CN108368547A

CN108368547A - 与靶核酸序列有关的信号提取

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Publication number: CN108368547A
Application number: CN201680073310.3A
Authority: CN
Inventors: 千钟润; 李荣祚; Ｈ·Ｂ·李
Original assignee: Seegene Inc
Current assignee: Seegene Inc
Priority date: 2015-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2018-08-03
Anticipated expiration: 2036-12-15
Also published as: US20190062824A1; KR20180085061A; WO2017105104A1; CN108368547B; EP3390665A4; EP3390665A1; EP3390665B1; US11485998B2; KR102110985B1

Abstract

本发明涉及从样品中与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号。本发明可有助于显著改善通过采用不同的检测温度及基准值来检测靶核酸序列的方法。使用初始基准值及校准基准值的本发明在通过使用不同的检测温度及基准值来检测靶核酸序列的方法中可提高检测准确性。

Description

与靶核酸序列有关的信号提取

技术领域

本发明涉及从样品中与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号。

背景技术

为了检测靶核酸序列，作为实时检测方式广泛利用以一边监控靶扩增，一边检测靶核酸序列的实时检测方法。通常，在实时检测方法中使用与靶核酸序列特异性杂交的已标记的探针或引物。作为使用已标记的探针及靶核酸序列之间的杂交的方法的例，包括使用具有发夹结构的双重标记的探针的分子信标(Molecular beacon)方法(Tyagi et al，Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJ et al.，Mol.CellProbes，15(6):363-374(2001))、利用分别标记成供体及受体的2个探针的杂交探针方法(Bernad et al，147-148 Clin Chem 2000；46)及使用单一标记的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本技术领域中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)利用借助双重标记的探针及脱氧核糖核酸(脱氧核糖核酸)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探针的切割。

作为使用标记的引物的方法的例，包括日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko etal，2516-2521Nucleic Acids Research，1997，v.25 no.12及美国专利第6117635号)、蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombe et al，804-807，Nature Biotechnology v.17 AUGUST1999及美国专利第6326145号)及TSG引物方法(WO第2011/078441号)。

作为代替接近法，提出使用靶核酸序列存在时形成的二聚体的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、美国专利第6358691号及美国专利第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO cleavage and extension)方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PCE-SH，PTO Cleavage and Extension-Dependent Si gnaling OligonucleotideHybridization)方法(WO第2013/115442号)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PCE-NH，PTO Cl eavage and Extension-Dependent Non-Hybridization)方法(PCT/KR20 13/012312)。

如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相关或无关的信号扩增工序中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标记产生的信号。根据现有实时检测技术，当在一个反应管中利用单一类型的标记来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标记。在利用单一类型的标记的情况下，利用T_m值差异的解链分析可检测多个靶核酸序列。但是，解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的T_m值的探针的设计变得越来越困难。

因此，若开发不依赖于解链分析且在单一反应容器中使用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性显著提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，若结合上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)，则以效率显著提高的方式在单一反应容器中使用单一类型的标记检测多个靶核酸序列。

为此，本发明人公开了在单一反应容器中通过使用单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的方法(WO第2015/147412号)。在上述方法中，可根据在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测的信号的分析来确认具有相对较低检测温度的靶核酸序列的存在。尤其，基于在相对较低检测温度及相对较高检测温度下的信号的强度互不相同的发现，本发明人导入了反映在不同检测温度下信号的变化关系的基准值。

典型地，使用仅包含具有相对较高检测温度的靶核酸序列的对照组样品，通过重复实验获得特定范围的值后，在上述获得的值中选择适当的值来预先确定基准值。但是，在所选择的基准值不适合一些反应的情况下，观察到往往会发生错误的结果。

因此，有必要开发通过校准基准值来以更加准确的方式提取与靶核酸序列有关的信号的新方法，以使没有这种错误的结果。

在本说明书全文中，参照了多篇专利及文献，并用括号提供了其引用。为了更加明确地说明本发明及本发明所属技术领域，这种专利及文献的内容全部插入于本说明书作为参照。

发明内容

因此，本发明的目的在于提供从样品中与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法。

本发明的还有一目的在于提供一种计算机可读储存介质，用于实现处理器，上述处理器执行从样品中与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号。

本发明的再一目的在于提供用于从与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的装置。

本发明的另一目的在于提供一种计算机程序，实现用于执行从样品中的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法的处理器且储存于计算机可读储存介质。

通过结合发明要求保护范围及附图和下述详细说明更加明确本发明的其他目的及优点。

附图说明

图1为示出用于提取与靶核酸序列有关的信号的本发明的实例的流程图。

图2A及2B为示出根据探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应方法(MuDT1技术)在60℃及72℃的不同检测温度检测对淋病奈瑟氏菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸或含有淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的混合物的样品的信号。

图3为示出与含有10pg的沙眼衣原体靶的样品有关的信号提取的一实例。根据数学式I-1，通过使用(i)对于1.30的第一靶核酸序列(沙眼衣原体)初始基准值及(ii)相对较低检测温度(60℃)及相对较高检测温度(72℃)下检测的信号来提取了与第二靶核酸序列(淋病奈瑟氏菌)有关的信号。

图4A为示出用于获得所再提取的信号的固定校准基准值(fixed amended-reference value)接近法的一实例。在图3中评价所提取的信号是否满足准确性标准(上部)，在所选择的PARV中获得校准基准值(中间部)，通过使用上述校准基准值再提取信号(下部)。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘阈值’表示从所提取的信号中确定RV的适合性的阈值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘PARV中的校准RV’表示由PARV中的信号计算的与沙眼衣原体有关的校准基准值。

图4B及图4C为示出对于多种浓度的淋病奈瑟氏菌沙眼衣原体或含有淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的混合物的样品，根据固定校准基准值接近法的信号提取及再提取的结果。通过使用1.30的初始基准值来提取信号。在所提取的上述信号不满足准确性标准的情况下，根据固定校准基准值接近法再提取信号。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘固定校准RV’表示根据PARV中的信号计算的与沙眼衣原体有关的校准基准值；虚线表示从所提取的信号中用于确定RV的适合性的阈值。

图4D为示出适用于图4B及4C中的各个反应的初始基准值、PARV及PARV中的固定校准基准值。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘固定校准RV’表示根据PARV中的信号计算的与沙眼衣原体有关的校准基准值。

图5A为示出用于获得所再提取的信号的可变校准基准值(variable amended-reference value)接近法的一实例。在图3中，评价所提取的信号是否满足准确性标准(上部)，基于所选择的PARV在所选择的多个周期中获得多个校准基准值(中间部)，通过使用上述多个校准基准值来进行信号再提取(下部)。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘阈值’表示用于从所提取的信号确定RV的适合性的阈值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘在各个周期中的校准RV’表示根据各个周期中的信号计算的校准基准值；‘PARV中的校准RV’表示根据PARV中的信号计算的校准基准值。

图5B及5C为示出含有各种浓度的与淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的混合物的样品，根据可变校准基准值接近法的信号提取及再提取的结果。信号提取通过使用1.30的初始基准值来进行。若所提取的上述信号不满足准确性标准，则根据可变校准基准值接近法来再提取信号。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘可变校准RV’表示与PARV中的信号及根据各个周期中的信号计算的沙眼衣原体有关的校准基准值；虚线表示用于从所提取的信号确定RV的适合性的阈值。

图5D为示出适用于图5B及5C中的各反应的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘各周期中的额外的校准RV’表示根据各周期中的信号计算的校准基准值；‘PARV中的校准RV’表示根据PARV中的信号计算的校准基准值。

图6A及6B为示出含有淋病奈瑟氏菌的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的混合物的样品，根据TaqMan实时聚合酶链式反应方法(MuDT2技术)，在60℃及72℃的不同温度下检测的信号。

图7A及7B为示出含有各种浓度的和淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的混合物，根据可变校准基准值接近法的淋病奈瑟氏菌靶的信号提取及再提取的结果。信号提取通过使用5.00的初始基准值来进行。若所提取的上述信号不满足准确性标准，则根据可变校准基准值接近法来再提取信号。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘可变校准RV’表示和根据PARV中的信号及各周期中的信号计算的沙眼衣原体有关的校准基准值；虚线表示用于从所提取的信号确定RV的适合性的阈值。

图7C为示出适用于图7A及7B中的反应结果的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。在上述附图中，‘初始RV’表示与沙眼衣原体有关的初始基准值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘各周期中的额外的校准RV’表示根据各周期中的信号计算的校准基准值；‘PARV中的校准RV’表示根据PARV中的信号计算的校准基准值。

图7D及7E为示出含有各种浓度的与淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的混合物的样品，根据可变校准基准值接近法的沙眼衣原体靶的信号提取及再提取的结果。信号提取通过使用2.50的初始基准值来进行。若所提取的上述信号不满足准确性标准，则根据可变校准基准值接近法来再提取信号。在上述附图中，‘初始RV’表示与淋病奈瑟氏菌有关的初始基准值；‘可变校准RV’表示与根据PARV中的信号及各周期中的信号计算的淋病奈瑟氏菌有关的校准基准值；虚线表示用于从所提取的信号确定RV的适合性的阈值。

图7F为示出适用于图7D及图7E的反应结果的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。在上述附图中，‘初始RV’表示与淋病奈瑟氏菌有关的初始基准值；‘PARV’表示用于设定校准基准值的点；‘各周期中的额外的校准RV’表示根据各周期中的信号计算的校准基准值；‘PARV中的校准RV’表示根据PARV中的信号计算的校准基准值。

具体实施方式

I.从与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号

在本发明的一实施方式中，提供从与两个靶核酸序列有关的信号中提取与靶核酸序列有关的信号的方法，包括：

步骤(a)，在单一反应容器中，与可产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及可产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一同培养样品，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由单一类型的检测器检测信号；上述培养步骤通过信号产生过程来进行；上述检测步骤在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的两个信号不被单一类型的检测器分辨；

步骤(b)，通过使用第二初始基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一初始基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一初始基准值为示出在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二初始基准值为示出在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；通过使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构来从对照组反应预先确定上述第一初始基准值，通过使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构来从对照组反应预先确定第二初始基准值；

(c)确认所提取的上述信号是否满足准确性标准；若所提取的上述信号不满足准确性标准，则通过使用校准基准值代替初始基准值来重复步骤(b)，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号；上述校准基准值被确定为使所再提取的信号满足准确性标准。

参照图1的流程图，进一步详细说明本发明：

步骤(a)：培养及信号检测(S110)

在步骤(a)中，在单一反应容器中，与可产生与第一靶核酸序列有关的信的第一信号产生机构及可产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一同培养样品。随后，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下通过单一类型的检测器检测信号。

在本文所使用的术语“样品”是指经历本发明的方法的任意物质。尤其，术语“样品”是指含有或推测含有感兴趣的核酸(第一靶核酸序列及第二靶核酸序列中的一种或所有)的任意物质或者含有或推测含有感兴趣的靶核酸序列的作为核酸本身的任意物质。进一步地，使用于本文的术语“样品”包含生物学样品(例如，生物来源的细胞、组织和流体)及非生物学样品(例如，饮食、水及土壤)。非限制性地，生物学样品包括病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴液、咯痰、拭子(swab)、吸收液、支气管肺泡灌洗液、牛奶、尿液、粪便、眼液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液(SCF)、阑尾、脾及扁桃体组织提取物、羊水及腹水。并且，样品可包括与生物学供给源分开的自然存在核酸分子及合成核酸分子。

使用于本文的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”是指用于分析、检测或定量的感兴趣的核酸序列。靶核酸序列包括双链及单链。靶核酸序列包括最初存在于样品内的序列及在反应中新产生的序列。

靶核酸序列可包含任意脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))、核糖核酸分子及它们的杂化体(嵌合核酸)。上述序列可以为双链或单链形态。在作为初始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将上述两条链制备成单链或部分单链形态。作为用于链分离的公知的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质。例如，链分离可在80℃～105℃的温度范围下进行加热来实现。用于实现这种处理的常规方法由文献[Joseph Sambrook，et al.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)]提供。

靶核酸序列包含任何天然原核细胞核酸、真核细胞核酸(例如，原生动物和寄生虫、真菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。并且，上述核酸分子可以为通过重组生产或可生产的或者化学生产或可生产的任何核酸分子。因此，可在自然中发现或无法发现核酸分子。

靶核酸序列不应被解释为将序列限制为给定时间内已知的序列或给定时间之后可利用的序列，反而应被解释为包括可利用于现在或未来的某一时间点或者可以知道的序列。即，靶核酸序列在实施本发明时可能是已知的，也可能不是已知的。在未知的靶核酸序列的情况下，在实施本发明的方法之前，可根据现有的测序方法之一来确定其序列。

使用于本发明的靶核酸序列包括第一靶核酸序列及第二靶核酸序列。术语“第一靶核酸序列”及“第二靶核酸序列”在本文中为了区分两个不同的靶核酸序列而使用。例如，第一靶核酸序列及第二靶核酸序列可以为感兴趣的两个不同的基因、两个不同的基因区域或两个不同的脱氧核糖核酸序列。尤其，第一靶核酸序列可来源于一个有机体，相反，第二靶核酸序列可来源于另一个有机体。

在本发明的一实例中，两个靶核酸序列之一包含核苷酸变异，或者两个靶核酸序列之一包含一种类型的核苷酸变异，另一种包含另一种类型的核苷酸变异。

使用于本文的术语“核苷酸变异”是指序列在类似的连续的脱氧核糖核酸片段中特定位置的脱氧核糖核酸序列中的任何单一或多个核苷酸取代、缺失或插入。这种连续的多个脱氧核糖核酸片段包含一个基因或一个染色体的任何其他部位。这种核苷酸变异可以是突变(mutant)或多态性等位基因变异(polymorphic allele variations)。例如，在本发明中所检测的核苷酸变异包括单一核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism；SNP)、突变、缺失、插入、取代及异位。作为核苷酸变异的例，包括人类基因组中的各种突变(例如，亚甲基氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase；MTHFR)基因突变、与病原体耐药性相关的变异及肿瘤形成突变。在本文中所使用的术语“核苷酸变异”包括核酸序列的特定位置中的任何变异。即，术语“核苷酸变异”包括核酸序列的特定位置中的野生型及其任何突变型。

在本发明中，为了获得与靶核酸序列有关的信号与两个信号产生机构一同培养样品(或者样品中的靶核酸序列)。

使用于本文中的术语“培养的”、“进行培养”或“培养”是指为了相互作用或反映而结合组分。尤其，上述术语是指使本文的成分经历信号产生过程。

使用于本文的术语“信号”是指可进行测定的产物。

信号变化可起到定量或定性示出分析物质(靶核酸序列)的存在或不存在的指标作用。

作为有用的指标的例，包括荧光强度、发光强度、化学发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷传递、电压、电流、电功率、能量、温度、粘度、光散射、放射线强度、反射力、渗透度、吸光度。最广泛使用的指标为荧光强度。

信号包括从信号检测出的各种信号特征，例如，信号强度[例如，在执行RFU(相对荧光单位)值或扩增的情况下，在特定周期中，在所选择的周期中或最后点中的RFU值]、信号变化形状(或图案)或沙眼衣原体值、或者对上述特征进行数学加工来获得的值。

在一实例中，与基准值或样品分析相关的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，而且包含通过对上述信号进行数学加工来提供的变形的信号。

在本发明的一实例中，在通过实时聚合酶链式反应(PCR)获得扩增曲线的情况下，从扩增曲线选择多种信号值(或特征)并可用于确定靶存在(强度，沙眼衣原体值或扩增曲线数据)。

使用于本文的术语“与第一靶核酸序列有关的信号”及“第二靶核酸序列”分别指表示第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的信号。即，上述术语是指依赖于第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在产生及被检测的信号，因此，与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号的显著水平表示第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在。

信号(尤其，信号强度)可根据其检测温度及所使用的信号产生机构而不同。

在本文中，根据使用信号产生机构的信号产生过程来进行培养。

使用于本文的术语“信号产生过程”是指能够以依赖于样品中靶核酸序列的存在的方式产生信号的任何过程。

使用于本文的术语“信号产生机构”是指表示靶核酸序列的存在的使用于信号的产生的任何物质，例如，包括寡核苷酸，标记及酶。选择性地，使用于本文的术语“信号产生机构”可用来表示使用用于信号产生的物质的任何方法。

尤其，使用于本文的术语“第一信号产生机构”及“第二信号产生机构”是指产生分别与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的信号的机构。第一信号产生机构及第二信号产生机构可包括使用于信号产生的共同成分(例如，单一类型的标记及单一类型的酶)或不同的成分(例如，不同类型的寡核苷酸)。尤其，第一信号产生机构及第二信号产生机构的特征在于具有单一类型的标记(相同的标记)。因此，无法根据现有的方法来区分来源于第一信号产生机构的标记的信号与来源于第二信号产生机构的标记的信号。

各种信号产生机构对于本技术领域的技术人员是已知的。信号产生机构包括所有具有标记本身及标记的寡核苷酸。白纸包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。标记本身，例如，嵌入染料可用作信号产生机构。选择性地，单一标记或包含供体分子及收容分子的相互作用性双标记可用作与至少一种寡核苷酸相结合的形态的信号产生机构。

信号产生机构可包含用于产生信号的额外的成分，如核酸降解酶(例如，5’-核酸酶及3’-核酸酶)。

信号产生过程伴随信号变化。信号变化可起到定量或定性示出靶核酸序列的存在或不存在的指标的作用。

“信号产生过程”的详细内容在本发明人申请的WO第2015/147412号中公开，其教导作为参照整体并入本文。

在一实例中，信号产生过程为信号扩增过程。

在本发明的一实例中，信号产生过程是伴随靶核酸序列的扩增或不伴随扩增的过程。

尤其，信号产生过程是伴随靶核酸分子的扩增的过程。进一步地，信号产生过程是伴随靶核酸分子的扩增且扩增靶核酸分子时可增加或减少信号的(尤其，可增加信号)过程。

使用于本文的术语“信号产生”包括信号的出现或消失及信号的增加或减少。尤其，术语“信号产生”是指信号的增加。

可根据本技术领域的技术人员已知的许多方法来实施信号产生过程。上述方法包括TaqManTM探针方法(美国专利第5210015号)、Molecular Beacon方法(Tyagi et al.，Nature Biotechnology，14(3)：303(1996))、蝎形(Scorpion)方法(Whitcombe et al.，Nature Biotechnology 17：804-807(1999))、日出(Sunrise)或Amplifluor方法(Nazarenko et al.，Nucleic Acids Research，25(12)：2516-2521(1997)及美国专利第6117635号)、Lux方法(美国专利第7537886号)、CPT(Duck P，et al.，Biotechniques，9：142-148(1990))、LNA方法(美国专利第6977295号)、Plexor方法(Sherrill CB，et al.，Journal of the American Chemical Society，126：4550-4556(2004))、HybeaconsTM(D.J.French，et al.，Molecular and Cellular Probes(2001)13363-374及美国专利第7348141号)、双标记，自淬火的探针(美国专利第5876930号)、杂化探针(Bernard PS，etal.，Clin Chem 2000，46，147-148)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage andextension)方法(WO第2012/096523号)、PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-DependentSignaling Oligonucleotide Hybridization)方法(WO第2013/115442号)及PCE-NH(PTOCleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization)方法(第PCT/KR2013/012312号)及CER方法(WO第2011/037306号)。

在根据TaqManTM探针方法实施信号产生过程的情况下，信号产生机构包括引物对、具有相互作用性双标记双标记的探针及具有5’->3’核酸酶活性的脱氧核糖核酸聚合酶。在根据探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法实施信号产生过程的情况下，信号产生机构可包括引物对、探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide，PTO)、捕获和模板寡核苷酸(Capturing and Templating Oligonucleotide，CTO)及具有5’->3’核酸酶活性的脱氧核糖核酸聚合酶。探测和标记寡核苷酸或捕获和模板寡核苷酸可使用适当的标记来标记。

在一实例中，与靶扩增一同以包括信号扩增的过程来实施信号产生过程。

在一实例中，作为信号产生过程，扩增反应以靶核酸序列的扩增的同时信号扩增的方式来实施(例如，实时聚合酶链式反应)。选择性地，扩增反应不伴随靶核酸分子的扩增并以信号被扩增的方式来实施[例如，CPT方法(Duck P，et al.，Biotechniques，9：142-148(1990))，侵入分析(美国专利第6358691号及第6194149号)]。

已知扩增靶核酸分子的多种方法，非限制性地，包括聚合酶链式反应、连接酶链式反应(LCR，ligase chain reaction，see Wiedmann M，et al.，"Ligase chain reaction(LCR)-overview and applications."PCR methods and Applications 1994 Feb；3(4)：S51-64)、间隙填充连接酶链反应(GLCR，gap filling LCR，see WO第90/01069号、EP第439182号及WO第93/00447号)、Q-beta(Q-beta replicase amplification，see Cahill P，et al.，Clin Chem.，37(9)：1482-5(1991)、美国专利第5556751号)、SDA(stranddisplacement amplification，see G T Walker et al.，核酸s Res.20(7)：16911696(1992)，EP 497272)、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification，seeCompton，J.Nature 350(6313)：912(1991))、TMA(Transcription-MediatedAmplification，see Hofmann WP et al.，J Clin Virol.32(4)：289-93(2005)；U.S.Pat.No.5888779)或RCA(Rolling Circle Amplification，see Hutchison C.A.etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA.102：1733217336(2005))。

培养样品后，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测两个信号产生机构(即，第一信号产生机构及第二信号产生机构)中的信号。

本发明根据检测温度，可通过使用任何类型的信号产生机构来实施。两个信号产生机构之一设计成靶核酸序列存在时均在两个检测温度下提供信号，另一种可设计成仅在相对较低检测温度下提供信号。选择性地，可将两个信号产生机构设计成以靶核酸序列存在时均在两个检测温度下提供信号。

在一实例中，通过考虑根据信号产生机构来产生信号的温度范围来预先确定检测温度。检测温度包括相对较高检测温度(例如，72℃)及相对较低检测温度(例如，60℃)。

在一实例中，相对较高检测温度为可产生具有相对较高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度，相对较低检测温度为均可产生具有相对较低检测温度的与靶核酸序列有关的信号及具有相对较高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度。

在还有一实例中，相对较高检测温度及相对较低检测温度可均可产生具有相对较低检测温度的与靶核酸序列有关的信号及具有相对较高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度。

本发明的一个特征为在检测温度下通过检测示出两个靶核酸序列的纯在的信号来区分并确定两个靶核酸序列的存在。

在一实例中，通过考虑根据信号产生机构产生信号的温度范围来预先确定与靶核酸序列有关的检测温度。

本发明利用以依赖于信号产生机构的方式产生信号的特定温度范围存在。

例如，在两个核酸分子之间杂化(或结合)时信号产生机构产生信号且它们之间非杂化(或解离)时不产生信号的情况下，在可使两个核酸分子之间杂化的温度下产生信号，但是在两个核酸分子之间非杂化的温度下不产生信号。像这样，存在产生信号(即，信号检测)的特定温度范围和不产生信号的其他温度范围。上述温度范围受使用于信号产生机构的两个核酸分子的杂化体的Tm值影响。

可通过考虑两个温度范围来确定与各个靶核酸序列有关的检测温度。相对较高检测温度可选自前者的温度范围，上述相对较高检测温度分配至第一靶核酸序列。相对较低检测温度可选自后者的温度范围，上述相对较低检测温度分配至第二靶核酸。

本发明的重要的技术特征在于，通过分析所有相对较高检测温度下的信号及相对较低检测温度下的信号来提取与第二靶核酸序列有关的信号或与第一靶核酸序列有关的信号。

信号的检测在检测器，尤其，在单一类型的检测器下进行。

使用于本文的术语“单一类型的检测器”是指用于检测单一类型的信号的机构。在包括用于获得几种类型的信号的几个通道(例如，光二极管)的检测器中，各个通道(例如，光二极管)对应于“单一类型的检测器”。

在本发明的一实例中，两个信号产生机构包括相同的标记，上述标记中的信号不会被单一类型的检测器分辨。

在信号产生过程的一个以上的周期中实施在相对较高检测温度及相对较低检测温度先从两个信号产生机构中的信号的检测，分别在一个以上的周期中获得信号值。

使用于本文的术语“周期”是指伴随状态变化的多个测定中状态的变化单位。例如，状态的变化包括温度、反应时间、反应次数、浓度、pH和/或靶核酸分子序列的复制次数的变化。因此，周期可包括时间或过程周期、单位运行周期及复制周期。例如，等温扩增在等温条件下反应时间的过程中对样品可进行多个测定，反应时间可对应于状态变化且反应时间的单位可对应于周期。

尤其，当重复一系列反应或者以规定时间坚固重复反应时，术语“周期”是指上述重复单位。

例如，在聚合酶链式反应(PCR)中，周期是指反应单位，包括靶分子变性、靶分子与引物之间的退火(杂化)及引物延伸。反应的重复的增加可对应于状态变化且重复单位可对应于周期。

信号的检测在信号产生过程的各周期中提供信号值。使用于本文的术语“信号值”是指在信号产生过程的各周期中实际测定的信号值(例如，通过扩增反应处理的荧光强度的实际值)或其变形。上述变形可包括测定的信号值(例如，强度)被数学加工的值。测定的信号值的数学加工的值的例可包括测定的信号值的对数值及导函数。使用于本文的术语“信号”是指包括术语“信号值”，因此可互换使用这些术语。

通过两个信号产生机构产生的信号不会被单一类型的检测器分辨。术语“不会被单一类型的检测器分辨的信号”是指信号因这些相同或者实际上相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)而不会被单一类型的检测器分辨。

使用于本文的术语“单一类型的信号”是指提供相同或者实际上相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)的信号。例如，FAM及CAL Fluor 610提供不同类型的信号。

信号提供由信号产生过程产生的数据集。使用于本文的术语“数据集”是指一组数据点。使用于本文的术语“数据点”是指坐标值，包括周期与上述周期中的信号值。在信号产生过程中获得的数据点由直角坐标系统中的坐标值绘制，从而可提供曲线(例如，扩增曲线)。上述曲线可以为拟合或正规化的(例如，减去基线的)曲线。尤其，被检测出的信号根据周期来绘制。

在特定实例中，在信号、及其数据集、数据点及曲线中减去基线。

步骤(b)：用于提取与靶核酸序列有关的信号的信号值的处理(S120)

然后，通过使用第二初始基准值来处理在步骤(a)中获得的信号值来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一初始基准值来处理在步骤(a)中获得的信号值来提取与第二靶核酸序列有关的信号。

使用于本文的术语“基准值”描述当在不同检测温度(即，相对较高检测温度及相对较低检测温度)下产生两个信号时，尤其，在数值上时，信号的变化、信号变化或信号差异关系或程度。换句话说，“基准值”包括反映在不同检测温度下的信号变化的模式(规则)的任何值。并且，术语“基准值”是指示出对于特定靶核酸序列在相对较高检测温度下检测的信号及在相对较低检测温度下检测的信号之间的变化程度的值。基准值可以指将在一种温度下检测的信号改变、转换、调节或变形为另一种温度下的信号而使用的值。基准值可根据靶核酸序列的类型、信号产生机构的类型及培养及检测的条件而不同。因此，对于不同或相同的靶核酸序列可确定多种基准值。

基准值可由多种方式表达。例如，基准值可由具有数值值、信号的存在/不存在或具有信号特征的结构表达。

术语“基准值”为“第一初始基准值”、“第二初始基准值”、“第一校准基准值”、“第二校准基准值”，在本文中进一步说明。在上述术语中，术语“第一”及“第二”分别用来区分第一靶核酸序列及与第二靶核酸序列有关的基准值。术语“初始”及“校准”分别用来区分用于再提取初始信号提取的基准值及信号的基准值。

尤其，如本文所使用，术语“第一初始基准值”及“第二初始基准值”分别是指作为与第一靶核酸序列有关的预先确定的基准值及作为与第二靶核酸序列有关的预先确定的基准值分别在步骤(b)中的第二靶核酸序列的信号提取及第一靶核酸的信号提取中最先使用的基准值。

进一步地，第一初始基准值为表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的两个信号的变化关系的值，第二初始基准值为表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第二信号产生机构提供的两个信号的变化关系的值。

另一方面，在下述步骤(c)中使用的术语“第一校准基准值”及“第二校准基准值”是指当提取错误的信号时分别代替第一初始基准值及第二初始基准值的基准值，这用于后期再提取与第二靶核酸序列及第一靶核酸序列有关的信号。

在一实例中，可通过考虑所选择的周期中的信号值来确定基准值。即，可通过考虑在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测的信号中所选择的周期中的信号值来确定基准值。在此情况下，所选择的上述周期可以扩增曲线的基线的区域后的周期之一，尤其，停滞期区域的周期之一，进一步地可以为最后周期。

在选择性的实例中，可通过考虑不同的所选择的周期中的多个信号值来确定基准值。例如，可通过考虑不同的所选择的周期中的多个信号值来确定基准值。

以下，对基准值进行说明。基准值应解释为包括初始基准值及校准基准值。

与信号产生机构一同培养相应的靶核酸序列，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测信号后，可通过获得在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测到的信号的变化关系来预先确定初始基准值。

在一实例中，通过使用与靶核酸序列相应的标准物质来预先确定初始基准值。

在一实例中，从对照组反应预先确定初始基准值。例如，通过使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构来从对照组反应预先确定第一初始基准值，通过使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构来从对照组反应预先确定第二初始基准值。

在一实例中，可通过使用相应的含有靶核酸序列的对照组样品来预先确定初始基准值。例如，可通过使用含有第一靶核酸序列的对照组样品来预先确定第一初始基准值，可通过使用含有第二靶核酸序列的对照组样品来预先确定第二初始基准值。

通过在各种条件(例如，靶核酸序列的浓度及引物的类型)下对对照组反应(对照组样品)进行重复反应来获得特定范围的值，可通过从上述获得的值中选择适当的值来预先确定初始基准值。

在一实例中，能够以除去不会被提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择初始基准值。在还有一实例中，能够以不除去或尽可能少除去被提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择初始基准值。在再一实例中，能够以除去不会被提取的与靶核酸序列有关的信号且不除去或尽可能少除去被提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择初始基准值。

例如，在通过使用第二初始基准值来提取与第一靶核酸序列有关的信号的情况下，能够以除去与第二靶核酸序列有关的信号且不除去与第一靶核酸序列有关的信号的方式选择第二初始基准值。

进一步具体地，靶核酸序列包含“沙眼衣原体”及“淋病奈瑟氏菌”，在需要提取与“淋病奈瑟氏菌”有关的信号的情况下，能够以完全除去与沙眼衣原体有关的信号且不除去或尽可能少除去与淋病奈瑟氏菌有关的信号的方式选择与沙眼衣原体有关的初始基准值。

可通过重复实验以经验获得基准值。

基准值可选自通过重复实验以经验获得的特定范围中。与此相关，在上述范围中选择相对高的值作为初始基准值是有利的，因为与相对低的初始基准值相比，相对高的初始基准值除去不想提取的信号的可能性更高。例如，在获得1.1至1.50的范围的情况下，约1.50的值可能更适合作为初始基准值。选择性地，大于上述范围的值可被选为初始基准值。例如，大于上述范围的上限5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的值可被选为初始基准值。但是，要注意过高的初始基准值是不理想的，因为过高的初始基准值反而有可能除去所要提取的信号。

在一实例中，可根据在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号间的差异来计算初始基准值。

在一实例中，可通过对在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号进行数学加工来计算初始基准值。

在特定实例中，数学加工包括使用来源于信号或上述信号的其他值的计算(例如，加法、减法、乘法及除法)。

在本发明的一实例中，用于获得初始基准值的对信号的数学加工是在相对较低检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号之比的计算。在本发明的一实例中，用于获得初始基准值的对信号的数学加工是在相对较高检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号与在相对较低检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号之比的计算。

上述比率可以为在相对较低检测温度下检测的信号的一个周期中的信号值与在相对较高检测温度下检测的信号的上述周期中的信号值之比。选择性地，上述比率可以为在相对较高检测温度下检测信号的一个周期中的信号值与在相对较低检测温度下检测信号的一个周期中的信号值之比。用于比率计算所选择的周期可以为扩增曲线的基线区域后的周期之一。尤其，用于比率计算的周期可以为停滞期区域中的周期之一。进一步地，用于比率计算的周期可以为最后周期。

在一实例中，初始基准值可由几个周期，例如，连续的两个周期，三个周期、四个周期、五个周期等中之比的平均计算。并且，可通过考虑几个周期中之比来适当选择初始基准值。例如，初始基准值可选择略高于一个周期中的信号值之比或几个周期中的信号值之比的值。

在特定实例中，可根据数学式III计算初始基准值：

式III：与靶有关的初始基准值＝[仅含有靶的与样品有关的相对低温下的信号]÷[仅含有靶的与样品有关的相对高温下的信号]

用于获得初始基准值的数学加工可以由多种方式进行。可通过使用机械来进行数学加工。例如，在检测器或实时聚合酶链式反应装置中可通过处理器对信号进行数学加工。选择性地，可根据预先确定的算法以手动对信号进行数学加工。

在本发明的一实例中，与初始基准值有关的信号产生机构可与步骤(a)的信号产生机构相同。

在一实例中，在步骤(b)中信号值的加工如下进行，即，从在步骤(a)中获得的信号中根据第二初始基准值去除与第二靶核酸序列有关的信号或者在步骤(a)中获得的信号中根据第一初始基准值去除与第一靶核酸序列有关的信号。

进一步地，由第二信号产生机构产生的信号的去除是从在步骤(a)中获得的信号数学上去除与第二靶核酸序列有关的信号，由第一信号产生机构产生的信号的去除是从在步骤(a)中获得的信号数学上去除与第一靶核酸序列有关的信号。

进一步地，由第二(或第一)信号产生机构产生的信号的去除是从在低温下检测的信号数学上去除与第二(或第一)靶核酸序列有关的信号，或者从在相对高温下检测的信号数学上去除与第二(或第一)靶核酸序列有关的信号。

本发明人通过使用不同的检测温度来开发对样品中多个靶核酸序列进行检测的两个技术。在前者的技术中，第一信号产生机构在所有相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号且第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号(参照WO第2015/147412号)。在后者的技术中，所有第一信号产生机构及第二信号产生机构在所有相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号。前者及后者技术分别被称为MuDT1及MuDT2技术。

在将本发明适用于MuDT1技术的情况下，本发明可以如下实施：

在一实例中，第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号且第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号，在步骤(b)中信号值的处理通过使用第一初始基准值来进行，从而从在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。

进一步地，根据下述数学式I-1提取与第二靶核酸序列有关的信号的：

式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)×(第一初始基准值)]；

在上述式中，第一初始基准值为在相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比。

在本文中所记载的数学式中，符号“-”为减法，尤其，表示减去信号。例如，减去信号通过从在一个信号中一个周期中的信号值减去在另一周期中相应的周期中的信号值来在各个周期中进行。

在本文中所记载的数学式中，符号“×”表示乘法。

在本文中所记载的数学式中，符号“÷”表示除法。

在根据数学式I-1的与第二靶核酸序列有关的信号的提取，在相对较低检测温度下检测的信号反映与第一靶核酸序列有关的信号及与第二靶核酸序列有关的信号的组合，相反，在相对较高检测温度下检测的信号仅反映与第一靶核酸序列有关的信号。因此，在假设在相对较高检测温度及相对较低检测温度下与第一靶核酸序列有关的信号不变的情况下，可从在相对较低检测温度下检测第信号减去在相对较高检测温度下检测的信号来获得与第二靶核酸序列有关的信号。但是，当考虑信号根据检测温度而异时，在减去信号之前，有必要将在相对较高检测温度下检测的信号调整(转换)为在相对较低检测温度下预期的信号。为此，使用第一初始基准值。

在选择性的实例中，第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号，在步骤(b)中信号值的处理通过使用第一初始基准值来进行并从在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。

进一步地，根据下述数学式I-2提取与第二靶核酸序列有关的信号：

式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号)÷(第一初始基准值)]；

在MuDT1技术中，在相对较高检测温度下检测的信号可被视为与第一靶核酸序列有关的所提取的信号，因为与第一靶核酸序列有关的信号仅在相对较高检测温度下检测到。

在数学式I-1及I-2中，第一初始基准值由在相对较低检测温度下的信号与在相对较高检测温度下的信号之比来表示。本技术领域的技术人员应理解，使用在相对较高检测温度下信号与在相对较低检测温度下的信号之比来表示的第一初始基准值，可通过进行一定的变形来提取与第二靶核酸序列有关的信号，上述变形使用在相对较高检测温度下的信号与在相对较低检测温度下的信号之比来表示的第一初始基准值。本技术领域的技术人员应理解这种变形属于本发明的主旨及范围内。

在将本发明适用于MuDT2技术的情况下，本发明可以如下实施：

在一实例中，两个信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号。

在一实例中，在第二初始基准值大于第一初始基准值的情况下，(i)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(ii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(iii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；或者(iv)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下信号提取与第一靶核酸序列有关的信号。

进一步地，根据数学式I-1，借助第一初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-2，借助第一初始基准值从相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-3，借助第二初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-4，借助第二初始基准值从相对较高检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号：

式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)×(第一初始基准值)]；

式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)÷(第一初始基准值)]；

在上述式中，第一初始基准值为在相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比；

式I-3：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号)×(第二初始基准值)]；

式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)÷(第二初始基准值)]，

在上述式中，第二初始基准值为在相对较低检测温度下由第二信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第二信号产生机构提供的信号之比。

参照数学式I-3，在相对较低检测温度及相对较高检测温度下检测的各个信号反映与第一靶核酸序列有关的信号及与第二靶核酸序列有关的信号的组合。假设第二初始基准值大于第一初始基准值，在相对较高检测温度下的信号与第二初始基准值的相乘将与第二靶核酸序列有关的信号(包括在相对较高检测温度下检测的信号)转换为预期在相对较低检测温度下检测的信号。并且，上述乘法阿静与第一靶核酸序列有关的信号(包括在相对较高检测温度下检测的信号)转换为大于预期在相对较低检测温度下检测的信号的信号。因此，从在相对较低检测温度下检测的信号减去上述被转换的信号的信号可使第一靶核酸序列的信号提取，因为这种减法去除与第二靶核酸序列有关的信号。

在式I-1、I-2、I-3及I-4中，初始基准值由在相对较低检测温度下的信号与在相对较高检测温度下的信号之比表示。本技术领域的技术人员应理解，使用在相对较高检测温度下信号与在相对较低检测温度下的信号之比来表示的初始基准值，可通过进行一定的变形来实现提取信号。本技术领域的技术人员应理解这种变形属于本发明的主旨及范围内。

应注意，数学式I-1及I-2均共同使用于MuDT1技术及MuDT2技术；与此相反，数学式I-3及I-4仅使用于MuDT2技术。因此，在根据本发明的方法适用数学式之前，必须确认实施了两个技术中的哪一个技术。

步骤(c)：错误提取的信号的确认及校准基准值的适用(S130、S140)

通过分析所提取的上述信号来确认所提取的上述信号是否满足预先确定的准确性标准(accuracy criterion)；若所提取的上述信号不满足准确性标准，用校准基准值来代替初始基准值，通过重复步骤(b)来再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

在步骤(c)中，通过分析在步骤(b)中所提取的信号来确认上述信号是否被准确地(或适当地、正常地)提取。若确认信号提取不准确(或适当、异常、错误)，则确定初始基准值不适当，用校准基准值代替初始基准值来再提取信号。与此相关，步骤(c)可包括：步骤(c-1)，确认所提取的信号是否准确地或适当地提取；及步骤(c-2)，若确认所提取的信号不准确或不适当，则用校准基准值代替初始基准值来再提取信号。

下述步骤(c-1)：信号提取的准确性确认

在下述步骤(c-1)中，通过分析在步骤(b)中所提取的信号来确认上述信号是否被准确地或适当地提取。可通过分析所提取的信号是否表示理论上预测的信号模式来进行上述确认。在所提取的信号表示理论上预测的信号模式的情况下，确认对靶核酸序列准确地(或正常地)进行提取。相反，在所提取的信号不表示理论上预测的信号模式的情况下，确认没有准确地(或正常地)进行提取。这种信号模式分析可以手动或自动进行。

在靶核酸序列存在于样品中的情况下，与靶核酸序列有关的理论上预测的信号模式为增加的或增长的模式(若不是，则为减少的模式)；相反，在靶核酸序列不存在于样品中的情况下，与靶核酸序列有关的理论上预测的信号模式实际上为接近0值(例如，RFU 0)的模式。

通过使用准确性标准来确认信号是否被准确地或适当地提取。

针对于信号提取，使用于本文的术语“准确性标准”是指用于区分准确提取的信号与错误提取的信号的基准。例如，准确性标准可以指确认所提取的信号是否表示理论上预测的信号模式的基准。准确性标准可以指用于确认用于信号提取的初始基准值的适当性(准确性)的基准。

只要可以区分准确提取的信号与错误提取的信号，可由本技术领域的技术人员预先确定准确性标准。准确性标准可以为非限制性的任何条件或值。准确性标准可根据经验预先确定。

在一实例中，通过考虑在信号提取中理论上预测的信号的模式来预先确定准确性标准。

如上所述，信号提取的准确性基于所提取的信号是否满足准确性标准。

即，所提取的信号满足准确性标准的确认表示用于信号提取的初始基准值的适当性，相反，所提取的信号不满足准确性标准的确认表示用于信号提取的初始基准值的不适当性。

当考虑使用于步骤(b)的初始基准值适当时，所提取的信号表示理论上预测的信号模式的可能性高。例如，假设初始基准值适当且正常信号示出正值(例如，增加的或增长的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)，示出负值(例如，减少的模式)信号可以确定时错误的。在通过采用任何小于0的值来适用为了提高这种确定的准确性的准确性标准且所提取的信号具有与阈值交叉的信号值的情况下，所提取的信号可被确定为是错误的。相反，表示正值(例如，增加的或增长的模式)的信号是理论上错误的且在阈值被选为任何大于0的值情况下，具有与阈值交叉的信号值的所提取的信号可被确定为是错误的。

可根据预先确定的阈值来例示准确性标准。

在本发明的一实例中，准确性标准是所提取的信号不具有与预先确定的阈值(或预先确定的阈值线)交叉的信号值。

例如，在准确性标准为所提取的信号不具有与预先确定的阈值交叉的信号值的情况下，除非所提取的信号具有与预先确定的阈值交叉的信号值，否则不必适用校准基准值。即，在所提取的信号不具有与预先确定的阈值交叉的信号值的情况下，不需要确定校准基准值且本发明的方法的步骤被中断。在此情况下，通过使用初始基准值来所提取的信号被准确地视为所提取的信号。

由不具有与预先确定的阈值交叉的信号值的所提取的信号表示的准确性标准包括两种情况：具有大于预先确定的阈值的信号值的所提取的信号及具有小于预先确定的阈值的信号值的所提取的信号。

术语“具有大于预先确定的阈值的信号值的所提取的信号”是指在所提取的信号中所有周期中的信号值大于预先确定的阈值。与此相同，术语“具有小于预先确定的阈值的信号值的所提取的信号”是指在所提取的信号中所有周期中的信号值小于预先确定的阈值。

例如，在准确性标准被确定为具有大于预先确定的阈值的信号值且所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值的情况下，不需要使用校准基准值来再提取信号。在准确性标准被确定为具有小于预先确定的阈值的信号值且所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值的情况下，不需要使用校准基准值来再提取信号。

当本发明的信号提取时，可基于理论上预测的信号模式来预先确定上述阈值。

作为一例，在理论上预测的正常信号模式为正值(例如，增加或增长的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)的情况下，阈值可以为任何适当的负值，准确性标准可以为所提取的信号具有大于阈值的信号值。例如，阈值可以为RFU-10、-20、-30、-40、-50、-60、-70、-80、-90、-100、-200、-300以下。在此情况下，具有阈值以下的信号值的所提取的信号，即，具有与阈值交叉的信号值的所提取的信号可被视为异常所提取的信号。

作为另一例，在理论上预测的整成信号模式为负值(例如，减少的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)的情况下，阈值可以为适当的正值，准确性标准可以为所提取的信号具有小于阈值的信号值。例如，阈值可以为RFU 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300以上，但是并不局限于此。在此情况下，具有阈值以上的信号值的所提取的信号，即，具有与阈值交叉的信号值的所提取的信号可以被视为异常所提取的信号。

应适当选择阈值，以避免正常所提取的信号，例如，因信号噪声或变化为误解为错误提取的信号。

下述步骤(c-2)：基于校准基准值的信号的再提取

在下述步骤(c-2)中，所提取的信号不满足准确性标准时适用校准基准值。

在本发明中，若所提取的信号不满足准确性标准，则重新获得校准基准值并再提取与靶核酸序列有关的信号(即，再实施步骤(b))。

在信号的文脉上，术语“再提取的，”、“进行再提取，”或“再提取”是指丢弃先前的所提取的信号而获得重新所提取的信号。

校准基准值作为除了初始基准值之外的另一基准值，使用于准确的提取信号。

如下所述，可由多种方式确定校准基准值。

在一实例中，校准基准值被确定为使所再提取的信号满足准确性标准。即，校准基准值选自所提取的信号满足准确性标准的值中。

在一实例中，在准确性标准为所提取的信号不与预先确定的阈值交叉的(及所提取的信号与预先确定的阈值交叉)情况下，校准基准值被确定为使所再提取的信号不与预先确定的阈值交叉。即，校准基准值选自所提取的信号不与预先确定的阈值交叉的值中。

在一实例中，在准确性标准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值的(及所提取的信号为具有预先确定的阈值以下的信号值)情况下，校准基准值被确定为使所再提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值。即，校准基准值选自所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值中。在此情况下，校准基准值被确定为小于初始基准值的值。

在一实例中，在准确性标准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值的(及所提取的信号具有预先确定的阈值以上的信号值)的情况下，校准基准值被确定为使所再提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值。即，校准基准值选自所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值的值中。在此情况下，校准基准值被确定为高于初始基准值的值。

在一实例中，通过以规定间距增加或减少初始基准值来确定校准基准值，直至所再提取的信号满足准确性标准。在所提取的信号具有与小于0的阈值交叉的信号值的情况下，可以由减少的方式选择适用小于初始基准值的校准基准值，直至所再提取的信号不与上述阈值交叉。在所提取的信号具有与大于0的阈值交叉的信号值的情况下，可以由增加的方式选择适用大于初始基准值的校准基准值，直至所再提取的信号不与上述阈值交叉。

例如，在初始基准值为“2.00”且所提取的信号具有与小于0的阈值交叉的信号的情况下，选择小于初始基准值的校准基准值，例如，1.90后，通过使用上述校准基准值来再提取信号。如果，在所再提取的信号依然具有与阈值交叉的信号值的情况下，选择小于1.90或其他校准基准值，例如，在选择1.80后，通过使用上述校准基准值来再提取信号。此过程重复至所再提取的信号具有不与阈值交叉的信号值时。若所再提取的信号不具有与阈值交叉的信号值，则结束上述过程。然后，采用最终使用的校准基准值及使用其的所提取的信号与靶核酸序列有关的适当的基准值及准确提取的信号。用于选择上述校准基准值的值的间距可以为规定的或者不规定的。例如，在初始基准值为“2.00”的情况下，之后所选择的校准基准值可以为“1.90”、“1.80”、“1.70”…或“1.90”，“1.70”、“1.30”…等(以固定间距)。

选择性地，在初始基准值为“2.00”的情况下，之后所选择的校准基准值可以为“1.92”、“1.70”、“1.45”等(以固定间距)。

如上所述的校准基准值大体上述初始基准值适用于步骤(a)的信号的所有周期并可再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

在还有一实例中，可根据在步骤(a)中获得的相对较高检测温度及在相对较低检测温度下检测的信号之间的变化关系来确定校准基准值。校准基准值可以为在步骤(a)中获得的相对较高检测温度及在相对较低检测温度下检测的信号间之比。

在特定实例中，可根据下述数学式IV来确定校准基准值：

式IV：与靶有关的校准基准值＝[所要分析的与样品有关的在相对较低检测温度下的信号]÷[所要分析的与样品有关的在相对较高检测温度下的信号]

尤其，校准基准值的确定如下，即，将预先确定的阈值作为准确性标准适用于所提取的信号，确认所提取的信号与上述预先确定的阈值最先交叉的点，在上述确认的点或其后中选择一个周期，计算在上述所选择的周期中在步骤(a)中的相对较高检测温度及在相对较低检测温度下的信号的变化关系。校准基准值应与初始基准值相同的方式进行计算。例如，在根据在相对较低检测温度下的信号与在相对较高检测温度下的信号之比来计算初始基准值的情况下，应根据在相对较低检测温度下的信号与在相对较高检测温度下的信号之比来计算校准基准值。在上述所选择的周期中所计算的信号的变化关系可使用于下述固定校准基准值接近法。

在一实例中，上述所选择的周期可以为具有大于或小于预先确定的阈值的信号值的任何周期。例如，在准确性标准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值的情况下，所选择的周期可以为具有小于上述预先确定的阈值的信号值的任何周期。相反，在准确性标准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值的情况下，所选择的周期可以为具有大于上述预先确定的阈值的信号值的任何周期。

在一实例中，上述所选择的周期可以为具有最高或最低的信号值的周期。例如，在准确性标准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值的情况下，所选择的周期为具有最低(最小)的信号值的周期。相反，在准确性标准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值的情况下，所选择的周期为具有最高(最大)的信号值的周期。

在一实例中，校准基准值为使上述所选择的周期中的信号值大于或小于预先确定的阈值，或者为背景水平的值。术语“背景水平”是指靶未被显著扩增时待检测的信号值，例如，约RFU 0。

在一实例中，将预先确定的阈值作为准确性标准适用于所提取的信号，确认信号值与上述预先确定的阈值最先交叉的点，在上述确认的点或其后中选择一个周期，计算在上述所选择的周期中在步骤(a)中的相对较高检测温度及在相对较低检测温度下的信号的变化关系来确定校准基准值；通过计算在所选择的上述周期之前的周期中在步骤(a)中在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号的变化关系来确定额外的校准基准值。在此情况下，所选择的周期为具有最高或最低的信号值的周期。在上述所选择的周期中计算的信号的变化关系可使用于下述可变校准基准值接近法。

在前述的实例中，校准基准值适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期及步骤(a)中的信号的所选择的周期之后的所有周期；各个额外的校准基准值代替初始基准值适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期之前的各周期，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

在一实例中，第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度产生信号，第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号，在步骤(b)中信号值的处理适用第一初始基准值来进行并从在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号，准确性标准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值。

在一实例中，与第二靶核酸序列有关的信号的提取可根据数学式I-1来进行。

在一实例中，在与第二靶核酸序列有关的所提取的信号具有预先确定的阈值以下的信号值的情况下，步骤(b)通过使用校准基准值代替初始基准值来进行重复并再提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述校准基准值被确定为使所再提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值。

校准基准值被确定为使具有预先确定的阈值以下的信号值(根据第一初始基准值提取)的周期中的任何周期中的信号值高于上述预先确定的阈值或者为背景水平(尤其，使成为背景水平)。在一实例中，校准基准值可被确定为使预先确定的阈值以下的信号值在上述预先确定的阈值及背景水平之间。

进一步地，校准基准值被确定为使根据第一初始基准值所提取的信号的值中具有最低的信号值的周期中的信号值大于预先确定的阈值或者为背景水平(尤其，成为背景水平)。在一实例中，校准基准值可被确定为使最低的信号值在预先确定的阈值及背景水平之间。

在第一初始基准值被视为适当的情况下，提取的与第二靶核酸序列有关的信号应具有第二靶核酸序列的存在及不存在时分别理论上为正值及约RFU 0值。但是，若根据任何特定基准值提取的与第二靶核酸序列有关的信号为负值，则其被视为错误的，这表示应校准初始基准值。为了提高这种确定的准确性，适用具有小于0的适当的值的阈值作为准确性标准(例如，阈值)，从而上述阈值以下的所提取的信号被视为错误的，然后适用校准基准值。

选择性地，第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号，步骤(b)中信号值的处理通过使用第一初始基准值来进行并从在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号，准确性标准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值。

在一实例中，可根据数学式I-2提取与第二靶核酸序列有关的信号。

在一实例中，在与第二靶核酸序列有关的所提取的信号具有预先确定的阈值以上的信号值的情况下，步骤(b)通过使用校准基准值代替初始基准值来进行重复并再提取与第二靶核酸序列有关的信号；上上述校准基准值被确定为使所再提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值。

校准基准值被确定为使具有预先确定的阈值以上的信号值(根据第一初始基准值提取)的周期中的任何周期中的信号值低于上述预先确定的阈值或者为背景水平(尤其，使成为背景水平)。在一实例中，校准基准值可被确定为使预先确定的阈值以上的信号值在上述预先确定的阈值及背景水平之间。

进一步地，校准基准值被确定为使根据第一初始基准值所提取的信号的值中具有最高的信号值的周期中的信号值低于预先确定的阈值或者为背景水平(尤其，成为背景水平)。在一实例中，校准基准值可被确定为使最高的信号值在预先确定的阈值及背景水平之间。

在第一初始基准值被视为适当的情况下，提取的与第二靶核酸序列有关的信号应具有第二靶核酸序列的存在及不存在时分别理论上为负值及约RFU 0值。但是，若根据任何特定基准值提取的与第二靶核酸序列有关的信号为正值，则其被视为错误的，这表示应校准初始基准值。为了提高这种确定的准确性，适用具有大于0的适当的值的阈值作为准确性标准(例如，阈值)，从而上述阈值以上的所提取的信号被视为错误的，然后适用校准基准值。

校准基准值的确定及适用可由两种方式选择实施：(i)固定校准基准值接近法；及(ii)可变校准基准值接近法。

尤其，通过培养样品与两个信号产生机构并使用产生及检测的信号来获得校准基准值，这与使用标准物质获得的初始基准值显著不同。

固定校准基准值接近法如图4A所示。

如图4A所示，固定校准基准值可以如下确定，即，将预先确定的阈值作为准确性标准适用于步骤(b)的所提取的信号，确认信号值与预先确定的阈值最先交叉的点，在上述确认的点或其后中选择一个周期，计算在所选择的上述周期中步骤(a)中的在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号变化关系。

上述预先确定的阈值表示用于确定使用于信号提取的初始基准值的适当性的阈值。若所提取的信号与预先确定的阈值交叉，信号被视为错误提取的信号，这表示应校准初始基准值。然后，确认所提取的信号与预先确定的阈值最先交叉的点。然后，选择用于校准基准值的计算的上述确认点或其后中的特定周期。上述所选择的周期被命名为PARV(用于设定校准基准值的点)。在一实例中，PARV可以为根据适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值具有最低或最高的信号值的周期。例如，在适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值为正值的情况下，PARV可以为具有最高的信号值的周期。在适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值为负值的情况下，PARV可以为具有最低信号值的周期。

在固定校准基准值接近法中，只能将所选择的周期，即，PARV中计算的一个校准基准值使用于信号再提取中。

在固定校准基准值接近法中，用在PARV中计算的校准基准值代替初始基准值适用于步骤(a)中的信号的所有周期来再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

将校准基准值适用于步骤(a)中的信号的所有周期中是指将校准基准值使用于在步骤(a)中在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测的信号的所有周期中的信号值的数学加工。

在固定校准基准值接近法中，将在PARV中计算的校准基准值适用于步骤(a)中的信号的所有周期，可通过使用下述数学式II-1或II-2来再提取与第二靶核酸序列有关的信号：

式II-1：与第二靶核酸序列有关的所再提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)×(第一校准基准值)]；

式II-2：与第二靶核酸序列有关的所再提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号)÷(第一校准基准值)]；

在上述式中，第一校准基准值为在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号与在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号之比。

当适用第一校准基准值时，用式II-1代替式I-1，用式II-2代替式I-2。

可变校准基准值接近法如图5A所示。

与固定校准基准值接近法不同，可变校准基准值接近法进一步适用额外的校准基准值。进一步地，一个校准基准值适用于从PARV到最后周期的范围的周期；多个额外的校准基准值适用于从开始周期到PARV的范围的周期。

在可变校准基准值接近法中，将预先确定的阈值作为准确性标准适用于所提取的信号，确认信号值与上述预先确定的阈值最先交叉的点，在上述确认的点或其后中选择一个周期，计算在上述所选择的周期中步骤(a)中的在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号的变化关系来确定校准基准值；计算在所选择的周期之前的周期中步骤(a)中的在相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号的变化关系来确定多个额外的校准基准值。

在可变校准基准值接近法中，上述所选择的周期为具有最高或最低的信号值的周期。

如图5A所示，确定PARV并与固定校准基准值接近法相同的方式计算PARV中的校准基准值。

校准基准值适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期及步骤(a)中的信号的所选择的周期之后的所有周期；各个额外的校准基准值代替初始基准值适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期之前的各周期中，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

PARV中的校准基准值适用于PARV及PARV之后的所有周期(即，从PARA之后的到周期最后周期)，以再提取靶信号。例如，PARV为第35周期，在第35周期中计算的校准基准值为1.30的情况下，将1.30适用于第35周期及第35周期之后的所有周期(例如，从第36周期到最后周期)，从而再提取靶信号。另一方面，在PARV前的各周期中计算额外的校准基准值。上述额外的基准值分别适用于PARV前的相应的周期。例如，在PARV为第35周期的情况下，在从第一周期到第34周期的范围的各个周期中计算额外的校准基准值，为了信号再提取适用于第一周期到第34周期的范围相应的周期。在基于适用额外的校准基准值的信号再提取在PARV前的周期实施的情况下，在上述周期中所再提取的信号值为背景水平(例如，0值；RFU 0)。即，可变校准基准值接近法通过将PARV前的周期中的信号值视为背景信号来将这些调整为背景水平(例如，0值)。图5A为示出PARV前的周期中计算额外的校准基准值后适用的一实例。选择性地，通过适用上述额外的校准基准值来考虑在所再提取的信号中PARV前的周期中的信号值被调整为背景水平(例如，0值)，所再提取的信号中PARV前的周期中的信号值可以任意改为背景水平(例如，0值)，而不用计算额外的校准基准值。选择性地，在所再提取的信号中PARV前的周期中的信号值可以任意改变为与所再提取的信号中PARV中的信号值相同的值。

尤其，PARV为根据适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值具有最低或最高的信号值的周期。例如，在适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值为正值的情况下，PARV可以为具有最高的信号值的周期。在适用于步骤(b)的所提取的信号的预先确定的阈值为负值的情况下，PARV可以为具有最低的信号值的周期。

并且，PARV为根据错误提取的信号的模式具有最低或最高的信号值的周期。例如，在具有错误提取的信号减少的模式的情况下，PARV可以为具有最低的信号值的周期。在具有错误提取的信号增加的模式的情况下，PARV可以为具有最高的信号值的周期。

在可变校准基准值接近法中，校准基准值适用于PARV及步骤(a)中获得的具有信号的最高或最低信号值的周期之后的所有周期，使周期的信号值为背景水平的各个额外的校准基准值使用于具有最高或最低的信号值的周期之前的各周期中。

在可变校准基准值接近法中，若具有最高或最低的信号值的周期，即，PARV为最后周期，则没有PARV后的周期。在此情况下，仅需要将各个额外的校准基准值适用于各个所有周期中。

如上所述，在固定校准基准值接近法中，在特定周期(例如，PARV)中计算校准基准值后将其适用于所有周期，相反，在可变校准基准值接近法中，计算用于适用于特定周期之后的所有周期的特定周期(例如，PARV)中的校准基准值及用于适用于上述周期之前的周期的额外的校准基准值。

将本发明适用于MuDT2技术的情况下，本发明可以如下实现：

在一实例中，两个信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，准确性标准为所提取的信号具有大于或小于阈值的信号值。上述准确性标准可根据与准确提取的信号相应的理论上预测的信号模式而不同。在准确提取的信号中理论上预测的信号模式为正模式(例如，增加的模式)的情况下，准确性标准可以为所提取的信号具有大于阈值的信号值。在准确提取的信号中理论上预测的信号模式为负模式(例如，减少的模式)的情况下，准确性标准可以为所提取的信号具有小于阈值的信号值。

进一步地，在第二初始基准值大于第一初始基准值的情况下，(i)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(ii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(iii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；或者(iv)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；在根据(i)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值；或者，在根据(ii)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值；或者，在根据(iii)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值；或者，在根据(iv)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值。

进一步地，在准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值且所提取的信号具有小于阈值以下的信号值的情况下，步骤(b)通过使用上述信号值大于阈值校准基准值来重复；在准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值且所提取的信号具有阈值以上的信号值的情况下，步骤(b)通过使用信号值小于阈值的校准基准值来重复。

在从在相对较低检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号且第一初始基准值适当的情况下，如上所述提取的与第二靶核酸序列有关的信号应为理论上的正值或约0值。但是，在根据任何特定基准值提取的与第二靶核酸序列有关的信号为负值的情况下，其可能被评价为错误的信号。

在从在相对较高检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号且第一初始基准值适当的情况下，如上所述提取的与第二靶核酸序列有关的信号应为理论上的负值或约0值。但是，在根据任何特定基准值提取的与第二靶核酸序列有关的信号为正值的情况下，其可能被评价为错误的信号。

在从在相对较低检测温度下的信号中提取与第一靶核酸序列有关的信号且第二初始基准值适当的情况下，如上所述提取的与第一靶核酸序列有关的信号为理论上的负值或约0值。但是，在根据任何特定基准值提取的与第一靶核酸序列有关的信号为正值的情况下，其可能被评价为错误的信号。

在从在相对较高检测温度下的信号中提取与第一靶核酸序列有关的信号且第二初始基准值适当的情况下，如上所述提取的与第一靶核酸序列有关的信号为理论上的正值或约0值。但是，在根据任何特定基准值提取的与第一靶核酸序列有关的信号为负值的情况下，其可能被评价为错误的信号。

在一实例中，准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值且所提取的信号具有阈值以下的信号值，在步骤(b)通过使用使信号值大于阈值的校准基准值来重复的情况下，校准基准值被确定为所提取的信号的值中使具有最低的信号值的周期中的信号值高于预先确定的阈值或者为背景水平。

在一实例中，准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值且所提取的信号具有阈值以上的信号值，在步骤(b)通过使用使信号值小于阈值的校准基准值来重复的情况下，校准基准值被确定为使所提取的信号的值中具有最高的信号值的周期中的信号值低于预先确定的阈值或者为背景水平。

校准基准值的适用可与MuDT1技术类似的方式实施。例如，在根据式I-1或I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号，校准基准值的适用可准确地再提取步骤(a)中的靶核酸序列有关的信号。在根据式I-3或I-4来进行与第一靶核酸序列有关的信号的情况下，校准基准值的适用可通过适用于步骤(a)中的信号的所有周期并使用下述式II-3或II-4来再提取与第二靶核酸序列有关的信号：

式II-3：与第一靶核酸序列有关的所再提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号)×(第二校准基准值)]

式II-4：与第一靶核酸序列有关的所再提取的信号＝[在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号)÷(第二校准基准值)]

在上述式中，第二校准基准值为在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度下的信号与在步骤(a)中获得的在相对较低检测温度下的信号之比。

在固定校准基准值接近法中，可通过在步骤(a)中的信号的所有周期中适用校准基准值并使用数学式II-1、II-2、II-3或II-4来准确地再提取与第二靶核酸序列有关的信号。在上述接近法中，校准基准值可以为在步骤(a)中获得的信号之比。

在可变校准基准值接近法中，校准基准值适用于具有在步骤(a)中获得的信号的最高或最低信号值的周期及上述周期之后的所有周期中，用于使周期的信号值为背景水平的各个额外的校准基准值适用于最高或最低信号值的周期之前的各周期中。在上述接近法中，校准基准值可以为在步骤(a)中获得的信号之比。并且，额外的校准基准值也可以为在步骤(a)中获得的信号之比。

对于额外的校准基准值详细说明可参照上述说明来进行描述。

根据本发明与靶核酸序列有关的提取的(或再提取的)信号不包括其他靶核酸序列的信号。提取的(或再提取的)信号不仅表示靶核酸序列的扩增曲线，而且表示具有其他信息的另一形态的信号。

例如，在使用MuDT1技术的实例中，在由在相对较高检测温度下的信号减去相对较低检测温度下的信号的方式进行信号提取的情况下，其结果可以表示靶核酸序列的扩增曲线的信号(正模式信号)。在由在相对较低检测温度下的信号减去在相对较高检测温度下的信号的方式进行信号提取的情况下，其结果可表示与扩增曲线不同的信号(正模式的信号)。

在使用MuDT2技术的实例中，提取的(或再提取的)信号可表示除扩增曲线之外的用于靶检测的变化的曲线。

信号提取可以被认为是与靶核酸序列有关的信号的提取，因为仅包括靶核酸序列的信号而没有靶核酸序列的信号。

在数学式I-1、I-2、I-3及I-4中，第一初始基准值由在相对较低检测温度下的信号与在相对较高检测温度下的信号之比来表示。本技术领域的技术人员应理解，可通过使用在相对较高检测温度下的信号与在相对较低检测温度下的信号之比表示的第一初始基准值来对与第二靶核酸序列有关的信号提取作出略微的变形。本技术领域的技术人员应理解这些变形属于本发明的主旨及范围内。

在MuDT1技术及MuDT2技术中，与前述的方法类似的方式，可通过使用三个以上的基准值来从与靶核酸序列有关的信号中提取与靶核酸序列有关的信号。在此情况下，所提取的上述信号可能表示错误的信号模式，因此本发明的方法也可适用于准确再提取信号中。在所提取的信号表示错误的信号模式的情况下(即，所提取的信号不满足预先确定的阈值的情况)，可用校准基准值代替初始基准值来再提取信号。

在从样品中与两个靶核酸序列有关的信号中提取一个与靶核酸序列有关的信号的一实例中，样品中两个靶核酸序列选自样品中三个以上的靶核酸序列中。

本发明的方法可涉及在能够产生与三个以上的靶核酸序列有关的三个以上的信号的反应中提取一个与靶核酸序列有关的信号。

并且，与三个靶核酸序列有关的信号提取能够以与两个靶核酸序列有关的信号提取类似的方式进行。

即，样品中与三个靶核酸序列有关的信号的一个与靶核酸序列有关的信号提取可包括样品中与两个靶核酸序列有关的信号的一个与靶核酸序列有关的信号提取的一实施方式。

作为一例，详细记载了样品中的与三个靶核酸序列有关的信号的与靶核酸序列有关的信号的提取方法。

在MuDT1技术中，使用三个信号产生机构(例如，第一信号产生机构，第二信号产生机构及第三信号产生机构)及三个检测温度(例如，相对较高检测温度、相对中间检测温度及相对较低检测温度)。

第一信号产生机构在相对较高检测温度、相对中间检测温度及相对较低检测温度下产生信号；第二信号产生机构在相对中间检测温度及相对较低检测温度下产生信号；第三信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号。

在单一反应容器中，与可产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构、可产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构及可产生与第三靶核酸序列有关的信号的第三信号产生机构一同培养样品，在相对较高检测温度、相对中间检测温度及相对较低检测温度下由单一类型的检测器检测信号。然后，通过使用第一初始基准值来数学加工在相对较高检测温度下检测的信号及相对中间检测温度下检测的信号，并提取与第二靶核酸序列有关的信号；第一初始基准值为表示在相对较高检测温度及相对中间检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值。确认第一初始基准值的适合性并根据本发明的方法来进行校准。

然后，若在上述提取步骤的结果中确定第一靶核酸序列及第二靶核酸序列之一不存在，则与样品中存在两个靶核酸序列一样，根据本发明的方法提取在相对较低检测温度下检测到的信号及相对中间检测温度下检测到的信号。

另一方面，若确定均存在第一靶核酸序列及第二靶核酸序列，则可通过作出如下变形来适用本发明的方法：通过使用与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的混合物有关的初始基准值数学加工在相对较低检测温度下检测的信号及相对中间检测温度下检测的信号来提取与第三靶核酸序列有关的信号；第一靶核酸序列及和第二靶核酸序列的混合物有关的初始基准值为表示在相对中间检测温度及相对较低检测温度下由第一信号产生机构及第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值。

然后，为了确认各个所提取的上述信号是否满足准确性标准，各个与第二靶核酸序列有关的所提取的信号及与第三靶核酸序列有关的所提取的信号经本发明的方法的步骤(c)。

像这样，与提取与两个靶核酸序列有关的信号类似的方式，可提取与三个靶核酸序列有关的信号。

因此，本技术领域的技术人员应理解，可通过对本发明的方法作出略微的变形来使用于提取三个以上的与靶核酸序列有关的信号。

在一实例中，培养包括多个培养，单独确定和培养有关的校准基准值。

使用于本文的术语“多个培养”是指在不同的反应容器、管或孔中进行的培养。在多个培养中进一步强调了本发明的优点。假设多个培养包括未知量的“淋病奈瑟氏菌”靶序列及“沙眼衣原体”靶序列的特定组合，则通常使用与各个靶核酸序列有关的单一基准值来分析多个培养。本发明人发现这种单一基准值的使用可能会导致错误的检测结果。在一实例中，将与“淋病奈瑟氏菌”靶序列有关的初始基准值或与“沙眼衣原体”靶序列有关的初始基准值适用于所有培养后，需要的情况下，将单独确定的校准基准值适用于单独培养中。

II.用于信号提取的储存介质、计算机程序及装置

以下记载的本发明的储存介质、装置及计算机是用于在计算机中执行本发明的方法的，因此为了避免导致本说明书的复杂性的过度的重复而省略它们之间的共同内容。

在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机可读储存介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法，上述从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法包括：

步骤(a)，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下从与样品有关的信号产生过程接收信号值；借助第一信号产生机构检测样品中的第一靶核酸序列，借助第二信号产生机构检测样品中的第二靶核酸序列；上述检测步骤在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；

步骤(b)，通过使用第二初始基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一初始基准值对在步骤(a)中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一初始基准值为表示在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二初始基准值为在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；通过使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构来从对照组反应预先确定上述第一初始基准值，通过使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构来从对照组反应预先确定上述第二初始基准值；以及

步骤(c)，确认所提取的上述信号是否满足准确性标准；若所提取的上述信号不满足准确性标准，则通过使用校准基准值代替初始基准值来重复步骤(b)，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号；上述校准基准值被确定为使所再提取的信号满足准确性标准。

在一实例中，第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值储存于计算机可读储存介质中。在一实例中，在执行本方法中，计算机可读储存介质包括输入第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值的指令。在一实例中，计算机可读储存介质还包括运行处理器的指令，上述处理器用于执行用于获得第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值的方法。

在本发明的又一实施方式中，提供一种计算机程序，运行用于执行从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法的处理器且储存于计算机可读储存介质，上述从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法包括：

在本发明的一实例中，上述计算机程序包括第一初始基准值(或第二初始基准值)。在本发明的一实例中，在执行本方法中，上述计算机程序包括输入第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值的指令。在本发明的一实例中，上述计算机程序还包括用于运行处理器的指令，上述去处理用于执行用于获得第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值的方法。

在通过处理器来执行的情况下，通过启动上述程序指令来使处理器执行上述记载的本发明。用于执行本方法的上述程序指令可包括在相对较高检测温度及相对较低检测温度下从具有样品的信号产生过程中接收信号值的指令；处理用于提取信号而接收信号值的指令；记忆确认所提取的信号是否满足准确性标准的指令。在一实例中，用于执行本方法的程序指令还可包括用于获得第一初始基准值(或第二初始基准值)及其校准基准值的指令。

上述记载的本发明的方法在处理器中执行，例如，在独立计算机、联网计算机或实时聚合酶链式反应设备等的数据收集装置中的处理器中执行。

计算机可读存储介质的类型包括刻录光盘(CD-R)、只读储存器(CD-ROM)、数字多功能光盘(DVD)、闪存存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘、通用串行总线(USB)、磁带、迷你光碟(MINIDISC)、非易失性存储卡、电可擦只读存储器(EEPROM)、光盘(CD)、光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、系统存储器及web服务器等多种存储介质。

可由几种设备接收信号产生过程的信号值。例如，信号值可由聚合酶链式反应数据获得装置中的处理器来获得。在进行收集期间可实时向处理器提供信号值或者可储存于存储器单元或缓冲区，在完成实验后可在处理器提供上述信号值。类似地，通过与上述获得装置的网络连接(例如，局域网(LAN)、虚拟专用网络(VPN)、互联网及内联网)或直接连接(例如，通用串行总线、其它直接有线连接或无线连接)向独立计算机系统等额外的系统提供信号值，或者可向光盘、数字多功能光盘、软盘、便携式硬盘或独立计算机系统等便携式介质提供信号值。类似地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供上述数据集。

在接收或获得信号值后，处理信号值并根据第二初始基准值来提取与第一靶核酸序列有关的信号或者根据第一初始基准值来提取与第二靶核酸序列有关的信号。处理器用于确认所提取的信号是否满足准确性标准。若所提取的信号不满足准确性标准，用校准基准值代替初始基准值来重复步骤(b)。

用于实现运行本发明的处理器的指示可包含在逻辑系统。虽然可向便携式硬盘、通用串行总线、软盘、光盘及数字多功能光盘等的任何软件存储介质提供上述指示，但是可进行下载且可存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着随机存取存储器、只读存储器等其他存储器)。用于运行本发明的计算机代码可运行为如C、C++、Java、VisualBasic、VBS cript、Java Script、Perl及XML等多种代码语言。并且，多种语言及协议可利用于基于本发明的数据和命令的外部及内部存储和传送。

在本发明的又一实施方式中，提供一种用于从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的装置，包括：(a)计算机处理器；以及(b)如上所述的计算机可读储存介质，与上述计算机处理器相连接。

在一实例中，装置还包括：反应容器，用于收容样品及信号产生机构；温度调节机构，用于调节上述反应容器的温度；和/或检测器，用于检测周期中信号。

在一实例中，计算机处理器不仅在信号产生过程的一个以上的周期中接收信号值，而且根据基准值处理获得的信号值来提取信号并确认所提取的上述信号是否满足预先确定的准确性标准。能够使单一处理器执行几种行为的方式构建处理器。选择性地，能够使多个处理器分别执行几种行为的方式构建处理器单元。

在一实例中，可通过在用于靶核酸序列的检测的现有的装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)中设置软件来实现处理器。

例如，可在实时聚合酶链式反应系统中实现本发明的装置。上述系统包括用于执行实时聚合酶链式反应扩增的实时聚合酶链式反应装置及通过电缆与实时聚合酶链式反应装置相连接的逻辑系统以用于提取信号并显示校准产物。上述计算机系统根据用于需求可由曲线图、表及文字等多种形态显示提取产物。上述计算机系统可包括用于执行本发明的方法的包括在计算机可读储存介质中的指令。可在一个系统中合并实时聚合酶链式反应装置及计算机系统。

可由多种方式接收信号值呈扩增曲线，例如，可通过实时聚合酶链式反应装置的数据收集器中的处理器来接收及收集信号值。当收集信号值时，由实时方式向处理器提供这些，但是在储存在内存单元或缓冲区后，在完成实验后可在处理器提供信号值。

类似的，可通过网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、内联网及互联网)或直接连接(例如，通用串行总线及直接有线连接或无线连接)或者光盘、数字多功能光盘、软盘及便携式硬盘等便携式介质，从实时聚合酶链式反应装置中向台式计算机系统等的计算机系统提供信号值。选择性地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端连接的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供信号值。

在接收或获得信号值后，信号值处理器根据基准值提取信号。本发明的信号提取可通过设置于计算机系统的应用(即，程序)来执行。选择性地，这可通过应用商店服务器或应用提供商服务器由直接设置的应用来执行，可在计算机系统的操作体系中操作应用。运行体系包括移动操作体系，如设置于视窗、麦金塔及智能手机和平板电脑等移动终端上的iOS及安卓。

如上所述，在上述计算机系统中可由提供商设置或由用户设置的应用(即，程序)来实现本发明的信号提取方法，并可记录于计算机可读储存介质。

实现本发明的方法的计算机程序可实现用于信号提取的所有功能。计算机程序可以为包括程序指令的程序，上述程序指令存储于实现用于执行本发明的方法的处理器的计算机可读储存介质中。

计算机程序可通过使用C、C++、Java、Visual Basic、VBS cript、Java Script、Perl、XML及代码语言等适当的计算机语言来编码。上述程序可包括用于上述数学功能的功能代码及由计算机系统的处理器依次实现处理器的处理器代码。

上述代码可包括存储器参考码，由处理器实现上述功能所需的附加信息或介质在计算机系统的内部或外部储存器的位置(地址)处被参照。

在计算机系统需要与另一个远程计算机或服务器通信以实现处理器的功能的情况下，上述代码还可包括处理器编码的通信相关代码，处理器编码的通信相关代码通过使用通信模块(例如，有限/或无线通信模块)来如何与远程的另一种计算机或服务器进行通信或者传递什么样的信息或介质。

用于实现本发明的功能性程序及代码(代码片段)可通过考虑用于解读储存介质并执行程序的计算机的系统环境来很容易地由本技术领域的程序员推断或变形。

在计算机系统中可分布有与网络连接的储存介质，可计算机可读代码能够以分布方式储存并执行。在此情况下，多个分布的计算机中的至少一台计算机可实现一些功能，并实现一些功能且可将实现结果传输给至少一台能够传输给计算机的至少一台计算机中。

用于实施本发明的记录有应用(即，程序)的储存介质包括应用商店或包括在应用提供商服务器的储存介质(例如，硬盘)、应用提供商服务器、上述程序及具有其储存介质的其他计算机。

可解读储存介质的计算机系统不仅包括台式计算机或笔记本电脑等的普通计算机、智能手机、平板电脑、掌上电脑(PDA)(个人数字助理装置)及移动通信终端等的移动终端，还可包括所有可执行计算的装置。

III.靶核酸的检测

与靶核酸序列有关的所提取的信号可用于靶核酸序列的检测。靶核酸序列的检测包括样品中的靶核酸序列的存在的确定。靶检测可由本技术领域中已知的多种方法来实现。例如，靶检测可通过在所提取的信号的图形中适用阈值并确认图形及阈值之间是否有交叉点来实现。若由交叉点，则确定靶核酸序列的存在；若没有交叉点，则确定靶核酸序列的不存在。

本发明的特征及优点如下：

(a)使用初始基准值及校准基准值的本发明可以以更加准确、有效、可重现的方式提取与靶核酸序列有关的信号，因此克服与使用单一基准值的方法相关的缺点。

(b)本发明可通过使用不同的检测温度及基准值来有助于显著改善检测靶核酸序列的方法。

(c)使用初始基准值及校准基准值的本发明可通过使用不同的检测温度及基准值来在检测靶核酸序列的方法中提高检测准确性。

(d)尤其，在使用缩退性引物组的核糖核酸把检测或具有低浓度的相对较低检测温度的靶核酸序列的情况下，更加突出本发明的有用性。

(e)在本发明中，用于检测靶核酸序列的更准确的信号提取开发用于执行信号提取的本发明的方法，从而实用。

通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明，在所附的发明要求保护范围中所公开的本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

实施例

实施例1：基于MuDT1技术的信号检测及提取

在MuDT1技术的一实例中，第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号，信号值的处理通过使用第一初始基准值来进行，从而从在相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。

1-1.模板及寡核苷酸的准备

作为在不同的检测温度下以实时方式检测信号的实时聚合酶链式反应接近法使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法(WO第2012/096523好)。

为了上游引物及下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋病奈瑟氏菌的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。

作为信号产生机构通过使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法并用于检测淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的探测和标记寡核苷酸包括(i)包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列有关的5’-标记部位及(ii)包含与靶核酸序列互补的杂化核苷酸序列有关的3’-靶向部位。捕获和模板寡核苷酸包括从3’到5’的方向(i)包含与探测和标记寡核苷酸有关的5’-标记部位或上述5’-标记部位的部分互补的核苷酸序列的捕捉部位及(ii)包含与探测和标记寡核苷酸有关的5’-标记部位及3’-靶向部位非互补的核苷酸序列的模板化部。捕获和模板寡核苷酸在5’-末端标记为淬灭分子(BHQ-2)及在模板化部位标记为荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)。探测和标记寡核苷酸及捕获和模板寡核苷酸在3’-末端用碳垫片阻断，以防止延伸。

由于探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法使用单一类型的荧光标记(CALFluor Red 610)，因此不可能由单一检测器在单一反应容器中分辨与靶核酸序列有关的信号。

在探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法中，在靶序列存在的情况下，切割与上述靶核酸序列杂化的探测和标记寡核苷酸，并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段退火到捕获和模板寡核苷酸的捕捉部位，并在捕获和模板寡核苷酸的模板化部位上延伸，从而形成于捕获和模板寡核苷酸延伸的二聚体(Duplexed CTO)。上述延伸二聚体的形成提供信号，可通过在延伸二聚体形成温度细测定信号来获得扩增曲线。

在本实施例中，各个延伸二聚体的序列及长度以与沙眼衣原体有关的二聚体可在72℃的温度下形成且与淋病奈瑟氏菌有关的延伸二聚体可在60℃的温度下形成而不是72℃的温度的方式设计。

因此，在72℃的检测温度下，仅检测与沙眼衣原体有关的信号，相反，在60℃的检测温度下，不仅检测与淋病奈瑟氏菌有关的信号，还检测与沙眼衣原体有关的信号。

在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕获和模板寡核苷酸的序列如表1所示。

表1

I：脱氧肌苷

探测和标记寡核苷酸：探测及标记寡核苷酸

捕获和模板寡核苷酸：捕捉及模板化部位寡核苷酸

BHQ：淬灭(黑洞淬灭)

加下划线的字符：探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位

1-2.实时聚合酶链式反应及不同温度下的信号检测

在含有靶核酸(10pg或100fg的淋病奈瑟氏菌或沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸、10pg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及100fg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物、100fg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及100fg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物、或者100fg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5皮摩尔的用于淋病奈瑟氏菌靶扩增的上游引物(序列号：1)、5皮摩尔的下游引物(序列号：2)、3皮摩尔的探测和标记寡核苷酸(序列号：3)及1皮摩尔的捕获和模板寡核苷酸(序列号：4)、5皮摩尔的用于沙眼衣原体靶扩增的上游引物(序列号：5)、5皮摩尔的下游引物(序列号：6)、3皮摩尔的探测和标记寡核苷酸(序列号：7)及1皮摩尔的捕获和模板寡核苷酸(序列号：8)、及5μl的4×主混合液(最终浓度，200μM的dNTPs、2mM的MgCl₂、2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)(韩国Enzynomics)的20μl的最终体积进行了探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的实时聚合酶链式反应。将上述反应混合物放置在50℃的温度下的实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，伯乐公司(Bio-Rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。上述结果如图2A及图2B所示。

如图2A所示，在仅含有淋病奈瑟氏菌靶(10pg或100fg)的样品的情况下，在60℃的温度下检测出信号，但是在72℃的温度下没有检测出信号；在仅含有沙眼衣原体靶(10pg或100fg)的样品的情况下，在60℃及72℃的温度下均检测出信号。

如图2B所示，在含有所有淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体靶(10pg的淋病奈瑟氏菌+100fg的沙眼衣原体；100fg的淋病奈瑟氏菌+100fg的沙眼衣原体；及100fg的淋病奈瑟氏菌+10pg的沙眼衣原体)的样品的情况下，在60℃及72℃的温度下均检测出信号；在不含有靶的样品(NTC)的情况下，在60℃及72℃的温度下没有检测出信号。

1-3.与靶核酸序列有关的信号的提取

如图2A及2B所示，仅在72℃的温度下检测出与沙眼衣原体靶有关的信号，因此可从在72℃的温度下检测出的信号直接获得。相反，在60℃的温度下与沙眼衣原体靶有关的信号一同检测出与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号，而没有在72℃的温度下检测到，因此，为了提取和淋病奈瑟氏菌靶有关的信号，从60℃的温度下的信号应去除与沙眼衣原体靶有关的信号。应注意的是，靶核酸，尤其，与沙眼衣原体有关的信号强度可根据检测温度不同，及，在60℃的温度下的信号的强度可能更大于在72℃的温度下的信号。因此，在72℃的温度下检测的与沙眼衣原体靶有关的信号应适当转换为在60℃的温度下预测的信号。为此，此方法使用了基准值。

具体地，根据式I-1，可使用示出与沙眼衣原体靶有关的在72℃及60℃的温度下的信号的变化关系的基准值来提取与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号：

式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在相对较低检测温度下的信号]-[(在相对较高检测温度下的信号)×(第一初始基准值)]；

在上述式中，第二靶核酸序列为淋病奈瑟氏菌靶，相对较低检测温度为0℃，相对较高检测温度为72℃，第一初始基准值是与沙眼衣原体有关的基准值。

可绘制和淋病奈瑟氏菌靶有关的所提取的信号。

可根据式III-1计算与沙眼衣原体靶有关的初始基准值：

式III-1：与沙眼衣原体有关的初始基准值＝[与仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品有关的在60℃的温度下的信号]÷[与仅含有沙眼衣原体的对照组样品有关的在72℃的温度下的信号]

与沙眼衣原体靶有关的基准值可根据反应条件不同。因此，通过重复实验可获得与沙眼衣原体有关的一些不同的基准值。即，可从仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品中在特定范围的值中获得与沙眼衣原体有关的基准值。

对于本技术领域的技术人员而言，从仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品中从特定范围中获得与沙眼衣原体有关的基准值，为了从60℃的温度下的信号中去除与沙眼衣原体靶有关的信号，在上述基准值中选择一个适当的基准值是普遍的。本发明人确认，当单一基准值对单个反应不合适时，将与沙眼衣原体靶有关的单一基准值适用于所有反应可能导致错误的信号。

例如，对于含有10pg的沙眼衣原体靶的样品，通过使用1.30的单一基准值在60℃的温度下的信号来提取的与淋病奈瑟氏菌有关的信号模式如图3所示。由于上述样品仅含有沙眼衣原体靶，因此，在适用与沙眼衣原体靶有关的适当的单一基准值的情况下，通过去除沙眼衣原体靶信号来提取的和淋病奈瑟氏菌有关的信号在所有周期中理论上约为RFU0。与这样的预期不一样，因去除大于来源于沙眼衣原体靶的信号的信号，而与沙眼衣原体靶有关的单一基准值(1.30)的适用产生小于阈值的错误的信号。上述错误的信号表示上述单一基准值不适合上述样品且需要小于上述单一基准值的新的基准值。

这样的结果证明，在为了与靶核酸序列有关的信号提取在所有反应中适用单一基准值的情况下，因对特定样品的基准值的不适合性而可导致产生错误的信号。

实施例2：基于MuDT1技术的使用校准基准值的信号再提取

本发明人为了代替实施例1的不适当的基准值采用了校准基准值。通过使用初始基准值来提取与靶核酸序列有关的信号。若所提取的信号不满足预先确定的准确性标准，则视为初始基准值不适合上述样品的分析，然后，通过使用校准基准值来再提取信号。通过使用准确性标准来评价所提取的信号是否表示理论上可预测的信号模式(即，准确的信号)。尤其，上述准确性标准为所提取的信号不具有与预先确定的阈值交叉的信号值。因此，若所提取的信号具有与预先确定的阈值交叉的信号值，则确定并适用校准基准值。

校准基准值的确定及适用可选自两种方式来进行：(i)固定校准基准值接近法；及(ii)可变校准基准值接近法。在固定校准基准值接近法中，基于在特定周期中的信号确定的校准基准值适用于所有周期。在可变校准基准值接近法中，基于在特定周期之前的各周期的信号确定的各个额外的校准基准值及在特定周期中的信号确定的校准基准值以不同的方式分别适用于特定周期之前的周期及特定周期之后的周期。两种接近法的详细说明如下：

2-1.固定校准基准值接近法

固定校准基准值接近法如图4A所示。

通过使用1.30的初始基准值来数学加工实施例1的实验结果(图2A及图2B)并提取淋病奈瑟氏菌靶的信号。所提取的信号将不与预先确定的阈值RFU-100交叉的准确性标准用作预先确定的阈值。在所提取的信号具有不与阈值交叉的信号的情况下，初始基准值被视为不适当且需要进行校准。在所提取的信号具有与阈值交叉的信号值的情况下，初始基准值被视为适当且不需要进一步校准校准基准值。在需要初始基准值的校准的情况下，作为用于计算校准基准值的周期选择具有最低的RFU的周期，并将其命名为PARV(用于设定校准基准值的点)(图4A，参照上部)。然后，根据式IV-1，在60℃及72℃的温度下，基于样品信号计算PARV中的校准基准值，并将其命名为PARV中的校准RV(基准值)(图4A，参照中间部)。

式IV-1：与沙眼衣原体靶有关的校准基准值＝[与所分析的样品有关的在60℃的温度下的信号]÷[和所分析的样品有关的在72℃的温度下的信号]

根据数学式I-1，为了再提取淋病奈瑟氏菌靶的信号，在72℃的温度下，在样品的信号的所有周期中适用PARV中的校准RV后，再提取了信号(图4A，参照下部)。根据上述信号再提取，校准了由信号提取产生的错误的信号模式。

并且，对固定校准基准值接近法是否能够成功地适用于其他样品进行了评价。根据固定校准基准值接近法，从含有多种浓度的淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的混合物的样品中再提取淋病奈瑟氏菌靶的信号(参照图4B及图4C)。

如图4B及图4C所示，对于仅含有淋病奈瑟氏菌靶的样品，所提取的信号没有与阈值交叉的信号值，因此，不需要校准基准值。对于单独含有沙眼衣原体靶或者含有100fg的淋病奈瑟氏菌及10pg的沙眼衣原体的混合物，所提取的信号具有与阈值交叉的信号值，因此确定并适用校准基准值。在适用校准基准值后，对于仅含有沙眼衣原体的样品，所再提取的信号具有约为RFU 0的信号值，对于含有淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体靶混合物的样品，所再提取的信号具有正信号值，这表示在所有样品中准确再提取和淋病奈瑟氏菌靶有关的信号。图4D示出适用于各反应的初始基准值、PARV及PARV中的固定校准基准值。

从这些结果可以推断，在使用单一检测通道的不同检测温度下的多个靶核酸序列的检测中，固定校准基准值接近法校准因不适当的基准值导致的错误的信号，从而可以更准确的方式检测靶核酸序列。

2-2.可变校准基准值接近法

可变校准基准值接近法如图5A所示。

通过使用1.30的初始基准值来数学加工实施例1的实验结果(参照图2A及图2B)并提取淋病奈瑟氏菌靶的信号。所提取的信号将不与预先确定的阈值RFU-100交叉的准确性标准用作预先确定的阈值。在所提取的信号具有与阈值交叉的信号值的情况下，初始基准值被视为不适当且需要进行校准。在所提取的信号不具有与阈值交叉的信号值的情况下，初始基准值被视为适当且不需要进一步校准校准基准值。在需要校准初始基准值的情况下，选择具有最低的RFU的周期作为用于计算校准基准值的周期的PARV(图5A，参照上部)。然后，根据数学式IV-1，基于在60℃及72℃的温度下的样品的信号计算PARV及PARV前的各周期中的校准基准值(图5A，参照中间部)。PARV前的各周期中的校准基准值适用于PARV前的各周期中，PARV中的校准基准值适用于PARV后的所有周期周，再提取信号(图5A，参照下部)。根据信号再提取校准了错误的信号模式。

并且，对可变校准基准值接近法是否能够成功地适用于其他样品进行了评价。根据可变校准基准值接近法，从含有多种浓度的淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体的混合物的样品中再提取淋病奈瑟氏菌靶的信号(参照图5B及图5C)。

如图5B及5C所示，对于仅含有淋病奈瑟氏菌靶的样品，所提取的信号没有与阈值交叉的信号值，因此，不需要校准基准值。对于单独含有沙眼衣原体靶或者含有100fg的淋病奈瑟氏菌及10pg的沙眼衣原体的混合物，所提取的信号具有与阈值交叉的信号值，因此确定并适用校准基准值。在适用校准基准值后，对于仅含有沙眼衣原体的样品，所再提取的信号具有约为RFU 0的信号值，对于含有淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体靶混合物的样品，所再提取的信号具有正信号值，这表示在所有样品中准确再提取与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号。图5D示出适用于各反应的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。

选择性地，所提取的信号可使用具有大于预先确定的阈值的信号值的准确性标准。在所提取的信号具有与预先确定的阈值以下的信号值的情况下，初始基准值被视为不适当且不需要进行校准。上述选择性基准的使用可提供类似校准的结果。

从这些结果可以推断，在使用单一检测通道的不同检测温度下的多个靶核酸序列的检测中，可变校准基准值接近法校准因不适当的基准值导致的错误的信号，从而可以更准确的方式检测靶核酸序列。

实施例3：基于MuDT2技术的信号检测及提取

在MuDT2技术的一实例中，两个信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号。通过进行信号值处理，根据第一初始基准值，从在相对较低检测温度下的信号或者在相对较高检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号。与此相同，通过信号值的处理，根据第二初始基准值，从在相对较低检测温度下的信号或在相对较高检测温度下的信号中提取与第一靶核酸序列有关的信号。

3-1.模板及寡核苷酸的制备

作为在不同检测温度下以实时方式用于检测信号的实时聚合酶链式反应接近法使用了TaqMan方法。

在上游引物及下游引物的衍射及TaqMan探针的切割中使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。作为靶核酸序列使用了淋病奈瑟氏菌的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸。

在TaqMan实时聚合酶链式反应中存在靶核酸的情况下，TaqMan探针释放被切割的标记的片段。上述标记的片段的释放可通过提供信号并从上述标记的片段测定信号来获得扩增曲线。

用于淋病奈瑟氏菌的TaqMan探针在5’-末端由荧光报道分子(Quasar 670)标记及在3’-末端由淬灭分子(序列号：9)，用于沙眼衣原体的TaqMan探针在5’-由荧光报道分子(Quasar 670)标记及在内部网站中由淬灭分子(BHQ-2)标记(序列号：12)。

在本实施例中，均在60℃及72℃的温度下检测到与淋病奈瑟氏菌有关的信号及与沙眼衣原体有关的信号。使用于两个靶的TaqMan探针在两个检测温度之提供不同的信号变化关系(即，不同的基准值)。尤其，本实施例中以对沙眼衣原体的60℃及72℃下的信号差异大于淋病奈瑟氏菌的方式设计了TaqMan探针。

在本实施例中使用的上游引物、下游引物及TaqMan探针的序列如表2所示。

表2

I：脱氧肌苷

BHQ：淬灭(黑洞淬灭)

3-2.实时聚合酶链式反应及不同温度下的信号检测

靶核酸(10pg或1pg的淋病奈瑟氏菌或沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸、10pg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及1pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物、10pg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物或者1pg的淋病奈瑟氏菌基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5皮摩尔的用于淋病奈瑟氏菌靶扩增的上游引物(序列号：1)、10皮摩尔的下游引物(序列号：2)及1.5皮摩尔的TaqMan探针(序列号：9)、5皮摩尔的用于沙眼衣原体靶扩增的上游引物(序列号：10)、10皮摩尔的下游引物(序列号：11)及3皮摩尔的TaqMan探针(序列号：12)、及5μl的4×主混合液(最终浓度，200μM的dNTPs、2mM的MgCl₂、2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)(韩国Enzynomics)的20μl的最终体积进行了TaqMan方法的实时聚合酶链式反应。将上述反应混合物放置在50℃的温度下的实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，伯乐公司)中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。上述结果如图图6A及图6B所示。

如图6A及6B所示，当淋病奈瑟氏菌、沙眼衣原体或者淋病奈瑟氏菌+沙眼衣原体靶存在时，在60℃及72℃的温度下均检测到信号，当靶不存在时(NTC)未检测到信号。

3-3.与靶核酸序列有关的信号的提取

如图6A及6B所示，从在60℃或72℃的温度下检测的信号不能直接获得对于各个靶的信号。因此，为了提取对于各个靶的信号，从各个检测温度下的信号中应去除对于其他靶的信号。

可通过使用对各个靶示出在72℃及60℃的温度下的信号变化关系的基准值来提取对于各个靶的信号。在本实施例中，根据数学式I-1及数学式I-4提取信号：

在上述式中，第二靶核酸序列为沙眼衣原体靶；第一初始基准值为在相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比。

式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在相对较高检测温度下的信号]-[(在相对较低检测温度下的信号)÷(第二初始基准值)]；

在上述式中，第一靶核酸序列为淋病奈瑟氏菌靶；第二初始基准值为在相对较低检测温度下由第二信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第二信号产生机构提供的信号之比。

可绘制对各个靶的所提取的信号。

可根据数学式III-1及数学式III-2来计算对各个靶的基准值：

式III-1：与沙眼衣原体有关的初始基准值＝[对仅含有沙眼衣原体的对照组样品的60℃的温度下的信号]÷[对仅含有沙眼衣原体的对照组样品的2℃的温度下的信号]

式III-2：与淋病奈瑟氏菌有关的初始基准值＝[对仅含有淋病奈瑟氏菌的对照组样品的60℃的温度下的信号]÷[对仅含有淋病奈瑟氏菌的对照组样品的72℃的温度下的信号]

如图7A及7B所示，通过使用与沙眼衣原体靶有关的初始基准值，从72℃的温度下的信号提取与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号。与沙眼衣原体有关的初始基准值预先被确定为“5.00”。在含有10pg或1pg的沙眼衣原体靶的样品中，对沙眼衣原体靶的初始基准值(5.00)的适用因去除了大于来源于沙眼衣原体靶的信号的信号而导致小于阈值的错误的信号(参照图7A)。上述错误的信号表示初始基准值不适合而需要大于初始基准值的新的基准值。

图7D及7E所示，通过使用与淋病奈瑟氏菌靶有关的初始基准值在60℃的温度下从信号中提取与沙眼衣原体靶的有关的信号。与淋病奈瑟氏菌靶有关的初始基准值(2.50)的适用因去除大于来源于淋病奈瑟氏菌靶的信号的信号而导致了小于阈值的错误的信号(参照图7D及7E)。上述错误的信号表示初始基准值不合适而需要小于初始基准值的新的基准值。

这些结果表明，当为了提取靶核酸序列的信号而在所有反应中适用单一基准值时，因对于特定样品的基准值的不适合性而导致错误的信号。

实施例4：使用基于MuDT技术的校准基准值的信号再提取

通过使用准确性标准来对所提取的信号是否表示理论上可预测的信号模式(即，准确的信号)进行了评价。尤其，准确性标准为所提取的信号不具有与预先确定的阈值交叉的信号值。因此，在所提取的信号具有与预先确定的阈值交叉的信号值的情况下，确定并适用校准基准值。校准基准值的确定及适用根据实施例2中所记载的“可变校准基准值接近法”来进行。

通过使用5.00的初始基准值来数学加工实施例3的实验结果(参照图6A及6B)并提取淋病奈瑟氏菌靶的信号。所提取的信号将不与预先确定的阈值RFU-30交叉的准确性标准用作预先确定的阈值。

如图7A所示，与仅含有沙眼衣原体的样品有关的所提取的信号具有与预先确定的阈值交叉的信号值，因此适用了校准基准值。其结果，由信号再提取校准了因上述信号提取而导致的错误的信号模式。图7C示出适用于反应结果的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。

通过使用2.50的初始基准值来数学加工实施例3的实验结果(参照图6A及6B)并提取沙眼衣原体靶的信号。所提取的信号将不与预先确定的阈值RFU-100交叉的准确性标准用作预先确定的阈值。

如图7D及7E所示，对于单独含有淋病奈瑟氏菌靶、10pg的淋病奈瑟氏菌及1pg的沙眼衣原体的混合物或者含有10pg的淋病奈瑟氏菌及10pg的沙眼衣原体的混合物的样品，所提取的信号具有与阈值交叉的信号值，因此确定并适用校准基准值。其结果，由信号再提取校准了因信号提取导致的错误的信号模式。图7F为示出适用于反应结果的初始基准值、PARV及PARV中的可变校准基准值。

从这些结果可以推出，在使用单一检测通道的不同的检测温度下的多个靶核酸序列的检测，可变校准基准值接近法可通过校准因不适当的基准值而导致的错误的信号，来以更准确的方式检测靶核酸序列。

使用校准基准值的本发明的方法可通过改善使用单一检测通道在不同的检测温度下检测多个靶核酸序列的方法，来校准因不适当的基准值而导致的错误的信号。结果，本发明以更准确的方式检测靶核酸序列。

详细记述了本发明的优选实例，应理解的是，属于本发明的主旨的变形及修改对于本技术领域的技术人员而言是显而易见的，本发明的范围应根据所附的发明要求保护范围及其等同技术方案来定义。

序列表

<110> SEEGENE, INC.

<120> 与靶核酸序列有关的信号提取

<130> PP160103

<150> KR 10-2015-0178868

<151> 2015-12-15

<160> 12

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NG_F

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(26)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 1

tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NG_R

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(26)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 2

caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NG_PTO

<400> 3

gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NG_CTO

<400> 4

tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT_F

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(30)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 5

gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT_R

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(30)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 6

ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT_PTO

<400> 7

gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT_CTO

<400> 8

gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NG_P

<400> 9

tgcccctcat tggcgtgttt cg 22

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2_F

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(26)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 10

tccgaatgga taaagcgtga cnnnnnatga actcac 36

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2_R

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(27)

<223> n表示脱氧肌苷

<400> 11

aacaatgaat cctgagcaaa ggnnnnncgt tagagtc 37

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CT2_P

<400> 12

cattgtaaag atatggtctg cttcgaccg 29

Claims

1.一种从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，在单一反应容器中，与能够产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及能够产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一同培养样品，在相对较高检测温度及相对较低检测温度下由单一类型的检测器检测信号；上述培养步骤通过信号产生过程来进行；上述检测步骤在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的两个信号不被单一类型的检测器分辨；

步骤(c)，确认所提取的上述信号是否满足准确性标准；若所提取的上述信号不满足准确性标准，则通过使用校正基准值代替初始基准值来重复步骤(b)，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号；上述校正基准值被确定为使所再提取的信号满足准确性标准。

2.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述准确性标准被确定为使所提取的信号不与预先确定的阈值相交，上述校正基准值被确定为使所再提取的信号不与预先确定的阈值相交。

3.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述准确性标准被确定为使所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值，上述校正基准值被确定为使所再提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值。

4.根据权利要求3所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述校正基准值被确定为具有低于初始基准值的值。

5.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述准确性标准被确定为使所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值，上述校正基准值被确定为使所再提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值。

6.根据权利要求5所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述校正基准值被确定为具有高于初始基准值的值。

7.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，以规定间隔增加或减少初始基准值直至所再提取的信号满足准确性标准来确定上述校正基准值。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，以上述校正基准值代替初始基准值来适用于在步骤(a)中的信号的所有周期中，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

9.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，借助在步骤(a)中获得的在相对较高检测温度及相对较低检测温度下检测到的信号的变化关系确定上述校正基准值。

10.根据权利要求9所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，将预先确定的阈值作为准确性标准来适用于所提取的信号中，确定所提取的信号与预先确定的阈值最初相交的交叉点，在所确认的上述交叉点或在之后相交的交叉点中选择一个周期，所选择的上述周期中，对在步骤(a)中的相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号的变化关系进行计算，从而确定上述校正基准值。

11.根据权利要求10所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，所选择的上述周期为具有最高或最低的信号值的周期。

12.根据权利要求10所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，以上述校正基准值代替初始基准值来适用于步骤(a)中的信号的所有周期中，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

13.根据权利要求9所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，将预先确定的阈值作为准确性标准来适用于所提取的信号中，确认信号值与预先确定的上述阈值最初相交的交叉点，在所确认的上述交叉点或在之后相交的交叉点中选择一个周期，所选择的上述周期中，对在步骤(a)中的相对较高检测温度及相对较低检测温度下的信号的变化关系进行计算，从而确定上述校正基准值；在所选择的周期之前的周期中，对在步骤(a)中的相对较高检测温度及相对较低检测温度下的变化关系进行计算，从而确定多个额外的校正基准值。

14.根据权利要求13所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，所选择的上述周期为具有最高或最低的信号值的周期。

15.根据权利要求13所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述校正基准值适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期及步骤(a)中的信号所选择的周期之后的所有周期中；以各个额外的校正基准值代替初始基准值来适用于步骤(a)中的信号的所选择的周期之前的各周期中，从而再提取与第一靶核酸序列有关的信号或与第二靶核酸序列有关的信号。

16.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述第一信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对较低检测温度下产生信号。

17.根据权利要求16所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，在上述步骤(b)中，通过使用第一初始基准值来对信号值进行数学加工，从而从在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。

18.根据权利要求17所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，根据下述数学式I-1提取上述与第二靶核酸序列有关的信号：

式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号)×(第一初始基准值)]，

19.根据权利要求17所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述准确性标准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值。

20.根据权利要求16所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述步骤(b)中，通过使用第一初始基准值来对信号值进行数学加工，从而从在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。

21.根据权利要求20所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，根据下述数学式I-2提取上述与第二靶核酸序列有关的信号：

式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号)÷(第一初始基准值)]，

22.根据权利要求20所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述准确性标准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值。

23.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述第一信号产生机构及第二信号产生机构在相对较高检测温度及相对较低检测温度下产生信号。

24.根据权利要求23所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，第二初始基准值大于第一初始基准值；(i)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(ii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第一初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者(iii)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；或者(iv)在步骤(b)中，对信号值进行数学加工，从而借助第二初始基准值从在步骤(a)中的相对较高检测温度下信号提取与第一靶核酸序列有关的信号。

25.根据权利要求24所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，根据数学式I-1，借助第一初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-2，借助第一初始基准值从相对较高检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-3，借助第二初始基准值从相对较低检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号；或者根据下述数学式I-4，借助第二初始基准值从相对较高检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号：

式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号]-[(步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号)×(第一初始基准值)]；

在上述式中，第一初始基准值为在相对较低检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对较高检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比，

式I-3：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号)×(第二初始基准值)]；

式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤(a)中的相对较高检测温度下的信号]-[(在步骤(a)中的相对较低检测温度下的信号)÷(第二初始基准值)]，

26.根据权利要求24所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，在根据(i)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值；或者在根据(ii)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值；或者在根据(iii)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有小于阈值的信号值；或者在根据(iv)进行上述数学加工的情况下，准确性标准为所提取的信号具有大于阈值的信号值。

27.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述样品中的两个靶核酸序列选自样品中的三个以上的靶核酸序列中。

28.根据权利要求1所述的从与两个靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法，其特征在于，上述培养步骤包或多个培养步骤，并单独确定与培养有关的校正基准值。

29.一种计算机可读储存介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法，计算机可读储存介质的特征在于，上述从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法包括：

30.一种用于从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的装置，其特征在于，包括：

(a)计算机处理器；以及

(b)权利要求29所述的计算机可读储存介质，与上述计算机处理器相连接。

31.一种计算机程序，运行用于执行从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法的处理器且储存于计算机可读储存介质，上述计算机程序的特征在于，上述从样品中包含第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的与两个靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的方法包括：