시그널의 존재 및 부존재로 인한 차이를 이용하여 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 수 있다는 것을 나타낸다.
예를 들어, 타겟 핵산 서열이 4개의 타겟 서열을 포함하는 것으로 가정하면, 72℃, 60℃, 50℃ 및 40℃의 검출 온도가 각각 상기 타겟 서열에 할당되고, 시그널은 상기 단계 (a)에서 검출 온도 60℃, 50℃ 및 40℃에서 검출된다. 상기 40℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고자 하는 경우, 상기 특정 검출 온도(40℃)를 갖는 타겟 핵산 서열은 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 높은 하나 이상의 검출 온도(60℃ 또는 50℃)에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 이용하여 결정된다. 더욱 명확하게, 40℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 60℃에서 검출된 시그널 및 40℃에서 검출된 시그널 간의 차이, 50℃에서 검출된 시그널 및 40℃에서 검출된 시그널 간의 차이 또는 상기 2개의 차이 모두가 사용될 수 있다.
다른 검출 온도(즉, 60℃ 및 50℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 각각 상술한 바와 같이 결정될 수 있다.
상기 용어 “특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이”는 2개의 검출 온도에서의 시그널 간에 얻어지는 차이를 포함한다. 상기 시그널 중 하나는 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도 중 하나에서 검출된 시그널이고, 다른 하나는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널이다. 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도가 2개 이상인 경우, 2개 이상의 차이가 얻어질 수 있다.
상기 용어 “하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이”는 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이뿐만 아니라 2개의 검출 온도 간의 차이 및 다른 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 얻어진 차이도 포함한다.
택일적으로, 일 구현예에 따르면, 특정 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도(60℃)보다 높은 하나 이상의 검출 온도(72℃)에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어진 차이를 이용함으로써 결정된다. 상기 높은 검출 온도(72℃)에서 시그널이 검출되지 않는 경우에는, 상기 차이를 계산하기 위해 배경 시그널이 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도(60℃)보다 높은 검출 온도(72℃)에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 특정 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도(60℃)보다 높은 검출 온도(72℃)에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 특정 검출 온도(60℃)에서 검출된 시그널을 이용하여 결정된다.
만약, 상기 최고 검출 온도(72℃)에서 시그널이 검출되면, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 것으로 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중에서 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고자 하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 이용하여 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어지는 차이를 이용하는 것을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하는 것을 포함한다.
예를 들어, 상기 40℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고자 하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 바로 다음으로 높은 검출 온도(50℃)에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 이용하여 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 50℃ 및 40℃ 검출 온도에서 검출된 시그널이 상기 50℃ 및 40℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지를 결정하기 위하여 기준값이 필요하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 얻기 위한 방법에 따라, 상기 얻어진 차이가 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는지를 분석하기 위하여 역치가 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 얻기 위한 방법에 따라, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 얻어진 차이 자체를 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 차이 자체의 직접적인 이용을 구현하기 위하여 상기 차이를 얻는데 있어서 역치 값이 미리 반영된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 기준값이 사용된다.
특정 구현예에서, 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 상기 특정 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서의 시그널의 차이는 기준값을 통해 표현될 수 있다.
특정 구현예에서, 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 의해 제공된 상기 특정 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서의 시그널이 서로 상이한 경우에 대한 기준값은 상기 2개의 시그널이 동일한 경우에 대한 기준값과 비교하여 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% 또는 30% 이상 상이할 수 있다.
특정 구현예에서, 2개의 검출 온도에서의 시그널로부터 계산된 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값이 상기 2개의 시그널이 동일한 경우에 대한 기준값과 비교하여 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 10%, 12%, 15%, 20% 또는 30% 이상 상이한 경우, 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 기준값을 상기 특정 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재 결정에 사용할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값의 사용 여부를 결정하기 위해 상기 비교를 실시하는 경우, 상기 기준값은 시그널의 나눗셈에 의해 계산된다. 일 구현예에 따르면, 상기 기준값의 사용 여부를 결정하기 위해 기준값을 계산하는 방법은 상기 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 기준값을 계산하는 방법과 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 복수의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 검출되는 경우, 복수의 타겟 핵산 서열에 대한 변화된 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 고려하여 복수의 타겟 핵산 서열에 대한 기준값을 사용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 상기 기준값이 사용된다.
상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우는 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 유의한 시그널이 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 검출된 경우를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다하기 위해 상기 기준값이 선택적으로 사용된다.
상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 경우는 배경 시그널과 유사한 강도를 갖는 시그널만이 검출된 경우를 포함한다.
상기 기준값은 상기 타겟 핵산 서열의 모든 조합 또는 일부 선택된 조합에 대하여 미리 준비될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 상기 조합으로부터 얻어진 검출 온도에서의 시그널 간의 차이이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 반응 완료시에 포화 시그널을 제공하기에 충분한 반응 조건하에서 얻어질 수 있다. 예를 들어, 2개의 타겟 핵산 서열의 조합에 대한 기준값을 얻기 위하여, 상기 각각의 타겟 핵산 서열의 함량과 같은 반응 조건들은 반응 완료시에 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 포화 시그널이 제공되도록 선택된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값 계산 중에 얻어진 상기 시그널 간의 차이는 특정 범위를 갖고, 상기 기준값은 상기 특정 범위 내에서 또는 상기 특정 범위를 참조하여 선택된다.
차이를 얻기 위한 방법 및 실제 검출 결과를 고려하여 상기 시료에서 얻어진 차이의 유의성을 결정하기 위해 상기 기준값이 사용될 수 있다. 상기 기준값은 시료에서 상기 차이를 얻기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해, 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는데 관여한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 방법은 (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합을 상응하는 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, (ii) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도뿐만 아니라 상기 특정 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값 중에서 최소 하나의 기준값을 이용한다.
본 발명에 의해 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하고자 하는 경우, 시그널 검출을 위해 선택된 2개의 검출 온도의 다양한 조합과 함께 타겟 핵산 서열의 다양한 조합을 고려하여, 다양한 기준값이 얻어질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열부터 상기 최저 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열까지 이들의 검출 온도 순으로 결정되고, 기준값은 타겟 존재를 결정하는 방법에 따라 적합하게 선택된다.
상기 예에서, 상기 특정 검출 온도(40℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 기준값을 얻기 위해, 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 높은 검출 온도(60℃ 및 50℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합(즉, 상기 60℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열, 상기 50℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 및 상기 60℃ 및 50℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열들의 조합)을 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고; 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 높은 하나 이상의 검출 온도(60℃ 및 50℃)뿐만 아니라 상기 특정 검출 온도(40℃)에서 시그널을 검출한 다음; 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 사용하여 상기 시그널 간의 차이를 얻는다. 동일한 방법에 따라, 상기 다른 검출 온도(즉, 60℃ 및 50℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 기준값을 얻는다.
택일적으로, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 방법은 (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합을 상응하는 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, (ii) 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값 중에서 최소 하나의 기준값을 추가적으로 이용한다.
상기 예에서, 상기 특정 검출 온도(40℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 기준값을 얻기 위해, 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 높은 검출 온도(60℃ 및 50℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합(즉, 상기 60℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열, 상기 50℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 및 상기 60℃ 및 50℃ 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열들의 조합)을 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단과 인큐베이션하고; 상기 특정 검출 온도(40℃)보다 바로 다음으로 높은 검출 온도(50℃) 및 상기 특정 검출 온도(40℃) 모두에서 시그널을 검출한 다음; 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도(50℃)에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도(40℃)에서 검출된 시그널을 사용하여 상기 시그널 간의 차이를 얻는다. 동일한 방법에 따라, 상기 다른 검출 온도(즉, 60℃ 및 50℃)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 기준값을 얻는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나의 검출 온도 및 상기 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 비율 또는 차이를 계산함으로써 얻어진다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나의 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 계산하여 얻어진다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 기준값은 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나의 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 계산하여 얻어진다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 기준값을 이용하여 역치가 얻어지는 경우, 상기 역치는 다양한 조합의 타겟 핵산 서열로부터 얻어진 기준값들 중에서 특정 기준값 또는 일부 기준값들을 이용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열 중 하나의 타겟 핵산 서열이 존재하지 않는 것으로 분석되는 경우, 상기 하나의 타겟 핵산 서열을 포함하지 않는 타겟 핵산 서열의 조합으로부터 얻어진 기준값이 상기 역치를 결정하기 위해 사용된다.
일 구현예에서, 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 경우, 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 확인하기 위하여, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 제외한 타겟 핵산 서열의 조합을 포함하는 표준 시료를 미리 준비한 다음, 기준값을 얻는다. 상기 기준값을 고려하여, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 역치가 얻어진다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하는 것은 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함하고, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 차이를 이용하는 것은 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함하며, 상기 정성값은 (i) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하거나 또는 (ii) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않은 경우, 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 이용하여 얻어진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 먼저 결정한 다음, 내림차순으로 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 순차적으로 결정하여 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 하나의 반응 용기는 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 추가적인 최소 3개의 시그널-발생 수단을 각각 포함하는 최소 하나의 추가적인 세트를 추가적으로 포함하고; 상기 용기에서 최소 3개의 시그널-발생 수단의 각 세트에 의해 발생된 상기 시그널은 서로 구별되고, 상기 시그널은 상이한 유형의 검출기에 의해 각각 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(특히 SNP)를 포함한다.
IV. 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용한 2개의 타겟 핵산 서열의 검출
*본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 2개의 시그널-발생 수단과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 실시되며;
(b) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 일정 범위의 온도에서 상기 단계 (a)의 인큐베이션 결과물(incubation resultant)의 멜팅 분석을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고, 상기 단계 (b)에서 멜팅 분석의 결과를 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
단계 (a):
시그널-발생 수단과의 인큐베이션 및 시그널 검출
먼저, 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단과 함께 분석하고자 하는 시료를 인큐베이션한 다음, 단일 유형의 검출기를 이용하여 발생된 시그널을 검출한다. 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출된다. 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 상이한 검출 온도를 이용한 실시간 검출 방법에 의해 검출되고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 멜팅 분석에 의해 검출된다.
상기 단계 (a)에서의 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도에서는 실시되지만, 상기 상대적 저온 검출 온도에서는 실시되지 않는다.
멜팅 분석 동안 시그널을 발생시킬 수 있는 시그널 발생 수단이 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 선택된다.
일 구현예에 따르면, 상기 멜팅 분석을 위한 시그널-발생 수단은 이합체의 혼성화 및 변성을 이용하기 때문에, 상기 단계 (a)의 반응 조건에 따라 시그널을 발생시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시키기 위한 시그널-발생 수단은 상기 상대적 고온 검출 온도에서는 시그널을 발생시키지 않도록 구성되어야 한다.
본 발명의 네 번째 양태에서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시키기 위한 시그널 발생 수단은 반응 조건에 따라 상기 단계 (a)에서 시그널을 발생시키거나 발생시키지 않을 수 있다. 특정 반응 조건하에서 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 발생할지라도, 상기 단계 (a)에서 시그널 검출이 상대적 고온 검출 온도에서 실시되기 때문에 상기 발생된 시그널은 검출되지 않는다.
상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 단계 (b)에서 발생되어 검출될 수 있기 때문에, 상기 시그널이 상기 단계 (a)에서 발생되어야 하는 것은 아니다.
일 구현예에 따르면, 상기 멜팅 분석을 위한 시그널-발생 수단은 표지된 프로브 또는 표지된 이합체의 절단에 의해 시그널을 발생시키는 수단은 포함하지 않는다. 상기 멜팅 분석은 혼성화물의 Tm 값을 이용하므로, 상기 검출되는 혼성화물의 절단은 배제되어야 한다. 절단 시에는 멜팅 피크가 생성되지 않거나 검출 민감도가 크게 감소될 수 있다. 또한, 절단에 의한 시그널은 실시간 검출 방법에서 위양성 시그널이 될 가능성이 있다.
상기 단계 (a)는 적어도 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 조건하에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 발생된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 발생된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다. 일 구현예에 따르면, 시그널은 타겟 핵산 서열과 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 후 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다. 일 구현예에 따르면, 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 시그널 발생은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 위해 사용된다.
특히, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 시그널 발생을 이용하는 것은 다음과 같은 이유로 매우 유리하다: (i) 상대적으로 넓은 검출 온도 범위에서 검출 온도가 선택될 수 있고; (ii) 혼성화 접근법과 비교하여 더 높은 온도가 선택될 수 있으며; 및 (iii) 적합한 시그널-발생 수단 및 반응 조건을 선택함으로써(예컨대, 절단 없이 혼성화만 시그널을 발생시키지 못하는 시그널-발생 수단의 선택 또는 대부분의 검출 올리고뉴클레오타이드가 절단되게 하는 조건의 선택) 멜팅 분석에서 시그널을 제공하지 않을 수 있다.
상기 이합체의 형성(예컨대, 분자 비콘)에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단은 또한 반응 조건에 의존적인 5’-뉴클레아제에 의한 절단을 통해 시그널을 제공할 수 있다. 상기 시그널-발생 수단이 절단에 의한 시그널을 발생시키기 위해 사용되는 한, 상기 시그널-발생 수단은 절단에 의한 시그널을 제공할 수 있는 시그널-발생 수단으로 간주될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 발생시킨다.
일 구현예에 따르면, 상기 2개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
시료를 시그널을 발생시키기 위한 2개의 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션(반응)한 후, 상기 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출된다. 상기 검출은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 상대적 고온 검출 온도에서 실시된다.
단계 (b):
멜팅 분석
이어, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 일정 범위의 온도에서 상기 단계 (a)의 인큐베이션 결과물의 멜팅 분석을 실시한다.
본 명세서는 단지 설명의 편의를 위해, 상기 단계 (a)에서의 검출 이후 상기 단계 (b)를 실시하는 것을 기술한다. 본 발명의 근본적인 원리를 고려해 보면, 상기 단계 (b)가 상기 단계 (a)에서의 검출 전에 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 단계 (a)의 검출 전에 상기 단계 (b)를 포함하는 과정 역시 본 발명의 범위에 속한다.
상기 단계 (b)는 본 기술 분야의 통상의 기술자에게 알려진 다양한 멜팅 분석 과정에 의해 실시될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “멜팅 분석(melting analysis)”은 달리 명시하지 않는 한, 좁은 의미의 멜팅 분석뿐만 아니라 혼성화 분석을 포괄하는 의미로 사용된다. 좁은 의미의 멜팅 분석은 온도 조절에 의해 증가하는 엄격 조건하에서 이합체의 해리(dissociation)를 측정하는 방법을 의미한다. 좁은 의미의 혼성화 분석은 온도 조절에 의해 감소하는 엄격 조건하에서 이합체의 결합(association)을 측정하는 방법을 의미한다. 본 명세서에 사용된 용어 “멜팅 곡선(melting curve)”또는 “멜팅 피크 곡선(melting peak curve)”은 달리 명시하지 않는 한, 좁은 의미의 멜팅 분석으로부터 얻은 멜팅 곡선이나 멜팅 피크 곡선뿐만 아니라 혼성화 분석으로부터 얻은 혼성화 곡선이나 혼성화 피크 곡선을 포괄하는 의미로 사용된다. 멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은 종래 기술들 예컨대, 미국특허 제6,174,670호 및 제5,789,167호, Drobyshev 등, Gene 188: 45(1997); Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Livehits 등, J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); 및 Howell 등, Nature Biotechnology 17:87(1999)에 기술된 방법들에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은 혼성화 엄격도(stringency)의 파라미터를 이용한 아웃풋 시그널(output signal) 변화의 그래픽 플롯(graphic plot) 또는 디스플레이(display)로 구성될 수 있다. 아웃풋 시그널은 혼성화 파라미터에 대하여 직접적으로 플롯팅될 수 있다. 전형적으로, 멜팅 곡선 또는 혼성화 곡선은, Y-축에 플롯팅된 이합체 구조의 정도(즉, 혼성화 정도)를 나타내는 아웃풋 시그널, 예컨대 형광, 및 X-축에 플롯팅된 혼성화 파라미터를 가질 것이다.
멜팅(혼성화) 곡선 분석 및 멜팅(혼성화) 피크 분석은 미국특허 제8,039,215호에 개시된 것을 참조하여 기술될 수 있다.
*상기 멜팅 분석은 “Tm” 값을 이용한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “Tm”은 이중가닥 핵산 분자의 집단(population)의 절반이 단일-가닥 분자로 해리되는 멜팅 온도를 의미한다. Tm 값은 혼성화된 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace 등, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr. 등, Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N. 등, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))과 같은 종래 방법에 의하여 계산할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 온도를 증가시키면서 발생된 시그널을 검출(좁은 의미의 멜팅 분석)하여 실시된다. 택일적으로, 상기 단계 (b)는 온도를 감소시키면서 발생된 시그널을 검출(좁은 의미의 혼성화 분석)하여 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 멜팅 분석에 사용된 시그널-발생 수단은 일정 범위의 온도에서 이합체 형성으로부터 시그널을 발생시키는 어떠한 수단도 포함한다. 또한, 실시간 검출 방법을 위한 시그널-발생 수단 중에서, 절단 반응 대신에 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 의해 시그널을 발생시키는 수단이 또한 멜팅 분석을 위해 사용된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 이용하여 실시된다. 특히, 상기 단계 (b)는 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 발생시키는 시그널 발생 수단을 이용하여 실시된다.
상기 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의한 시그널은 PTOCE-멜팅 방법(WO 2012/096523), PCE-SH-멜팅 방법(WO 2013/115442) 및 PCE-NH-멜팅 방법(PCT/KR2013/012312)을 포함하는 다양한 방법에 의해 발생될 수 있다. 상기 PTOCE-멜팅 방법, PCE-SH-멜팅 방법 및 PCE-NH-멜팅 방법은 각각 멜팅 분석을 이용하는 PTOCE-기반 방법, 멜팅 분석을 이용하는 PCE-SH-멜팅 방법 및 멜팅 분석을 이용하는 PCE-NH-멜팅 방법에 해당된다. 상기 PTOCE-기반 방법 중에서, 절단에 의해 시그널을 발생시키지 않는 방법이 상기 단계 (b)에서의 멜팅 분석을 위해 이용된다.
상기 PTOCE-멜팅 방법, PCE-SH-멜팅 방법 및 PCE-NH 멜팅 방법은 이전의 특허 문헌에서도 기재되어 있다.
상기 PTOCE-멜팅 방법에 의해 실시되는 단계(a)-(b)는 다음의 단계를 포함한다:
(a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오티드 또는 그의 연장가닥은 상기 5'뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편을 CTO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장이합체를 형성하며, 상기 연장이합체는 (i) 상기 단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절 가능한 Tm 값을 가지며; (e) 상기 연장이합체를 일정 범위의 온도에서 멜팅하여 상기 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널을 제공하는 단계로서; 상기 타겟 시그널은 (i) 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지와 상기 단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 표지, 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지에 의하여 제공되고; 및 (f) 상기 타겟 시그널을 측정하여 연장이합체를 검출하는 단계로서; 상기 연장이합체의 존재는 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다.
이러한 경우, 상기 PTOCE 멜팅 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함한다. 상기 PTOCE-멜팅 방법의 단계 (a)에서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드 대신에 타겟 핵산 서열의 증폭을 위한 프라이머 세트가 사용될 수 있다. 이러한 경우, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(f)의 전부 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함한다.
상기 PTOCE-기반 멜팅 방법에 의해 실시된 본 발명의 단계 (a)-(b)는 다음의 단계를 포함한다.
(a) 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO와 혼성화시키는 단계; (b) 상기 PTO의 절단을 위한 조건 하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오티드 또는 그의 연장가닥은 상기 5'뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO의 절단을 유도하며, 이러한 상기 절단은 상기 PTO의 5'-태깅 부위 또는 5'-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출하고; (c) 상기 PTO로부터 방출된 단편을 CTO와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO로부터 방출된 단편은 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고; (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장 반응을 실시하는 단계로서; 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 상기 단편은 연장되어 연장 가닥을 형성하며; 및 (e) 일정 범위의 온도에서 상기 연장 가닥의 존재에 의존적으로 발생되는 시그널을 검출하여 멜팅 분석을 실시하는 단계.
단계 (c):
타겟 핵산 서열의 존재 결정
마지막으로, 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널을 이용하여 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고, 상기 단계 (b)에서의 멜팅 분석 결과를 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(특히, SNP)를 포함한다.
실시간 검출을 위한 절단에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단과 멜팅 분석을 위한 타겟 핵산 서열과 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 조합하는 경우, 본 발명의 예기치 못한 결과가 얻어질 수 있다. 이러한 경우, 멜팅 분석을 위하여, 이합체의 형성에 관여하고, 절단에 의해 직접적으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단은 배제되어야 한다
본 발명을 실시간 과정으로서 절단에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대, TaqMan 방법) 그리고 멜팅 분석으로서 PTOCE-기반 멜팅 방법의 조합으로 실시함으로써, 매우 우수한 결과를 제공한다는 점은 주목할만 하다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널을 이용하는 것은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 정성값을 얻는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(특히, SNP)를 포함한다.
V. 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석를 이용한 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는, 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 제공한다:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열은 검출 온도 분석에 의해 검출되며, 상기 검출은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 검출 온도 및 상기 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 모두에서 실시되고;
(b) 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 일정 범위의 온도에서 상기 단계 (a)의 인큐베이션 결과물의 멜팅 분석을 실시하는 단계; 및
(c) (i) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고; 여기서 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 중에서 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정되며; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되며; (ii) 상기 단계 (b)에서 멜팅 분석의 결과에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
본 발명은 상술한 본 발명의 첫 번째 양태에서 네 번째 양태의 원리를 따르므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
단계 (a):
시그널-발생 수단과의 인큐베이션 및 시그널 검출
먼저, 하나의 반응 용기에서 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 분석하고자 하는 시료를 인큐베이션한 다음, 단일 유형의 검출기를 이용하여 발생된 시그널을 검출한다. 최소 3개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
상기 타겟 핵산 서열 중 하나는 상대적 최고 검출 온도를 갖는다. 상대적 최고 검출 온도에서 시그널을 제공할 수 있는 시그널-발생 수단은 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 이용된다.
본 발명에서, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열은 상기 검출 온도 분석에 의해 검출되고, 나머지는 멜팅 분석에 의해 검출된다.
표현 “최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열”에서 용어 “일부(some)”는 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 “검출 온도 분석(detection temperature analysis)”은 달리 명시되지 않는 한, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 상이한 검출 온도에서의 검출을 포함하는 실시간 검출을 의미한다.
상기 멜팅 분석에 의해 분석되는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시키기 위한 시그널-발생 수단은 반응 조건에 따라 상기 단계 (a)에서 시그널을 발생시키거나 발생시키지 않을 수 있다. 상기 멜팅 분석에 의해 분석되는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상기 단계 (b)에서 발생되어 검출될 수 있으므로, 상기 시그널이 상기 단계 (a)에서 발생되어야 하는 것은 아니다.
상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 각각은 서로 상이한 검출 온도를 갖는 시그널-발생 수단을 이용해야 한다.
일 구현예에 따르면, 상기 멜팅 분석을 위한 시그널-발생 수단은 이합체의 혼성화 및 변성을 이용하기 때문에, 상기 단계 (a)에서의 반응 조건에 따라 시그널을 발생시킬 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 상기 검출 온도 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열에 대한 적어도 하나의 시그널을 발생시키기에 적합한 조건하에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 온도 분석에 의해 분석될 타겟 핵산 서열은 검출 온도를 고려하여 선택된다. 특히, 상기 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 먼저 선택된 다음, 검출 온도 순서대로 일부 서열이 선택된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의해 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 타겟 핵산 서열 및 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 이합체의 형성에 의해 발생된다. 일 구현예에 따르면, 상기 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것에 의한 시그널-발생 수단이다.
일 구현예에 따르면, 시그널-발생 수단 중 최소 하나는 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단이다. 일 구현예에 따르면, 시그널은 타겟 핵산 서열과 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 후 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의해 발생된다. 일 구현예에 따르면, 시그널은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 상기 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 발생된다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 올리고뉴클레오타이드 절단에 의존적인 방식의 시그널 발생은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대해서만 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 다른 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 다른 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식의 이합체의 형성에 의하여 시그널을 발생시킨다.
예를 들어, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 TaqMan 방법에 의해 발생되고, 다른 타켓 핵산 서열에 대한 시그널은 PTOCE 방법, PCE-SH 방법 또는 PCE-NH 방법에 의해 발생된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 최소 3개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
본 발명에 의해 검출되는 상기 타겟 핵산 서열의 수는 하나의 반응 용기에서 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10개 이상의 타겟 핵산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
시료를 시그널을 발생시키는 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션(반응)한 후, 상기 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출한다. 일 구현예에 따르면, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열은 검출 온도 분석에 의해 검출되고, 상기 검출은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 검출 온도 및 상기 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 모두에서 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 온도 분석을 실시하기 위해 요구되는 모든 검출 온도에서 시그널이 검출된다.
상기 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출된다. 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 갖는다. 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 온도 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열은 상기 멜팅 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열의 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는다.
단계 (b):
멜팅 분석
상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 일정 범위의 온도에서 상기 단계 (a)의 인큐베이션 결과물의 멜팅 분석을 실시한다.
본 명세서는 설명의 편의를 위해, 상기 단계 (a)에서의 검출 이후 상기 단계 (b)를 실시하는 하는 것에 대해서만 기술한다. 본 발명의 근본적인 원리를 고려해 보면, 상기 단계 (b)가 상기 단계 (a)에서의 검출 전에 실시될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 상기 단계 (a)의 검출 전에 상기 단계 (b)를 포함하는 과정 역시 본 발명의 범위에 속한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)는 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단을 이용하여 실시된다. 특히, 상기 단계 (b)는 PTOCE 기반-멜팅 방법에 따라 실시된다.
단계 (c):
타겟 핵산 서열의 존재 결정
마지막으로, 상기 단계 (a)에서의 시그널 및 상기 단계 (b)의 멜팅 분석의 결과를 이용하여 시료 내 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한다.
상기 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널을 이용하여 결정된다. 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 상기 일부 타겟 핵산 서열 중에서 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다. 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 방법은 (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합을 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, (ii) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도뿐만 아니라 상기 특정 검출 온도에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값을 추가적으로 사용한다.
택일적으로, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 방법은 (i) 상기 단계 (a)에서의 반응 용기와는 다른 반응 용기에서 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합을 시그널-발생 수단과 함께 인큐베이션하고, (ii) 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도 모두에서 시그널을 검출한 다음, (iii) 상기 특정 검출 온도보다 바로 다음으로 높은 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 구하여 얻어진 기준값을 추가적으로 이용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 검출 온도 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 또는 기준값 간의 차이를 얻기 위하여, 상기 멜팅 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도에서의 시그널 검출이 필요한 경우, 상기 멜팅 분석에 의해 검출되는 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도에서 시그널이 수집될 수 있다.
상기 검출 온도 분석에 의해 결정되는 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 단계 (b)에서의 멜팅 분석의 결과에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (d)는 먼저 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정한 다음, 내림차순으로 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 순차적으로 결정하여 실시된다.
일 구현예에 따르면, 상기 멜팅 분석에 의한 타겟 핵산 서열 존재의 결정은 상기 검출 온도 분석에 의한 타겟 핵산 서열 존재의 결정에서 (예컨대, 기준값 선택을 위해) 이용될 수 있다.
상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열이 실시간 방식으로 검출되는 경우, 절단에 의한 시그널 발생은 오직 하나의 타겟 핵산 서열만을 위해 사용된다. 다른 타겟 핵산 서열을 위해서는, 분석의 효율 및 준비도(readiness)를 개선하기 위해 PTOCE-기반 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(특히, SNP)를 포함한다.
VI. 복수의 검출 온도를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단으로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며; 및
(b) 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 검출이라고 명명되는 양태 I의 본 발명의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하기 위한 키트를 제공한다:
(a) SNP 대립유전자의 검출을 위한 시그널-발생 수단으로서; 상기 각각의 SNP 대립유전자는 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며; 및
(b) 상이한 검출 온도를 이용한 SNP 유전자형 분석이라고 명명되는 양태 II의 본 발명의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단으로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 각각의 상이한 검출 온도에서 실시되며; 및
(b) 상이한 검출 온도를 이용한 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출이라고 명명되는 양태 III의 본 발명의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단으로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 실시되며; 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이고; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용한 2개의 타겟 핵산 서열의 검출이라고 명명되는 양태 IV의 본 발명의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단으로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열은 검출 온도 분석에 의해 검출되며, 상기 검출은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 검출 온도 및 상기 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 모두에서 실시되고; 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 나머지 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단이고; 및
(b) 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석를 이용한 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출이라고 명명되는 양태 V의 본 발명의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 제조되므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
상술한 본 발명의 모든 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사 효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 상기 키트의 구성성분들은 개별 용기 내에 존재하거나 복수의 구성성분들이 하나의 용기 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법을 기술하거나 실시하기 위한 설명서는 적합한 기록 매체에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 종이 및 플라스틱과 같은 기판에 인쇄될 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 CD-ROM 및 디스켓과 같은 적합한 컴퓨터 해독가능한 기록매체 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트 내에 실질적인 설명서는 포함되지 않으며, 다만 원격 소스로부터, 예컨대 인터넷을 통해, 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 상기 구현예의 한 예는 설명서를 볼 수 있는 웹 주소 및/또는 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
VII. 복수의 검출 온도를 이용하여 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 기록매체 및 장치
하기에 기술된 본 발명의 기록매체, 장치 및 컴퓨터 프로그램은 컴퓨터에서 본 발명을 실행하기 위한 것으로서, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 모두 수신하는 단계로서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되고; 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며;
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서, (i) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되고, (ii) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다.
일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 존재하는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값이 사용된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값은 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 본 방법을 실행하는 동안 상기 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 상기 기준값을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 모두 수신하는 단계로서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되고; 상기 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며;
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서, (i) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되고, (ii) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열은 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상술한 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 본 방법을 실행하는 동안 상기 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 상기 기준값을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
상기 프로세서에 의해 상기 방법이 실행되는 경우, 상기 프로그램 지시가 작동되어, 프로세서가 상술한 본 발명의 방법을 실행하게 한다. 상기 프로그램 지시는 첫 번째 시그널 및 두 번째 시그널을 수신하는 지시를 포함할 수 있고, 상기 수신된 시그널을 이용하여 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 지시를 포함할 수 있다.
*상술한 본 발명의 방법은, 프로세서, 예컨대, 독립형 컴퓨터(stand-alone computer), 네트워크에 연결된 컴퓨터(network attached computer) 또는 실시간 PCR 기기와 같은 데이터 수집 장치(data acquisition device)에 있는 프로세서에서 실행된다.
상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 포터블 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 기록매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버와 같은 다양한 기록매체를 포함한다.
상기 시그널과 관련된 데이터(예컨대, 강도, 증폭 사이클 수 및 검출 온도)는 몇몇 기기를 통해 수신될 수 있다. 예를 들어, 상기 데이터는 PCR 데이터 수집 장치에 있는 프로세서에 의해 수집될 수 있다. 상기 데이터는 데이터가 수집되고 있는 동안 실시간으로 제공될 수 있고, 또는 메모리 유닛이나 버퍼에 저장될 수 있으며, 실험 완료 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 상기 수집 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷 및 인트라넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있고, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크, 포터블 HDD 또는 독립형 컴퓨터 시스템과 같은 포터블 매체 상에 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인터넷, 인트라넷 및 무선 통신 네트워크)을 통하여 서버 시스템에 제공될 수 있다. 상기 상대적 고온 검출 온도에서 상기 시그널이 검출되는 경우, 상기 데이터가 수신되거나 수집된 후에, 상기 데이터 분석 과정은 타겟 핵산 서열의 존재 결정을 위한 시그널 간의 차이로부터 얻은 가공 시그널을 제공한다. 상기 프로세서는 상기 시그널과 관련된 수신된 데이터를 처리하여 상기 2개의 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 반영하는 가공 시그널을 제공한다. 예를 들어, 상기 프로세서는 상기 수신된 데이터를 처리하여 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 대한 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 비율을 얻는다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 포터블 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD와 같은 어떠한 소프트웨어 기록매체 상으로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM이나 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위한 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전송에 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 장치를 제공한다.
일 구현예에 따르면, 상기 장치는 시료 및 시그널-발생 수단을 수용할 수 있는 반응용기, 상기 반응 용기의 온도를 조절하는 온도 조절 수단 및/또는 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출할 수 있는 단일 유형의 검출기를 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로세서는 상기 단일 유형의 검출기가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 할 뿐만 아니라 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 계산할 수 있게 한다. 상기 프로세서는 하나의 프로세서가 두 가지 행위를 하도록 구축될 수 있다: 2개의 검출 온도에서의 검출 및 상기 차이 계산의 명령. 택일적으로, 프로세서 유닛은 2개의 프로세서가 두 가지 행위를 각각 하도록 구축될 수 있다.
상기 장치의 첫 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 시그널이 상기 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 발생되는 경우, 상기 장치는 매 증폭 사이클마다 상기 2개의 검출 온도에서 발생되는 시그널을 검출할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
상기 장치의 두 번째 필수적인 특징은 상기 장치가 상기 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널을 처리하여 상기 시그널 간의 차이를 얻는 프로세서를 가지고 있다는 것이다. 일 구현예에 따르면, 상기 시그널 간의 차이는 수학적인 처리에 의해 숫자 값으로 표현된다.
일 구현예에 따르면, 상기 프로세서는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치)에 소프트웨어가 설치되어 구현될 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 장치는 최소 2개의 검출 온도에서 시그널을 검출할 수 있게 하며, 최소 2개의 검출 결과를 수학적으로 처리할 수 있게 하는 프로세서를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 최소 3개의 검출 온도에서 검출된 시그널을 수신하는 단계로서, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 각각의 상이한 검출 온도에서 실시되며;
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정되고; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값은 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 상기 방법을 실행하는 동안 상기 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 상기 기준값을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 상술한 상기 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 또는 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 모두 수신하는 단계로서, 상기 각각의 SNP 대립유전자는 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되고; 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며;
(b) 상기 수신된 시그널 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및/또는 상기 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및/또는 이형접합체에 대한 기준값은 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 상기 방법을 실행하는 동안 상기 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 상기 기준값을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도를 이용하여 시료내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하기 위한 상술한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 또는 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및/또는 상기 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체 및/또는 이형접합체에 대한 기준값을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 상기 방법을 실행하는 동안 상기 기준값을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 상기 기준값을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 일정 범위의 온도에서의 멜팅 분석으로부터의 시그널을 모두 수신하는 단계로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여 상기 일정 범위의 온도에서 멜팅 분석이 실시되고; 및
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단게로서; 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널에 의해 결정되고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 멜팅 분석으로부터의 시그널에 의해 결정된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 상이한 검출 온도 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 상기 상술한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 또는 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) (i)상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 일부 타겟 핵산 서열의 검출 온도 및 상기 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서의 시그널 및 (ii) 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위하여, 일정 범위의 온도에서의 멜팅 분석으로부터의 시그널을 모두 수신하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열은 검출 온도 분석에 의해 검출되며, 상기 검출은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 검출 온도 및 상기 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 모두에서 실시되고; 상기 일정 범위의 온도에서의 멜팅 분석은 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 실시되며; 및
(b) (i) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하고; 여기서 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 상기 일부 타겟 핵산 서열 중에서 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이에 의해 결정되며; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되며; (ii) 상기 멜팅 분석으로부터의 시그널에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 상기 일부 타겟 핵산 서열 이외의 다른 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명은 검출 온도 분석 및 멜팅 분석을 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 상기 상술한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 또는 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명은 하나의 반응 용기에서 단일 유형의 표지만으로도 종래의 실시간 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 종래 기술은 타겟 증폭 후 멜팅 분석에 의해 복수의 타겟 핵산 서열을 검출한다. 이와 달리, 본 발명은 타겟 증폭 후 멜팅 분석을 필요로 하지 않으므로, 분석 시간이 획기적으로 단축된다.
(b) 흥미롭게도, 본 발명자들은 시그널-발생 수단을 이용하여 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 발생되는 경우, (i) 시그널 발생 수단의 유형에 따라, 특정 온도에서 시그널의 검출이 조절될 수 있고, (ii) 선택된 2개의 검출 온도에서 시그널을 검출하는 경우, 상기 2개의 검출 온도에서 검출된 시그널은 특정 패턴에 따라 변한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 이를 타겟 핵산 서열의 검출에 적용함으로써 본 발명을 달성하였다.
(c) 상이한 검출 온도를 이용하는 본 발명에서, 각각의 타겟 핵산 서열에 대하여, 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단의 사용(예컨대, PTOCE-기반 방법)은 예기치 못한 결과를 유도할 수 있다. 첫째, PTOCE-기반 방법과 같은 매개 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법은 형성된 이합체의 Tm 값을 용이하게 조절할 수 있어 검출 온도의 용이한 선택을 가능하게 한다. 둘째, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 프로브로부터 직접적으로 시그널을 제공하는 방법을 타겟 증폭을 위한 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소를 이용하는 방법과 함께 이용하는 경우, 상기 프로브가 상기 5’-뉴클레아제 활성에 의해 절단될 가능성이 있고, 이는 시그널 해석에 영향을 줄 수 있다. 상기 PTOCE-기반 방법과 같은 매개 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법은 일반적으로 5’-뉴클레아제 활성에 의한 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단을 이용하기 때문에, 결과 시그널의 해석과 관련된 이러한 문제점들은 통상적으로 발생되지 않는다. 마지막으로, PTOCE-기반 방법과 같은 매개 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법에서, 상기 이합체는 타겟 핵산 서열과 상관없는 서열을 갖기 때문에, 특정 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있다. 이와 달리, 타겟 핵산 서열에 직접적으로 혼성화되는 프로브를 이용하는 방법에서는, 형성된 이합체 중 적어도 한 가닥이 타겟 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하고 있기 때문에, 타겟 핵산 서열 상에 변이가 존재하는 경우, 의도하지 않은 Tm 값을 갖는 이합체가 형성될 수 있다.
(d) 실시간 방식으로 상이한 검출 온도를 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 본 발명의 일 구현예에서, (i) 하나의 타겟 핵산 서열에 대해, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대, TaqMan 방법) 및 (ii) 다른 타겟 핵산 서열에 대해, 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단(예컨대, PTOCE-기반 방법)의 조합은 예기치 못한 결과를 유도할 수 있다.
상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 이용하는 방법은 상기 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 위해 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 효소(특히, Taq 중합효소)를 일반적으로 이용한다. 검출 프로브의 직접적인 혼성화에 의해 시그널을 발생시키는 종래 방법(예컨대, 분자 비콘 방법, 혼성화 프로브 방법 또는 Hybeacon 방법)에서, 상기 검출 프로브는 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 효소(특히, Taq 중합효소)에 의해 절단될 가능성이 매우 높다. 상기 검출 프로브의 절단은 검출 프로브의 소모로 인한 민감도 감소를 야기할 수 있으며(예컨대, 혼성화 프로브 방법), 또는 절단-의존적인 시그널링을 이용하는 방법에서 위양성 시그널을 야기할 수 있다(예컨대, 분자 비콘 방법). 표지된 프라이머 방법(예컨대, 선라이즈 방법 또는 스콜피온 방법)은 상기 프로브 방법처럼 절단에 대한 문제는 없지만, 검출 온도를 조절하기 위하여 증폭산물 자체의 Tm 값이 조절되어야 하는 단점이 있다. 대조적으로, 상기 PTOCE-기반 방법은 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단을 이용하기 때문에, 5’-뉴클레아제 활성을 갖는 효소(특히, Taq 중합효소)에 의한 영향을 받지 않는다. 또한, 상기 PTOCE-기반 방법은 형성된 이합체의 Tm 값을 용이하게 조절할 수 있어 검출 온도의 용이한 선택을 가능하게 한다.
(e) 일부 타겟에 대하여 실시간 검출을 이용하고, 나머지 타겟에 대하여 멜팅 분석을 이용함으로써 하나의 반응 용기에서 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 본 발명의 일 구현예에서, 분석되는 타겟 핵산 서열의 특성에 적합한 시그널-발생 수단이 선택되어 적용될 수 있으며, 이는 보다 효율적인 방식으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있게 한다.
(f) 실시간 검출 및 멜팅 분석을 이용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 본 발명의 일 구현예에서, 실시간 방식으로 검출되는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단으로 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대, TaqMan 방법)은 매우 향상된 편의성 및 효율로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있게 한다. TaqMan 방법과 같은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단을 이용하는 방법은 검출 프로브의 절단이 일어난다. 특정 반응 조건에서, 대부분의 검출 프로브를 절단시킬 수 있다. 이러한 경우, 실시간 반응 후 멜팅 분석에서 시그널을 발생시킬 수 있는 이합체는 존재하지 않고, 이에 의해, 멜팅 분석에 의해 검출되는 다른 타겟 핵산 서열에 대한 Tm 값이 용이하게 선택될 수 있다.
(g) 실시간 검출 및 멜팅 분석에 의해 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 본 발명의 일 구현예에서, (i) 하나의 타겟 핵산 서열에 대해, 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단(예컨대, TaqMan 방법) 및 (ii) 다른 타겟 핵산 서열에 대해, 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고튜클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 형성된 이합체에 의해 시그널을 제공하는 시그널-발생 수단(예컨대, PTOCE-기반 방법)의 조합은 예기치 못한 결과를 유도할 수 있다.
타겟 핵산 서열 및 검출 올리고뉴클레오타이드 간의 혼성화를 이용하는 종래 기술들에 따르면, 프로브 절단으로 인한 민감도 감소(멜팅 분석에서의 민감도 감소 포함) 및 절단으로 인한 위양성 발생과 같은 심각한 문제점들이 있다. 본 발명은 이러한 문제들로부터 완전히 자유롭다. 상기 PTOCE-기반 방법은 검출하기 위해 사용되는 이합체의 Tm 값을 용이하게 조절할 수 있고, 이에 의해 실시간 검출을 위해 사용되는 검출 온도 및 멜팅 분석을 위해 사용되는 피크 Tm 값이 용이하게 선택될 수 있다.
도 1a는 상대적 고온 검출 온도(72℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Chlamydia trachomatis의 지놈 DNA, CT), 상대적 저온 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Neisseria gonorrhoeae의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합을 검출하기 위해 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 검출 결과를 나타낸다. 상기 CT 및 NG에 대한 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다.
도 1b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 1c는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 플로팅하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 1d 및 1e는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타내며, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 역치 값으로 변형되고 상기 차이를 얻기 위해 사용된다.
도 2a는 상대적 고온 검출 온도(72℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Chlamydia trachomatis의 지놈 DNA, CT), 상대적 저온 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Neisseria gonorrhoeae의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합을 검출하기 위해 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 검출 결과를 나타낸다. 상기 CT에 대한 시그널은 TaqMan 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었고, 상기 NG에 대한 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다.
도 2b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율에 의하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 2c는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 플로팅하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 2d 및 2e는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타내며, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 역치 값으로 변형되고 상기 차이를 얻기 위해 사용된다.
도 3은 상이한 검출 온도를 이용하는 실시간 PCR 및 멜팅 분석에 따른, 상대적 고온 검출 온도(72℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Chlamydia trachomatis의 지놈 DNA, CT), 상대적 저온 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Neisseria gonorrhoeae의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합의 검출 결과를 나타낸다. 상기 CT에 대한 시그널은 Taqman 실시간 방법에 의해 발생되었고, 상기 NG에 대한 시그널은 PTOCE-멜팅 방법에 의해 발생되었다.
도 4a는 실시간 방식으로 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 SNP 유전자형 분석 결과를 나타낸다. 템플레이트(타겟 서열)로 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA가 사용되었다. 야생형 동형접합체(CC), 돌연변이형 동형접합체(TT) 및 이형접합체(CT)가 검출되었다. 모든 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다.
도 4b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 이용한 SNP 유전자형 분석을 나타낸다.
도 5a-5c는 3개의 타겟 서열(Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA, Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA 및 Mycoplasma genitalium(MG)의 지놈 DNA)을 검출하기 위해 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 검출 결과를 나타낸다. 상기 MG에 대한 시그널은 TaqMan 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었고, 상기 CT 및 NG에 대한 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다. 시그널 발생 수단을 고려하여, MG에 대한 시그널 검출 온도로 “95℃”가 선택되었고, CT에 대한 시그널 검출 온도로 “72℃”가 선택되었으며, NG에 대한 시그널 검출 온도로는 “60℃”가 선택되었다.
도 5d는 CT 지놈 DNA의 존재를 결정하기 위해 95℃ 및 72℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFU를 나타낸다.
도 5e는 NG 지놈 DNA의 존재를 결정하기 위해 72℃ 및 60℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFU를 나타낸다.
도 1b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 1c는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 플로팅하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 1d 및 1e는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타내며, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 역치 값으로 변형되고 상기 차이를 얻기 위해 사용된다.
도 2a는 상대적 고온 검출 온도(72℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Chlamydia trachomatis의 지놈 DNA, CT), 상대적 저온 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Neisseria gonorrhoeae의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합을 검출하기 위해 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 검출 결과를 나타낸다. 상기 CT에 대한 시그널은 TaqMan 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었고, 상기 NG에 대한 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다.
도 2b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율에 의하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 2c는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 플로팅하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타낸다.
도 2d 및 2e는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이에 의해 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 것을 나타내며, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널은 역치 값으로 변형되고 상기 차이를 얻기 위해 사용된다.
도 3은 상이한 검출 온도를 이용하는 실시간 PCR 및 멜팅 분석에 따른, 상대적 고온 검출 온도(72℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Chlamydia trachomatis의 지놈 DNA, CT), 상대적 저온 검출 온도(60℃)를 갖는 타겟 핵산 서열(Neisseria gonorrhoeae의 지놈 DNA, NG) 및 이들의 조합의 검출 결과를 나타낸다. 상기 CT에 대한 시그널은 Taqman 실시간 방법에 의해 발생되었고, 상기 NG에 대한 시그널은 PTOCE-멜팅 방법에 의해 발생되었다.
도 4a는 실시간 방식으로 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 SNP 유전자형 분석 결과를 나타낸다. 템플레이트(타겟 서열)로 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA가 사용되었다. 야생형 동형접합체(CC), 돌연변이형 동형접합체(TT) 및 이형접합체(CT)가 검출되었다. 모든 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다.
도 4b는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 비율을 이용한 SNP 유전자형 분석을 나타낸다.
도 5a-5c는 3개의 타겟 서열(Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA, Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA 및 Mycoplasma genitalium(MG)의 지놈 DNA)을 검출하기 위해 상이한 검출 온도를 이용한 본 발명의 검출 결과를 나타낸다. 상기 MG에 대한 시그널은 TaqMan 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었고, 상기 CT 및 NG에 대한 시그널은 PTOCE 실시간 PCR 방법에 의해 발생되었다. 시그널 발생 수단을 고려하여, MG에 대한 시그널 검출 온도로 “95℃”가 선택되었고, CT에 대한 시그널 검출 온도로 “72℃”가 선택되었으며, NG에 대한 시그널 검출 온도로는 “60℃”가 선택되었다.
도 5d는 CT 지놈 DNA의 존재를 결정하기 위해 95℃ 및 72℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFU를 나타낸다.
도 5e는 NG 지놈 DNA의 존재를 결정하기 위해 72℃ 및 60℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFU를 나타낸다.
실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR에 의한 2개의 타겟 검출
본 발명자들은 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지를 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA 및 Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
CT 및 NG를 검출하기 위하여 PTOCE 실시간 PCR을 사용하였다. 만약 타겟이 존재하는 경우, PTO는 절단되고, PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장이합체(이합체 CTO)를 형성한다. 상기 연장이합체의 형성은 시그널을 제공하며, 연장이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선를 얻을 수 있다.
본 실시예에서, 시그널 발생 수단을 고려하여, CT를 위한 시그널 검출 온도로서 “72℃”를 선택하였고, NG를 위한 시그널 검출 온도로서 “60℃”를 선택하였다. 상기 CT 또는 NG의 존재에 따라 생성된 연장이합체는 그의 서열 및 길이에 의해 조절된 조절가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, CT에 대한 상기 연장이합체의 서열 및 길이는 72℃에서 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하도록 디자인하였다. 한편, NG에 대한 상기 연장이합체의 서열 및 길이는 60℃에서는 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하지만, 72℃에서는 상기 이합체를 형성하지 않고 해리되어 시그널을 제공하지 않도록 디자인하였다. 72℃의 검출 온도에서는, 상기 CT에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다. 60℃의 검출 온도에서는, 상기 CT에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 NG에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다.
상기 PTO 및 CTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 상기 CTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 4 및 8).
CT, NG, CT 및 NG의 혼합물 및 타겟이 없는 대조군 각각을 포함하는 4개의 반응 튜브를 준비하였다.
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG_R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG_PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 3)
NG_CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 4)
CT_F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 5)
CT_R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 6)
CT_PTO 5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 7)
CT_CTO 5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3' (서열번호: 8)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
타겟 핵산(NG 지놈 DNA 10 pg, CT 지놈 DNA 10 pg 또는 NG 지놈 DNA 10 pg 및 CT 지놈 DNA 10 pg의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 5 pmole, PTO(서열번호: 3) 3 pmole, CTO(서열번호: 4) 1 pmole, CT 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 5) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 6) 5 pmole, PTO(서열번호: 7) 3 pmole, CTO(서열번호: 8) 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스[최종적으로 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 및 2 U Taq DNA 중합효소] 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 5분 반응시킨 후, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃ 및 72℃에서 실시하였다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, CT가 존재하는 경우(튜브 1 및 3)에는 72℃에서 시그널이 검출되었다. NG만이 존재하는 경우(튜브 2)에는 60℃에서 시그널이 검출되었지만, 72℃에서는 시그널이 검출되지 않았다. 타겟 핵산이 존재하지 않는 경우(튜브 4)에는 시그널이 검출되지 않았다. 도 1A의 결과는 상기 상대적 고온 검출 온도인 72℃에서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT에 대한 시그널은 발생되지만, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG에 대한 시그널은 발생되지 않는 것을 보여준다. 따라서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 검출로 최소한 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT의 존재를 결정할 수 있다는 것을 알 수 있다. 또한, 튜브 2에서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 부존재 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 존재로 인한 차이를 이용하는 것은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재를 결정할 수 있게 해 주었다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT로부터의 시그널이 존재하는 경우 또는 존재하지 않는 경우에도 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재가 검출될 수 있는지를 실험하기 위하여, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 다양한 접근법을 이용하여 계산하였다(도 1B~1E).
상기 도 1B는 72℃ 및 60℃에서 엔드-포인트의 RFU 값의 비율을 보여준다(모든 RFU 값은 장치 소프트웨어에서 “베이스라인 차감된 곡선 피팅(baseline subtracted curve fit)” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). CT만이 존재하는 경우(튜브 1)의 비율은 1.2였지만, CT 및 NG가 모두 존재하는 경우(튜브 3)의 비율은 2.1이었다. 또한, NG만 존재하는 경우(튜브 2)의 비율 및 어떠한 타겟 핵산도 없는 경우(튜브 4)의 비율은 각각 36.7 및 0.7이었다. NG의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 역치 1.5를 적용하였다. 상기 역치에 따라, 튜브 2 및 3에서는 NG의 존재를 확인하였고, 튜브 1 및 4에는 NG가 없다는 것을 확인하였다. 상기 역치는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 엔드-비율(End-Raio)을 고려하여 결정하였다. 튜브 2와 같이, 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT가 존재하지 않는 것으로 결정될 수 있는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널에 대한 역치는 1.5를 적용하는 대신에 독립적으로 설정될 수 있다.
72℃ 및 60℃에서의 시그널을 이용하는 다른 접근법은 매 사이클에서 72℃ 및 60℃에서의 형광 시그널의 비율을 계산하고, 상기 비율을 사이클에 대하여 플롯팅하는 것이다(플롯팅을 위해 처리된 모든 RFU 값은 장치 소프트웨어에서 “베이스라인 미차감(no baseline subtraction)” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). NG의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 역치 0.1을 적용하였다. 상기 역치는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 비율 플롯을 고려하여 결정하였다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, 튜브 2 및 3에서 NG의 존재를 확인하였고, Ct 값은 각각 32.90 및 33.18이였다. 튜브 1 및 4에서는 Ct 값이 얻어지지 않았다. 비율을 계산하는 대신, 매 사이클마다 72℃에서의 형광 강도에서 60℃에서의 형광 강도를 차감하고, 타겟 검출 위하여 상기 결과를 사이클에 대하여 플롯팅할 수 있다.
상대적 고온 검출 온도에서 CT의 존재를 나타내는 시그널을 이용하여 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재를 검출하는 다른 방법은 각각의 튜브에서 60℃에서 얻어진 시그널의 분석을 위해 개별 역치들을 적용하는 것이다. 72℃에서 시그널이 검출되는 경우, 72℃에서의 각각의 End-RFU에 역치(1.5)를 곱하여 상기 튜브로부터 60℃에서의 시그널에 대한 개별 역치를 계산하였다. 상기 역치(1.5)는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 엔드-비율(참조 도 1B)을 고려하여 결정하였다. 72℃에서 시그널이 검출되지 않은 경우, 역치의 일반적인 설정 방법에 따라 배경 시그널, 민감도, 및 시그널 변화 또는 장치의 오차 범위를 고려하여 상기 튜브로부터 60℃에서의 시그널에 대한 개별 역치를 선택하고 이용하였다. 본 실시예에서, 60℃에서의 시그널을 위한 개별 역치는 “200”으로 결정하였다.
도 1D 및 도 1E에서 나타낸 바와 같이, 60℃에서의 개별 역치에 따라, 튜브 2 및 튜브 3에서 상기 NG의 존재를 확인하였고, 더욱이, Ct 값은 각각 31.32 및 35.83으로 얻어졌다. 튜브 1 및 튜브 4에서는 NG에 대한 Ct 값을 구할 수 없었다.
이러한 결과는, 2개의 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 방법에서, (i) 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있게 하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 시그널이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
실시예 2: 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR에 의한 2개의 타겟 검출
본 발명자들은 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지를 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, TaqMan 프로브의 절단, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA 및 Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
CT를 검출하기 위하여 TaqMan 실시간 PCR을 사용하였다. CT가 존재하면, TaqMan 프로브는 절단되어 표지된 단편이 방출된다. 증폭 곡선은 상기 표지된 단편으로부터의 시그널을 측정하여 얻을 수 있다. NG를 검출하기 위하여 PTOCE 실시간 PCR 방법을 사용하였다.
본 실시예에서, 시그널 발생 수단을 고려하여, CT를 위한 시그널 검출 온도로서 “72℃”를 선택하였고, NG를 위한 시그널 검출 온도로서 “60℃”를 선택하였다. 상기 NG의 존재에 따라 생성된 연장이합체는 그의 서열 및 길이에 의해 조절된 조절가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, 연장이합체의 서열 및 길이는 60℃에서는 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하지만, 72℃에서는 상기 이합체를 형성하지 않고 해리되어 시그널을 제공하지 않도록 디자인하였다. 72℃의 검출 온도에서는, 상기 CT에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다. 60℃의 검출 온도에서는, 상기 CT에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 NG에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다.
TaqMan 프로브는 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610) 및 그의 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되어 있다(서열 번호: 9). 상기 PTO 및 CTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 상기 CTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 4).
CT, NG, CT 및 NG의 혼합물 및 타겟이 없는 대조군 각각을 포함하는 4개의 반응 튜브를 준비하였다.
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 TaqMan 프로브의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG_R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG_PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 3)
NG_CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 4)
CT_F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 5)
CT_R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 6)
CT_P 5'-[Cal Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3' (서열번호: 9)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
타겟 핵산(NG 지놈 DNA 10 pg, CT 지놈 DNA 10 pg 또는 NG 지놈 DNA 10 pg 및 CT 지놈 DNA 10 pg의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 10 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 10 pmole, PTO(서열번호: 3) 5 pmole, CTO(서열번호: 4) 1 pmole, CT 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 5) 10 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 6) 12 pmole, TaqMan 프로브(서열번호: 9) 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스[최종적으로 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 및 2 U Taq DNA 중합효소] 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 5분 반응시킨 후, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃ 및 72℃에서 실시하였다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, CT가 존재하는 경우(튜브 1 및 3)에는 72℃에서 시그널이 검출되었다. NG만이 존재하는 경우(튜브 2)에는 60℃에서 시그널이 검출되었지만, 72℃에서는 시그널이 검출되지 않았다. 타겟 핵산이 존재하지 않는 경우(튜브 4)에는 시그널이 검출되지 않았다. 도 2A의 결과는 상대적 고온 검출 온도인 72℃에서, 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT에 대한 시그널은 발생되지만, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG에 대한 시그널은 발생되지 않는 것을 보여준다. 따라서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 검출로 최소한 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT의 존재를 결정할 수 있었음을 인식할 것이다. 또한, 튜브 2에서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 부존재 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 존재로 인한 차이를 이용하는 것은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재를 결정할 수 있게 해 주었다.
상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT로부터의 시그널이 존재하는 경우 또는 존재하지 않는 경우에도 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재가 검출될 수 있는지를 실험하기 위하여, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 간의 차이를 다양한 접근법을 이용하여 계산하였다(도 2B~2E).
상기 도 2B는 72℃ 및 60℃에서 엔드-포인트의 RFU 값의 비율을 보여준다(모든 RFU 값은 “베이스라인 차감된 곡선 피팅” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). CT만이 존재하는 경우(튜브 1)의 비율은 1.1이였지만, CT 및 NG가 모두 존재하는 경우(튜브 3)의 비율은 1.8이었다. 또한, NG만 존재하는 경우(튜브 2)의 비율 및 어떠한 타겟 핵산도 없는 경우(튜브 4)의 비율은 각각 1278.0 및 1.0이었다. NG의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 역치 1.2를 적용하였다. 상기 역치에 따라, 튜브 2 및 3에서는 NG의 존재를 확인하였고, 튜브 1 및 4에는 NG가 없다는 것을 확인하였다. 상기 역치는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 엔드-비율(End-Raio)을 고려하여 결정하였다. 택일적으로, 튜브 2와 같이, 상대적 고온 검출 온도를 갖는 CT가 존재하지 않는 것으로 결정될 수 있는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널에 대한 역치는 1.2를 적용하는 대신에 독립적으로 설정될 수 있다.
72℃ 및 60℃에서의 시그널을 이용하는 다른 접근법은 매 사이클에서 72℃ 및 60℃에서의 형광 시그널의 비율을 계산하고, 상기 비율을 사이클에 대하여 플롯팅하는 것이다(플롯팅을 위해 처리된 모든 RFU 값은 장치의 소프트웨어에서 “베이스라인 미차감” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). NG의 존재 또는 부존재를 결정하기 위하여 역치 0.1을 적용하였다. 상기 역치는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 비율 플롯을 고려하여 결정하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 튜브 2 및 3에서 NG의 존재를 확인하였고, Ct 값은 각각 37.88 및 37.20이였다. 튜브 1 및 4에서는 Ct 값이 얻어지지 않았다. 비율을 계산하는 대신, 매 사이클마다 72℃에서의 형광 강도에서 60℃에서의 형광 강도를 차감하고, 타겟 검출 위하여 상기 결과를 사이클에 대하여 플롯팅할 수 있다.
상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널을 이용하여 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 NG의 존재를 검출하는 다른 방법은 각각의 튜브에서 60℃에서 얻어진 시그널의 분석을 위해 개별 역치들을 적용하는 것이다. 72℃에서 CT의 존재를 나타내는 시그널이 검출되는 경우, 72℃에서의 각각의 End-RFU에 역치(1.2)를 곱하여 상기 튜브로부터 60℃에서의 시그널에 대한 개별 역치를 계산하였다. 상기 역치(1.2)는 CT만을 포함하는 튜브로부터의 엔드-비율(참조 도 2B)을 고려하여 결정하였다. 72℃에서 검출되지 시그널이 않은 경우, 역치의 일반적인 설정 방법에 따라 배경 시그널, 민감도, 및 시그널 변화 또는 장치의 오차 범위를 고려하여 상기 튜브로부터 60℃에서의 시그널에 대한 개별 역치를 선택하고 이용하였다. 본 실시예에서, 60℃에서의 시그널을 위한 개별 역치는 “200”으로 결정하였다.
도 2D 및 도 2E에서 나타낸 바와 같이, 60℃에서의 개별 역치에 따라, 튜브 2 및 튜브 3에서 상기 NG의 존재를 확인하였고, 더욱이, Ct 값은 각각 36.21 및 37.07로 얻어졌다. 튜브 1 및 튜브 4에서는 NG에 대한 Ct 값을 구할 수 없었다.
이러한 결과는, 2개의 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 방법에서, (i) 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있게 하고, (ii) 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 얻어진 시그널이 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
실시예 3: 실시간 PCR 및 멜팅 분석에 의한 2개의 타겟 검출
본 발명자들은 하나의 검출 채널 및 실시간 PCR과 멜팅 분석의 조합을 이용하여 하나의 반응 용기에서 2개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지를 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, TaqMan 프로브의 절단, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA 및 Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
CT를 검출하기 위하여 TaqMan 실시간 PCR을 사용하였고, NG를 검출하기 위하여 PTOCE 멜팅 분석을 사용하였다. CT가 존재하면, TaqMan 프로브는 절단되어 표지된 단편이 방출된다. NG가 존재하면, PTO는 절단되고, PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장이합체(이합체 CTO)를 형성한다.
실시간 PCR 과정 동안, TaqMan 프로브의 절단에 의해 발생되는 형광 시그널만을 검출하기 위하여, 연장이합체는 해리되어 이합체를 형성하지 않아서 PTOCE에 의해 형성된 상기 연장이합체로부터 시그널이 발생되지 않는 온도에서 상기 형광 시그널 검출을 실시하였다. 멜팅 과정에서, NG의 존재에 따라 형성된 연장이합체의 존재를 나타내는 멜팅 피크를 얻기 위하여 시그널을 측정하였다.
TaqMan 프로브는 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610) 및 그의 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되어 있다(서열 번호: 9). 상기 PTO 및 CTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 상기 CTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 4).
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 TaqMan 프로브의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG_R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG_PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 3)
NG_CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 4)
CT_F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 5)
CT_R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 6)
CT_P 5'-[Cal Fluor Red 610]CATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[BHQ-2]-3' (서열번호: 9)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
타겟 핵산(NG 지놈 DNA 10 pg, CT 지놈 DNA 10 pg 또는 NG 지놈 DNA 10 pg 및 CT 지놈 DNA 10 pg의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 10 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 10 pmole, PTO(서열번호: 3) 5 pmole, CTO(서열번호: 4) 1 pmole, CT 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 5) 10 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 6) 12 pmole, TaqMan 프로브(서열번호: 9) 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스[최종적으로 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 및 2 U Taq DNA 중합효소] 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 5분 반응시킨 후, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 72℃에서 실시하였다. 상기 반응 후, 상기 튜브를 55℃에서 5분 동안 반응시켰다. 55℃에서 95℃까지 0.5℃ 간격으로 온도를 올리는 동안에 형광 시그널을 측정하여 멜팅 곡선 분석을 실시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, CT가 존재하는 경우(튜브 1)에는, 실시간 PCR 동안 증폭 곡선이 얻어졌지만, 멜팅 분석에서 멜팅 피크는 관찰되지 않았다. NG가 존재하는 경우(튜브 2)에는, 실시간 PCR 동안 증폭 곡선이 얻어지지는 않았지만, 멜팅 분석에서 NG의 존재에 따라 형성된 연장이합체의 예상된 Tm 값(66℃)을 갖는 멜팅 피크가 관찰되었다. CT 및 NG가 존재하는 경우(튜브 3)에는, 실시간 PCR 과정 및 멜팅 분석 과정 모두에서 시그널이 관찰되었다. 타겟 핵산이 존재하지 않는 경우(튜브 4)에는 어떠한 시그널도 관찰되지 않았다.
이러한 결과는 실시간 PCR 및 멜팅 분석의 조합에 의해 하나의 검출 채널만으로도 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 실시간 PCR에 의한 SNP 유전자형 분석
본 발명자들은 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 실시간 PCR이 하나의 반응 용기에서 하나의 검출 채널을 이용한 SNP 유전자형 분석에 적용가능한지를 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 동형접합체, 돌연변이형(T) 동형접합체, 및 이형접합체를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 대립유전자 및 돌연변이형(T) 대립유전자를 검출하기 위하여 PTOCE 실시간 PCR을 사용하였다. 타겟 대립유전자가 존재하면, PTO는 절단되고, PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, 상기 CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어 CTO와 연장이합체(이합체 CTO)를 형성한다. 상기 연장이합체의 형성은 시그널을 제공하며, 연장이합체-형성 온도에서의 시그널을 측정하여 증폭 곡선을 얻을 수 있다.
본 실시예에서, 시그널 발생 수단을 고려하여, 야생형(C) 대립유전자를 위한 시그널 검출 온도로서 “72℃”를 선택하였고, 돌연변이형(T) 대립유전자를 위한 시그널 검출 온도로서 “55℃”를 선택하였다. 야생형(C) 대립유전자 또는 돌연변이형(T) 대립유전자의 존재에 따라 생성된 연장이합체는 그의 서열 및 길이에 의해 조절된 조절가능한 Tm 값을 갖는다. 본 실시예에서, 상기 야생형(C) 대립유전자에 대한 연장이합체의 서열 및 길이는 72℃에서 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하도록 디자인하였다. 한편, 상기 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 연장 이합체의 서열 및 길이는 55℃에서는 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하지만, 72℃에서는 상기 이합체를 형성하지 않고 해리되어 시그널을 제공하지 않도록 디자인하였다. 72℃의 검출 온도에서는, 상기 야생형(C) 대립유전자에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다. 55℃의 검출 온도에서는, 상기 야생형(C) 대립유전자에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 돌연변이형(T) 대립유전자에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다.
상기 PTO 및 CTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 상기 CTO는 그의 5’말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 13 및 15).
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
M677_F 5'-CCACCCCGAAGCAGGGAIIIIIGAGGCTGACC-3' (서열번호: 10)
M677_R 5'-CAAGTGATGCCCATGTCGGIIIIIGCCTTCACAA-3' (서열번호: 11)
M677_W_PTO 5'-GGTCCCGACGTTAGCTCCCGCAGACACCTTCTCCTTC[C3 spacer]-3' (서열번호: 12)
M677_W_CTO 5'-[BHQ-2]CCTCGGTGCCACGCCATCGG[T(Cal Fluor Red 610)]TCTTCTAACGTCGGGACC[C3 spacer]-3' (서열번호: 13)
M677_M_PTO 5'-ACGTCGATTCGCACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAA[C3 spacer]-3' (서열번호: 14)
M677_M_CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(Cal Fluor Red 610)]ATTCTGCGAATCGACGT[C3 spacer]-3' (서열번호: 15)
(I: 데옥시이노신)
*(밑줄친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
타겟 핵산(MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 야생형(C) 동형접합체 1 ng, MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 돌연변이형(T) 동형접합체 1 ng 또는 MTHFR(C677T) 인간 지놈 DNA의 이형접합체 1 ng), 업스트림 프라이머(서열번호: 10) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 11) 5 pmole, PTO(서열번호: 12 및 14) 각각 3 pmole, CTO(서열번호: 13 및 15) 각각 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스[최종적으로 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 및 2 U Taq DNA 중합효소] 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 5분 반응시킨 후, 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30초, 55℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 55℃ 및 72℃에서 실시하였다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, 야생형(C) 동형접합체가 존재하는 경우(튜브 1) 또는 이형접합체가 존재하는 경우(튜브 3)에는 72℃ 및 55℃에서 시그널이 검출되었다. 돌연변이형(T) 동형접합체가 존재하는 경우(튜브 2)에는, 55℃에서 강한 시그널이 검출되었지만, 72℃에서는 매우 약한 시그널이 검출되었다. 타겟이 존재하지 않는 경우(튜브 4)에는 어떠한 시그널도 검출되지 않았다.
도 4B는 72℃ 및 55℃에서 엔드-포인트의 RFU 값의 비율을 보여준다(모든 RFU 값은 장치의 소프트웨어에서 “베이스라인 차감된 곡선 피팅” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). 야생형(C) 동형접합체가 존재하는 경우(튜브 1)의 비율은 1.2이지만, 이형접합체가 존재하는 경우(튜브 3)의 비율은 1.9였다. 이러한 상기 2개의 비율 간의 차이는 이형접합체를 포함하는 튜브에서 돌연변이형(T) 대립유전자가 야생형(C) 대립유전자와 함께 존재한다는 것을 나타낸다. 한편, 돌연변이형(T) 동형접합체의 경우(튜브 2), 72℃에서의 RFU 값이 낮기 때문에, 돌연변이형(T) 동형접합체로부터 얻어진 비율은 상대적으로 매우 컸다. 이형접합체에서 야생형 대립유전자 및 돌연변이형 대립유전자가 1:1 비율로 존재한다는 사실을 고려하면, 돌연변이형 동형접합체가 존재하는 경우에서 상기 72℃에서 검출된 약한 시그널은 위양성 시그널인 것을 알 수 있다. SNP 유전자형 분석을 위한 본 발명의 방법에 따르면, 상기 비율 값은 상기 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널이 오류 시그널인지 아닌지를 결정할 수 있게 한다.
이러한 결과는 상이한 온도에서 시그널 검출을 포함하는 실시간 PCR이 하나의 검출 채널을 이용한 SNP 유전자형 분석에 적용될 수 있다는 것을 나타내며, 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 얻어진 차이가 SNP 유전자형 분석을 위해 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5: 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR에 의한 복수의 타겟 검출
본 발명자들은 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 3개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는지를 실험하였다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, TaqMan 프로브의 절단, PTO의 절단 및 PTO 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. Neisseria gonorrhoeae(NG)의 지놈 DNA, Chlamydia trachomatis(CT)의 지놈 DNA 및 Mycoplasma genitalium(MG)의 지놈 DNA를 타겟 핵산 서열로 사용하였다.
MG를 검출하기 위하여 TaqMan 실시간 PCR을 사용하였다. CT 및 NG를 검출하기 위하여 PTOCE 실시간 PCR을 사용하였다.
본 실시예에서, 시그널 발생 수단을 고려하여, MG를 위한 시그널 검출 온도로서 “95℃”를 선택하였고, CT를 위한 시그널 검출 온도로서 “72℃”를 선택하였으며, NG를 위한 시그널 검출 온도로서 “60℃”를 선택하였다. 본 실시예에서, 상기 CT 또는 NG의 연장이합체의 서열 및 길이는 72℃ 또는 60℃에서는 상기 이합체를 형성하여 시그널을 제공하지만, 95℃에서는 상기 이합체를 형성하지 않고 해리되어 시그널을 제공하지 않도록 디자인하였다. 95℃의 검출 온도에서는, 상기 MG에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다. 72℃의 검출 온도에서는, 상기 MG에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 CT에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다. 또한, 60℃의 검출 온도에서는, 상기 MG 및 CT에 대한 시그널뿐만 아니라 상기 NG에 대한 시그널이 발생되고 검출될 것이다.
TaqMan 프로브는 그의 5’-말단에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610) 및 그의 3’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되어 있다(서열번호: 18). 상기 PTO 및 CTO는 그의 연장이 방지되도록 그의 3’-말단이 카본 스페이서로 블록킹되어 있다. 상기 CTO는 그의 5’-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 그의 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되어 있다(서열번호: 4 및 8).
NG, CT, MG, NG 및 CT의 혼합물, NG 및 MG의 혼합물, CT 및 MG의 혼합물, NG, CT, 및 MG의 혼합물 및 타겟이 없는 대조군 각각을 포함하는 8개의 반응 튜브를 준비하였다.
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, CTO 및 TaqMan 프로브의 서열은 다음과 같다:
NG_F 5'-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3' (서열번호: 1)
NG_R 5'-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3' (서열번호: 2)
NG_PTO 5'-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 3)
NG_CTO 5'-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer]-3' (서열번호: 4)
CT_F 5'-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC-3' (서열번호: 5)
CT_R 5'-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA-3' (서열번호: 6)
CT_PTO 5'-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer]-3' (서열번호: 7)
CT_CTO 5'-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer]-3' (서열번호: 8)
MG-F 5'-AAAACCCACGGAAATGATGAGAIIIIIATTGGTTCTAC-3' (서열번호: 16)
MG-R 5'-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTGIIIIICTGATAAAAG-3' (서열번호: 17)
MG-P 5'-[CAL Fluor Red 610]GAGTTCTTTCAAGAACAGCAAGAGGTGT[BHQ-2]-3' (서열번호: 18)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
타겟 핵산(NG 지놈 DNA 10pg, CT 지놈 DNA 10pg, MG 지놈 DNA 10pg, 각각 10pg의 NG 및 CT 지놈 DNA의 혼합물, 각각 10pg의 NG 및 MG 지놈 DNA의 혼합물, 각각 10pg의 CT 및 MG 지놈 DNA의 혼합물, 각각 10pg의 NG, CT, 및 MG 지놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 1) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 2) 5 pmole, PTO(서열번호: 3) 3 pmole, CTO(서열번호: 4) 1 pmole, CT 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 5) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 6) 5 pmole, PTO(서열번호: 7) 3 pmole, CTO(서열번호: 8) 1 pmole, MG 타겟 증폭을 위한 업스트림 프라이머(서열번호: 16) 5 pmole 및 다운스트림 프라이머(서열번호: 17) 5 pmole, TaqMan 프로브(서열번호: 18) 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스[최종적으로 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 및 2 U Taq DNA 중합효소] 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켜 50℃에서 5분 반응시킨 후, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초 과정을 50 사이클 반복하였다. 시그널의 검출은 매 사이클마다 60℃, 72℃ 및 95℃에서 실시하였다.
도 5A, 5B, 및 5C에서 나타낸 바와 같이, 95℃에서 검출된 시그널은 튜브 3, 5, 6 및 7에서 최소한 상대적 최고 검출 온도(95℃)를 갖는 MG의 존재를 결정할 수 있게 해 주었다.
상기 상대적 최고 검출 온도(95℃)에서의 시그널의 부존재 및 상기 상대적 중간 검출 온도(relatively middle detection temperature; 72℃)에서의 시그널 존재로 인한 차이의 이용은 튜브 2 및 4에서 상기 상대적 중간 검출 온도(72℃)를 갖는 CT의 존재를 결정할 수 있게 해 주었다.
더욱이, 상기 상대적 중간 검출 온도(72℃)에서의 시그널의 부존재 및 상기 상대적 최저 검출 온도(60℃)에서의 시그널의 존재로 인한 차이의 이용은 튜브 1에서 상기 상대적 최저 검출 온도(60℃)를 갖는 NG의 존재를 결정할 수 있게 해 주었다.
다른 타겟과 함께 존재하는 CT 또는 NG를 하나의 반응 용기에서 확인할 수 있는지 조사하기 위하여, 상기 95℃, 72℃ 및 60℃에서 검출된 시그널 간의 차이를 End-RFUs(End-△RFU)의 뺄셈에 의해 계산하였다.
도 5D는 95℃ 및 72℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFUs를 나타낸다(모든 RFU 값은 장치의 소프트웨어에서 “베이스라인 차감된 곡선 피팅” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). CT의 존재를 결정하기 위하여 역치 “300”을 적용하였다. 상기 역치는 CT를 포함하지 않는 튜브(튜브 1, 3 및 5)로부터의 End-△RFUs를 고려하여 결정하였다. 상기 역치에 따라, 튜브 2, 4, 6 및 7에서 CT의 존재를 확인하였다.
도 5E는 72℃ 및 60℃에서 엔드-포인트의 RFU 값을 이용하여 계산된 End-△RFUs를 나타낸다(모든 RFU 값은 장치의 소프트웨어에서 “베이스라인 차감된 곡선 피팅” 분석 데이터로부터 유래되어 내보내졌음). NG의 존재를 결정하기 위하여 역치 “800”을 적용하였다. 상기 역치는 NG를 포함하지 않는 튜브(튜브 2, 3 및 6)로부터의 End-△RFUs를 고려하여 결정하였다. 상기 역치에 따라, 튜브 1, 4, 5 및 7에서 NG의 존재를 확인하였다.
이러한 결과는 3개의 온도에서 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 방법에서, (i) 상기 상대적 최고 검출 온도에서의 시그널 검출은 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있게 해주고, (ii) 상기 최고 검출 온도보다 낮은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열을 확인하기 위하여 상기 상이한 검출 온도에서의 시그널로부터 얻어진 차이가 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
따라서, 하나의 검출 채널 및 상이한 온도에서의 시그널 검출을 포함하는 TaqMan/PTOCE 실시간 PCR을 이용하여 하나의 반응 용기에서 복수의 타겟 핵산을 검출할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는바, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능함은 본 발명이 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의해 정의된다고 할 것이다.
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<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 1
tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 2
caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-PTO
<400> 3
gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NG-CTO
<400> 4
tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 5
gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 6
ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-PTO
<400> 7
gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-CTO
<400> 8
gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CT-P
<400> 9
catcagaagc tgtcattttg gctgcg 26
<210> 10
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(22)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 10
ccaccccgaa gcagggannn nngaggctga cc 32
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 11
caagtgatgc ccatgtcggn nnnngccttc acaa 34
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-W-PTO
<400> 12
ggtcccgacg ttagctcccg cagacacctt ctccttc 37
<210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-W-CTO
<400> 13
cctcggtgcc acgccatcgg ttcttctaac gtcgggacc 39
<210> 14
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-M-PTO
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acgtcgattc gcactcccgc agacaccttc tccttcaa 38
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> M677-M-CTO
<400> 15
tttttttttt tttttttttt tattctgcga atcgacgt 38
<210> 16
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 16
aaaacccacg gaaatgatga gannnnnatt ggttctac 38
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(30)
<223> n denotes deoxyinosine
<400> 17
ctcgttaatt tacctattcc attttgnnnn nctgataaaa g 41
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MG-P
<400> 18
gagttctttc aagaacagca agaggtgt 28
Claims (34)
- 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 2개의 시그널-발생 수단(signal-generating means)과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기(single type of detector)를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도(relatively high detection temperature)를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도(relatively low detection temperature)를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 2개의 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며;
(b) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; (i) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도에 의해 결정되고, (ii) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 기준값을 사용하여 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 결정되고, 상기 기준값은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드(mediation oligonucleotide)의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고 뉴클레오타이드(detection oligonucleotide)의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의한 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고 뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 2개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 차이는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어지는 차이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 하나의 반응 용기는 상기 2개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 추가적인 2개의 시그널-발생 수단을 각각 포함하는 최소 하나의 추가적인 세트(additional set)를 추가적으로 포함하고; 상기 용기에서 2개의 시그널-발생 수단의 각 세트에 의해 발생된 상기 시그널은 서로 구별되고, 상기 시그널은 상이한 유형의 검출기에 의해 각각 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 2개의 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)를 포함하고, 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 뉴클레오타이드 변이 중 한 유형을 포함하고, 다른 하나는 뉴클레오타이드 변이 중 다른 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석(SNP genotyping)하는 방법:
(a) 하나의 반응 용기에서 SNP 대립유전자(alleles)를 검출하기 위한 시그널-발생 수단과 함께 상기 SNP 사이트를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 각각의 SNP 대립유전자는 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도 모두에서 실시되며;
(b) 최소 하나의 기준값을 사용하여 상기 단계 (a)에서 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서, 상기 기준값 중 하나의 기준값은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이고; 또 다른 기준값은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체가 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이며; 다른 기준값은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
- 다음의 단계를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법:
(a) 하나의 반응 용기에서 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단과 함께 상기 시료를 인큐베이션하고, 발생된 시그널을 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 상기 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 각각의 상이한 검출 온도에서 실시되며;
(b) 상기 단계 (a)에서 검출된 시그널에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 특정 검출 온도(certain detection temperature)를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 최소 하나의 기준값을 사용하여 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 결정되고; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도(relatively highest detection temperature)인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도에 의해 결정되며, 상기 기준값은 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합이 나타내는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합이 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
- 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 먼저 결정한 다음, 내림차순으로 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 순차적으로 결정하여 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 수반되는 시그널 증폭 과정에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 핵산 증폭이 없는 시그널 증폭 과정에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 이합체의 형성에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 나머지 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단 은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 상대적 최고 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단은 검출 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의한 시그널-발생 수단이고, 상기 나머지 타겟 핵산 서열에 대한 시그널-발생 수단 은 상기 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화된 매개 올리고뉴클레오타이드의 절단에 의존적인 방식으로 이합체가 형성되는 것을 이용하는 시그널-발생 수단인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 최소 3개의 시그널-발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 차이는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널을 수학적으로 처리하여 얻어지는 차이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도에서 시그널이 검출되지 않는 것을 고려하여 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널에 의해 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 하나의 반응 용기는 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 이외의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 추가적인 최소 3개의 시그널-발생 수단을 각각 포함하는 최소 하나의 추가적인 세트를 추가적으로 포함하고; 상기 용기에서 최소 3개의 시그널-발생 수단의 각 세트에 의해 발생된 상기 시그널은 서로 구별되고, 상기 시그널은 상이한 유형의 검출기에 의해 각각 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 15 항에 있어서, 상기 타겟 핵산 서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 2개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 2개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 방법을 기재한 설명서.
- 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하기 위한 키트:
(a) SNP 대립유전자의 검출을 위한 시그널-발생 수단; 및
(b) 제 14 항의 방법을 기재한 설명서.
- 다음을 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 키트:
(a) 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 최소 3개의 시그널-발생 수단; 및
(b) 제 15 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 방법을 기재한 설명서.
- 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 모두 수신하는 단계로서, 상기 각각의 타겟 핵산 서열은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되고; 발생된 시그널은 단일 유형의 검출기를 이용하여 검출되며; 상기 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며;
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서, (i) 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도에 의해 결정되고, (ii) 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 기준값을 사용하여 상기 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 결정되고, 상기 기준값은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열이 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
- (a) 컴퓨터 프로세서, 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 커플링된 상기 제 31 항의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 장치.
- 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 핵산 서열의 SNP 유전자형을 분석하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널을 모두 수신하는 단계로서, 상기 각각의 SNP 대립유전자는 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되고; 상기 SNP 대립유전자 중 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 고온 검출 온도를 가지고, 다른 하나는 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상기 상대적 저온 검출 온도를 가지며; 상기 상대적 고온 검출 온도는 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 및 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이며;
(b) 최소 하나의 기준값을 사용하여 상기 수신된 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 SNP 유전자형을 결정하는 단계로서, 상기 기준값 중 하나의 기준값은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 나타내는 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이고; 또 다른 기준값은 상기 상대적 고온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 및 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체에 대해 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자 모두로 구성된 이형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이며; 다른 기준값은 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체에 대해 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 상대적 저온 검출 온도를 갖는 SNP 대립유전자로 구성된 동형접합체가 상기 상대적 고온 검출 온도 및 상기 상대적 저온 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
- 상이한 검출 온도를 이용하여 시료 내 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체로서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 최소 3개의 검출 온도에서 검출된 시그널을 수신하는 단계로서, 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 검출되며; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 각각은 상기 상응하는 시그널-발생 수단에 의해 결정되는 상이한 검출 온도를 가지고; 상기 검출 온도는 상기 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 시그널뿐만 아니라 상기 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널도 발생시킬 수 있는 온도이며; 상기 시그널-발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않고; 상기 검출은 각각의 상이한 검출 온도에서 실시되며;
(b) 상기 수신된 시그널에 의해 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 단계로서; 상기 최소 3개의 타겟 핵산 서열 중 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는 경우, 상기 특정 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 최소 하나의 기준값을 사용하여 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 및 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도 간의 차이에 의해 결정되고; 상기 특정 검출 온도가 상기 검출 온도 중에서 상대적 최고 검출 온도인 경우, 상기 타겟 핵산 서열의 존재는 상기 특정 검출 온도에서 검출된 시그널의 강도에 의해 결정 결정되며, 상기 기준값은 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합이 나타내는 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴을 반영하는 값으로서, 상기 특정 검출 온도보다 높은 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 모든 조합이 상기 특정 검출 온도보다 높은 하나 이상의 검출 온도 및 상기 특정 검출 온도에서 발생시키는 시그널 간의 비율이다.
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