CN111629831A

CN111629831A - 用于离散解链分析的方法和组合物

Info

Publication number: CN111629831A
Application number: CN201980009454.6A
Authority: CN
Inventors: 道格拉斯·惠特曼; 珍妮弗·贝尔尼尔; 威廉·旺
Original assignee: Luminex Corp
Current assignee: Luminex Corp
Priority date: 2018-01-22
Filing date: 2019-01-22
Publication date: 2020-09-04
Also published as: EP3743211A1; KR20200115552A; EP3743211A4; US20190226008A1; BR112020014412A2; US11390902B2; CA3088250A1; AU2019209444A1; WO2019144107A1; JP2021511056A; US20220364148A1

Abstract

提供了用于确定样品中靶核酸序列的存在和/或用于量化样品中靶核酸序列的量的方法和试剂。在一些方面中，所述方法包括通过在低于探针Tm的温度下检测来自探针的信号和在高于探针Tm的温度下检测信号而不在探针Tm下检测信号来进行解链分析。

Description

用于离散解链分析的方法和组合物

本申请要求于2018年1月22日提交的美国临时专利申请No.62/620,298的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明背景

1.技术领域

本发明一般性地涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及用于鉴定和量化生物样品中的核酸靶标的方法。

2.背景技术

对双链体核酸进行的解链分析(melt analysis)利用解链或退火峰来区分扩增子同一性，但是除非扩增子或核酸被明确标记，否则在同一温度附近解链的扩增子或核酸双链体中不容易区分解链峰。此外，由于缓慢升高或降低样品温度和在多个温度下获取图像所需的时间，解链分析通常在靶扩增后进行，并增加了测定的周转时间。

数字聚合酶链式反应(digital polymerase chain reaction，dPCR)是对常规PCR的改进，可用于直接量化和克隆扩增核酸，例如DNA、cDNA或RNA。常规PCR通常用于测量核酸量，并且通过每个样品的单个反应进行。使用dPCR方法，也可以对样品进行单个反应，然而样品被分成许多分区(partition)，并且该反应在每个分区中单独进行。这种分离允许更可靠地收集并进行灵敏的核酸量的测量。

当前用于dPCR的方法依赖于终点PCR来量化靶核酸的存在。终点PCR分析在多种方式上受到限制。首先，DNA嵌入染料和TaqMan探针的使用导致非特异性扩增在分区中产生假阳性信号的可能性。另外，现有的商业系统在可用荧光通道的数量上有局限性，这限制了检测多个靶标的能力。最后，将分区分类为阳性(pisitive)或阴性(negative)仅依赖于分区的终点荧光强度。

在精心设计的测定中，期望在阳性和阳性分区的平均强度值中具有良好的分离。然而，在数字PCR中，更常见的是一种称为“雨(rain)”的现象，其将分区的分类混淆为这两类。雨可被描述为扩增后中等强度的分区。阳性分区可由于不完全扩增而导致低于预测强度，而阴性分区可由于非特异性扩增而导致高于预测强度。这是除了荧光强度变化之外由于仪器光学和热系统可变性引起的。

尝试以与定量实时PCR(qPCR)中所应用的相似的方式将解链分析应用于dPCR反应，已发现了潜在的缺点。缺点之一是在dPCR应用中获取解链曲线所需的时间。必须在许多不同的温度(例如约35至70个独特温度)下在大量(例如，多至30,000个)分区上获取图像，这会非常耗时。典型的曝光时间为约1s，不包括在成像之前打开LED的时间。30,000个1nL分区的占用空间(footprint)可为约12.5mm×12.5mm。在1nL分区上实现适当分辨率的典型视场尺寸为约6mm×6mm。因此，为了生成分辨率为0.5℃的解链曲线，单个样品可需要630张图像，而在未考虑到在其他通道中的解链获取的情况下，单独的图像获取可需要多于10分钟。该方法还要求将分区在连续较高的温度下保持延长的时间和使样品保持长期暴露于光，这可通过光漂白而降低荧光信号。

期望发现用于在dPCR应用中进行解链分析的改进方法，以减少数据收集和分析所需的时间，并提高反应的特异性以确保准确的结果。

发明内容

在一些实施方案中，本公开内容提供了在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述标记的双链体核酸具有预定Tm，并且所述方法包括：(a)在低于标记的双链体核酸的预定Tm的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；(b)在高于标记的双链体核酸的预定Tm的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号；以及(c)通过比较所述第一信号和所述第二信号来确定所述标记的双链体核酸是否为靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，其中所述第一信号与第二信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是所述反应混合物中靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，并且其中不在所述标记的双链体核酸的预定Tm下测量信号。在一些方面中，提供了方法，所述方法包括对反应混合物中的标记的双链体核酸进行解链分析，所述标记的双链体核酸具有预定Tm，并且所述方法包括：(a)在低于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；(b)在高于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及(c)比较所述第一信号和所述第二信号，当所述第一与第二信号之间存在变化时，确定所述标记的双链体核酸是所述反应混合物中靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。在一些方面中，靶标特异性探针是在靶标特异性探针与靶序列特异性杂交后被切割的可切割探针。在一些方面中，靶标特异性探针能够采用第一温度依赖性构象或第二温度依赖性构象。在一些方面中，不在标记的双链体核酸的预定Tm的2摄氏度内测量信号。在一些方面中，不在标记的双链体核酸的预定Tm的5摄氏度内测量。在一些方面中，第一温度与第二温度之间的差异大于2摄氏度。在一些方面中，第一温度与第二温度之间的差异大于5摄氏度。在一些方面中，第一温度与第二温度之间的差异大于8摄氏度。在一些方面中，所述方法还包括以下步骤：在所述反应混合物中的所有标记的双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。在一些方面中，反应混合物包含至少两种不同的双链体核酸，每种具有独特的预定Tm，并且每种不同的双链体核酸具有同一信号产生标记，还包括以下步骤：e)在低于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度和高于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度下测量来自每种不同的标记的双链体核酸的信号，并且其中，对于每种不同的标记的双链体核酸，在低于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号与在高于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与其靶标特异性杂交的结果。在一些方面中，在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中独特的靶标特异性探针的数目。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。在一些方面中，通过从第一和第二信号中减去第三信号，相对于第三信号将第一和第二信号归一化。在另一些方面中，第一与第二信号之间的变化超过预定阈值。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于确定样品中至少一种靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括：a)在杂交条件下，使所述样品与至少一种可切割靶标特异性探针接触，所述探针能够与所述靶核酸序列(如果存在于反应混合物中的话)特异性杂交；b)将与所述靶核酸序列特异性杂交的所述探针进行切割以形成截短的探针；c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交；d)使所述截短的探针延伸以形成具有预定Tm和信号产生标记的双链体核酸；e)在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号(借此进行解链分析)；以及f)通过检测所述第一与第二信号的变化来确定所述靶核酸序列的存在。在一些方面中，所述样品与至少两种不同的可切割探针接触，每种不同的可切割探针对于不同的靶核酸序列具有特异性，其中在其特异性靶核酸序列的存在下，每种不同的可切割探针形成具有独特的预定Tm的双链体核酸，并且其中所述具有独特的预定Tm的双链体核酸均具有同一信号产生标记，还包括以下步骤：对于每种具有独特的预定Tm的双链体核酸，在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号，并在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，并通过检测所述第一与第二信号之间的变化来确定所述靶核酸序列的存在。在一些方面中，在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同的可切割探针的数目。在一些方面中，所述不同双链体核酸的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。在一些方面中，所述不同双链体核酸的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。在一些方面中，所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少10摄氏度。在一些方面中，捕获序列和截短的探针是单分子的。在另一些方面中，捕获序列和截短的探针是双分子的。在一些方面中，当第一信号与第二信号的比超过预定阈值时，确定存在靶核酸。在一些方面中，进行所述方法而不在预定Tm的2摄氏度内的温度下测量信号。在一些方面中，进行所述方法而不在预定Tm的5摄氏度内的温度下测量信号。在一些方面中，所述至少一种可切割探针用报道分子-猝灭剂对的第一成员标记，并且所述至少一种可切割探针在与其靶核酸序列杂交时采用第一构象。

在一些方面中，至少一种可切割探针与其靶序列的特异性杂交导致探针在切割位点处切割、从靶核酸序列释放截短的探针以采用第二构象，以及从切割位点开始的链延伸。在一些方面中，链延伸包括并入与所述报道分子-猝灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-猝灭剂对的第二成员(导致信号的改变)。在一些方面中，第一构象是线性构象，并且第二构象是发夹构象。在一些方面中，所述方法还包括以下步骤：在反应混合物中的所有核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且相对于第三信号将第一和第二信号归一化。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。在一些方面中，在dPCR反应中跨多个分区进行解链分析，还包括在切割之前在所述多个分区中测量来自所述可切割探针的标记的信号，并使用在切割之前测得的所述信号设置阈值，以将包含所述靶核酸的分区与不包含所述靶核酸的分区区分开。在一些方面中，解链分析在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在延伸之后和在解链分析之前在一定温度范围内测量多个信号，并使用所测得的信号校正在解链分析过程中测得的信号的光和温度依赖性变化。

在一些实施方案中，本公开内容提供了在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述方法包括：a)在所述标记的双链体核酸主要处于第一构象的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；(b)在所述标记的双链体核酸主要处于第二构象以及约一半所述双链体核酸处于第一构象且一半所述双链体核酸处于第二构象的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，其中不在所述第一与第二温度之间的温度下测量信号；以及(c)通过比较所述第一信号与所述第二信号来确定所述标记的双链体核酸是否是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。在另外的方面中，方法包括在反应混合物中进行标记的双链体核酸的解链分析，所述方法包括：(a)在所述标记的双链体核酸处于第一构象的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；(b)在所述标记的双链体核酸处于第二构象的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，其中不在所述第一与第二温度之间的温度下测量信号；以及(c)通过比较所述第一信号与所述第二信号来确定所述标记的双链体核酸是否是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。在一些方面中，所述反应混合物包含至少两种不同的标记的双链体核酸，每种不同的标记的双链体核酸能够在独特的温度下采用所述第二构象，并且每种不同的标记的核酸具有同一信号产生标记，还包括以下步骤：对于每种标记的双链体核酸，在所述标记的双链体核酸主要处于第一构象的温度下测量第一信号，并在所述标记的双链体核酸主要处于第二构象的温度下测量第二信号，并比较所述第一与第二信号。在一些方面中，在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同双链体核酸的数目。在一些方面中，第一构象是发夹构象，并且第二构象是线性构象。在一些方面中，靶标特异性探针是用报道分子-猝灭剂对的第一成员标记的可切割探针。在一些方面中，靶标特异性探针与其靶序列的特异性杂交导致所述探针在切割位点处切割以形成截短的探针、所述截短的探针从所述靶核酸序列中释放以形成发夹探针，以及从所述切割位点开始的链延伸。在一些方面中，链延伸包括并入与所述报道分子-淬灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-淬灭剂对的第二成员，从而导致信号变化。在一些方面中，所述方法还包括以下步骤：在反应混合物中所有核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并将第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于检测样品中至少一种靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括：a)使样品与至少一种能够与靶核酸序列(如果存在的话)特异性杂交的可切割探针接触，所述可切割探针包含标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸；b)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；c)提供条件以使截短的探针形成发夹探针；d)在标记有报道分子-猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸的存在下使发夹探针延伸，所述第二非天然核苷酸能够与第一非天然核苷酸进行碱基配对以形成具有预定Tm的发夹探针；e)在低于所述预定Tm的温度下测量来自报道分子-猝灭剂对的第一信号，并在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号(借此进行解链分析)；以及f)通过检测第一和第二信号的变化来确定靶核酸序列的存在。在一些方面中，使样品与两种或更多种不同的可切割探针接触，每种均对不同的核酸具有特异性，并且每种均能够在其各自的靶核酸的存在下形成具有独特的预定Tm的发夹探针，并且其中每种不同的发夹探针包括相同的报道分子-猝灭子对，还包括以下步骤：对于每种不同的发夹探针，在低于所述发夹探针的预定Tm的温度下测量第一信号，并且在高于所述发夹探针的预定Tm的温度下测量第二信号，并比较每种不同的发夹探针的第一与第二信号。在一些方面中，样品在单个反应室中与两种或更多种不同的可切割探针接触。在一些方面中，在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是反应室中不同的可切割探针的数目。在一些方面中，所述不同的发夹探针的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。在一些方面中，所述不同的发夹探针的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。在一些方面中，所述不同的发夹探针的独特的预定Tm至少相差10摄氏度。在一些方面中，当第一信号与第二信号的比超过预定阈值时，确定存在靶核酸。在一些方面中，进行解链分析而不在预定Tm的2摄氏度内的温度下测量信号。在一些方面中，进行解链分析而不在预定Tm的5摄氏度内的温度下测量信号。在一些方面中，所述方法还包括以下步骤：在反应混合物中的所有核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且相对于第三信号将第一和第二信号归一化。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。在一些方面中，解链分析在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在切割之前在所述多个分区中测量来自所述可切割探针的标记的信号，并使用在切割之前测得的所述信号设置阈值，以将包含所述靶核酸的分区与不包含所述靶核酸的分区区分开。在一些方面中，解链分析在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在延伸之后和在解链分析之前在一定温度范围内测量多个信号，并使用所测得的信号校正在解链分析过程中测得的信号的光和温度依赖性变化。

在一些实施方案中，本公开内容提供了用于检测样品中至少一种靶核酸序列存在与否的方法，所述方法包括：a)使所述样品与至少一种能够与所述靶核酸序列(如果存在的话)特异性杂交的可切割探针接触，所述可切割探针包含信号产生标记；b)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交，所述捕获序列包括与所述截短的探针互补的序列；d)使用所述捕获序列为模板使所述截短的探针延伸，以形成具有预定Tm的双链探针；以及e)在低于所述预定Tm的第一温度下测量来自所述信号产生标记的第一信号，以及在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号(借此进行解链分析)；以及f)通过检测在所述第一温度与所述第二温度下测得的信号的变化来确定所述靶核酸序列的存在。在一些方面中，样品与两种或更多种不同的可切割探针接触，每种均对不同的靶核酸具有特异性，并且每种均能够在其各自的靶核酸存在下形成具有独特的预定Tm的双链探针，并且其中每种不同的双链探针均包括相同的报道分子-猝灭剂对，还包括以下步骤：对于每种不同的双链探针，在低于所述预定Tm的第一温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，并比较针对每种不同的双链探针测得的所述第一与第二信号。在一些方面中，捕获序列和截短的探针是单分子的。在另一些方面中，捕获序列和截短的探针是双分子的。在一些方面中，样品在单个反应室中与两种或更多种不同的可切割探针接触。在一些方面中，在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是反应室中不同的可切割探针的数目。在一些方面中，所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。在一些方面中，所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。在一些方面中，所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少8摄氏度。在一些方面中，当第一信号与第二信号的比超过预定阈值时，确定存在靶核酸。在一些方面中，进行所述方法而不在预定Tm的2摄氏度内的温度下测量信号。在一些方面中，进行所述方法而不在预定Tm的5摄氏度内的温度下测量信号。在另一些方面中，信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且双链探针包括与报道分子-猝灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-猝灭剂对的第二成员。在一些方面中，其中所述可切割探针包含连接有所述信号产生标记的第一非天然核苷酸，所述双链体核酸包含与所述第一非天然核苷酸杂交的第二非天然核苷酸，并且所述报道分子-猝灭剂对的第二成员与所述第二非天然核苷酸连接。在某些方面中，报道分子-猝灭剂对的第一成员是荧光实体，且报道分子-猝灭剂对的第二成员是猝灭荧光实体的荧光的猝灭剂。在另一些方面中，第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。在一些方面中，所述方法还包括以下步骤：在反应混合物中的所有核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且相对于第三信号将第一和第二信号归一化。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。在一些方面中，解链分析在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在切割之前在所述多个分区中测量来自所述可切割探针的标记的信号，并使用在切割之前测得的所述信号设置阈值，以将包含所述靶核酸的分区与不包含所述靶核酸的分区区分开。在一些方面中，解链分析在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在延伸之后和在解链分析之前，在一定温度范围内测量多个信号，并使用所测得的信号校正在解链分析过程中测得的信号的光和温度依赖性变化。

在一些实施方案中，本公开内容提供了对多种标记的核酸双链体进行解链分析的方法，所述方法包括：(a)至少提供第一、第二和第三标记的双链体核酸，其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的每种均具有独特的预定Tm，并且所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm，且所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm，并且其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸被同一标记进行标记；(b)在低于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第一温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第一信号；(c)在第二温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第二信号，所述第二温度介于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；(d)在第三温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第三信号，所述第三温度介于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；(e)在高于所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第四温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第四信号；以及(f)通过比较所述第一、第二、第三和第四信号来确定所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的一种或更多种是否是靶标特异性探针切割的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述第一标记的双链体核酸是第一靶标特异性探针切割的结果，所述第二信号与所述第三信号之间的变化表明所述第二标记的双链体核酸是第二靶标特异性探针切割的结果，并且所述第三信号与所述第四信号之间的变化表明所述第三标记的双链体核酸是第三靶标特异性探针切割的结果。在一些方面中，不在所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm下检测信号。在一些方面中，第一温度与第二温度之间的差异大于2摄氏度，第二温度与第三温度之间的差异大于2摄氏度，并且第三温度与第四温度之间的差异大于2摄氏度。在一些方面中，步骤在dPCR反应中在多个分区上进行。在一些方面中，通过从第一和第二信号中减去第三信号，相对于第三信号将第一和第二信号归一化。在另一些方面中，方法包括以下步骤：在反应混合物中的所有双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且相对于第三信号将第一和第二信号归一化。

在另一个实施方案中，提供了用于确定样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述样品和信号产生靶标特异性探针的反应混合物，其中所述靶标特异性探针当处于第一单链构象时产生第一信号；(b)测量所述反应混合物中来自所述靶标特异性探针的第一信号；(c)为所述靶标特异性探针提供条件以使其与所述靶核酸(如果存在的话)杂交并采用第二构象，所述第二构象是具有预定Tm并能够在低于所述预定Tm的温度下产生第二信号的双链体核酸；(d)在低于所述预定Tm的温度下测量来自所述双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及(e)当所述第一信号与所述第二信号之间存在差异时，确定所述靶核酸的存在。在某些方面中，靶标特异性探针是可切割探针，其在与靶核酸杂交后被切割以形成截短的探针，和/或截短的探针与捕获序列结合并延伸以形成双链体核酸。在一些方面中，第一和第二信号是荧光信号。在某些方面中，在靶标特异性探针与靶核酸杂交之前检测第一信号。在一些方面中，在靶标特异性探针处于第一构象的条件下切割和延伸后检测第一信号。在另一些方面中，所述可切割探针包含标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述双链体核酸包含能够与所述第一非天然核苷酸进行碱基配对并标记有报道分子-猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸。例如，在某些情况下，第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。在一些情况下，靶标特异性探针在与所述捕获序列结合之前用荧光团标记，并且其中在导致所述荧光团淬灭的位置处将淬灭剂并入到所述双链体核酸中。在某些情况下，在步骤(b)之后，使所述反应混合物经受用于扩增所述靶核酸的条件。在某些方面中，捕获序列和截短的探针是单分子的并且杂交以形成发夹探针。在一些情况下，捕获序列和截短的探针是双分子的。

在另一个实施方案中，提供了用于检测样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述样品、至少一种标记的可切割靶标特异性探针的反应混合物，所述探针能够与所述靶核酸序列(如果存在于所述反应混合物中的话)特异性杂交，并且所述标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员；(b)测量所述反应混合物中来自所述标记的靶标特异性探针的第一信号；(c)提供条件以使所述标记的可切割靶标特异性探针与所述靶核酸序列(如果存在于所述反应混合物中的话)杂交；(d)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；(e)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交；(f)使所述截短的探针延伸以形成具有所述报道分子.猝灭剂对的第二成员和预定Tm的双链体核酸；(g)在低于所述预定Tm的温度下测量第二信号；以及(h)当所述第一和第二信号之间的差异超过预定阈值时，检测到所述靶核酸的存在。在一些方面中，捕获序列和截短的探针是单分子的并且杂交以形成发夹探针。在某些情况下，捕获序列和截短的探针是双分子的。在某些方面中，其中靶标特异性探针包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述双链体核酸包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。例如，在某些情况下，第一和第二非天然核苷酸是isoC和isoG中的任一者。在某些方面中，报道分子-猝灭剂对的第一成员是荧光团，且报道分子-猝灭剂对的第二成员是猝灭剂。

在又一个实施方案中，提供了用于确定样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含所述样品和信号产生靶标特异性探针的反应混合物，其中所述靶标特异性探针当处于第一单链构象时产生第一信号；(b)测量所述反应混合物中来自所述靶标特异性探针的第一信号；(c)使所述反应混合物经受用于扩增所述靶核酸的条件，其中在扩增期间，所述靶标特异性探针被修饰以形成经修饰的靶标特异性探针，所述经修饰的靶标特异性探针包含具有预定Tm并且能够在低于所述预定Tm的温度下产生第二信号的双链体核酸；(d)在低于所述预定Tm的温度下测量第二信号而不在所述预定Tm下测量信号；以及(e)当所述第一信号与所述第二信号之间的差异超过预定阈值时，确定所述靶核酸的存在。在一些方面中，所述靶标特异性探针通过与所述靶核酸杂交后被切割以形成截短的探针来修饰，所述截短的探针与捕获序列结合并延伸以形成所述双链体核酸。在某些方面中，第一和第二信号是荧光信号。在某些情况下，在靶标特异性探针与靶核酸杂交之前检测第一信号。在某些方面中，在经修饰的靶标特异性探针处于单链构象的条件下切割和延伸后检测第一信号。在某些方面中，所述靶标特异性探针包含标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述经修饰的靶标特异性探针包含能够与所述第一非天然核苷酸进行碱基配对并且标记有所述报道分子-淬灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸。例如，在某些情况下，第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。在某些方面中，所述靶标特异性探针在与所述捕获序列结合之前用荧光团标记，并且其中在延伸过程中在导致所述荧光团淬灭的位置处将淬灭剂并入到所述双链体核酸中。

在另一个实施方案中，提供了检测样品中第一和第二靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)形成扩增反应混合物，其包含第一和第二荧光信号产生靶标特异性探针和可能含有所述第一和第二靶核酸的所述样品；(b)对所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述第一和/或第二靶核酸；(c)在预选温度T1、T2和T3下从至少一个分区子集的图像中获取第一、第二和第三组荧光强度值，并对于所述分区子集中的每个分区，确定预选温度T1下的第一荧光强度值、预选温度T2下的第二荧光强度值和预选温度T3下的第三荧光强度值；(d)使包含所述扩增反应混合物的所述分区经受用于以下的条件：扩增所述第一和第二靶核酸，以及在其靶核酸存在下修饰所述第一信号产生探针以形成具有第一预定Tm的第一双链体核酸，并且在其靶核酸存在下修饰所述第二信号产生探针以形成具有第二预定Tm的第二双链体核酸；(e)在低于第一预定Tm的温度T1下，从所述分区子集的图像中获取第四组荧光强度值，并计算每个分区的第四强度值；(f)在高于第一预定Tm但低于第二预定Tm的温度T2下，从所述分区子集的图像中获取第五组荧光强度值，并计算每个分区的第五强度值；(g)在高于第二预定Tm的温度T3下，从所述分区子集的图像中获取第六组荧光强度值，并计算每个分区的第六强度值；(h)对于每个分区，将第四强度值除以第一强度值以获得与T1相关的第七强度值；(i)对于每个分区，将第五强度值除以第二强度值以获得与T2相关的第八强度值；(j)对于每个分区，将第六强度值除以第三强度值以获得与T3相关的第九强度值；(k)对于每个分区，检测第八强度值与第七强度值之间的变化以确定所述第一靶核酸的存在；以及(l)对于每个分区，检测第九平均强度值与第八平均强度值之间的变化以确定第二靶核酸的存在。在某些情况下，第一和第二荧光信号产生探针具有同一信号产生标记。在某些方面中，信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且第一和第二双链体核酸包含报道分子-猝灭剂对的第二成员。在某些方面中，所述第一和第二信号产生探针包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述第一和第二双链体核酸包含连接有所述报道分子-猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。例如，在一些方面中，非天然核苷酸是iso-C或iso-G中之一。在某些情况下，第一和第二信号产生探针是在扩增过程中被切割的可切割探针。在另一些方面中，第八强度值与第七强度值之间的变化超过预定阈值，并且其中第九强度值与第八强度值之间的变化超过预定阈值。

在另一个实施方案中，提供了检测样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)形成扩增反应混合物，其包含荧光信号产生靶标特异性探针和包含所述靶核酸的样品；(b)对所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述靶核酸；(c)在预选温度T1和T2下从分区的至少一个子集的图像中获取第一和第二组荧光强度值，并且对于所述分区子集中的每个分区，确定预选温度T1下的第一荧光强度值和预选温度T2下的第二荧光强度值；(d)使含有所述扩增反应混合物的分区经受用于扩增所述靶核酸和在其靶核酸存在下修饰所述信号产生探针以形成具有预定Tm的双链体核酸的条件；(e)在低于所述预定Tm的温度T1下，从所述分区子集的图像中获取第三组荧光强度值，并计算每个分区的第三强度值；(f)在高于所述预定Tm的温度T2下，从所述分区子集的图像中获取第四组荧光强度值，并计算每个分区的第四强度值；(g)对于每个分区，将第三强度值除以第一强度值以获得与T1相关的第五强度值；(h)对于每个分区，将第四强度值除以第二强度值以获得与T2相关的第六强度值；(i)对于每个分区，检测第六强度值与第五强度值之间的变化以确定所述靶核酸的存在。在另外的方面中，所述靶核酸是第一靶核酸，所述信号产生靶标特异性探针是第一荧光信号产生靶特标异性探针，并且所述预定Tm是第一预定Tm，还包括检测第二靶核酸的存在，其中所述反应混合物还包含第二荧光信号产生靶标特异性探针，所述方法还包括以下步骤：(j)在步骤(b)中，将所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述第一和/或第二靶核酸；(k)在步骤(c)中，在预选温度T3下从至少一个分区子集的图像中获取第五组荧光强度值，并且对于所述分区子集中的每个分区，确定在预选温度T3下的第七荧光强度值；(l)在步骤(d)中，使含有所述扩增反应混合物的所述分区经受用于扩增所述靶核酸和在其靶核酸存在下修饰所述第二信号产生探针以形成具有第二预定Tm的第二双链体核酸的条件；(m)在高于第二预定Tm的温度T3下，从所述分区子集的图像中获取第六组荧光强度值，并计算每个分区的第八强度值；(n)对于每个分区，将第八强度值除以第七强度值以获得与T3相关的第九强度值；(o)对于每个分区，检测第九强度值与第六强度值之间的变化以确定所述第二靶核酸的存在。在一些方面中，第六和第五强度值之间的变化以及第九与第六强度值之间的变化超过预定阈值。在某些情况下，第一和第二荧光信号产生探针具有同一信号产生标记。在另一些方面中，信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且第一和第二双链体核酸包含报道分子.猝灭剂对的第二成员。在一些情况下，第一和第二信号产生探针包含连接有所述报道分子.淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述第一和第二双链体核酸包含连接有所述报道分子.猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。例如，在一些方面中，非天然核苷酸是iso-C或iso-G中之一。在一些方面中，第一和第二信号产生探针是在扩增过程中被切割的可切割探针。

在另一些方面中，可进行任何前述方法，其中步骤在dPCR反应中跨多个分区进行，还包括在确定所述靶核酸的存在之前将其中在所述第一与第二信号之间没有变化的分区鉴定为靶标阴性分区，并使用来自靶标阴性分区的测得信号将每个分区中测得的第一和第二信号的光和温度依赖性变化归一化。

如本文所用，就特定组分而言，“基本上不含”用于意指没有特定组分被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。由组合物的任何意外污染引起的指定组分的总量优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到指定组分的量的组合物。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。如本文在说明书和权利要求书中所使用的，当与词语“包含/括”结合使用时，没有数量词修饰的名词包括一个/种或更多个/种。如本文中所使用，在说明书和权利要求书中，“另一”或“又一”可意指至少第二个/种或更多个/种。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，术语“约/大约”用于表示这样的值，其包括用于确定所述值的装置、方法之误差的固有变化，或者研究对象之间存在的变化。

通过以下详细描述，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应该理解，详细描述和具体实例虽然指示了本发明的某些实施方案，但是仅以举例说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的多种改变和修改对于本领域技术人员而言从该详细描述中将变得明显。

附图说明

以下附图构成了本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅并结合本文所呈现的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本发明。

图1：示出了包含解链温度分别为65、75和85℃的3个靶标特异性探针的靶标的样品的相对荧光单位(Relative Fluorescent Unit，RFU)相对于温度(A)和相对于温度的RFU的负导数(negative derivative)(B)的连续解链分析的示例性图。对于连续解链分析，以每0.5至1.0温度变化进行RFU测量。

图2：示出了使用本发明方法的包含单一靶标特异性探针的靶标的样品(A，C)和包含图1中所示3个靶标特异性探针的靶标的样品(B，D)的RFU相对于温度(A，B)和相对于温度的RFU的负导数(C，D)的解链分析图的实例。荧光图像仅在由X表示的温度下获取。

图3：dPCR应用的36个分区中图1中所示的3个靶标特异性探针的靶标的随机分布的实例。每个分区包含0、1、2或3个靶标。

图4：在T1(在该实例中为60℃)下采集的图3中所示系统的荧光图像，其中相对亮度指示分区中未经切割、未经延伸且独特的探针的数目。在使用可切割探针的该实例中，由于未经切割、未经延伸的探针的荧光，所有靶标阴性分区均是亮的，并且所有含靶标的分区均相对较暗，这取决于每个分区中靶标的数目。

图5：在T2(70℃)下采集的图3中所示系统的荧光图像，在该温度下，由于靶标A探针变性而导致荧光与淬灭剂分离，因此包含靶标A的分区显示出提高的荧光。

图6：图3中所示系统的图像比较的实例。将在T2下针对每个分区计算的平均荧光强度除以在T1下针对每个分区计算的平均荧光强度，以确定哪些分区显示荧光强度的变化(A)。图6B表示示出了对应于被确定为针对靶标为阴性的分区(1)和被确定为针对靶标为阳性的分区(＞1)的分区的2个簇(＞1和1)的1D振幅图。

图7：确定每个室中靶标的存在或不存在的针对图3中所示的系统，在T1、T2、T3和T4下采集的图像的图像比较实例(A)。生成伴随的1D振幅图的对在T2相对于T1、T3相对于T2、以及T4相对于T3下针对每个分区计算的荧光强度的比较产生每组温度的被确定为针对靶标为阴性(1)的分区的簇和被确定为针对靶标为阳性(＞1)的分区的簇(B)。

图8：使用图像归一化以说明特定于分区的、系统引起的变化的实例。图8A和8B分别示出了原始数据和归一化(相对于在95℃下采集的图像)的荧光图像；图8C和8D示出了相应的强度直方图；图8E和8F示出了相应的1D振幅图。

图9：使用扩增前图像建立初步阈值的实例。经分区样品的扩增前图像(图9A)；经分区样品的扩增后图像(图9B)；来自扩增前(深灰色条)和扩增后(白色条)图像的平均微滴强度直方图(图9C)；示出了平均微滴强度的来自扩增前和扩增后图像(分别为黑色和白色)的1D振幅图(图9D)。在C和D二者中，灰色线表示距扩增前平均强度的平均值3σ。

图10：对探针荧光强度的温度和光剂量依赖性变化进行校正的实例。使用来自具有3个靶标和具有独特Tm的3个探针的分区(上部，实线)和来自具有0个靶标和3个探针的分区(上部，虚线)的原始的、未经校正的数据的荧光与温度的图；来自同一样品的经校正的荧光与温度数据的图示于该图的下半部中。所述校正由观察到的阴性分区的线性衰减来确定，所述线性衰减由荧光漂白和荧光的温度依赖性变化引起。

图11：单重连续解链分析。左：来自包含单一靶标样品并使用可切割探针检测的dPCR反应的分区的以1℃间隔采集的图像的荧光与温度图；A：原始未经校正的数据；B：示出了在60℃下每个分区的信号强度的对应于A的1D振幅图；C：对系统引起的分区变异性进行校正的相对于95℃下的荧光归一化的A中所示的数据；D：示出了在60℃下每个分区的信号强度的对应于C的1D振幅图；E：对探针的光和温度依赖性荧光变化进行校正的归一化的C中所示的数据；F：示出了在60℃下每个分区的信号强度的对应于E的1D振幅图；G：示出了每个分区中靶标特异性探针Tm的E中所示数据的反导数；H：示出了跨靶标特异性解链窗口的积分信号强度的对应于G的1D振幅图。使用泊松统计(Poisson statistic)计算每个分区的预期拷贝数，并将其推断为每μL的靶标拷贝数。

图12：单重离散解链分析。A：在温度T1和T2下测量的图11中所示样品的分区的荧光与温度图；B：在T2/T1下每个分区的荧光强度的1D振幅图；C：在进行归一化以对系统变异性进行校正之后，来自C的数据的荧光与温度图。通过计算每个分区的平均拷贝数确定靶标浓度。

图13：多重连续解链分析。左图：来自包含3个靶标和具有可区分Tm的3个探针的样品的以1℃温度间隔采集的35个图像的荧光与温度图。从上至下：A：解链分析期间每个分区的平均荧光与温度；C：对系统引起的分区变异性进行校正的归一化的每个分区的平均荧光；E：进一步对光和温度依赖性荧光衰减进行校正的来自C的每个分区的平均荧光；G：示出了3个可区分探针Tm的E的反导数图；右图：B：相对于95℃图像归一化的在57℃下每个分区的平均强度的1D振幅图；D、E&F：每个靶标特异性解链窗口的导数积分的图。

图14：多重离散解链分析。A：在温度T1、T2、T3和T4下测量的图13中所示样品分区的荧光与温度图；B：相对于在95℃下每个分区的平均荧光强度归一化的在57℃下每个分区的平均荧光强度；C：在进行归一化以对系统引起的分区变异性进行校正之后，来自A的数据的荧光与温度图；D：针对第一温度间隔(T2/T1)计算的每个分区的荧光强度之比；E：在进行归一化以对光和温度依赖性荧光衰减进行校正之后，来自C的数据的荧光与温度图；F：针对第二温度间隔(T3/T2)计算的每个分区的荧光强度之比；G：针对第三温度间隔(T4/T3)计算的每个分区的荧光强度之比。再次，所计算的每个分区的平均拷贝数用于确定特定靶标浓度。

图15：用于离散解链分析的dPCR工作流程：在每个分区中使用多个靶标特异性探针进行dPCR解链分析的工作流程的实例。

一些示例性实施方案的描述

I.本发明实施方案

本公开内容提供了用于进行快速解链分析以确定样品中靶标的存在或不存在的方法，即使在经扩增的靶标具有相似的解链峰的情况下也是如此。在一个优选的实施方案中，解链分析在低于靶标特异性探针Tm和高于靶标特异性探针Tm但不以靶标特异性探针Tm的离散解链温度下进行。

II.定义

本文中使用的“核酸”意指单链或双链的DNA或RNA，及其任何化学修饰。修饰包括但不限于提供其它化学基团的那些，其整合另外的电荷、极性、氢键、静电相互作用以及对核酸配体碱基或整个核酸配体的流动性(fiuxionality)。这样的修饰包括但不限于，2’位的糖修饰，5位的嘧啶修饰，8位的嘌呤修饰，环外胺处的修饰，4-硫代尿苷的替换，5-溴或5-碘代-尿嘧啶的替换，骨架修饰，甲基化和不常见的碱基配对组合，例如异碱基。因此，本文中所述的核酸不仅包括标准碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，还包括非标准或非天然核苷酸。形成氢键碱基对的非标准或非天然核苷酸描述于例如美国专利No.5,432,272、5,965,364、6,001,983、6,037,120和6,140,496，其全部通过引用并入本文。“非标准核苷酸”或“非天然核苷酸”意指除A、G、C、T或U之外的还易于并入到寡核苷酸中并且能够通过氢键，或通过疏水、熵或范德瓦耳斯相互作用(van der Waalsinteraction)，与互补的非标准或非天然核苷酸形成碱基对来进行碱基配对的碱基。一些实例包括iso-C/iso-G、K/X、K/P、H/J和M/N的碱基对组合，如美国专利No.6,037,120中所示，其通过引用并入本文。

这些非标准或非天然核苷酸对的氢键类似于天然碱基的那些，其中配对的非标准或非天然核苷酸的氢键接纳体与氢键供体之间形成两个或三个氢键。天然碱基与这些非标准或非天然核苷酸的一个区别在于氢键接纳体和氢键供体的数目和位置。例如，胞嘧啶可被认为是供体/接纳体/接纳体碱基，而鸟嘌呤是互补的接纳体/供体/供体碱基。Iso-C是接纳体/接纳体/供体碱基，而iso-G是互补的供体/供体/接纳体碱基，如美国专利No.6,037,120中所示，其通过引用并入本文。

用于寡核苷酸的另一些非天然核苷酸包括，例如，萘、菲和芘衍生物，如例如Ren，et al.，1996和McMinn et al.，1999中所讨论的，其二者均通过引用并入本文。这些碱基不利用氢键来稳定，而是替代地依赖于疏水或范德瓦耳斯相互作用形成碱基对。

本文中使用的术语“样品”以其最广义使用。样品可包括体组织或体液，包括但不限于血液(或血液级分，例如血浆或血清)、淋巴、黏液、泪、尿和唾液。样品可包括来自细胞、染色体、细胞器或病毒的提取物。样品可包含DNA(例如，基因组DNA)、RNA(例如，mRNA)和/或eDNA，其中任何一个均可被扩增以提供经扩增的核酸。样品可包括在溶液中或与基底结合(例如，作为微阵列的一部分)的核酸。样品可包含从环境场所(environmental locus)(例如水体、土壤等)中获得的物质或从媒介物(fomite)(即用于将病原体从一个宿主转移至另一个宿主的无生命物体)中获得的物质。

术语“核酸来源”是指包含核酸(RNA或DNA)的任何样品。特别优选的靶核酸来源是生物样品，包括但不限于，血液、血浆、血清、唾液、脑脊液、胸腔液、乳汁、淋巴、痰和精液。

本文中使用的术语“检测限”是指可检测和定量的分析物，例如核酸的最低水平或量。检测限可表示为摩尔值(例如，2.0nM检测限)，克测量值(例如，如在特定反应条件下的2.0微克检测限)，拷贝数(例如1×10⁵拷贝数检测限)，或本领域已知的其他表示形式。

本文中使用的对于核酸分子的术语“分离”是指与存在于核酸分子的天然来源中的生物体和生物材料(例如血液、细胞、血清、血浆、唾液、尿、粪便、痰、鼻咽抽吸物等)分离的核酸分子。当通过重组技术产生时，分离的核酸分子(例如cDNA分子)可以基本不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，所述分离的核酸分子基本不含化学前体或其它化学物质。在一些实施方案中，还可分离或纯化编码多肽/蛋白质的核酸分子。核酸分离的方法是本领域公知的，可包括总核酸分离/纯化方法、RNA特异性分离/纯化方法，或DNA特异性分离/纯化方法。

本文中使用的术语“微阵列”是指基底上的多个多核苷酸、多肽或其他化学化合物的排列。术语“元件”和“阵列元件”是指微阵列上具有独特和限定位置的多核苷酸、多肽或其他化合物。

本文中使用的寡核苷酸理解为具有骨架上之碱基序列的分子，所述骨架主要包含具有限定间隔的相同单体单元。所述碱基在所述骨架上以这样的方式排列，使其可与核酸键合，所述核酸具有与所述寡核苷酸的碱基互补的碱基序列。最常见的寡核苷酸具有糖磷酸单元骨架。可区分由在2’位不具有羟基的“dNTP”组成的寡脱氧核糖核苷酸与由在2’位具有羟基的“NTP”组成的寡核糖核苷酸。寡核苷酸还可包括其中羟基的氢被有机基团例如烯丙基替代的衍生物。

寡核苷酸为包含至少两个核苷酸的核酸。用于本文中所公开方法中的寡核苷酸通常包含至少约十(10)个核苷酸，并且更通常至少约十五(15)个核苷酸。用于本文中所公开方法的优选寡核苷酸包含约10至100个核苷酸。可将寡核苷酸设计为用作“引物”。“引物”是短核酸，通常是ssDNA寡核苷酸，其可通过互补碱基配对与靶多核苷酸退火。然后可通过聚合酶，例如DNA聚合酶，沿靶标DNA或RNA模板链延伸引物。引物对可用于扩增(和鉴定)核酸序列(例如，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR))。可将寡核苷酸设计为用作“探针”。“探针”是指用于检测相同、等位或相关核酸序列的寡核苷酸，其互补序列，或其片段。探针可包含已与可检测标记或报道分子连接的寡核苷酸。典型的标记包括荧光染料、淬灭剂、放射性同位素、配体、闪烁剂、化学发光剂和酶。探针也可通过聚合酶，使用靶核酸或自身互补区作为模板进行延伸。

可将寡核苷酸设计为对样品中的靶核酸序列具有特异性。例如，可将寡核苷酸设计为包含靶核酸的“反义”核酸序列。本文中使用的术语“反义”是指能够与核酸序列的“有义”(编码)链进行碱基配对的任何组合物。反义核酸序列可与靶核酸序列“互补”。本文中使用的“互补性”描述了通过碱基配对退火的两个单链核酸序列之间的关系。例如，5’-AGT-3’与其互补序列3’-TCA-5’配对。在一些实施方案中，可将引物或探针设计为包含多个位置处的错配。本文中使用的“错配”意指不包含标准沃森-克里克碱基对(Watson-Crick basepair)的核苷酸对，或不优先形成氢键的核苷酸对。所述错配可包含被靶标中特定的一个或更多个碱基替换的天然核苷酸或者非天然或非标准核苷酸。例如，探针或引物序列5’-AGT-3’与靶序列3’-ACA-5’具有单个错配。探针或引物的5’“A”与靶标的3’“A”错配。类似地，靶序列5’-AGA-3’与探针或引物序列3’-(iC)CT-5’具有单个错配。此处用iso-C代替地替换天然的“T”。然而，序列3’-(iC)CT-5’与序列5’-(iG)GA-3’不错配。

也可将寡核苷酸设计为简并寡核苷酸。本文中使用的“简并寡核苷酸”意指包括群体、集合或多个寡核苷酸，其包含不同序列的混合物，其中序列差异出现在群体的每个寡核苷酸中的指定位置。多种替换可包括任意天然或非天然核苷酸，并且可包括任意数目的在任意给定位置上不同的可能核苷酸。例如，上述简并寡核苷酸可替代地包括R＝iC或iG，或者R＝A或G或T或C或iC或iG。

本文中所述的寡核苷酸通常能够与具有互补碱基序列的寡核苷酸形成氢键。这些碱基可包括天然碱基，例如A、G、C、T和U，以及人工的、非标准或非天然核苷酸，例如iso-胞嘧啶和iso-鸟嘌呤。如本文中描述的，当与第二序列的连续碱基(从3’至5’读)比较时，第一序列的连续碱基(从5’至3’读)遵循沃森-克里克的碱基配对规则时，寡核苷酸的第一序列被描述为与寡核苷酸的第二序列100％互补。寡核苷酸可包括核苷酸替换。例如，可使用人工碱基代替天然碱基，使得人工碱基表现出与天然碱基相似的特定相互作用。

对靶核酸具有特异性的寡核苷酸也可对与靶核酸序列具有“同源性”的核酸序列具有特异性。本文中使用的“同源性”是指两个或更多个多核苷酸序列或两个或更多个多肽序列之间的序列相似性或可互换地，序列同一性。应用于多核苷酸序列的术语“百分比同一性”和“同一性％”是指使用标准化算法(例如，BLAST)比对的至少两个多核苷酸序列之间残基匹配的百分比。

对靶核酸具有特异性的寡核苷酸将在合适的条件下与靶核酸“杂交”。本文中使用的“杂交(hybridization)”或“使杂交(hybridizing)”是指寡核苷酸单链在限定的杂交条件下通过碱基配对与互补链退火的过程。“特异性杂交”是指示两个核酸序列具有高度的互补性。特异性杂交复合体在允许退火的条件下形成，并在任意后续洗涤步骤之后保持杂交。允许核酸序列退火的条件可由本领域普通技术人员常规地确定，并且可在例如存在约6×SSC的情况下于65℃下进行。可部分参考进行洗涤步骤的温度表示杂交的严格性。对于在限定的离子强度和pH下的特定序列，通常选择低于热解链点(thermal melting point，T_m)约5℃至20℃的这样的温度。T_m是50％的靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度(在限定的离子强度和pH下)。用于计算T_m的方程，例如，最近邻参数，以及用于核酸杂交的条件是本领域已知的。

本文中使用的“靶标”或“靶核酸”是指包含与寡核苷酸，例如探针或引物具有至少部分互补性的序列的核酸分子。“靶”序列可包括基因或基因组的一部分。

本文中使用的“核酸”、“核苷酸序列”或“核酸序列”是指核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸，或其任何片段以及天然存在的或合成的分子。这些术语也指基因组或合成来源的DNA或RNA，其可是单链或双链的并且可表示有义或反义链，或者指任何DNA样或RNA样物质。对于DNA序列的“RNA等同物”由与参考DNA序列相同的线性核苷酸序列构成，不同之处在于所有出现的含氮碱基胸腺嘧啶均被尿嘧啶替代，以及糖骨架由代替脱氧核糖的核糖构成。RNA可用于本文中所述的方法中，和/或可通过在本文中所述方法中采用的逆转录转化为eDNA。

本文中使用的“扩增(amplification)”或“扩增(amplifying)”是指核酸序列的另外拷贝的产生。扩增可使用聚合酶链式反应(PCR)或本领域已知的其他扩增技术来进行。术语“扩增反应系统”是指用于产生核酸靶序列的至少第一互补拷贝的任何体外手段。在一些方面中，扩增产生核酸靶序列的多个拷贝。术语“扩增反应混合物”是指包含用于扩增靶核酸的多种试剂的水溶液。这些可包括酶(例如，热稳定聚合酶)、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸、核苷三磷酸，以及任选地，至少一个经标记的探针和/或任选地，用于确定经扩增靶核酸的解链温度的至少一种试剂(例如，在存在双链核酸的情况下表现出荧光变化的荧光嵌入剂)。

核酸扩增可包括核酸或这些核酸之亚区域的扩增。例如，扩增可包括通过选择合适引物序列和使用PCR对30至50、50至100或100至300碱基长的核酸部分进行扩增。在另一些方面中，扩增可使用等温扩增技术(即，无需热循环)来实现。例如，用于等温核酸扩增的方法，例如环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)提供于美国专利6,410,278和美国专利公布20080182312中，其每一个均通过引用其整体并入本文。

扩增混合物可包含天然核苷酸(包括A、C、G、T和U)和非天然或非标准核苷酸(例如，包括iC和iG)。DNA和RNA寡核苷酸分别包含通过磷酸二酯键偶联的脱氧核糖或核糖。每个脱氧核糖或核糖均包含与糖偶联的碱基。天然存在的DNA和RNA中并入的碱基是腺苷(A)、鸟苷(G)、胸苷(T)、胞嘧啶(C)和尿苷(U)。这五个碱基是“天然碱基”。根据沃森和克里克阐述的碱基配对规则，天然碱基杂交形成嘌呤-嘧啶碱基对，其中G与C配对以及A与T或U配对。这些配对规则促进寡核苷酸与互补寡核苷酸的特异性杂交。

每个碱基对的两个碱基之间产生两个或三个氢键有利于天然碱基形成碱基对。每个碱基包含两个或三个氢键供体和氢键接纳体。通过一个碱基上的至少一个氢键供体与另一碱基上的氢键接纳体的相互作用来各自形成碱基对的氢键。氢键供体包括例如具有至少一个连接的氢的杂原子(例如，氧或氮)。氢键接纳体包括例如具有孤电子对的杂原子(例如，氧或氮)。

本文中使用的天然或非天然核苷酸可通过非氢键合位点的替换而衍生，以形成经修饰的天然或非天然核苷酸。例如，通过将反应官能团(例如，巯基、肼、醇、胺等)与核苷酸的非氢键合原子偶联，可将天然核苷酸衍生以与支持物连接。另一些可能的取代基包括，例如，生物素、地高辛、荧光基团、烷基(例如，甲基或乙基)等。

根据本文中所公开方法的非天然核苷酸的用途可延伸超出了对样品中存在之核酸序列的检测和定量。例如，通过催化与核酸相关的反应的多种酶，可识别非天然核苷酸。虽然聚合酶需要互补核苷酸以继续聚合并延伸寡核苷酸链，但是其它酶并不需要互补核苷酸。如果非天然核苷酸存在于模板中并且其互补非天然核苷酸不存在于反应混合物中，则当尝试将延长的引物延伸通过所述非天然核苷酸时，聚合酶通常会停止(或者，在一些情况下，当给予足够量的时间时，会错并入碱基)。然而，催化与核酸相关的反应的另一些酶，例如连接酶、激酶、核酸酶、聚合酶、拓扑异构酶、解旋酶等，可催化涉及非天然核苷酸的反应。非天然核苷酸的这样的特征可被利用，并且在本文公开的方法和试剂盒的范围内。

本文中公开的核苷酸，其可包括非天然核苷酸，可与标记(例如，淬灭剂或荧光团)偶联。偶联可使用本领域已知的方法来进行。

本发明方法的寡核苷酸可用作引物。在一些实施方案中，将寡核苷酸进行标记。例如，可用发射可检测信号的报道子(例如，荧光团)标记寡核苷酸。寡核苷酸可包括至少一个非天然核苷酸。例如，寡核苷酸可包括具有非A、C、G、T或U的碱基(例如，iC或iG)的至少一个核苷酸。在寡核苷酸用作PCR的引物的情况下，扩增混合物可包含用淬灭剂(例如，Dabcyl)标记的至少一个核苷酸。经标记的核苷酸可包括至少一个非天然或非标准的核苷酸。例如，经标记的核苷酸可包括具有非A、C、G、T或U的碱基(例如，iC或iG)的至少一个核苷酸。

在一些实施方案中，可将寡核苷酸设计为不形成分子内结构(例如发夹)。在另一些实施方案中，可将寡核苷酸设计为形成分子内结构(例如发夹)。例如，可将寡核苷酸设计为形成发夹结构，这在所述寡核苷酸与靶核酸杂交之后，以及任选地，在使用所述寡核苷酸作为引物对靶核酸进行扩增之后发生改变。在另一些实施方案中，可将寡核苷酸设计为在与靶序列杂交时被切割并在切割之后采用分子内结构。

寡核苷酸可用荧光团进行标记，当所述寡核苷酸作为引物并入在经扩增的产物中时，所述荧光团表现出淬灭。在另一些实施方案中，在将寡核苷酸作为引物并入在经扩增产物中之后，寡核苷酸可发射可检测的信号(例如，固有地，或通过荧光诱导或荧光去淬灭)。这样的引物是本领域已知的(例如，LightCycler引物、Amplifluor^TM引物、Scorpion^TM引物和Lux^TM引物)。当嵌入在双链核酸中时，用于标记寡核苷酸的荧光团可发射信号。因此，在寡核苷酸用作引物扩增核酸之后，荧光团可发射信号。

用于所公开方法中的寡核苷酸可适合作为引物以扩增样品中的至少一个核酸，以及作为探针以检测样品中的至少一个核酸。在一些实施方案中，用可产生可检测信号的至少一个荧光染料标记寡核苷酸。荧光染料可用作荧光共振能量转移(fluorescenceresonance energy transfer，FRET)的荧光供体。当寡核苷酸用于扩增靶核酸时，所述可检测信号可被淬灭。例如，扩增混合物可包含用由荧光团发射的可检测信号的淬灭剂标记的核苷酸。任选地，可用第二荧光染料或可用作荧光接纳体的淬灭剂染料(例如，对于FRET)标记寡核苷酸。在用第一荧光染料和第二荧光染料标记寡核苷酸的情况下，可从第一荧光染料、第二荧光染料或二者中检测信号。可在温度梯度下检测信号(例如，以便确定双链体核酸，例如扩增子，包含与靶核酸杂交的探针的复合体，发夹探针或T探针复合体的解链曲线(melting profile))。或者，可在所选择的温度下检测信号以确定双链体核酸的解链曲线。

公开的方法可用任何合适数目的寡核苷酸进行。在使用多个寡核苷酸(例如，两个或更多个寡核苷酸)的情况下，可用能够产生可区分的可检测信号的不同荧光染料标记不同的寡核苷酸。在一些实施方案中，用两种不同荧光染料中的至少一种标记寡核苷酸。在另一些实施方案中，用三种不同荧光染料中的至少一种标记寡核苷酸。

在一些实施方案中，每种不同的荧光染料发射可与用于标记寡核苷酸的任何其他不同荧光染料发射的信号区分开的信号。例如，不同的荧光染料可具有波长发射最大值，所有所述最大值彼此相差至少约5nm(优选至少约10nm)。在一些实施方案中，每种不同的荧光染料被不同的波长能量激发。例如，不同的荧光染料可具有波长吸收最大值，所有所述最大彼此相差至少约5nm(优选至少约10nm)。

在该方法中使用荧光染料确定核酸的解链曲线的情况下，该荧光染料可发射可与用于标记寡核苷酸的任何其他不同荧光染料发射的信号区分开的信号。例如，用于确定核酸的解链曲线的荧光染料可具有波长发射最大值，所述最大值与用于标记寡核苷酸的任何其他荧光染料的波长发射最大值相差至少约5nm(优选至少约10nm)。在一些实施方案中，用于确定核酸的解链曲线的荧光染料可通过与用于标记寡核苷酸的任何其他不同荧光染料不同的波长能量来激发。例如，用于确定核酸的解链曲线的荧光染料可具有波长吸收最大值，所述最大值与用于标记寡核苷酸的任意荧光染料的波长吸收最大值相差至少约5nm(优选至少约10nm)。

该方法可包括确定样品中至少一个核酸(例如，包含与靶核酸杂交的探针或与自身互补区杂交的探针或与互补捕获序列杂交的探针的扩增子或双链体核酸)的解链曲线，这可用于鉴定核酸。确定解链曲线可包括将扩增子或双链体核酸暴露于温度梯度下并在整个温度梯度下观察来自荧光团的可检测信号。或者，确定解链曲线可包括将扩增子或双链体核酸暴露于所选择的离散温度下并且仅在所选择离散温度下观察可检测信号。任选地，在用第一荧光染料标记该方法的寡核苷酸的情况下，确定所检测的核酸的解链曲线可包括观察来自不同于第一荧光染料的第二荧光染料的信号。在一些实施方案中，用于确定所检测核酸的解链曲线的第二荧光染料是嵌入剂。合适的嵌入剂可包括但不限于SYBR^TMGreen 1染料、SYBR染料、Pico Green、SYTO染料、SYTOX染料、溴乙锭、乙锭同二聚体1、乙锭同二聚体2、乙锭衍生物、吖啶、吖啶橙、吖啶衍生物、乙锭-吖啶异二聚体、单叠氮乙锭、碘化丙啶、花青单体、7-氨基放线菌素D、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、花青二聚体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1，及其混合物。在一些合适的实施方案中，所选择的嵌入剂是SYBR^TM Green 1染料。

在所公开的方法中，每个经扩增靶核酸、报道探针-模板对或经杂交探针可具有不同的解链温度或不同的解链曲线。例如，每个经扩增靶核酸、报道探针-模板对或经杂交探针的解链温度可与任何其他经扩增靶核酸、报道探针-模板对或经杂交探针的解链温度相差约1至10℃，例如至少约1℃，更优选至少约2℃或4℃，或者更优选至少约5℃。

本文中使用的“标记”或“报道分子”是可用于标记核酸的化学或生化部分。“标记”和“报道分子”包括荧光剂、化学发光剂、显色剂、淬灭剂、放射性核素、酶、底物、辅因子、闪烁剂、抑制剂、磁性颗粒和本领域已知的其他部分。“标记”或“报道分子”能够产生可测量的信号，并且可与寡核苷酸共价或非共价连接。

本文中使用的“荧光染料”或“荧光团”是可被光激发以发射荧光的化学基团。一些合适的荧光团可被光激发以发射磷光。染料可包括能够淬灭来自荧光供体染料的荧光信号的接纳体染料。可用于所公开方法中的染料包括但不限于荧光团，例如红色荧光方酸菁染料(red fluorescent squaraine dye)，例如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚基甲基]环丁烯二

-1，3-二氧戊酸酯；红外染料，例如2，4-双[3，3-二甲基-2-(1H-苯并[e]二氢亚吲哚基甲基)]环丁烯二

-1，3-二氧戊酸酯；或橙色荧光方酸菁染料，例如2，4-双[3，5-二甲基-2-吡咯基]环丁烯二

-1，3-二氧戊酸酯。荧光团的另一些非限制性实例包括量子点，Alexa Fluor^TM染料，AMCA，BODIPY^TM630/650，BODIPY^TM 650/665，BODIPY^TM-FL，BODIPY^TM-R6G，BODIPY^TM-TMR，BODIPY^TM-TRX，Cascade Blue^TM，CyDye^TM，包括但不限于Cy2^TM、Cy3^TM、和Cy5^TM，DNA嵌入染料，6-FAM^TM，Fluorescein，HEX^TM，6-JOE，Oregon Green^TM 488，OregonGreen^TM 500，Oregon Green^TM514，Pacific Blue^TM，REG，藻胆蛋白(phycobiliprotein)，包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，Rhodamine Green^TM，Rhodamine Red^TM，ROX^TM，TAMRA^TM，TET^TM，Tetramethylrhodamine或Texas Red^TM。

荧光染料或荧光团可包括已被修饰以促进与另一反应性分子缀合的衍生物。因此，荧光染料或荧光团可包括胺反应性衍生物，例如荧光团的异硫氰酸酯衍生物和/或琥珀酰亚胺酯衍生物。

所公开方法的寡核苷酸和核苷酸可用淬灭剂进行标记。淬火可包括动态淬火(例如，通过FRET)、静态淬火或二者。合适的淬灭剂可包括Dabcyl。合适的淬灭剂还可包括暗淬灭剂(dark quencher)，其可包括以商品名“BHQ”(例如，BHQ-O、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，Biosearch Technologies，Novato，CA)出售的黑洞淬灭剂(black hole quencher)。暗淬灭剂还可包括以商品名“QXL^TM”(Anaspec，San Jose，CA)出售的淬灭剂。暗淬灭剂还可包括包含2，4-二硝基苯基的DNP型非荧光团。

本文中公开的方法和组合物可用于区室化反应中。使反应区室化的一种方法是通过使用微滴(droplet)，所述微滴是第一流体的隔离体积，所述第一流体被第二流体或第二流体和一个或更多个表面完全包围。在一些实施方案中，第一和第二流体是两种不互溶的液体。本文中公开的多个实施方案均采用油包水乳剂，其包含非水连续相中的多个水性微滴。水性微滴的全部或子集可包含目的分析物。通常在存在一种或更多种表面活性剂的情况下，通过将两种不互溶相(例如水和油)组合来形成乳剂。乳剂的基本类型是水包油(o/w)、油包水(w/o)和双连续乳剂。在基于微滴的生物测定中，乳剂将通常是油包水乳剂，其中水相中包含测定试剂(例如PCR引物、盐、酶等)。“油”相可以是单一油或不同油的混合物。任何合适的非水流体均可形成本文中公开的乳剂的非水连续相。在一些实施方案中，非水连续相包含矿物油、硅油或氟化油(例如，

FC-40[Sigma-Aldrich])。

可使用多种技术使微滴成像。为了促进成像，可将包含微滴的组合物分散在表面上，使得微滴基本上以单层布置在表面上。成像表面可例如在载玻片上或在室(例如玻璃或石英室)中。可使用成像系统检测微滴以及微滴内的经标记分析物或反应产物(例如，发夹探针)。例如，检测可包括对来自经标记发夹探针发射的荧光波长和/或荧光强度进行成像。在其中微滴还包含经编码颗粒，例如经编码微球的实施方案中，成像可包括采集经编码颗粒的第一解码图像和采集检测微滴中探针的第二测定图像。解码图像和测定图像的比较通过使用荧光团的组合允许更大的多重能力。本发明的方法可还包括将来自直接或间接经标记的扩增产物的信号与样品中DNA或RNA的浓度相关联。可适用于与本文中所公开的方法和组合物一起使用的成像系统的一些实例描述于美国专利No.8,296,088和美国专利公布2012/0288897中，其通过引用并入本文。另外，经编码微球的使用可有助于微滴跟踪。以足够的浓度包含的随机分布的、独特经编码微球将使每个微滴相对于邻近微滴具有独特的特征。如果在PCR扩增或扩增后的解链分析期间发生任意移动，则该特征将可用于跟踪微滴。可使测定中独特微球编码的数目和微球的总数目最优化，以确保最小的分区特征重复。

或者，代替微滴，可通过例如对硅、金属或玻璃的可控刻蚀或者通过常规或微注射成型技术在平面上以静态阵列形成区室或分区。形成静态阵列或反应室的数种不同方式已描述于例如如U.S.9,039,993、PCT/US2003/041356、US6391559、EP2906348、US9643178和Du.Et al.2009“SlipChip.”Lab on a Chip 9(16)：2286中，其通过引用并入本文。最佳地，分区紧密邻近地堆积(pack)以降低总表面积，并且可通过微流控通道连接以改善分区填充。在之后的实施方案中，可使用方法例如描述于U.S.9,163,277中的那些以确保填充之后分区的完全分开。

如上所述，聚合酶链式反应(PCR)是可在分区内进行的反应的一个实例。特别地，分区可用于数字PCR(digital PCR，dPCR)技术中。dPCR涉及对样品进行分区，使得样品中包含的单独核酸分子定位于许多分开的区域，例如微孔板或微分区中的单独孔中，乳剂的分散相中或核酸结合表面的阵列中。理想地，每个分区将包含靶核酸的0或1个拷贝，分别提供阴性或阳性反应。与常规PCR不同，dPCR不依赖于扩增循环的数目来确定样品中靶核酸的初始量。因此，dPCR消除了对指数数据的依赖以对靶核酸进行定量并提供了绝对定量。对乳剂中珠上之核酸进行克隆扩增的珠乳剂PCR(Bead emulsion PCR)是其中将反应分配至微滴中的dPCR技术的一个实例。参见，例如，美国专利No.8,048,627和7,842,457，其通过引用并入于此。当在乳剂中进行dPCR时，乳剂应是热稳定的，以使其承受热循环条件。

存在在乳剂中或静态阵列上进行dPCR的多种方式。在任一情况下，均将DNA样品稀释至合适的浓度，与PCR试剂(引物，dNTP等)混合，并相应地使分区成许多离散的反应样品。对分区进行PCR热循环，并通过如上所述的荧光(或其他合适的报道子)成像来检测扩增子。在本文可切割探针实施方案的背景下，通过探针的荧光(或其他合适的报道子)的变化来检测扩增子。

分区的热循环可通过本领域已知的任何合适的技术来进行。例如，分区可在管或室中进行热循环，然后可进行加热和冷却。在一些实施方案中，该方法采用连续流扩增来扩增核酸模板。已经报道了连续扩增的多种方法。例如，美国专利No.7,927,797(其通过引用并入本文)描述了与连续流PCR结合使用的油包水乳剂。或者，微滴可以以2D阵列进行布置并且使用平板式热循环仪(flat block thermal cycler)进行热循环，如在基于静态阵列的数字PCR中用于热循环的方法中一样。等温反应(例如，滚环扩增、全基因组扩增、NASBA或链置换扩增)也可在微滴或静态阵列分区中进行。该系统在提高或降低温度以获得分区内探针的解链曲线的同时，还可用于监测微滴或分区，从而允许进行多重检测和定量。探针本身可在微滴或分区中用于等温扩增信号，使得不需要另一些形式的扩增(例如PCR或其他等温扩增反应)来检测微滴或静态阵列分区内靶标的低拷贝数。

III用于定量的离散解链方法

解链曲线(解离曲线(dissociation curve))绘制了当反应温度升高时，当双链DNA解离或“解链”成单链DNA时观察到的荧光变化。例如，当在存在嵌入染料的情况下缓慢加热双链DNA时，随着达到解链点(Tm)且染料从双链体中解离，检测到荧光的突然降低。因为核酸的Tm受长度、GC含量和碱基错配的存在等因素的影响，所以不同的双链体核酸可通过其不同的解链特征来区分。扩增后解链曲线分析也可用于将引物二聚体伪影(artifact)和非靶核酸与靶标来源扩增子区分开，以确保反应特异性。此外，通过解链曲线分析而对反应产物，例如引物二聚体相对于扩增子的表征降低了对费时的凝胶电泳的需求。实时PCR测定的特异性由所使用的引物和反应条件来确定。然而，总是存在即使设计良好的引物，也可能形成引物二聚体或扩增非特异性产物的可能。在进行qRT-PCR时，也存在RNA样品包含也可被扩增的基因组DNA的可能。qPCR或qRT-PCR反应产物的特异性可使用解链曲线分析来确定。

高分辨解链曲线(high-resolution melt curve，HRM)分析是用于鉴定单一核苷酸差异(例如SNP、新突变和甲基化模式)的均质扩增后方法。HRM分析是传统解链曲线分析的一种更灵敏的方法，其中，针对双链DNA解离成单链DNA的温度(Tm)，对双链DNA进行监测。在HRM中，扩增反应在连续监测荧光的同时，进行小的增量温度提高(通常为每分钟0.1至0.5℃)。在存在结合双链核酸的嵌入染料的情况下，荧光会缓慢降低，直到温度接近双链体Tm为止，而在Tm处，随着样品从双链DNA过渡至单链DNA，观察到荧光急剧降低。由于Tm尤其取决于核苷酸序列和双链体中错配核苷酸的存在，因此可在HRM分析中随着Tm的变化或是解链曲线形状的变化检测突变。与传统的解链曲线分析相比，HRM可提供扩增子之间的单核苷酸区分。

通过以许多温度间隔(以2℃间隔或更小，例如以1℃、0.5℃、0.3℃、0.2℃或甚至0.1℃间隔)进行荧光测量，可跟踪荧光强度变化的速率(即，相对于温度的荧光强度的导数)，并确定发生显著解链活性的温度(Tm)。相对于温度的相对荧光单位(relativefluorescence unit，RFU)的导数图中的峰对应于靶双链体的解链温度(Tm)。例如，图1A和1B示出了在包含解链温度分别为65℃、75℃和85℃的3个靶探针的样品中，随着温度提高，基于连续监测荧光，RFU相对于温度以及相对于温度的负导数的图。将针对特定探针或双链体核酸测量的Tm与预期Tm的比较用于确定靶核酸是否被扩增。

传统上，在dPCR应用中，已使用单独分区中荧光的扩增后终点测量来确定样品中靶核酸的存在或不存在。最近，使用嵌入染料进行的解链分析已被用于特异性鉴定dPCR中的靶核酸。为了区分纯噪声与解链事件的实际存在，可为RFU图和负导数图之一或二者设置阈值。对于RFU图，信号阈值可通过使用经斜率校正的对照曲线的标准差的百分比，例如标准差的200％、300％、400％、500％、1000％或2000％来选择。如果确定荧光强度在给定的解链温度窗口(例如，对于预期其解链温度为65℃的靶探针，为60至70℃)内已超过阈值量变化，则可认为靶标是存在的。对于负导数图，信号阈值可通过使用对照样品的经斜率校正的RFU曲线的负导数的标准差百分比，例如标准差的200％、300％、400％、500％、1000％或2000％来选择。然后，如果确定任意负导数低峰大于低于零的阈值大小(thresholdmagnitude)，则认为相关靶探针发生了阳性解链事件，并且确定相应靶标存在于该分区中。可通过考虑历史数据并使用负导数解链峰的典型大小的一部分来替代地设置阈值。例如，针对该特定靶探针，可将阈值设置为平均负导数解链峰大小的10％至50％中的任意处。

US2016/0310949描述了在数字微流控系统中使用从传统的或高分辨解链分析(HRM)中产生的独特解链特征，以在dPCR中实现定量多路复用。WO2015023616描述了其中使用通用引物对靶核酸进行非特异性扩增，并且HRM分析用于鉴定单独细菌物种的数字系统。将包含靶核酸的单独孔中的解链特征与标准解链曲线进行比较，以鉴定存在的靶序列。单独细菌物种的准确鉴定需要仔细比较独特靶标之间的解链曲线，并且因此依赖于高分辨解链数据，通常为ΔT＜1℃。

离散解链分析(Discrete Melt Analysis，DMA)提供了用于进行解链分析的改进方法，该方法需要较少的荧光相对于温度的测量，并且因此导致更快的数据收集和分析，并且因此提供了更低的用于测定的周转时间。从概念上讲，DMA代表连续解链或HRM分析的欠采样(under-sampling)。与后两种方法相比，DMA需要测量每个靶标在仅2个温度下的荧光，而无需计算Tm即可鉴定靶核酸。在(1)代表该靶标的所有探针或双链体核酸均处于杂交双链体构象的温度下和(2)代表该靶标的所有探针或双链体核酸均处于单链构象或完全变性的温度下采集特定靶核酸的荧光图像。使用区分这2种构象的合适的标记方案，允许在存在靶标的情况下检测两个测量温度下构象的变化。针对具有单一靶标特异性探针的样品(左)和具有可通过具有独特Tm来区分的3个靶标特异性探针的样品(右)，该概念示出于图2中。

DMA特别良好地适合于使用探针例如描述于美国申请No.14/82,288中的那些而进行的解链分析，所述申请通过引用并入本文，并且提供了在数字扩增系统中进行多路复用的有效且具有成本效益的手段。

本发明方法可使用具有预定的独特解链特征的可切割探针，以鉴定数字PCR中单独分区中特定靶核酸的存在。在一些特定的方面中，本发明方法涉及使用来源于在仅两个温度下获取的荧光图像的离散解链特征，而不是在多个温度下获取的多个图像的离散解链特征，来确定靶核酸的存在。DMA的使用特别不需要获取所检测的双链体核酸或探针Tm处的荧光图像。

靶标特异性可切割解链探针的使用提供了两种提高特异性的机制，因为靶标特异性探针可降低检测非特异性扩增产物的发生率，而由这样的探针实现的离散解链分析提供了确定存在和鉴定所检测靶标的有效手段。此外，本发明方法可使用靶标特异性可切割探针来增强dPCR应用中的多路复用能力。

因此，本发明方法可用于检测反应混合物中的一个或更多个靶标。该方法可应用于qPCR和dPCR反应二者。对于dPCR反应，可使用单一荧光通道在单一分区中检测三个或更多个独特解链特征，这意味着最低具有四个不同的荧光通道，可在单一分区中检测12个独特的靶标。

重要地，本文中所述的方法提供了对需要在进行温度的增量变化时获取大量图像的费时的解链分析的解决方案。该方法被认为特别地可用于其中传统和HRM解链曲线分析的图像获取和数据处理是费时且计算上密集的dPCR应用中。DMA需要获取最少n+1个图像以进行靶标阐明，其中n＝以同一波长发射荧光的不同靶标特异性探针的数目。这可显著降低确定靶标存在所需的图像数目，而不会牺牲准确鉴定靶标和对其定量的能力。与传统解链分析和HRM相比，本发明方法可替代地使用在高于和低于预定探针Tm的温度下进行的离散荧光测量，并利用强度的阶跃变化(step change)来指示特定靶标的存在。

在一个实施方案中，对可切割的探针(例如描述于美国申请序列号No.14/823,288中的那些)进行设计，以使得在靶标杂交介导的切割，随后支持经切割探针的延伸的发夹形成之后，对第一靶标具有特异性的探针表现出与反应混合物中对任何其他靶核酸具有特异性的探针相差至少5℃的Tm。在这些条件下，在多重检测方案中每个探针集合的解链曲线导数图会产生可彼此区分的高度差异化的解链峰。在一个优选的实施方案中，不同的探针Tm相隔约10℃，以使得在被设计成在较高的Tm下解链的探针开始变性之前，在同一Tm下解链的所有探针完全变性/单链化。通常来说，探针包含在扩增反应混合物中，并且在扩增之后，用于确定反应混合物中经修饰探针的解链曲线。可切割探针表现出不同的荧光强度，这取决于它们是否遇到了它们的同源靶核酸并且是否被切割和延伸。在图2至7中所示的实施方案中，探针在不存在靶标的情况下表现出荧光作为具有偶联至探针的5’端的荧光报道子的结果，并且在延伸期间通过并入淬灭剂来淬灭荧光。

图像获取

在DMA中具有预定Tm的探针的使用允许以低于和高于预定解链峰的温度间隔测量荧光，以阐明扩增之后靶标存在。图2的左图示出了在具有预定Tm的单个探针的解链分析期间获取仅2个荧光图像(在由X表示的温度下采集)。注意图像获取不会在探针的预测Tm处发生。图2的右侧图示出了对于包含各自分别具有独特解链峰(Tm1＝65℃、Tm2＝75℃和Tm3＝85℃)并且可在同一荧光通道中检测到的三个探针的反应混合物，仅需要四个图像即可生成解链曲线。在温度T1下获取第一图像，该温度处于或略低于PCR扩增中使用的引物的退火温度，并且在该温度下已遇到其相应靶标的所有探针在扩增之后均处于杂交双链体状态。在温度T2下获取第二图像，在该温度下Tm1探针将变性，但具有Tm＞Tm1的探针保持杂交状态。在T3(Tm2与Tm3中间的温度)下获取第三图像。在大于Tm3并且在该温度下所有探针将变性的变性温度T4下获取第四图像。在dPCR应用中，针对所有四个获取的图像，测量单独分区中的平均荧光强度。

在另一种方法中，当使用可切割探针(例如美国申请序列号14/823,288(通过引用并入本文)中所描述的那些)时，初始图像和相关荧光可在扩增之前获取，并且代表了反应中所有探针的最大荧光。该荧光测量在理论上等同于在温度T4下获取的图像，在该图像中，反应中的所有探针均被完全变性并显示出最大荧光，而不管它们是否遇到其同源靶标。在扩增之后，可以在温度T1、T2和T3下获取后续图像，用于与扩增之前采集的图像进行比较，以测量随着温度升高探针从双链体构象转变为单链构象时荧光的变化。可以将预扩增图像对所有探针均完全变性的高温(T4)图像的这种替换应用于以下的任何测定形式：其中未经修饰(预扩增)的探针最大程度发荧光并且那些相同的探针一旦经修饰就显示出基于它们是否遇到靶标的信号的变化。

测量温度的选择可以基于先前的临床或实验室数据，所述数据显示出对于每个探针，RFU相对于温度图的最平坦区域出现在解链峰的任一侧(即，低于最低解链温度，以及高于最高解链温度)。或者，也可以基于负导数曲线的峰(Tm)侧的最高点(最小负值)来选择测量温度。即使没有跨越整个相关温度区域的先前的高分辨率RFU和/或导数数据，仍然可以通过为反应混合物中的每个探针选择低于和高于预定解链温度的温度来简单地选择测量温度。计算机建模数据可以进一步支持此过程。虽然图2示出了待以均匀间隔的温度间隔获取的荧光图像，但这不是必需的。

图2中所示的荧光强度图已被理想化，其中在低于和高于靶标解链温度的温度下的荧光几乎没有变化，从而导致相对较浅、几乎平坦的斜率(斜率接近零)。然而，实际上，荧光报告染料的光漂白和/或温度依赖性可在相关温度范围内改变荧光的斜率。可以在解链分析之前将斜率校正和/或归一化应用于荧光强度相对于温度的原始数据，以更清晰地鉴定解链特征。

图3至7举例说明了用于在dPCR应用中使用DMA确定输入靶标拷贝数的图像分析过程。图3示出了针对图2所述的相同的三个靶标A、B和C，其以多种组合分布在36个分区中，包括没有靶标的4个分区(空分区)。在该实例中，一些分区仅包含靶标A、靶标B或靶标C，一些包含两个靶标(AB、BC或AC)，一些包含三个靶标(ABC)，并且一些在扩增之后不包含靶标。可以使用针对图2所述的相同探针来检测靶标，这些探针被设计为具有独特的解链温度Tm1、Tm2和Tm3，其中Tm1＜Tm2＜Tm3。

在该实施方案中，图像分析过程通常涉及比较在靶标扩增之后在高于和低于给定靶标探针或双链体的预期解链温度的温度下获取的两个荧光图像。最初，在低于Tm1的温度T1(在该实例中为60℃)下获取起始荧光强度图像。图4举例说明了在扩增完成之后图3中所示系统的单独分区中在T1下的荧光强度。图4中所示的图像表示所有探针均为双链体(发夹)构型的情况，其中仅未切割、未延伸的探针(即不存在其靶标的探针)发射荧光。在此情况下，来自所有三个靶标的在其相应靶核酸存在下已被切割且延伸的探针的荧光将被淬灭，导致相对于不存在靶标的情况或被切割且延伸的探针变性的情况的降低的荧光强度。接下来，温度升高至高于Tm1但低于Tm2的温度T2(在该实例中为70℃)，并且获取第二图像(图5)。在此温度下并且在靶标A的存在下，靶标A特异性探针将变性，并且由于淬灭的损失将显示出荧光的相对提高。

为了确定对靶标A的测试为阳性的分区数目，执行以下图像处理步骤：i)计算单独分区中的平均像素强度，其被定义为单独分区中的积分像素强度值除以分区图像中的像素数目；ii)确定T2与T1下的平均荧光强度之比(F_T2/T1)；iii)绘制图像比较结果，以鉴定在整个温度测量窗口中示出了荧光强度变化的分区。或者，可以从在T2下获取的荧光值中减去在T1下采集的荧光值(_FT2-T1)(使用平均强度值)，而不是使用比值。平均强度值还可以仅询问分区内的像素或感兴趣区(region of interest，ROI)的子集。或者，在本文中所述的所有分析中，积分强度可以替代平均强度。最终，可以在图像之间基于逐像素(pixel-by-pixel)基础直接进行相比(ratio)或相减，并且可从产生的图像中确定分区强度(平均或积分的)。

在图3至7中，荧光的变化表示荧光的提高，因为发夹探针在每个末端变性处都包含荧光团和淬灭剂，从而使荧光团和淬灭剂分子分离。当然，也可使用由于解链分析期间双链体变性而导致荧光强度降低的替代检测化学和标记方案。

在T2下获取的图像还表示在低于解链温度为Tm2的靶标B的预定Tm的温度下采集的图像。可以在高于和低于每个探针的预定Tm的温度下对每个靶标执行相同的通用程序。DMA的一个特点是，在高于指定探针的预定Tm的温度Tx下进行的测量也可用作在低于探针(具有高于Tx的Tm)的预定Tm的温度下进行的测量，因此不必对每个探针进行至少2次测量。因此，如果反应混合物包含n个具有不同Tm的靶标特异性探针，则仅需要在n+1个不同的温度下获取荧光图像。图6是图3中所示系统的图像比较的一个实例，其中将在T2(70℃)下计算的平均荧光强度除以在T1(60℃)下计算的强度，以确定哪些分区示出了强度变化。所得的1D振幅图(图6，底部)包含两个强度下的分区的簇，其对应于对靶标为阴性(连续图像之间荧光强度无明显变化导致比值接近1)或对于靶标为阳性(连续图像之间荧光强度的变化导致比值＞1)的分区。可以通过设置手动阈值或通过使用基于算法的方法(例如k-平均值聚类)将分区分类为这两个组。一旦在低于和高于所有靶标探针的各自Tm的温度下获取图像，就进行图像分析以比较图像的各自的组并计算每个测量组的荧光强度比(图7)。对图像的组之间的分区强度的比进行绘制允许计算阳性和阴性分区的相应数目。一旦知晓了对于每个靶标的测试为阳性的分区数目，就可使用泊松统计来估计每个分区的靶标输入拷贝的平均数目λ。等式1可以单独应用于每个靶标。重要的是要注意，假设靶标A、B和C在分区之间的分布是独立的，并且因此，在等式1的计算中对靶标A可为阴性的分区对于靶标B或C或二者可为阳性。但是，这不影响单独靶标的定量。

通过等式2中的表达式给出了在平均载荷(λ)的+/-Z标准偏差内的置信区间，其中λ_CIL是置信区间的下限，而λ_CIU是置信区间的上限。对于95％的置信区间，Z＝1.96。可以用Z的适当替代来获得替代的置信区间。如果分区的体积保持恒定，则随着分区数目的提高，置信区间变窄。因此，提高分区数目将是提高估计每个分区的平均输入靶标拷贝的精确度的一种方法。

为了量化精确度，等式3中的表达式比较了置信区间的跨度与每个分区的靶标拷贝的平均数目。较小的值表示较高的精确度程度。尽管相对标准偏差和相对置信区间可在可定量检测的极限处显著提高(即，极少的靶标阳性或极少的靶标阴性分区)，但在这些情况下，误差的大小可仍然是可接受的。例如，当尝试检测极其稀少的靶标时，靶标的简单存在本身可能已经是非常有价值的信息，而与误差的程度无关。

数据分析

还提供了使用在dPCR扩增之前和之后获取的图像来优化数据分析的策略。这样的策略包括使用扩增之前或之后获取的图像来对在解链分析期间测得的荧光强度进行归一化(参见实施例2)，并建立背景(阴性分区)阈值以使用扩增之前和之后的图像来将阳性和阴性信号与背景区分开(参见实施例3)。另外的实施方案(参见实施例4)提供了用于校正在解链分析期间获取的图像的方法，以解决温度曲线上温度和光剂量依赖性的荧光强度变化。例如，已知FAM对光非常敏感，其随着光暴露的提高显示出降低的荧光强度，并且许多染料(例如FAM和HEX)在较高的温度下显示出降低的荧光。

实施例5提供了用于比较扩增之前和扩增之后的图像以初步鉴定包含0或3个靶标的分区的方法。可期望从进一步的分析中消除这样的分区，以简化并降低数据分析所需的时间。不被包含在数据分析中的分区的初步识别也可用于限制解链步骤期间获取的图像的数目，因为对于这些分区无需获取图像。因此，由于被认为适合于产生可用的数据，因此该方法允许仅来自感兴趣的分区的图像获取。在某些实验条件下，这可大大降低解链获取时间和后续数据分析。

因此，本发明方法提供了对于一个或更多个靶标为阳性或阴性的分区的改进分类，这导致了改进的定量。与依赖于DNA嵌入染料以进行解链分析的方法不同，本发明方法利用靶标特异性探针的解链分析来增强特异性，同时在测定设计(例如引物区域，扩增子长度等)中保持灵活性。另外，所描述的方法依赖于使用低分辨率数字解链曲线来检测和鉴定靶核酸，这简化了解链数据的获取和分析，并最终导致更快的数据获取和数据分析。

DMA相比于传统的连续解链分析需要更少的数据点，这降低了数据获取所需的时间，并产生了更少的待处理图像和光敏报告探针的更少的光漂白。这在基于成像的数字PCR方案中特别有用，在该方案中，在每个解链温度下处理许多分区(即，微滴或静态阵列分区)图像。dPCR反应的解链分析通常需要在解链曲线的每个温度下在分区的阵列上获取图像。根据分区的数目，在其上获取图像的区域可能很大。此外，图像必须具有足够高的分辨率，以确保可靠地将分区鉴定和分配为对于靶标为阳性或阴性的。这通常需要获取每个分区阵列的多个图像。此外，为了在数字以及总体积测定中实现多路复用，需要在多个荧光通道中获取图像。通过降低解链分析所需的图像获取事件的数目，DMA在数字应用中具有特定的价值，因为它减少了获取解链数据和处理所获取图像所需的时间。

DMA的使用还提供了一个优点，即样品暴露于具有较少潜在破坏性的光和高温。一些常用的荧光团(例如FAM)是光敏的。这种光敏性在数字PCR中很重要，因为与总体积PCR相比，每次荧光测量都要询问整个样品，在总体积PCR中，通常询问小于总体积的聚焦体积(focal volume)。这种差异是至关重要的，因为在后一种情况下，荧光团是自由的以扩散到聚焦体积中或从聚焦体积中扩散出来，并且平均接收的激发曝光更少，并因此不太可能经历光致漂白。数字PCR反应中的荧光团暴露于提高量的入射激发(尤其是如果进行解链分析)，并且因此更容易经历光漂白。DMA降低了曝光事件的数目，并因此降低了荧光团所经历的光漂白的程度。在一些情况下，荧光探针反复和连续暴露于高温也具有不良作用，其可通过DMA来缓解。

使用具有可切割探针的DMA的另一个优点是其提供了增强的特异性。美国申请No.14/82,228中描述的可切割探针仅在存在靶DNA的情况下被切割和延伸，但不使用靶DNA作为延伸的模板。因此，这样的探针具有即使在存在靶核酸序列变异的情况下也不改变的非常可预测的Tm。相反，具有至少部分地由靶核酸或其扩增产物的组成决定的Tm的核酸双链体和探针/靶标双链体由于较小的靶序列变化而可在样品之间显示出Tm的变化。出于该原因，HRM通常需要确定解链峰以证实样品中未知靶序列的身份。相反，与可切割探针组合的DMA的使用不需要确定解链峰Tm以确定靶核酸的身份。DMA需要仅在低于探针的预期Tm的温度和高于探针的预期Tm的温度下获取的荧光强度值以确定两个值之间的比值或差异，以将阳性样品与阴性样品区分开。DMA还可包括在另外的预先选择的温度下获取荧光强度值，但是不需要确定解链温度来鉴定靶标。此外，在一些实施方案中，可以在扩增之前而不是在反应中所有探针均变性的温度下获取荧光强度值。

然而，DMA不限于dPCR实施方案。它还可容易地应用于实时PCR和qPCR解链分析应用，以减少获取数据以进行解链分析所需的时间。该方法还可应用于其他基于探针的检测方法，例如分子信标(Molecular Beacon，MB)、TaqMan、TOCE技术，以及可应用于DNA嵌入染料(例如SYBR或EvaGreen)的特定用途。

分子信标探针可被设计成具有独特的预定解链温度。但是，由于使用MB探针的解链分析反映了探针与已与其杂交的靶序列的解离，因此解链温度由靶序列决定，并因此在设计上受到限制。由于温度在MB探针解链分析期间升高，随着MB探针与靶标解离并采用无规卷曲构型，荧光降低。类似地，对于使用TaqMan探针的解链分析，解链曲线由旨在被检测的靶序列决定，并且因此探针设计受到限制。使用分子信标和TaqMan探针的解链分析描述于Huang et al.，PLoS One，6(4)2011中，其通过引用并入本文。被设计为具有预定解链曲线的MB和Taqman探针也可用于DMA，因为DMA不需要确定特定的双链体Tm，因此靶序列的微小变化不会产生显著的有害作用。

DMA也可以与在WO2012096523(其通过引用并入本文)中描述的TOCE探针一起使用。上游引物在其靶核酸的存在下的杂交和延伸导致下游杂交的投手(pitcher)寡核苷酸的切割以释放标签寡核苷酸。随后，标签寡核苷酸与经标记的探针或捕手(catcher)寡核苷酸杂交，其用作标记区域延伸的模板，以产生具有预定Tm的双链体核酸。多种标记方案可用于支持双链体核酸的解链分析。例如，标记区域的延伸可导致无规卷曲的经标记探针的淬灭剂和荧光团的分离，从而导致荧光。因此，可通过检测作为双链体形式的荧光提高来实时检测扩增，并且当无规卷曲探针重新采取无规卷曲构型时，可将解链分析检测为荧光降低。由于捕手寡核苷酸是靶标非依赖性的并且可被设计为具有预定的Tm，因此该检测方法非常适合用于DMA。

DMA也可以与嵌入染料例如SYBR或EvaGreen一起使用。靶标的鉴别可通过扩增具有不同长度或序列组成并因此具有不同Tm值的靶标区域来实现。扩增之后，可以在离散解链分析中使反应混合物经历升高的温度，以测量与双链扩增子或双链解离相对应的荧光强度的变化。DMA可用于嵌入染料和基于探针的检测方法，因为信号可以在高于和低于感兴趣的双链体的预定Tm的离散温度下检测，感兴趣的双链体的预定Tm可被设计为在包含非靶标扩增产物例如引物二聚体(其Tm通常比真实的靶标双链体低)的Tm范围之外。例如，在解链分析中，非靶标假双链体的Tm可在60至75℃的温度范围内。感兴趣的靶标扩增子或双链体可被设计为具有83℃的Tm。在这种情况下，DMA可以以整体反应或以dPCR形式于78℃和88℃下进行。这种分析方法将避免以快速且有效的方式获取与非靶标扩增事件相关的信号，其特异性优于单温度测量，并且其速度和处理优于高分辨率解链分析。

尽管DMA可应用于非数字或同质测定化学方法，例如闭管或实时总PCR方法，但DMA在数字扩增应用中特别有用，因为它为精确计数用于量化反应中靶标的起始浓度的阳性分区提供了特别的优势。

另外，本文中描述了用于使用多种分析技术来量化和改善dPCR中靶核酸的定量的多种方法。

A.用于在dPCR中使用对照的方法

对于将样品处理和dPCR并入到单个仪器和工作流(样品到答案)中的dPCR系统或保持样品处理与dPCR工作流分离的系统，描述了在dPCR中使用对照的策略。所描述的所有方法均旨在优化使用dPCR、特别是采用了解链分析来鉴定单个反应室或分区中多个靶标的dPCR系统的靶标定量的精确度。本文中所述的方法依赖于校准染料、探针和对照靶标以产生参考数据集和标准品，通过该参考数据集和标准品可测量仪器性能。用这些染料、探针和靶标进行的测试可与样品反应分开进行，或者与样品反应同时进行，以验证系统性能，包括样品处理、光学和热控制。一个优选的实施方案包括与样品测试反应同时运行的对照反应，以及与样品测试反应分开运行的对照反应。

目前的dPCR系统不具有如本文中所考虑的在单个反应中包含多个对照的优点，因为其多路复用能力受到限制。因此，现有的dPCR方法需要将这样的对照包含在独立的孔或芯片中，而不是包含在样品反应中，这可导致样品与对照性能之间的变异性。同样地，由于qPCR反应依赖于总体积PCR反应中包含的对照，因此包含多个对照的能力也受到可用的多路复用的程度的限制。

校准染料和探针的组可用于产生参考数据集，通过该参考数据集可在合适的频率下监测仪器性能。该染料和探针的组可包含标记有短寡核苷酸序列以使系统特异性染料可溶于水的系统特异性染料以及被设计成表现出解链曲线(解链校准对照)范围以进行适当的校准的多种发夹探针。

校准染料的组可用于确保仪器正在检测并报告所有通道上的预期荧光强度。每个通道的不同校准染料可包含在对照样品中，并且所测量的强度可与在期望的温度范围(例如55至95℃)的上端和下端处的先前确定的强度进行比较。如果任一种测量偏离到预期值的预定可接受范围之外，则这可表示仪器、试剂混合物或操作条件存在问题。此外，可使用校准染料来归一化和/或调整原始测量值以使得可针对整个参考数据集(例如，期望的解链幅度和靶标或探针的温度)适当地评价测量结果。

在另一个实施方案中，具有已知解链曲线和解链温度的一个或更多个解链校准对照包含在反应混合物中或在单独的分区中。评价dPCR应用中的解链校准对照的一种方法是执行连续的解链分析，以在荧光导数相对于温度的图中确定解链峰。一旦确定了精确的所观测的解链温度，则将其与预期值进行比较，并且观测值与预期值之间的任何差异都将用于将温度校正应用于所有测量。如果需要的话，可包含多于一个的解链校准对照，以确保整个解链分析温度窗口内的准确的温度校正。但是，当使用解链对照执行DMA时，可难以使用确定解链峰的标准方法来准确地确定任何必要温度校正的范围。

为了克服该限制，用于DMA的解链校准对照应被设计为在狭窄的温度范围(包括(在5℃内解链＞90％)用于DMA分析的测量温度)内解链。由于DMA不能测量在靶标特异性探针Tm处的荧光，因此将解链校正剂的Tm限制在DMA测量温度的狭窄范围内(T1、T2、T3和T4)确保了解链校正剂的荧光为对系统热波动最敏感的。与来源于解链校准剂的参考值相比的荧光强度值的波动将确定热变异性程度。如果热变异性在预定的公差规格(tolerancespecification)之内，则可以认为解链分析已完成。但是，如果解链校准剂值表明热性能的变异性，则可在适当调节的温度下重复解链分析，或者可应用适当的校正因子。为了最准确地量化温度波动，重要的是确保针对特定通道确定的最小和最大荧光强度与该通道的预期强度(参考情况)相匹配。这些解链校准对照可作为系统维护和校准的一部分独立地被评价，或者如果保留了通道中或跨通道的期望数目的解链，则这些解链校准对照可作为板载(on-board)对照被包含在内并且与所有样品一起被处理。

最佳的是与样品测量一起同时测量解链校准对照，因为单独的实验条件可导致结果偏离预期。例如，在极端情况下，寡核苷酸和盐的浓度可改变解链温度多达10至20℃。在一种方法中，包含已知其预期Tm的解链校准对照。为了避免与受试靶标混淆，可选择解链校准对照以使得照明通道和发射波长区域与靶标的发射波长不一致。例如，可以将FAM标记的预期解链温度为84.1℃的对照包含在受试分析物中，或者其可单独进行测量。可以确定可接受的范围，例如+/-2.5℃或81.6至86.6℃。然后，如果原始解链数据(例如，通过以0.5℃的增量从55至95℃进行测量而获得的)显示了荧光的负导数相对于温度的图中83.1℃的设定点温度下的解链峰，可计算根据需要移动设定点温度所需的温度校正ΔT_corr。在该实例中，从设定点温度中减去预期温度产生ΔT_corr＝83.1-84.1℃＝-1.0℃的温度校正。通过-1.0℃的温度校正来调整将来的设定点温度，预期的解链应在预期的温度下发生。如果对照重复进行但这次考虑了温度校正，则对于在84.1℃的数据点，我们计算出的温度校正指示对于我们的设定点，应使用84.1℃+ΔT_corr＝84.1-1.0＝83.1℃，其随后将在我们期望的84.1℃数据点处产生解链峰。

如果需要的话，可以包含多于一个的解链校准对照，以不仅确保适当的温度校正，而且确保预期的解链峰之间的适当温度差。例如，第一解链校准对照可以是FAM标记的对照寡核苷酸，其预期解链温度为84.1℃，并且第二解链校准对照可以是AP-593标记的寡核苷酸，其预期解链温度为71.0℃。由于我们预期温度差为13.1C，因此所观测到的解链峰之间的该值的任何实质性偏差都可表示系统存在问题，例如不良或不合适的温度升高——例如，松散的电线可能输送比所需更少的电流到热电加热/冷却单元，从而输送比给定设定点的预期更少的热和更低的温度。

用于热校准的一种替代方法依赖于使用良好表征的、对温度敏感的荧光染料。用于该用途的示例性染料是罗丹明和AP662。这些染料在解链分析范围内显示出稳健的、可重现的温度依赖性荧光。与预期的染料性能的偏差用于相应地调整系统的热量。

即使对于相同的输入靶标浓度，实际的浓度测量也可由于包括以下的多种原因而变化：提取和纯化过程的变异性；操作条件的变异性；所观测到的解链温度对寡核苷酸浓度和/或盐浓度的依赖性；设备效率的变异性。由于这些原因，本公开内容的另外的实施方案提供了用于包含和使用对照来确定如何补偿或校正所测量的输入靶标值以最佳地比较和解释结果的方法。通常，这些方法包括使用样品处理的不同阶段中包含的核酸对照。

一种方法包括包含在反应混合物中具有可再现的已知浓度的样品处理对照以确定样品制备效率。通过将测得的对照的最终浓度与已知的输入进行比较，可将适当的校正应用于针对样品计算的未知分析物的浓度。可通过将对照的预期输入值除以测定中获得的测量值以获得乘数值来获得此校正。可将乘数值应用于泊松校正之后针对每种分析物获得的初始值，以获得样品制备效率校正值，该值将更准确地反映患者样品中每种分析物的真实浓度。可以在与通常添加样品相同的阶段添加样品处理对照。例如，其可手动添加，或者其可通过自动化过程从药筒中的指定孔机械地添加。其可以是液体形式，或者是干燥或冻干的状态。或者，可使用预期在感兴趣的样品类型的相对稳定浓度下的内源性核酸对照。

另外，该方法可包括在PCR主要混合物(master mix)中添加包含寡核苷酸靶序列和相应的靶标特异性探针的扩增对照(样品处理之后)，以表征已知浓度对照靶标的阳性和阴性分区的分布。通过添加已知浓度的对照靶标，阳性和阴性分区的预期荧光强度可被确定，并用于设置初步阈值以对未知靶标进行分类。此外，初步阈值可用作初始分类阈值，其随后使用手动阈值或基于算法的方法进行调整。在任何情况下，用于设置样品处理对照或扩增对照的示例性理想浓度将是具有1.59的λ(每个分区的预期拷贝)值的浓度。在此值下，数字PCR达到了最高的定量精确度(Majumdar et al.，Digital PCR Modeling forMaximal Sensitivity，Dynamic Range 2and Measurement Precision，PLOS One，2015)，这意味着归因于样品处理的变异性将最远离泊松分布的固有变异性。这些对照可在单个Tm处被包含在单个荧光通道中或跨越所有荧光通道。在前一种情况下，先前所述的使用校准染料验证过的数据集将允许使用者将单荧光通道数据外推至其他荧光通道。

或者，对于未知靶标，在测量温度极限处的阳性和阴性微滴的分布及其强度可产生有价值的信息，以最佳地解释结果。例如，假设至少一个分区对所有靶标测试均为阴性的，则靶标阴性分区的荧光强度可用作内部对照。可确定靶标阴性分区的平均强度，并将其与参考或历史情况进行比较。测量值和历史值之间的差异可指示操作条件、样品组成或设备问题的变化。靶标阳性分区的荧光强度可类似地与参考或历史情况进行比较以评价系统性能。

由于分区的二维阵列上照明或荧光测量的不均匀性，图像可示出一定程度的变异性。当将多个图像缝合(stitch)在一起以创建单个样品的所有分区的聚合图像时，这种变异性将具有更大的影响。在校正这种变异性的一种方法中，在进行分区之后但在核酸扩增之前获取的图像可用于将扩增之后获取的图像归一化。计算扩增之前的图像中所有分区的平均分区强度，并将其除以单独分区中的平均强度。所得的分区特异性比值可用于将后续获取的图像的强度归一化，以解决任何照明或测量引起的不均匀性。在最终的仪器实施方案中，相同的策略可用于每个通道。

在另一个实施方案中，不依赖于所包含的探针预扩增的固有荧光信号，而是使用被动(passive)参考染料来校正荧光的不均匀性。内部参考染料可用作所有荧光测量的不可知通道强度归一化因子，与在现有实时或定量PCR仪器中使用被动参考染料几乎一样。另外，在微滴的实施方案中，由于基于探针的荧光测量将相对于依赖于探针Tm的扩增状态和温度而变化，因此被动参考染料可用于有助于微滴鉴定。

在并行处理多个样品的某些dPCR系统中，可保留单个样品孔以包含本文中所述的对照类型。在一种方法中，可保留微流控装置(例如US9039993中所述的)中的孔/分区用于荧光归一化和热校准。与样品孔中包含的内部对照几乎一样，该孔可包含可用作所有荧光测量的不可知通道强度归一化因子的被动参考染料。可包含一个或更多个解链校准剂以解决任何热变异性。通过确定校准剂的已知解链峰和校准剂的所测量解链峰之间的差异，可以将这种或这些解链校准剂的所测量峰用于热校准。沿温度轴的简单翻译可解决天与天之间(day-to-day)的小的变异性。

IV.实施例

包含以下实施例以说明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，以下实施例中所公开的技术代表发明人所发现的在本发明实践中良好地发挥作用的技术，并且因此可被认为构成其实施的优选方式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，可在所公开的特定实施方案中进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果而不脱离本发明的精神和范围。

实施例1-使用在核酸扩增之前或之后获取的图像对图像进行归一化以改善分区分类的方法

在实时PCR中，使用被动参考染料(例如ROX)的孔间归一化使由于光学和反应体积的变化而引起的变异性最小化。类似的归一化方案在基于阵列的数字PCR中将是有益的，但是包含专用于单一被动参考染料的通道将最终限制系统的多路复用能力。在所描述的实施方案中，选定的荧光通道中完全变性的探针可用作每个分区中的内部被动参考染料。在一个实例中，图像在所有探针均变性的温度(例如95℃)下获取，并因此显示出最大的荧光。此95℃图像可在分区之后但在核酸扩增之前或在核酸扩增之后的解链分析期间获取。在图像中鉴定分区，并确定每个分区的平均像素强度。通过从解链分析期间测量的强度中减去95℃平均强度，可将在不同温度下在解链系列中获取的所有分区平均强度相对于相应的95℃分区平均强度归一化以解决分区特异性的变化。

图8示出了此归一化对由包含单一探针的分区生成的离散解链数据的影响。图8A示出了在T1处采集的原始数据图像，并且图8B示出了使用95℃图像归一化的相同数据。可以看出，在归一化的图像中阳性和阴性微滴之间对比度增强。图8C和8D中所示的相应强度直方图说明了归一化导致聚类为两个预期的群体(与暗微滴相关的像素和与亮微滴相关的像素)。在归一化之前，三个不同的峰是可见的(图8C)。不受理论的束缚，假定一个群体与暗微滴相关，并且两个群体与亮微滴相关，所述亮微滴由于照明和荧光收集的不均匀性而改变亮度。归一化的积极效果在图8E和8F所示的1D振幅图中被进一步证明。在图E中，可难以确定合适的阈值，以将微滴分类为阳性或阴性的，因为大量微滴位于2个可辨别的群体之间。然而，在归一化之后(图8F)，许多更少的微滴落在两个可辨别的群体之间。

实施例2-使用在区室化之后但在核酸扩增之前获取的图像为阴性和阳性分区建立初步截止的方法

阴性和阳性分区的正确分类是使用数字PCR进行准确定量所必需的。现有的dPCR方法仅依赖于终点成像以将分区分类为针对靶核酸为阳性或阴性的。在本发明方法中，在分区之后但在核酸扩增之前获取分区阵列的图像(图9A)。在此阶段，每个分区理论上应具有源自靶标特异性探针的相同的均匀荧光强度。但是，实际上，不同分区的平均强度值将遵循关于具有一定方差或标准偏差的平均值或预期值的分布。如前所述计算室的平均强度值。

将分区的整个群体的这些平均强度值分组在一起，并计算平均值(预期值)和标准偏差(方差的平方根)(图9C；灰色条)。使用该分布的现在限定的标准偏差，将把分区分类为阳性或阴性的阈值设置为所有扩增之前分区的平均强度值，其除去了(less)平均扩增之前分区群体的平均强度值的三个(图9C和D中的灰色线)标准偏差。该初始阈值设置可以构成扩增之后迭代阈值细化的基础。图9B示出了扩增之后微滴的图像。亮微滴对于靶标是阴性的，并且暗淡的微滴对于靶标是阳性的。在强度分布(图9C)和强度事件图(图9D)的叠加图中，阴性群体中的高重叠程度证明了以这种方式设置初始阈值的可行性。此外，在分类算法(例如k-平均值聚类)用于鉴定阳性和阴性分区的一个实施方案中，通过该图像获取的数据可用作分类算法的训练集。为了该预分类工作，应在相同温度下获取扩增之前和扩增之后的图像。注意，在探针信号随着靶标扩增的进行而降低的检测方案中，扩增之后强度值高于阈值的分区被分类为阴性微滴。扩增之后强度值低于阈值的分区被分类为阳性分区。在使用在靶标的存在下未淬灭的DNA插入染料或探针的信号传导方案中，荧光强度随着靶标扩增的进行而提高，因此低于阈值的分区被分类为阴性的，而高于阈值的分区被分类为阳性的。

实施例3-用于校正探针荧光强度的温度依赖性和光剂量依赖性变化的扩增之后的图像的方法

在核酸扩增之后，在55℃至95℃的温度范围内进行解链分析以鉴定特定靶标。已经证明一些荧光染料的荧光强度在该温度范围内是可变的。另外，已知一些染料例如FAM(荧光素的衍生物)由于重复曝光(例如多次图像获取期间持续的曝光)而表现出光漂白(Song et al.，Photobleaching Kinetics of Fluorescein in QuantitativeFluorescence Microscopy，Biophysical Journal，68，2588-2600(1995))。

为了校正这样的变异性，可在分区之后但在核酸扩增之前在55℃至95℃温度下获取一系列图像。优选地，对于在解链分析中使用的每个波长，在整个解链曲线温度范围内以相等间隔的温度间隔获取最少3张图像。单独分区中的平均强度使用先前所述的方法之一来确定(整个分区相对于ROI)，并在图的y轴上相对于获取图像的温度进行绘制。该数据点的集合基于关于探针对温度和光二者的敏感性的先验知识使用最小二乘回归与合适的模型(线性或指数)拟合。在光敏感性占主导地位且光漂白是强度损失的重要来源的探针的情况下，指数模型或者线性和指数的混合模型可最好地拟合该数据。在温度依赖性占主导地位且光漂白最小的探针的情况下，线性模型可最好地拟合该数据。拟合优度由回归的标准误差或确定系数R₂确定。从这些拟合中获得的重要度量可包含斜率、时间常数和/或y轴截距。针对存在的每个荧光通道确定独特的度量集。

在核酸扩增之后，获取一系列解链图像。在解链分析(即评估解链曲线以确定探针特异性靶标的存在)之前，针对对于每个荧光通道特异的任何温度和光剂量依赖性损失，在整个解链曲线温度范围内校正针对每个单独分区所确定的平均强度。具体地，通过从扩增之后的解链曲线中减去获自扩增之前数据的拟合，在一系列扩增之后的解链图像中校正荧光信号的线性或指数衰减，以产生经校正的解链曲线。现在，使用经校正的解链曲线进行进一步的分析，以鉴定和量化探针特异性靶标的存在。或者，在计算单独的室或微滴中的平均强度之前，将与温度和光剂量依赖性的荧光损失的校正逐像素地应用于整个图像。

在另一种替代方法中，使用预先存在的数据集来校正温度和光剂量依赖性的荧光损失。如先前所述，在解链测量的过程中，探针强度可以以线性或非线性方式变化，或者甚至通过线性和非线性关系的组合变化。例如，在Song et al.(Photobleaching kineticsof fluorescein in quantitative fluorescence microscopy，1995.BiophysicalJournal，68(6)，2588-2600.doi：10.1016/s0006-3495(95)80442-x)中，显示荧光素强度在氧气不足的情况下具有双指数光漂白行为，而在氧气充足的环境下观察到单指数行为。为了校正任何温度依赖性和/或光漂白的强度斜率，使用了来自对照样品的数据，其中最合适的曲线与对照数据拟合(例如双指数曲线拟合)，并且来自实验数据的拟合的曲线被减去或相对于对照值归一化。或者，如果扩增之后存在足够的阴性结果分区，则它们可用作对照，并用于曲线拟合目的，以调整由于温度和光依赖性的荧光变化引起的斜率变化。

图10示出了从阴性(无靶标)对照分区测得的荧光强度如何可用于补偿/校正受试样品中温度依赖性和/或光剂量依赖性的荧光变化。图10示出了由从具有三个靶标特异性探针(其每一个具有不同的解链温度(靶标))的样品和阴性分区(对照)中收集的原始数据产生的解链曲线，以及样品(经校正靶标)和阴性对照(经校正对照)的经校正解链曲线。根据来自对照的未经校正(原始)数据明显的是，阴性对照中荧光强度的线性衰减随温度提高而发生。低于预期的荧光强度在阳性样品解链曲线的最后10°处也是明显的，在那里未检测到RFU的预期提高。从未经校正的数据可以看出，在没有校正的情况下的离散采样将导致对靶标3的阴性调用(call)，因为在第三和第四数据点(在图中用大圆点突出显示)之间没有可测量的荧光强度提高。由于荧光漂白，每个解链事件的强度的预期的逐步提高被强度的温度依赖性降低而掩盖。但是，在应用线性衰减校正(以及在此出于比较观察的目的而沿Y轴转化)之后，所有3种探针的离散解链事件是易于检测的。

实施例4-确定用于初始分区分类的总荧光变化值的整个范围的方法。

在扩增之后，首先在解链分析温度曲线的最低温度(T1)下获取图像。使用实施例3中所述的方法之一，必须对所有图像应用荧光的温度和光剂量依赖性衰减的校正。然后，如在实施例1中所述，通过在热循环之前或之后获得的T4下的图像，或者在热循环之前在T1下获得的图像，对T1图像中的平均或积分分区强度进行归一化。在静态阵列dPCR的情况下，可以对整个图像上的逐像素基础或对单独分区内的平均或积分强度应用校正和归一化。在微滴dPCR的情况下，如果微滴在图像获取期间移动，则可能需要首先从两个图像中鉴定和关联微滴，然后基于逐滴的基础确定分区荧光的比例。可以使用通过T1图像的校正和归一化而确定的平均强度或者通过使用经校正和经归一化的T1和T4图像之间的差异来进行以下分析，如等式5中所示。

ΔF＝I_高-I_低等式5

经校正和经归一化的T1图像或所计算的ΔF值的分区特异性的平均强度的直方图或1D振幅图可报告将分区初始分类为包含0、1、2或3个独特靶标。不包含靶标分子的阴性分区将显示出荧光强度的很少或几乎没有的变化(即，I_AVG＝1或ΔF＝0)。包含所有三个靶标的分区将显示出最大的荧光强度变化。包含1个或2个靶标的分区将显示出荧光强度的中间变化，其中含2个靶标的分区显示出比包含单个标靶的分区更大的荧光强度变化。展示了单通道中3重测定中的初始微滴分类的1D振幅图的一个实例示于图13B中。

假设所有探针以相等的浓度均被包含在3重反应中，则解离图像中分区强度的分布以0或1、ΔRFU_最大、(1/3)*ΔRFU_最大、(2/3)*ΔRFU_最大的强度为中心，其中ΔRFU具体地是指ΔRFU_95至56。对于表征良好的测定中的给定探针，ΔRFU_最大应为一致的值，并且可以基于参考数据集设置初始阈值以对分区进行分类。然后可以手动或使用基于算法的方式(例如k-平均值聚类)进一步完善这些阈值。例如，第三方已通过网络界面(definetherain.org.uk)使得能够获得使用k-平均值聚类的被称为definetherain的方法，以应用于使用Bio-Rad系统获得的数字微滴数据。存在多种另外的可应用于分区分类的分类或聚类分析算法。

可使用先前所述的方法对不包含靶标或包含全部三个靶标的分区进行分类。因此，为简便起见，可以将这些分区从进一步的分析(解链获取或数据分析)中排除。从进一步的分析中消除这些分区降低了需要获取的解链分析图像的数目，从而减少图像获取和数据分析所需的时间。但是，如果三种靶标特异性探针在单通道中是可检测的，并且一个分区仅包含单个靶标，则解链分析可用于区分分区内特定靶标的存在。

所描述的用于执行初始分区分类的方法还可以应用于使用被动参考染料进行归一化。等式1中计算的ΔF值是通过被动参考染料信号大量以以下方式进行归一化的：Rn和ΔRn是针对实时或定量实时PCR计算的。Rn是所测得的荧光与被动参考染料荧光的比，而ΔRn是基线校正之后的Rn。使用被动参考染料未消除在解链曲线生成过程中解释温度和光剂量依赖性荧光强度损失的需要，因为被动参考染料仅解释了预期单通道中的这种损失与跨通道的损失是不一致的。同样地，不同荧光团的温度和光剂量依赖性可存在差异。

实施例5.单重连续解链分析与离散解链分析

单重连续分析

对在本文中称为靶标B的靶标进行单重PCR，并使用如美国申请No.14/822,288中所描述的预期Tm为74℃的可切割探针进行检测。在含有以下的缓冲液中制备PCR样品：10mMBis-Tris丙烷(pH 9.1)、0.3mg/mL BSA、100μM dNTP、90μM DTT、1μM Dabcyl-diGTP、10mMTris碱、2.5mM MgCl₂和50mM KCl。包含在反应中的酶包括4×的TiTaq(Clontech)和16mU/uL的热启动RNase H2(Takara)。以480nM的浓度包含正向引物B(针对靶标B)(5’GCAAGATACCATTTATCAATGAAG 3’；SEQ ID NO：1)，以120nM的浓度包含反向引物B(5’GGTGTCAATTTTCTTATATCATAAT 3’；SEQ ID NO：2)，以及以300nM的浓度包含探针B

以907个拷贝/uL的预期浓度包含Ultramer B

包括无模板对照反应，以确保测定按预期进行，但是在此不包含数据。使用QuantStudio 3D(QS3D)荷载器和v2数字PCR芯片(每个芯片14.5μL)将样品分成多个分区，并根据制造商的说明进行密封以进行连续解链分析。

使用以下热循环方案在ProFlex热循环仪上以11°倾斜(根据QS3D手册)将分区的反应热循环至终点：96℃持续10分钟，57℃持续2分钟和98℃持续30秒的45次循环，以及最后在57℃下保持5分钟。热循环之后，使用LabView控制的定制解链读取器进行解链分析，该读取器由热电冷却器(thermoelectric cooler，TEC)和成像装置组成。对于连续解链分析，将芯片以1℃的增量从60℃加热到90℃，并使用适合于HEX的激发(511/55nM)和发射滤波(549/15)在每个温度下获取图像。使用定制软件在Matlab中分析图像。使用基于霍夫变换(Hough transform)的内置圆查找(built-in circle finding)算法来鉴定单独分区，确定整个解链曲线的平均强度值(基于每个图像基础)。在单重测定中，在探针的自退火温度下采集的终点图像足以将分区分类对于靶标为阳性或阴性的。图11示出了来自解链分析的原始荧光数据(A)以及在探针退火温度下每个分区的平均强度的曲线(B)。将对于模板为阳性或阴性的分区的分类以及随后的计算应用于以下等式1，以确定模板拷贝/分区的平均数目，并因此确定反应中存在的模板的浓度。该分类可以手动地或者使用分类算法来完成。与预期的907个拷贝/μL相比，k-平均值分类产生1，100个拷贝/μL的确定。由于存在大量的“雨”，因此预期手动分类依赖于使用者产生可变的结果。将单独分区解链曲线相对于在95℃下测得的平均分区强度归一化减少了雨并简化了对阳性和阴性微滴的手动分类(图11.C&D)。可以应用另外的校正来解决整个解链曲线上的温度或光剂量依赖性的荧光衰减(图11E&F)，尽管该校正的影响将依赖于实验中使用的荧光染料是否表现出这样的衰减。解链曲线的导数也可用于量化模板的存在。计算经归一化的解链曲线的反导数，并在解链峰上对强度进行积分。每个分区的积分分区强度在图11G&H中示出。如前所述，可以应用手动的或基于算法的分类来确定反应中存在的模板拷贝数。注意，在单重的情况下，对于解链与终点分析，使用k-平均值分类对模板进行量化是相同的，并且上述校正因子的应用看起来产生更接近于预期值907个拷贝/μL的值(1，038个拷贝/μL)。在多重测定中，终点图像将仅足以确定给定分区中存在的独特靶标的数目(0、1、2或3)，但是需要解链分析来鉴定存在哪些特定靶标。

单重离散解链分析

如先前对于连续解链单重PCR所述的，准备样品反应，进行数字化和热循环。在低于探针的预期Tm的温度(T₁＝67℃)下和在高于探针的预期Tm的温度(T₂＝78℃)下获取解链图像，并且在每个温度下测量每个分区的平均强度(图12A)。相对于在95℃下获取的图像对图像进行归一化(图12C)，并确定T₂/T₁的比(图B)。使用k-平均值对分区进行分类，并且靶标浓度被确定为1，050个拷贝/μL。

根据这些结果的比较明显的是，离散解链分析足以替代连续解链分析。在前一种的情况下，对于离散解链分析，计算输入拷贝浓度为1，050个拷贝/μL，与1，038个拷贝/μL相比，相差仅1.2％。

实施例6.多重连续与离散解链分析

多重连续解链分析

连续解链分析用于确定样品中多个靶标的存在。每个反应中均包含三个靶标(A、B和C)，以及Tm分别为63、74和85℃的相应探针。如上所述制备样品和扩增缓冲液。以对于靶标B以及先前所述的引物和对于靶标B的探针所描述的相同的浓度包含分别针对靶标A和C的正向引物A_F和C_F

反向引物A_R和C_R

和探针A_P和C_P

同样地，包含两个另外的模板(A和C)：

以770个拷贝/μL的浓度包含靶标A，以453个拷贝/μL的浓度包含靶标B，并且以775个拷贝/μL的浓度包含靶标C。如先前所述对样品进行分区、进行热循环和解链。使用相同的定制软件对图像进行分析，以确定解链温度的整个范围内分区中的平均信号强度。图13A、C、E&G表示原始数据(A)、95℃经归一化数据(C)、温度和荧光衰减校正数据(E)和解链导数(G)的解链曲线。

基于在探针退火温度下获取的解链数据的分区分类导致鉴定出四个不同的簇，其对应于0个靶标、一个靶标占有、两个靶标占有和三个靶标占有的分区(图13B)。但是，需要解链分析以确定一个和两个靶标占有的分区的特定靶标占有率。为了确定样品中存在的靶标A的量，计算了第一解链曲线的积分，并对每个分区进行了分类(图13D)。对两个剩余模板执行了相同的过程(图13F&H)。基于该分析，靶标A的测量浓度为692个拷贝/μL，靶标B的为537个拷贝/μL，并且靶标C的为392个拷贝/μL。

多重离散解链分析

如前所述准备样品反应，进行数字化和热循环。在四个温度(T₁＝57℃，T₂＝69℃，T₃＝81℃，T₄＝93℃)下获取解链图像，并测量四个图像的每个分区的平均强度(图14A)，将其相对于95℃归一化(图14C)，并针对温度和光剂量依赖性进行校正(图14E)。还示出了57℃图像中所有分区的1D振幅图，其可用于将分区分类为包含零个、一个、两个或所有三个靶标(图14B)。为了确定模板A的浓度，确定了T₂/T₁的比(图14D)。使用k-平均值对分区进行分类，并使用等式1确定靶标浓度。对于模板B，确定T₃/T₂的比，使用k-平均值对分区进行分类，并使用等式1(图14F)。最后，对于模板C，确定T₄/T₃的比，使用k-平均值对分区进行分类，并用等式1确定模板浓度(图14G)。如在单重情况下所证明的，在多重反应中的离散解链分析得到与在连续解链分析中测得的浓度基本相等的估计浓度。表1中示出了单重和多重连续与离散解链分析的所计算的靶标浓度。

表1：使用连续和离散解链分析从包含单个或多个不同靶标的分区中计算出的靶标浓度。

实施例7-使用可切割探针的dPCR工作流

该实施例提供了使用具有预定解链曲线的靶标特异性探针(如在美国申请序列号14/823,288中所述的)进行dPCR分析的一个示例性工作流。这样的探针基于探针是否为双链体构象(作为遇到靶核酸的结果)或者它们是否为单链构象而表现出可区分的信号。注意，对于这些探针，可以在以下情况下在任何温度下检测到最大荧光：在遇到靶核酸(作为与探针偶联的荧光团的结果)之前，或者在高于双链体的预定Tm的温度下遇到靶核酸之后，当并入到探针中的淬灭剂与荧光团分离时，因为在这些温度下分子内双链体解离。该工作流不必限于这些探针，并且可以应用于具有相似标记方案的其他类型的探针。

用于dPCR反应的离散解链图像分析需要3个关键步骤，以确保解链数据的准确解释以及将分区最佳地分类为阴性或阳性分区：1)针对由于荧光的温度依赖性而导致的荧光强度变化，校正所测得的荧光值；2)针对系统依赖性荧光变异性(例如光学不均匀性或分区体积的变化)对所测得的荧光值进行归一化；以及3)通过检测在高于和低于探针的预先选择的Tm的预先选择的温度下的荧光强度变化来确定靶标的存在。图15提供了用于执行这些步骤的一个示例性工作流。

在分区之后的第一步骤中，在热循环之前在一定温度范围内获取图像以确定由于温度引起的荧光强度的变化。可以选择温度以对应于热循环之后将用于DMA的温度，或者可以选择更大范围的温度(例如，用于DMA的最低和最高温度之间的每个度)，或者可以使用每种荧光染料的先前获取的图像组。

对荧光的温度依赖性的校正可以以多种方式应用于在热循环之后获取的图像：i)将曲线拟合至在扩增之前在不同温度下针对分区计算的平均强度值，并使用该表达式校正相关温度下的扩增之后的图像；ii)在扩增之前在用于DMA的温度下获取分区的图像，并用相应的扩增之前的图像对每个扩增之后的图像进行归一化；iii)从示例性数据集中得出在选定温度下的适当校正表达式，并将其应用于在选定温度下在扩增之后采集的图像；以及iv)使用与扩增之后的阴性分区相关的强度值来校正阳性分区中的积分强度值。在该最后一个实例中，在单个温度下获取的图像中的阴性分区强度替代了从在相同温度下获取的扩增之前的图像中确定的分区强度。在一个优选的实施方案中，使用(ii)中描述的方法，因为该方法提供了同时归一化图像以用于系统依赖性荧光变异性的优点。在另一个实施方案中，进行荧光的温度依赖性的校正，然后使用在扩增之前采集的任何图像进行归一化。类似地，在扩增之后在95℃下获取的并针对温度依赖性荧光变化进行校正的图像可用于归一化。也可将获取的图像替换为被动参考染料例如ROX以进行归一化。

如上所述，在对图像进行了校正和归一化之后，可以比较在低于每个探针的预定Tm的温度下和在高于每个探针的预定Tm的温度下获取的图像的荧光强度，以确定是否存在靶标。本领域技术人员将认识到，强度的比较可以涉及计算在不同温度下获取的强度测量的比值或差值。另外，本领域技术人员将认识到，可以使用每个感兴趣区域的所检测强度值、或者积分或平均强度来进行计算。无论如何，对于所研究的每个靶标，预期结果将聚类到每个分区的两个组(阳性分区或阴性分区)之一中。在多路复用的情况中，可以预期阳性分区的多重类别，因为一些分区将包含多个靶标。该聚类应允许手动或使用分类算法来确定区分阳性和阴性分区的阈值。特别地，在不同温度下获取的扩增之前的图像应有助于建立阴性分区的预期强度(包括平均值和标准偏差)附近的统计。

根据本公开内容，本文中所公开和要求保护的所有方法均可在不进行过度实验的情况下做出和执行。尽管已经根据一些优选实施方案描述了本发明的组合物和方法，但对于本领域技术人员来说明显的是，可对本文中所述方法以及所述方法的步骤或步骤顺序作出改变而不脱离本发明的概念、精神和范围。更具体地，将明显的是，可用化学和生理学二者相关的某些试剂替代本文中所述的试剂而实现相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似替代和改变被视为在由所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念内。

参考文献

以下参考文献就其提供补充本文中阐述内容的示例性操作或其他细节而言特别地通过引用并入本文。

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<130> LUMN.P0144WO

<140> 未知

<141> 2019-01-22

<150> US 62/620,298

<151> 2018-01-22

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 1

gcaagatacc atttatcaat gaag 24

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 2

ggtgtcaatt ttcttatatc ataat 25

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成探针

<400> 3

ttctcttctc tttcattcac ataacgccaa aaaacccgtt atgtcctcca gttcccatat 60

ttg 63

<210> 4

<211> 198

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成ultramer

<400> 4

atgactaagc aagataccat ttatcaatga agaagagttt attgtagaga aaataagagt 60

aatgtttgtc caacattaac tgcaaatatg ggaactggag gacataacgt tccattaata 120

aaggataatt atgatataag aaaattgaca ccagaagaat gtgtggcatt tcaaggtttt 180

ccttcagaat ttcaattc 198

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 5

gtggaggatg acacttttcg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 6

attgaattga gagaactgtt agata 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 7

attccttagg taccgtcaga 20

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成引物

<400> 8

caacaaagtt aaagctagtg tttag 25

<210> 9

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成探针

<400> 9

atatatatat atataagaat tctgccaaaa aaaacccaga attcttccct aagaaaagga 60

gtttacg 67

<210> 10

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成探针

<400> 10

cctcccctcc cctccccttc accatccaaa aaaccatggt gaucaatcct taacactgct 60

tt 62

<210> 11

<211> 111

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 11

ccctgacgca gcaacgccgc gtggaggatg acacttttcg gagcgtaaac tccttttctt 60

agggaagaat tctgacggta cctaaggaat aagcaccggc taactccgtg c 111

<210> 12

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 12

atgctaatta caaaaacagg attgaattga gagaactgtt agataaaaac ctgtttaaag 60

cagtgttaag gattgatcac catcccaatg aagatgatct aaacactagc tttaactttg 120

ttgaagaaag ctatgtagct tgt 143

Claims

1.在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述标记的双链体核酸具有预定Tm，并且所述方法包括：

(a)在低于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；

(b)在高于所述标记的双链体核酸的预定Tm的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及

(c)比较所述第一信号和所述第二信号，当所述第一与第二信号之间存在变化时，确定所述标记的双链体核酸是所述反应混合物中靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。

2.权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性探针是在所述靶标特异性探针与所述靶序列特异性杂交后被切割的可切割探针。

3.权利要求1或2所述的方法，其中不在所述标记的双链体核酸的预定Tm的2摄氏度内测量信号。

4.权利要求1或2所述的方法，其中不在所述标记的双链体核酸的预定Tm的5摄氏度内测量信号。

5.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于2摄氏度。

6.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于5摄氏度。

7.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于8摄氏度。

8.权利要求1或2所述的方法，其还包括以下步骤：在所述反应混合物中的所有标记的双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。

9.权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的双链体核酸，每种具有独特的预定Tm，并且每种不同的双链体核酸具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：

d)在低于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度和高于所述标记的双链体核酸的独特的预定Tm的温度下测量来自每种不同的标记的双链体核酸的信号，并且

其中，对于每种不同的标记的双链体核酸，在低于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号与在高于所述独特的预定Tm的温度下测得的信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与其靶标特异性杂交的结果。

10.权利要求9所述的方法，其中信号在不超过n+1个不同的温度下测量，其中n是所述反应混合物中不同靶标特异性探针的数目。

11.权利要求1或2所述的方法，其中所述第一与第二信号之间的变化超过预定阈值。

12.用于确定样品中至少一种靶核酸序列的存在的方法，所述方法包括：

a)在杂交条件下，使所述样品与至少一种可切割靶标特异性探针接触，如果所述靶核酸序列存在于反应混合物中，所述探针能够与所述靶核酸序列特异性杂交，

b)将与所述靶核酸序列特异性杂交的所述探针进行切割以形成截短的探针；

c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交；

d)使所述截短的探针延伸以形成具有预定Tm和信号产生标记的双链体核酸；

e)在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号，以及

f)通过检测所述第一与第二信号之间的变化来确定所述靶核酸序列的存在。

13.权利要求12所述的方法，其中所述样品与至少两种不同的可切割探针接触，每种不同的可切割探针对于不同的靶核酸序列具有特异性，其中在其特异性靶核酸序列的存在下，每种不同的可切割探针形成具有独特的预定Tm的双链体核酸，并且其中所述具有独特的预定Tm的双链体核酸均具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：对于每种具有独特的预定Tm的双链体核酸，在低于所述预定Tm的温度下测量第一信号，并在高于所述预定Tm的温度下测量第二信号，并通过检测所述第一与第二信号之间的变化来确定所述靶核酸序列的存在。

14.权利要求13所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同的可切割探针的数目。

15.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。

16.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。

17.权利要求13所述的方法，其中所述不同的双链体核酸的独特的预定Tm相差至少10摄氏度。

18.权利要求12所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的。

19.权利要求12所述的方法，其中捕获序列和截短的探针是双分子的。

20.权利要求12所述的方法，其中当所述第一信号与所述第二信号的比超过预定阈值时，确定存在所述靶核酸。

21.权利要求12所述的方法，其中不在所述预定Tm的2摄氏度以内的温度下测量信号。

22.权利要求12所述的方法，其中不在所述预定Tm的5摄氏度以内的温度下测量信号。

23.权利要求12所述的方法，其中所述至少一种可切割探针用报道分子-猝灭剂对的第一成员标记，并且所述至少一种可切割探针在与其靶核酸序列杂交时采用第一构象。

24.权利要求23所述的方法，其中所述至少一种可切割探针与其靶序列的特异性杂交导致所述探针在切割位点处切割、所述截短的探针从所述靶核酸序列释放以采用第二构象，以及从所述切割位点开始的链延伸。

25.权利要求24所述的方法，其中链延伸包括并入与所述报道分子-淬灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-淬灭剂对的第二成员。

26.权利要求24所述的方法，其中所述第一构象是线性构象，并且所述第二构象是发夹构象。

27.在反应混合物中对标记的双链体核酸进行解链分析的方法，所述方法包括：

a)在所述标记的双链体核酸处于第一构象的第一温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第一信号；

(b)在所述标记的双链体核酸处于第二构象的第二温度下测量来自所述标记的双链体核酸的第二信号，其中不在所述第一与第二温度之间的温度下测量信号；以及

(c)通过比较所述第一信号与所述第二信号来确定所述标记的双链体核酸是否是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述标记的双链体核酸是靶标特异性探针与靶序列特异性杂交的结果。

28.权利要求27所述的方法，其中所述反应混合物包含至少两种不同的标记的双链体核酸，每种不同的标记的双链体核酸能够在独特的温度下采用所述第二构象，并且每种不同的标记的核酸具有同一信号产生标记，所述方法还包括以下步骤：对于每种标记的双链体核酸，在所述标记的双链体核酸主要处于第一构象的温度下测量第一信号，并在所述标记的双链体核酸主要处于第二构象的温度下测量第二信号，并比较所述第一与第二信号。

29.权利要求28所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应混合物中不同双链体核酸的数目。

30.权利要求27所述的方法，其中所述第一构象是发夹构象，并且所述第二构象是线性构象。

31.权利要求27所述的方法，其中所述靶标特异性探针是标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的可切割探针。

32.权利要求31所述的方法，其中所述靶标特异性探针与其靶序列的特异性杂交导致所述探针在切割位点处切割以形成截短的探针、所述截短的探针从所述靶核酸序列中释放以形成发夹探针，以及从所述切割位点开始的链延伸。

33.权利要求32所述的方法，其中链延伸包括并入与所述报道分子-淬灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-淬灭剂对的第二成员，从而导致信号变化。

34.用于检测样品中至少一种靶核酸序列存在与否的方法，所述方法包括：

a)使所述样品与至少一种在靶核酸序列存在时能够与所述靶核酸序列特异性杂交的可切割探针接触，所述可切割探针包含信号产生标记；

b)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；

c)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交，所述捕获序列包括与所述截短的探针互补的序列；

d)使用所述捕获序列为模板使所述截短的探针延伸，以形成具有预定Tm的双链探针；

e)在低于所述预定Tm的第一温度下测量来自所述信号产生标记的第一信号，以及在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；以及

f)通过检测在所述第一温度与所述第二温度下测得的信号的变化来确定所述靶核酸序列的存在。

35.权利要求34所述的方法，其中所述样品与两种或更多种不同的可切割探针接触，每种均对不同的靶核酸具有特异性，并且每种均能够在其各自的靶核酸存在下形成具有独特的预定Tm的双链探针，并且其中每种不同的双链探针均包括相同的报道分子-猝灭剂对，所述方法还包括以下步骤：对于每种不同的双链探针，在低于所述预定Tm的第一温度下测量第一信号和在高于所述预定Tm的第二温度下测量第二信号，并比较针对每种不同的双链探针测得的所述第一与第二信号。

36.权利要求34所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的。

37.权利要求34所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是双分子的。

38.权利要求35所述的方法，其中所述样品在单个反应室中与两种或更多种不同的可切割探针接触。

39.权利要求38所述的方法，其中在不超过n+1个不同的温度下测量信号，其中n是所述反应室中不同的可切割探针的数目。

40.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少2摄氏度。

41.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少5摄氏度。

42.权利要求35所述的方法，其中所述不同的双链探针的独特的预定Tm相差至少8摄氏度。

43.权利要求34所述的方法，其中当所述第一信号与所述第二信号的比超过预定阈值时，确定存在所述靶核酸。

44.权利要求34所述的方法，其中不在所述预定Tm的2摄氏度以内的温度下测量信号。

45.权利要求34所述的方法，其中不在所述预定Tm的5摄氏度以内的温度下测量信号。

46.权利要求34所述的方法，其中所述信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且所述双链探针包括与所述报道分子-猝灭剂对的第一成员相互作用的报道分子-猝灭剂对的第二成员。

47.权利要求46所述的方法，其中所述可切割探针包含连接有所述信号产生标记的第一非天然核苷酸，所述双链体核酸包含与所述第一非天然核苷酸杂交的第二非天然核苷酸，并且所述报道分子.猝灭剂对的第二成员与所述第二非天然核苷酸连接。

48.权利要求46和47所述的方法，其中所述报道分子-猝灭剂对的第一成员是荧光实体，并且所述报道分子-猝灭剂对的第二成员是猝灭所述荧光实体的荧光的猝灭剂。

49.权利要求47所述的方法，其中所述第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。

50.对多种标记的核酸双链体进行解链分析的方法，所述方法包括：

(a)至少提供第一、第二和第三标记的双链体核酸，

其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的每个均具有独特的预定Tm，并且

所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm，并且

所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm高于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm，并且

其中所述第一、第二和第三标记的双链体核酸被同一标记进行标记，

(b)在低于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第一温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第一信号；

(c)在第二温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第二信号，所述第二温度介于所述第一标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；

(d)在第三温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第三信号，所述第三温度介于所述第二标记的双链体核酸的独特的预定Tm与所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm之间；

(e)在高于所述第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm的第四温度下检测来自所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的第四信号；以及

(f)通过比较所述第一、第二、第三和第四信号来确定所述第一、第二和第三标记的双链体核酸中的一种或更多种是否是靶标特异性探针切割的结果，其中所述第一信号与所述第二信号之间的变化表明所述第一标记的双链体核酸是第一靶标特异性探针切割的结果，所述第二信号与所述第三信号之间的变化表明所述第二标记的双链体核酸是第二靶标特异性探针切割的结果，并且所述第三信号与所述第四信号之间的变化表明所述第三标记的双链体核酸是第三靶标特异性探针切割的结果。

51.权利要求50所述的方法，其中不在所述第一、第二和第三标记的双链体核酸的独特的预定Tm下检测信号。

52.权利要求50所述的方法，其中所述第一温度与所述第二温度之间的差异大于2摄氏度，所述第二温度与所述第三温度之间的差异大于2摄氏度，并且所述第三温度与所述第四温度之间的差异大于2摄氏度。

53.权利要求12、27或34所述的方法，其还包括以下步骤：在所述反应混合物中的所有双链体核酸均被变性的第三温度下测量第三信号，并且将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。

54.权利要求1、12、27、34或50所述的方法，其中所述步骤在dPCR反应中的多个分区上进行。

55.权利要求8或53所述的方法，其中通过从所述第一和第二信号中减去所述第三信号，而将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。

56.权利要求8或53所述的方法，其中通过将所述第一和第二信号除以所述第三信号，而将所述第一和第二信号相对于所述第三信号归一化。

57.权利要求12或34所述的方法，其中所述步骤在dPCR反应中跨多个分区进行，所述方法还包括在切割之前在所述多个分区中测量来自所述可切割探针的标记的信号，并使用在切割之前测得的所述信号设置阈值，以将包含所述靶核酸的分区与不包含所述靶核酸的分区区分开。

58.权利要求12或34所述的方法，其中所述步骤在dPCR反应中跨多个分区进行，所述方法还包括在切割之前在一定温度范围内测量多个信号，并使用所测得的信号校正在解链分析过程中测得的信号的光和温度依赖性变化。

59.权利要求1、12、27或34所述的方法，其中所述步骤在dPCR反应中跨多个分区进行，所述方法还包括在确定所述靶核酸的存在之前将其中在所述第一与第二信号之间没有变化的分区鉴定为阴性靶标分区，并使用来自阴性靶标分区的测得信号将每个分区中测得的第一和第二信号的光和温度依赖性变化归一化。

60.用于确定样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述样品和信号产生靶标特异性探针的反应混合物，其中所述靶标特异性探针当处于第一单链构象时产生第一信号；

b)测量所述反应混合物中来自所述靶标特异性探针的第一信号；

c)为所述靶标特异性探针提供条件以使其在靶核酸存在时与所述靶核酸杂交并采用第二构象，所述第二构象是具有预定Tm并能够在低于所述预定Tm的温度下产生第二信号的双链体核酸；

d)在低于所述预定Tm的温度下测量来自所述双链体核酸的第二信号，而不在所述预定Tm下测量信号；

e)当所述第一信号与所述第二信号之间存在差异时，确定所述靶核酸的存在。

61.权利要求60所述的方法，其中所述靶标特异性探针是在与所述靶核酸杂交后被切割以形成截短的探针的可切割探针。

62.权利要求61所述的方法，其中所述截短的探针与捕获序列结合并延伸以形成所述双链体核酸。

63.权利要求60所述的方法，其中所述第一和第二信号是荧光信号。

64.权利要求60所述的方法，其中在所述靶标特异性探针与所述靶核酸杂交之前检测所述第一信号。

65.权利要求62所述的方法，其中在所述靶标特异性探针处于第一构象的条件下切割和延伸之后检测所述第一信号。

66.权利要求61所述的方法，其中所述可切割探针包含标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述双链体核酸包含能够与所述第一非天然核苷酸进行碱基配对并且标记有所述报道分子-淬灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸。

67.权利要求66所述的方法，其中所述第一和第二非天然核苷酸是iso-C和iso-G中之一。

68.权利要求62所述的方法，其中所述靶标特异性探针在与所述捕获序列结合之前用荧光团标记，并且其中在导致所述荧光团淬灭的位置处将淬灭剂并入到所述双链体核酸中。

69.权利要求60所述的方法，其中在步骤(b)之后，使所述反应混合物经受用于扩增所述靶核酸的条件。

70.权利要求62所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的并且杂交以形成发夹探针。

71.权利要求62所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是双分子的。

72.用于检测样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供包含所述样品、至少一种标记的可切割靶标特异性探针的反应混合物，如果所述靶核酸序列在于所述反应混合物中，所述探针能够与所述靶核酸序列特异性杂交，并且所述标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员；

b)测量所述反应混合物中来自所述标记的靶特标异性探针的第一信号；

c)提供条件以使所述标记的可切割靶特标异性探针在所述靶核酸序列存在于所述反应混合物中时与所述靶核酸序列杂交；

d)对与所述靶核酸序列特异性杂交的探针进行切割以形成截短的探针；

e)提供条件以使所述截短的探针与捕获序列杂交；

f)使所述截短的探针延伸以形成具有所述报道分子-猝灭剂对的第二成员和预定Tm的双链体核酸；

g)在低于所述预定Tm的温度下测量第二信号；以及

h)当所述第一与第二信号之间的差异超过预定阈值时，检测到所述靶核酸的存在。

73.权利要求72所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是单分子的并且杂交以形成发夹探针。

74.权利要求72所述的方法，其中所述捕获序列和截短的探针是双分子的。

75.权利要求72所述的方法，其中所述靶标特异性探针包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述双链体核酸包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。

76.权利要求75所述的方法，其中所述第一和第二非天然核苷酸是isoC和isoG中的任一者。

77.权利要求72所述的方法，其中所述报道分子-猝灭剂对的第一成员是荧光团，并且所述报道分子-猝灭剂对的第二成员是淬灭剂。

78.用于确定样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

c)使所述反应混合物经受用于扩增所述靶核酸的条件，其中在扩增期间，所述靶标特异性探针被修饰以形成经修饰的靶标特异性探针，所述经修饰的靶标特异性探针包含具有预定Tm并且能够在低于所述预定Tm的温度下产生第二信号的双链体核酸；

d)在低于所述预定Tm的温度下测量第二信号而不在所述预定Tm下测量信号；

e)当所述第一信号与所述第二信号之间的差异超过预定阈值时，确定所述靶核酸的存在。

79.权利要求78所述的方法，其中所述靶标特异性探针通过与所述靶核酸杂交后被切割以形成截短的探针来修饰，所述截短的探针与捕获序列结合并延伸以形成所述双链体核酸。

80.权利要求78所述的方法，其中所述第一和第二信号是荧光信号。

81.权利要求79所述的方法，其中在所述靶标特异性探针与所述靶核酸杂交之前检测所述第一信号。

82.权利要求79所述的方法，其中在所述经修饰的靶标特异性探针处于单链构象的条件下切割和延伸后检测所述第一信号。

83.权利要求78所述的方法，其中所述靶标特异性探针包含标记有报道分子-猝灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述经修饰的靶标特异性探针包含能够与所述第一非天然核苷酸进行碱基配对并且标记有所述报道分子-淬灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸。

84.权利要求83所述的方法，其中所述第一和第二非天然核苷酸是iso.C和iso-G中之一。

85.权利要求79所述的方法，其中所述靶标特异性探针在与所述捕获序列结合之前用荧光团标记，并且其中在延伸过程中在导致所述荧光团淬灭的位置处将淬灭剂并入到所述双链体核酸中。

86.检测样品中第一和第二靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)形成扩增反应混合物，其包含第一和第二荧光信号产生靶标特异性探针和可能含有所述第一和第二靶核酸的所述样品；

b)对所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述第一和/或第二靶核酸；

c)在预选温度T1、T2和T3下从至少一个分区子集的图像中获取第一、第二和第三组荧光强度值，并且对于所述分区子集中的每个分区，确定预选温度T1下的第一荧光强度值、预选温度T2下的第二荧光强度值和预选温度T3下的第三荧光强度值；

d)使包含所述扩增反应混合物的所述分区经受用于以下的条件：扩增所述第一和第二靶核酸，以及在其靶核酸存在下修饰所述第一信号产生探针以形成具有第一预定Tm的第一双链体核酸，并且在其靶核酸存在下修饰所述第二信号产生探针以形成具有第二预定Tm的第二双链体核酸；

e)在低于第一预定Tm的温度T1下，从所述分区子集的图像中获取第四组荧光强度值，并计算每个分区的第四强度值；

f)在高于第一预定Tm但低于第二预定Tm的温度T2下，从所述分区子集的图像中获取第五组荧光强度值，并计算每个分区的第五强度值；

g)在高于第二预定Tm的温度T3下，从所述分区子集的图像中获取第六组荧光强度值，并计算每个分区的第六强度值；

h)对于每个分区，将第四强度值除以第一强度值以获得与T1相关的第七强度值；

i)对于每个分区，将第五强度值除以第二强度值以获得与T2相关的第八强度值；

j)对于每个分区，将第六强度值除以第三强度值以获得与T3相关的第九强度值；

k)对于每个分区，检测第八强度值与第七强度值之间的变化以确定所述第一靶核酸的存在；以及

l)对于每个分区，检测第九平均强度值与第八平均强度值之间的变化以确定第二靶核酸的存在。

87.权利要求86所述的方法，其中所述第一和第二荧光信号产生探针具有同一信号产生标记。

88.权利要求87所述的方法，其中所述信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且所述第一和第二双链体核酸包含所述报道分子-猝灭剂对的第二成员。

89.权利要求88所述的方法，其中所述第一和第二信号产生探针包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述第一和第二双链体核酸包含连接有所述报道分子-猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。

90.权利要求89所述的方法，其中所述非天然核苷酸是iso-C或iso-G中之一。

91.权利要求86所述的方法，其中所述第一和第二信号产生探针是在扩增过程中被切割的可切割探针。

92.权利要求86所述的方法，其中所述第八强度值与所述第七强度值之间的变化超过预定阈值，并且其中所述第九强度值与所述第八强度值之间的变化超过预定阈值。

93.检测样品中靶核酸的存在的方法，所述方法包括以下步骤：

a)形成扩增反应混合物，其包含荧光信号产生靶标特异性探针和包含所述靶核酸的所述样品；

b)对所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述靶核酸；

c)在预选温度T1和T2下从分区的至少一个子集的图像中获取第一和第二组荧光强度值，并且对于所述分区子集中的每个分区，确定预选温度T1下的第一荧光强度值和预选温度T2下的第二荧光强度值；

d)使包含所述扩增反应混合物的所述分区经受用于扩增所述靶核酸和在其靶核酸存在下修饰所述信号产生探针以形成具有预定Tm的双链体核酸的条件；

e)在低于所述预定Tm的温度T1下，从所述分区子集的图像中获取第三组荧光强度值，并计算每个分区的第三强度值；

f)在高于所述预定Tm的温度T2下，从所述分区子集的图像中获取第四组荧光强度值，并计算每个分区的第四强度值；

g)对于每个分区，将第三强度值除以第一强度值以获得与T1相关的第五强度值；

h)对于每个分区，将第四强度值除以第二强度值以获得与T2相关的第六强度值；

i)对于每个分区，检测第六强度值与第五强度值之间的变化以确定所述靶核酸的存在。

94.权利要求93所述的方法，其中所述靶核酸是第一靶核酸，所述信号产生靶标特异性探针是第一荧光信号产生靶标特异性探针，并且所述预定Tm是第一预定Tm，所述方法还包括检测第二靶核酸的存在，其中所述反应混合物还包含第二荧光信号产生靶标特异性探针，所述方法还包括以下步骤：

j)在步骤(b)中，将所述反应混合物进行分区，以使得每个分区平均包含零种或一种所述第一和/或第二靶核酸；

k)在步骤(c)中，在预选温度T3下从至少一个分区子集的图像中获取第五组荧光强度值，并且对于所述分区子集中的每个分区，确定在预选温度T3下的第七荧光强度值；

l)在步骤(d)中，使包含所述扩增反应混合物的所述分区经受用于扩增所述靶核酸和在其靶核酸存在下修饰所述第二信号产生探针以形成具有第二预定Tm的第二双链体核酸的条件；

m)在高于第二预定Tm的温度T3下，从所述分区子集的图像中获取第六组荧光强度值，并计算每个分区的第八强度值；

n)对于每个分区，将第八强度值除以第七强度值以获得与T3相关的第九强度值；

o)对于每个分区，检测第九强度值与第六强度值之间的变化以确定所述第二靶核酸的存在。

95.权利要求93或94所述的方法，其中所述第六与第五强度值之间的变化以及所述第九与所述第六强度值之间的变化超过预定阈值。

96.权利要求94所述的方法，其中所述第一和第二荧光信号产生探针具有同一信号产生标记。

97.权利要求94所述的方法，其中所述信号产生标记是报道分子-猝灭剂对的第一成员，并且所述第一和第二双链体核酸包含所述报道分子-猝灭剂对的第二成员。

98.权利要求94所述的方法，其中所述第一和第二信号产生探针包含连接有所述报道分子-淬灭剂对的第一成员的第一非天然核苷酸，并且所述第一和第二双链体核酸包含连接有所述报道分子-猝灭剂对的第二成员的第二非天然核苷酸，并且所述第一和第二非天然核苷酸能够彼此进行碱基配对。

99.权利要求98所述的方法，其中所述非天然核苷酸是iso-C或iso-G中之一。

100.权利要求94所述的方法，其中所述第一和第二信号产生探针是在扩增过程中被切割的可切割探针。