CN102171366A - 多重扩增与检测 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多重扩增的领域。本发明尤其涉及在单次反应中，基于引物和/或探针的不同熔解温度或熔解图谱，检测一份样品中一种或更多种目标(靶)核酸的方法。本发明还提供了用于此类方法的探针和试剂盒。

Description

多重扩增与检测

本发明涉及多重检测的领域。本发明尤其涉及在单次反应中，基于探针的不同熔解温度或熔解图谱，检测一份样品中一种或多种目标(靶)核酸的方法。本发明还提供了用于此类方法的探针和试剂盒。

利用多种引物对，以在单次PCR反应中同时扩增多种目标序列的多重PCR，是一种比使用单种引物对的标准PCR更加高效率的PCR方法。对不同目标核酸的同时扩增降低了PCR分析的成本和时间消耗，令实验变差和交叉污染的风险最小化，并且提高了最终结果的可靠性。多重PCR已被用于DNA检测的多个领域，包括微生物的鉴定、基因表达分析、突变和多态性分析、基因分型和DNA阵列分析以及RNA检测。

已发展出了用于在PCR反应过程中对扩增产物进行定量的实时PCR。实时PCR所基于的原理是，从染料发射出的荧光直接或间接地与新合成的扩增子的形成相关联，或者引物与DNA模板之间的退火可以被检测到并且在每个PCR循环中与扩增子的量成比例。实时PCR以闭管方式进行，并且可以定量。目前已有数种进行实时PCR的方法，例如利用TaqMan探针(美国专利5,210,015和5,487,972，以及Lee等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)21：3761-6，1993)，分子信标(美国专利5,925,517和6,103,476，以及Tyagi和Kramer，Nat.Biotechnol.(国家生物科技)14：303-8，1996)，自检测扩增子(蝎型探针)(美国专利6,326,145，以及Whitcombe等人，Nat.Biotechnol.(国家生物科技)17：804-7，1999)，Amplisensor(Chen等人，Appl.Environ.Microbiol.(应用与环境微生物学)64：4210-6，1998)，Amplifluor(美国专利6,117,635，以及Nazarenko等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：2516-21，1997)，替换杂交探针(Li等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)30：E5，2002)；DzyNA-PCR(Todd等人，Clin.Chem.(临床化学)46：625-30，2000)，荧光限制酶检测(Cairns等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.(生物化学与生物物理研究通讯)318：684-90，2004)，以及邻近杂交探针(美国专利6,174,670以及Wittwer等人，Biotechniques(生物技术)22：130-1，134-8，1997)。这些探针大多包含一对涉及荧光共振能量转移(FRET)的染料(一种报告染料和一种受体染料)，其中所述受体染料可令所述报告染料的荧光发射淬灭。总之，荧光标记的探针提高了扩增子定量的特异性。

用于PCR的另一种形式的探针，是一种具有两条互补的寡核苷酸的双链线性探针。该在先技术中所描述的探针具有相同的长度，其中至少一种寡核苷酸以一种单链构象作为针对一段目标序列的探针。上述寡核苷酸之一的5′端被一种荧光基团标记，而另一种寡核苷酸的3′端被一种淬灭剂，如一种受体荧光基团标记，或者反之亦可。当这两种寡核苷酸相互退火时，上述两种标记互相接近，从而使荧光淬灭。而竞争性地与探针结合的目标(靶)核酸，则能随着其浓度的升高导致探针的荧光发生低于正比例的升高。(Morrison L.等人，Anal.Biochem.(分析生物化学)，Vol.183，pages 231-244(1989)；美国专利5,928,862)。

通过将互补的两条寡核苷酸之一缩短几个碱基，从而得到一种部分双链的线性化探针，这种经改进的双链线性探针亦为本领域所知。该在先技术中的这种双链线性探针中，较长的寡核苷酸末端被一种荧光基团标记，而较短的寡核苷酸末端被一种淬灭剂标记。所述探针以双链形式存在时，由于荧光基团和淬灭剂位置紧邻，荧光发射较弱。而当一种目标(靶)核酸存在时，带有淬灭剂的较短的寡核苷酸则被该目标(靶)核酸所取代。结果，较长的寡核苷酸(以探针-目标核酸杂交体形式存在)的荧光发射充分变强(Li等人，Nucleic Acids Research(核酸研究)，Vol.30，No.2，e5(2002))。

US2005/0227257描述了一种略加改进的双链线性核酸探针。该专利申请中所描述的探针的改进为，与前述探针相比，通过将两种互补的寡核苷酸之一缩短更多的碱基，而得到一种部分双链的线性化探针。

荧光杂交探针还被用于其他的领域。例如，利用荧光杂交探针进行多重基因分型的方法已有描述(例如US6,140,054)，该方法利用与基因组、核酸序列的一段经PCR扩增的目标区域杂交的荧光杂交探针的熔解温度，来鉴定突变和多态性。

高通量遗传检测的出现使得对多个基因同时进行定性和定量分析成为必要，并且令多重PCR和实时PCR向着结合成为多重实时PCR发展。由于双链DNA嵌入染料的非特异性，这些染料并不适合用于多重检测，而荧光标记的探针则令多重实时PCR成为可能。但是，多重实时PCR受限于荧光染料组合的可用性。目前，实时PCR中最多只能同时对四或五种荧光染料进行检测和定量。

US2005/0053950描述了一种用于多重实时定量聚合酶链式反应(PCR)的方法。该方法根据扩增子以双链体或分离形式存在时，每种扩增子不同的熔解温度(T_m)和双链DNA染料，如SYBR Green I的荧光发射变化，在单次实时PCR反应中对多种PCR产物或扩增子进行定量。对于一种特异性的扩增子，在一低于其T_m的温度测得的荧光发射，与在一高于其T_m的温度测得的荧光发射之间的荧光发射差异，对应于以双链体存在的该扩增子的荧光发射值。相应地，在单次PCR反应中，每种扩增子的荧光发射差异可用于对其进行定量。但是，此类方法的多重性和敏感度相对较低。例如，长度为约100至150个核苷酸之间的扩增子，在熔解温度方面差别微小。因此，这些技术要求使用大小差别巨大的扩增子，以能对其加以区分。

但是，对于具有更高的多重性和敏感度水平的多重实时PCR，还需要发展出其他在单次PCR反应中对多种目标序列进行扩增和定量的方法。

本发明的方法不同于在先技术。首先，本方法所基于的，是每种探针不同的熔解特性(T_m或熔解图谱)，和当探针内部的双链部分以双链体或分离形式存在时，该探针上的标记物的荧光发射变化。本发明的探针包含一个双链部分，该双链部分可由一种第一寡核苷酸和一种第二寡核苷酸形成；对于每种探针，所述双链部分具有独特的T_m，由此在包含相同或相似的标记物的一组探针中，可对不同的探针加以区分。其次，所述第一寡核苷酸可包含或不包含一种或多种标记，并且此第一寡核苷酸在扩增反应过程中被消耗。在两种不同温度检测的荧光发射之间的差异，对应于当某些探针被消耗后，该探针的荧光发射值。第三，对未消耗的探针进行的熔解图谱测量，提供了一份样品中目标(靶)核酸的存在或者其量的一种指标。

为了便于理解本发明，对一些术语定义如下。

本文所用术语“核酸”是核苷酸共价连接的序列，其中一个核苷酸的戊糖的3’位置通过磷酸二酯基团被连接至下一个戊糖的5’位置，并且其中核苷酸残基(碱基)被以特异序列连接，即，核苷酸的线性顺序。本文所用术语“多聚核苷酸”是包含长度大于200核苷酸的序列的核酸。本文所用术语“寡核苷酸”是短的多聚核苷酸或多聚核苷酸的一部分。寡核苷酸典型地包含约200到约100碱基的序列。“核酸”、“DNA”以及类似术语还包括核酸类似物，即，具有磷酸二酯主链以外的类似物。举例来说，本领域已知并且在主链上具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”，被认为在本发明的范围内。

本文所用术语“目标(靶)序列”、“目标(靶)核酸”、“目标(靶)核酸序列”和“所感兴趣的核酸”可互换使用，它们是指将对其进行扩增或者检测或者既扩增又检测的一段目标(靶)区域。目标(靶)序列作为扩增和检测的对象可以是任何核酸。目标(靶)序列可以是RNA、cDNA、基因组DNA，或者来自如一种致病的微生物或病毒的DNA或RNA。目标(靶)序列还可以是经化学试剂、各种酶类以及物理暴露处理过的DNA。一份样品中令人感兴趣的目标(靶)核酸序列可以以单链DNA或RNA如cDNA、mRNA、其他RNA，或以分离的互补链的形式存在。可以通过物理的、化学的或酶学的方法实现目标(靶)核酸互补链的分离。为了便于描述和理解，当提及所感兴趣的核酸或目标(靶)核酸时，既指在一份待测样品中所发现的这些部分，也指这些核酸的部分的扩增拷贝，除非有相反的特别说明。

本文所用术语“引物”是指一种自然产生或人工合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸当被置于诱发与一条核酸链互补的一种引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成的起始点，其中所述条件即有核苷酸和一种聚合反应试剂如DNA聚合酶的存在，以及适当的温度和缓冲条件。本文中的引物是经过选择从而与待扩增的各特异性序列的不同链充分互补的。也就是说引物与它们各自的对应链必须充分互补以能与之杂交。一段非互补的核苷酸片段可以与引物的5’端相联，而该引物序列的其余部分与目标碱基序列的诊断区互补。除了当非互补的核苷酸如上文所述存在于预先确定的引物末端时以外，引物通常是互补的。

本文所用术语“与……互补”是指一个核苷酸能与另一个特定的核苷酸碱基配对。即腺苷与尿苷或胸苷互补，鸟苷与胞苷互补。根据本说明书的目的应当认为，尽管在某些情况下胸苷与鸟苷可以碱基配对，亦不应将它们视为互补的。根据本发明的目的，术语“充分互补”是指探针的一条链上大于或等于70％，优选大于80％，更优选大于90％，最优选大于95％或99％的核酸碱基，在一种匹配方式下能在探针的另一条链(或者所感兴趣的核酸)上找到其Watson-Crick结合伴侣，使得相应的核苷酸能够彼此杂交。确定相同或相似的方法在公众可获得的计算机程序中被编码。优选的决定两条序列间相同及相似的计算机程序方法包括，但不限于：在GCG Pileup程序包中可找到的GCG Pileup程序，所述程序使用Needleman和Wunsch算法，以gap creation penalty＝12和gap extension penalty＝4为所述算法的标准缺省值(Devereux等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)12：387-395(1984))，BLASTP，BLASTN，以及FASTA(Pearson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国科学院院刊)85：2444-2448(1988))。所述BLASTX程序是从NCBI和其他来源可公开获得的(BLAST手册，Altschul等人，Natl.Cent.Biotechnol.Inf(美国国立生物技术信息中心)，Natl.Library Med.(美国国立医学图书馆)(NCBI NLM)，NIH(美国国家卫生研究院)，Bethesda，MD；Altschul等人，J.MoI.Biol.(分子生物学杂志)215：403-410(1990)；Altschul等人，Nucleic Acids Res.(核酸研究)25：3389-3402(1997)).

术语“双链体”和“双链”可互换使用，它们是指一条寡-多聚核苷酸与互补的寡-多聚核苷酸杂交。

术语“相同的”是指两段核酸序列具有同样的序列或互补的序列。

术语“同源的”意为一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交的程度可以依赖于许多因素，包括两个序列间的相同的量以及杂交条件(例如温度和盐浓度)。优选地，相同的区域是大于约5bp，更优选地，相同的区域是大于10bp。

本文所用术语“连续监测”以及类似术语，是指在PCR的一个循环中进行多次监测，优选在温度转变期间，更优选在每一温度转变过程中收集至少一个数据点。

本文所用术语“逐循环”监测，是指在每一循环对PCR反应进行一次或多次监测。

术语“实际消耗量”(ACA)是指在一个反应中，荧光检测所反映的被消耗的探针的量。

本文所用术语“扩增”是指在核酸序列的混合物中令一种特定核酸序列的浓度升高的任何扩增过程。

本文所用术语“样品”以其最广义使用。一份被怀疑含有核酸的生物样品可以包含但不限于基因组DNA，cDNA(在溶液中或与固相载体结合)以及类似物。

本文所用术语“标记”是指任何一种能被用于提供一种可检测的(优选为可以计量的)信号，并能与核酸或蛋白质相联的原子或分子。标记提供的信号可以通过荧光、放射性、比色法、重量分析、磁性、酶活性以及类似途径检测。

本文所用术语“相邻”或“基本上相邻”，是指两种寡核苷酸在模板核酸与之互补的链上的位置关系。模板与寡核苷酸杂交的两个区域可以是连续的，即在这两个模板区域之间没有间隔。或者，模板与寡核苷酸杂交的两个区域可以被1至约40个核苷酸间隔开，更优选约1至10个核苷酸。

术语“加热循环”、“热循环”是指温度自一个完全变性温度，至一个退火(或者杂交)温度，再至一个延伸温度，并回到完全变性温度变化的重复循环。上述术语还指自一个变性温度至一个延伸温度的重复循环，其中退火和延伸温度合并为同一温度。完全变性温度令所有的双链片段解链成为单链。退火温度令引物与一种核酸模板的分离单链上的互补序列杂交或退火。延伸温度允许扩增子的新生DNA链的合成。

本文所用术语“反应”，是指杂交反应、延伸反应或扩增反应，或者其他生物学、化学反应。

本文所用术语“扩增混合物”或“PCR混合物”，是指从核酸模板中检测目标(靶)核酸所需的组分的混合物。所述混合物可以包含核苷酸(dNTPs)、探针、一种耐热聚合酶、引物以及多条核酸模板。所述混合物还可以进一步包含一种Tris缓冲液、一种单价盐和Mg²⁺。每种组分的浓度为本领域所熟知，并可由本领域的普通技术人员作进一步的优化。

术语“扩增产物”或“扩增子”，是指在一种扩增方法如PCR中，利用一对引物，由一种聚合酶扩增出的DNA片段。

术语“熔解图谱”是指对一种寡(或多)核苷酸及其互补体进行的、作为该寡(或多)核苷酸分子自双链状态向单链核酸(或者反之亦可)转变的指征的测量结果的集合。一种核酸自双链状态向单链状态的转变在本领域通常描述为该核酸分子的“熔解”。上述转变也可以描述为该核酸的“变性”或“解链”。相应地，本发明中的熔解图谱也可以称为“解链图谱”、“变性图谱”、“熔解曲线”、“解链曲线”、“杂交/解链图谱”等。

一种核酸分子的“熔解温度”或者“T_m”通常是指一种多核苷酸与其互补序列解离时的温度。总的来说，T_m可以被定义为当双链核酸分子中一半的Watson-Crick碱基对断开或解离(即“熔解”了)，而另外一半的Watson-Crick碱基对依然保持完整的双链构象时的温度。在优选的实施方案中双链核酸分子为寡核苷酸，在其他实施方案中双链核酸以一种两状态方式解离，上述这些实施方案中，一种核酸的T_m还可被定义为当一份样品中一半的核酸分子处于单链构象，而该样品中另外一半的核酸分子处于双链构象时的温度。因此，T_m表明了核酸分子自双链向单链转变(或者反之，核酸分子自单链向双链转变)的中点。本领域中普遍认为，核酸分子自双链向单链的转变并非在单一的温度发生，而是在一个温度范围内发生。尽管如此，T_m提供了关于一份样品中的核酸分子以单链还是双链构象存在的一种方便的近似量度。如此，一份核酸样品的熔解温度可以通过分析该样品的熔解图谱而容易地获得。

术语“消耗”或“消耗量”是指在一种标记的探针通常会保持完整的温度下，游离的该标记的探针的量的减少。上述标记的探针可不包含双链部分；上述标记的探针的消耗可以导致检测信号的变化。上述标记的探针的消耗可以包括探针与目标(靶)核酸的杂交或与目标(靶)核酸杂交时该探针的降解。当探针包含双链部分时，游离的标记的探针量的减少，可以由该探针的至少一种链，即该探针的第一寡核苷酸或第二寡核苷酸或二者皆有，的消失引起。上述探针的至少一种链的消失意味着该探针的第一寡核苷酸或该探针的第二寡核苷酸或者该探针的上述两种寡核苷酸与目标核酸发生杂交。上述探针的第一寡核苷酸或该探针的第二寡核苷酸或者该探针的上述两种寡核苷酸与目标(靶)核酸发生杂交后，可继之以该探针的寡核苷酸作为引物发生延伸，或者继之以该探针的寡核苷酸发生降解。

本发明描述的方法允许对大量不同的目标(靶)核酸序列进行基本上同时的扩增和检测。

第一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括：

(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种反应混合物接触，所述混合物包含：

一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种具有双链部分的探针可以包含

一种包含一个第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，其中所述第一区域与一种目标(靶)核酸的部分充分互补，和

至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成该探针的一个双链部分，

其中每种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了一种目标(靶)核酸是否存在，并且

其中至少两种探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针有不同的熔解特性(熔解温度T_m)并能在熔解图谱分析中区分；

(b)在样品/反应混合物中进行反应，其中所述反应为延伸条件下的一种引物延伸反应，其中，当一种目标(靶)核酸存在时，所述探针作为引物得到延伸并因此被消耗，其中相应探针作为可延伸的引物的第一寡核苷酸与目标(靶)序列杂交，并因此在所述引物延伸反应中被消耗，其中所述探针被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分(双链体)；以及

(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述反应混合物中所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，

其中所述熔解图谱提供了至少一种目标(靶)核酸是否在所述样品中存在的指征。

在该实施方案中，探针的第一寡核苷酸作为引物起作用。在一个引物延伸反应中，将探针的混合物加入至包含用于在延伸条件下进行延伸的所有成分的反应混合物中。如果一种特定的目标(靶)核酸存在于上述反应中，则相应探针的所述寡核苷酸与目标(靶)序列杂交，然后得到延伸并掺入至引物延伸产物中，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分。在熔解图谱分析中，被消耗的探针表现为一个峰的降低或消失。

另一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括：

(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种杂交反应混合物接触，所述杂交反应混合物包含：

一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种探针包含

一种包含一个与一种目标(靶)核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和

至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中所述至少一种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，并且

其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针的第一和第二寡核苷酸所组成的双链部分有不同的熔解特性并能在熔解图谱分析中区分；

(b)于杂交条件下在样品/反应混合物中进行杂交反应，其中，当一种目标(靶)核酸存在时，与该目标(靶)核酸的部分充分互补的探针的第一寡核苷酸，与该目标序列发生杂交并因此在上述反应过程中被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分(双链体)；以及

(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述反应混合物中所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，

其中所述熔解图谱提供了至少一种目标(靶)核酸是否在所述样品中存在的指征。

在一个实施方案中，所述探针或探针的第一寡核苷酸可作为杂交探针起作用。在一个杂交反应中，将探针的混合物加入至包含用于杂交条件下的所有成分的反应混合物中。如果一种特定的目标(靶)核酸存在于上述反应中，则相应探针的所述寡核苷酸与该目标序列杂交，并因此被消耗。所述被消耗的寡核苷酸不再能参与形成该探针的双链部分。在熔解图谱分析中，被消耗的探针表现为一个峰的降低或消失。

另一方面，本发明提供了一种对一份样品进行一种或多种目标(靶)核酸的检测的方法，所述方法包括：

(a)令一份包含一种或多种目标(靶)核酸的样品与一种扩增反应混合物接触，所述混合物包含：

(i)一对或多对正向/反向寡核苷酸引物，其中当所述样品中存在一种或多种目标(靶)核酸时，所述引物对能扩增所述目标(靶)核酸，

(ii)一个包括两种或多种探针的探针组，其中至少一种探针包含

一种包含一个与一种目标(靶)核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和

至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中所述至少一种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，并且

其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且

其中每种上述探针的第一和第二寡核苷酸所组成的双链部分有不同的熔解特性并能在熔解图谱分析中区分；

(b)在在样品/扩增反应混合物中进行扩增反应

其中，当一种目标(靶)核酸存在时，与该目标(靶)核酸的部分充分互补的所述第一寡核苷酸，与该目标(靶)序列发生杂交并因此在上述扩增反应过程中被消耗；

(c)作为温度的一个函数，通过检测来自未被消耗的探针上的标记的信号，测量所述未被消耗的探针的熔解图谱至少一次，

其中所述熔解图谱提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。

其中所述至少两种探针中的一种第一探针具有一个基于其双链部分的熔解温度T_m1，

其中所述至少两种探针中的一种第二探针具有一个基于其双链部分的熔解温度T_m2，

其中T_m1＞T_m2，

其中相同的标记分别与所述第一和第二探针相联，

其中，任何在T_m1和/或T_m2的熔解峰的降低提供了所述第一和/或第二探针的消耗的指征。

优选地，上述该方法包括步骤(d)：

(i)比较步骤(c)中获得的至少两种熔解图谱

和/或

(ii)将步骤(c)中获得的一种熔解图谱与

一种事先获得的相同探针的熔解图谱，或者

相同探针的一种在平行对照反应中同时获得的熔解图谱，或者

相同探针的一种理论上的熔解图谱

进行比较

其中所述熔解图谱的变化提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。

所述扩增反应可以为任意一种扩增方法，例如PCR，SDA，NASBA，LAMP，3SR，ICAN，TMA，解旋酶依赖的等温DNA扩增以及类似方法。PCR为一种优选的扩增方法。

所述扩增反应混合物应包含标准的扩增试剂。扩增试剂可以方便地分为四类组分：(i)一种水性缓冲液，通常包括但不限于一种镁盐，(ii)扩增底物，例如DNA或RNA，(iii)一种或多种寡核苷酸引物(通常针对每种目标序列有两种引物，当采用PCR时，所述序列限定了双链目标序列的两条互补链的5′端)，以及(iv)一种扩增酶如一种多核苷酸聚合酶(例如，用于PCR的Taq聚合酶或用于TMA的RNA聚合酶)，或者一种连接酶。此外，通常还需要适当的核苷三磷酸。更多的试剂或添加剂的加入可由本领域的技术人员酌情而定，并且这些试剂的选择属于本领域的普通技术人员的技能范围。当然，当上述扩增试剂用于同时进行逆转录和扩增时，上述扩增试剂中还包括逆转录试剂。根据所采用的扩增反应方法，对扩增试剂进行选择，属于本领域的普通技术人员的技能范围。

在本文所描述的方法中，所提供的样品为被怀疑包含目标核酸或所感兴趣的核苷酸变异的样品。样品中包含的目标核酸可以是双链的基因组DNA或者在必要时是cDNA，然后利用任何为本领域的技术人员所知的适当的变性方法，包括物理的、化学的或酶学的方法，使上述基因组DNA或cDNA变性。一种用于链分离的优选的物理方法包括加热核酸至其完全(＞99％)变性。典型的热变性条件包括从约80℃至约105℃范围的温度，和从数秒至数分钟范围的时间。作为变性之外的另一选择，目标核酸可以以一种单链形态，例如单链的RNA或DNA病毒，存在于样品中。

然后将变性的核酸链与寡核苷酸引物和探针在杂交条件下共同孵育，所述杂交条件即令所述引物或探针能与核酸单链结合的条件。在本发明的一些实施方案中，退火的引物和/或探针被一种聚合剂延伸。在适当量的四种脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或其如前所述的类似物的存在下，寡核苷酸引物依赖于模板的延伸反应，在包含适当的盐、金属阳离子和pH缓冲体系的反应介质中，被一种聚合剂所催化。合适的聚合剂为已知可催化依赖于引物和模板的DNA合成的酶类。利用所述DNA聚合酶类催化DNA合成的反应条件为本领域所熟知。探针在扩增过程中被消耗。

一种扩增引物可以是一种目标特异性的引物，其包含一个与目标核酸的一个目标区域互补的3’启始部分。扩增引物也可以是通用引物，所述通用引物具有与靶特异引物的5’通用部分相同或基本上相同的序列。反应可以包括针对多个靶序列的扩增的多个引物。所述多个引物的所述5’通用部分可以具有实质相同的序列组成，所述实质相同的序列组成是与所述通用扩增引物的所述3’启始部分等同或基本上等同。优选地，所述引物是DNA引物，特别是适合于PCR扩增的那些。

用于SNP基因分型或者检测变异核苷酸时，扩增引物可以是一种等位基因特异性的引物，其中所述引物的一个末端核苷酸为经过选择，从而与所怀疑的变异核苷酸或相应的正常核苷酸之一互补的，由此当所述引物与包含一个特定核苷酸的诊断区域退火时，所述引物的延伸产物得到合成，而当所述引物与不包含目标核酸序列的该特定核苷酸的诊断区域退火时，所述延伸产物不被合成。

扩增反应混合物中包括由正向和反向引物组成的引物对，如此若样品中存在一种目标核酸，所述引物对将能扩增该目标核酸，扩增优选以一种指数方式进行。

在一些实施方案中，反应混合物中会含有1至50、1至25、1至20或1至10种引物对。在另一些实施方案中，反应混合物中会含有5至50、5至25、5至20或5至10种引物对。如上所述，一种特定的引物对中的正向或反向引物可以是一种在多于一种引物对中共用的通用引物。

扩增反应混合物包含由两种或多种探针组成的一个探针组。所述探针包含：

一种包含一个第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，其中所述第一区域与一种目标核酸的部分充分互补，和

一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成该探针的一个双链部分。

所述第一寡核苷酸须能在适当的杂交条件下与至少一种所述目标核酸的部分相结合。优选地，每种第一寡核苷酸对仅一种目标核酸的部分具有特异性。所述第一寡核苷酸应具有一个第一区域，该第一区域的核苷酸序列与一种目标核酸的部分的核苷酸序列互补或充分互补。此第一互补区域的长度优选为6至100个核苷酸，更优选为15至30个核苷酸。

所述第一寡核苷酸的总长度优选为15至150个核苷酸，更优选为17至100个核苷酸，最优选为20至80个核苷酸。

在一些反应包括引物延伸或扩增的实施方案中，与所述第一寡核苷酸互补的目标核酸的部分须属于将被正向和反向引物扩增的序列或与该序列重叠。或者，所述第一寡核苷酸可以是所述扩增引物之一，例如是正向或者反向引物。在一些实施方案中，所述第一和/或第二寡核苷酸不是一种正向或者反向引物。

所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的一个第二区域充分互补的区域。此第二区域的长度优选为4至100个核苷酸，更优选为15至30个核苷酸。所述第一寡核苷酸的第二区域可与所述第一寡核苷酸的第一区域重叠或不重叠。

所述第二寡核苷酸的总长度优选为6至150个核苷酸，更优选为10至100个核苷酸，最优选为12至80个核苷酸。

所述第一和第二寡核苷酸可以在5′或3′端包含1至5个或1至10个或更多的分别与目标核酸或所述第一寡核苷酸不互补的核苷酸。

寡核苷酸探针可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸类似物和/或非核苷酸的化学部分。可能促进探针结合的对所述探针的改进包括但不限于向所述探针中掺入带正电荷的或中性的磷酸二酯键，以减弱探针和目标核酸的多聚阴离子主链之间的斥力(参见Letsinger等人，1988，J.Amer.Chem.Soc.(美国化学学会杂志)110：4470)；向所述探针中掺入烷基化或卤化的基团如5-溴尿苷，以促进碱基堆积；向所述探针中掺入核糖核苷酸，以促使探针：目标核酸双链体形成具有增强的碱基堆积的“A”型结构；用2，6-二氨基嘌呤(氨基腺苷)替换所述探针中部分或全部的腺苷；以及掺入核苷酸衍生物如LNA(锁核酸)，PNA(肽核酸)或类似物。

通常所述探针的3’末端为“封闭的”，以阻止探针掺入到引物延伸产物中。不过在本发明的一些优选的实施方案中，一些探针同时还作为引物起作用，因此所述探针的3′末端为未封闭的。“封闭”可以通过使用非互补的碱基或通过将一个化学部分，如生物素或磷酸基团，添加到最后一个核苷酸的羟基上来实现。依赖于所选择的部分，所述化学部分还可以作为一种用于后续检测或者捕获与之相联的核酸的标记，而起到双重作用。封闭还可以通过去除3’-羟基或使用缺少3’-羟基的核苷酸如双脱氧核苷酸而实现。

不难理解，术语“探针”是指该种探针的复数，即反应混合物中并不仅仅包含该探针的一个分子。

在本发明的一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域不重叠或者不充分重叠。

在本发明的另一些实施方案中，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域充分重叠，或者所述第二区域包含于所述第一区域中。在这些实施方案中，所述第一寡核苷酸与目标序列杂交形成的双链体的T_m，优选高于所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交形成的双链体的T_m，如此若一种目标核酸存在，所述第一寡核苷酸与该目标核酸形成更牢固的杂交体，从而与所述第一/第二寡核苷酸双链体相比在更高的温度熔解。

优选地，所述第一寡核苷酸与目标核酸形成的双链体的T_m比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸形成的双链体的T_m高至少2度或至少5度。

在另一些实施方案中，所述第一寡核苷酸可以包含一个与用于扩增的一种引物的序列相同或充分相同的第三区域。

本发明的至少一种探针能够形成一个双链部分。由于这种双链部分，该探针具有一个熔解温度T_m和一种特征性的熔解图谱。特别地，本发明的多种探针的一种混合物也具有一种特征性的熔解图谱。

熔解温度(T_m)受若干因素的影响，包括但不限于盐浓度、DNA浓度、变性剂的存在、核酸序列、GC含量以及长度。典型地，每种双链核酸探针具有一个独特的T_m。在低于一个给定T_m的温度下，至少50％的核酸双链体保持以双链体形式存在。相反，在高于一个给定T_m的的温度下，预计超过50％的核酸双链体会解链为两条寡核苷酸单链。

任意一种给定的DNA片段的T_m可以通过为本领域所熟知的方法加以确定。例如，本领域中测定一段DNA片段T_m的一种方法是，利用一台紫外分光光度计中的一个恒温小室，并测定伴随温度缓慢升高时268nm的吸光度。以吸光度对温度作图，得到一条有两个平稳段的S形曲线。(例如，参见图1)。吸光度在这两个平稳段之间的中间点对应于该片段的T_m。或者，以吸光度的一阶负导数对温度作图，得到一条正态分布曲线。该正态曲线的峰对应于该片段的T_m。

还可以通过最近邻法测定一种探针的T_m或者多种探针的一种混合物的多个T_m，并且在单次反应中的探针上存在一种双链DNA染料或标记时，还可以对一种探针的T_m或者多种探针的一种混合物的多个T_m进行细致的或者说精确的测量。例如，以每秒0.01℃至3℃的速率，将一种包含一种探针和适当的缓冲液的反应混合物从一个杂交温度加热至完全变性温度。同时，以一种被上述染料(标记)吸收的波长的光照射上述混合物，并检测和记录上述染料(探针)的荧光发射，作为荧光发射读数。以上述荧光发射读数相对于温度的一阶负导数对温度作图，得到若干正态曲线，所述曲线的每个峰对应于该探针的实际T_m。所述曲线也被称为“熔解图谱”或“杂交/解链图谱”。一种探针的T_m或熔解图谱还可以通过一种基于本领域所熟知的理论的计算机程序进行估计。

对于一次多重检测，在一个反应中包括了由针对多种目标序列的多种探针构成的探针组。在一个实施方案中，一组探针中的不同探针可以包含相同的标记或者其发射光谱不可区分的标记。这样的一个探针组中的每种探针应具有不同的T_m，从而令各自的熔解图谱能够相互区分。不仅个别的探针具有一种熔解图谱，上述探针组中的多种探针的混合物也具有该探针组特征性的熔解图谱。所述反应混合物可以包含一种没有特征性熔解温度的单链探针。

根据本发明，通过设计由与不同的目标序列杂交的探针和基于其内部的双链部分而具有不同熔解温度的探针组成的探针组，可以在单个管中对多种目标核酸序列进行分析。如果一种目标序列存在，则其相应的探针被消耗。然后根据反应前后所述探针组的熔解图谱之间的比较，可以确定该目标的序列。有利地，一个探针组中的不同探针可以与同样的标记相联，从而允许在单个发射波长进行监测。在一个实施方案中，所述探针组中的每种探针与同样的标记，例如一个荧光能量转移对或接触淬灭对，更特别地，一种为荧光基团的第一标记和一种为淬灭剂的第二标记相联。另一方面，多个探针组可以与不同的标记对相联，从而各个探针组可基于不同发射光谱而相互区分。

根据本发明，分析多种目标核酸的方法既可以利用与具有可区分的发射光谱的不同标记相联的多种探针的混合物，也可以利用与具有相同的或重叠的发射光谱的标记相联，但可基于其内部的双链部分在熔解温度上的不同而加以区分的多种探针的混合物。

当利用具有双链部分的探针时，所述探针可以包含两条链：一条第一寡核苷酸和一条第二寡核苷酸，其中所述第一寡核苷酸包含一个与一种目标核酸充分互补的第一区域(参见图4)。在一个实施方案中，探针包含一条第一寡核苷酸和至少一条第二寡核苷酸(参见图4A至J)。所述第一寡核苷酸包含一个与一种目标核酸充分互补的第一区域和一个第二区域，其中所述第二区域与一条或多条第二寡核苷酸充分互补，从而所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸能结合形成一个双链部分。所述第一区域和第二区域可以以任意顺序排列，例如5′至3′或3′至5′(参见图4A)，或者一个区域包含在另一个区域内(参见图4B)。优选地，若所述第一寡核苷酸作为一种引物，所述第一区域和第二区域以3′至5′的顺序排列(参见图4A)。

在一方面，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域不重叠或者不充分重叠(参见图4A)。换句话说，所述第一区域与一段目标序列互补，而所述第二区域与该目标序列不互补。当所述第二区域与所述目标序列不互补时，不同的探针可以具有相同或充分相同的第二区域序列，并且该探针组的不同探针之间可以具有相同的第二寡核苷酸。当所述探针组有相同的第二寡核苷酸时，该探针组中的不同探针的第一寡核苷酸的第二区域可以在长度和/或核苷酸序列方面有差异，从而各种探针有不同的T_m和熔解图谱。

另一方面，所述第一寡核苷酸的第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域充分重叠，或者所述第二区域包含于所述第一区域内(参见图4B)，其中所述第一寡核苷酸与目标序列杂交形成的双链体的T_m高于所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交形成的双链体的T_m，如此若一种目标核酸存在，该目标核酸与所述探针的第一寡核苷酸形成更牢固的杂交体，从而该目标核酸/第一寡核苷酸双链体与第二寡核苷酸/第一寡核苷酸双链体相比在更高的温度熔解。在该方面，所述第一区域可以比所述第二区域更长，或者所述第二区域可以在与所述第二寡核苷酸杂交时包含错配的核苷酸。所述第一寡核苷酸与目标核酸的结合阻止了所述探针的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸结合。优选地，所述第一寡核苷酸与所述目标序列的杂交体的T_m比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的杂交体的T_m高至少2度。更优选地，所述第一寡核苷酸与所述目标序列的杂交体的T_m比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸的杂交体的T_m高至少5度。

又一方面，第一寡核苷酸包含一个与一段引物序列相同或充分相同的第三区域(参见图4C和E)。所述第三区域可与目标序列互补或不互补。一组探针中的多种探针可以包含相同的第三区域序列。与所述第三区域序列相同的所述引物可以作为一种通用扩增引物。当目标核酸特异性的探针(作为引物)经过若干个循环的扩增变得不足时，上述通用引物可以作为接替的引物在后续循环中继续进行扩增。

在本发明的一些实施方案中，所述第一和第二寡核苷酸通过一种连接部分相连。这种连接部分可以包含核苷酸、核苷酸衍生物、核苷酸类似物或者一种非核苷酸的化学键，换言之，所述第一和第二寡核苷酸可以是相连的寡核苷酸中的一段(图4K)。在该实施方案中，所述探针可以理解为仅包含一段第一寡核苷酸(参见图4K)，此第一寡核苷酸包含能形成茎-环结构的自我互补区域，其中所述自我互补区域彼此充分互补，形成了该探针的双链部分。其中的茎部分可以位于寡核苷酸的任意部分并且长度为4至20个核苷酸。所述寡核苷酸的3′部分优选与目标序列互补。它可以具有一个平末端，或者3′突出或5′突出末端。平末端或3′突出末端为优选的形式。

上述含双链部分的探针的第一寡核苷酸能在扩增过程中被消耗。或者，上述含双链部分的探针的第一和第二寡核苷酸都能在扩增过程中被消耗。优选地，将所述第一寡核苷酸设计为会在一次反应中被消耗，而所述第二寡核苷酸可保持不变。

所述探针可以被延伸，从而可作为一种引物起作用。或者，所述第一寡核苷酸的3’端被封闭并且第二寡核苷酸的3’被封闭，从而不可被延伸。

每种探针包含一个能产生一种可变信号的可检测的标记，其中所述信号反映了该探针的双链部分是否存在。

此外，至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记。

所述探针上的标记可以是一种荧光基团，或者所述探针可以包含一对相互作用的标记，例如荧光基团和/或非荧光的染料。此类相互作用的标记的一个例子是一对荧光基团-淬灭剂对。所述探针上的标记可以位于任何位置，只要其能与其他标记或者其他实体如G核苷酸相互作用。

在一些实施方案中，所述第一寡核苷酸包含一个第一标记并且所述第二寡核苷酸包含第二标记。优选地，所述第一标记是一种荧光基团而所述第二标记是一种淬灭剂，或者反之亦可。

在另一些实施方案中，所述探针包含两种标记，此两种标记为一个FRET对。优选地，一种标记在第一寡核苷酸上而第二种标记在第二寡核苷酸上。

此外，所述第一和第二寡核苷酸都可以包含多个标记实体。例如，所述第一和第二寡核苷酸都可以既包含一个荧光基团又包含一个淬灭剂。

典型地，所述荧光基因和所述淬灭剂与所述寡核苷酸相联，并且联接方式满足当所述第一寡核苷酸与一段未标记的模板序列(例如一条目标核酸)结合时，该荧光基团与该淬灭剂分离。

或者，所述荧光基因与所述淬灭剂与所述寡核苷酸相联，并且联接方式满足当所述第一寡核苷酸与一段未标记的模板序列(例如一条目标核酸)结合时，该荧光基团与该淬灭剂被拉至紧邻位置，从而该荧光基团被淬灭。

本文所用术语“荧光基团”是指在一定范围的激发波长下吸收光能，并以一个不同范围的波长发射光能的基团。

荧光标记的例子包括但不限于：Alexa Fluor染料(Alexa Fluor 350，Alexa Fluor 488，Alexa Fluor 532，Alexa Fluor 546，Alexa Fluor 568，Alexa Fluor 594，Alexa Fluor 633，Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)，AMCA，AMCA-S，BODIPY染料(BODIPY FL，BODIPY R6G，BODIPY TMR，BODIPY TR，BODIPY 530/550，BODIPY 558/568，BODIPY 564/570，BODIPY 576/589，BODIPY 581/591，BODIPY 630/650，BODIPY 650/665)，羧基罗丹明6G，羧基-X-罗丹明(ROX)，Cascade蓝(Cascade Blue)，Cascade黄(Cascade Yellow)，花青染料(Cy3，Cy5，Cy3.5，Cy5.5)，磺酰，Dapoxyl，二烷基氨基香豆素(Dialkylaminocoumarin)，4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基-荧光素，DM-NERF，伊红，赤藓红，荧光素，FAM，羟基香豆素，IRDye(IRD 40，IRD 700，IRD 800)，JOE，丽丝胺罗丹明B，Marina Blue，甲氧基香豆素，萘荧光素(Naphthofluorescein)，俄勒冈绿488，俄勒冈绿500，俄勒冈绿514，太平洋蓝(Pacific Blue)，PyMPO，芘，罗丹明6G，罗丹明绿，罗丹明红，对甲氨基酚绿(Rhodol Green)2′，4′，5′，7′-四溴砜-荧光素(2′，4′，5′，7′-Tetra-bromosulfone-fluorescein)，四甲基罗丹明(TMR)，羧基四甲基罗丹明(TAMRA)，德克萨斯红和德克萨斯红-X。

本文所用术语“淬灭剂”包括任何当与一种激发态的荧光标记紧邻时，能够吸收该荧光标记的能量，并能令此能量散逸的基团。淬灭剂可以是一种荧光的淬灭剂或一种非荧光的淬灭剂，后者也被称为暗淬灭剂。以上所列的荧光基团当被拉拢至另一荧光基团相邻位置时能起到淬灭剂的作用，其中所发生的淬灭可以是FRET淬灭或者接触淬灭。优选使用不发射任何可见光的暗淬灭剂。暗淬灭剂的例子包括但不限于：DABCYL(4-(4′-二甲基对胺基偶氮苯)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯，二芳基罗丹明羧酸(diarylrhodamine carboxylic acid)，琥珀酰亚胺酯(QSY-7)，4′，5′-二硝基荧光素羧酸，琥珀酰亚胺酯(QSY-33)，quencherl，“黑洞淬灭剂”(BHQ-1，BHQ-2和BHQ-3)，核苷酸类似物，鸟苷酸残基，纳米粒子，以及金颗粒。

上述相互作用的标记对可以形成FRET关系或者接触淬灭关系。优选地，为了有效的接触淬灭，荧光标记和淬灭剂之间的距离是0到10个核苷酸；更优选地，荧光标记和淬灭剂之间的距离是0到5个核苷酸；更优选地，荧光标记和淬灭剂之间的距离是0到2个核苷酸.淬灭剂优选为非荧光体。淬灭剂可以是一种纳米粒子。所述纳米粒子可以是一种金纳米粒子。上述淬灭剂还可能是鸟苷酸残基或多聚鸟苷酸残基。

每种探针上的标记或多个标记的组合能够产生一种每种探针特征性的可检测的信号，此信号可表示第一和第二寡聚核苷酸的双链区存在还是不存在。标记的功能是显示探针的第一寡聚核苷酸是与第二寡聚核苷酸结合还是与靶核苷酸结合，更能显示是否第二寡聚核苷酸结合。

至少一种标记与所述探针或其第一寡核苷酸，或者与该探针的第二寡核苷酸相联。当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸结合时，该标记令荧光发射增强或者减弱。

优选地，所述探针包含一种第一标记和一种第二标记，其中至少一种标记能够产生一种可检测的信号，并且其中所述信号的强度受这两种标记的接近程度的影响。

在本发明的一些实施方案中，所述第一标记与所述双链部分的一条链相联，并且所述第二标记与所述探针的该双链部分的另一条链相联，如此当该探针的内部双链体形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。

在另一些实施方案中，所述第一标记与所述第一寡核苷酸相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸相联，如此当所述探针的内部双链部分形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。

在本发明的一些实施方案中，所述第一寡核苷酸不包含标记。在另一些实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一种单一标记，当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，该标记能改变其荧光发射。

在一些实施方案中，所述第一标记与所述第一寡核苷酸相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸相联，如此当所述探针的内部双链体形成时，所述第一标记和第二标记位置紧邻。优选地，所述第一标记与所述第一寡核苷酸的第二区域相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸上与所述第一寡核苷酸的第二区域互补的区域相联，如此当所述探针的内部双链体形成时，所述第一和第二标记被拉拢至位置紧邻。这样的实施方案的例子显示于图4A、4B和4C中。

在本发明的一些方面中，所述探针的第一寡核苷酸不包含标记，而该探针的第二寡核苷酸包含至少一种、优选两种标记。

在该方面的一个实施方案中，所述第二寡核苷酸包含一个第一标记和一个第二标记。所述第一标记在所述第二寡核苷酸的一个末端或接近末端处与之相联，并且所述第二标记在该第二寡核苷酸的另一个末端或接近该末端处与之相联，由此当该第二寡核苷酸不与第一寡核苷酸杂交时，该第二寡核苷酸处于将该第一标记和第二标记拉拢至紧邻位置的一种无规线团结构或一种茎-环结构。当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，上述两种标记保持彼此远离。这样的实施方案的例子显示于图4D、4E和4F中。

在先技术中已知，当一种双标记的寡核苷酸处于单链状态并且在一定的许可温度下时，其可以形成一种无规线团结构。这样的线性寡核苷酸探针在溶液中的行为类似一种无规线团：它的两个末端会偶然地互相接近，导致能量转移的一种可测量的改变。但是，当这种探针与其模板结合时，该探针-模板杂交体迫使该探针的两个末端分开，破坏了这两个末端部分之间的相互作用，从而导致荧光发射的一种改变。

双标记的寡核苷酸也可以形成一种称为分子信标的茎-环结构。分子信标探针是能形成一种发夹结构的单链寡核苷酸探针，在所述发夹结构中，一种荧光基团和一种淬灭剂通常被置于该寡核苷酸相对的两端。在所述探针末端处的短的互补序列允许一种分子内茎的形成，从而令所述荧光基团与所述淬灭剂能处于紧邻位置。上述分子信标的环部分与所感兴趣的一种目标核酸互补。这种探针与其目标核酸之间的结合形成了一种杂交体，令所述茎分开。这将导致一种构象变化，构象变化使所述荧光基团和所述淬灭剂彼此分开并导致更强的荧光信号(Tyagi S.和Kramer F.R.，Nature Biotechnology(自然生物技术)，Vol.14，pages 303-308(1996)；Tyagi等人，Nature Biotechnology(自然生物技术)，Vol.16，pages 49-53(1998)；Piatek等人，Nature Biotechnology(自然生物技术)，Vol.16，pages 359-363(1998)；Marras S.等人，Genetic Analysis：Biomolecular Engineering(遗传分析-生物分子工程)，Vol.14，pages 151-156(1999)；Tpp I.等人，BioTechniques(生物技术)，Vol 28，pages 732-738(2000))。

在本发明中，具有双链部分的线性探针的一种第二寡核苷酸，是一种探针的一个双链部分的一部分，其中所述第二寡核苷酸可以是一种类似分子信标的寡核苷酸。这种探针与其他探针的不同之处在于，所述第二寡核苷酸可不与目标序列杂交，而与所述第一寡核苷酸的第二区域杂交，其中所述第二区域可与目标序列无关。所述第二寡核苷酸可以是能与目标序列杂交的，但它被设计为在实际的扩增反应中不能与目标序列杂交。所述第二寡核苷酸可以包含与一种目标序列不能牢固地结合的序列。在扩增反应的延伸和退火步骤，温度可能会太高，使得所述第二寡核苷酸不能与目标序列杂交。而在通常于延伸步骤之后进行的信号收集步骤，温度可能会较低，但由于待扩增的目标序列可能因扩增引物业已进行的延伸而变成双链，所述目标序列可能会不能供所述第二寡核苷酸杂交。因此，在信号收集步骤，所述第二寡核苷酸可能仅能与所述探针未被消耗的第一寡核苷酸杂交。

另一方面，所述第一寡核苷酸不含标记而所述第二寡核苷酸包含一种标记。当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交从而形成所述探针的双链部分时，所述标记的可检测的信号发射，相对于该标记在单链形式的所述第二寡核苷酸中的发射发生改变。这可以是由于所述标记被拉至与所述第一寡核苷酸中的一个或多个核苷酸紧邻的位置，或者由于所述标记被拉离了所述第二寡核苷酸中的一个或多个核苷酸。

在先技术中已知，当一种荧光染料与特定的核苷酸，例如一个G核苷酸位置紧邻时，其荧光发射可发生改变。

在另一个实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸不含标记，并且所述探针包含两种能与所述第一寡核苷酸的第二区域上的不同部分相邻地或充分相邻地杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸之一与一种第一标记相联，而另一种第二寡核苷酸与一种第二标记相联，如此当上述两种第二寡核苷酸与上述第一寡核苷酸杂交时，这两种标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。

所述紧邻位置可以导致如FRET或接触淬灭的关系。与上述第一寡核苷酸杂交的上述两种第二寡核苷酸是所述探针的部分。上述两种标记的第二寡核苷酸被设计为不与扩增的目标序列杂交，而与未被消耗的第一寡核苷酸杂交。图4I和4J中给出了这样的实施方案的例子。

在其他一些实施方案中，一种探针的第一和第二寡核苷酸通过包含核苷酸或一种非核苷酸的化学部分的一种连接部分相连，从而允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成一种茎-环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸分别被标记，如此当所述探针形成一种内部茎-环结构时，上述标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。

所述连接部分可以是如分子式为(CH₂)_n的一个简单部分，或者是功能与之相当的一种连接(n优选地为1至100或1至50)。优选地，所述连接部分为与所述第一和第二寡核苷酸相连的一种寡核苷酸。优选地，上述环与所述目标序列互补。

所述扩增反应混合物中的至少两种探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的一种不同的可检测的标记。

在多重反应中，两种或多种探针被用于检测两种或多种目标核酸的存在。但是，这并不一定意味着，每种不同的探针需要有不同的可区分的标记。每种探针可以具有依赖于其内部双链部分的特征的一种特有的熔解图谱。因此，若两种或多种探针具有可区分的熔解特性，则可将相同的标记用于这些探针。也就是说，用相同的标记或其发射光谱不可区分的标记标记的不同探针，必须具有不同的熔解特性，优选具有不同的熔解温度(T_m)。上述不同的熔解特性将允许各种探针在步骤(c)中被鉴定和/或定量。

本文所用术语“熔解特性”包括探针的熔解图谱(优选通过测定来自该探针上的标记的信号作为温度的函数进行测量)和/或探针的熔解温度(T_m)。

当称探针的熔解特性是“不同的”时，应当明白这种不同之处系会在相同或对照条件下测得。

在本发明的一些实施方案中，两种或多种探针被相同的可检测的标记标记。例如，第一寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多种的不同的探针可以都被相同的标记标记，或第二寡聚核苷酸的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或30或者更多种的不同的探针可以都被相同的标记标记。

在步骤(b)中，在所述样品/扩增(或样品/杂交)反应混合物中进行扩增反应，其中，当一种目标核酸存在时，与该目标核酸的部分充分互补的探针(第一寡聚核苷酸)在所述扩增反应过程中被消耗。

所述扩增反应可以在本领域已知的条件下进行，如此与所述目标核酸的部分充分互补的探针被消耗。

优选地，所述扩增包括至少一个变性步骤、至少一个退火步骤和至少一个引物延伸步骤。

更优选地，所述扩增是一种包括两个或更多的变性、退火和引物延伸步骤的热循环扩增。

优选的扩增反应包括PCR，SDA，NASBA，LAMP，3SR，ICAN，TMA，解旋酶依赖的等温DNA扩增以及类似方法。PCR为一种优选的扩增方法。若所述扩增为PCR，则所述条件包括将反应进行热循环。

当一种目标核酸在所述样品中存在时，至少一些与该目标核酸的部分互补的探针(第一寡聚核苷酸)将在适当的反应条件下与各自的互补部分杂交。所述第一寡核苷酸将因此被消耗。

所述探针的消耗通过其与目标序列的杂交而实现，杂交可继以在扩增步骤中所述探针向扩增产物中的掺入或/和所述探针的降解。也就是说，所述探针第一寡核苷酸在被消耗后不再能重新构成其之前形成了一种部分的那样的探针。

在一个扩增反应中，当探针具有两条链时，本发明的探针可以通过将所述第一和第二寡核苷酸以任意比例，例如，所述第二寡核苷酸对所述第一寡核苷酸的比例优选为大于1，或者可以为大于0.1且小于1，添加到所述反应中而构成。如此，所述第一和第二寡核苷酸可以独立地加入加入到扩增反应混合物中。

依赖于检测方法的类型和实际使用的标记的类型，当所述探针或所述探针的第一寡核苷酸被消耗时，来自所述探针的信号(例如荧光发射)可以增强或减弱。参阅图4中所示的实施方案。在图4A至4C中，由于与荧光基团相联的第一寡核苷酸被消耗，并因此允许该荧光基团发射其信号，所述探针的消耗导致荧光的增强。相反地，在图4D至4F中，所述第一寡核苷酸的消耗释放了双重末端标记的第二寡核苷酸，并因此允许荧光基团与淬灭剂彼此并置，从而导致来自所述荧光基团的信号的降低。

在一个实施方案中，所述探针第一寡核苷酸可被延伸，并且作为正向或反向引物起作用。所述探针的第一寡核苷酸可以作为扩增引物之一，能够被掺入到扩增产物之中，并因此被消耗(参见图6)。在一次PCR中，所述探针的第一寡核苷酸与针对反向链的另一扩增引物作为引物对共同进行扩增。在信号收集步骤，或者测量所述探针的熔解图谱的步骤，该探针的已掺入到扩增产物中的第一寡核苷酸不再能参与形成该探针内部双链部分的双链体。所述探针未被消耗的、能够参与形成该探针双链体的第一寡核苷酸的量，可以被测定，并且此信号可以转换为被消耗了的第一寡核苷酸的量，从而测定出哪种或者有多少目标序列存在于一份样品中。当所述第一寡核苷酸作为一种引物起作用时，所述第二寡核苷酸优选不作为一种引物起作用。

在本发明的另一个实施方案中，所述单链探针或具有两条链的探针的第一寡核苷酸在扩增过程中被降解。例如，所述第一寡核苷酸可以包括对一种消化剂敏感的核苷酸或非核苷酸的化学部分。一个进一步的例子中，当与目标序列杂交时，所述探针或所述第一寡核苷酸能被上述消化剂降解。例如，所述探针或所述第一寡核苷酸可以包含RNA核苷酸。当所述第一寡核苷酸与目标序列杂交时，它能被具有核酸核酸酶H活性的酶降解。可以设计为当所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交以形成所述探针的双链部分时，所述第一寡核苷酸不能被降解。所述第一寡核苷酸也可以被一种外切核酸酶降解。例如，所述第一寡核苷酸的3′核苷酸可以被一种聚合酶的3′外切核酸酶活性降解。所述第一寡核苷酸还可以被一种内切核酸酶降解，例如在与一种目标核酸杂交时被一种限制酶降解。

优选地，所述单链探针或具有两条链的探针的第一寡核苷酸被一种DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶的5′外切核酸酶活性降解。在该实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸可以是3′端被封闭的，并且因此而不能被延伸。在PCR扩增中，所述第一寡核苷酸与目标序列上两边分别为正向和反向引物的区域杂交，并且能被一种核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5′外切核酸酶活性降解(参见图8)。或者，所述探针的第一寡核苷酸3′端是未被封闭的，并且因此而能被延伸。所述第一寡核苷酸与目标序列杂交，并且能被一种聚合酶延伸。所述第一寡核苷酸上游的一种扩增引物也得到延伸。在PCR扩增中，当上述扩增引物延伸至与所述第一寡核苷酸的延伸链相遇时，所述第一寡核苷酸的整条延伸链能被一种核酸酶活性，例如Taq聚合酶的5′外切核酸酶活性降解(参见图7)。

在本发明的另一个实施方案中，所述探针的消耗可以仅仅是该探针与目标序列的杂交，杂交的探针由此不再能形成所述探针的双链结构(参见图5)。优选地，扩增被设计为产生一种单链的产物，如此所述探针的第一寡核苷酸能在退火步骤期间和/或延伸步骤之后与目标序列杂交。用以产生单链产物的方法可以是不对称PCR，或者在PCDR中描述的一种方法(PCT/GB2007/003793)。上述单链的扩增链可以与所述第一寡核苷酸形成一种牢固的杂交体；所述第一寡核苷酸因此可以视作已被消耗，因为其难以再供形成所述探针的内部杂交体。

在本发明的另一个实施方案中，所述探针的第一寡核苷酸可以作为一种巢式内侧扩增引物起作用。所述第一寡核苷酸与一种外侧扩增引物与目标核酸的同一链退火。与目标核酸杂交后，所述外侧扩增引物和所述第一寡核苷酸可以都得到延伸。如果DNA聚合酶包含一种置换活性，则所述第一寡核苷酸的延伸链可在所述外侧引物的延伸过程中被置换。如果DNA聚合酶包含一种5′外切核酸酶活性，则所述第一寡核苷酸的延伸链可在所述外侧引物的延伸过程中被降解。

在一些实施方案中，扩增条件可以被设计为令所述探针在所述扩增的一些阶段即使当目标核酸存在时也不被消耗，而在另一些阶段被消耗。例如，若所述扩增为PCR，在扩增的一些热循环中，所述探针可因退火和延伸温度设置得太高，令所述探针不能结合而不被消耗。扩增的热循环条件可以被设计为令所述探针可以在扩增的一些阶段或者最后一个循环被消耗。例如，在热循环之后，将PCR管置于一个比所述热循环的退火和延伸温度都更低的温度孵育。这个较低的温度允许所述探针与目标核酸杂交，导致杂交的探针被延伸或降解。

步骤(b)可以进一步包括步骤(b1)：在多个测量温度(MTs)，逐循环地测量荧光发射(FEs)。所述测量温度(MTs)是指逐循环地对所述探针上的标记进行荧光发射读数以测定一种探针的荧光发射量的温度。

优选地，在一个反应中的每一循环，在反应混合物经一种被所述探针上的一种标记吸收的波长的光照射或激发之后，获得、检测和/或记录该标记的荧光发射。术语“逐循环”是指在每一循环中测量。在一个循环中，在一个测量温度进行荧光发射读数以计算剩余探针的荧光发射量。荧光发射可以连续地或间歇地被检测、记录或获得。

在一个连续记录过程中，在例如一个PCR反应的每一循环，所述探针的荧光发射例如每50ms、每100ms、每200ms或每1s被监测和记录一次。由此可以形成时间、温度和荧光发射的一个立体图。在任意一个给定的循环，在对应于一个所期望的MT的一个时间点进行荧光发射读数，以测定该循环中所述探针的荧光发射量。在一个间歇记录过程中，在每一循环中，仅当反应温度达到一个所期望的MT时进行荧光发射读数。

对于通过掺入至扩增产物或被一种消化剂降解而被消耗的探针，所述逐循环的荧光发射(FE)优选在每一循环的延伸步骤完成之后进行测定。对于通过与目标序列杂交而被消耗的探针，所述逐循环的荧光发射(FE)可以在每一循环的延伸步骤完成之前进行测定。

本文所述的荧光发射(FE)是指经基线校正的荧光(dR)。通常，对于每一孔(反应)和每一光路，利用一种线性最小均方算法(或者其他类似算法)在一定范围的循环对原始荧光数据进行拟合以得到一条基线。对每一循环，计算上述基线函数的值并将其从原始荧光中扣除，从而得到经基线校正的荧光(dR)。

荧光强度数据(扩增图)可以描述为一个二元函数：一个线性分量或者说背景，和一个包含有关信息的指数分量。荧光中的线性部分可以被算出并扣除，以分离出上述指数分量。对于每一扩增图(即每一反应和每一标记)，进行的处理由三个步骤组成：

1.鉴定出所有荧光组分均为严格线性(荧光无指数增长)的循环的范围。

2.利用以上确定的循环过程中的荧光强度值，将数据拟合为一条直线(一个预测上述线性分量在整个反应中的贡献的函数)。

3.在每一循环过程中，扣除上述预测的背景荧光强度。如此得到的曲线对应于因DNA扩增导致的荧光变化。

当扩增反应混合物包含“n”种用于对“n”种目标核酸进行多重检测的探针时，第一种探针的熔解温度为T_m1，第二种探针的熔解温度为T_m2，第三种探针的熔解温度为T_m3，第k种探针的熔解温度为T_mk，并且第n种探针的熔解温度为T_mn，其中T_m1＞T_m2＞T_m3＞…T_mk…＞T_mn，其中n和k为正整数，1≤k≤n，并且n≥2。

在一个特定的温度或一系列的温度，一种探针的双链形式占探针总量的百分比，可以通过实验进行测定，或者进行预测，其中所述预测可以通过计算机程序进行。由于一种探针熔解时的荧光发射的一阶负导数对温度作图会得到一条正态分布曲线，统计学领域的普通技术人员可以容易地定义一个MT，一种给定探针总量的一个百分比的该探针在该MT处于双链形式或单链(即分离的)形式。据此，一个测量温度为，例如不多于20％的一种探针处于单链形式的一个温度。可以制作出一个列出每种探针在每一温度其双链(ds)和单链(s)形式的百分比的表。

在一个测量温度MTa可以获得一个第一荧光发射FEa，其中在此MTa多于50％的第一探针处于双链形式；在一个测量温度MTb可以获得第二荧光发射FEb，其中在此MTb多于50％的第二探针处于双链形式；在一个测量温度MTk可以获得第k荧光发射FEk，其中在此MTk多于50％的第k种探针处于双链形式；在一个测量温度MT(n-1)可以获得第n-1荧光发射FE(n-1)，其中在此MT(n-1)多于50％的第n-1种探针处于双链形式；在一个测量温度MTn可以获得第n荧光发射FEn，其中在此MTn多于50％的第n种探针处于双链形式；可供选择地，在一个测量温度MT0可以获得一个荧光发射FE0，其中在此MT0不多于10％的第一探针处于双链形式。

尽管以上提到的50％是处于双链形式的探针的一个优选的量，应当认为任何百分比都可使用，例如40％、55％、70％或80％。优选地，在一个测量温度MTk逐循环地获得荧光发射FEk的步骤，其中在此MTk不多于30％的第(k-1)种探针处于其内部双链形式。更优选地，在一个测量温度MTk逐循环地获得荧光发射FEk的步骤，其中在此MTk不多于20％的第(k-1)种探针处于其内部双链形式。

步骤(b)可进一步包括步骤(b2)：对每种探针，逐循环地测定来自被消耗的探针的荧光发射的实际消耗量，其中第k种探针的荧光发射的实际消耗量记为ACA_k。在一个特定的测量温度(MTa)，此温度一种探针有一定百分比(dska)％处于ds(双链)形式，第一探针在此测量温度MTa对荧光发射FE的贡献为(ds1a)％*(ACA₁)，第二探针的贡献为(ds2a)％*(ACA₂)，第k种探针的贡献为(dska)％*(ACA_k)。例如，在60℃，70％的探针1处于ds形式；在50℃，80％处于ds形式。所述探针1在60℃对FE的贡献为70％*(ACA₁)；所述探针1在50℃对FE的贡献为80％*(ACA₁)。若存在多种探针，则FE为被消耗的所有探针所贡献的总量。实际消耗量(ACA)可以用下列公式计算：

在温度a，总荧光发射为

FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％

在温度b，总荧光发射为

FEb＝(ACA1)*(ds1b)％+(ACA2)*(ds2b)％+(ACA3)*(ds3b)％…+(ACAn)*(dsna)％

在温度c，总荧光发射为

FEc＝(ACA1)*(ds1c)％+(ACA2)*(ds2c)％+(ACA3)*(ds3c)％…+(ACAn)*(dsna)％

依此类推。单独的ACA可以从以上公式算出。

“*”表示“乘以”。

优选地，每种探针的实际消耗量通过一种运行上述计算的计算机程序获得。或者，上述计算可以人工进行。

例如，在一个扩增反应中，有针对三种目标序列的三种探针。在65℃时，5％的第一探针处于双链形式，0％的第二探针和0％的第三探针处于双链形式。在60℃时，60％的第一探针处于双链形式，5％的第二探针处于双链形式，0％的第三探针处于双链形式。在55℃时，90％的第一探针处于双链形式，55％的第二探针处于双链形式，5％的第三探针处于双链形式。在45℃时，多于95％的所有各种探针处于双链形式。在60℃收集第一荧光发射FE60，在55℃收集第二荧光发射FE55，在45℃收集第三荧光发射FE45。可供选择地，在收集所述第一荧光发射之前，在65℃或更高的温度收集一个荧光发射，是为FE65。由单种探针的实际消耗量ACA贡献的FE用ds％*(ACA)进行计算。参见下表：

FE65＝5％*ACA1+0％*ACA2+0％*ACA3≈0

FE60＝60％*ACA1+5％*ACA2+0％*ACA3    (1)

FE55＝90％*ACA1+55％*ACA2+5％*ACA3    (2)

FE45＝95％*ACA1+95％*ACA2+95％*ACA3    (3)

单独的ACA可以从以上公式算出。若我们假设5％*ACA可忽略不计。可以从(1)、(2)和(3)计算出近似的ACA，其中

ACA1＝(EF60)/0.6

ACA2＝((EF55)-0.9/0.6*(EF60))/0.55

ACA3＝(EF45)/0.95-(EF60)/0.6-(EF55-(0.9/0.6)*(EF60))/0.55

随着PCR混合物热循环的进行，荧光发射和实际消耗量(ACA)被记录(计算)，并对循环数作图，得到一个荧光发射对循环的图。在最初的若干循环，荧光发射的量几乎不变，表现为上述图中的一条基线或者一个平台。随着热循环继续进行，可以预期会观察到荧光发射的量发生高于基线的增加，这表明经扩增的产物(或被消耗的探针)已积累至一种探针在所述经扩增的产物(或被消耗的探针)存在下的荧光发射超过PCR设备的检测阈值。自荧光发射量发生指数增加起进入指数期，最终当PCR混合物中的组分之一变得有限时达至另一个平台期。上述作图通常得到一条两端各有一平台、中间为一个指数期的S形曲线。在指数期，探针的荧光发射量在每一循环增加为此前量的(1+E)倍，其中E为扩增的效率，其理想值为100％或1。众所周知，用以扩增出一种产物的核酸模板的初始量越大，高于基线的增长就越早被观察到。如本领域所熟知的，上述荧光发射对循环的图提供了用以获知核酸模板的初始拷贝数或者量的重要信息。

如实时PCR领域中所知的，可以通过将一种核酸模板的荧光发射对循环的图，与经标准化的图进行比较，来对未知量的该核酸模板进行定量。

在本发明的一个实施方案中，当多种核酸模板被扩增，得到多种扩增产物时，每种产物优选与用与之相同的产物获得的标准曲线进行比较。可以用每一PCR混合物的每一稀释度产生单独一种产物来获得标准曲线。优选地，在每一稀释度，基于本发明中所述的方法，在单一PCR混合物中包含多种产物并且可对每种探针的荧光发射读数进行测量和作图从而得到一条标准曲线。

一份样品中的一种核酸模板的初始量也可以不使用标准曲线，而通过将所述模板以其对一种校准子的相对关系相对一种看家基因或一种均一化子进行均一化而测定出。例如，GAPDH和b-actin基因是常用的看家基因，由于他们的大量存在和稳定可以用来作校准子子模板。用于均一化子的样品可以是没有加工的细胞，组织或器官。

在本发明的一个实施方案中，在单一PCR混合物中对所感兴趣的多种核酸模板进行扩增和定量。每种核酸模板的初始量可以同时被算出并相对一种均一化子进行均一化。并且预期，多种核酸模板和一种均一化子模板可以在相同的PCR反应中进行监测和扩增。进一步预期，多于一种的看家基因模板或均一化子可以在同一PCR反应中与多种核酸模板一起扩增。进一步预期，这些模板之间的相对量或者这些模板之间的比例可以从单一PCR混合物中得到测定。

步骤(c)包括通过检测来自未被消耗的探针上的标记的、作为温度的一个函数的信号，测量这些探针的第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的熔解图谱至少一次，

其中所述熔解图谱提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。

为了测定每种探针或每组探针的熔解(图谱)曲线，用能被这些探针上的标记吸收的光照射反应混合物，并且监测所述反应作为温度的一个函数的荧光。更特别地，随着样品温度的升高(或降低)，测量上述标记的荧光，直至荧光达到一个基线水平。

数据可以以荧光对温度作图，或者如以荧光的一阶导数对温度作图来显示。这两种图可以相互转换，不过每种图令观察者的注意力聚焦在数据的不同方面。导数图最适合观察熔解峰(或T_m)。而在荧光对温度的图中，则更容易观察转变的展宽和低熔点转变的出现。通过观察荧光的一阶导数对温度的图，可以更容易鉴别出荧光增强或减弱的速率发生转变的点。荧光变化速率最大的点被认为是该探针双链体的熔解温度。若一种探针具有更高的T_m，则它形成的探针双链体更牢固，并且相应地比其他探针在更高的温度熔解。不同探针的明显不同的熔解温度使得可以鉴定出扩增过程中被消耗的是哪种探针(假设这些探针具有相同的标记)。

在本发明的一些方法中，作为一种变性梯度的一个函数对荧光进行监测。不过，实际监测的是由所述探针的双链部分的两条链的解离导致的荧光的改变，而与梯度的类型无关。上述变性梯度可以是一种热梯度。或者说，本发明示例性地指向一种方法，其特征在于，在(优选为PCR的)扩增期间或之后，对温度依赖的荧光进行检测。不过，若对温度依赖的荧光的监测是一种均一检测方式的一部分，如此(PCR)扩增和对温度依赖的荧光的监测在中途不打开反应室的情况下于同一反应管中进行时，它通常是可取的。

熔解图谱分析可以通过在熔解或杂交过程中检测温度依赖的荧光而实现。通常，熔解曲线分析的进行尽可能地慢，以产生准确的并且高度可重复的数据，从而实现对熔点的准确测定，其中熔点被定义为温度对荧光作图的一阶导数的最大值。不过，若所选择的时间参数相对较短，也可以带来某些好处。

熔解图谱的测量可以在扩增完成之后进行(扩增后熔解图谱)，和/或于扩增期间在每一循环或选定的循环进行(扩增中熔解图谱)。

在一个实施方案中，在一次PCR反应完成之后对温度依赖的荧光进行监测。在一个可选择的实施方案中，在一次PCR反应期间对温度依赖的荧光进行实时监测。

在一个实施方案中，在进行所述测量的过程中，扩增产物(扩增子)依然为双链，因而不涉及信号的可检测的变化或者即使涉及也极少。而在另一个实施方案中，对熔解图谱的测量可以在一些扩增产物处于单链形式时进行。

技术人员将能够仅从扩增后熔解图谱(并且不用将所述熔解图谱与任何其他的熔解图谱进行比较)即可判定至少一种目标核酸是否已得到扩增。例如，图1和2显示了扩增后得到的“更扁平”的曲线，不同于未被消耗的探针特征性的更趋“S”形的曲线。

本发明的方法可进一步包括步骤(d)

(i)比较步骤(c)中获得的至少两种熔解图谱

和/或

(ii)将步骤(c)中获得的一种熔解图谱与

一种事先获得的相同探针的熔解图谱，或者

相同探针的一种在平行对照反应中同时获得的熔解图谱，或者

相同探针的一种理论上的熔解图谱，

进行比较

其中所述熔解图谱的变化提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。

所述熔解图谱的测量可以在扩增发生前(扩增前熔解图谱)，和/或扩增完成后(扩增后熔解图谱)，和/或扩增期间在每一循环或选定的循环(扩增中熔解图谱)进行。

探针的扩增前熔解图谱可以在扩增开始前在同一反应管中进行测量，或者可以在由于其反应混合物中缺乏扩增所必需的一种或多种成分而不发生扩增的另一反应管中进行测量。这样的成分的例子包括一种dNTP，一种聚合酶和一种目标核酸。

应当指出的是，本发明的方法并不一定要求上述扩增前熔解图谱的测量作为本发明的方法的一个部分。此图谱可以是所涉及的探针或多种探针的组合的特征性的图谱，并且可以是之前已被测量并且/或者以一种可恢复的方式，例如以一种可用计算机读取的形式，进行了存储的。

反应混合物中的每种探针特异性地针对一种特定的目标核酸。所使用的不同探针被相同的标记或其发射光谱不可区分的标记标记，并且所述探针为经过选择，以具有不同的熔解特性如不同的熔解图谱或不同的熔解温度(T_m)的。

步骤(c)中所获得的熔解图谱是存在于扩增反应混合物中的各种探针的熔解图谱的一个综合。由于不同的探针为经过选择以具有不同熔解图谱的这一事实，本领域的技术人员可以通过人工方法或者优选地通过利用计算机的方法，对每种探针各自对于合并后的熔解图谱的贡献加以区分。这样，特定探针的存在与否，并且因此特定目标核酸在样品中的存在与否，都可以彼此得到区分。

每种探针的扩增前和扩增后熔解图谱之间的比较，可鉴定出该曲线中为一种特定探针所特有的哪方面特征消失了或减弱了，从而表明该特定探针在扩增过程中被消耗，并进一步表明相应的目标核酸存在于该样品中。

优选地，扩增进行之前与扩增完成之后或扩增进行一些循环之后探针的熔解图谱之间的比较，通过一种计算机程序进行。所述计算机程序能确定哪种探针或者该探针有多少被消耗，这些又表明哪种目标核酸或者相应的目标核酸有多少存在于一份样品中。

具有相同的标记或其发射光谱不可区分的不同标记的探针的熔解温度(T_m)，与类似标记的探针的熔解温度普遍彼此不同。在一个实施方案中，一个探针组中的多种探针各自被相同的标记(或其发射光谱不可区分的不同标记)标记，并且每种探针具有一个独特的熔解温度范围。在一次多重检测中，当反应温度从杂交温度向一个变性温度升高时，具有最低的T_m的探针双链体最先解链，具有次低的T_m的探针双链体次之分离，而具有最高的T_m的探针双链体最后变性。同时，由于所述探针双链体的逐渐熔解，与探针相联的标记的荧光发射发生与逐渐升高的反应温度成比例的变化，从而允许在合并的熔解图谱中对每种探针进行区分。熔解曲线的形状和位置是探针的双链部分的GC/AT比例、长度和序列的函数。

优选地，具有相同的标记或其发射光谱不可区分的不同标记的探针的T_m，与其他类似地标记的探针的T_m，有至少2℃，优选至少3℃，4℃或5℃的差异。

在本发明的一个方面，利用对一个PCR反应的实时荧光监测来获得该PCR反应过程中一种探针的熔解曲线。PCR中驱动扩增进行的温度循环，交替地在一个较高的温度令累积中的产物和标记的探针变性，而在一个较低的温度令探针的至少一条链和引物与产物退火，从而令一些探针被消耗。随着对样品的加热，剩余的(未被消耗的)探针的内部双链部分逐渐解链，以贯穿此内部双链部分解链温度的加热过程中的荧光作为温度的一个函数作图，即得出了一个探针的熔解曲线。如此，在一个PCR反应过程中对荧光的持续监测提供了一种通过探针熔解图谱检测探针浓度变化的体系。这样的一种体系，尤其是一种HRM-PCR体系，可用于通过熔解温度上少于2℃的差异区分剩余的探针。

本发明还提供了一种用于监测对至少两种目标核酸的一次PCR扩增的方法，所述方法包括：

(a)令一份包含一种或多种目标核酸的样品与一种扩增反应混合物接触，所述混合物包含：

(i)一对或多对正向/反向寡核苷酸引物，其中当所述样品中存在一种或多种目标核酸时，所述引物对能扩增所述目标核酸，以及一种核酸聚合酶，

(ii)包括两种或多种探针的一个探针组，其中至少一种探针包含一个双链部分，所述探针可以是分子信标探针，或者所述探针可以包含两条链：

一种包含一个与一种目标核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和

至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的一个第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中每种探针包含一个能产生一种可变信号的可检测的标记，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸之间形成的双链部分是否存在，并且

其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，

其中每种上述探针的双链部分的熔解特性不相同；

(b)在样品/扩增反应混合物中进行扩增反应

其中，当一种目标核酸存在时，与该目标核酸的部分充分互补的相应探针，在扩增反应过程中被消耗；并且

其中步骤(b)进一步包括步骤(b1)：在多个检测温度(MT)逐循环地获取荧光发射(FE)，其中所述荧光发射(FE)为经基线校正的荧光(dR)，

其中当所述扩增反应混合物包含“n”种用于对“n”种目标核酸进行多重检测的探针时，其中第一种探针的熔解温度为T_m1，第二种探针的熔解温度为T_m2，第三种探针的熔解温度为T_m3，第n种探针的熔解温度为T_mn，其中T_m1＞T_m2＞T_m3…＞T_mn，其中，在一个特定的温度或不同的多个温度，每种探针的双链形式所占的百分比可以通过实验进行测定或通过计算机程序从理论上予以算出，其中在一个测量温度MTa获得一个第一荧光发射FEa，在此MTa多于50％的第一种探针处于双链形式，在一个测量温度MTb获得第二荧光发射FEb，在此MTb多于50％的第二种探针处于双链形式，在一个测量温度MT(n-1)获得第n-1荧光发射FE(n-1)，在此MT(n-1)多于50％的第n-1种探针处于双链形式，在一个测量温度MTn获得第n荧光发射FEn，在此MTn多于80％的第n种探针处于双链形式，可供选择地，在一个测量温度MT0获得一个荧光发射FE0，在此MT0不多于10％的第一种探针处于双链形式，其中n为一个正整数并且n≥2，

其中步骤(b)可进一步包括步骤(b2)：对每种探针，逐循环地测定来自被消耗的探针的荧光发射的实际消耗量，其中第k种探针的荧光发射的实际消耗量记为ACA_k。在一个特定的测量温度(MTa)，其中此温度一种探针有一定百分比(dska)％处于ds(双链)形式，第一探针在此测量温度MTa对荧光发射FE的贡献为(ds1a)％*(ACA₁)，第二探针的贡献为(ds2a)％*(ACA₂)，第k种探针的贡献为(dska)％*(ACA_k)。例如，在60℃，70％的探针1处于ds形式；在50℃，80％处于ds形式。所述探针1在60℃对FE的贡献为70％*(ACA₁)；所述探针1在50℃对FE的贡献为80％*(ACA₁)。若存在多种探针，则FE为被消耗的所有探针所贡献的总量。实际消耗量(ACA)的计算可以用下列公式进行：

在温度“a”，总荧光发射为

FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％

在温度“b”，总荧光发射为

FEb＝(ACA1)*(ds1b)％+(ACA2)*(ds2b)％+(ACA3)*(ds3b)％…+(ACAn)*(dsna)％

在温度“c”，总荧光发射为

FEc＝(ACA1)*(ds1c)％+(ACA2)*(ds2c)％+(ACA3)*(ds3c)％…+(ACAn)*(dsna)％

依此类推。单独的ACA可以从以上公式算出。

其中每种探针的荧光发射量通过一种计算机程序得出或者人工得出。

本发明还提供了一种与本发明的方法一起使用的计算机软件产品，当以适当的数据处理方法运行时，所述软件适用于比较探针的熔解图谱和/或对一个包含多重目标的实时PCR扩增进行定量，并且所述软件可进行对荧光发射和实际消耗量(ACA)的计算。

通常，一旦通过PCR设备获得了荧光发射值并且已知在每一温度每种探针的双链形式所占的百分比，即可人工计算出ACA。不过，通过使用一种计算机系统而自动进行上述计算往往是可取的。

在一个进一步的实施方案中，本发明涉及一种计算机体系，该计算机体系包括一个存储有一种计算机软件程序的计算机存储器，其中所述计算机软件程序当被一个处理器或在一台计算机中运行时，会施行根据本发明的方法。在一个优选的实施方案中，一种计算机程序产品包括一个存储有一种计算机软件程序的计算机存储器，其中所述计算机软件程序运行一种包括在扩增期间或在扩增结束时计算ACA和/或测定熔解图谱的特征的步骤的方法。

如本领域的技术人员所会乐见的那样，本发明的一种计算机程序产品，或者本发明的一种计算机软件程序，可以存储于一台PCR设备中并且/或者在其中运行，并用于计算每种探针的量。

本发明进一步提供一种用于检测一种或多种目标核酸的试剂盒，该试剂盒包括一种探针，所述探针包含：

一种包含一个与一种目标核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的、由15至150个核苷酸构成的第一寡核苷酸，和

至少一种由4至150个核苷酸构成的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中每种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，

并且其中

(a)所述探针的第一寡核苷酸不包含标记，所述第二寡核苷酸包含一种第一标记和一种第二标记，其中所述第一标记在所述第二寡核苷酸的一个末端或接近末端处与之相联，并且所述第二标记在该第二寡核苷酸的另一个末端或接近该末端处与之相联，由此当该第二寡核苷酸不与第一寡核苷酸杂交时，该第二寡核苷酸处于将该第一标记和第二标记拉拢至紧邻位置的一种无规线团结构或一种茎-环结构，并且其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，上述两种标记彼此远离；或者

(b)所述第一寡核苷酸不包含标记而所述第二寡核苷酸包含一种标记，其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交从而形成所述探针的双链部分时，所述标记的可检测的信号发射，相对于该标记在单链形式的所述第二寡核苷酸中的发射，能够发生改变；或者

(c)所述探针的第一寡核苷酸不含标记，并且所述探针包含两种能与所述第一寡核苷酸的第二区域上的不同部分相邻地或充分相邻地杂交的第二寡核苷酸，其中所述第二寡核苷酸之一与一种第一标记相联，而另一种第二寡核苷酸与一种第二标记相联，如此当上述两种第二寡核苷酸与上述第一寡核苷酸杂交时，这两种标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。

本发明还提供了一种如上述(a)至(c)所定义的探针在本发明的一种方法中的使用。

本发明还提供了一种探针在如本文所公开的一种方法中的使用，所述探针包含：

一种包含一个与一种目标核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的、由15至150个核苷酸构成的第一寡核苷酸，和

至少一种由4至150个核苷酸构成的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中每种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，

并且其中

(a)所述第一标记与所述第一寡核苷酸的第二区域相联，并且所述第二标记与所述第二寡核苷酸上与所述第一寡核苷酸的第二区域互补的区域相联，如此当所述探针的内部双链体形成时，所述第一和第二标记被拉拢至位置紧邻，或者

(b)所述探针的第一和第二寡核苷酸通过包含核苷酸或一种非核苷酸的化学部分的一种连接部分相连，从而允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成一种茎-环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸分别被标记，如此当所述探针形成一种内部茎-环结构时，上述标记被拉至紧邻位置并且一种标记影响来自另一种标记的信号。

本发明的另一方面指向一种对一份样品进行目标核酸上的一个或多个变异核苷酸的检测的方法，所述方法包括：

(a)令一份包含目标核酸的样品与一种扩增反应混合物接触，所述混合物包含：

(i)一对或多对正向/反向寡核苷酸引物，其中当所述样品中存在一种或多种目标核酸时，所述引物对能扩增所述目标核酸，

(ii)至少一个探针对，其中所述探针对中的第一探针包含与野生型目标核酸序列(正常序列)互补的序列，所述探针对中的第二探针包含与包含变异核苷酸(例如SNP、突变的核苷酸等)的目标核酸序列互补的序列，其中所述探针对中的每种探针包含：

一种包含一个与一种目标核酸的部分充分互补的第一区域和一个第二区域的第一寡核苷酸，和

至少一种第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包含一个与所述第一寡核苷酸的所述第二区域充分互补的区域，

如此上述第一和第二寡核苷酸能够形成一个双链部分，

其中所述探针对中的每种探针包含相同的第二寡核苷酸，

其中每种探针包含能产生一种可变信号的一种可检测的标记或可检测的多种标记的组合，其中所述信号反映了该探针的第一和第二寡核苷酸组成的一个双链部分是否存在，并且

其中至少两种所述探针包含相同的可检测的标记或者其发射光谱不可区分的不同的可检测的标记，并且其中每种上述探针的第一和第二寡核苷酸所组成的双链部分有不同的熔解特性；

(b)在样品/扩增反应混合物中进行扩增反应

其中，当一种目标核酸存在时，探针的与该目标核酸的部分充分互补的第一寡核苷酸，在扩增反应过程中被消耗；并且

(c)通过检测来自任何未被消耗的探针上的标记的、作为温度的一个函数的信号，测量这些探针的第一和第二寡核苷酸之间形成的任何双链部分的熔解图谱至少一次，

其中所述熔解图谱提供了至少一种目标核酸是否在所述样品/扩增反应混合物中得到扩增的一个指征。

所述探针对中的相同的第二寡核苷酸可以包含对应于目标核酸序列中的变异核苷酸的通用碱基或次黄苷。上述通用碱基可以是3-硝基吡咯2’-脱氧核苷，5-硝基吲哚，嘧啶类似物或嘌呤类似物。次黄苷天然地出现于某些转运RNA反密码子的摇摆位置，并且已知其在翻译过程中与A、C和U形成碱基对(图17)。

要扫描一段目标序列中的多个突变或SNP，则可以在一个反应中包括与相同的扩增产物上不同位点杂交的不同探针的多种第一寡核苷酸。所述探针可以包括一个竞争性的探针对，该探针对中的第一探针与野生型(正常核苷酸)序列杂交；该探针对中的第二探针与包含变异(突变的)核苷酸的目标序列杂交。当野生型的目标序列存在时，与该野生型目标序列互补的探针被消耗。当含有变异核苷酸的目标序列存在时，与该变异的目标序列互补的探针被消耗。上述多种第一寡核苷酸可以相互邻接地，或者在比邻的第一寡核苷酸之间具有一些重叠区域地与目标核酸序列的相同链杂交(图17)。

发明的另外一个方面是一个引物和探针的组合，此组合是用于在一个扩增反应里监控，检测或定量一系列核酸底物。扩增反应是基于引物或探针杂交于引物扩增产物的熔解特征(图14)。

引物和探针的组合可含有第一引物，第二引物和第一探针(图14A)。

这里的第二引物含有，从3‘到5’方向，一个3‘靶特异的启动区，此启动区相对互补于一个靶核酸序列，一个探针互补区，此探针互补区含有一个能与第一探针互补的顺序，和一个5’共有区，此共有区含有一个与第一引物相同或相对相同的顺序。

这里可与第二引物杂交的第一探针含有一个第一标记，第一引物含有一个第二标记，使得第一标记和第二标记，当他们距离很近时，能相互作用。

这里第一引物可在一个模板上延伸，此模板与第二引物的延伸链互补。

这里，当第一探针杂交到第一引物的延伸产物后，两个标记被拉近距离，并产生可检测信号。

在一种情况下的引物和探针的组合，第一引物是共有引物，第一探针是共有探针，第二引物包含一个引物组，此引物组里的每个引物都有一个相同标记。在第二个引物组里，3‘靶特异启动区可与每个靶顺序杂交，第一探针与第二引物杂交或与第一引物的延伸链杂交，杂交的Tm或熔解谱对每一个靶顺序特异。此第一探针相对于每个靶的不同的Tm或熔解谱是可分辨的，使得Tm或熔解谱可提供靶是否存在的信息(图14B)。

在另外一种情况下，第二引物的探针互补区和3‘靶特异启动区不互相重叠，这里的探针互补区含有的顺序可能与靶顺序无关。

还有一种情况，第二引物的探针互补区与3‘靶特异区重叠，或者是第二引物的探针互补区包含在3’靶特异启动区里面(图14A)，第二引物杂交在靶顺序的Tm比第二引物杂交在第一探针上要高，这样当靶顺序存在时，第二引物可与靶形成较强的杂交产物。

标记之一可以是猝灭剂或荧光素，第一探针与第一引物的延伸链杂交，可把两个标记拉近距离，产生紧密的猝灭或FRET效果。

发明的另外一个方面是用于在一个扩增反应里监控，检测或定量一系列核酸底物的方法。

检测或定量靶核酸的方法包括：(a)在扩增反应条件下，用引物和探针组合处理核酸样品，第二引物与靶核酸杂交并延伸，第二引物的延伸链从模板分离，并参与下一轮杂交，延伸，

这里，第二引物的浓度比第一引物的浓度低，当第二引物被逐渐消耗，第一引物参加到扩增反应中；(b)从第一探针杂交到每个循环的第一引物的延伸产物中检测信号产生；(c)检测第一探针与第一引物延伸产物的杂交双链的熔解谱，这里的熔解谱是通过激发反应混合物并监视作为温度函数的荧光，一个特征性的Tm或熔解谱表示存在靶顺序。

优选地，扩增反应是不对称扩增，第一引物的延伸单链在扩增中逐渐积累，不对称扩增可以通过正向引物的不等比例实现。

发明的另外一个方面是用于在一个扩增反应里监控，检测或定量一系列核酸底物的试剂盒，检测或定量靶核酸的试剂盒包括，引物和探针的组合，或一组引物和探针的组合，引物和探针的组合可含有第一引物，第二引物和第一探针。

这里的第二引物含有，从3‘到5’方向，一个3‘靶特异的启动区，此启动区相对互补于一个靶核酸序列，一个探针互补区，此探针互补区含有一个能与第一探针互补的顺序，和一个5’共有区，此共有区含有一个与第一引物相同或相对相同的顺序。

这里可与第二引物杂交的第一探针含有一个第一标记，第一引物含有一个第二标记，使得第一标记和第二标记，当他们距离很近时，能相互作用。

这里第一引物可在一个模板上延伸，此模板与第二引物的延伸链互补。

这里，当第一探针杂交到第一引物的延伸产物后，两个标记被拉近距离，并产生可检测信号。

能与第一引物延伸链杂交的第一探针可含有靶特异顺序或随机顺序，并可有任意长度。

一般来说，第一探针长度是4到60核苷酸，优选地，5到25核苷酸。

第二引物的探针互补区含有顺序能与第一探针杂交，设计使得探针互补区与第一探针的杂交双链有相对于每个靶顺序的独特的Tm或熔解谱。

第二引物的5‘共有区，含有一个顺序相同或类似于第一引物的3’启动区，或第一引物的全部顺序。设计使得第一引物能与第二引物复制产物的模板杂交并启动延伸。

一种情况下，第一引物是靶特异引物，含有能与靶互补的3‘启动区。这里，反应中第一探针含有顺序能与第一引物的延伸链杂交并与第一引物比邻。

在一个优选的情况下，第一引物是共有引物，第一探针是共有探针，第二引物包含一个引物组，此引物组的每个第二引物的3‘靶特异启动区能与每个靶顺序特异杂交，并启动扩增。这里的每个第二引物的探针互补区能与第一探针杂交，并具有独特性。

对与SNP分型或检测突变的核苷酸，第二引物可以是型特异引物。第二引物的末端核苷酸被选择与怀疑的突变核苷酸互补或与正常核苷酸互补。这样，当第二引物杂交在诊断区含有怀疑的核苷酸，第二引物的延伸产物被合成，反之，不被合成。基因型特异的第二引物可由于探针互补区而不同，这样使得熔解谱在不同基因型中能区分。

另外，第一引物和第一探针可以用一个连接基团连接。连接的引物/探针有以下排列顺序，从5‘到3’端，第一探针-连接基团-第一引物，这里的第一探针可称为第一引物的5‘尾区。连接基团可以是自然核苷酸或任何化学基团。连接基团可以含有封闭基团。如果封闭基团存在，第一探针的复制被阻遏。封闭基团可以是碳氢链，HEG非核苷酸链接，无碱基糖，核苷酸衍生物或染料。

在某些情况下，用在反应中的第二引物组可以是巢式引物。用于扩增的巢式引物是具有互补于靶序列的寡核苷酸。

第一引物可含有第一标记。当第一探针杂交在第一引物的延伸部分，第一探针的杂交/熔解产生可检测的信号或特异的熔解谱。优选地，第一引物的3‘启动区可含有第二标记，第一标记和第二标记是可相互作用的标记对。当第一探针杂交到第一引物的延伸部分，杂交使得两个标记拉近距离，从而第一探针的熔解谱显示靶顺序是否存在。

当标记的引物/探针与第一引物的延伸产物杂交，两个标记产生FRET或紧密猝灭关系。引物或探针上的标记可以处于任何位置，只要他们能产生相互作用。

用于检测一个样品中的靶核酸的方法含有：

(a)提供模板核酸，此模板核酸是从靶核酸衍生而来，第一引物可与模板核酸杂交；

(b)用第一引物或多从第一引物处理模板核酸，每个第一引物，在杂交条件下，与其相应的靶核酸杂交，每个第一引物含有3‘启动区与模板核酸的第一区互补，并且5’尾区能与第一引物的延伸部分杂交。

另外，用第一引物或多重第一引物和第一探针处理模板核酸，在杂交条件下，每一个第一引物与模板核酸杂交，每一个第一引物含有一个3‘启动区，此启动区与模板核酸的第一区互补，第一探针能与第一引物的延伸部分杂交。

(c)保持步骤(a)中的混合物在延伸条件中，延伸条件含有相应的核苷三磷酸和DNA聚合酶，在此条件下，延伸退火的第一引物并合成延伸产物。

(d)把延伸产物从模板中分离。

(e)保持步骤(c)中的反应物与相应的条件下，此条件包括缓冲液，相应的温度或一系列温度，这里第一探针或第一引物的5‘尾区杂交于第一引物的延伸部分。第一探针的杂交或解链产生可检测的信号或特有的熔解谱。

此方法可进一步含有重复步骤(a)和(e)在一个扩增反应中。任何扩增系统可被用于含有这些步骤，像PCR，SDA，LAMP，3SR。PCR是优选的含有这些步骤的扩增方法。

在以上描述的方法中，提供的样品怀疑含有靶核酸或感兴趣的突变核苷酸。样品中的靶核酸可含有双链gDNA或cDNA.DNA可以用任何方法变性，包括已知的物理的，化学的或酶处理。优选的物理处理方法是加热到99％以上的DNA变性。典型的热处理温度是80℃到105℃，时间可以是几秒或几分钟。另外，如果靶核酸本来就处于单链状态，如单链的RNA或DNA病毒，就不用变性步骤。

在杂交条件下，变形的核酸链与寡核苷酸引物混合，此条件使引物与单链的核酸结合。在一种情况下，提供的模板核酸是变性的靶核酸，并能与第一引物杂交。第一引物是靶核酸特异引物，在引物组中的每一个引物都含有一个3‘启动区，能杂交每个靶序列，并启动延伸。例如，每个第一引物含有的5’尾区与第一引物的延伸部分杂交。另外一个例子，第一引物不含有5‘尾区，但是反应含有第一探针，此探针能与第一引物的延伸部分杂交并与第一引物临近。

退火的第一引物在聚合酶的作用下延伸。模板依赖性的引物延伸由聚合酶催化，并有足够量的脱氧核苷三磷酸(dATP，dGTP，dCTP，和dTTP)或类似物，在反应介质中含有相应的盐，金属阳离子和pH缓冲系统。合适的聚合剂是已知能催化模板核酸依赖DNA合成的酶。能催化DNA合成的反应条件已经知道。

从模板上把延伸的产物分开可用加热的方法，例如，延伸的产物能在95℃下分离。或者，延伸的产物也可以以链替换的方式分离。

当第一引物的产物从模板分离以后，反应混合物保持在一定的反应条件，此反应条件包括缓冲液和相应的温度或一系列温度。这里第一探针或第一引物的5‘尾区与第一引物的延伸部分杂交或解链。此过程产生可检测信号或特有的熔解谱。

测定扩增产物或探针的双链结构的Tm或监测熔解曲线已广泛应用。此发明中，检测多重靶核酸可以通过标记对和第一探针杂交在第一引物的延伸部分的杂交/解链谱分析来实现。

在另外一种情况下，第一引物是共有引物。第一探针是共有探针。多个靶核酸能通过共有探针杂交在靶核酸上的熔解谱分析来检测，并在一个检测通道内进行。

这里，提供模板核酸的步骤(a)包括：i)用第二引物处理样品核酸，此第二引物引物是靶特异的引物组。在杂交条件下，每个第二引物与靶核酸退火。第二引物由以下成分构成，此3‘到5’方向，一个与靶核酸相当互补的靶特异部分，一个尾部探针互补部分，此部分能与第一探针或第一引物的尾顺序杂交，和一个相同或相似与第一引物的3‘启动区的5‘共有部分；ii)保持以上反应液在延伸条件中，此延伸条件包括相应的核苷三磷酸和核酸聚合酶用来延伸退火的第二引物从而合成延伸产物；iii)把延伸产物从模板上分离；iv)退火另外一个扩增引物(第三引物)或第三引物组在以上单链的扩增产物，并延伸退火的第三引物；和v)把双链延伸产物变性成单链形式，包括模板核酸，从而单链的模板核酸能与第一引物杂交(图15)。

此第三引物可以是扩增产物之一。选择扩增产物是基于他们在双链顺序的相当位置，使得一个扩增引物的延伸产物，当从模板上分离以后(互补链)，能做为另外一个引物延伸的模板。

存在于一个反应中的共有第一引物浓度至少3倍于第二引物的浓度。优选地，存在于一个反应中的共有第一引物浓度至少6倍于第二引物的浓度.

附图说明

图1图示本发明的一种核酸探针在扩增之前和扩增之后的熔解图谱，该探针在此扩增中被消耗。

图2图示本发明的核酸探针(探针1和2)的一种混合物在扩增之前和扩增之后的熔解图谱，所述探针中的一种或全部两种在此扩增中被消耗。

图3图示在不同温度对一种扩增子合成情况的一次实时测量。

图4显示可用于本发明中的不同探针的例子。

图5显示本发明的一种方法的一个例子，其中探针的第一寡核苷酸与一种目标核酸序列杂交。

图6显示本发明的一种方法的一个例子，其中探针的第一寡核苷酸被掺入至扩增产物中。

图7显示本发明的一种方法的一个例子，其中探针的第一寡核苷酸在扩增过程中被延伸和降解。

图8显示本发明的一种方法的一个例子，其中探针的第一寡核苷酸在扩增过程中被降解。

图9A图示本发明的探针1和2在扩增之前的一个熔解图谱。图9B显示不同比例的探针1和2的一种混合物的一个熔解图谱。

图10图示本探针1和2的混合物在扩增之前的4次反应中的一个熔解图谱。

图11图示在所述实施例中在不同温度对扩增子合成情况的一次实时测量。

图12图示本探针1和2的一种混合物在扩增之后的4次反应中的一个熔解图谱。

图13显示一扩增图，其中第一探针(K10)的荧光发射量标示为FE1。计算出的FE1×P图标示为FE1xP。第二探针(SV40)的荧光发射量的扩增图显示为FE2-(FE1 x P)。

图14图示引物和探针的组合(A)和一组引物和探针的组合(B)。

图15图示检测和定量3个靶核酸的方法，此方法用一组引物和探针的组合。

图16图示一个改进的引物和探针的组合，引物和探针被疑个连接基团相连。

图17一组以Fam标记的包含与野生型序列互补的序列的探针，该探针组具有不同的T_m；另一组以Hex标记的包含与相同目标核酸序列的变异序列互补的序列的探针。

图18显示利用图14中所描述的探针组的一种方法。

图19显示三重扩增的一个例子的结果。具有不同T_m的三种探针被Fam染料标记。(A)显示在一未加入目标DNA的管中产生的一个熔解图谱。下列图显示在一未加入目标DNA的管中产生的熔解图谱与在一加入了目标DNA的管中产生的熔解图谱之间的比较。(B)在一所含样品中有目标2存在的管中产生的熔解图谱。(C)在一所含样品中有目标3存在的管中产生的熔解图谱。(D)在一所含样品中有目标2和3存在的管中产生的熔解图谱。(E)在一所含样品中有目标1存在的管中产生的熔解图谱。(F)在一所含样品中有目标1和2存在的管中产生的熔解图谱。(G)在一所含样品中有目标1和3存在的管中产生的熔解图谱。(H)在一所含样品中有目标1、2和3存在的管中产生的熔解图谱。

图20(A)显示熔解温度和信号收集参数设定。(B)为探针1、探针2以及探针1和2的混合物的熔解图谱。(C)为显示如何估计一种探针的双链形式所占百分比的解链曲线的多元视图。

图21为实际消耗量和标准曲线的扩增图的图示(实施例4)。

图22显示四重扩增一个实验例的结果：在反应中所存在的目标核酸使用了多种组合，反应A没有模板；反应B含有靶3模板；反应C含有靶2模板；反应D含有靶4模板；反应E含有靶1和靶3模板；反应F含有靶1，3和4模板。

具体实施方式

在下列的实施例中对本发明作了进一步的阐述，除非另有说明，其中提及的部分和百分比为以重量计，提及的温度单位为摄氏度。应当了解的是，虽然这些实施例代表了本发明的优选的实施方案，但其仅作为示例提供。本领域的技术人员能够从以上的论述和这些实施例中明白本发明的本质特征，并且在不偏离其主旨和范围的前提下，能够对本发明作出各种改变和改进，以令其适应不同的用途和条件。因此，基于以上的描述，除本文中已显示和描述的之外的对本发明的各种改进，对本领域的技术人员将是显而易见的。这样的改进同样属于所附权利要求的范围。

本文述及的每一参考文献的公开内容均全文引入本文以供参考。

实施例1

下述实验中所用的所有引物均由EUROGENTEC合成。

扩增引物和探针如下：

K10R266Fam    GttcaATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA(SEQ ID NO：1)；

K10R266Dab    GCGCGGTGAAACCCAATTGAAC(SEQ ID NO：2)；

SV40R1F3FAM   ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC(SEQ ID NO：3)；

SV40R1F3Dab   CAAATGTGGTATGGCTGAT(SEQ ID NO：4)；

K10F155       CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG(SEQ ID NO：5)；

SV40RealR     CCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAAC(SEQ ID NO：6)

引物/探针K10R266Fam(第一寡核苷酸)在其5’端被FAM标记。K10R266Dab(第二寡核苷酸)在其3’端包含DABCYL。K10R266Fam和K10R266Dab能够形成双链部分，如下：

Fam-5′GTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA3′(SEQ ID NO：1)

DABCYL-3′CAAGTTAACCCAAAGTGGCGCG5′(SEQ ID NO：2)

以上这种杂交体称为探针K10R266。引物/探针SV40R1F3FAM(第一寡核苷酸)在其5’端被FAM标记。SV40R1F3Dab(第二寡核苷酸)在其3’端包含DABCYL。SV40R1F3FAM和SV40R1F3Dab能够形成双链部分，如下：

Fam-5′ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC3′(SEQ ID NO：3)

DABCYL-3′TAGTCGGTATGGTGTAAAC5′(SEQ ID NO：4)

这一杂交体称为探针SV40R1F3。

上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以多种比例组合，典型地以1∶3组合，形成一种部分双链的线性DNA探针。当目标核酸不存在时，上述第一和第二寡核苷酸杂交体的形成将淬灭剂和荧光基团拉近至紧邻位置，有效地令荧光信号淬灭。当目标核酸存在时，上述第一寡核苷酸优先与该目标序列杂交，并掺入至扩增子中。结果，淬灭剂与荧光基团分离，导致荧光发射的增强。

引物对K10R266Fam和K10F155在一种K10目标序列存在时扩增出一种110bp的产物。SV40R1F3FAM和SV40RealR在一种SV40目标序列存在时扩增出一种125bp的产物。

实施例2

熔解图谱实验的进行如下所述：探针的热稳定性于熔解图谱实验中得到检定，实验中荧光发射的测量于自40至90℃范围的温度进行。熔解温度T_m定义为所述第一和第二寡核苷酸双链体解链的特征性温度。

每一熔解图谱的测量在一包含PCR缓冲液(1xThermoPol反应缓冲液，New England BioLabs)的20μl体系的反应管中进行。热循环在一Mx3005p定量PCR系统(Stratagene)中进行，循环条件如下：于90℃变性3分钟，1个循环；自40至90℃范围的温度保持30秒，每一循环递升1℃，50个循环。上述50个循环的每一30秒保持温度过程中记录荧光测量结果。

通过在自90至40℃范围的温度监测荧光，测定探针K10R266(探针1)和探针SV40R1F3(探针2)的熔解图谱。K10R266具有一个72℃的T_m；SV40R1F3具有一个62℃的T_m(图9A)。

对探针K10R266和探针SV40R1F3的一系列混合物测定了熔解图谱：

样品1包含0.5μM的K10R266和0.5μM的SV40R1F3。

样品2包含0.5μM的K10R266和0.25μM的SV40R1F3。

样品3包含0.5μM的K10R266和0.125μM的SV40R1F3。

样品4包含0.5μM的K10R266和0.0625μM的SV40R1F3。

样品5包含0.5μM的K10R266和0.003125μM的SV40R1F3。

熔解图谱显示于图9B中。

采用实时PCR分析，以包含K10和SV40序列的质粒DNA作为模板，对探针K10R266和SV40R1F3的一个组合进行了检测。

配制了包含0.5μM的K10R266和0.5μM的SV40R1F3(第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的组合按1∶3的比例混合)以及标准的PCR成分(NEB)的反应预混液。扩增反应在Stratagene Mx3005p定量PCR系统中进行，循环条件如下：

1.扩增前，熔解图谱：自90至40℃范围的温度保持30秒，每一循环递降1℃，50个循环，此50个循环的每一30秒保持温度过程中记录荧光测量结果。

2.扩增：94℃20秒，63℃30秒，51℃30秒，72℃30秒，30个循环；在63℃、51℃和72℃的读数步骤记录荧光测量结果。

3.扩增后熔解图谱：自40至90℃范围的温度保持30秒，每一循环递升1℃，50个循环，此50个循环的每一30秒保持温度过程中记录荧光测量结果。

进行了四次反应：反应1包含K10模板；反应2包含SV40模板；反应3包含K10和SV40模板；反应4不包含模板。

四次反应的扩增前熔解图谱显示于图10中。

扩增过程中，于63℃收集的荧光发射显示于图11A中。

扩增过程中，于51℃收集的荧光发射显示于图11B中。

扩增过程中，于72℃收集的荧光发射显示于图11C中。

四次反应的扩增后熔解图谱显示于图12中。

上述扩增前和扩增后熔解图谱之间的比较表明：

在反应1中，K10R266探针被消耗，图谱显示SV40R1F3探针的特征。

在反应2中，SV40R1F3探针被消耗。

在反应3中，K10R266和SV40R1F3探针均被消耗。

在反应4中，没有探针被消耗，所述扩增前和扩增后图谱是类似的。

逐循环的荧光发射FE于三个测量温度获得：MT 72℃、63℃和51℃。

在一个测量温度63℃获得一个第一荧光发射FE1，在此温度不多于10％的第二探针(SV40R1F3)处于双链体形式(该探针的内部双链形式)；在一个测量温度51℃获得第二荧光发射FE2，在此温度多于95％的两种探针处于双链体形式，并且可供选择地，在一个测量温度72℃获得一个荧光发射FE0，在此温度不多于10％的第一探针(K10R266)处于双链体形式。

在上述扩增反应中，有两种针对目标序列K10和SV40的探针。在72℃，10％的K10R266探针处于双链形式，0％的SV40R1F3探针处于双链形式。在63℃，90％的K10R266探针处于双链形式，5％的SV40R1F3探针处于双链形式。在51℃，多于98％的所有探针处于双链形式。

第一荧光发射收集于63℃，是为FE1；第二荧光发射收集于51℃，是为FE2。

FE1＝90％*ACA1+5％*ACA2

FE2＝98％*ACA1+98％*ACA2

假定5％*ACA2可忽略不计，ACA1＝FE1/90％；ACA2＝FE2/98％-FE1/90％。ACA1为探针1的实际消耗量；ACA2为探针2的实际消耗量。

所述第一探针(K10)实际消耗量的扩增图显示为ACA1。所述第二探针(SV40R1F3)实际消耗量的扩增图显示为ACA2(图13)。

上述实际消耗量的计算可以人工进行。所述计算也可以通过一种计算机程序或软件进行。为令扩增更加快捷，设计软件用于处理来自多重实时PCR的荧光发射数据和进行适当的计算。所述软件还具有其他功能，例如Ct的人工选择和空白的扣除。

上述软件作为Microsoft Excel的一个插件以Visual Basic for applications(VBA)执行。源代码以两个主要模块进行组织。一个模块包括所有的“实用”功能，例如数学功能，从荧光发射数据中产生显示于Excel工作表的阵列的功能，打印结果的数据和标注的功能，处理误差或模板的功能以及产生一种特定类型的图表的功能。第二个模块包括控制该程序流程的功能。该模块包括实现与用户之间的互动所需的所有功能，例如菜单选择、工具条分割、插入/剔除标准曲线中的数据。

实施例3

扩增引物和探针如下：

对目标序列1(K10)

K10R266Fam  GttcaATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA(SEQ ID NO：1)；

K10R266Dab  GCGCGGTGAAACCCAATTGAAC(SEQ ID NO：2)；

K10F155     CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG(SEQ ID NO：5)；

对目标序列2(SV40)

SV40R1F3FAM ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC(SEQ ID NO：3)；

SV40R1F3Dab CAAATGTGGTATGGCTGAT(SEQ ID NO：4)；

SV40RealR   CCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAAC(SEQ ID NO：6)；

对目标序列3(Jak2)

JKR3Fam    AACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA(SEQ ID NO：11)；

JKR3FDabF  CTCAGAGCATCTGTT(SEQ ID NO：12)；

JKF2       GCATCTTTATTATGGCAGAGAGAA(SEQ ID NO：13).

寡核苷酸K10R266Fam是一种扩增引物，同时，寡核苷酸K10R266Fam还是探针1的第一寡核苷酸。K10R266Fam(第一寡核苷酸)在其5’端被FAM标记。K10R266Dab(第二寡核苷酸)在其3’端包含DABCYL。K10R266Fam和K10R266Dab能够形成双链部分。K10R266Fam和K10R266Dab形成的杂交体称为探针1。

寡核苷酸SV40R1F3FAM是一种扩增引物，同时，寡核苷酸SV40R1F3FAM还是探针2的第一寡核苷酸。SV40R1F3FAM(第一寡核苷酸)在其5’端被FAM标记。SV40R1F3Dab(第二寡核苷酸)在其3’端包含DABCYL。SV40R1F3FAM和SV40R1F3Dab能够形成双链部分。SV40R1F3FAM和SV40R1F3Dab形成的杂交体称为探针2。

寡核苷酸JKR3Fam是一种扩增引物，同时，寡核苷酸JKR3Fam还是探针3的第一寡核苷酸。JKR3Fam(第一寡核苷酸)在其5’端被FAM标记。JKR3FDabF(第二寡核苷酸)在其3’端包含DABCYL。JKR3Fam和JKR3FDabF能够形成双链部分。JKR3Fam和JKR3FDabF形成的杂交体称为探针3。

上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以多种比例组合，典型地以1∶2至1∶4组合，形成一种部分双链的线性DNA探针。当目标核酸不存在时，上述第一和第二寡核苷酸杂交体的形成将淬灭剂和荧光基团拉近至紧邻位置，有效地令荧光信号淬灭。当目标核酸存在时，上述第一寡核苷酸优先与该目标序列杂交，并掺入至扩增子中。结果，淬灭剂与荧光基团分离，导致荧光发射的增强。

引物对K10R266Fam和K10F155在一种K10目标序列存在时扩增出一种110bp的产物。SV40R1F3FAM和SV40RealR在一种SV40目标序列存在时扩增出一种125bp的产物。引物对JKR3Fam和JKF2在Jak2目标序列存在时扩增出一种222bp的产物。

对探针1、探针2、探针3以及探针1、2和3的混合物的熔解图谱分析利用Stratagene Mx3005实时PCR仪器进行(图19)。采用的热参数基于解链曲线分析软件的参数：70℃加热30秒，冷却至40℃后保持30秒，然后缓慢升温至94℃，温度上升期间持续收集荧光发射数据。以上述荧光发射读数相对于温度的一阶负导数对温度作图，得到曲线，所述曲线的每个峰对应于该探针的实际T_m。

单重、双重和三重扩增采用相同的反应预混液进行，只是分别存在有一种目标核酸、两种目标核酸或全部三种目标核酸。

配制了包含上述三种探针的每种第一寡核苷酸各0.1μM，上述三种探针的每种第二寡核苷酸各0.4μM，每种目标核酸的引物(并非探针的第一寡核苷酸)各0.2μM，以及标准的PCR成分(NEB)的反应预混液。扩增反应在Stratagene Mx3005p定量PCR系统中进行，循环条件如下：

1.扩增：94℃15秒，63℃20秒，50℃20秒，55℃20秒，63℃20s秒，68℃20s秒，72℃20s，40个循环；在50℃、55℃、63℃、68℃、和72℃的读数步骤记录荧光测量结果。

2.扩增后熔解图谱：在最后一个循环的72℃20秒之后，冷却至40℃并保持30秒，然后缓慢升温至78℃，温度上升期间持续收集荧光发射数据。

进行了八次反应：反应(A)不包含模板；反应(B)包含模板目标核酸2；反应(C)包含模板目标核酸3；反应(D)包含目标核酸2和3；反应(E)包含目标核酸1；反应(F)包含目标核酸1和2；反应(G)包含目标核酸1和3；反应(H)包含目标核酸1、2和3。八次反应的扩增后熔解图谱显示于图19中。

目标核酸存在时和不存在时的扩增后熔解图谱之间的比较表明(图19)：

在反应A中，没有探针被消耗，熔解图谱显示全部三种探针的混合物的特征。

在反应B中，探针2被消耗。

在反应C中，探针3被消耗。

在反应D中，探针2和3被消耗。

在反应E中，探针1被消耗。

在反应F中，探针1和2被消耗。

在反应G中，探针1和3被消耗。

在反应H中，探针1、2和3被消耗。

逐循环的荧光发射FE于五个测量温度获得：MT 50℃、55℃、63℃、68℃和72℃。每种探针的实际消耗量可以通过以下公式计算：FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％。

实施例4

针对目标核酸1(K10)的扩增引物：

K10F155    CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG(SEQ ID NO：5)；

K10R14     CCTGAGGGTTAAATCTTCCCCATTGA(SEQ ID NO：21)

针对目标核酸1的探针(称为探针1)包括：第一寡核苷酸

K10R266Famph  GTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA(SEQ ID NO：7)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

K10R266Dab    GCGCGGTGAAACCCAATTGAAC(SEQ ID NO：2)，其3’端与DABCYL相联。

针对目标核酸2(SV40)的扩增引物：

dsredendF2    GTAAGATCCACCGGATCTAGATAAC(SEQ ID NO：8)；

sv40testR     GGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAG(SEQ ID NO：9).

针对目标核酸2的探针(称为探针2)包括：第一寡核苷酸

SV40R1F3FAPh ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC(SEQ ID NO：10)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

SV40R1F3Dab  CAAATGTGGTATGGCTGAT(SEQ ID NO：4)，其3’端与DABCYL相联。

上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以多种比例组合，典型地以1∶2至1∶4组合，形成一种部分双链的线性DNA探针。当目标核酸不存在时，上述第一和第二寡核苷酸杂交体的形成将淬灭剂和荧光基团拉近至紧邻位置，有效地令荧光信号淬灭。当目标核酸存在时，上述第一寡核苷酸优先与该目标序列杂交。结果，淬灭剂与荧光基团分离，导致荧光发射的增强。

探针1和2中的第一寡核苷酸经过修饰以包含封闭的3’末端，以令其不能被延伸。但是，当上述第一寡核苷酸与上述目标序列结合时，它能被一种聚合酶的5’核酸酶活性降解。上述探针(被消耗的探针)的第一寡核苷酸的降解，导致可供与探针的第二寡核苷酸结合的第一寡核苷酸的数量减少，从而可于适当的温度测量到荧光信号的增强。

对探针1、探针2以及探针1和2混合物的熔解图谱分析利用Stratagene Mx3005实时PCR仪器进行(图20)。采用的热参数基于解链曲线分析软件的参数(图20A)：72℃加热30秒，冷却至40℃后保持30秒，然后缓慢升温至94℃，温度上升期间持续收集荧光发射数据。以上述荧光发射读数相对于温度的一阶负导数对温度作图，得到曲线，所述曲线的每个峰对应于该探针的实际T_m。探针1在67℃的一个峰为其T_m；探针2在59℃的一个峰为其T_m(图20B)。

对每种探针的双链形式和单链形式所占的百分比的估计列于下表中。实际的计算也可以通过计算机软件进行。

上述估计(计算)可基于解链曲线(荧光R对温度，图20C)的多元视图进行。假定基线代表100％为双链，其R为9000。在一个温度(100％为单链)的R为24500。在62℃，R为13000。62℃与基线之间荧光值的差值dR＝13000-9000＝4000。在62℃，双链形式的探针所占百分比按4000/(24500-9000)估算为25.8％。

多重实时PCR和标准曲线分析

引物-探针预混液的配制如下：将引物和探针混合至探针的终浓度为0.4μM并且引物的终浓度为0.6μM，得到一种2X的引物-探针预混液。

通过将等量的2X引物-探针预混液和2X TaqMan

Gene Expression Master Mix(Applied Biosystem，cat.No 4369514)混合，得到反应混合液。

对包含目标核酸1、目标核酸2以及目标核酸1和2的混合物的模板DNA进行梯度稀释如下：1，0.1，0.01，0.001，0.0001，0.00001，0.000001。

单重PCR使用包含目标核酸1(k10)或目标核酸2(SV40)的DNA样品进行。双重PCR使用包含目标核酸1(k10)和目标核酸2(SV40)的混合物的DNA样品进行。

热参数为：95℃8分30秒；94℃10秒，66℃20秒，63℃20秒，54℃30秒，52℃20秒，61℃20秒，62℃20秒，68℃20秒，40个循环；在66℃、63℃、54℃、52℃、61℃、62℃和68℃的读数步骤记录荧光测量结果。

选择62℃的荧光发射(dR)作为FE1；选择52℃的荧光发射(dR)作为FE2。根据上文所列的表和本发明的论述和权利要求中的用于计算实际消耗量(ACA)的公式，我们得出：

在62℃，FE1＝0.75*(ACA1)+0.05*ACA2    (1)

在52℃，FE2＝100％*ACA1+100％*ACA2    (2)

根据(1)和(2)，

ACA1＝(FE1-0.05*FE2)/0.7

ACA2＝(0.75*FE2-FE1)/0.7

对于两种目标核酸均存在的双重反应，获得上述FE1和FE2如下：

FE1：

FE2：

计算出的目标核酸1的ACA列于下表中：

ACA1＝(FE1-0.05*FE2)/0.7

ACA1的扩增图显示于图21A中。标准曲线显示于图21B中。

计算出的目标核酸2的ACA列于下表中：

ACA2＝(0.75*FE2-FE1)/0.7

ACA2的扩增图显示于图21C中。标准曲线显示于图21D中。

若反应中仅有目标核酸1存在，此种情况时ACA1的扩增图显示于图18E中，ACA2的扩增图显示于图21G中。结果显示，由于仅有目标核酸1存在于反应中，其ACA1显示正常的扩增曲线和正常的标准曲线(图21F)，而其ACA2显示背景曲线，此背景表明没有目标核酸2的信号。

若反应中仅有目标核酸2存在，此种情况时ACA1的扩增图显示于图21H中，ACA2的扩增图显示于图21I中。结果显示，由于仅有目标核酸2存在于反应中，其ACA2显示正常的扩增曲线和正常的标准曲线(图21J)，而其ACA1显示背景曲线，此背景表明没有目标核酸1的信号。

实施例5

针对目标核酸1(K10)的扩增引物：

K10F155    CTCTGCTGACTTCAAAACGAGAAGAG(SEQ ID NO：5)；

K10R14     CCTGAGGGTTAAATCTTCCCCATTGA(SEQ ID NO：21)

针对目标核酸1的探针(称为探针1)包括：第一寡核苷酸

K10R266Famph GTTCAATTGGGTTTCACCGCGCTTAGTTACA(SEQ ID NO：7)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

K10R266Dab  GCGCGGTGAAACCCAATTGAAC(SEQ ID NO：2)，其3’端与DABCYL相联。

针对目标核酸2(SV40)的扩增引物：

dsredendF2  GTAAGATCCACCGGATCTAGATAAC(SEQ ID NO：8)；

sv40testR   GGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAG(SEQ ID NO：9).

针对目标核酸2的探针(称为探针2)包括：第一寡核苷酸

SV40R1F3FAPh  ATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTAC(SEQ ID NO：10)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

SV40R1F3Dab  CAAATGTGGTATGGCTGAT(SEQ ID NO：4)，其3’端与DABCYL相联。

针对目标核酸3(Jak2)的扩增引物：

JknewF8    GTGGAGACGAGAGTAAGTAAAACTACA(SEQ ID NO：14)；

JKnewR8    CTCCTGTTAAATTATAGTTTACACTGACA(SEQ ID NO：15)；

针对目标核酸3的探针(称为探针3)包括：第一寡核苷酸

JKR3FamPh    AACAGATGCTCTGAGAAAGGCATTAGA(SEQ ID NO：16)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

JKR3FDabF    CTCAGAGCATCTGTT(SEQ ID NO：12)，其3’端与DABCYL相联。

针对目标核酸4(Kras)的扩增引物：

KR12GVF1B   GTCACATTTTCATTATTTTTATTATAAGGCCTGC(SEQ ID NO：17)；

KR12GVR12As GATCATATTCGTCCACAAAATGATTC(SEQ ID NO：18).

针对目标核酸4的探针(称为探针4)包括：第一寡核苷酸

KR12GVFamPh    GAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGT

(SEQ IDNO：19)，

其5’端与Fam相联；3’端与与一种磷酸基相联，而不是3’-OH；和第二寡核苷酸

KR12GVFamDab  CACAAGTTTATATTC(SEQ ID NO：20)，其3’端与DABCYL相联。

上述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以多种比例组合，典型地以1∶2至1∶4组合，形成一种部分双链的线性DNA探针。当目标核酸不存在时，上述第一和第二寡核苷酸杂交体的形成将淬灭剂和荧光基团拉近至紧邻位置，有效地令荧光信号淬灭。当目标核酸存在时，上述第一寡核苷酸优先与该目标序列杂交。结果，淬灭剂与荧光基团分离，导致荧光发射的增强。

所有各种探针中的第一寡核苷酸经过修饰以包含封闭的3’末端，以令其不能被延伸。但是，当上述第一寡核苷酸与上述目标序列结合时，它能被一种聚合酶的5’核酸酶活性降解。上述探针(被消耗的探针)的第一寡核苷酸的降解，导致可供与探针的第二寡核苷酸结合的第一寡核苷酸的数量减少，从而可于适当的温度测量到荧光信号的增强。

多重实时PCR和标准曲线分析

引物-探针预混液的配制如下：将引物和探针混合至探针的终浓度为0.4μM并且引物的终浓度为0.6μM，得到一种2X的引物-探针预混液。

通过将等量的2X引物-探针预混液和2X TaqMan

Gene Expression Master Mix(Applied Biosystem，cat.No 4369514)混合，得到反应混合液。

热参数为：95℃8分30秒；94℃10秒，66℃20秒，63℃20秒，54℃30秒，49℃20秒，55℃20秒，61℃20秒，68℃20秒，40个循环；在66℃、63℃、54℃、49℃、55℃、61℃和68℃的读数步骤记录荧光测量结果。在反应中所存在的目标核酸使用了多种组合，图22显示一些结果：反应A没有模板；反应B含有靶3模板；反应C含有靶2模板；反应D含有靶4模板；反应E含有靶1和靶3模板；反应F含有靶1，3和4模板。

序列表之非关键词文字(SEQUENCE LISTING FREE TEXT)

SEQ ID Nos：1，2，5，7和21    <223>源自K10的PCR引物

SEQ ID Nos：3，4，6和8-10     <223>源自SV40的PCR引物

SEQ ID Nos：11-16             <223>源自Jak2的PCR引物

SEQ ID Nos：17-20             <223>源自Kras的PCR引物

Claims (37)

1.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括：

(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包括：

(i)一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸，

(ii)两个或更多个探针，其中每个探针包括

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的

所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且

其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；

(b)在扩增条件下，在所述样品/反应混合物上进行扩增反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸与所述靶核酸杂交，因此被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及

(c)通过检测来自在未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，

其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征，

其中所述探针的所述至少两个中的第一探针具有依据所述第一探针的双链部分的熔解温度T_m1，

其中所述探针的所述至少两个中的第二探针具有依据所述第二探针的双链部分的熔解温度T_m2，

其中T_m1＞T_m2，

其中所述相同的标记物被独立地附接到所述第一和第二探针，

其中在T_m1和/或T_m2的任一熔解峰的降低提供所述一个或多个第一和/或第二探针的消耗的指征。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述熔解图谱是在反应/扩增发生前测量(扩增前熔解图谱)，和/或是在反应/扩增完成后测量(扩增后熔解图谱)，和/或是在每个循环或者选择的循环的反应/扩增期间测量(扩增中熔解图谱)，

其中所述方法额外地包括步骤(d)，

(i)比较至少两个在(c)中获得的熔解图谱，和/或

(ii)将在步骤(c)中获得的熔解图谱

与相同探针的之前获得的溶解曲线比较，或者

与同时在对照反应中平行获得的相同探针的熔解图谱比较，或者

与相同探针的理论熔解图谱比较，

其中所述熔解图谱的改变提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品/反应混合物中的指征，

其中所述扩增前熔解图谱是在反应/扩增开始之前在相同的反应容器中被测量的，或者是在单独的反应容器中被测量的，在所述单独的反应容器中由于反应混合物缺乏所述反应/扩增所必须的一种或更多种成分而无扩增发生，

其中在步骤(d)中，将所述扩增后或扩增中熔解图谱与所述探针的双链体的所述扩增前熔解图谱比较，以确定特定探针是否被消耗，作为相应靶存在于所述样品中的指征。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少一种可检测的标记物是荧光标记物，其中步骤(b)还包括逐循环在各个测量温度(MT)获得荧光发射(FE)的步骤(b1)，其中所述荧光发射(FE)是基线校正的荧光(dR)。

4.根据权利要求3所述的方法，其中当所述扩增反应混合物包括针对“n”个靶核酸的多重检测的“n”个探针时，其中第一探针具有熔解温度T_m1，第二探针具有熔解温度T_m2，第三探针具有熔解温度T_m3，第n探针具有熔解温度T_mn，其中T_m1＞T_m2＞T_m3…＞T_mn，每个探针在特定温度或不同温度的双链形式的百分比是以实验方法确定的，或者是通过计算机程序理论上计算出的，其中第一荧光发射FEa是在测量温度MTa获得的，在所述测量温度MTa，第一探针的多于50％是双链体形式，第二荧光发射FEb是在测量温度MTb获得的，在所述测量温度MTb，第二探针的多于50％是双链体形式，第n-1荧光发射FE(n-1)是在测量温度MT(n-1)获得的，在所述测量温度MT(n-1)，第(n-1)探针的多于50％是双链体形式，第n荧光发射FEn是在测量温度MTn获得的，在所述测量温度MTn，第n探针的多于80％是双链体形式，以及可选地，荧光发射FE0是在测量温度MT0获得的，在所述测量温度MT0，第一探针的不多于10％是双链体形式，其中n是正整数并且n≥2。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述步骤(b)还包括逐循环确定针对每个探针的荧光发射的实际消耗量(ACA)的步骤(b2)，其中第k探针的荧光发射的实际消耗量以ACA_k描述，其中所述第k探针在特定测量温度(MTa)具有百分比为(dska)％的ds(双链)形式，在该测量温度MTa由所述第一探针贡献的所述荧光发射FEa将是(ds1a)％*(ACA₁)，由所述第二探针贡献的将是(ds2a)％*(ACA₂)，由所述第k探针贡献的将是(dska)％*(ACA_k)，由所述第n探针贡献的将是(dsna)％*(ACA_n)，其中实际消耗量(ACA)的计算使用以下公式：

在测量温度MTa，总荧光发射将是

FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTb，总荧光发射将是

FEb＝(ACA1)*(ds1b)％+(ACA2)*(ds2b)％+(ACA3)*(ds3b)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTc，总荧光发射将是

FEc＝(ACA1)*(ds1c)％+(ACA2)*(ds2c)％+(ACA3)*(ds3c)％…+(ACAn)*(dsna)％

其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”，“k”是正整数，1≤k≤n，并且“n”是探针的数目。

6.根据权利要求5所述的方法，其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量是通过计算机程序获得的，所述计算机程序在每个循环在每个测量温度进行计算。

7.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括：

(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与反应混合物接触，所述反应混合物包括：

两个或更多个探针，其中每个探针包括

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且

其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征(熔解温度，T_m)是不同的，并且所述熔解特征在熔解图谱分析中是可区分的；

(b)在所述样品/反应混合物上进行所述反应，其中所述反应是在延伸条件下的引物延伸反应，其中，当靶核酸存在时，相对应的是可延伸引物的探针的所述第一寡核苷酸与靶核酸杂交，因此在所述引物延伸反应期间被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及

(c)通过检测来自未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，

其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征。

8.一种用于针对一个或更多个靶核酸检验样品的方法，所述方法包括：

(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与杂交反应混合物接触，所述杂交反应混合物包括：

两个或更多个探针，其中每个探针包括

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号是该探针的

所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在的特征，并且

其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的，并且所述熔解特征在熔解图谱分析中是可区分的；

(b)在杂交条件下，在所述样品/反应混合物上进行所述杂交反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的第一寡核苷酸与靶核酸杂交，因此在所述反应期间被消耗，其中探针的所述被消耗的寡核苷酸不再能够参与形成所述探针的双链部分(双链体)；以及

(c)通过检测来自未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，

其中所述熔解图谱提供至少一个靶核酸是否存在于所述样品中的指征。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增是等温扩增或热循环扩增反应，所述反应包括两次或更多次的变性、退火和引物延伸步骤。

10.一种用于监控至少两个靶核酸的PCR扩增的方法，所述方法包括：

(a)将包括一个或更多个靶核酸的样品与扩增反应混合物接触，所述扩增反应混合物包括：

(i)一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸，

(ii)两个或更多个探针，其中每个探针包括

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括荧光标记物或者荧光标记物/淬灭剂对，所述荧光标记物或者荧光标记物/淬灭剂对能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，并且

其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；

(b)进行包括所述样品/扩增反应混合物的热循环的扩增反应

其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸在所述扩增反应中被消耗；并且

其中所述步骤(b)还包括逐循环在各个测量温度(MT)获得荧光发射(FE)的步骤(b1)，其中所述荧光发射(FE)是基线校正的荧光(dR)，

其中当所述扩增反应混合物包括针对“n”个靶核酸的多重检测的“n”个探针时，其中第一探针具有熔解温度T_m1，第二探针具有熔解温度T_m2，第三探针具有熔解温度T_m3，第n探针具有熔解温度T_mn，其中T_m1＞T_m2＞T_m3…＞T_mn，其中每个探针在特定温度或不同温度的双链形式的百分比是以实验方法确定的，或者是通过计算机程序理论上计算出的，其中第一荧光发射FEa是在测量温度MTa获得的，在所述测量温度MTa，第一探针的多于50％是双链体形式，第二荧光发射FEb是在测量温度MTb获得的，在所述测量温度MTb，第二探针的多于50％是双链体形式，第n-1荧光发射FE(n-1)是在测量温度MT(n-1)获得的，在所述测量温度MT(n-1)，第(n-1)探针的多于50％是双链体形式，第n荧光发射FEn是在测量温度MTn获得的，在所述测量温度MTn，第n探针的多于80％是双链体形式，以及可选地，荧光发射FE0是在测量温度MT0获得的，在所述测量温度MT0，第一探针的不多于10％是双链体形式，其中n是正整数并且n≥2，

其中所述步骤(b)还包括逐循环确定针对每个探针的荧光发射的实际消耗量(ACA)的步骤(b2)，其中第k探针的荧光发射的所述实际消耗量以ACA_k描述，其中所述第k探针在特定测量温度(MTa)具有百分比为(dska)％的ds(双链)形式，在该测量温度MTa由所述第k探针贡献的所述荧光发射FEa将是(dska)％*(ACA_k)，由所述第n探针贡献的将是(dsna)％*(ACA_n)，其中实际消耗量(ACA)的计算使用以下公式：

在测量温度MTa，总荧光发射将是

FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTb，总荧光发射将是

FEb＝(ACA1)*(ds1b)％+(ACA2)*(ds2b)％+(ACA3)*(ds3b)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTc，总荧光发射将是

FEc＝(ACA1)*(ds1c)％+(ACA2)*(ds2c)％+(ACA3)*(ds3c)％…+(ACAn)*(dsna)％

其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”，“k”是正整数，1≤k≤n，并且“n”是探针的数目，

其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量是通过计算机程序获得，所述计算机程序在每个循环在每个测量温度进行计算，并且

其中每个探针的荧光发射的所述实际消耗量与所述靶核酸的扩增程度相关，所述靶核酸与该探针结合。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述消耗是通过所述探针的所述第一寡核苷酸与所述靶序列的杂交来实现的，接下来是所述探针的所述第一寡核苷酸整合入扩增产物，其中当所述探针的所述第一寡核苷酸可以被整合入所述扩增产物时，所述第一寡核苷酸是可延伸的引物或者是所述正向/反向寡核苷酸引物对之一。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述消耗是通过所述探针的所述第一寡核苷酸与所述靶序列的杂交来实现的，接下来是所述探针的第一和/或第二寡核苷酸的降解，其中当所述探针的所述第一寡核苷酸在所述反应期间被降解，所述反应混合物包括双链依赖的核酸酶活性。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述探针包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物是荧光基团，并且所述第二标记物是淬灭剂，反之亦然。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第一标记物被附接至所述第一寡核苷酸，并且所述第二标记物被附接至所述第二寡核苷酸，使得当所述探针的内部双链体形成时，所述第一标记物和第二标记物是非常接近的。

15.根据权利要求13所述的方法，其中标记物在所述探针的一个寡核苷酸上，所述一个寡核苷酸或者是所述第一寡核苷酸，或者是所述第二寡核苷酸。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述探针的所述第二寡核苷酸包括至少一个、优选两个标记物，其中所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，所述第一标记物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲或者茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近。

17.根据权利要求15所述的方法，其中所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中，当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，所述标记物能够改变相对于单链形式的所述第二寡核苷酸的发射的信号发射。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且其中所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一个是与第一标记物附接的，并且另一个第二寡核苷酸是与第二标记物附接的，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。

19.根据权利要求13所述的方法，其中探针的所述第一和第二寡核苷酸通过包括核苷酸的连接部分或者非核苷酸的化学连接部分连接，允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成茎环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸是分别用第一和第二标记物来标记，使得当所述探针形成内部茎环结构时，使得所述标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一区域与所述第一寡核苷酸的第二区域基本上不重叠。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的所述第一区域与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上重叠，或者所述第二区域嵌入所述第一区域，其中所述第一寡核苷酸与所述靶序列杂交的所述双链体的T_m比所述第一寡核苷酸与所述第二寡核苷酸杂交的所述双链体的T_m更高，使得如果靶存在，所述第一寡核苷酸与所述靶形成比所述第一/第二寡核苷酸双链体更强的杂交体，并且因此在更高的温度熔解。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸包括第三区域，所述第三区域与用于所述扩增反应的引物的序列等同或基本上等同。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中探针的所述第一和第二寡核苷酸两者均能够在扩增期间被消耗。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸在3’末端被封闭，并且其中所述第二寡核苷酸在3’末端被封闭。

25.一种用于针对靶核酸上一个或更多个变异的核苷酸的检验样品的方法，所述方法包括：

(a)将包括靶核酸的样品与反应混合物接触，所述反应混合物包括：

(i)一对或更多对正向/反向寡核苷酸引物，其中如果一个或更多个靶核酸存在于所述样品中，所述引物对能够扩增所述一个或更多个靶核酸，

(ii)至少一对探针，其中所述一对探针中的第一探针包括与野生型靶核酸序列互补的序列，所述一对探针中的第二探针包括与含有变异核苷酸的靶核酸序列互补的序列，其中所述一对探针中的每个探针包括

第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中所述一对探针中的每个探针包括相同的第二寡核苷酸，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，并且

其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的；

(b)在所述样品/反应混合物上进行扩增反应，其中，当靶核酸存在时，与该靶核酸的一部分基本上互补的探针的所述第一寡核苷酸在扩增期间被消耗，以及

(c)通过检测来自在未被消耗的探针中的所述标记物的一个或多个信号作为温度的函数，至少测量一次所述反应混合物中的所述未被消耗的探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解图谱，

其中所述熔解图谱提供在所述样品/扩增反应混合物中是否至少一个靶核酸已被扩增的指征。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一对探针中所述相同的寡核苷酸包括通用碱基或与所述靶核酸序列中的所述变异的核苷酸对应的肌苷，其中所述通用碱基是3-硝基吡咯2’-脱氧核苷、5-硝基吲哚、嘧啶类似物或嘌呤类似物。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中不同探针的多个第一寡核苷酸杂交至靶序列的同一链的不同位点。

28.一种用于与根据前述权利要求中任一项所述的方法一起使用的计算机软件产品，当在合适的数据处理装置上运行时，用于比较探针的熔解图谱和/或定量多个靶的实时PCR扩增，当被计算机处理器执行时，所述计算机软件产品使用以下公式进行实际消耗量(ACA)的计算：

在测量温度MTa，总荧光发射将是

FEa＝(ACA1)*(ds1a)％+(ACA2)*(ds2a)％+(ACA3)*(ds3a)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTb，总荧光发射将是

FEb＝(ACA1)*(ds1b)％+(ACA2)*(ds2b)％+(ACA3)*(ds3b)％…+(ACAn)*(dsna)％

在测量温度MTc，总荧光发射将是

FEc＝(ACA1)*(ds1c)％+(ACA2)*(ds2c)％+(ACA3)*(ds3c)％…+(ACAn)*(dsna)％

其余类推，其中针对每个探针的所述ACA可以从以上公式计算，其中“*”表示“乘以”，“k”是正整数，1≤k≤n，并且“n”是探针的数目。

29.一种包括计算机内存的计算机系统，所述计算机内存具有存储在其中的计算机软件程序，其中所述计算机软件程序，当被处理器执行或在计算机中被执行时，实现根据权利要求1至27中任一所述的方法。

30.根据权利要求29所述的计算机系统，其中所述计算机软件程序实现包括以下步骤的方法，所述步骤是在扩增期间或在扩增终点计算每个探针的荧光发射的实际消耗量和/或确定熔解图谱的特征。

31.一种用于针对一个或更多个靶核酸的检测的试剂盒，所述试剂盒包括探针，所述探针包括：

15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，

并且其中

(a)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物被附接在或靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲的或者是茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近，并且其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，所述两个标记物被保持远离彼此；或者

(b)所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中，当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，相对于当为单链形式的所述第二寡核苷酸时所述标记物的所述发射，所述标记物能够改变所述标记物的可检测信号发射；或者

(c)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部分，其中所述第二寡核苷酸中的一个与第一标记物附接，并且另一个第二寡核苷酸与第二标记物链接，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号。

32.一种用于针对一个或更多个靶核酸的检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有两个或更多个探针的探针混合物，其中每个探针包括：

15-150核苷酸的第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸包括第一区域和第二区域，所述第一区域与一个靶核酸的一部分基本上互补，以及

至少一个4-150核苷酸的第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸包括与所述第一寡核苷酸的所述第二区域基本上互补的区域，使得所述第一和第二寡核苷酸能够形成双链部分，

其中每个探针包括可检测的标记物或者可检测的标记物的组合，所述可检测的标记物或可检测的标记物的组合能够产生可变的信号，所述可变的信号表征该探针的所述第一和第二寡核苷酸之间的双链部分的存在或不存在，

并且其中

(a)所述第一标记物被附接至所述第一寡核苷酸的所述第二区域，并且所述第二标记物被附接到所述第二寡核苷酸的区域，所述第二寡核苷酸的所述区域与所述第一寡核苷酸的所述第二区域互补，使得当所述探针的内部双链体形成时，使得所述第一和第二标记物非常接近；或者

(b)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述第二寡核苷酸包括第一标记物和第二标记物，其中所述第一标记物被附接在或者靠近第二寡核苷酸的一端，并且所述第二标记物被附接在或者靠近所述第二寡核苷酸的另一端，从而当所述第二寡核苷酸不与所述第一寡核苷酸杂交时，所述第二寡核苷酸是无规卷曲的或者是茎环结构，所述结构使得所述第一标记物和第二标记物非常接近，并且其中当所述第二寡核苷酸与所述第一寡核苷酸杂交时，所述两个标记物被保持远离彼此；或者

(c)所述第一寡核苷酸不包括标记物，并且所述第二寡核苷酸包括标记物，其中当所述第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸以形成所述探针的所述双链部分时，相对于当为单链形式的所述第二寡核苷酸时所述标记物的所述发射，所述标记物能够改变所述标记物的可检测信号发射；或者

(d)所述探针的所述第一寡核苷酸不包括标记物，所述探针包括两个第二寡核苷酸，所述两个第二寡核苷酸能够邻近地或基本上邻近地杂交至所述第一寡核苷酸的所述第二区域的不同部位，其中所述第二寡核苷酸中的一个与第一标记物附接，并且另一个第二寡核苷酸与第二标记物附接的，使得当所述两个第二寡核苷酸杂交至所述第一寡核苷酸时，使得所述两个标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号；或者

(e)探针的所述第一和第二寡核苷酸通过包括核苷酸的连接部分或者非核苷酸的化学连接部分接合，允许所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成茎环结构，其中所述第一和第二寡核苷酸分别用第一和第二标记物标记，使得当所述探针形成内部茎环结构时，使得所述标记物非常接近，并且一个标记物影响来自另一个标记物的信号；

并且其中所述探针中的至少两个包括相同的可检测标记物或者具有不可区分的发射光谱的不同的可检测标记物，并且其中这样的探针中的每个的所述第一和第二寡核苷酸之间的所述双链部分的熔解特征是不同的。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的试剂盒，其中至少一个标记物是荧光标记物。

34.根据权利要求31的(a)或(c)部分或权利要求32的(a)、(b)、(d)或(e)部分所述的试剂盒，其中所述探针包括第一标记物和第二标记物。

35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述第一标记物是荧光基团并且所述第二标记物是淬灭剂，或者反之亦然。

36.如权利要求31的(a)-(c)部分的任一所定义的探针，权利要求32的探针混合物在如权利要求1-27中任一项所定义的方法中的应用。

37.基本上如此处所描述和/或参照实施例的根据权利要求1-27中任一项所述的方法。

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